本發(fā)明涉及分子生物學(xué)診斷領(lǐng)域和遺傳病領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)多種耳聾基因多態(tài)性的snapshot試劑盒。
背景技術(shù)：
：先天性耳聾是最常見(jiàn)的出生缺陷之一，也是最常見(jiàn)的人類感覺(jué)系統(tǒng)疾病，發(fā)病率為0.1％-0.3％。60％的耳聾與遺傳因素相關(guān)。在這些遺傳因素中，主要包括gjb2、slc26a4、gjb3基因和線粒體dnam.1555a>g和m.1494c>t位點(diǎn)。在中國(guó)新生兒耳聾基因突變篩查中，gjb2基因突變具有較高的攜帶率，約2.6％，slc26a4基因突變攜帶率約為1.9％，新生兒線粒體dnam.1555a>g均質(zhì)突變占0.1％，gjb3基因突變僅在少數(shù)患者中發(fā)現(xiàn)。gjb2基因編碼的cx26表達(dá)于耳蝸，位于內(nèi)耳血管紋、基底膜和螺旋緣，與先天性遺傳性中重度耳聾相關(guān)，gjb2基因突變后，k+進(jìn)入內(nèi)淋巴液的循環(huán)受到影響，導(dǎo)致常顯或常隱感音神經(jīng)性耳聾(dfnb1或dfna3)。gjb3基因編碼的cx31是縫隙連接蛋白的一員，在耳蝸和聽(tīng)神經(jīng)內(nèi)表達(dá)，突變可導(dǎo)致常顯或常隱非綜合性耳聾、周圍神經(jīng)疾病伴聽(tīng)力喪失。slc26a4基因主要引起中國(guó)人大前庭水管綜合征，可結(jié)合顳骨ct進(jìn)行檢測(cè)。此病出生時(shí)聽(tīng)力可能正常，或有輕度至中重度的聽(tīng)力損失，因墮床、兒童玩?；蝮w育活動(dòng)中的輕度碰撞或感冒可以造成明顯的聽(tīng)力下降，其臨床表現(xiàn)與發(fā)病年齡、耳聾程度以及是否伴有眩暈有密切的關(guān)系。線粒體dna突變?yōu)槟赶颠z傳，線粒體dnam.1494c＞t、m.1555a＞g與氨基糖甙類藥物致聾和非綜合征型耳聾有關(guān)。中國(guó)不同地區(qū)的非綜合征型耳聾患者中，各基因的突變比例有所差異，主要突變基因?yàn)間jb2基因，slc26a4基因和線粒體dnam.1555a>g和m.1494c>t位點(diǎn)，gjb3基因突變僅在少數(shù)患者中發(fā)現(xiàn)，gjb2基因主要突變方式為c.235delc，約占gjb2基因突變的63.6-76.8％，其次是c.299_300delat和c.176_191del16約占8.7％-13.1％，c.508_511dupaacg約占4.3％-6.3％。slc26a4基因的主要突變?yōu)閏.2168a>g和c.919-2a>g，約占slc26a4基因突變的77.1％-84.67％，c.1975g>c和c.2162c>t等分別約占1％-2.5％。線粒體dna耳聾基因主要突變?yōu)閙.1555a>g，m.1494c>t。由于其他測(cè)序檢測(cè)方法多存在準(zhǔn)確度，特異性，精密度不足的問(wèn)題，目前的耳聾基因多態(tài)性檢測(cè)一般仍然采用sanger法進(jìn)行，其一次實(shí)驗(yàn)中僅能檢測(cè)一個(gè)位點(diǎn)，而且花費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)。這種困難造成的耳聾基因多態(tài)性檢測(cè)，特別是能覆蓋廣泛耳聾基因多態(tài)性位點(diǎn)的篩查難以普及，即使在北京，上海等城市，新生兒免費(fèi)耳聾基因篩選也僅覆蓋兩個(gè)gjb2和slc26a4位點(diǎn)，需要自費(fèi)數(shù)百元的進(jìn)一步篩查也僅多4個(gè)位點(diǎn)，這樣的篩查無(wú)疑會(huì)遺漏大量潛在的遺傳性耳聾患者，對(duì)其今后的保健和治療帶來(lái)不利影響。此外，上述檢測(cè)手段的局限也使得遺傳病相關(guān)科研工作難以大規(guī)模開(kāi)展。snapshot通過(guò)為不同位點(diǎn)設(shè)計(jì)不同長(zhǎng)度的引物進(jìn)行snapshot反應(yīng)，產(chǎn)物經(jīng)電泳分離，熒光檢測(cè)，genemapper分析，可一次性檢測(cè)多個(gè)snp位點(diǎn)，而且每次反應(yīng)中僅需極少量dna樣本。比一般pcr方法復(fù)雜的是，snapshot檢測(cè)體系，特別是多重snapshot檢測(cè)體系設(shè)計(jì)中需要考慮的因素眾多：引物長(zhǎng)度，tm值，尾部結(jié)構(gòu)選擇，以及模板和引物的比例都可能造成非特異性擴(kuò)增和隨后的堿基誤讀。設(shè)計(jì)可靠的多重snapshot檢測(cè)體系需要對(duì)引物設(shè)計(jì)進(jìn)行縝密考慮，大量驗(yàn)證并進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整。目前將該檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用于耳聾snp位點(diǎn)檢測(cè)的實(shí)例僅有cn103911452a和cn102618624a，前者的檢測(cè)對(duì)象包括gjb2基因35、109、176-199、235、299-300位點(diǎn)，slc26a4基因1174、1226、1229、1975、2027、2162、2168、ivs7-2位點(diǎn)、線粒體dna1494、1555、3243、7444位點(diǎn)的突變。后者的檢測(cè)對(duì)象包括gjb2基因235、299-300位點(diǎn)，slc26a4基因2168、ivs7-2位點(diǎn)，線粒體dna1555、3243、7445位點(diǎn)。兩者均已經(jīng)獲得授權(quán)。但仍有部分耳聾相關(guān)snp位點(diǎn)，如c.508_511dupaacg,slc26a4-919-2，gjb3的gjb3-547、538位點(diǎn)等沒(méi)有被覆蓋，其中的c.508_511dupaacg,slc26a4-919-2還是我國(guó)人群中出現(xiàn)率較高的突變位點(diǎn)。設(shè)計(jì)能囊括更廣泛耳聾相關(guān)位點(diǎn)，特別是現(xiàn)有的試劑盒未涉及的位點(diǎn)的snapshot試劑盒，對(duì)于遺傳性耳聾的預(yù)防和科研具有重要意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明利用snapshot技術(shù)一次性檢測(cè)多個(gè)耳聾基因多態(tài)性位點(diǎn)，速度快并且節(jié)約時(shí)間和費(fèi)用?？梢詸z測(cè)到大比例的，現(xiàn)有技術(shù)遺漏的中國(guó)遺傳性非綜合征型耳聾人群，有助于及早發(fā)現(xiàn)攜帶耳聾基因突變的患兒(包括遲發(fā)性聽(tīng)力缺陷患兒)，為后期的診斷及治療提供科學(xué)依據(jù)，有助于及時(shí)采取干預(yù)措施預(yù)防言語(yǔ)障礙的發(fā)生，有效地降低聾啞發(fā)病率。一方面，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)多種耳聾基因多態(tài)性的snapshot試劑盒，檢測(cè)的耳聾基因多態(tài)性位點(diǎn)包括gjb2基因位點(diǎn)rs80338943、rs111033204、508_511dupaacg；slc26a4基因rs111033318、rs121908362、rs121908363、rs200455203、rs111033380、rs111033313；12srrna基因(線粒體dna)rs267606617。進(jìn)一步地，試劑盒中包含檢測(cè)這些多態(tài)性位點(diǎn)的擴(kuò)增引物和測(cè)序引物。進(jìn)一步地，擴(kuò)增引物分別為：進(jìn)一步地，測(cè)序引物分別為：進(jìn)一步地，擴(kuò)增引物在進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增試劑比例如下：其中，擴(kuò)增引物的比例均為1：1；進(jìn)一步地，擴(kuò)增產(chǎn)物在進(jìn)行微測(cè)序時(shí)，測(cè)序試劑比例如下：試劑體積(μl)snapshotreadymix1.25ddh2o4.255倍稀釋的測(cè)序緩沖液1.5引物混合物2total9.0進(jìn)一步地，擴(kuò)增產(chǎn)物在進(jìn)行微測(cè)序時(shí)，測(cè)序引物濃度比例如下：進(jìn)一步地，該試劑盒使用方法包括步驟：dna提??；擴(kuò)增產(chǎn)物純化；延伸產(chǎn)物純化；測(cè)序分析。另一方面，本發(fā)明提供了一種利用snapshot技術(shù)一次性檢測(cè)多個(gè)耳聾基因多態(tài)性位點(diǎn)的非診斷科研方法，具體包括步驟：dna提?。阂匀搜牟杉瘶颖具M(jìn)行dna提供，具體參考公司有關(guān)《血液基因組dna提取標(biāo)準(zhǔn)操作流程》，提取完畢的dna計(jì)算其濃度并稀釋至5-10μg/ml；試劑準(zhǔn)備：a)配置二倍的mastermix，這其中包括dntp、mgcl2、熱啟動(dòng)超保真dna聚合酶、緩沖液，室溫融化后，短暫離心；準(zhǔn)備好合適數(shù)量的pcr反應(yīng)管；b)配制引物混合物：各引物的比例均為＝1:1，震蕩混勻；短暫離心后備用；c)反應(yīng)體系配制d)震蕩混勻，短暫離心后，分裝23μl至標(biāo)記好的pcr反應(yīng)管。轉(zhuǎn)移至標(biāo)本制備區(qū)；加樣a)若樣品及質(zhì)控品保存在-20℃，使用前置室溫解凍，并短暫離心；b)向分裝好的pcr反應(yīng)管中加入10ngdna模板，并進(jìn)行稀釋；c)蓋好管蓋后，震蕩混勻，短暫離心，轉(zhuǎn)移至pcr擴(kuò)增區(qū)；pcr擴(kuò)增：置pcr管放于pcr儀上。反應(yīng)程序設(shè)置如下：95℃5min；95℃30s；55℃30s；72℃1min；45個(gè)循環(huán)；72℃5min；25℃保溫；pcr擴(kuò)增產(chǎn)物純化：取2ul的exosap-it分裝到200ulep管，每管加入pcr產(chǎn)物5ul，混勻微離，按以下程序進(jìn)行pcr：7ul37℃15min；80℃15min；4℃foreversnapshotpcr擴(kuò)增a)反應(yīng)結(jié)束后取出8連管，配制引物混合物，比例如下：b)按以下體系配置：c)對(duì)純化后2管的擴(kuò)增產(chǎn)物分別進(jìn)行snapshot延伸，加入1ul純化產(chǎn)物，混勻微離，按以下程序進(jìn)行pcr：96℃10s；96℃10s；50℃5s；60℃30s；25個(gè)循環(huán)；4℃保溫；sne產(chǎn)物純化：a)往snapshotpcr產(chǎn)物中加入fastap1ul、buffer2ul、7ul水、10ulsnapshotpcr產(chǎn)物，按以下程序進(jìn)行pcr：b)37℃10min；75℃5min；1個(gè)循環(huán)；4℃保溫；電泳：sap處理完的產(chǎn)物1ul+8.8ulhidi+0.2ul120liz95℃變性3min，冰上冷卻，上機(jī)結(jié)果分析與解釋：分析采用genemapperidv4.1軟件進(jìn)行初步分析，確定snp位點(diǎn)；分析完畢的結(jié)果需要保存，genemapperidv4.1軟件文件格式及snapshot峰圖各保存一份；genemapper4.1軟件分析。另一方面，本發(fā)明提供了引物組在制備檢測(cè)多種耳聾基因多態(tài)性的snapshot試劑中的應(yīng)用，擴(kuò)增引物分別為：測(cè)序引物分別為：進(jìn)一步地，測(cè)序引物濃度比例如下：附圖說(shuō)明圖1為部分位點(diǎn)的snapshot檢測(cè)實(shí)例。圖2為部分位點(diǎn)snapshot檢測(cè)結(jié)果實(shí)例(陰性)。具體實(shí)施方式實(shí)施例1檢測(cè)過(guò)程1.檢測(cè)的具體實(shí)施過(guò)程1.1dna提取以人血的采集樣本進(jìn)行dna提供，具體參考公司有關(guān)《血液基因組dna提取標(biāo)準(zhǔn)操作流程》，提取完畢的dna計(jì)算其濃度并稀釋至5-10μg/ml。1.2試劑準(zhǔn)備e)配置二倍的mastermix，這其中包括dntp、mgcl2、熱啟動(dòng)超保真dna聚合酶、緩沖液，室溫融化后，短暫離心；準(zhǔn)備好合適數(shù)量的pcr反應(yīng)管。f)配制引物混合物：各引物的比例均為＝1:1，震蕩混勻；短暫離心后備用。g)反應(yīng)體系配制d)震蕩混勻，短暫離心后，分裝23μl至標(biāo)記好的pcr反應(yīng)管。轉(zhuǎn)移至標(biāo)本制備區(qū)。1.3加樣d)若樣品及質(zhì)控品保存在-20℃，使用前置室溫解凍，并短暫離心。e)向分裝好的pcr反應(yīng)管中加入10ngdna模板，并進(jìn)行稀釋。f)蓋好管蓋后，震蕩混勻，短暫離心，轉(zhuǎn)移至pcr擴(kuò)增區(qū)。1.4pcr擴(kuò)增置pcr管放于pcr儀上。反應(yīng)程序設(shè)置如下：95℃5min；95℃30s；55℃30s；72℃1min；45個(gè)循環(huán)；72℃5min；25℃保溫；1.5pcr擴(kuò)增產(chǎn)物純化取2ul的exosap-it分裝到200ulep管，每管加入pcr產(chǎn)物5ul，混勻微離，按以下程序進(jìn)行pcr：7ul37℃15min；80℃15min；4℃forever1.6snapshotpcr擴(kuò)增a)反應(yīng)結(jié)束后取出8連管，配制引物混合物，比例如下：b)按以下體系配置：試劑體積(μl)snapshotreadymix1.25ddh2o4.255倍稀釋的測(cè)序緩沖液1.5引物混合物2total9.0c)對(duì)純化后2管的擴(kuò)增產(chǎn)物分別進(jìn)行snapshot延伸，加入1ul純化產(chǎn)物，混勻微離，按以下程序進(jìn)行pcr：96℃10s；96℃10s；50℃5s；60℃30s；25個(gè)循環(huán)；4℃保溫；1.7sne產(chǎn)物純化c)往snapshotpcr產(chǎn)物中加入fastap1ul、buffer2ul、7ul水、10ulsnapshotpcr產(chǎn)物，按以下程序進(jìn)行pcr：d)37℃10min；75℃5min；1個(gè)循環(huán)；4℃保溫；1.8電泳sap處理完的產(chǎn)物1ul+8.8ulhidi+0.2ul120liz95℃變性3min，冰上冷卻，上機(jī).2.結(jié)果分析與解釋2.1結(jié)果分析方法分析采用genemapperidv4.1軟件進(jìn)行初步分析，確定snp位點(diǎn)。分析完畢的結(jié)果需要保存，genemapperidv4.1軟件文件格式及snapshot峰圖各保存一份。2.2結(jié)果分析genemapper4.1軟件分析，結(jié)果如附圖1。3.qc規(guī)則本檢測(cè)共設(shè)立兩個(gè)質(zhì)控，質(zhì)控判斷標(biāo)準(zhǔn)參考檢測(cè)sop：1.pos，為陽(yáng)性對(duì)照，一般選擇1或多個(gè)位點(diǎn)為雜合突變的樣本。2.ntc，為無(wú)模板對(duì)照。4.引物特異性1)本發(fā)明所設(shè)計(jì)的所有引物的擴(kuò)增片段均覆蓋了相應(yīng)的檢測(cè)位點(diǎn)，無(wú)其它同源基因，詳細(xì)信息參考附表2；2)本發(fā)明使用擴(kuò)增引物分別對(duì)檢測(cè)樣本進(jìn)行擴(kuò)增，并采用sanger測(cè)序法進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示，各引物擴(kuò)增片段與基因參考序列吻合(見(jiàn)附表3，僅顯示部分結(jié)果)。3)本發(fā)明使用snapshot測(cè)序引物對(duì)相應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行微測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示，各產(chǎn)物峰的相對(duì)位置及測(cè)序反應(yīng)摻入的堿基與預(yù)期相符，且無(wú)其它干擾峰(見(jiàn)附表4，僅顯示部分結(jié)果)。5.準(zhǔn)確度本檢測(cè)準(zhǔn)確度定義為本檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果同其它實(shí)驗(yàn)室或已知結(jié)果的一致性。本申請(qǐng)納入的dna樣本，采用snapshot測(cè)序法進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。所有檢測(cè)結(jié)果均符合預(yù)期，計(jì)算得到本檢測(cè)準(zhǔn)確度為100％。備注：1.其他樣本的已知結(jié)果是指采用sanger測(cè)序法確定的結(jié)果。2.nmd＝nomutationdetected.表3準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表6.檢測(cè)特異性及檢測(cè)靈敏度本申請(qǐng)檢測(cè)的檢測(cè)特異性定義為陰性符合率，檢測(cè)靈敏度定義為陽(yáng)性符合率。本檢測(cè)使用的引物對(duì)64例樣本進(jìn)行檢測(cè)，所有dna樣本均同其它實(shí)驗(yàn)室結(jié)果或由認(rèn)證組織進(jìn)行評(píng)估，詳細(xì)結(jié)果見(jiàn)表3。檢測(cè)結(jié)果為陰性(耳聾基因22位點(diǎn)均未檢測(cè)到突變)的樣本完全一致，本檢測(cè)的檢測(cè)特異性為100％。檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性(耳聾基因22位點(diǎn)任意一位點(diǎn)檢測(cè)到突變或均檢測(cè)到突變，均認(rèn)為此樣本為突變陽(yáng)性)的樣本完全一致，突變位點(diǎn)及類型也完全一致，本檢測(cè)的檢測(cè)靈敏度為100％。表4檢測(cè)特異性及檢測(cè)靈敏度7.精密度本檢測(cè)的精密度定義為對(duì)標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)得到同一結(jié)果的能力。7.1批內(nèi)精密度本檢測(cè)對(duì)1例陽(yáng)性樣本(其中dfn-pos-1已知結(jié)果為gjb2:c.235delc)進(jìn)行了3復(fù)孔檢測(cè)，結(jié)果顯示，同一樣本不同孔間的檢測(cè)結(jié)果一致。本檢測(cè)的批內(nèi)精密度為100％。表5批內(nèi)精密度樣本編號(hào)孔1孔2孔3dfn-pos-1gjb2:c.235delcgjb2:c.235delcgjb2:c.235delc7.2批間精密度(precision-betweenruns)本檢測(cè)對(duì)1例陽(yáng)性樣本(其中dfn-pos-1已知結(jié)果為gjb2:c.235delc)進(jìn)行了四次檢測(cè)。同一樣本不同批次的檢測(cè)結(jié)果一致。本檢測(cè)批內(nèi)精密度為100％。表6批間精密度注：i：儀器編號(hào)；t：技術(shù)員上述數(shù)據(jù)證明了本申請(qǐng)方法。準(zhǔn)確性、特異性均可以滿足檢測(cè)要求，可以在臨床上替代sanger測(cè)序法。本申請(qǐng)的方法通過(guò)科學(xué)設(shè)計(jì)和搭配引物分組，實(shí)現(xiàn)了在一個(gè)反應(yīng)管中全面檢測(cè)現(xiàn)有技術(shù)遺漏的c.508_511dupaacg,slc26a4-919-2耳聾相關(guān)位點(diǎn)以及其他幾個(gè)高發(fā)位點(diǎn)，具有良好的市場(chǎng)價(jià)值和重要的醫(yī)學(xué)意義。附表:引物擴(kuò)增片段sequencelisting<110>金域<120>檢測(cè)10個(gè)位點(diǎn)耳聾基因多態(tài)性的snapshot試劑盒<160>22<170>patentinversion3.5<210>1<211>22<212>dna<213>人工序列<400>1gagaagtctccctgttctgtcc22<210>2<211>21<212>dna<213>人工序列<400>2acaaagcagtccacagtgttg21<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列<400>3tctcgtatccagcagcaatg20<210>4<211>22<212>dna<213>人工序列<400>4gggttccaggaaattactttgt22<210>5<211>30<212>dna<213>人工序列<400>5aattgtggtaagtagaatatgtagttagaa30<210>6<211>24<212>dna<213>人工序列<400>6aaggagtatcagtgaaatgaagct24<210>7<211>22<212>dna<213>人工序列<400>7ttctatggcaatgtcgatggtt22<210>8<211>23<212>dna<213>人工序列<400>8ctacacaaagggaagagggtcta23<210>9<211>21<212>dna<213>人工序列<400>9gaactctgagcttccagtcaa21<210>10<211>20<212>dna<213>人工序列<400>10gcccatgtatttgccctgtt20<210>11<211>19<212>dna<213>人工序列<400>11tggagcaatgcgggttctt19<210>12<211>25<212>dna<213>人工序列<400>12cttgagatttcacttggttctgtag25<210>13<211>43<212>dna<213>人工序列<400>13tttttttttttttttttttatctcccacatccggctatgggcc43<210>14<211>51<212>dna<213>人工序列<400>14ttttttttttttttttttttttttttgccatgcacgtggcctaccggagac51<210>15<211>59<212>dna<213>人工序列<400>15ttttttttttttttttttttttttttttttctccatgcagcggctggtgaagtgcaacg59<210>16<211>26<212>dna<213>人工序列<400>16ttgccagtgccctgactctgctggtt26<210>17<211>44<212>dna<213>人工序列<400>17tttttttttttttttttttttttatggcagtagcaattatcgtc44<210>18<211>21<212>dna<213>人工序列<400>18aatgtatcaagtccacagtaa21<210>19<211>34<212>dna<213>人工序列<400>19ttttttttttttttaccagaaccttaccacccgc34<210>20<211>59<212>dna<213>人工序列<400>20tttttttttttttttttttttttttttttttttttttgatatagctccacagtcaagca59<210>21<211>41<212>dna<213>人工序列<400>21tttttttttttacttggttctgtagatagagtatagcatca41<210>22<211>47<212>dna<213>人工序列<400>22tttttttttttttttttttttttttagaaaggacacattctttttga47當(dāng)前第1頁(yè)12