一種檢測cyp2d6_c2850t基因多態(tài)性的引物及其方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種檢測CYP2D6_C2850T基因多態(tài)性的 引物及其方法。
【背景技術(shù)】
[0002] CYP2D6是第一個(gè)被確認(rèn)由單基因控制的P450酶，CYP2D6是位于第22號染色體上， 其含有9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子，總長為化b左右，是一個(gè)完整的功能性基因。有研究發(fā)現(xiàn)， CYP2D6基因上游有2個(gè)高度同源的假基因，分別稱為CYP2D7P基因和CYP2D8P基因，CYP2D7P 基因與CYP2D6基因有97%的核酸序列同源性，而且?guī)в蠺ATA盒，但是由于在外顯子1的第226 位點(diǎn)上插入了一個(gè)胸腺喀晚(T)，從而改變了讀碼框架，使轉(zhuǎn)錄提前終止;CYP2D8P基因是一 個(gè)含有多個(gè)斷裂點(diǎn)的突變假基因。CYP2D7P和CYP2D8P基因在人體足跡中均不表達(dá)，只有 CYP2D6在肝、腸、腎和人腦中表達(dá)。
[0003] 現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，肝臟中CYP2D6的含量僅占 P450肝臟蛋白總量的2%，但是，它卻參與 代謝約25%的臨床用藥，包括抗抑郁藥、抗屯、律失常藥、抗精神病藥和鎮(zhèn)痛藥等。目前已發(fā)現(xiàn) 超過100種CYP2D6等位基因的變異，主要是單核巧酸變異、大片段基因的丟失W及多基因拷 貝，運(yùn)些變異使CYP2D6基因呈現(xiàn)多態(tài)性，并決定其代謝表型的多樣性，使酶的活性表現(xiàn)為缺 失、降低、正?；蚴窃黾拥葞追N類型。
[0004] 楊軟等人發(fā)表了一篇題目為"CYP2D6基因多態(tài)性與他莫昔芬治療"的論文，該論文 表明不同基因型的CYP2D6對他莫昔芬的代謝不同，產(chǎn)生的活性代謝產(chǎn)物(4-徑基他莫昔芬 和化doxifen)濃度不同，其中PMs(含兩個(gè)無效等位基因致CYP2D6活性缺失）血漿中活性 代謝產(chǎn)物濃度最低，而UMs(含兩個(gè)W上正常功能等位基因，即多基因拷貝致CYP2D6活性增 強(qiáng))血漿活性代謝產(chǎn)物濃度最高。因此，CYP2D6的多態(tài)性研究對臨床具有重要的意義，成為 目前研究的熱點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供一種檢測CYP2D6_C2850T基因多態(tài)性 的引物及其方法，該引物檢測CYP2D6基因 C2850T (rs 16947)位點(diǎn)，具有特異性好、靈敏度 高、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)，為CYP2D6_C2850T基因多態(tài)性提供了一種簡單有效的檢測方法。
[0006] 本發(fā)明提供了一種檢測CYP2D6_C2850T基因多態(tài)性的引物，包括巢式PCR擴(kuò)增引物 和挪aPshot PCR引物;所述巢式PCR擴(kuò)增引物包括巢式A輪PCR擴(kuò)增引物和巢式B輪PCR擴(kuò)增 引物;所述巢式A輪擴(kuò)增引物為：針對CYP2D6的上游引物5 ' - CCAGAAGGCTTTGCAGGCTTCA-3 ' (沈Q ID N0.1)和下游引物5'- CTGAGCCCTGGGAGGTAGGTAG-3'（沈Q ID 側(cè).2);所述巢式8輪 PCR擴(kuò)增引物為：針對CYP2D6_C2850T的上游引物5'- GCTCACGCTGCACATCCGGA-3'（SEQ ID N0.3)和下游引物5'-GGGCAAGGGTGGTGGGTTGA-3'（SEQIDN0.4);所述S化PshotPCR引物 為：針對CYP2D6_C2850T的挪aPshot PCR引物5 ' -TTTTTTTTTTTTTTCAGGTCAGCCACCACTATGC- 3'（沈Q ID NO. 5)。
[0007]另外，本發(fā)明還提供了一種檢測CYP2D6_C2850T基因多態(tài)性的方法，包括如下步 驟： S1提取DNA樣品； S2采用權(quán)利要求1所述的巢式A輪PCR擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對巢式A輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn) 行純化； S3W巢式A輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板采用權(quán)利要求1所述的巢式B輪PCR擴(kuò)增引物進(jìn)行多重 PCR擴(kuò)增； S4采用權(quán)利要求1所述的挪aPshot PCR引物進(jìn)行挪aPshot PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行 純化； S5毛細(xì)管電泳技術(shù)進(jìn)行檢測，對檢測結(jié)果進(jìn)行分析，確定SNP位點(diǎn)及其基因型。
[000引進(jìn)一步地，所述步驟S1中的DNA樣品為邸TA抗凝外周血的DNA樣品。
[0009]進(jìn)一步地，所述步驟S2中的巢式A輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件包括:階段1:98°C 3min;階 段2:98°C 10s;階段3:72°C 3min;階段4:返回到階段2,24個(gè)循環(huán);階段5:72°C 5min;階段 6:25°C 保溫。
[0010]進(jìn)一步地，所述步驟S3中的巢式B輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件包括:階段1:98°C 3min;階 段2:98°C 10s;階段3:58°C 30s;階段4:72°C Imin;階段5:返回到階段2,29個(gè)循環(huán);階段6: 72°C 5min;階段7:25°C 保溫。
[0011] 進(jìn)一步地，所述步驟S4中的挪aPshot PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件包括:階段1:96°C 10s;階 段2:55°C 5s;階段3:60°C 30s;階段4:返回到階段1，25個(gè)循環(huán);階段5:4°C保溫。
[001引進(jìn)一步地，所述步驟S5中采用GENEMAPP邸ID V4.1軟件對檢測結(jié)果進(jìn)行分析。
[0013] 除此之外，本發(fā)明提供的CYP2D6_C2850T基因多態(tài)性的引物在制備檢測CYP2D6_ C2850T基因多態(tài)性試劑中的用途。
[0014] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的技術(shù)方案具有W下優(yōu)勢:本發(fā)明提供了一種檢測 CYP2D6_C2850T基因多態(tài)性的引物，該引物的特異性好，不會(huì)發(fā)生交叉反應(yīng)，準(zhǔn)確性好，實(shí)現(xiàn) 了CYP2D6_C2850T基因多態(tài)性的檢測，對實(shí)現(xiàn)基因?qū)蛐詡€(gè)體化治療，不斷提高治療效果、 降低不良反應(yīng)具有非常重要的意義。
【附圖說明】
[0015] 圖1為本發(fā)明提供的CYP2D6_C2850T的擴(kuò)增片段； 圖2為CYP2D6_C2850T引物擴(kuò)增產(chǎn)物的部分測序圖； 圖3為樣品的CYP2D6_C2850T基因多態(tài)性檢測結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0017] 實(shí)施例一、引物 本發(fā)明提供的引物如表1所示，包括巢式PCR擴(kuò)增引物和挪aPshot PCR引物;所述巢式 PCR擴(kuò)增引物包括巢式A輪PCR擴(kuò)增引物和巢式B輪PCR擴(kuò)增引物，所述巢式B輪PCR擴(kuò)增引物 和挪aPshot PCR引物是相對應(yīng)的。本發(fā)明提供的所有引物序列均通過UCSC數(shù)據(jù)庫比對，無 已知SNP位點(diǎn)。
[0018]表1本發(fā)明提供的引物
實(shí)施例二、引物的特異性 將本發(fā)明提供的引物于UCSC中進(jìn)行Blasting,結(jié)果如下： CYP2D6_C2850T基因特異引物于UCSC中進(jìn)行Blast,無其它同源基因。CYP2D6_C2850T擴(kuò) 增片段位于C虹22:42127836+42128150，長度為31化P，擴(kuò)增序列如圖1。
[0019]使用表1中PCR擴(kuò)增引物分別對檢測樣品進(jìn)行擴(kuò)增及Sanger測序，測序結(jié)果顯示， 各引物擴(kuò)增片段與CYP2D6_C2850T基因參考序列吻合，結(jié)果如圖2所示。使用表1中挪aPshot PCR引物，SNaPshot法進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖3所示。從圖3可知，各產(chǎn)物峰的相對位置及測序反 應(yīng)滲入的堿基與預(yù)期相符，且無其它干擾峰。
[0020] 實(shí)施例S、CYP2D6_C2850T基因多態(tài)性的檢測 1)提取抓TA抗凝外周血的DNA樣品，提取方法參照TIANamp Blood DNA Kit(購自 Τ iagen，貨號DP318 )的說明書，將DM樣品稀釋至1 OOng/yL，備用。
[0021 ] 2)配制引物混合物：配制巢式A輪PCR引物混合物，CYP2D6-Fwd: CYP2D6-Rev:肥0= 1:1:3,引物終濃度為1 pmolAiL，震蕩混勻，短暫離屯、后備用；加入CYP2D6_C2850T擴(kuò)增引 物，引物終濃度為0.5 pmol/μレ短暫離屯、后備用;PCR擴(kuò)增采用Q5?熱啟動(dòng)超保真2X Master M