本發(fā)明屬于免疫學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種姜黃醇半抗原及完全抗原的合成方法。

背景技術(shù)：

姜黃醇又名姜黃環(huán)氧醇，目前姜黃醇的測(cè)定方法主要有比色法、紅外分光光度法、雙波長(zhǎng)掃描法、氣相色譜法等方法，而上述方法在快速、批量檢測(cè)方面均存在一定的缺陷。免疫分析方法因其具有操作簡(jiǎn)便、靈敏、穩(wěn)定、快速和高通量檢測(cè)的特點(diǎn)，在中藥材的質(zhì)量監(jiān)測(cè)與評(píng)價(jià)方面具有較好的應(yīng)用前景。具有與檢測(cè)成分對(duì)應(yīng)的抗體是免疫分析的關(guān)鍵，姜黃醇為小分子天然化合物，相對(duì)分子量236.35，僅具有反應(yīng)原性，而不具有免疫原性，小分子往往不直接與載體蛋白連接，通過(guò)偶聯(lián)劑與載體蛋白交聯(lián)。因此需要與大分子蛋白等偶聯(lián)形成復(fù)合物后才能成為完全抗原，但現(xiàn)有技術(shù)中完全抗原的產(chǎn)率僅有52％，需要進(jìn)一步提高產(chǎn)率。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述問(wèn)題，本發(fā)明的主要目的在于提供一種姜黃醇半抗原及完全抗原的合成方法，從姜黃醇到最終偶聯(lián)產(chǎn)物產(chǎn)率得到完全抗原的產(chǎn)率可達(dá)90％。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：一種姜黃醇半抗原的合成方法，包括如下步驟：

提供第一溶液，其中所述第一溶液包含姜黃醇和丁二酸酐分散于第一溶劑中，所述第一溶劑為吡啶；

加熱所述第一溶液反應(yīng)，反應(yīng)后的所述第一溶液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)以旋干得到固體；

采用弱堿性溶液溶解所述固體得到第二溶液，在所述第二溶液中加入酸性溶液，直至有沉淀析出，加入酯類物質(zhì)進(jìn)行萃取，合并有機(jī)相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)以旋干有機(jī)相，得固體姜黃醇-丁二酸單酯偶聯(lián)物。

作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述姜黃醇和丁二酸酐在第一溶液中的摩爾比為2:3。

作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述姜黃醇和丁二酸酐在第一溶液中的濃度分別為0.05M和0.075M。

作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述加熱溫度為50-80℃。

作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述加熱溫度為70℃。

作為進(jìn)一步的優(yōu)選，加熱所述第一溶液反應(yīng)過(guò)夜。

作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述弱堿性溶液為碳酸氫鈉的水溶液，所述碳酸氫鈉水溶液的濃度為1％-10％。

作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述碳酸氫鈉水溶液的濃度為5％。

作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述酸性溶液為鹽酸溶液。

作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述酯類物質(zhì)選自乙酸乙酯、乙酸異戊酯和苯甲酸甲酯。

作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述酯類物質(zhì)為乙酸乙酯。

一種姜黃醇完全抗原的合成方法，包括如下步驟：

提供第三溶液，其中所述第三溶液包含姜黃醇-丁二酸單酯偶聯(lián)物分散于第三溶劑中；

提供第四溶液，其中所述第四溶液包含EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺)和NHS(N-羥基琥珀酰亞胺)分散于水中；

將所述第四溶液加入到所述第三溶液中反應(yīng)得到反應(yīng)液；

將所述反應(yīng)液加入到載體蛋白溶液中，反應(yīng)后透析得到最終偶聯(lián)產(chǎn)物。

作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述第三溶劑為DMF。

作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述第三溶液中姜黃醇-丁二酸單酯偶聯(lián)物的濃度為0.143M。

作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述第四溶液中EDC的濃度為0.16-2.6M，所述第四溶液中NHS的濃度為0.087-0.261M。

作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述第四溶液中EDC的濃度為0.16M，所述第四溶液中NHS的濃度為0.16M。

作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述第四溶液和所述第三溶液的反應(yīng)溫度為4-8℃。

作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述第四溶液和所述第三溶液的反應(yīng)溫度為4℃。

作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述第四溶液和所述第三溶液反應(yīng)過(guò)夜。

作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述載體蛋白溶液的濃度為0.03-0.22mM。

作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述載體蛋白溶液的濃度為0.13mM。

作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述透析步驟為：透析時(shí)間為3d，透析液為1×PBS(磷酸緩沖鹽溶液)，每天更換透析液三次。

本發(fā)明的有益效果是：

(1)本發(fā)明采用姜黃醇為原料可制備得到姜黃醇半抗原及完全抗原，根據(jù)姜黃醇結(jié)構(gòu)中存在C6羥基的特點(diǎn)，本發(fā)明先將姜黃醇制備成姜黃醇琥珀酸單酯(姜黃醇-丁二酸單酯偶聯(lián)物)，然后再與BSA(牛血清白蛋白)或OVA(雞蛋清白蛋白)偶聯(lián)形成復(fù)合物，從而成為完全抗原，且從姜黃醇到最終偶聯(lián)產(chǎn)物，得到完全抗原的產(chǎn)率可達(dá)90％。

(2)本發(fā)明的合成步驟簡(jiǎn)單，所需的實(shí)驗(yàn)條件溫和，產(chǎn)物容易得到，且穩(wěn)定性高。

(3)本發(fā)明可制備姜黃醇單克隆抗體，為利用酶聯(lián)免疫吸附方法對(duì)含姜黃醇的中草藥進(jìn)行定性或定量分析提供了可能，可用于大規(guī)模生產(chǎn)的中藥質(zhì)量控制、中草藥原料藥的鑒定、中藥活性成分的體內(nèi)分析及中草藥有效成分的純化等諸多方面，同時(shí)為完善中藥的質(zhì)量評(píng)價(jià)體系和方法起到積極的作用，具有快速、靈敏、精確和簡(jiǎn)便等特點(diǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例姜黃醇半抗原的合成方法的流程示意圖。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例姜黃醇-HS-BSA的紫外鑒定結(jié)果示意圖。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例姜黃醇-HS-OVA的紫外鑒定結(jié)果示意圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明通過(guò)提供一種姜黃醇半抗原及完全抗原的合成方法，解決了現(xiàn)有技術(shù)中得到完全抗原產(chǎn)率低的問(wèn)題。

為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明實(shí)施例的主要思路是：

本發(fā)明實(shí)施例姜黃醇半抗原的合成方法，包括如下步驟：

提供第一溶液，其中所述第一溶液包含姜黃醇和丁二酸酐分散于第一溶劑中，所述第一溶劑為吡啶；

加熱所述第一溶液反應(yīng)，反應(yīng)后的所述第一溶液經(jīng)過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)以旋干得到固體；

采用弱堿性溶液溶解所述固體得到第二溶液，在所述第二溶液中加入酸性溶液，直至有沉淀析出，加入酯類物質(zhì)進(jìn)行萃取，合并有機(jī)相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)以旋干有機(jī)相，得固體姜黃醇-丁二酸單酯偶聯(lián)物。

本發(fā)明實(shí)施例姜黃醇完全抗原的合成方法，包括如下步驟：

提供第三溶液，其中所述第三溶液包含姜黃醇-丁二酸單酯偶聯(lián)物分散于第三溶劑中；

提供第四溶液，其中所述第四溶液包含EDC和NHS分散于水中；

將所述第四溶液加入到所述第三溶液中反應(yīng)得到反應(yīng)液；

將所述反應(yīng)液加入到載體蛋白溶液中，反應(yīng)后透析得到最終偶聯(lián)產(chǎn)物。

本發(fā)明實(shí)施例所述術(shù)語(yǔ)“分散”可理解為溶質(zhì)溶解在溶劑中，溶解姜黃醇和丁二酸酐的第一溶劑可選為吡啶，吡啶除了作為溶劑，亦有催化姜黃醇和丁二酸酐反應(yīng)的作用。選擇姜黃醇和丁二酸酐物質(zhì)的用量，使得兩者在第一溶劑中呈一定比例的濃度，以達(dá)到最佳的反應(yīng)效果。

本發(fā)明實(shí)施例所述加熱所述第一溶液反應(yīng)時(shí)，一般為加熱反應(yīng)過(guò)夜，可采用水浴加熱，溫度為50-80℃，優(yōu)選為70℃。反應(yīng)后的所述第一溶液一般采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀以旋干。

所述酸性溶液加入到弱堿性溶液時(shí)可采用滴加，并且兩者采用適當(dāng)?shù)臐舛?，以達(dá)到較好的沉淀效果；所述酯類物質(zhì)為揮發(fā)性酯類物質(zhì)，例如可采用乙酸乙酯、乙酸異戊酯和苯甲酸甲酯等安全且萃取效果好的揮發(fā)性物質(zhì)。

本發(fā)明實(shí)施例采用的EDC/NHS水溶液可以將反應(yīng)不穩(wěn)定的中間產(chǎn)物變穩(wěn)定，反應(yīng)活性不變；將所述第四溶液加入到所述第三溶液中反應(yīng)得到反應(yīng)液時(shí)，其中的加入可采用滴加，控制一定的速度；其中的反應(yīng)可為反應(yīng)過(guò)夜。

為了讓本發(fā)明之上述和其它目的、特征、和優(yōu)點(diǎn)能更明顯易懂，下文特舉數(shù)實(shí)施例，來(lái)說(shuō)明本發(fā)明所述之姜黃醇半抗原及完全抗原的合成方法。

實(shí)施例1

本發(fā)明實(shí)施例1姜黃醇半抗原衍生物合成步驟如下：

(1)稱取姜黃醇118mg(0.5mmol)，75mg(0.75mmol)丁二酸酐溶解于10mL吡啶中，70℃水浴加熱反應(yīng)過(guò)夜；

(2)取出反應(yīng)液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干；

(3)用5％NaHCO₃的水溶液20mL溶解步驟(2)中已烘干的固體；

(4)用1M HCl滴加入上述步驟(3)溶液中，調(diào)pH至2，如有沉淀析出，則繼續(xù)以下步驟：

(5)加入適量的乙酸乙酯進(jìn)行萃取，重復(fù)3次；

(6)合并有機(jī)相，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干有機(jī)相，得固體，收集后備用；

本發(fā)明實(shí)施例姜黃醇-HS-BSA合成步驟：

(1)稱取姜黃醇-HS(姜黃醇-丁二酸單酯)24mg溶于0.5mL的DMF中，為A液；

(2)取EDC 30mg，NHS 18mg溶于1mL的水中，為B液；

(3)將B液滴入A液中，4℃反應(yīng)過(guò)夜，為C液；

(4)稱取BSA 94mg溶于10mL PBS中，將C液加入至BSA溶液中，反應(yīng)8h后透析3d，每天更換透析液3次(透析液為1×PBS)從姜黃醇到最終偶聯(lián)產(chǎn)物的產(chǎn)率達(dá)到75.6％。

實(shí)施例2

姜黃醇半抗原衍生物合成步驟如下：

(1)稱取姜黃醇118mg(0.5mmol)，75mg(0.75mmol)丁二酸酐溶解于10mL吡啶中，70℃水浴加熱反應(yīng)過(guò)夜；

(2)取出反應(yīng)液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干；

(3)用5％NaHCO₃的水溶液20mL溶解已烘干的固體；

(4)用1M HCl滴加入上述溶液中，調(diào)pH至2，如有沉淀析出，則繼續(xù)以下步驟：

(5)加入適量的乙酸乙酯進(jìn)行萃取，重復(fù)3次；

(6)合并有機(jī)相，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干有機(jī)相，得固體，收集后備用；

姜黃醇-HS-OVA合成步驟如下：

(1)稱取姜黃醇-HS 24mg溶于0.5mL的DMF中，為A液；

(2)取EDC 30mg，NHS 18mg溶于1mL的水中，為B液；

(3)將B液滴入A液中，4℃反應(yīng)過(guò)夜，為C液；

(4)稱取OVA 63mg溶于10mL PBS中，將C液加入至BSA溶液中，反應(yīng)8h后透析3d，每天更換透析液3次(透析液為1×PBS)從姜黃醇到最終偶聯(lián)產(chǎn)物的產(chǎn)率達(dá)到89.2％。

實(shí)施例3

姜黃醇半抗原衍生物合成步驟:

(1)稱取姜黃醇118mg(0.5mmol)，75mg(0.75mmol)丁二酸酐溶解于10mL吡啶中，80℃水浴加熱反應(yīng)過(guò)夜；

(2)取出反應(yīng)液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干；

(3)用1％NaHCO₃ 40mL溶解已烘干的固體；

(4)用1M HCl滴加入上述溶液中，調(diào)pH至2，如有沉淀析出，則繼續(xù)以下步驟：

(5)加入適量的乙酸異戊酯進(jìn)行萃取，重復(fù)3次；

(6)合并有機(jī)相，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干有機(jī)相，得固體，收集后備用。

姜黃醇-HS-BSA合成步驟：

(1)稱取姜黃醇-HS 24mg溶于0.5mL的DMF中，為A液；

(2)取EDC 300mg，NHS 28mg溶于10mL的水中，為B液；

(3)將B液滴入A液中，4℃反應(yīng)過(guò)夜，為C液；

(4)稱取BSA 94mg溶于10mL PBS中，將C液加入至BSA溶液中，反應(yīng)8h后透析3d，每天更換透析液3次(透析液為1×PBS)從姜黃醇到最終偶聯(lián)產(chǎn)物的產(chǎn)率達(dá)到85.6％。

實(shí)施例4

1.姜黃醇半抗原衍生物合成步驟:

(1)稱取姜黃醇118mg(0.5mmol)，75mg(0.75mmol)丁二酸酐溶解于10mL吡啶中，50℃水浴加熱反應(yīng)過(guò)夜；

(2)取出反應(yīng)液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干；

(3)用10％NaHCO₃ 15mL溶解已烘干的固體；

(4)用1M HCl滴加入上述溶液中，調(diào)pH至2，如有沉淀析出，則繼續(xù)以下步驟:

(5)加入適量的苯甲酸甲酯進(jìn)行萃取，重復(fù)3次；

(6)合并有機(jī)相，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干有機(jī)相，得固體，收集后備用。

2.姜黃醇-HS-OVA合成步驟:

(1)稱取姜黃醇-HS 24mg溶于0.5mL的DMF中，為A液；

(2)取EDC 100mg，NHS 20mg溶于5mL的水中，為B液；

(3)將B液滴入A液中，8℃反應(yīng)過(guò)夜，為C液；

(4)稱取OVA63mg溶于10mL PBS中，將C液加入至BSA溶液中，反應(yīng)8h后透析3d，每天更換透析液3次(透析液為1×PBS)從姜黃醇到最終偶聯(lián)產(chǎn)物的產(chǎn)率達(dá)到90.5％。

實(shí)施例5

姜黃醇半抗原衍生物合成步驟:

(1)稱取姜黃醇118mg(0.5mmol)，75mg(0.75mmol)丁二酸酐溶解于10mL吡啶中，60℃水浴加熱反應(yīng)過(guò)夜；

(2)取出反應(yīng)液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干；

(3)用3％NaHCO₃ 18mL溶解已烘干的固體；

(4)用1M HCl滴加入上述溶液中，調(diào)pH至2，如有沉淀析出，則繼續(xù)以下步驟:

(5)加入適量的乙酸乙酯進(jìn)行萃取，重復(fù)3次；

(6)合并有機(jī)相，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干有機(jī)相，得固體，收集后備用。

姜黃醇-HS-BSA合成步驟:

(1)稱取姜黃醇-HS 24mg溶于0.5mL的DMF中，為A液；

(2)取EDC 200mg，NHS 20mg溶于8mL的水中，為B液；

(3)將B液滴入A液中，6℃反應(yīng)過(guò)夜，為C液；

(4)稱取BSA 150mg溶于10mL PBS中，將C液加入至BSA溶液中，反應(yīng)8h后透析3d，每天更換透析液3次(透析液為1×PBS)從姜黃醇到最終偶聯(lián)產(chǎn)物的產(chǎn)率達(dá)到83.5％。

實(shí)施例6

姜黃醇半抗原衍生物合成步驟:

(1)稱取姜黃醇118mg(0.5mmol)，75mg(0.75mmol)丁二酸酐溶解于10mL吡啶中，70℃水浴加熱反應(yīng)過(guò)夜；

(2)取出反應(yīng)液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干；

(3)用5％NaHCO₃ 20mL溶解已烘干的固體；

(4)用1M HCl滴加入上述溶液中，調(diào)pH至2，如有沉淀析出，則繼續(xù)以下步驟：

(5)加入適量的乙酸乙酯進(jìn)行萃取，重復(fù)3次；

(6)合并有機(jī)相，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干有機(jī)相，得固體，收集后備用。

姜黃醇-HS-OVA合成步驟：

(1)稱取姜黃醇-HS 24mg溶于0.5mL的DMF中，為A液；

(2)取EDC 50mg，NHS 10mg溶于3mL的水中，為B液；

(3)將B液滴入A液中，5℃反應(yīng)過(guò)夜，為C液；

(4)稱取OVA 30mg溶于10mLPBS中，將C液加入至BSA溶液中，反應(yīng)8h后透析3d，每天更換透析液3次(透析液為1×PBS)從姜黃醇到最終偶聯(lián)產(chǎn)物的產(chǎn)率達(dá)到72.6％。

實(shí)驗(yàn)例 本實(shí)施例1和2中姜黃醇的兩種偶聯(lián)物鑒定：

以紫外分光光度計(jì)測(cè)定姜黃醇、姜黃醇-HS-BSA和BSA最大吸收峰。如下圖2所示：姜黃醇、姜黃醇-HS-BSA和BSA最大吸收波長(zhǎng)分別為238nm、274nm和280nm；如下圖3所示：姜黃醇、姜黃醇-HS-OVA和OVA最大吸收波長(zhǎng)分別為273nm、263nm和275nm。載體偶聯(lián)本發(fā)明實(shí)施例半抗原后最大吸收波長(zhǎng)發(fā)生改變，證明偶聯(lián)物合成成功。

上述本申請(qǐng)實(shí)施例中的技術(shù)方案，至少具有如下的技術(shù)效果或優(yōu)點(diǎn)：

(1)本發(fā)明采用姜黃醇為原料可制備得到姜黃醇半抗原及完全抗原，根據(jù)姜黃醇結(jié)構(gòu)中存在C6羥基的特點(diǎn)，本發(fā)明先將姜黃醇制備成姜黃醇琥珀酸單酯，然后再與BSA或OVA偶聯(lián)形成復(fù)合物，從而成為完全抗原，且從姜黃醇到最終偶聯(lián)產(chǎn)物，得到完全抗原的產(chǎn)率可達(dá)90％。

(2)本發(fā)明的合成步驟簡(jiǎn)單，所需的實(shí)驗(yàn)條件溫和，產(chǎn)物容易得到，且穩(wěn)定性高。

(3)本發(fā)明可制備姜黃醇單克隆抗體，為利用酶聯(lián)免疫吸附方法對(duì)含姜黃醇的中草藥進(jìn)行定性或定量分析提供了可能，可用于大規(guī)模生產(chǎn)的中藥質(zhì)量控制、中草藥原料藥的鑒定、中藥活性成分的體內(nèi)分析及中草藥有效成分的純化等諸多方面，同時(shí)為完善中藥的質(zhì)量評(píng)價(jià)體系和方法起到積極的作用，具有快速、靈敏、精確和簡(jiǎn)便等特點(diǎn)。

盡管已描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，但本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員一旦得知了基本創(chuàng)造性概念，則可對(duì)這些實(shí)施例作出另外的變更和修改。所以，所附權(quán)利要求意欲解釋為包括優(yōu)選實(shí)施例以及落入本發(fā)明范圍的所有變更和修改。顯然，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種改動(dòng)和變型而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。這樣，倘若本發(fā)明的這些修改和變型屬于本發(fā)明權(quán)利要求及其等同技術(shù)的范圍之內(nèi)，則本發(fā)明也意圖包含這些改動(dòng)和變型在內(nèi)。