Tc標(biāo)記的錳基螯合物MR/SPECT雙模態(tài)探針的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于雙模態(tài)分子影像探針的制備領(lǐng)域，特別涉及一種葉酸靶向99mTc標(biāo)記的 錳基螯合物MR/SPECT雙模態(tài)探針的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 癌癥（cancer)，醫(yī)學(xué)術(shù)語(yǔ)亦稱惡性腫瘤，現(xiàn)在已直接或間接的影響許多人的生活， 成為威脅人類健康的頭號(hào)殺手。因此，早期的診斷和治療成為治愈癌癥的關(guān)鍵。在腫瘤的 早期診斷方面，傳統(tǒng)的影像技術(shù)只能了解腫瘤體積大小和解剖定位，而分子影像學(xué)技術(shù)可 以獲得更多的檢測(cè)參數(shù)，如腫瘤生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)評(píng)估，惡變前的分子異常檢測(cè)，腫瘤細(xì)胞標(biāo)記物 等，且活體分子成像可以實(shí)現(xiàn)在無(wú)損生物體微環(huán)境的狀況下進(jìn)行發(fā)病機(jī)制的研宄，并幫助 破譯復(fù)雜的分子運(yùn)動(dòng)軌跡。目前應(yīng)用于臨床的分子影像學(xué)技術(shù)主要包括超聲成像、SPECT成 像、CT成像和核磁共振成像（MRI)等。
[0003] 作為分子影像學(xué)的重要組成部分，造影劑的適當(dāng)選擇可以大大地提高成像診斷的 靈敏性、特異性。而作為理想的且能應(yīng)用于臨床癌癥早期靶向診斷的納米材料體系，在生物 安全性得以保障的同時(shí)，更要兼顧能同時(shí)攜帶靶向分子、成像試劑分子、制備方法簡(jiǎn)便、原 材料價(jià)廉易得幾個(gè)主要因素。目前應(yīng)用于臨床的造影劑，如應(yīng)用于CT成像的Omnipaque，用 于MRI的六種釓基小分子造影劑都存在不可克服的缺陷，而應(yīng)用于SPECT成像的DTPA- 99mTc 造影劑主要是腎臟顯影，上述的分子影像劑均存在不足之處如：血液循環(huán)時(shí)間過(guò)短、無(wú)組織 特應(yīng)性，尤其是釓基造影劑一定濃度下還存在腎毒性。因此，臨床醫(yī)學(xué)界更加期望能開發(fā)出 兼具兩種或者多種成像模式的分子影像探針，進(jìn)而彌補(bǔ)單一分子影像成像的不足之處。
[0004] 納米技術(shù)的發(fā)展使越來(lái)越多的科研工作者開始研發(fā)雙模態(tài)甚至多模態(tài)造影劑以 滿足臨床的需求。前期工作中，Shi和其合作者首先通過(guò)共沉淀法制備得到四氧化三鐵納 米顆粒，然后再在其表面層層靜電自組裝上聚谷氨酸和聚賴氨酸，最后將包裹有金納米顆 粒的第五代聚酰胺-胺樹狀大分子在EDC作用下修飾到氧化鐵表面，實(shí)現(xiàn)了 T2加權(quán)MR成 像和CT成像雙模態(tài)造影（J. Mater. Chem.，2012, 22, 15110-15120);隨后，Shi等人利用第 五代聚酰胺-胺樹狀大分子為平臺(tái)，將螯合試劑DOTA-NHS連接到樹狀大分子表面用于螯 合釓離子用于MR成像，同時(shí)利用樹狀大分子特殊的空腔結(jié)構(gòu)，包裹金納米顆粒用于CT成 像，實(shí)現(xiàn)了 T1加權(quán)MR增強(qiáng)和CT增強(qiáng)的MR/CT雙模態(tài)成像功能（Biomaterials，34,（2013)， 1570-1580)。正是基于前人以及本課題組的前期研宄工作基礎(chǔ)之上，本發(fā)明將靶向試劑葉 酸、螯合試劑DOTA結(jié)合到樹狀大分子上，然后將放射核素 99mTc成功地標(biāo)記到DOTA上，從而 制備出可實(shí)現(xiàn)MR/SPECT雙模態(tài)成像的分子影像探針。
[0005] 檢索國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，尚沒(méi)有發(fā)現(xiàn)關(guān)于葉酸靶向放射核素 99mTc標(biāo)記的樹狀大分子基錳 螯合物MR/SPECT雙模態(tài)分子影像探針的制備及其用于體內(nèi)腫瘤模型靶向MR/SPECT雙模態(tài) 成像應(yīng)用研宄的相關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種葉酸靶向99mTc標(biāo)記的錳基螯合物MR/ SPECT雙模態(tài)探針的制備方法，本發(fā)明的合成工藝簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件溫和可控，易于操作；制 備得到的MR/SPECT雙模態(tài)分子影像探針具有良好是生物相容性和血液相容性，并且在細(xì) 胞水平和動(dòng)物水平能實(shí)現(xiàn)良好的靶向MR/SPECT雙模態(tài)顯影功能；最終造影劑會(huì)隨代謝排 出體外，不會(huì)在體內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間蓄積。
[0007] 本發(fā)明的一種葉酸靶向99mTc標(biāo)記的錳基螯合物MR/SPECT雙模態(tài)探針的制備方 法，包括：
[0008] (1)分別將第五代聚酰胺-胺樹狀大分子G5、螯合試劑DOTA-NHS溶解在溶劑中， 待分別完全溶解后，攪拌條件下將DOTA-NHS溶液逐滴加入到G5溶液中，持續(xù)攪拌反應(yīng) 20-24h，得到G5. NH2-DOTA ;其中G5和DOTA-NHS二者之間的摩爾比為1 :35~40 ;
[0009] (2)將葉酸FA和EDC各自溶解在溶劑中，完全溶解后，將EDC溶液逐滴加入到FA 溶液中，避光攪拌20-30min，得到FA和EDC溶液；將NHS溶解在溶劑中，然后滴加到FA和 EDC溶液中，避光攪拌2-3h，得到活化后的FA溶液中，然后邊攪拌邊滴加入步驟（1)所得 G5. NH2-DOTA 中，避光持續(xù)反應(yīng) 60-72h，得到 G5. NH2-FA-DOTA ;
[0010] (3)將異硫氰酸熒光素 FI溶解在溶劑中，邊攪拌邊滴加到步驟⑵的 G5. NH2-FA-DOTA 中，避光持續(xù)反應(yīng) 20-24h，得到 G5. NH2-Fi-FA-DOTA ;
[0011] (4)將MnSO4. H2O溶解在超純水中，邊攪拌邊滴加入步驟（3)體系中，避光持續(xù)攪 拌 20-24h，得到 G5. NH2-FI-FA-DOTA-Mn ;
[0012] (5)將三乙胺加入到步驟（4)反應(yīng)體系中，避光持續(xù)攪拌反應(yīng)20-30min，然后再加 入乙酸酐，避光持續(xù)攪拌反應(yīng)20-24h，透析，冷凍干燥，得到G5. NHAc-FI-FA-DOTA-Mn ;
[0013] (6)將G5. NHAc-FI-FA-DOTA-Mn溶解在緩沖液中，然后加入99mTc淋洗液、還原劑， 將99niTc與DOTA螯合，分離純化，得到G5. NHAc-FI-FA-D0TA-Mn」9niTc，即為葉酸靶向99niTc標(biāo) 記的錳基螯合物MR/SPECT雙模態(tài)探針。
[0014] 所述步驟⑴中G5、DOTA-NHS分別溶解的溶劑的體積比為10-12:2-3。
[0015] 所述步驟（1)中第五代聚酰胺-胺樹狀大分子G5的分子量為26010。
[0016] 所述步驟⑵中FA、EDC和NHS的比例為8. 8-10mg: 19. 2~21. 4mg :11· 5~ 12. lmg，F(xiàn)A和G5的摩爾比為8. 83~9 :13 ;FA溶解在溶劑中的濃度為1-2. 5mg/ml ;EDC溶 解在溶劑中的濃度為2-5mg/ml ;NHS溶解在溶劑中的濃度為l-4mg/ml。
[0017] 所述步驟⑶中FI與G5的比例為0· 97~I. 56mg :13mg ;FI溶解在溶劑中的濃度 為 0· 5mg/mL ~L 5mg/mL〇
[0018] 所述步驟⑷中MnSO4. H2O與DOTA的比例為7. 6~9. 2mg :23mg ;MnS04. H2O溶解 在超純水中后的濃度為lmg/mL~2. 5mg/mL。
[0019] 所述步驟（5)中三乙胺和乙酸酐與G5的比例為46~50. 5 yL :26~31. 2 yL : 13mg〇
[0020] 所述步驟（6)中緩沖液為PBS緩沖液；G5. NHAc-FI-FA-DOTA-Mn溶于緩沖液后的 濃度為1~I. 2mg/mL ;還原劑為氯化亞錫SnCl2。
[0021] 所述步驟（6)中G5. NHAc-FI-FA-D0TA-Mn、99niTc淋洗液、還原劑的比例為3-5mg : 0.5_lmL :50-100 μ g。
[0022] 所述步驟（1)-⑶中的溶劑均為二甲基亞砜DMSO ;步驟（5)中透析為用截留分子 量為8000~14000的透析袋透析三天；步驟(6)中分離純化為用凝膠過(guò)濾柱分離純化。
[0023] 所述葉酸靶向放射核素99mTc標(biāo)記的樹狀大分子基錳螯合物作為MR/SPECT雙模態(tài) 分子影像探針的應(yīng)用。
[0024] 本發(fā)明首先分別將螯合試劑（DOTA-NHS)和靶向分子葉酸（FA)修飾到第五代聚酰 胺-胺樹狀大分子（G5)表面，然后利用配位化學(xué)方法將錳離子螯合到DOTA上，最終標(biāo)記放 射核素 99mTc。其制備方法：第一步，經(jīng)表面共價(jià)修飾將螯合試劑DOTA-NHS修飾到G5表面； 第二步，將靶向分子FA連接到G5表面；第三步，將示蹤分子異硫氰酸熒光素（FI)標(biāo)記到G5 上；第四步，利用DOTA配位螯合錳離子；第五步，利用乙?；磻?yīng)將G5表面氨基轉(zhuǎn)化為乙 酰基；最后，將放射核素 99mTc標(biāo)記到剩余的DOTA上。本發(fā)明以G5為平臺(tái)，將靶向分子FA、 MR成像造影劑（DOTA-Mn螯合物）和SPECT成像放射核素99mTc三者有機(jī)結(jié)合，得到功能化 的樹狀大分子基MR/SPECT雙模態(tài)分子影像探針。
[0025] 本發(fā)明利用樹狀大分子表面存在大量氨基從而可實(shí)現(xiàn)多功能化修飾這一特性，首 先采用化學(xué)鍵合法將螯合試劑DOTA連接到G5表面氨基上，進(jìn)一步將靶向分子葉酸（FA)、熒 光分子（FI)修飾到G5表面。FA可以實(shí)現(xiàn)對(duì)葉酸受體高表達(dá)細(xì)胞株系或者腫瘤模型特異靶 向性，F(xiàn)I分子為在細(xì)胞水平研宄葉酸的靶向能力起到了分子探針的作用，而DOTA的存在不 僅僅可以起到螯合金屬離子錳的作用，同時(shí)還可標(biāo)記放射核素 99mTc。
[0026] 本發(fā)明采用的合成工藝簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件溫和可控，易于操作。制備得到的MR/SPECT 雙模態(tài)分子影像探針具有良好是生物相容性和血液相容性，并且在細(xì)胞水平和動(dòng)物水平能 實(shí)現(xiàn)良好的靶向MR/SPECT雙模態(tài)顯影功能，最終造影劑會(huì)隨代謝排出體外，不會(huì)在體內(nèi)長(zhǎng) 時(shí)間蓄積。該方法制備的FA靶向的MR/SPECT雙模態(tài)分子影像探針在分子影像診斷領(lǐng)域有 著潛在的應(yīng)用。
[0027] 本發(fā)明使用紫外可見吸收光譜（UV-Vis)、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法 (ICP-AES)、Zeta電勢(shì)、水合粒徑等方法表征制備得到的分子探針的物理化學(xué)性質(zhì)，并通過(guò) 核磁共振成像儀分析分子探針的T 1成像性能和r i弛豫率，然后通過(guò)溶血實(shí)驗(yàn)、MTT法評(píng)價(jià)該 探針的血液相容性和細(xì)胞毒性，再利用流式細(xì)胞術(shù)、體外和體內(nèi)核磁共振成像實(shí)驗(yàn)檢測(cè)FA 修飾的分子探針對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向成像效果。具體測(cè)試結(jié)果如下：
[0028] (1)紫外吸收（UV-Vis)測(cè)試結(jié)果
[0029] 通過(guò)分析G5. NHAc-FI-FA-DOTA-Mn分子影像探針的紫外圖譜（圖1)發(fā)現(xiàn)在500nm 處有一個(gè)明顯的FI的紫外特征吸收峰，由此可以說(shuō)明已經(jīng)成功地將FI修飾到G5表面上。
[0030] (2) Zeta電勢(shì)及水合粒徑測(cè)試結(jié)果
[0031] 本發(fā)明制備得到的G5. NHAc-FI-FA-DOTA-Mn分子影像探針表面有大量的伯氨基 存在而具有較高的正電荷，較高的正電荷會(huì)制約該材料在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。因此本發(fā) 明對(duì)修飾后的實(shí)驗(yàn)組材料和對(duì)照組材料進(jìn)行了完全乙?；幚?，以期降低分子影像探針的 表面電勢(shì)，從而提高其生物相容性。表面電勢(shì)和水合粒徑測(cè)定結(jié)果如表1所示：合