發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及用于從纖維素材料生產(chǎn)乙醇的改進(jìn)方法和改進(jìn)的發(fā)酵生物。發(fā)明背景乙醇是通常共混入汽油中的運(yùn)輸燃料。纖維素材料用作乙醇生產(chǎn)方法中的原料。在本領(lǐng)域中存在若干種用于制造包含葡萄糖、甘露糖、木糖和阿拉伯糖的纖維素和半纖維素水解產(chǎn)物的方法。葡萄糖和甘露糖在天然無氧代謝過程中有效地轉(zhuǎn)化為乙醇。到目前為止，最有效的產(chǎn)乙醇微生物是酵母菌釀酒酵母。然而，釀酒酵母缺乏將主要的糖木糖轉(zhuǎn)化為木酮糖所必需的酶，并且因此不能利用木糖作為碳源。這樣做需要釀酒酵母的基因工程以表達(dá)可以將木糖轉(zhuǎn)化為木酮糖的酶。需要的多種酶之一是木糖異構(gòu)酶(e.c.5.3.1.5)，它將木糖轉(zhuǎn)化為木酮糖，然后木酮糖可以在發(fā)酵期間被釀酒酵母轉(zhuǎn)化為乙醇。wo2003/062430披露了將功能性的梨囊鞭菌屬(piromyces)木糖異構(gòu)酶(xi)引入釀酒酵母，通過由xks1編碼的內(nèi)源性木酮糖激酶(ec2.7.1.17)和戊醣磷酸途徑的非氧化部分的酶，允許木糖的緩慢代謝，并且賦予該酵母菌轉(zhuǎn)化體生長在木糖上的能力。美國專利號8,586,336-b2披露了一種表達(dá)由牛瘤胃液而獲得的木糖異構(gòu)酶的釀酒酵母酵母菌菌株。該酵母菌菌株可以用于在厭氧發(fā)酵條件下通過培養(yǎng)來生產(chǎn)乙醇。盡管在過去十年中來自纖維素材料的乙醇生產(chǎn)方法顯著改進(jìn)，但仍然存在提供改進(jìn)方法的希望和需求。為了經(jīng)濟(jì)地生產(chǎn)乙醇，需要一種生物學(xué)有效的發(fā)酵生物。發(fā)明概述本發(fā)明還涉及生產(chǎn)乙醇的方法，該方法包括：(a)用一種纖維素分解酶組合物使一種纖維素材料糖化；(b)用發(fā)酵微生物發(fā)酵糖化的纖維素材料以生產(chǎn)乙醇；其中該發(fā)酵生物是釀酒酵母cibts1260(在美國伊利諾伊州(illinois)61604農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)培養(yǎng)物保藏中心(agriculturalresearchculturecollection,nrrl)登錄號nrrly-50973下保藏)或一種具有與釀酒酵母cibts1260的大致一樣的特性的發(fā)酵生物菌株。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，該方法包括從發(fā)酵中回收乙醇。在一個(gè)實(shí)施例中，該酵母細(xì)胞投料是介于0.1g和20gdwc釀酒酵母cibts1260/l發(fā)酵培養(yǎng)基之間，例如0.2g/l-10g/l，優(yōu)選地是0.3g/l-5g/l，例如0.4g/l，例如1gdwc/l左右或2gdwc/l左右。在另一方面，本發(fā)明涉及具有與釀酒酵母cibts1260(在美國伊利諾伊州(illinois)61604農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)培養(yǎng)物保藏中心(nrrl)登錄號nrrly-50973下保藏)的一樣的特性的重組發(fā)酵生物或具有與釀酒酵母cibts1260的大致一樣的特性的發(fā)酵生物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，具有與釀酒酵母cibts1260的大致一樣的特性的本發(fā)明的發(fā)酵生物具有一個(gè)或多個(gè)，例如所有的，以下特性：-在1gdwc/l、35℃、ph5.5下，48小時(shí)發(fā)酵后，相比bsgx001更高的木糖消耗，特別是如在實(shí)例3中所述；-在1gdwc/l、35℃、ph5.5下，48小時(shí)發(fā)酵后，相比bsgx001更高的葡萄糖消耗，特別是如在實(shí)例3中所述；-在1gdwc/l、35℃、ph5.5下，48小時(shí)發(fā)酵后，相比bsgx001更高的乙醇生產(chǎn)，特別是如在實(shí)例3中所述。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的發(fā)酵生物包括編碼具有在us8586336b2中在seqidno:2或在此seqidno:13中示出的木糖異構(gòu)酶活性的氨基酸序列，或編碼與在us8586336b2中的seqidno:2或在此的seqidno:13至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％一致的氨基酸序列的基因。在該發(fā)酵生物中編碼該木糖異構(gòu)酶的基因可以是在美國專利號8,586,336-b2(通過引用結(jié)合在此)中在seqidno:1或在此的eqidno:20中示出的那一個(gè)，或是與其具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％一致性的序列。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的發(fā)酵生物具有一個(gè)或多個(gè)，例如所有的，以下遺傳修飾：-從牛瘤胃液獲得的木糖異構(gòu)酶基因(ru-xi)，特別是在此seqidno:20中示出的一個(gè)，編碼在此seqidno:13中示出的木糖異構(gòu)酶；-任選地來自中間假絲酵母的一種戊糖轉(zhuǎn)運(yùn)基因(gxf1)，特別是在seqidno:18中示出的那一個(gè)；-木酮糖激酶基因(xks)，特別是來自釀酒酵母的一個(gè)模式株；-核酮糖5磷酸3-差向異構(gòu)酶基因(rpe1)，特別是來自釀酒酵母的一個(gè)模式株；-核酮糖5磷酸異構(gòu)酶基因(rki1)，特別是來自釀酒酵母的一個(gè)模式株；-轉(zhuǎn)酮酶基因(tkl1)和轉(zhuǎn)醛醇酶基因(tal1)，特別是來自釀酒酵母的一個(gè)模式株。在一個(gè)具體實(shí)施例中，該發(fā)酵生物是釀酒酵母cibts1260(在美國伊利諾伊州(illinois)61604農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)培養(yǎng)物保藏中心(nrrl)登錄號nrrly-50973下保藏)。附圖簡述圖1示出容納mgxi和gxf表達(dá)盒的質(zhì)粒pyie2-mgxi-gxf1-δ的質(zhì)粒圖。圖2示出使用psh47-hyg的質(zhì)粒的質(zhì)粒圖。圖3示出生成的質(zhì)粒pyie2-xks1-ppp-δ的圖。圖4示出在1gdcw/l酵母菌投料、35℃、ph5.5下，經(jīng)72小時(shí)，在nrel酸預(yù)處理的玉米秸桿水解產(chǎn)物中的cibts1260對比bsgx001的發(fā)酵比較。圖5示出在模式培養(yǎng)基(2g/l酵母菌投料、32℃、ph5.5、72小時(shí))中釀酒酵母對比bsgx001的比較。圖6示出經(jīng)72小時(shí)，以1g/l酵母菌投料，與cibts1260一起的纖維素分解酶組合物ca和纖維素分解酶組合物cb產(chǎn)生的甘蔗渣水解產(chǎn)物的發(fā)酵比較。圖7示出在1g/l酵母菌投料、35℃、ph5.5下，72小時(shí)，在用纖維素酶ca或cb產(chǎn)生的水解產(chǎn)物的發(fā)酵期間，dp2濃度的降低百分比。發(fā)明詳細(xì)說明本發(fā)明提供了用于使用一種發(fā)酵生物，從木質(zhì)纖維素材料中生產(chǎn)乙醇的改進(jìn)方法。定義輔助活性9：術(shù)語“輔助活性9”或“aa9”意指分類為溶解性多糖單加氧酶(昆蘭(quinlan)等人，2011，美國科學(xué)院院刊(proc.natl.acad.sci.usa)208:15079-15084；菲利普斯(phillips)等人，2011，acs化學(xué)生物學(xué)(acschem.biol.)6:1399-1406；林(lin)等人，2012，結(jié)構(gòu)(structure)20:1051-1061)的多肽。根據(jù)亨利薩特(henrissat)，1991，生物化學(xué)雜志(biochem.j.)280:309-316；以及亨利薩特(henrissat)和貝洛赫(bairoch)，1996，生物化學(xué)雜志(biochem.j.)316:695-696，aa9多肽之前被分類為糖苷水解酶家族61(gh61)。aa9多肽通過具有纖維素分解活性的酶增強(qiáng)纖維素材料的水解?？梢酝ㄟ^測量在以下條件下來自由纖維素分解酶水解纖維素材料的還原糖的增加或纖維二糖與葡萄糖總量的增加來測定纖維素分解增強(qiáng)活性：1-50mg總蛋白/g預(yù)處理的玉米秸稈(pcs)中的纖維素，其中總蛋白包括50％-99.5％w/w纖維素分解酶蛋白和0.5％-50％w/waa9多肽蛋白，在適合的溫度(例如40℃-80℃，例如，50℃、55℃、60℃、65℃、或70℃)、和適合的ph(例如4-9，例如，4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、或8.5)下持續(xù)1-7天，與不具有纖維素分解增強(qiáng)活性的相等的總蛋白負(fù)載的對照水解(1-50mg纖維素分解蛋白/gpcs中的纖維素)進(jìn)行比較?？梢允褂胏elluclasttm1.5l(諾維信公司，巴格斯瓦德(bagsvaerd)，丹麥)和β-葡糖苷酶的混合物作為纖維素分解活性的來源來測定aa9多肽增強(qiáng)活性，其中該β-葡糖苷酶是以纖維素酶蛋白負(fù)載的至少2％-5％蛋白的重量存在的。在一方面，該β-葡糖苷酶是米曲霉β-葡糖苷酶(例如，根據(jù)wo02/095014，在米曲霉中重組產(chǎn)生的)。在另一方面，該β-葡糖苷酶是煙曲霉β-葡糖苷酶(例如，如在wo02/095014中描述的，在米曲霉中重組產(chǎn)生的)。aa9多肽增強(qiáng)活性還可通過以下來確定：在40℃下，將aa9多肽與0.5％磷酸溶脹纖維素(pasc)、100mm乙酸鈉(ph5)、1mmmnso4、0.1％沒食子酸、0.025mg/ml的煙曲霉β-葡糖苷酶，以及0.01％x-100(4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇)一起孵育24-96小時(shí)，接著測定從pasc釋放的葡萄糖。還可以根據(jù)wo2013/028928測定高溫組合物的aa9多肽增強(qiáng)活性。aa9多肽通過將達(dá)到相同的水解程度所需要的纖維素分解酶的量降低優(yōu)選至少1.01倍，例如，至少1.05倍、至少1.10倍、至少1.25倍、至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、或至少20倍，來增強(qiáng)由具有纖維素分解活性的酶催化的纖維素材料的水解。β-葡糖苷酶：術(shù)語“β-葡糖苷酶”意指一種β-d-葡糖苷葡糖水解酶(e.c.3.2.1.21)，其催化末端非還原性β-d-葡萄糖殘基的水解，并釋放β-d-葡萄糖?？梢愿鶕?jù)文丘里(venturi)等人，2002，基礎(chǔ)微生物學(xué)雜志(j.basicmicrobiol.)42:55-66的程序，使用對硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷作為底物來測定β-葡糖苷酶活性。一個(gè)單位的β-葡糖苷酶被定義為25℃，ph4.8下，在包含0.01％20的50mm檸檬酸鈉中，從作為底物的1mm對硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷每分鐘產(chǎn)生1.0微摩爾的對硝基酚根陰離子。β-木糖苷酶：術(shù)語“β-木糖苷酶”意指催化短β(1→4)-木寡糖的外切水解，以從非還原末端去除連續(xù)的d-木糖殘基的β-d-木糖苷木糖水解酶(e.c.3.2.1.37)?？梢栽诎?.01％20的100mm檸檬酸鈉中，在ph5、40℃下，使用1mm對硝基苯基-β-d-木糖苷作為底物確定β-木糖苷酶活性。將一個(gè)單位的β-木糖苷酶定義為在40℃、ph5下，在含有0.01％20的100mm檸檬酸鈉中從1mm對硝基苯基-β-d-木糖苷每分鐘產(chǎn)生1.0微摩爾的對硝基酚根陰離子。過氧化氫酶：術(shù)語“過氧化氫酶”意指過氧化氫：過氧化氫氧化還原酶(ec1.11.1.6)，該酶催化2h2o2轉(zhuǎn)化為o2+2h2o。出于本發(fā)明的目的，根據(jù)美國專利號5,646,025確定過氧化氫酶活性。一個(gè)單位的過氧化氫酶活性等于在測定條件下催化1微摩爾的過氧化氫氧化的酶的量。纖維二糖水解酶：該術(shù)語“纖維二糖水解酶”意指一種1,4-β-d-葡聚糖纖維二糖水解酶(e.c.3.2.1.91和e.c.3.2.1.176)，其催化纖維素、纖維寡糖、或任何含有β-1,4-連接葡萄糖的聚合物中的1,4-β-d-糖苷鍵的水解，從而從鏈的還原性末端(纖維二糖水解酶i)或非還原性末端(纖維二糖水解酶ii)釋放纖維二糖(泰里(teeri)，1997，生物技術(shù)趨勢(trendsinbiotechnology)15:160-167；泰里等人，1998，生物化學(xué)學(xué)會(huì)會(huì)刊(biochem.soc.trans.)26:173-178)?？梢愿鶕?jù)里弗(lever)等人，1972，分析生物化學(xué)(anal.biochem.)47:273-279；范·帝伯赫(vantilbeurgh)等人，1982，歐洲生化學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)快報(bào)(febsletters)，149:152-156；范·帝伯赫和克萊森斯(claeyssens)，1985，歐洲生化學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)快報(bào)，187:283-288；以及湯美(tomme)等人，1988，歐洲生物化學(xué)雜志(eur.j.biochem.)170:575-581所描述的程序來測定纖維二糖水解酶活性。纖維素分解酶組合物或纖維素酶：術(shù)語“纖維素分解酶組合物”或“纖維素酶”意指水解纖維素材料的一種或多種(例如若干種)酶。此類酶包括一種或多種內(nèi)切葡聚糖酶、一種或多種纖維二糖水解酶、一種或多種β-葡糖苷酶、或其組合。用于測量纖維素分解酶活性的兩種基本方法包括：(1)測量總纖維素分解酶活性，以及(2)測量單獨(dú)的纖維素分解酶活性(內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、和β-葡糖苷酶)，如在張(zhang)等人，2006，生物技術(shù)進(jìn)展(biotechnologyadvances)24:452-481中所述的?？墒褂貌蝗苄缘孜?，包括沃特曼(whatman)№1濾紙、微晶纖維素、細(xì)菌纖維素、藻類纖維素、棉花、預(yù)處理的木質(zhì)纖維素等，測量總纖維素分解酶活性。最常用的總纖維素分解活性測定是使用沃特曼№1濾紙作為底物的濾紙測定。該測定法是由國際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)(iupac)建立的(高斯(ghose)，1987，純粹與應(yīng)用化學(xué)(pureappl.chem.)59:257-68)?？梢酝ㄟ^測量在以下條件下，由一種或多種纖維素分解酶進(jìn)行的纖維素材料水解期間，糖的產(chǎn)生/釋放的增加來確定纖維素分解酶活性：1-50mg纖維素分解酶蛋白/g預(yù)處理的玉米秸稈(pcs)中的纖維素(或其他預(yù)處理的纖維素材料)，在適合的溫度(例如40℃-80℃，例如，50℃、55℃、60℃、65℃、或70℃)，以及在適合的ph(例如4-9，例如，5.0、5.5、6.0、6.5、或7.0)下持續(xù)3-7天，與未添加纖維素分解酶蛋白的對照水解相比。典型條件為：1ml反應(yīng)，洗滌或未洗滌的pcs，5％不溶性固體(干重)，50mm乙酸鈉(ph5)，1mmmnso4，50℃、55℃、或60℃，72小時(shí)，通過hpx-87h柱層析(伯樂實(shí)驗(yàn)室有限公司(bio-radlaboratories,inc.)，赫拉克勒斯(hercules)，加利福尼亞州，美國)進(jìn)行糖分析。纖維素材料：術(shù)語“纖維素材料”意指包含纖維素的任何材料。生物質(zhì)的初生細(xì)胞壁中的主要多糖是纖維素，第二豐富的是半纖維素，而第三豐富的是果膠。細(xì)胞停止生長后產(chǎn)生的次生細(xì)胞壁也包含多糖，并且它通過與半纖維素共價(jià)交聯(lián)的聚合木質(zhì)素得到強(qiáng)化。纖維素是脫水纖維二糖的均聚物，因此是線性β-(1-4)-d-葡聚糖，而半纖維素包括多種化合物，如具有一系列取代基以復(fù)雜支鏈結(jié)構(gòu)存在的木聚糖、木葡聚糖、阿拉伯糖基木聚糖、以及甘露聚糖。盡管纖維素一般為多態(tài)的，但發(fā)現(xiàn)其在植物組織中主要以平行葡聚糖鏈的不溶性晶體基質(zhì)存在。半纖維素通常氫鍵合至纖維素以及其他半纖維素，這有助于穩(wěn)定細(xì)胞壁基質(zhì)。纖維素通常見于例如植物的莖、葉、殼、皮、以及穗軸，或樹的葉、枝、以及木材中。纖維素材料可以是，但不限于：農(nóng)業(yè)廢棄物、草本材料(包括能源作物)、城市固體廢物、紙漿和造紙廠廢棄物、廢紙、和木材(包括林業(yè)廢棄物)(參見例如維塞勞格爾(wiselogel)等人，1995，生物乙醇手冊(handbookonbioethanol)(查爾斯e.懷曼(charlese.wyman)，編著)中，第105-118頁，泰勒-弗朗西斯出版集團(tuán)(taylor&francis)，華盛頓特區(qū)；懷曼(wyman)，1994，生物資源技術(shù)(bioresourcetechnology)50:3-16；林德(lynd)，1990，應(yīng)用生物化學(xué)與生物技術(shù)(appliedbiochemistryandbiotechnology)24/25:695-719；馬塞爾(mosier)等人，1999，木質(zhì)纖維素的生物轉(zhuǎn)化的最近進(jìn)展，生物化學(xué)工程/生物技術(shù)進(jìn)展(advancesinbiochemicalengineering/biotechnology)，斯卡皮爾(t.scheper)，總編輯，第65卷，第23-40頁，施普林格出版公司(springer-verlag)，紐約)。在此應(yīng)該理解的是，纖維素可以處于木素纖維素，在混合基質(zhì)中包含木質(zhì)素、纖維素、和半纖維素的植物細(xì)胞壁材料的形式。在一方面，該纖維素材料是任何生物質(zhì)材料。在另一方面，該纖維素材料是木質(zhì)纖維素，該木質(zhì)纖維素包括纖維素、半纖維素、以及木質(zhì)素。在一個(gè)實(shí)施例中，該纖維素材料是農(nóng)業(yè)廢棄物、草本材料(包括能源作物)、城市固體廢物、紙漿和造紙廠廢棄物、廢紙或木材(包括林業(yè)廢棄物)。在另一實(shí)施例中，該纖維素材料是蘆竹、甘蔗渣、竹子、玉米芯、玉米纖維、玉米秸稈、芒屬、稻秸、柳枝稷或麥秸。在另一實(shí)施例中，該纖維素材料是山楊、桉樹、冷杉、松樹、白楊、云杉或柳樹。在另一實(shí)施例中，該纖維素材料是海藻纖維素、細(xì)菌纖維素、棉短絨、濾紙、微晶纖維素(例如，)、或經(jīng)磷酸處理的纖維素。在另一實(shí)施例中，纖維素材料是一種水生生物質(zhì)。如在此所用的，術(shù)語“水生生物質(zhì)(aquaticbiomass)”是指在水生環(huán)境中通過光合作用過程產(chǎn)生的生物質(zhì)。水生生物質(zhì)可以是藻類、挺水植物、浮葉植物、或沉水植物。纖維素材料可以按原樣使用或可以使用本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法進(jìn)行預(yù)處理，如在此所描述。在一優(yōu)選方面，對該纖維素材料進(jìn)行預(yù)處理。內(nèi)切葡聚糖酶：術(shù)語“內(nèi)切葡聚糖酶”意指4-(1,3；1,4)-β-d-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(e.c.3.2.1.4)，其催化纖維素、纖維素衍生物(如羧甲基纖維素和羥乙基纖維素)、地衣多糖中的1,4-β-d-糖苷鍵和混合β-1,3-1,4葡聚糖如谷物β-d-葡聚糖或木葡聚糖以及包含纖維素組分的其他植物材料中的β-1,4鍵的內(nèi)切水解?？梢酝ㄟ^測量底物粘度的降低或通過還原糖測定所確定的還原性末端的增加來確定內(nèi)切葡聚糖酶活性(張(zhang)等人，2006，生物技術(shù)進(jìn)展(biotechnologyadvances)24:452-481)。還可以根據(jù)高斯(ghose)，1987，純粹與應(yīng)用化學(xué)(pureandappl.chem.)59:257-268的程序，在ph5、40℃下，使用羧甲基纖維素(cmc)作為底物測定內(nèi)切葡聚糖酶活性。半纖維素分解酶或半纖維素酶：術(shù)語“半纖維素分解酶”或“半纖維素酶”是指水解半纖維素材料的一種或多種(例如，若干種)酶。參見例如，沙魯姆(shallom)和沙哈姆(shoham)，2003，微生物學(xué)當(dāng)前觀點(diǎn)(currentopinioninmicrobiology)6(3):219-228)。半纖維素酶是在植物生物質(zhì)的降解中的關(guān)鍵組分。半纖維素酶的實(shí)例包括但不局限于乙?；事毒厶酋ッ?、乙酰基木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶、以及木糖苷酶。這些酶的底物，半纖維素是支鏈和直鏈多糖的異質(zhì)性組，其可通過氫鍵與植物細(xì)胞壁中的纖維素微纖維相結(jié)合，交聯(lián)成堅(jiān)固的網(wǎng)絡(luò)。半纖維素還共價(jià)附接至木質(zhì)素，從而與纖維素一起形成高度復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。半纖維素的可變結(jié)構(gòu)和組織要求許多酶的協(xié)同作用以使其完全降解。半纖維素酶的催化模塊是水解糖苷鍵的糖苷水解酶(gh)，或是水解乙酸或阿魏酸側(cè)基的酯鍵的碳水化合物酯酶(ce)。這些催化模塊基于它們一級序列的同源性，可以被分配到gh和ce家族中。具有總體相似的折疊的一些家族可以進(jìn)一步被分組為以字母標(biāo)記的氏族(例如，gh-a)。在碳水化合物活性酶(cazy)數(shù)據(jù)庫中可得到這些酶以及碳水化合物活性酶的最翔實(shí)和更新的分類。可以根據(jù)高斯(ghose)和比賽亞(bisaria)，1987，純粹與應(yīng)用化學(xué)(pure&appi.chem.)59:1739-1752，在適合的溫度(例如40℃-80℃，例如，50℃、55℃、60℃、65℃、或70℃)以及適合的ph(例如4-9，例如，5.0、5.5、6.0、6.5、或7.0)下測量半纖維素分解酶活性。預(yù)處理的玉米秸桿：術(shù)語“預(yù)處理的玉米秸桿”或“pcs”意指通過熱和稀硫酸處理、堿預(yù)處理、中性預(yù)處理、或本領(lǐng)域已知的任何預(yù)處理從玉米秸桿得到的纖維素材料。包含木聚糖的材料：術(shù)語“包含木聚糖的材料”意指包含包含β-(1-4)連接的木糖殘基主鏈的植物細(xì)胞壁多糖的任何材料。陸生植物的木聚糖是具有β-(1-4)-d-吡喃木糖主鏈的雜聚物，其通過短的碳水化合物鏈分支。它們包括d-葡糖醛酸或其4-o-甲基醚、l-阿拉伯糖、和/或不同的低聚糖，這些低聚糖由d-木糖、l-阿拉伯糖、d-或l-半乳糖、以及d-葡萄糖構(gòu)成?？梢詫⒛揪厶穷愋偷亩嗵欠殖赏茨揪厶?homoxylan)和異源木聚糖(heteroxylan)，包括葡糖醛酸木聚糖、(阿拉伯糖)葡糖醛酸木聚糖、(葡糖醛酸)阿拉伯糖基木聚糖、阿拉伯糖基木聚糖、以及復(fù)雜的異源木聚糖。參見，例如，埃伯林格羅瓦(ebringerova)等人，2005，聚合物科學(xué)進(jìn)展(adv.polym.sci.)186:1-67。在本發(fā)明的方法中，可以使用包含木聚糖的任何材料。在一優(yōu)選方面，包含木聚糖的材料是纖維素材料。木聚糖降解活性或木聚糖分解活性：術(shù)語“木聚糖降解活性”或“木聚糖分解活性”意指水解包含木聚糖的材料的生物活性。用于測量木聚糖分解活性的兩種基本方法包括：(1)測量總木聚糖分解活性，和(2)測量單獨(dú)的木聚糖分解活性(例如內(nèi)切木聚糖酶、β-木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡糖醛酸糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、以及α-葡糖醛酸酯酶)。木聚糖分解酶的測定的最近進(jìn)展總結(jié)于若干出版物中，這些出版物包括別雷(biely)和普查德(puchard)，2006，食品與農(nóng)業(yè)科學(xué)雜志(journalofthescienceoffoodandagriculture)86(11):1636-1647；斯帕尼克娃(spanikova)和別雷(biely)，2006，歐洲生化學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)快報(bào)(febsletters)580(19):4597-4601；赫爾曼(herrimann)等人，1997，生物化學(xué)雜志(biochemicaljournal)321:375-381?？梢酝ㄟ^確定由不同類型的木聚糖，包括例如燕麥木聚糖、山毛櫸木材木聚糖、和落葉松木材木聚糖形成的還原糖，或者通過光度確定從不同共價(jià)染色的木聚糖釋放的染色的木聚糖片段，測量總木聚糖降解活性。一種常見的總木聚糖分解活性測定是基于由聚合4-o-甲基葡糖醛酸木聚糖產(chǎn)生還原糖，如描述于別雷(biely)等人，1992，用于木聚糖酶活性測定的多個(gè)實(shí)驗(yàn)室測試方法(interlaboratorytestingofmethodsforassayofxylanaseactivity)，生物技術(shù)雜志(journalofbiotechnology)23(3):257-270中。木聚糖酶活性還可以在37℃下在0.01％x-100和200mm磷酸鈉(ph6)中用0.2％azcl-阿拉伯糖基木聚糖作為底物來確定。將一個(gè)單位的木聚糖酶活性定義為在37℃、ph6下，在200mm磷酸鈉(ph6)中從作為底物的0.2％azcl-阿拉伯糖基木聚糖每分鐘產(chǎn)生1.0微摩爾天青蛋白。還可以通過測量在以下典型條件下由一種或多種木聚糖降解酶引起的樺木木聚糖(西格瑪化學(xué)有限公司(sigmachemicalco.,inc.)，圣路易斯，密蘇里州，美國)水解的增加來確定木聚糖降解活性：1ml反應(yīng)，5mg/ml底物(總固形物)，5mg的木聚糖分解蛋白/g的底物，50mm的乙酸鈉(ph5)，50℃，24小時(shí)，使用對羥基苯甲酸酰肼(phbah)測定法的糖分析，如萊韋爾(lever)，1972，分析生物化學(xué)(anal.biochem.)47:273-279中所述的。木聚糖酶：術(shù)語“木聚糖酶”意指一種1,4-β-d-木聚糖-木糖水解酶(e.c.3.2.1.8)，其催化木聚糖中的1,4-β-d-木糖苷鍵的內(nèi)切水解。木聚糖酶活性可以在37℃下在0.01％x-100和200mm磷酸鈉(ph6)中用0.2％azcl-阿拉伯糖基木聚糖作為底物來確定。將一個(gè)單位的木聚糖酶活性定義為在37℃、ph6下，在200mm磷酸鈉(ph6)中從作為底物的0.2％azcl-阿拉伯糖基木聚糖每分鐘產(chǎn)生1.0微摩爾天青蛋白。木糖異構(gòu)酶：術(shù)語“木糖異構(gòu)酶”或“xi”意指可以在體內(nèi)將d-木糖催化為d-木酮糖，并且在體外將d-葡萄糖轉(zhuǎn)化為d-果糖的酶。木糖異構(gòu)酶也稱為“葡萄糖異構(gòu)酶”，并且被分類為e.c.5.3.1.5。由于該酶的結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定，木糖異構(gòu)酶是用于研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能之間的關(guān)系的良好模型之一(芟牧(karimaki)等人，蛋白質(zhì)工程、設(shè)計(jì)與選擇(proteinengdessel)，12004,17(12):861-869)。此外，極其重要的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值使得木糖異構(gòu)酶被視為重要的工業(yè)酶，如蛋白酶和淀粉酶(田申(tianshen)等人，微生物學(xué)通報(bào)(microbiologybulletin)，2007,34(2):355-358；博薩萊(bhosale)等人，微生物學(xué)評論(microbiolrev)，1996,60(2):280-300)?？茖W(xué)家保持高度關(guān)注并對木糖異構(gòu)酶進(jìn)行了廣泛的研究。自20世紀(jì)70年代以來，木糖異構(gòu)酶的應(yīng)用已經(jīng)集中在高果糖漿和燃料乙醇的生產(chǎn)。近年來，科學(xué)家已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在某些條件下，木糖異構(gòu)酶可用于生產(chǎn)許多重要的稀有糖，它們是制藥工業(yè)中的生產(chǎn)材料，例如核糖、甘露糖、阿拉伯糖和來蘇糖(芟牧(karlmaki)等人，蛋白質(zhì)工程、設(shè)計(jì)與選擇(proteinengdessel)12004,17(12):861-869)。這些發(fā)現(xiàn)為木糖異構(gòu)酶的研究帶來了新的活力。本發(fā)明的方法本發(fā)明還涉及生產(chǎn)乙醇的方法，該方法包括：(a)用一種纖維素分解酶組合物使一種纖維素材料糖化；(b)用發(fā)酵微生物發(fā)酵該經(jīng)糖化的纖維素材料以生產(chǎn)乙醇；其中該發(fā)酵生物是釀酒酵母cibts1260(在美國伊利諾伊州(illinois)61604農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)培養(yǎng)物保藏中心(nrrl)登錄號nrrly-50973下保藏)或一種具有與釀酒酵母cibts1260的大致一樣的特性的發(fā)酵生物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，該方法包括從發(fā)酵培養(yǎng)基中回收乙醇。根據(jù)本發(fā)明的纖維素材料的加工可以使用本領(lǐng)域常規(guī)的方法來完成。此外，本發(fā)明的方法可以使用被配置成根據(jù)本發(fā)明來操作的任何常規(guī)生物質(zhì)加工設(shè)備來實(shí)施。分開或同時(shí)的糖化(即，水解)和發(fā)酵包括但不限于：分開水解和發(fā)酵(shf)；同時(shí)糖化和發(fā)酵(ssf)；同時(shí)糖化和共發(fā)酵(sscf)；雜合的水解和發(fā)酵(hhf)；分開水解和共發(fā)酵(shcf)；雜合的水解和共發(fā)酵(hhcf)。shf使用分開的處理步驟，以首先將纖維素材料酶促水解為可發(fā)酵糖(例如，葡萄糖、纖維二糖、以及戊糖單體)，并且然后將可發(fā)酵糖發(fā)酵為乙醇。在ssf中，纖維素材料的酶水解和糖發(fā)酵成乙醇被組合在一個(gè)步驟中(菲利皮迪斯·g.p.(philippidis,g.p.)，1996，纖維素生物轉(zhuǎn)化技術(shù)(cellulosebioconversiontechnology)，生物乙醇手冊：生產(chǎn)和利用(handbookonbioethanol:productionandutilization)，懷曼·c.e(wyman,c.e.)編輯，泰勒-弗朗西斯出版集團(tuán)(taylor&francis)，華盛頓特區(qū)(washington,dc)，179-212))。sscf涉及多種糖的共發(fā)酵(希恩(sheehan)和希默爾(himmel)，1999，生物技術(shù)進(jìn)展(biotechnol.prog.)15:817-827)。hhf涉及一個(gè)分開的水解步驟，并且另外涉及一個(gè)同時(shí)糖化和水解步驟，這些步驟可以在同一反應(yīng)器中進(jìn)行。hhf過程中的步驟可以在不同的溫度下進(jìn)行，即高溫酶糖化，隨后在發(fā)酵生物耐受的更低溫度下進(jìn)行ssf。在此應(yīng)理解的是，本領(lǐng)域中已知的包括預(yù)處理、酶法水解(糖化)、發(fā)酵、或其組合的任何方法，可以用于實(shí)施本發(fā)明的方法。常規(guī)的裝置可以包括一個(gè)分批補(bǔ)料攪拌反應(yīng)器、一個(gè)批式攪拌反應(yīng)器、一個(gè)具有超濾作用的連續(xù)流攪拌反應(yīng)器、和/或一個(gè)連續(xù)活塞流柱式反應(yīng)器(continuousplug-flowcolumnreactor)(德卡斯特胡斯克拉茲(decastilhoscorazza)等人，2003，技術(shù)學(xué)報(bào)(actascientiarum.technology)25:33-38；古薩考瓦(gusakov)和斯尼特森(sinitsyn)，1985，酶學(xué)與微生物學(xué)技術(shù)(enz.microb.technol.)7:346-352)，一個(gè)碾磨反應(yīng)器(劉(ryu)和李(lee)，1983，生物技術(shù)與生物工程(biotechnol.bioeng.)25:53-65)。另外的反應(yīng)器類型包括：用于水解和/或發(fā)酵的流化床反應(yīng)器、升流層(upflowblanket)反應(yīng)器、固定化反應(yīng)器、以及擠出機(jī)型反應(yīng)器。預(yù)處理在一個(gè)實(shí)施例中，在步驟(a)中的糖化之前對纖維素材料進(jìn)行預(yù)處理。在實(shí)踐本發(fā)明的方法中，可以使用本領(lǐng)域中已知的任何預(yù)處理方法來破壞纖維素材料的植物細(xì)胞壁組分(錢德拉(chandra)等人，2007，生化工程/生物技術(shù)進(jìn)展(adv.biochem.engin./biotechnol.)108:67-93；蓋博(galbe)和小林(zacchi)，2007，生化工程/生物技術(shù)進(jìn)展，108:41-65；亨德里克斯(hendriks)和塞曼(zeeman)，2009，生物資源技術(shù)(bioresourcetechnology)100:10-18；莫西爾(mosier)等人，2005，生物資源技術(shù)96:673-686；泰和拉德(taherzadeh)和卡里米(karimi)，2008，分子科學(xué)國際雜志(int.j.mol.sci.)9:1621-1651；楊(yang)和懷曼，2008，生物燃料，生物產(chǎn)品和生物精制biofpr.(biofuelsbioproductsandbiorefining-biofpr.)2:26-40)。在使用本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行預(yù)處理之前，纖維素材料還可以經(jīng)受顆粒粒度減小、篩分、預(yù)浸泡、濕潤、洗滌和/或調(diào)理。常規(guī)的預(yù)處理包括但不限于，蒸汽預(yù)處理(伴隨或不伴隨爆炸)、稀酸預(yù)處理、熱水預(yù)處理、堿性預(yù)處理、石灰預(yù)處理、濕氧化、濕爆炸、氨纖維爆炸、有機(jī)溶劑預(yù)處理和生物預(yù)處理。另外的預(yù)處理包括氨滲濾、超聲、電穿孔、微波、超臨界co2、超臨界h2o、臭氧、離子液體以及γ輻射預(yù)處理。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，在糖化(即，水解)和/或發(fā)酵之前對纖維素材料進(jìn)行預(yù)處理。預(yù)處理優(yōu)選在水解前進(jìn)行?？商娲?，預(yù)處理可以與酶水解同時(shí)進(jìn)行，以釋放可發(fā)酵的糖，例如葡萄糖、木糖、和/或纖維二糖。在多數(shù)情況下，預(yù)處理步驟自身導(dǎo)致將生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵糖(甚至在不存在酶的情況下)。蒸汽預(yù)處理。在蒸汽預(yù)處理中，加熱纖維素材料以破壞植物細(xì)胞壁組分，包括木質(zhì)素、半纖維素、和纖維素以使纖維素和其他級分，例如半纖維素可接近酶。纖維素材料經(jīng)過或穿過反應(yīng)容器，將蒸汽注入該反應(yīng)容器以增加溫度至所需溫度和壓力，并且將蒸汽保持在其中持續(xù)希望的反應(yīng)時(shí)間。優(yōu)選在140℃-250℃，例如160℃-200℃或170℃-190℃進(jìn)行蒸汽預(yù)處理，其中最佳溫度范圍取決于化學(xué)催化劑的任選添加。蒸汽預(yù)處理的停留時(shí)間優(yōu)選是1-60分鐘，例如1-30分鐘、1-20分鐘、3-12分鐘、或4-10分鐘，其中最適停留時(shí)間取決于溫度和化學(xué)催化劑的任選添加。蒸汽預(yù)處理允許相對較高的固體加載量，這樣使得纖維素材料在預(yù)處理過程中通常僅變得潮濕。蒸汽預(yù)處理經(jīng)常與預(yù)處理后的材料的爆炸放料組合，這被稱為蒸汽爆炸，即，快速閃變至大氣壓和材料湍流，以通過破碎增加可及的表面積(達(dá)夫(duff)和默里(murray)，1996，生物資源技術(shù)(bioresourcetechnology)855:1-33；蓋博(galbe)和小林(zacchi)，2002，應(yīng)用微生物學(xué)與生物技術(shù)(appl.microbiol.biotechnol.)59:618-628；美國專利申請?zhí)?002/0164730)。在蒸汽預(yù)處理過程中，半纖維素乙?；涣呀猓⑶业玫降乃嶙源呋肜w維素部分水解成單糖和寡糖。僅在有限的程度上去除木質(zhì)素?；瘜W(xué)預(yù)處理。術(shù)語“化學(xué)處理”是指促進(jìn)纖維素、半纖維素、和/或木質(zhì)素的分離和/或釋放的任何化學(xué)預(yù)處理。這種預(yù)處理可以將結(jié)晶纖維素轉(zhuǎn)化為無定形纖維素。適合的化學(xué)預(yù)處理方法的實(shí)例包括例如稀酸預(yù)處理、石灰預(yù)處理、濕法氧化、氨纖維/冷凍膨脹(afex)、氨滲濾(apr)、離子液體、以及有機(jī)溶劑預(yù)處理。有時(shí)在蒸汽預(yù)處理之前添加化學(xué)催化劑，例如h2so4或so2(典型地是0.3％至5％w/w)，該催化劑減少時(shí)間并降低溫度、增加回收率、并改進(jìn)酶水解(巴列斯特羅斯(ballesteros)等人，2006，應(yīng)用生物化學(xué)與生物技術(shù)(appl.biochem.biotechnol.)129-132:496-508；瓦爾加(varga)等人，2004，應(yīng)用生物化學(xué)與生物技術(shù)(appl.biochem.biotechnol.)113-116:509-523；塞斯尼爾(sassner)等人，2006，酶與微生物技術(shù)(enzymemicrob.technol.)39:756-762)。在稀酸預(yù)處理中，將纖維素材料與稀酸(典型地是h2so4)和水混合，以形成漿料，由蒸汽加熱至希望的溫度，并且在停留時(shí)間后閃變至大氣壓?？刹捎枚喾N反應(yīng)器設(shè)計(jì)來進(jìn)行稀酸預(yù)處理，例如，活塞流反應(yīng)器、逆流反應(yīng)器或連續(xù)逆流收縮床反應(yīng)器(達(dá)夫(duff)和默里(murray)，1996，生物資源技術(shù)(bioresourcetechnology)855:1-33；謝爾(schell)等人，2004，生物資源技術(shù)(bioresourcetechnology)91:179-188；李(lee)等人，1999，生物化學(xué)工程/生物技術(shù)進(jìn)展(adv.biochem.eng.biotechnol.)65:93-115)。在一個(gè)具體實(shí)施例中，在180℃下使用4％w/w硫酸持續(xù)5分鐘來進(jìn)行纖維素材料的稀酸預(yù)處理。還可以使用堿性條件下的若干種預(yù)處理方法。這些堿性預(yù)處理包括但不限于：氫氧化鈉、石灰、濕氧化、氨滲濾(apr)、以及氨纖維/冷凍膨脹(afex)預(yù)處理。用氧化鈣或氫氧化鈣在溫度85℃-150℃下進(jìn)行石灰預(yù)處理，停留時(shí)間是從1小時(shí)至若干天(懷曼(wyman)等人，2005，生物資源技術(shù)(bioresourcetechnol.)96:1959-1966；莫西爾(mosier)等人，2005，生物資源技術(shù)(bioresourcetechnology)，96:673-686)。wo2006/110891、wo2006/110899、wo2006/110900、和wo2006/110901披露了使用氨的預(yù)處理方法。濕氧化是典型地在添加如過氧化氫等氧化劑或過壓的氧氣、在180℃-200℃下進(jìn)行5-15分鐘的熱預(yù)處理(施密特(schmidt)和湯姆森(thomsen)，1998，生物資源技術(shù)(bioresourcetechnol.)64:139-151；帕隆恩(palonen)等人，2004，應(yīng)用生物化學(xué)與生物技術(shù)(appl.biochem.biotechnol.)117:1-17；瓦爾加(varga)等人，2004，生物技術(shù)與生物工程(biotechnol.bioeng.)88:567-574；馬丁(martin)等人，2006，化學(xué)技術(shù)與生物技術(shù)雜志(j.chem.technol.biotechnol.)81:1669-1677)。預(yù)處理優(yōu)選以1％-40％干物質(zhì)，例如2％-30％干物質(zhì)，或5％-20％干物質(zhì)進(jìn)行，并且由于添加堿如碳酸鈉，初始ph經(jīng)常會(huì)增加。被稱為濕爆炸(濕氧化和蒸汽爆炸的組合)的濕氧化預(yù)處理方法的修改方案能夠處理高達(dá)30％的干物質(zhì)。在濕爆炸中，在某一停留時(shí)間后，在預(yù)處理期間引入氧化劑。然后通過急驟蒸發(fā)至大氣壓結(jié)束預(yù)處理(wo2006/032282)。氨纖維膨脹(afex)涉及用液體或氣體氨在適中的溫度(例如90℃-150℃)和高壓(例如17-20巴)處理纖維素材料，持續(xù)5-10分鐘，其中干物質(zhì)含量可以高達(dá)60％(戈拉帕里(gollapalli)等人，2002，應(yīng)用生物化學(xué)與生物技術(shù)(appl.biochem.biotechnol.)98:23-35；丘恩達(dá)瓦特(chundawat)等人，2007，生物技術(shù)和生物工程(biotechnol.bioeng.)96:219-231；阿里扎德(alizadeh)等人，2005，應(yīng)用生物化學(xué)與生物技術(shù)(appl.biochem.biotechnol.)121:1133-1141；泰莫里(teymouri)等人，2005，生物資源技術(shù)(bioresourcetechnol.)96:2014-2018)。在afex預(yù)處理期間，纖維素和半纖維素保持相對完整。木質(zhì)素-碳水化合物復(fù)合物被裂解。有機(jī)溶劑預(yù)處理可通過使用乙醇水溶液(40％-60％ethanol)在160℃-200℃下萃取30-60分鐘使纖維素材料去木質(zhì)化(潘(pan)等人，2005，生物技術(shù)與生物工程(biotechnol.bioeng.)90:473-481；潘等人，2006，生物技術(shù)與生物工程(biotechnol.bioeng.)94:851-861；酷比(kurabi)等人，2005，應(yīng)用生物化學(xué)與生物技術(shù)(appl.biochem.biotechnol.)121:219-230)。通常添加硫酸作為催化劑。在有機(jī)溶劑預(yù)處理中，大部分半纖維素和木質(zhì)素被去除。適合的預(yù)處理方法的其他實(shí)例由謝爾(schell)等人，2003，應(yīng)用生物化學(xué)與生物技術(shù)(appl.biochem.biotechnol.)105-108:69-85，和馬塞爾(mosier)等人，2005，生物資源技術(shù)(bioresourcetechnology)96:673-686，以及美國公開的申請?zhí)?002/0164730進(jìn)行描述。在一方面，化學(xué)預(yù)處理優(yōu)選作為稀酸處理，并且更優(yōu)選作為連續(xù)稀酸處理進(jìn)行。酸典型地是硫酸，但也可以使用其他酸，例如乙酸、檸檬酸、硝酸、磷酸、酒石酸、琥珀酸、氯化氫、或其混合物。優(yōu)選在1-5，例如1-4或1-2.5的ph范圍進(jìn)行溫和的酸處理。在一方面，酸濃度在優(yōu)選從0.01至10wt.％酸的范圍內(nèi)，例如0.05至5wt.％酸或0.1至2wt.％酸。酸與纖維素材料接觸，并且優(yōu)選在溫度140℃-200℃的范圍內(nèi)，例如165℃-190℃，進(jìn)行1到60分鐘范圍的時(shí)間。在另一方面，預(yù)處理發(fā)生在含水漿料中。在優(yōu)選的方面，在預(yù)處理過程中纖維素材料以優(yōu)選在10wt.％至80wt.％之間，例如20wt.％至70wt.％或30wt.％至60wt.％，如大約40wt.％的量存在?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的任何方法不洗滌或洗滌預(yù)處理的纖維素材料，例如用水洗滌。機(jī)械預(yù)處理或物理預(yù)處理：術(shù)語“機(jī)械預(yù)處理”或“物理預(yù)處理”是指促進(jìn)顆粒粒度減小的任何預(yù)處理。例如，這樣的預(yù)處理可以涉及不同類型的研磨或碾磨(例如，干磨、濕磨或振動(dòng)球磨)。纖維素材料可以物理地(機(jī)械地)且化學(xué)地預(yù)處理。機(jī)械或物理預(yù)處理可以與蒸汽/蒸汽爆炸、水熱解(hydrothermolysis)、稀酸或弱酸處理、高溫、高壓處理、輻射(例如，微波福射)或其組合相結(jié)合。在一個(gè)方面，高壓是指優(yōu)選在約100至約400psi的范圍內(nèi)的壓力，例如約150至約250psi。在另一方面，高溫意指溫度在約100℃至約300℃，例如約140℃至約200℃的范圍內(nèi)。在一優(yōu)選方面，機(jī)械或物理預(yù)處理在分批過程中使用蒸汽槍水解器系統(tǒng)，例如從順智公司(sundsdefibratorab)，瑞典可獲得的順智水解器(sundshydrolyzer)來進(jìn)行，該系統(tǒng)使用如上所定義的高壓和高溫。根據(jù)需要，可以順序或同時(shí)進(jìn)行物理和化學(xué)預(yù)處理。因此，在一優(yōu)選方面，使纖維素材料經(jīng)受物理(機(jī)械)或化學(xué)預(yù)處理、或其任何組合，以促進(jìn)纖維素、半纖維素、和/或木質(zhì)素的分離和/或釋放。生物預(yù)處理。術(shù)語“生物預(yù)處理”是指促進(jìn)纖維素、半纖維素、和/或木質(zhì)素從纖維素材料中分離和/或釋放的任何生物預(yù)處理。生物預(yù)處理技術(shù)可以涉及應(yīng)用溶解木質(zhì)素的微生物和/或酶(參見，例如，舒t.-a.(hsu,t.-a.)，1996，生物質(zhì)的預(yù)處理(pretreatmentofbiomass)，生物乙醇手冊：生產(chǎn)和利用(handbookonbioethanol:productionandutilization)，懷曼c(diǎn).e.(wyman,c.e.)，編輯，泰勒-弗朗西斯出版集團(tuán)，華盛頓特區(qū)(taylor&francis,washington,dc)，179-212；高希(ghosh)和辛格(singh)，1993，應(yīng)用微生物學(xué)進(jìn)展(adv.appl.microbiol.)39:295-333；麥克米蘭·j.d.(mcmillan,j.d.)，1994，預(yù)處理木質(zhì)纖維素生物質(zhì)：綜述(pretreatinglignocellulosicbiomass:areview)，用于燃料生產(chǎn)的生物質(zhì)的酶轉(zhuǎn)化(inenzymaticconversionofbiomassforfuelsproduction)，希默爾·m.e.(himmel,m.e.)，貝克·j.o.(baker,j.o.)，以及奧弗倫·r.p.(overend,r.p.)編輯，美國化學(xué)學(xué)會(huì)討論會(huì)系列566(acssymposiumseries566)，美國化學(xué)學(xué)會(huì)，華盛頓特區(qū)(americanchemicalsociety,washington,dc)，第15章；貢·c.s.(gong,c.s.)，卡奧·n.j.(cao,n.j.)，杜·j.(du,j.)，以及曹·g.t.(tsao,g.t.)，1999，由可再生資源生產(chǎn)乙醇(ethanolproductionfromrenewableresources)，生物化學(xué)工程/生物技術(shù)的進(jìn)展(advancesinbiochemicalengineering/biotechnology)，舍佩爾·t.(scheper,t.)，編輯，施普林格出版社(springer-verlag)，柏林，海德堡，德國(berlinheidelberg,germany)，65:207-241；奧爾森(olsson)和哈恩-哈格達(dá)爾(hahn-hagerdal)，1996，酶與微生物技術(shù)(enz.microb.tech.)18:312-331；以及瓦藍(lán)德(vallander)和埃里克松(eriksson)，1990，生物化學(xué)工程/生物技術(shù)的進(jìn)展(adv.biochem.eng./biotechnol.)42:63-95)。糖化在糖化步驟(即，水解步驟)中，纖維素材料(例如預(yù)處理的)被水解，來分解纖維素和/或半纖維素為可發(fā)酵糖，例如葡萄糖、纖維二糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、和/或可溶寡糖。水解由纖維素分解酶組合物酶促進(jìn)行。這些組合物的酶可以同時(shí)或順序添加。酶水解優(yōu)選在易于由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定的條件下，在適合的含水環(huán)境中進(jìn)行。在一方面，水解在適合于一種或多種酶的活性，即，對于該一種或多種酶來說最佳的條件下進(jìn)行。水解可以作為進(jìn)料分批過程或連續(xù)過程進(jìn)行，其中將纖維素材料逐漸進(jìn)料至例如含酶的水解溶液中。糖化通常在受控的ph、溫度以及混合條件下在攪拌釜反應(yīng)器或發(fā)酵罐中進(jìn)行。適合的處理時(shí)間、溫度以及ph條件可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。例如，糖化可以持續(xù)高達(dá)200小時(shí)，但是典型地優(yōu)選進(jìn)行約12至約120小時(shí)，例如約16至約72小時(shí)或約24至約48小時(shí)。溫度優(yōu)選在約25℃至約70℃，例如約30℃至約65℃、約40℃至約60℃、或約50℃至55℃的范圍內(nèi)。優(yōu)選ph是在約3至約8的范圍內(nèi)，例如約3.5至約7、約4至約6、或約4.5至約5.5。干固體含量優(yōu)選在約5至約50wt.％，例如，約10至約40wt.％或約20至約30wt.％的范圍內(nèi)。使用纖維素分解酶組合物進(jìn)行在步驟(a)中的糖化。這樣的酶組合物在下面的“纖維素分解酶組合物”部分中進(jìn)行了描述。這些纖維素分解酶組合物可以包括有用于降解纖維素材料的任何蛋白。在一方面，該纖維素分解酶組合物包括或進(jìn)一步包括選自下組的一種或多種(例如，若干種)蛋白質(zhì)，該組由以下各項(xiàng)組成：纖維素酶、aa9(gh61)多肽、半纖維素酶、酯酶、擴(kuò)張蛋白、木質(zhì)素分解酶、氧化還原酶、果膠酶、蛋白酶、以及膨脹蛋白。在另一方面，纖維素酶優(yōu)選是一種或多種(例如，若干種)選自下組的酶，該組由以下各項(xiàng)組成：內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和β-葡糖苷酶。在另一方面，半纖維素酶優(yōu)選是一種或多種(例如，若干種)選自下組的酶，該組由以下各項(xiàng)組成：乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶、以及木糖苷酶。在另一方面，氧化還原酶優(yōu)選是一種或多種(例如，若干種)選自下組的酶，該組由以下各項(xiàng)組成：過氧化氫酶、漆酶、以及過氧化物酶。在本發(fā)明的方法中使用的酶或酶組合物可以是以任何適于使用的形式存在的，例如像發(fā)酵液配制品或細(xì)胞組合物、具有或不具有細(xì)胞碎片的細(xì)胞裂解物、半純化或純化的酶制劑、或作為酶的來源的宿主細(xì)胞。該酶組合物可以是干粉或顆粒、非塵顆粒、液體、穩(wěn)定化的液體、或穩(wěn)定化的受保護(hù)的酶。可以根據(jù)已建立的方法例如通過添加穩(wěn)定劑(例如糖、糖醇或其他多元醇)、和/或乳酸或另一種有機(jī)酸，對液體酶制劑進(jìn)行穩(wěn)定化。在一方面，纖維素分解或半纖維素分解酶組合物對于纖維素材料的有效量是約0.5mg至約50mg，例如，約0.5mg至約40mg、約0.5mg至約25mg、約0.75mg至約20mg、約0.75mg至約15mg、約0.5mg至約10mg、或約2.5mg至約10mg/g的該纖維素材料。在一方面，將這樣一種化合物以該化合物與纖維素的葡糖基單元的以下摩爾比：約10-6至約10，例如，約10-6至約7.5、約10-6至約5、約10-6至約2.5、約10-6至約1、約10-5至約1、約10-5至約10-1、約10-4至約10-1、約10-3至約10-1、或約10-3至約10-2添加。在另一方面，這樣一種化合物的有效量是約0.1μm至約1m，例如約0.5μm至約0.75m、約0.75μm至約0.5m、約1μm至約0.25m、約1μm至約0.1m、約5μm至約50mm、約10μm至約25mm、約50μm至約25mm、約10μm至約10mm、約5μm至約5mm、或約0.1mm至約1mm。術(shù)語“液體(liquor)”意指在如描述于wo2012/021401中的條件下，由處理漿料中的木質(zhì)纖維素和/或半纖維素材料、或其單糖(例如，木糖、阿拉伯糖、甘露糖等)所產(chǎn)生的溶液相(水相、有機(jī)相或其組合)、及其可溶性內(nèi)容物。可以通過對木質(zhì)纖維素或半纖維素材料(原料)加熱和/或加壓進(jìn)行處理，任選地是在一種例如酸等催化劑存在下、任選地是在有機(jī)溶劑的存在下、和任選地與材料的物理破壞相結(jié)合，然后將溶液與殘余固形物分離，來產(chǎn)生一種用于加強(qiáng)aa9多肽(gh61多肽)纖維分解的液體。在由纖維素分解酶制劑對纖維素底物的水解過程中，從液體與aa9多肽的組合中可得到纖維素分解增強(qiáng)的程度是由這類條件決定的?？梢允褂帽绢I(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法，例如過濾、沉淀或離心，而將液體與經(jīng)過處理的材料進(jìn)行分離。在一方面，液體對于纖維素的有效量是約10-6至約10g/g的纖維素，例如，約10-6至約7.5g、約10-6至約5g、約10-6至約2.5g、約10-6至約1g、約10-5至約1g、約10-5至約10-1g、約10-4至約10-1g、約10-3至約10-1g、或約10-3至約10-2g/g的纖維素。發(fā)酵可以用一種或多種(例如若干種)能夠直接或間接將糖發(fā)酵成希望的發(fā)酵產(chǎn)物的發(fā)酵微生物，對從水解的纖維素材料獲得的可發(fā)酵糖進(jìn)行發(fā)酵。“發(fā)酵”或“發(fā)酵方法”指任何發(fā)酵方法或包括發(fā)酵步驟的任何方法。發(fā)酵方法還包括用于消費(fèi)性醇工業(yè)(例如，啤酒和葡萄酒)、乳品工業(yè)(例如，發(fā)酵奶制品)、皮革工業(yè)、以及煙草工業(yè)的發(fā)酵方法。發(fā)酵條件取決于所希望的發(fā)酵產(chǎn)物和發(fā)酵生物，并且可以由本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員容易地確定。在發(fā)酵步驟中，通過發(fā)酵有機(jī)體，例如酵母，作為預(yù)處理和酶水解步驟的結(jié)果，從纖維素材料釋放的糖被發(fā)酵為產(chǎn)物，例如乙醇。水解(糖化)和發(fā)酵可以是分開的或同時(shí)的。在實(shí)踐本發(fā)明的發(fā)酵步驟中可以使用任何適合的水解的纖維素材料。該材料一般是基于經(jīng)濟(jì)學(xué)，即，每當(dāng)量糖勢的成本，以及對酶致轉(zhuǎn)變的難降解性而進(jìn)行選擇。術(shù)語“發(fā)酵培養(yǎng)基”在此可理解為指在添加一種或多種發(fā)酵微生物之前的培養(yǎng)基，如，由糖化過程產(chǎn)生的培養(yǎng)基，以及在同時(shí)糖化和發(fā)酵過程(ssf)中使用的培養(yǎng)基。本發(fā)明的發(fā)酵生物在這個(gè)方面，本發(fā)明涉及能夠?qū)⒓禾呛臀焯寝D(zhuǎn)化為乙醇的重組發(fā)酵生物。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及具有與釀酒酵母cibts1260(在美國伊利諾伊州(illinois)61604農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)培養(yǎng)物保藏中心(nrrl)登錄號nrrly-50973下保藏)的一樣的特性的重組發(fā)酵生物，或具有與釀酒酵母cibts1260的大致一樣的特性的發(fā)酵生物。在一個(gè)實(shí)施例中，具有與釀酒酵母cibts1260的大致一樣的特性的發(fā)酵生物具有一個(gè)或多個(gè)，例如所有的，以下特性：-在1gdwc/l、35℃、ph5.5下，48小時(shí)發(fā)酵后，相比bsgx001更高的木糖消耗，特別是如在實(shí)例3中所述；-在1gdwc/l、35℃、ph5.5下，48小時(shí)發(fā)酵后，相比bsgx001更高的葡萄糖消耗，特別是如在實(shí)例3中所述；-在1gdwc/l、35℃、ph5.5下，48小時(shí)發(fā)酵后，相比bsgx001更高的乙醇生產(chǎn)，特別是如在實(shí)例3中所述。在一個(gè)實(shí)施例中，具有與釀酒酵母cibts1260的大致一樣的特性的發(fā)酵生物，在實(shí)例3的方法條件下，即1gdcw/l、35℃、ph5.5下，通過48小時(shí)發(fā)酵，提供完全的木糖消耗。在一個(gè)實(shí)施例中，具有與釀酒酵母cibts1260的大致一樣的特性的發(fā)酵生物，在實(shí)例3的方法條件下，即1gdcw/l、35℃、ph5.5下，通過24小時(shí)發(fā)酵，提供完全的葡萄糖消耗。在一個(gè)實(shí)施例中，具有與釀酒酵母cibts1260的大致一樣的特性的發(fā)酵生物，在實(shí)例3的方法條件下，即1gdcw/l、35℃、ph5.5下，48小時(shí)發(fā)酵后，提供多于30g/l乙醇，例如多于40g/l乙醇、例如多于45g/l乙醇、例如大約47g/l乙醇。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，該重組發(fā)酵生物是釀酒酵母cibts1260(在美國伊利諾伊州(illinois)61604農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)培養(yǎng)物保藏中心(nrrl)登錄號nrrly-50973下保藏)。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的發(fā)酵生物包括編碼在us8586336b2中的seqidno:2或在此seqidno:13中示出的具有木糖異構(gòu)酶活性地氨基酸序列，或編碼與在us8586336b2中的seqidno:2或在此seqidno:13的至少80％，例如至少90％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％一致的氨基酸序列的基因。在一個(gè)任選的實(shí)施例中，本發(fā)明的發(fā)酵生物包括一個(gè)戊糖轉(zhuǎn)運(yùn)基因，例如gfx基因，特別是來自中間假絲酵母的gfx1，例如，在seqidno:18中示出的序列。在一個(gè)實(shí)施例中，包括在發(fā)酵生物中的戊糖轉(zhuǎn)運(yùn)基因具有與在此seqidno:18的至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的發(fā)酵生物過量表達(dá)木酮糖激酶基因(xks)，特別是來自釀酒酵母的一個(gè)模式株。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的發(fā)酵生物過量表達(dá)核酮糖5磷酸3-差向異構(gòu)酶基因(rpe1)，特別是來自釀酒酵母的一個(gè)模式株。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的發(fā)酵生物過量表達(dá)核酮糖5磷酸異構(gòu)酶基因(rki1)，特別是來自釀酒酵母的一個(gè)模式株。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的發(fā)酵生物過量表達(dá)轉(zhuǎn)酮酶基因(tkl1)，并且過量表達(dá)轉(zhuǎn)醛醇酶基因(tal1)，特別是來自釀酒酵母的一個(gè)模式株。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的發(fā)酵生物具有一個(gè)或多個(gè)，例如一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或所有，以下遺傳修飾：-從牛瘤胃液獲得的木糖異構(gòu)酶基因(ru-xi)，特別是在此seqidno:20中示出的一個(gè)，編碼在此seqidno:13中示出的木糖異構(gòu)酶；-任選地來自中間假絲酵母的一種戊糖轉(zhuǎn)運(yùn)基因(gxf1)，特別是在seqidno:18中示出的那一個(gè)；-木酮糖激酶基因(xks)，特別是來自釀酒酵母的一個(gè)模式株；-核酮糖5磷酸3-差向異構(gòu)酶基因(rpe1)，特別是來自釀酒酵母的一個(gè)模式株；-核酮糖5磷酸異構(gòu)酶基因(rki1)，特別是來自釀酒酵母的一個(gè)模式株；-轉(zhuǎn)酮酶基因(tkl1)和轉(zhuǎn)醛醇酶基因(tal1)，特別是來自釀酒酵母的一個(gè)模式株。例如，在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明發(fā)酵生物具有以下遺傳修飾：-從牛瘤胃液獲得的木糖異構(gòu)酶基因(ru-xi)，特別是在此seqidno:20中示出的一個(gè)，編碼在此seqidno:13中示出的木糖異構(gòu)酶；-木酮糖激酶基因(xks)，特別是來自釀酒酵母的一個(gè)模式株；-核酮糖5磷酸3-差向異構(gòu)酶基因(rpe1)，特別是來自釀酒酵母的一個(gè)模式株；-核酮糖5磷酸異構(gòu)酶基因(rki1)，特別是來自釀酒酵母的一個(gè)模式株；-轉(zhuǎn)酮酶基因(tkl1)和轉(zhuǎn)醛醇酶基因(tal1)，特別是來自釀酒酵母的一個(gè)模式株。發(fā)酵刺激劑發(fā)酵刺激劑可以用于在此所描述的本發(fā)明的方法中，以進(jìn)一步改進(jìn)發(fā)酵，并且特別是改進(jìn)發(fā)酵生物的性能，例如速率增加和產(chǎn)物產(chǎn)率(例如，乙醇產(chǎn)率)?！鞍l(fā)酵刺激劑”是指用于發(fā)酵生物(特別是酵母)生長的刺激劑。用于生長的優(yōu)選發(fā)酵刺激劑包括維生素和礦物質(zhì)。維生素的實(shí)例包括多種維生素、生物素、泛酸(鹽)、煙酸、內(nèi)消旋肌醇、硫胺素、吡哆醇、對氨基苯酸、葉酸、核黃素、以及維生素a、b、c、d和e。參見例如，奧芬諾拉(alfenore)等人，在補(bǔ)料分批方法過程中通過維生素補(bǔ)料策略改進(jìn)乙醇生產(chǎn)和釀酒酵母的生存力(improvingethanolproductionandviabilityofsaccharomycescerevisiaebyavitaminfeedingstrategyduringfed-batchprocess)，施普林格出版社(springer-verlag)(2002)，將其通過引用結(jié)合在此。礦物質(zhì)的實(shí)例包括可以供應(yīng)營養(yǎng)素(包括p、k、mg、s、ca、fe、zn、mn和cu)的礦物質(zhì)和礦物鹽。發(fā)酵產(chǎn)物本發(fā)明的發(fā)酵產(chǎn)物是乙醇?；厥湛梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的任何方法，任選地從發(fā)酵培養(yǎng)基中回收發(fā)酵產(chǎn)物(即，乙醇)，該方法包括但不限于：層析法、電泳程序、差別溶解度、蒸餾或萃取。例如，通過常規(guī)蒸餾方法從發(fā)酵的纖維素材料中分離和純化醇?？梢垣@得具有高達(dá)約96vol.％的純度的乙醇，這可以用作例如燃料乙醇、飲用乙醇(即可飲用的中性烈酒)，或工業(yè)乙醇。酶以下部分說明了可以用于本發(fā)明的方法中的多肽、酶、和酶組合物。纖維素分解酶組合物根據(jù)本發(fā)明，纖維素分解酶組合物是在步驟(a)中的糖化過程中存在的或添加的。纖維素分解酶組合物是包含水解纖維素材料的一種或多種(例如若干種)酶的酶制劑。此類酶包括內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、β-葡糖苷酶、和/或其組合。該纖維素分解酶組合物可以具有任何來源。在一個(gè)實(shí)施例中，纖維素分解酶組合物來源于木霉屬的菌株，例如里氏木霉的菌株；腐質(zhì)霉屬的菌株，例如特異腐質(zhì)霉的菌株，和/或金孢子菌屬的菌株，例如盧克諾文思金孢子菌(chrysosporiumlucknowense)的菌株。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，該纖維素分解酶制劑來源于里氏木霉的菌株。該纖維素分解酶組合物可進(jìn)一步包括以下多肽(例如酶)中的一種或多種：具有纖維素分解增強(qiáng)活性的aa9多肽(gh61多肽)、β-葡糖苷酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶、cbhi、cbhii、或其兩種、三種、四種、五種、或六種的混合物。該另外的一種或多種多肽(例如，aa9多肽)和/或一種或多種酶(例如，β-葡糖苷酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶、cbhi和/或cbhii)對于該纖維素分解酶組合物生產(chǎn)生物(例如，里氏木霉)可以是外來的。在一個(gè)實(shí)施例中，該纖維素分解酶制劑包括一種具有纖維素分解增強(qiáng)活性的aa9多肽和一種β-葡糖苷酶。在另一實(shí)施例中，該纖維素分解酶制劑包括一種具有纖維素分解增強(qiáng)活性的aa9多肽、一種β-葡糖苷酶、以及一種cbhi。在另一實(shí)施例中，該纖維素分解酶制劑包括一種具有纖維素分解增強(qiáng)活性的aa9多肽、一種β-葡糖苷酶、一種cbhi以及一種cbhii。其他酶(例如內(nèi)切葡聚糖酶)，還可以包括在纖維素分解酶組合物中。如以上提到的，該纖維素分解酶組合物可以包括多種不同的多肽，包括酶。在一個(gè)實(shí)施例中，該纖維素分解酶組合物是一種里氏木霉纖維素分解酶組合物，進(jìn)一步包括具有纖維素分解增強(qiáng)活性的橙色嗜熱子囊菌aa9(gh61a)多肽(例如，wo2005/074656)，以及米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(例如，披露于wo2008/057637中的一種，特別是如seqidno:59和seqidno:60中所示)。在另一實(shí)施例中，纖維素分解酶組合物是一種里氏木霉纖維素分解酶組合物，進(jìn)一步包括具有纖維素分解增強(qiáng)活性的橙色嗜熱子囊菌aa9(gh61a)多肽(例如，在wo2005/074656中的seqidno:2或在此的seqidno:4)，以及煙曲霉β-葡糖苷酶(例如，wo2005/047499的seqidno:2或在此的seqidno:5)。在另一實(shí)施例中，纖維素分解酶組合物是一種里氏木霉纖維素分解酶組合物，進(jìn)一步包括具有纖維素分解增強(qiáng)活性的埃默森青霉菌aa9(gh61a)多肽，特別是披露于wo2011/041397或在此的seqidno:7中的一種，以及煙曲霉β-葡糖苷酶(例如，wo2005/047499的seqidno:2或在此的seqidno:5)。在另一實(shí)施例中，纖維素分解酶組合物是一種里氏木霉纖維素分解酶組合物，進(jìn)一步包括具有纖維素分解增強(qiáng)活性的埃默森青霉菌aa9(gh61a)多肽，特別是披露于wo2011/041397中的一種，以及煙曲霉β-葡糖苷酶(例如，wo2005/047499的seqidno:2或在此的seqidno:5)，或披露于wo2012/044915(通過引用結(jié)合在此)的一個(gè)變體，特別是包括一個(gè)或多個(gè)，例如所有的以下取代：f100d、s283g、n456e、f512y的一個(gè)變體。在一個(gè)實(shí)施例中，纖維素分解酶組合物是一種里氏木霉纖維素分解組合物，進(jìn)一步包括具有纖維素分解增強(qiáng)活性的aa9(gh61a)多肽，特別是來源于埃默森青霉菌(例如，在wo2011/041397中的seqidno:2或在此的seqidno:7)的菌株，煙曲霉β-葡糖苷酶(例如，在wo2005/047499中的seqidno:2或在此的seqidno:5)變體(該變體具有一個(gè)或多個(gè)，特別是所有的下述取代：f100d、s283g、n456e、f512y，并且披露于wo2012/044915中)；煙曲霉cel7acbh1(例如，披露為wo2011/057140中的seqidno:6和在此的seqidno:10的一種)，以及煙曲霉cbhii(例如，披露為wo2011/057140中的seqidno:18或在此的seqidno:11的一種)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，纖維素分解酶組合物是一種里氏木霉纖維素分解酶組合物，進(jìn)一步包括半纖維素酶或半纖維素分解酶組合物，例如，煙曲霉木聚糖酶(例如，在此的seqidno:8)和煙曲霉β-木糖苷酶(例如，在此的seqidno:9)。在一個(gè)實(shí)施例中，纖維素分解酶組合物還包括一種木聚糖酶(例如，來源于曲霉屬的菌株，特別是棘孢曲霉或煙曲霉；或踝節(jié)菌屬的菌株，特別是雷塞特納斯踝節(jié)菌(talaromycesleycettanus))和/或一種β-木糖苷酶(例如，來源于曲霉屬，特別是煙曲霉，或踝節(jié)菌屬的菌株，特別是埃默森踝節(jié)菌)。在一個(gè)實(shí)施例中，纖維素分解酶組合物是一種里氏木霉纖維素分解酶組合物，進(jìn)一步包括具有纖維素分解增強(qiáng)活性的橙色嗜熱子囊菌aa9(gh61a)多肽(例如，wo2005/074656或在此的seqidno:4)，米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(例如，披露于wo2008/057637中的一種，特別是如seqidno:59和seqidno:60)，以及棘孢曲霉木聚糖酶(例如，在wo94/21785中的xylii或在此的seqidno:6)。在另一實(shí)施例中，纖維素分解酶制劑包括一種里氏木霉纖維素分解制劑，進(jìn)一步包括具有纖維素分解增強(qiáng)活性的橙色嗜熱子囊菌gh61a多肽(例如，在wo2005/074656中的seqidno:2或在此的seqidno:4)，煙曲霉β-葡糖苷酶(例如，wo2005/047499的seqidno:2或在此的seqidno:5)，以及棘孢曲霉木聚糖酶(披露于wo94/21785中的的xylii或在此的seqidno:6)。在另一實(shí)施例中，纖維素分解酶組合物包括一種里氏木霉纖維素分解酶組合物，進(jìn)一步包括具有纖維素分解增強(qiáng)活性的橙色嗜熱子囊菌aa9(gh61a)多肽(例如，在wo2005/074656中的seqidno:2或在此的seqidno:4)，煙曲霉β-葡糖苷酶(例如，wo2005/047499的seqidno:2或在此的seqidno:5)以及棘孢曲霉木聚糖酶(例如，披露于wo94/21785中的xylii或在此的seqidno:6)。在另一實(shí)施例中，纖維素分解酶組合物是一種里氏木霉纖維素分解酶組合物，進(jìn)一步包括具有纖維素分解增強(qiáng)活性的埃默森青霉菌aa9(gh61a)多肽，特別是在wo2011/041397或在此的seqidno:7中披露的一種，煙曲霉β-葡糖苷酶(例如，wo2005/047499的eqidno:2或在此的seqidno:5)和煙曲霉木聚糖酶(例如，在wo2006/078256中的xyliii或在此的seqidno:8)。在另一實(shí)施例中，纖維素分解酶組合物包括一種里氏木霉纖維素分解酶組合物，進(jìn)一步包括具有纖維素分解增強(qiáng)活性的埃默森青霉菌aa9(gh61a)多肽，特別是披露于wo2011/041397或在此的seqidno:7中的一種，煙曲霉β-葡糖苷酶(例如，wo2005/047499的seqidno:2或在此的seqidno:5)，煙曲霉木聚糖酶(例如，在wo2006/078256中的xyliii或在此的seqidno:8)，以及來自煙曲霉的cbhi，特別是披露為wo2011/057140中的seqidno:2或在此的seqidno:10的cel7acbh1。在另一實(shí)施例中，纖維素分解酶包括一種里氏木霉纖維素分解酶組合物，進(jìn)一步包括具有纖維素分解增強(qiáng)活性的埃默森青霉菌aa9(gh61a)多肽，特別是披露于wo2011/041397或在此的seqidno:7中的一種，煙曲霉β-葡糖苷酶(例如，wo2005/047499中的seqidno:2或在此的seqidno:5)，煙曲霉木聚糖酶(例如，wo2006/078256中的xyliii或在此的seqidno:8)，來自煙曲霉的cbhi，特別是披露為wo2011/057140中的seqidno:2或在此的seqidno:10的cel7acbh1，以及來源于煙曲霉的cbhii，特別是披露為wo2013/028928中的seqidno:4或在此的seqidno:11的一種。在另一實(shí)施例中，纖維素分解酶組合物是一種里氏木霉纖維素分解酶組合物，進(jìn)一步包括具有纖維素分解增強(qiáng)活性的埃默森青霉菌aa9(gh61a)多肽，特別是披露于wo2011/041397或在此的seqidno:7中的一種，煙曲霉β-葡糖苷酶(例如，wo2005/047499的seqidno:2或在此的seqidno:5)或其變體(具有一個(gè)或多個(gè)，特別是所有的，以下取代：f100d、s283g、n456e、f512y)；煙曲霉木聚糖酶(例如，在wo2006/078256中的xyliii或在此的seqidno:8)，來自煙曲霉的cbhi，特別是披露為wo2011/057140中的seqidno:2或在此的seqidno:10的cel7acbhi，以及來源于煙曲霉的cbhii，特別是披露于wo2013/028928或在此的seqidno:11中的一種。在另一實(shí)施例中，纖維素分解酶組合物是一種里氏木霉纖維素分解酶組合物，包括在此的seqidno:14的cbhi(genseqp登錄號azy49536(wo2012/103293)；在此的seqidno:15的cbhii(genseqp登錄號azy49446(wo2012/103288)；在此的seqidno:5的β-葡糖苷酶變體(genseqp登錄號azu67153(wo2012/44915))，特別是具有一種或多種，特別是所有的，以下取代：f100d、s283g、n456e、f512y；以及在此的seqidno:7的aa9(gh61多肽)(genseqp登錄號bal61510(wo2013/028912))。在另一實(shí)施例中，纖維素分解酶組合物是一種里氏木霉纖維素分解酶組合物，包括在此的seqidno:14的cbhi(genseqp登錄號azy49536(wo2012/103293))；在此的seqidno:15的cbhii(genseqp登錄號azy49446(wo2012/103288)；在此的seqidno:16的gh10木聚糖酶(genseqp登錄號bak46118(wo2013/019827))；以及在此的seqidno:17的β-木糖苷酶(genseqp登錄號azi04896(wo2011/057140))。在另一實(shí)施例中，纖維素分解酶組合物是一種里氏木霉纖維素分解酶組合物，包括在此的seqidno:14的cbhi(genseqp登錄號azy49536(wo2012/103293))；在此的seqidno:15的cbhii(genseqp登錄號azy49446(wo2012/103288))；以及在此的seqidno:7的aa9(gh61多肽)(genseqp登錄號bal61510(wo2013/028912))。在另一實(shí)施例中，纖維素分解酶組合物是一種里氏木霉纖維素分解酶組合物，包括在此的seqidno:14的cbhi(genseqp登錄號azy49536(wo2012/103293))；在此的seqidno:15的cbhii(genseqp登錄號azy49446(wo2012/103288))，在此的seqidno:7的aa9(gh61多肽)(genseqp登錄號bal61510(wo2013/028912))，以及在此的seqidno:19的過氧化氫酶(genseqp登錄號bac11005(wo2012/130120))。在一個(gè)實(shí)施例中，纖維素分解酶組合物是一種里氏木霉纖維素分解酶組合物，包括在此的seqidno:14的cbhi(genseqp登錄號azy49446(wo2012/103288)；在此的seqidno:15的cbhii(genseqp登錄號azy49446(wo2012/103288))，在此的seqidno:5的β-葡糖苷酶變體(genseqp登錄號azu67153(wo2012/44915))，該變體具有一個(gè)或多個(gè)，特別是所有的，以下取代：f100d、s283g、n456e、f512y；在此的seqidno:7的aa9(gh61多肽)(genseqp登錄號bal61510(wo2013/028912))，在此的seqidno:16的gh10木聚糖酶(genseqp登錄號bak46118(wo2013/019827))，以及在此的seqidno:17的β-木糖苷酶(genseqp登錄號azi04896(wo2011/057140))。在一個(gè)實(shí)施例中，纖維素分解組合物是一種里氏木霉纖維素分解酶制劑，包括在此的seqidno:21的egi(swissprot登錄號p07981)，在此的seqidno:22的egii(embl登錄號m19373)，在此的seqidno:14的cbhi；在此的seqidno:15的cbhii；在此的seqidno:5的β-葡糖苷酶變體，該變體具有以下取代：f100d、s283g、n456e、f512y；在此的seqidno:7的aa9(gh61多肽)，在此的seqidno:16的gh10木聚糖酶；以及在此的seqidno:17的β-木糖苷酶。也考慮披露于wo2013/028928中的所有的纖維素分解酶組合物并且通過引用結(jié)合在此。該纖維素分解酶組合物包括或可以進(jìn)一步包括選自下組的一種或多種(若干種)蛋白質(zhì)，該組由以下各項(xiàng)組成：纖維素酶、具有纖維素分解增強(qiáng)活性的aa9(即gh61)多肽、半纖維素酶、棒曲霉素、酯酶、漆酶、木質(zhì)素分解酶、果膠酶、過氧化物酶、蛋白酶、以及膨脹素。在一個(gè)實(shí)施例中，該纖維素分解酶組合物是一種商業(yè)纖維素分解酶組合物。適合用于本發(fā)明的方法的商業(yè)纖維素分解酶組合物的實(shí)例包括：ctec(諾維信公司)、ctec2(諾維信公司)、ctec3(諾維信公司)、celluclasttm(諾維信公司)、spezymetmcp(杰能科國際公司(genencorint.))、accellerasetm1000、accellerase1500、accellerasetmtrio(杜邦公司(dupont))、nl(dsm)；s/l100(dsm)、rohamenttm7069w(羅姆公司(gmbh))、或cmax3tm(并矢國際公司(dyadicinternational,inc.))。可以按從約0.001wt.％至約5.0wt.％的固體，例如，約0.025wt.％至約4.0wt.％的固體、或約0.005wt.％至約2.0wt.％的固體的有效量添加纖維素分解酶組合物。內(nèi)切葡聚糖酶在本發(fā)明的方法中使用的纖維素分解酶組合物可以包括任何來源的內(nèi)切葡聚糖酶。可以在本發(fā)明的方法中使用的細(xì)菌內(nèi)切葡聚糖酶的實(shí)例包括但不限于：解纖維熱酸菌(acidothermuscellulolyticus)內(nèi)切葡聚糖酶(wo91/05039；wo93/15186；美國專利申請?zhí)?,275,944；wo96/02551；美國專利申請?zhí)?,536,655，wo00/70031，wo05/093050)、胡蘿卜軟腐歐文氏菌(erwiniacarotovara)內(nèi)切葡聚糖酶(薩里拉赫蒂(saarilahti)等人，1990，基因(gene)90:9-14)、嗜熱裂孢菌(thermobifidafusca)內(nèi)切葡聚糖酶iii(wo05/093050)、以及嗜熱裂孢菌(thermobifidafusca)內(nèi)切葡聚糖酶v(wo05/093050)?？梢杂糜诒景l(fā)明的真菌內(nèi)切葡聚糖酶的實(shí)例包括但不限于：里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶i(彭蒂萊(penttila)等人，1986，基因45:253-263，里氏木霉cel7b內(nèi)切葡聚糖酶i(genbank:m15665)；里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶ii(薩洛黑莫(saloheimo)等人，1988，基因63:11-22)，里氏木霉cel5a內(nèi)切葡聚糖酶ii(genbank:m19373)；里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶iii(奧卡達(dá)(okada)等人，1988，應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)(appl.environ.microbiol.)64:555-563，genbank:ab003694)；里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶v(薩洛黑莫等人，1994，分子微生物學(xué)(molecularmicrobiology)13:219-228，genbank:z33381)；棘孢曲霉內(nèi)切葡聚糖酶(黃(ooi)等人，1990，核酸研究18:5884)；白曲霉(aspergilluskawachii)內(nèi)切葡聚糖酶(坂元(sakamoto)等人，1995，當(dāng)代遺傳學(xué)(currentgenetics)27:435-439)；尖鐮孢內(nèi)切葡聚糖酶(genbank:l29381)；灰腐質(zhì)霉高溫變種(humicolagriseavar.thermoidea)內(nèi)切葡聚糖酶(genbank:ab003107)；熱白絲菌(melanocarpusalbomyces)內(nèi)切葡聚糖酶(genbank:mal515703)；粗糙脈孢菌內(nèi)切葡聚糖酶(genbank:xm_324477)；特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶v；嗜熱毀絲霉cbs117.65內(nèi)切葡聚糖酶；橙色嗜熱子囊菌內(nèi)切葡聚糖酶i(genbank:af487830)；里氏木霉菌株號vtt-d-80133內(nèi)切葡聚糖酶(genbank:m15665)、嗜松青霉內(nèi)切葡聚糖酶(wo2012/062220)；以及(wo2013/019780)。在一個(gè)實(shí)施例中，該內(nèi)切葡聚糖酶，例如來源于里氏木霉的一種或其同系物，選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：(i)一種內(nèi)切葡聚糖酶(eg)，包括在此的seqidno:21的成熟多肽；(ii)一種內(nèi)切葡聚糖酶(eg)的氨基酸序列與在此的seqidno:21的成熟多肽具有至少60％，例如至少70％，例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該內(nèi)切葡聚糖酶，例如來源于里氏木霉的一種或其同系物，選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：(i)一種內(nèi)切葡聚糖酶(eg)，包括在此的seqidno:22的成熟多肽；(ii)一種內(nèi)切葡聚糖酶(eg)的氨基酸序列與在此的seqidno:22的成熟多肽具有至少60％，例如至少70％，例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。具有纖維素分解增強(qiáng)活性的aa9(即，gh61)多肽在一個(gè)實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明使用的纖維素分解酶組合物可以包括一種或多種具有纖維素分解增強(qiáng)活性的aa9(gh61)多肽。在本發(fā)明的方法中使用的纖維素分解酶組合物可以包括一種任何來源的aa9(gh61)多肽。在本發(fā)明的方法中有用的aa9多肽的實(shí)例包括但不限于來自于以下各項(xiàng)的aa9多肽：土生梭孢殼霉(wo2005/074647、wo2008/148131和wo2011/035027)、橙色嗜熱子囊菌(wo2005/074656和wo2010/065830)、里氏木霉(wo2007/089290和wo2012/149344)、嗜熱毀絲霉(wo2009/085935、wo2009/085859、wo2009/085864、wo2009/085868及wo2009/033071)、煙曲霉(wo2010/138754)、嗜松青霉(wo2011/005867)、嗜熱子嚢菌屬(wo2011/039319)、青霉菌屬(埃默森青霉菌)(wo2011/041397和wo2012/000892)、甲殼嗜熱子囊菌(thermoascuscrustaceous)(wo2011/041504)、棘孢曲霉(wo2012/125925)、疏棉狀嗜熱絲孢菌(wo2012/113340、wo2012/129699、wo2012/130964及wo2012/129699)、aurantiporusalborubescens(wo2012/122477)、褐孢長毛盤菌(wo2012/122477)、托姆青霉(wo2012/122477)、柄踝節(jié)菌(wo2012/135659)、特異腐質(zhì)霉(wo2012/146171)、樟絨枝霉(wo2012/101206)、talaromycesleycettanus(wo2012/101206)、以及嗜熱毛殼菌(wo2012/101206)和嗜熱踝節(jié)菌(talaromycesthermophilus)(wo2012/129697和wo2012/130950)。在一方面，aa9多肽在根據(jù)wo2008/151043的可溶性活化二價(jià)金屬陽離子(例如錳或銅)的存在下使用。在另一方面，aa9多肽在二氧化合物、二環(huán)化合物、雜環(huán)化合物、含氮化合物、醌化合物、含硫化合物、或從預(yù)處理的纖維素材料(如預(yù)處理的玉米秸桿)獲得的液體的存在下使用(wo2012/021394、wo2012/021395、wo2012/021396、wo2012/021399、wo2012/021400、wo2012/021401、wo2012/021408、以及wo2012/021410)。在一個(gè)實(shí)施例中，該纖維素分解酶組合物包括一種具有纖維素分解增強(qiáng)活性的aa9(gh61)多肽，例如來源于嗜熱子嚢菌屬的，例如橙色嗜熱子囊菌的菌株，例如在wo2005/074656描述為seqidno:2，或在此的seqidno:4的；或來源于梭孢殼菌屬的，例如土生梭孢殼的菌株，例如在wo2005/074647描述為seqidno:7和seqidno:8、和在此的seqidno:2的；或來源于曲霉屬的菌株的，例如煙曲霉的菌株，例如在wo2010/138754描述為seqidno:2；或來源于源于青霉屬的菌株的，例如埃默森青霉菌的菌株，例如wo2011/041397中披露的或此處的seqidno:7的。在一個(gè)實(shí)施例中，具有纖維素分解增強(qiáng)活性的橙色嗜熱子囊菌aa9(gh61)多肽或其同系物選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：(i)一種具有纖維素分解增強(qiáng)活性的gh61多肽，包括在此的seqidno:4的成熟多肽；(ii)一種具有纖維素分解增強(qiáng)活性的gh61多肽，包括以下氨基酸序列，該氨基酸序列與在此的seqidno:4的成熟多肽具有至少70％，例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。在另一實(shí)施例中，具有纖維素分解增強(qiáng)活性的青霉屬aa9(gh61)多肽或其同系物選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：(i)一種具有纖維素分解增強(qiáng)活性的gh61多肽，包括在此的seqidno:7的成熟多肽；(ii)一種具有纖維素分解增強(qiáng)活性的gh61多肽，包括以下氨基酸序列，該氨基酸序列與在此的seqidno:7的成熟多肽具有至少70％，例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。β-葡糖苷酶根據(jù)本發(fā)明，β-葡糖苷酶可以存在于和/或添加到糖化步驟(a)中。在本發(fā)明的方法中使用的纖維素分解酶組合物可以包括任何來源的β-葡糖苷酶。在本發(fā)明中有用的β-葡糖苷酶的實(shí)例包括但不限于，來自以下各項(xiàng)的β-葡糖苷酶：棘孢曲霉(川口(kawaguchi)等人，1996，基因(gene)173:287-288)、煙曲霉(wo2005/047499)、黑曲霉(丹(dan)等人，2000，生物化學(xué)雜志(j.biol.chem.)，275:4973-4980)、米曲霉(wo02/095014)、巴西青霉菌ibt20888(wo2007/019442和wo2010/088387)、土生梭孢殼霉(wo2011/035029)、以及褐孢長毛盤菌(wo2007/019442)。在一個(gè)實(shí)施例中，該β-葡糖苷酶可以是來源于曲霉屬的菌株的一種，例如黑曲霉或米曲霉，例如披露于wo2002/095014中的一種或具有β-葡糖苷酶活性的在wo2008/057637中披露為seqidno:59和eqidno:60的融合蛋白，或煙曲霉，例如披露于wo2005/047499或在此的seqidno:5中的一種，或煙曲霉β-葡糖苷酶變體，例如披露于wo2012/044915中的一種，例如具有以下取代：f100d、s283g、n456e、f512y的一種(使用在此的seqidno:5用于編號)。在另一實(shí)施例中，該β-葡糖苷酶來源于青霉屬的菌株，例如披露于wo2007/019442中的巴西青霉菌的菌株，或木霉屬的菌株，例如里氏木霉的菌株。在一個(gè)實(shí)施例中，β-葡糖苷酶是一種選自下組的煙曲霉β-葡糖苷酶或其同系物，該組由以下各項(xiàng)組成：(i)一種β-葡糖苷酶，包括在此的seqidno:5的成熟多肽；(ii)一種β-葡糖苷酶，包括以下氨基酸序列，該氨基酸序列與在此的seqidno:5的成熟多肽具有至少70％，例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，β-葡糖苷酶是一個(gè)變體，該變體在對應(yīng)于在此的seqidno:5的成熟多肽的位置100、283、456以及512的一個(gè)或多個(gè)(若干個(gè))位置處包括取代，其中該變體具有β-葡糖苷酶活性。在一個(gè)實(shí)施例中，β-葡糖苷酶是以下各項(xiàng)的一個(gè)變體：(a)包括在此的seqidno:5的成熟多肽；(b)具有與在此的seqidno:5的成熟多肽至少80％序列一致性的多肽，或(c)在此的seqidno:5的成熟多肽的具有β-葡糖苷酶活性的片段。在一個(gè)實(shí)施例中，該β-葡糖苷酶變體與在此的seqidno:5的成熟多肽具有至少80％，例如，至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但小于100％序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，β-葡糖苷酶來自曲霉屬的菌株，例如煙曲霉的菌株，例如煙曲霉β-葡糖苷酶(例如，在此的seqidno:5中示出)，它包括一個(gè)或多個(gè)選自下組的取代，該組由以下各項(xiàng)組成：l89m、g91l、f100d、i140v、i186v、s283g、n456e、和f512y；例如一種具有以下取代的其變體：-f100d+s283g+n456e+f512y；-l89m+g91l+i186v+i140v；-i186v+l89m+g91l+i140v+f100d+s283g+n456e+f512y。在一個(gè)實(shí)施例中，取代的數(shù)目在1與10之間，例如1與8之間，例如1與6之間，例如1與4之間，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)取代。在一個(gè)實(shí)施例中，變體在對應(yīng)于位置100的位置處包括取代、在對應(yīng)于位置283的位置處包括取代、在對應(yīng)于位置456的位置處包括取代和/或在對應(yīng)于位置512的位置處包括取代。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，該β-葡糖苷酶變體包括以下取代：在此seqidno:5中的phe100asp、ser283gly、asn456glu、phe512tyr。纖維二糖水解酶在本發(fā)明的方法中使用的纖維素分解酶組合物可以包括任何來源的纖維二糖水解酶，例如cbhi和/或cbhii。在本發(fā)明中有用的的纖維二糖水解酶的實(shí)例包括但不限于：棘孢曲霉纖維二糖水解酶ii(wo2011/059740)、煙曲霉纖維二糖水解酶i(wo2013/028928)、煙曲霉纖維二糖水解酶ii(wo2013/028928)、嗜熱毛殼菌纖維二糖水解酶i、嗜熱毛殼菌纖維二糖水解酶ii、特異腐質(zhì)霉纖維二糖水解酶i、嗜熱毀絲霉纖維二糖水解酶ii(wo2009/042871)、奧斯塔尼青霉(penicilliumoccitanis)纖維二糖水解酶i(genbank:ay690482)、埃默森踝節(jié)菌纖維二糖水解酶i(genbank:af439936)、赫卡尼亞梭孢殼霉(thielaviahyrcanie)纖維二糖水解酶ii(wo2010/141325)、土生梭孢殼霉纖維二糖水解酶ii(cel6a，wo2006/074435)、里氏木霉纖維二糖水解酶i、里氏木霉纖維二糖水解酶ii、以及褐孢長毛盤菌纖維二糖水解酶ii(wo2010/057086)。纖維二糖水解酶i。纖維二糖水解酶i在一個(gè)實(shí)施例中，在本發(fā)明的方法中使用的纖維素分解酶組合物可以包括一種或多種cbhi(纖維二糖水解酶i)。在一個(gè)實(shí)施例中，該纖維素分解酶組合物包括纖維二糖水解酶i(cbhi)，例如來源于曲霉屬的菌株的一種，例如煙曲霉的菌株，例如披露于在wo2011/057140中的seqidno:6或在此的seqidno:10的cel7acbhi；木霉屬的菌株，例如里氏木霉的菌株；或踝節(jié)菌屬的菌株，例如雷塞特納斯踝節(jié)菌(talaromycesleycettanus)的菌株，優(yōu)選地是在此的seqidno:14中示出的一種或genseqp登錄號azy49536(wo2012/103293)。在一個(gè)實(shí)施例中，該煙曲霉纖維二糖水解酶i或其同系物選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：(i)一種纖維二糖水解酶i，包括在此的seqidno:10的成熟多肽；(ii)一種維二糖水解酶i，包括以下氨基酸序列，該氨基酸序列與在此的seqidno:10的成熟多肽具有至少60％、至少70％，例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。在另一實(shí)施例中，該纖維二糖水解酶i，例如，來源于雷塞特納斯踝節(jié)菌(talaromycesleycettanus)的菌株的一種，選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：(i)一種纖維二糖水解酶i，包括在此的seqidno:14的成熟多肽；(ii)一種維二糖水解酶i，包括以下氨基酸序列，該氨基酸序列與在此的seqidno:14的成熟多肽具有至少60％、至少70％，例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。纖維二糖水解酶ii在一個(gè)實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明使用的纖維素分解酶組合物可以包括一種或多種cbhii(纖維二糖水解酶ii)。在一個(gè)實(shí)施例中，該纖維二糖水解酶ii(cbhii)，例如來源于曲霉屬的菌株的一種，例如煙曲霉的菌株，例如在此的seqidno:11中的一種或木霉屬的菌株，例如里氏木霉，或梭孢殼菌屬的菌株，例如土生梭孢殼霉的菌株，例如來自土生梭孢殼霉的纖維二糖水解酶iicel6a；或踝節(jié)菌屬的菌株，例如雷塞特納斯踝節(jié)菌(talaromycesleycettanus)的菌株，優(yōu)選地是在此的seqidno:15中示出的一種或genseqp登錄號azy49446(wo2012/103288)。在一個(gè)實(shí)施例中，煙曲霉纖維二糖水解酶ii或其同系物選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：(i)一種纖維二糖水解酶ii，包括在此的seqidno:11的成熟多肽；(ii)一種纖維二糖水解酶ii，包括以下氨基酸序列，該氨基酸序列與在此的seqidno:11的成熟多肽具有至少60％、至少70％，例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性。在另一實(shí)施例中，該纖維二糖水解酶ii，例如，來源于雷塞特納斯踝節(jié)菌(talaromycesleycettanus)的菌株的一種，選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：(i)一種纖維二糖水解酶ii，包括在此的seqidno:15的成熟多肽；(ii)一種纖維二糖水解酶ii，包括以下氨基酸序列，該氨基酸序列與在此的seqidno:15的成熟多肽具有至少60％、至少70％，例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。半纖維素酶根據(jù)本發(fā)明，半纖維素酶可以是在步驟(a)中的糖化過程中存在的和/或添加的。該半纖維素酶可以呈半纖維素分解酶組合物的形式。該半纖維素酶可以是任何起源的，但優(yōu)選真菌或細(xì)菌起源的。術(shù)語“半纖維素酶”或“半纖維素分解酶”意指一種或多種(若干種)水解半纖維素材料的酶。參見，例如，沙勒姆(shallom)和肖漢姆(shoham)，2003，微生物半纖維素酶(microbialhemicellulases.)微生物學(xué)當(dāng)前觀點(diǎn)(currentopinioninmicrobiology)，6(3):219-228。半纖維素酶是在植物生物質(zhì)的降解中的關(guān)鍵組分。半纖維素酶的實(shí)例包括但不限于乙酰基甘露聚糖酯酶、乙?；揪厶酋ッ?、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶、以及木糖苷酶。半纖維素酶的催化模塊是水解糖苷鍵的糖苷水解酶(gh)，或是水解乙酸或阿魏酸側(cè)基的酯鍵的碳水化合物酯酶(ce)。這些催化模塊基于它們一級序列的同源性，可以通過數(shù)字進(jìn)行標(biāo)記而被分配到gh和ce家族中。具有總體相似的折疊的一些家族可以進(jìn)一步被分組為以字母標(biāo)記的氏族(例如，gh-a)。這些和其他碳水化合物活性酶的最具信息性和最新的分類可在碳水化合物活性酶(carbohydrate-activeenzymes)(cazy)數(shù)據(jù)庫中獲得?？梢愿鶕?jù)高斯(ghose)和比薩拉(bisaria)，1987，純粹與應(yīng)用化學(xué)(pure&appi.chem.)59:1739-1752來測量半纖維素分解酶活性。在一個(gè)實(shí)施例中，在糖化過程中存在和/或添加的半纖維素酶是半纖維素分解酶組合物。在一個(gè)實(shí)施例中，該半纖維素分解酶組合物是來自里氏木霉的纖維素分解酶組合物，進(jìn)一步包括木聚糖酶和/或β-木糖苷酶。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，該半纖維素分解酶組合物是來自里氏木霉的纖維素分解酶組合物，進(jìn)一步包括煙曲霉木聚糖酶(在此的seqidno:8中示出的xyliii)和煙曲霉β-木糖苷酶(在此的seqidno:9)。優(yōu)選地，可以0.01mgep/g和20mgep/g纖維素之間，例如0.1mgep/g-1mgep/g纖維素的濃度添加半纖維素酶或半纖維素分解酶制劑。木聚糖酶在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，該半纖維素酶是木聚糖酶或半纖維素分解酶組合物包括木聚糖酶。術(shù)語“木聚糖酶”意指一種1,4-β-d-木聚糖-木糖水解酶(e.c.3.2.1.8)，其催化木聚糖中的1,4-β-d-木糖苷鍵的內(nèi)切水解。出于本發(fā)明的目的，在37℃下，在0.01％x-100和200mm磷酸鈉緩沖液(ph6)中用0.2％azcl-阿拉伯糖基木聚糖作為底物來確定木聚糖酶活性。一個(gè)單位的木聚糖酶活性定義為在37℃、ph6下在200mm磷酸鈉(ph6)緩沖液中從作為底物的0.2％azcl-阿拉伯糖基木聚糖每分鐘產(chǎn)生1.0μ摩爾天青蛋白。在本發(fā)明的方法中有用的木聚糖酶的實(shí)例包括但不限于來自以下各項(xiàng)的木聚糖酶：棘孢曲霉(geneseqp:aar63790；wo94/21785)、煙曲霉(wo2006/078256)、嗜松青霉(wo2011/041405)、青霉菌屬(wo2010/126772)、疏棉狀嗜熱絲孢菌(geneseqp:baa22485)、嗜熱踝節(jié)菌屬(geneseqp:baa22834)、土生梭孢殼霉nrrl8126(wo2009/079210)、和褐孢長毛盤菌(wo2011/057083)。特別考慮到的木聚糖酶的實(shí)例包括gh10木聚糖酶，例如來源于曲霉屬的菌株的一種，例如來自煙曲霉的菌株的，例如在wo2006/078256中披露為xyliii的一種，或來自棘孢曲霉的菌株的，例如在wo94/21785中披露為seqidno:5(xylii)的一種。木聚糖酶可以包括在一種纖維素分解酶制劑(其進(jìn)一步包括一種木聚糖酶)中。在一個(gè)實(shí)施例中，半纖維素酶是一種纖維素分解酶制劑，該制劑進(jìn)一步包括一種木聚糖酶，優(yōu)選地是一種gh10木聚糖酶，例如來源于曲霉屬的菌株的一種，例如來自煙曲霉的菌株的，例如在wo2006/078256中披露為xyliii的一種，或來自棘孢曲霉的菌株的，例如在wo94/21785中披露為seqidno:5(xylii)或在此的seqidno:6的一種。在一個(gè)實(shí)施例中，木聚糖酶來源于棘孢曲霉，例如示于在此的seqidno:6中的一種木聚糖酶。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，木聚糖酶來源于煙曲霉，例如示于在此的seqidno:8中的一種木聚糖酶?？紤]到的木聚糖酶還包括包含與wo2006/078256中的如在此的seqidno:8所示的煙曲霉木聚糖酶或wo94/21785中披露為seqidno:5(xylii)的或在此的seqidno:6的棘孢曲霉木聚糖酶具有至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％一致性，至少97％、至少98％、至少99％一致性的氨基酸序列的那些。在一個(gè)實(shí)施例中，該木聚糖酶，例如，來源于雷塞特納斯踝節(jié)菌(talaromycesleycettanus)的菌株，包括在纖維素分解酶組合物中，具有與在此的seqidno:16具有至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％一致性、至少97％、至少98％、至少99％一致性的氨基酸序列。β-木糖苷酶在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，用于本發(fā)明的方法中的半纖維素酶是一種β-木糖苷酶，或該半纖維素分解酶組合物包括一種β-木糖苷酶。術(shù)語“β-木糖苷酶”意指β-d-木糖苷木糖水解酶(e.c.3.2.1.37)，其催化短β(1→4)-木寡糖的外切水解，以從非還原末端去除連續(xù)的d-木糖殘基。出于本發(fā)明的目的，一個(gè)單位的β-木糖苷酶定義為在40℃、ph5下在包含0.01％20的100mm檸檬酸鈉中從作為底物的1mm對硝基苯基-β-d-木糖苷每分鐘產(chǎn)生1.0微摩爾的對硝基苯酚陰離子。在本發(fā)明的方法中有用的β-木糖苷酶包括但不限于來自以下各項(xiàng)的β-木糖苷酶：粗糙脈孢菌(swissprot:q7sow4)、里氏木霉(uniprotkb/trembl:q92458)、埃默森踝節(jié)菌(swissprot:q8x212)、以及嗜熱踝節(jié)菌(geneseqp:baa22816)。特別考慮到的β-木糖苷酶的實(shí)例包括來源于曲霉屬的菌株的一種β-木糖苷酶，例如煙曲霉的菌株，例如在wo2013/028928(實(shí)例16和17)或在此的seqidno:9中披露的一種，或來源于木霉屬的菌株，例如里氏木霉的菌株，例如在wo2011/057140中的seqidno:58或在此的seqidno:1的成熟多肽。用于本發(fā)明的方法中的β-木糖苷酶可以包括在一種纖維素分解酶組合物中。在一個(gè)實(shí)施例中，該半纖維素酶是一種纖維素分解酶組合物；例如里氏木霉纖維素分解酶組合物；進(jìn)一步包括一種β-木糖苷酶，例如來源于曲霉屬的菌株的一種β-木糖苷酶，例如煙曲霉的菌株(例如，在wo2011/057140或在此的seqidno:9中披露的一種)，例如在wo2013/028928(實(shí)例16和17)中披露的一種，或來源于木霉屬的菌株，例如里氏木霉的菌株，例如在wo2011/057140中的seqidno:58的成熟多肽?？紤]到的β-木糖苷酶還包括包含與wo2011/057140中披露為seqidno:206的煙曲霉β-木糖苷酶或在此的seqidno:9或在此提到的β-木糖苷酶中的任一種具有至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％一致性，至少97％、至少98％、至少99％一致性的氨基酸序列的那些。在一個(gè)實(shí)施例中，該β-木糖苷酶，例如，來源于埃默森踝節(jié)菌的菌株，包括在纖維素分解酶組合物中，具有與在此的seqidno:17具有至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％一致性，至少97％、至少98％、至少99％一致性的氨基酸序列。用于本發(fā)明的方法中的半纖維素酶可以包括一種商業(yè)半纖維素酶產(chǎn)品。商業(yè)半纖維素酶產(chǎn)品的實(shí)例包括：例如shearzymetm(諾維信公司)、cellictmhtec(諾維信公司)、cellictmhtec2(諾維信公司)、cellictmhtec3(諾維信公司)、(諾維信公司)、(諾維信公司)、hc(諾維信公司)、木聚糖酶(杰能科)、tx-200a(ab酶(abenzymes))、hsp6000木聚糖酶(帝斯曼(dsm))、depoltm333p(生物催化劑有限公司(biocatalystslimit)，英國威爾士(wales,uk))、depoltm740l。(生物催化劑有限公司，英國威爾士)以及depoltm762p(生物催化劑有限公司，英國威爾士)。過氧化氫酶該纖維素分解酶組合物可以包括一種過氧化氫酶。該過氧化氫酶可以是任何過氧化氫酶。該過氧化氫酶可以包括，但不限于e.c.1.11.1.6或e.c.1.11.1.21過氧化氫酶。有用的過氧化氫酶的實(shí)例包括但不限于來自以下各項(xiàng)的過氧化氫酶：海水產(chǎn)堿桿菌(alcaligenesaquamarinus)(wo98/00526)、蘭圖魯斯曲霉(aspergilluslentilus)、煙曲霉、黑曲霉(美國專利號5,360,901)、米曲霉(jp2002223772a；美國專利號6,022,721)、嗜熱葡糖苷酶芽孢桿菌(jp11243961a)、特異腐質(zhì)霉(wo2009/104622，wo2012/130120)、樟絨枝霉、變黑微顫菌(wo98/00526)、粗糙脈孢菌、埃默森青霉菌(wo2012/130120)、嗜松青霉、微小根毛霉、巴斯德酵母(wo2007/105350)、嗜熱柱頂孢霉、柄狀踝節(jié)菌(wo2012/130120)、橙色嗜熱子囊菌(wo2012/130120)、布氏棲熱菌(thermusbrockianus)(wo2005/044994)、和土生梭孢殼霉(wo2010/074972)。有用的過氧化氫酶的非限制性實(shí)例是來自以下各項(xiàng)的過氧化氫酶：專性嗜堿芽孢桿菌(bacilluspseudofirmus)(uniprot：p30266)、枯草芽孢桿菌(uniprot：p42234)、灰腐質(zhì)霉(geneseqp：axq55105)、費(fèi)希新薩托菌(uniprot：a1dju9)、埃默森青霉(geneseqp：bac10987)、嗜松青霉(geneseqp：bac10995)、嗜熱柱頂孢霉(geneseqp：aaw06109或adt89624)、柄狀踝節(jié)菌(geneseqp：bac10983或bac11039；uniprot：b8mt74)以及橙色嗜熱子囊菌(geneseqp：bac11005)。將登錄號以其全部內(nèi)容結(jié)合在此。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，該纖維素分解酶組合物可以包括一種過氧化氫酶，例如，來源于嗜熱子嚢菌屬的一種，特別是橙色嗜熱子囊菌，特別是在wo2012/130120或在此的seqidno:19中示出的一種。在一個(gè)實(shí)施例中，該過氧化氫酶，例如，來自橙色嗜熱子囊菌的菌株的一種過氧化氫酶，選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：(i)一種過氧化氫酶，包括在此的seqidno:19的成熟多肽；(ii)一種過氧化氫酶，包括以下氨基酸序列，該氨基酸序列與在此的seqidno:19的成熟多肽具有至少60％、至少70％，例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。在糖化/水解反應(yīng)中，過氧化氫酶的蛋白含量處于約0.5％至約10％，例如，約0.5％至約7％、約0.5％至約5％、約0.5％至約4％、約0.5％至約3％、約0.5％至約2％、以及約0.5％至約1％的總酶蛋白的范圍內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施例中，過氧化氫酶與纖維素分解酶組合物的蛋白比處于約1:200至約1:10，例如，約1:100至約1:15或約1:50至約1:25的范圍內(nèi)。通過以下實(shí)例進(jìn)一步對本發(fā)明進(jìn)行描述，但不應(yīng)將其理解為對本發(fā)明范圍的限制。材料&方法材料：纖維素分解酶組合物ca(“ca”)：來源于里氏木霉的纖維素分解酶制劑，進(jìn)一步包括具有纖維素分解增強(qiáng)活性的gh61a多肽(該多肽來源于埃默森青霉菌菌株(wo2011/041397中的seqidno:2或在此的seqidno:7))、披露于wo2012/044915中的煙曲霉β-葡糖苷酶(wo2005/047499中的seqidno:2或在此的seqidno:5)變體f100d、s283g、n456e、f512y；wo2011/057140中披露為seqidno:6的和此處seqidno:10中的煙曲霉cel7acbh1以及wo2011/057140中披露為seqidno:18的和在此的seqidno:11的煙曲霉cbhii。此外，纖維素分解酶制劑ca進(jìn)一步包含一種來自里氏木霉的10％的纖維素分解酶制劑，進(jìn)一步包括煙曲霉木聚糖酶(在此的seqidno:8)和煙曲霉β-木糖苷酶(在此的seqidno:9)。纖維素分解酶組合物cb(“cb”)：里氏木霉纖維素分解酶制劑包括以下各項(xiàng)：在此的seqidno:21的egi、在此的seqidno:22的egii、在此的seqidno:14的cbhi；在此的seqidno:15的cbhii；在此的seqidno:5的β-葡糖苷酶變體，該變體具有以下取代：f100d、s283g、n456e、f512y；在此的seqidno:7的aa9(gh61多肽)、在此的seqidno:16中的gh10木聚糖酶；以及在此的seqidno:17的β-木糖苷酶。cibts1260：根據(jù)布達(dá)佩斯條約，由諾維信公司(novozymesa/s)，在農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)培養(yǎng)物保藏中心(nrrl)，北大學(xué)街(northuniversitystreet)1815號，皮奧瑞亞(peoria)，伊利諾伊州(illinois)61604，美國)保藏了釀酒酵母酵母菌，并且給出以下登錄號：保藏登錄號保藏日期cibts1260nrrly-509732014年9月5日bsgx001披露于美國專利號8,586,336-b2(通過引用結(jié)合在此)中，并且被構(gòu)建如下：用載體pjfe3-ruxi轉(zhuǎn)化宿主釀酒酵母菌株bspx042(表型：ura3-251，xks1過量表達(dá)；rpe1、rki1、tal1、和tkl1過量表達(dá)，它們是在ppp中的基因；醛糖還原酶基因gre3的敲除；以及適應(yīng)進(jìn)化后通過缺失基因cox4，電子傳遞呼吸鏈的損傷)，該載體插入有木糖異構(gòu)酶基因(在美國專利號8,586,336-b2中的seqidno:1或在此的seqidno:20)，該木糖異構(gòu)酶基因編碼在美國專利號8,586,336-b2中的seqidno:2或在此的seqidno:13中示出的ruxi。方法：一致性兩個(gè)氨基酸序列之間或兩個(gè)多核苷酸序列之間的相關(guān)性由參數(shù)“一致性”來描述。出于本發(fā)明的目的，兩個(gè)氨基酸序列之間的一致性程度是通過clustal方法(希金斯(higgins)，1989，cabios5:151-153)來確定，其中使用具有一致性表(identitytable)的lasergenetmmegaligntm軟件(dnastar，inc.公司，麥迪遜(madison)，威斯康星州)和以下多重比對參數(shù)：缺口罰分10和缺口長度罰分10。成對比對參數(shù)是：k元組(ktuple)＝1，缺口罰分＝3，窗口＝5，并且對角線＝5。出于本發(fā)明的目的，兩個(gè)多核苷酸序列之間的一致性程度是通過威爾伯-李普曼(wilbur-lipman)方法(威爾伯(wilbur)和李普曼(lipman)，1983，美國國家科學(xué)院院刊(proceedingsofthenationalacademyofscienceusa)80:726-730)來確定，其中使用具有一致性表(identitytable)的lasergenetmmegaligntm軟件(dnastar,inc.公司，麥迪遜(madison)，威斯康星州)和以下多重比對參數(shù)：缺口罰分10和缺口長度罰分10。成對比對參數(shù)是：k元組＝3，缺口罰分＝3和窗口＝20。在此描述并且要求保護(hù)的本發(fā)明不局限于在此披露的特定方面的范圍，因?yàn)檫@些方面旨在作為本發(fā)明若干方面的說明。任何等同方面預(yù)期處于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。實(shí)際上，除在此所示和描述的那些之外，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言本發(fā)明的不同修改將從前述描述變得清楚。這樣的修改也旨在落入所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。在發(fā)生沖突的情況下，以包括定義的本披露為準(zhǔn)。實(shí)例實(shí)例1菌株cibts1000的構(gòu)建.鑒定出是已知從葡萄糖的有效的乙醇生產(chǎn)者的二倍體釀酒酵母菌株。使用來自中國典型培養(yǎng)物保藏中心(cctcc)的釀酒酵母菌株cctccm94055。從表示供體生物體是未知的宏基因組學(xué)項(xiàng)目克隆了稱為mgxi的木糖異構(gòu)酶。此木糖異構(gòu)酶的分離和特征描述于中國專利申請?zhí)?02174549a或美國專利公開號2012/0225452中。使用標(biāo)準(zhǔn)方法從中間假絲酵母克隆稱為gxf的戊糖轉(zhuǎn)運(yùn)體。此木糖轉(zhuǎn)運(yùn)體由d.蘭奎斯特(d.runquist)等人.(蘭奎斯特d.(runquistd)，方西卡c(fonsecac)，瑞德托姆p(radstromp)，斯賓塞-馬丁i(spencer-martinsi)，汗-哈格戴b(hahn-b)：“來自中間假絲酵母的gxf1轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)改進(jìn)了利用重組木糖的釀酒酵母的發(fā)酵性能”(“expressionofthegxf1transporterfromcandidaintermediaimprovesfermentationperformanceinrecombinantxylose-utilizingsaccharomycescerevisiae”).應(yīng)用微生物學(xué)與生物技術(shù)(applmicrobiolbiotechnol)2009,82:123-130)進(jìn)行了描述。使用標(biāo)準(zhǔn)方法將木糖異構(gòu)酶基因與來自釀酒酵母的磷酸丙糖異構(gòu)酶(tpi)啟動(dòng)子和tpi終止子融合，使得木糖異構(gòu)酶在釀酒酵母中的表達(dá)由tpi表達(dá)信號控制。以相同的方式將該gxf基因與該tpi表達(dá)信號融合。插入大腸桿菌克隆載體的這兩種表達(dá)盒包含：·保證該質(zhì)?？稍诖竽c桿菌中增殖的大腸桿菌cole1復(fù)制起點(diǎn)?！碜葬劸平湍傅囊粋€(gè)δ(δ)序列片段?！ひ环N來自印度斯坦鏈異壁菌(streptoalloteichushindustanus)的博來霉素抗性標(biāo)記，用于博來霉素抗性的大腸桿菌或釀酒酵母轉(zhuǎn)化體的選擇。將雙啟動(dòng)子與博來霉素基因的5’端融合，該博來霉素基因由釀酒酵母翻譯延長因子(tef1)啟動(dòng)子和大腸桿菌em7啟動(dòng)子組成。向博來霉素基因的3’端添加釀酒酵母cyc1終止子。整個(gè)博來霉素表達(dá)盒側(cè)翼有l(wèi)oxp位點(diǎn)以能夠通過cre-lox重組來使該表達(dá)盒缺失(b.薩奧爾(b.sauer)：“酵母菌釀酒酵母中的cre-lox位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)的功能性表達(dá)”(“functionalexpressionofthecre-loxsitespecificrecombinationsystemintheyeastsaccharomycescerevisiae.”)分子細(xì)胞生物學(xué)(mol.cell.biol.)1987,7:2087-2096)。該木糖異構(gòu)酶/戊糖轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)質(zhì)粒被稱為pyie2-mgxi-gxf1-δ，并且在圖1中示出。該質(zhì)粒pyie2-mgxi-gxf1-δ最初由xhoi消化來線性化，然后轉(zhuǎn)化為親本菌株釀酒酵母cctccm94055，隨后選擇博來霉素抗性轉(zhuǎn)化體。分離具有整合到δ序列中的質(zhì)粒的稱為cibts0912的菌株。然后通過瞬時(shí)cre重組酶表達(dá)來缺失位于兩個(gè)loxp位點(diǎn)之間的博來霉素抗性盒，生成菌株cibts0914。實(shí)現(xiàn)的該瞬時(shí)cre重組酶表達(dá)類似于由普瑞(prein)等人(普瑞b(preinb)，耐特k(natterk)，考文sd(kohlweinsd).“用于在酵母釀酒酵母中構(gòu)建綠色熒光蛋白的n-末端染色體融合的新策略”(“anovelstrategyforconstructingn-terminalchromosomalfusionstogreenfluorescentproteinintheyeastsaccharomycescerevisiae”).歐洲生物化學(xué)學(xué)會(huì)聯(lián)盟通訊(febslett.)2000:485,29-34.)描述的酵母菌標(biāo)準(zhǔn)方法，用一種不穩(wěn)定的質(zhì)粒表達(dá)該cre重組酶來轉(zhuǎn)化，隨后再次固化那一質(zhì)粒。在這項(xiàng)工作中，酵母菌標(biāo)準(zhǔn)載體psh47的卡那霉素基因被潮霉素抗性標(biāo)記替代，使得使用潮霉素的選擇，而不是選擇卡那霉素抗性。使用psh47-hyg的質(zhì)粒的質(zhì)粒圖在圖2中示出。再次用xhoi消化的pyie2-mgxi-gxf1-δ轉(zhuǎn)化菌株cibts0914，以增加兩個(gè)表達(dá)盒的拷貝數(shù)，并且選擇博來霉素抗性菌株cibts0916。為了過量表達(dá)戊糖磷酸途徑的基因，裝配容納經(jīng)選擇的戊糖磷酸途徑的基因的表達(dá)質(zhì)粒。選擇用于過量表達(dá)的基因是：1.木酮糖激酶(xks1)。2.轉(zhuǎn)醛醇酶(tal1)。3.核酮糖5磷酸差向異構(gòu)酶(rpe1)。4.轉(zhuǎn)酮酶(tkl1)。5.核糖5磷酸異構(gòu)酶(rki1)除了這些基因之外，被loxp位點(diǎn)包圍的kanmx選擇盒被包括作為大腸桿菌-釀酒酵母穿梭載體pug6的一部分(蓋登納u(güldeneru)，?？藄(hecks)，菲爾德t(fieldert)，貝霍爾j(beinhauerj)，黑格曼jh.(hegemannjh.)用于芽殖酵母中重復(fù)使用的一種新的有效的基因破壞盒(“anewefficientgenedisruptioncassetteforrepeateduseinbuddingyeast.”)nar1996,24:2519-24)。生成的質(zhì)粒pyie2-xks1-ppp-δ的圖在圖3中示出。使用列出遺傳要素的表如下所示：將質(zhì)粒pyie2-xks1-ppp-δ用noti消化，并且通過瓊脂糖凝膠電泳去除這些載體元件。然后將包含所有表達(dá)盒的線性片段轉(zhuǎn)化到cibts0916中，用于雙重同源重組，隨后選擇卡那霉素(g418)抗性。選擇卡那霉素抗性菌落，并且稱為cibts0931。cibts0931包含博來霉素選擇標(biāo)記和卡那霉素選擇標(biāo)記二者。它們二者的側(cè)翼都具有l(wèi)oxp重組位點(diǎn)。為了去除博來霉素和卡那霉素抗性標(biāo)記，用附加體質(zhì)粒psh47-hygs再次轉(zhuǎn)化該菌株，并且在包含潮霉素的平板上選擇轉(zhuǎn)化體。隨后，進(jìn)行針對已經(jīng)失去博來霉素和卡那霉素抗性的轉(zhuǎn)化體的篩選，并且在此之后，進(jìn)行針對也失去潮霉素抗性標(biāo)記的菌株的篩選。選擇菌株cibts1000，并且示出已經(jīng)失去質(zhì)粒psh47-hyg。實(shí)例2菌株cibts1000對高木糖攝取和乙酸鹽抗性的適應(yīng)。修飾該菌株cibts1000，使得它可以利用木糖作為碳源，并且將其發(fā)酵為乙醇。然而，該木糖利用是非常低效的。改進(jìn)代謝工程領(lǐng)域中的那個(gè)問題的一種熟知方式是使用適應(yīng)。在這種情況下也是這樣進(jìn)行的。在包含木糖作為唯一碳源和已知存在于纖維素生物質(zhì)水解產(chǎn)物中的酵母生長抑制劑的培養(yǎng)基中，將菌株cibts1000從搖瓶連續(xù)轉(zhuǎn)移至搖瓶。在這些連續(xù)轉(zhuǎn)移中累積突變，使得菌株在所提供的條件下更好地生長-并且由此更好地利用木糖。在第一輪適應(yīng)中，使用ypx培養(yǎng)基(10g/l酵母菌提取物、20g/l蛋白胨、和20g/l木糖)和ypdx(10g/l酵母菌提取物、20g/l蛋白胨、10g/l葡萄糖、和10g/l木糖)，將cibts1000在搖瓶系統(tǒng)中連續(xù)轉(zhuǎn)移。在適應(yīng)的第二輪中，在ypxi(補(bǔ)充有43mm甲酸鈉、50mm乙酸鈉、和100mm硫酸鈉的ypx)和ypdxi(補(bǔ)充有43mm甲酸鈉、50mm乙酸鈉、和100mm硫酸鈉的ypdx)中進(jìn)行連續(xù)轉(zhuǎn)移。在適應(yīng)的最后一輪中，使補(bǔ)充有10g/l酵母菌提取物、20g/l蛋白胨、10g/l葡萄糖和10g/l木糖的nrel稀酸預(yù)處理的玉米秸稈水解產(chǎn)物(參見實(shí)例3)來進(jìn)行連續(xù)轉(zhuǎn)移。選擇名為cibts1260-j132-f3的菌株作為適應(yīng)的菌株。實(shí)例3在nrel稀酸預(yù)處理的玉米秸稈水解產(chǎn)物中的cibts1260和bsgx001的發(fā)酵比較將兩種釀酒酵母菌株(cibts1260和bsgx001)在nrel稀酸預(yù)處理的玉米秸稈水解產(chǎn)物(4％w/w硫酸，在180℃下持續(xù)5分鐘)中進(jìn)行測試。在20kg反應(yīng)器中，在50℃下，用纖維素分解酶組合物ca的20mg酶蛋白/g葡聚糖水解3天后，產(chǎn)生水解產(chǎn)物。稀酸預(yù)處理的玉米秸稈水解產(chǎn)物具有63.2g/l葡萄糖、44.9g/l木糖、0.8g/l甘油、和9.5g/l乙酸鹽的最終組成。發(fā)酵之前，每個(gè)菌株在30℃空氣震蕩器中，在150rpm下，在ypd培養(yǎng)基(10g/l酵母菌提取物、20g/l蛋白胨、和20g/l葡萄糖)上進(jìn)行繁殖。生長24小時(shí)后，將這兩種酵母菌菌株在50ml的水解產(chǎn)物中，在125ml帶擋板的錐形瓶(以1g干細(xì)胞重量(dcw)/l的酵母菌投料)中進(jìn)行測試。使用裝配有18號鈍頭填充針的橡皮塞來密封每個(gè)燒瓶，并將這些燒瓶置于35℃，150rpm的速度下的空氣震蕩器中。在24、48和72小時(shí)取樣，經(jīng)由hplc分析用于確定葡萄糖、木糖、和乙醇的濃度。將每組3個(gè)重復(fù)的結(jié)果進(jìn)行平均，并且在圖1中給出，其示出了在72小時(shí)內(nèi)，以1g/l酵母菌投料的nrel酸預(yù)處理的玉米秸稈水解產(chǎn)物中，cibts1260對比bsgx001的比較。如在圖4中所示，通過48小時(shí)發(fā)酵，cibts1260菌株完成了完全的木糖消耗，并且產(chǎn)生了大約47g/l乙醇。然而，bsgx001菌株攝取用于乙醇轉(zhuǎn)化的葡萄糖緩慢，并且因此消耗了僅3g/l木糖。這些結(jié)果表明，與bsgx001相比，cibts1260導(dǎo)致了改進(jìn)的用于轉(zhuǎn)化至乙醇的木糖攝取和利用。實(shí)例4在模式培養(yǎng)基中，針對發(fā)酵性能進(jìn)行cibts1260和bsgx001的比較將cibts1260及其前體bsgx001的發(fā)酵性能進(jìn)行比較。發(fā)酵之前，每個(gè)菌株在30℃空氣震蕩器中，在150rpm下，在ypd培養(yǎng)基(10g/l酵母菌提取物、20g/l蛋白胨、和20g/l葡萄糖)上進(jìn)行繁殖。生長24小時(shí)后，將這兩種酵母菌菌株在ypx培養(yǎng)基(5g/l酵母菌提取物、5g/l蛋白胨、和50g/l木糖)中進(jìn)行測定。為了測試發(fā)酵性能，將每個(gè)菌株在50ml的ypx培養(yǎng)基中，在125ml帶擋板的錐形瓶中(以2gdcw/l酵母菌投料)中進(jìn)行接種。使用裝配有18號鈍頭填充針的橡皮塞來密封每個(gè)燒瓶，并將這些燒瓶置于32℃，150rpm的速度下的空氣震蕩器中。在24、48和72小時(shí)取樣，經(jīng)由hplc分析用于確定葡萄糖、木糖、和乙醇的濃度。將每組3個(gè)重復(fù)的結(jié)果進(jìn)行平均，并在圖5中給出。如在圖5中所示，cibts1260(虛線)在24小時(shí)內(nèi)已經(jīng)完全利用了所有可用的木糖，并產(chǎn)生了21.3g/l的乙醇。在72小時(shí)發(fā)酵期間內(nèi)，bsgx001(實(shí)線)消耗了1.5g/l的木糖，并且所得乙醇濃度是1.3g/l。實(shí)例5具有cibts1260的纖維素分解酶組合物ca(“ca”)和纖維素分解酶組合物cb(“cb”)甘蔗渣水解產(chǎn)物的發(fā)酵將cibts1260用于使用在美國諾維信北美公司(novozymesnorthamerica，usa)產(chǎn)生的nrel稀酸預(yù)處理的甘蔗渣水解產(chǎn)物的發(fā)酵測試中。在2lika反應(yīng)器中，在50℃下，用兩種纖維素分解酶組合物(稱為“ca”和“cb”)的6mg酶蛋白/g葡聚糖的劑量水解5天后，產(chǎn)生水解產(chǎn)物。這些材料是針對具有以下最終組成的稀酸預(yù)處理的甘蔗渣水解產(chǎn)物的代表性的基準(zhǔn)：分別針對“ca”和“cb”，40.7g/l和58.7g/l葡萄糖、42.5g/l和44.7g/l木糖、0.19g/l和0.08g/l甘油、以及8.99g/l和11.3g/l乙酸鹽。發(fā)酵之前，將酵母菌在30℃空氣震蕩器中，在150rpm下，在2％ypd培養(yǎng)基(10g/l酵母菌提取物、20g/l蛋白胨、以及20g/l葡萄糖)上進(jìn)行繁殖。生長24小時(shí)后，將cibts1260在50ml的“ca”和“cb”水解產(chǎn)物中，在125ml帶擋板的錐形瓶中(以1gdcw/l的酵母菌投料)中進(jìn)行測試。使用裝配有18號鈍頭填充針的橡皮塞來密封每個(gè)燒瓶，并將這些燒瓶置于35℃，150rpm的速度下的空氣震蕩器中。在24、48和72小時(shí)取樣，經(jīng)由hplc分析用于確定葡萄糖、木糖、乙醇、乙酸鹽、和甘油的濃度。將每組3個(gè)重復(fù)的結(jié)果進(jìn)行平均，并在圖6中給出。在72小時(shí)時(shí)間段內(nèi)，存在于兩種系統(tǒng)中的大于95％的葡萄糖和木糖被消耗，其中基于總糖的乙醇產(chǎn)率對于“ca”水解產(chǎn)物為84.1％，對于“cb”水解產(chǎn)物為86.4％。實(shí)例6稀酸預(yù)處理的玉米秸稈和甘蔗的甘蔗渣水解產(chǎn)物的cibts1260和bsgx001發(fā)酵過程中的dp2減少將來自美國國家可再生能源實(shí)驗(yàn)室(nrel)的稀酸預(yù)處理的玉米秸桿和甘蔗的甘蔗渣在50℃下，2lika反應(yīng)器中，用兩種酶產(chǎn)物混合物(稱為ca和cb)的6mg酶蛋白/g葡聚糖劑量，持續(xù)5天進(jìn)行水解。發(fā)酵之前，將cibts1260和bsgx001酵母菌在30℃空氣震蕩器中，在150rpm下，在ypd培養(yǎng)基(10g/l酵母菌提取物、20g/l蛋白胨、以及20g/l葡萄糖)上進(jìn)行繁殖。生長24小時(shí)后，經(jīng)由離心收獲來自每個(gè)菌株的細(xì)胞，并且將這些細(xì)胞分別添加至在125ml帶擋板的錐形瓶中的補(bǔ)充有2g/l尿素的50ml的ca和cb水解產(chǎn)物(以1gdcw/l(干細(xì)胞重量/l)的酵母菌投料)。使用裝配有18號鈍頭填充針的橡皮塞來密封每個(gè)燒瓶，并將這些燒瓶置于35℃，150rpm的速度下的空氣震蕩器中。在0小時(shí)和72小時(shí)取樣，經(jīng)由hplc分析用于確定dp2濃度。將每組的重復(fù)的結(jié)果進(jìn)行平均(對于cibts1260，n＝3，并且對于bsgx001，n＝2)。如圖7所示，在相同的水解產(chǎn)物中，使用cibts1260進(jìn)行的發(fā)酵比使用bsgx001的發(fā)酵更多地降低了dp2濃度。如在hplc上測量的dp2峰，包含纖維二糖和短鏈的糖。序列表<110>諾維信公司（novozymesa/s）薩頓（sutton）,凱特布蘭登（katebrandon）刁（diao）,劉楊（liuyang）江（jiang）,宇（yu）楊（yang）,盛（sheng）<120>用于生產(chǎn)乙醇的方法和發(fā)酵生物<130>13021-wo-pct[4]<160>22<170>patentin版本3.5<210>1<211>797<212>prt<213>里氏木霉<400>1metvalasnasnalaalaleuleualaalaleuseralaleuleupro151015thralaleualaglnasnasnglnthrtyralaasntyrseralagln202530glyglnproaspleutyrprogluthrleualathrleuthrleuser354045pheproaspcysgluhisglyproleulysasnasnleuvalcysasp505560serseralaglytyrvalgluargalaglnalaleuileserleuphe65707580thrleuglugluleuileleuasnthrglnasnserglyproglyval859095proargleuglyleuproasntyrglnvaltrpasnglualaleuhis100105110glyleuaspargalaasnphealathrlysglyglyglnpheglutrp115120125alathrserpheprometproileleuthrthralaalaleuasnarg130135140thrleuilehisglnilealaaspileileserthrglnalaargala145150155160pheserasnserglyargtyrglyleuaspvaltyralaproasnval165170175asnglypheargserproleutrpglyargglyglngluthrprogly180185190gluaspalaphepheleuserseralatyrthrtyrglutyrilethr195200205glyileglnglyglyvalaspprogluhisleulysvalalaalathr210215220vallyshisphealaglytyraspleugluasntrpasnasnglnser225230235240argleuglypheaspalaileilethrglnglnaspleuserglutyr245250255tyrthrproglnpheleualaalaalaargtyralalysserargser260265270leumetcysalatyrasnservalasnglyvalprosercysalaasn275280285serphepheleuglnthrleuleuargglusertrpglypheproglu290295300trpglytyrvalserseraspcysaspalavaltyrasnvalpheasn305310315320prohisasptyralaserasnglnserseralaalaalaserserleu325330335argalaglythraspileaspcysglyglnthrtyrprotrphisleu340345350asngluserphevalalaglygluvalserargglygluilegluarg355360365servalthrargleutyralaasnleuvalargleuglytyrpheasp370375380lyslysasnglntyrargserleuglytrplysaspvalvallysthr385390395400aspalatrpasnilesertyrglualaalavalgluglyilevalleu405410415leulysasnaspglythrleuproleuserlyslysvalargserile420425430alaleuileglyprotrpalaasnalathrthrglnmetglnglyasn435440445tyrtyrglyproalaprotyrleuileserproleuglualaalalys450455460lysalaglytyrhisvalasnphegluleuglythrgluilealagly4654704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