本發(fā)明涉及培養(yǎng)細(xì)胞的分化促進方法以及培養(yǎng)細(xì)胞分化促進劑。
背景技術(shù)：
：近年來，利用了ES細(xì)胞、iPS細(xì)胞等萬能細(xì)胞、干細(xì)胞的再生醫(yī)療備受矚目。萬能細(xì)胞、干細(xì)胞被稱為未進行分化的未分化狀態(tài)的細(xì)胞。在再生醫(yī)療中，使這些未分化狀態(tài)的細(xì)胞分化成目標(biāo)的臟器、組織、細(xì)胞，使用得到的臟器、組織、細(xì)胞進行患者的治療。實現(xiàn)了例如使用從患者的皮膚的表皮組織采取的干細(xì)胞進行皮膚的再生醫(yī)療、美容行為。皮膚的表皮在從真皮側(cè)至皮膚表面?zhèn)鹊姆较蚓哂谢准?xì)胞、有棘細(xì)胞、顆粒細(xì)胞以及角質(zhì)細(xì)胞，基底細(xì)胞一邊分化成有棘細(xì)胞、顆粒細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞，一邊轉(zhuǎn)移至上層，最終成為污垢而剝落。在皮膚的再生醫(yī)療中，從受驗者的皮膚的最表面的表皮組織采取基底細(xì)胞、有棘細(xì)胞，將這些細(xì)胞一邊在培養(yǎng)容器內(nèi)培養(yǎng)而使其層狀地增殖，一邊進行分化誘導(dǎo)處理以使層的最外側(cè)的細(xì)胞分化成顆粒細(xì)胞、接著分化成角質(zhì)細(xì)胞。然后，將通過該分化誘導(dǎo)處理而按照基底細(xì)胞、有棘細(xì)胞、顆粒細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞的順序?qū)訝畹卦鲋车募?xì)胞群(培養(yǎng)表皮)移植至受驗者的皮膚。在上述的分化誘導(dǎo)操作中，作為培養(yǎng)容器，一般通用經(jīng)親水化處理的聚苯乙烯制皿、燒瓶等。已知在構(gòu)成表皮的細(xì)胞內(nèi)，基底細(xì)胞、有棘細(xì)胞在鈣的濃度增加的環(huán)境中分化成顆粒細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞。此外，在顆粒細(xì)胞分化成角質(zhì)細(xì)胞的過程中，角蛋白、內(nèi)披蛋白(involucrin)、兜甲蛋白等構(gòu)成角質(zhì)細(xì)胞的蛋白質(zhì)被生物合成。因此，制作培養(yǎng)表皮時，重要的是在培養(yǎng)細(xì)胞中這些蛋白質(zhì)被生物合成。另外，在培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)這些蛋白質(zhì)被生物合成的情況可以通過檢測與各蛋白質(zhì)對應(yīng)的mRNA而進行。如上所述，盡管皮膚的再生醫(yī)療技術(shù)日益進展，但是現(xiàn)有技術(shù)的培養(yǎng)表皮的制作方法不僅費力而且還需要時間，因此存在著在移植手術(shù)時來不及培養(yǎng)表皮、與制作培養(yǎng)表皮所需要的工夫、時間成比例地產(chǎn)生高額的費用這樣的問題。因此，期望得到能夠進一步促進培養(yǎng)細(xì)胞的分化的方法。作為促進向角質(zhì)細(xì)胞的分化的方法，已知有使用乳酸菌的乳發(fā)酵物的方法。在專利文獻1中公開有以下技術(shù)：通過在人正常表皮細(xì)胞的培養(yǎng)基中添加使用瑞士乳酸菌(Lactobacillushelveticus)而得到的乳發(fā)酵物，從而作為表皮細(xì)胞的分化標(biāo)記的角蛋白的mRNA增加。此外，示出通過口服該乳發(fā)酵物，可促進皮膚表皮的角質(zhì)化。然而，該乳發(fā)酵物中包含乳酸菌，因此在培養(yǎng)再生醫(yī)療用的細(xì)胞時所使用的培養(yǎng)基中混入該乳發(fā)酵物是不現(xiàn)實的。此外，已知有使用櫻桃提取物促進表皮細(xì)胞的分化的方法。在專利文獻2中示出：通過將櫻桃提取物給予表皮細(xì)胞，從而作為分化過程中重要成分的角蛋白10和絲聚合蛋白的mRNA產(chǎn)生顯著加快。然而，角蛋白10和絲聚合蛋白是從表皮細(xì)胞的分化過程的初期到中期在有棘細(xì)胞內(nèi)合成的，櫻桃提取物并沒有促進向角質(zhì)細(xì)胞的分化。此外，在專利文獻2中記載的技術(shù)是以化妝品等外用劑為目標(biāo)的，很難將該見解直接適用于再生醫(yī)療用的表皮細(xì)胞的分化的促進?，F(xiàn)有技術(shù)文獻專利文獻專利文獻1：國際專利WO2006/137513號(US2010/0166877)；專利文獻2：日本特開第2012-167048號公報。技術(shù)實現(xiàn)要素：發(fā)明要解決的課題本發(fā)明鑒于這樣的現(xiàn)有技術(shù)的實際情況而完成的，其課題在于提供能夠進一步促進培養(yǎng)細(xì)胞的分化的方法以及培養(yǎng)細(xì)胞分化促進劑。用于解決課題的方案本發(fā)明者為了解決上述課題進行了深入的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，如果一邊使作為分化的對象的細(xì)胞和含脂環(huán)結(jié)構(gòu)的聚合物接觸一邊進行培養(yǎng)，則作為分化標(biāo)記的mRNA增加，從而完成了本發(fā)明。像這樣，根據(jù)本發(fā)明，可提供下述(1)～(2)的培養(yǎng)細(xì)胞的分化促進方法、及(3)的培養(yǎng)細(xì)胞分化促進劑。(1)一種培養(yǎng)細(xì)胞的分化促進方法，其特征在于，使含脂環(huán)結(jié)構(gòu)的聚合物成型體與被培養(yǎng)的細(xì)胞接觸。(2)根據(jù)(1)所述的培養(yǎng)細(xì)胞的分化促進方法，其中，被培養(yǎng)的細(xì)胞是表皮細(xì)胞。(3)一種培養(yǎng)細(xì)胞分化促進劑，包含含脂環(huán)結(jié)構(gòu)的聚合物成型體。發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明，可提供能夠促進培養(yǎng)細(xì)胞的分化的方法、以及適用于該方法的培養(yǎng)細(xì)胞分化促進劑。附圖說明圖1是示出兜甲蛋白表達量的圖表。圖2是示出GATA3表達量的圖表。具體實施方式本發(fā)明中使用的細(xì)胞只要是能夠分化的細(xì)胞即可，沒有特別限制。作為能夠分化的細(xì)胞，可列舉出：萬能細(xì)胞；間充質(zhì)干細(xì)胞等各種的干細(xì)胞；各種的祖細(xì)胞；由外胚層、中胚層和內(nèi)胚層分化的細(xì)胞、不是最終分化狀態(tài)的細(xì)胞等。作為這樣能夠分化的細(xì)胞，可舉出用于皮膚的表皮再生的表皮細(xì)胞作為優(yōu)選例。表皮細(xì)胞可以是與真皮相接的表皮的基底細(xì)胞、位于基底的皮膚表面?zhèn)鹊挠屑?xì)胞、位于有棘細(xì)胞的皮膚表面?zhèn)鹊念w粒細(xì)胞中的任一種。表皮細(xì)胞優(yōu)選采取自成為皮膚治療的對象的患者。對細(xì)胞進行培養(yǎng)時，通常使用液體培養(yǎng)基。作為液體培養(yǎng)基，通常使用具有pH緩沖作用、滲透壓適合細(xì)胞、包含細(xì)胞的營養(yǎng)成分、并且對細(xì)胞沒有毒性的液體培養(yǎng)基。作為顯示出pH緩沖作用的成分，可列舉出三羥甲基氨基甲烷(Tris)鹽酸鹽、各種磷酸鹽、各種碳酸鹽等。液體培養(yǎng)基的滲透壓調(diào)整通常使用調(diào)整鉀離子、鈉離子、鈣離子、葡萄糖等濃度的水溶液進行，以使其與細(xì)胞滲透壓基本相同。作為這樣的水溶液，具體而言，可列舉出：磷酸緩沖生理鹽水、三羥甲基氨基甲烷緩沖生理鹽水、HEPES緩沖生理鹽水等生理鹽水；乳酸林格氏液、醋酸林格氏液、碳酸氫根林格氏液等林格氏液等。作為細(xì)胞的營養(yǎng)成分，可列舉出氨基酸、核酸、維生素類、礦物質(zhì)類等。作為液體培養(yǎng)基，可以利用RPMI-1640、HAM、α-MEM、DMEM、EMEM、F-12、F-10、M-199等各種市售品。液體培養(yǎng)基中，也可以配合添加劑。作為添加劑，可列舉出蛋白質(zhì)等的誘導(dǎo)因子、具有分化誘導(dǎo)活性的低分子化合物、礦物質(zhì)、金屬、維生素成分等。其中，優(yōu)選配合用于分化誘導(dǎo)的添加劑。作為用于分化誘導(dǎo)的添加劑，可列舉出：作用于細(xì)胞表面的受體的配體、激動劑、拮抗劑；核內(nèi)受體的配體、激動劑、拮抗劑；骨膠原、纖連蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)；細(xì)胞外基質(zhì)的一部分或模擬的化合物；作用于與細(xì)胞內(nèi)的信息傳達路徑相關(guān)的蛋白質(zhì)的成分；作用于細(xì)胞內(nèi)的初級代謝和次級代謝的酶的成分；影響細(xì)胞內(nèi)的核內(nèi)或線粒體內(nèi)的基因的表達的成分；能夠與病毒載體等組合而導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的DNA、RNA等。這些添加劑可以單獨使用一種、或組合兩種以上使用。細(xì)胞的培養(yǎng)條件沒有特別限定，可以根據(jù)使用的細(xì)胞、目的適宜決定。例如，可以使用將二氧化碳濃度固定維持為5％左右、將溫度固定維持為20℃～37℃的范圍的經(jīng)加濕的恒溫器來對細(xì)胞進行培養(yǎng)。在本發(fā)明中使用的含脂環(huán)結(jié)構(gòu)的聚合物成型體是將含脂環(huán)結(jié)構(gòu)的聚合物成型為任意形狀而成的。含脂環(huán)結(jié)構(gòu)的聚合物是在主鏈和/或側(cè)鏈具有脂環(huán)結(jié)構(gòu)的樹脂，從機械強度、耐熱性等的觀點來看，優(yōu)選在主鏈含有脂環(huán)結(jié)構(gòu)的聚合物。作為脂環(huán)結(jié)構(gòu)，可列舉出飽和環(huán)狀烴(環(huán)烷烴)結(jié)構(gòu)、不飽和環(huán)狀烴(環(huán)烯烴)結(jié)構(gòu)等，但從機械強度、耐熱性等的觀點來看，優(yōu)選環(huán)烷烴結(jié)構(gòu)、環(huán)烯烴結(jié)構(gòu)，其中，最優(yōu)選具有環(huán)烷烴結(jié)構(gòu)的脂環(huán)結(jié)構(gòu)。構(gòu)成脂環(huán)結(jié)構(gòu)的碳原子數(shù)沒有特別的限制，但通常為4～30個，優(yōu)選為5～20個，進一步優(yōu)選為5～15個。當(dāng)構(gòu)成脂環(huán)結(jié)構(gòu)的碳原子數(shù)在該范圍內(nèi)時，機械強度、耐熱性以及成型性的特性高度平衡，因此優(yōu)選。含脂環(huán)結(jié)構(gòu)的聚合物中的具有脂環(huán)結(jié)構(gòu)的重復(fù)單元的比例只要根據(jù)使用目的適宜選擇即可，但通常為30重量％以上，優(yōu)選為50重量％以上，更優(yōu)選為70重量％。當(dāng)含脂環(huán)結(jié)構(gòu)的聚合物中的具有脂環(huán)結(jié)構(gòu)的重復(fù)單元的比例過少時，耐熱性差，因此不優(yōu)選。對于含脂環(huán)結(jié)構(gòu)的聚合物中的具有脂環(huán)結(jié)構(gòu)的重復(fù)單元以外的剩余部分，沒有特別的限定，可根據(jù)使用目的適宜選擇。作為含脂環(huán)結(jié)構(gòu)的聚合物的具體例子，可列舉出(1)降冰片烯系聚合物、(2)單環(huán)的環(huán)狀烯烴系聚合物、(3)環(huán)狀共軛二烯系聚合物、(4)乙烯基脂環(huán)式烴系聚合物以及(1)～(4)的氫化物等。其中，從耐熱性、機械強度等的觀點來看，優(yōu)選降冰片烯系聚合物及其氫化物。(1)降冰片烯系聚合物降冰片烯系聚合物是將具有降冰片烯骨架的單體即降冰片烯系單體進行聚合而成的，大致區(qū)分為通過開環(huán)聚合得到的降冰片烯系聚合物和通過加成聚合得到的降冰片烯系聚合物。作為通過開環(huán)聚合得到的降冰片烯系聚合物，可列舉出：降冰片烯系單體的開環(huán)聚合物、及降冰片烯系單體和能夠與其開環(huán)共聚的其它單體的開環(huán)聚合物，以及它們的氫化物等。作為通過加成聚合得到的降冰片烯系聚合物，可列舉出：降冰片烯系單體的加成聚合物、及降冰片烯系單體和能夠與其共聚的其它單體的加成聚合物等。其中，從耐熱性、機械強度等的觀點來看，優(yōu)選降冰片烯系單體的開環(huán)聚合物氫化物。作為降冰片烯系單體，可列舉出：雙環(huán)[2.2.1]庚-2-烯(常用名：降冰片烯)、5-甲基-雙環(huán)[2.2.1]庚-2-烯、5,5-二甲基-雙環(huán)[2.2.1]庚-2-烯、5-乙基-雙環(huán)[2.2.1]庚-2-烯、5-乙叉基-雙環(huán)[2.2.1]庚-2-烯、5-乙烯基-雙環(huán)[2.2.1]庚-2-烯、5-丙烯基-雙環(huán)[2.2.1]庚-2-烯、5-甲氧羰基-雙環(huán)[2.2.1]庚-2-烯、5-氰基雙環(huán)[2.2.1]庚-2-烯、5-甲基-5-甲氧羰基-雙環(huán)[2.2.1]庚-2-烯等2環(huán)式單體；三環(huán)[4.3.01,6.12,5]癸-3,7-二烯(常用名：二環(huán)戊二烯)、2-甲基二環(huán)戊二烯、2,3-二甲基二環(huán)戊二烯、2,3-二羥基二環(huán)戊二烯等3環(huán)式單體；四環(huán)[4.4.0.12,5.17,10]-3-十二碳烯(四環(huán)十二碳烯)、四環(huán)[4.4.0.12,5.17,10]-3-十二碳烯、8-甲基四環(huán)[4.4.0.12,5.17,10]-3-十二碳烯、8-乙基四環(huán)[4.4.0.12,5.17,10]-3-十二碳烯、8-乙叉基四環(huán)[4.4.0.12,5.17,10]-3-十二碳烯、8,9-二甲基四環(huán)[4.4.0.12,5.17,10]-3-十二碳烯、8-乙基-9-甲基四環(huán)[4.4.0.12,5.17,10]-3-十二碳烯、8-乙叉基-9-甲基四環(huán)[4.4.0.12,5.17,10]-3-十二碳烯、8-甲基-8-羧甲基四環(huán)[4.4.0.12,5.17,10]-3-十二碳烯、7,8-苯并三環(huán)[4.3.0.12,5]癸-3-烯(常用名：橋亞甲基四氫芴，也叫1,4-橋亞甲基-1,4,4a,9a-四氫芴)、1,4-橋亞甲基-8-甲基-1,4,4a,9a-四氫芴、1,4-橋亞甲基-8-氯-1,4,4a,9a-四氫芴、1,4-橋亞甲基-8-溴-1,4,4a,9a-四氫芴等4環(huán)式單體等。作為能夠與降冰片烯系單體開環(huán)共聚的其它單體，可列舉出環(huán)己烯、環(huán)庚烯、環(huán)辛烯、1,4-環(huán)己二烯、1,5-環(huán)辛二烯、1,5-環(huán)癸二烯、1,5,9-環(huán)十二碳三烯、1,5,9,13-環(huán)己基癸四烯等單環(huán)的環(huán)烯烴系單體。這些單體也可以具有1種或2種以上的取代基。作為取代基，可列舉出烷基、亞烷基(alkylenegroup)、芳基、甲硅烷基、烷氧羰基、烷叉基(alkylidenegroup)等。作為能夠與降冰片烯系單體加成共聚的其它單體，可列舉出：乙烯、丙烯、1-丁烯、1-戊烯、1-己烯等碳原子數(shù)為2～20的α-烯烴系單體；環(huán)丁烯、環(huán)戊烯、環(huán)己烯、環(huán)辛烯、四環(huán)[9.2.1.02,10.03,8]四癸-3,5,7,12-四烯(也稱為3a,5,6,7a-四氫-4,7-橋亞甲基-1H-茚)等環(huán)烯烴系單體；1,4-己二烯、4-甲基-1,4-己二烯、5-甲基-1,4-己二烯、1,7-辛二烯等非共軛二烯烴系單體等。其中，優(yōu)選α-烯烴系單體，更優(yōu)選乙烯。這些單體也可以具有1種或2種以上的取代基。作為取代基，可列舉出烷基、亞烷基(alkylenegroup)、芳基、甲硅烷基、烷氧羰基、烷叉基(alkylidenegroup)等。降冰片烯系單體的開環(huán)聚合物、或降冰片烯系單體和能夠與其開環(huán)共聚的其它單體的開環(huán)聚合物可以在公知的開環(huán)聚合催化劑的存在下聚合單體成分而得到。作為開環(huán)聚合催化劑，可以使用例如包含釕、鋨等金屬的鹵化物、硝酸鹽或乙酰丙酮化合物、以及還原劑的催化劑；或者包含鈦、鋯、鎢、鉬等金屬的鹵化物或乙酰丙酮化合物、以及有機鋁化合物的催化劑。降冰片烯系單體的開環(huán)聚合物氫化物通常可以通過向上述開環(huán)聚合物的聚合溶液中添加含鎳、鈀等過渡金屬的公知的氫化催化劑，對碳-碳不飽和鍵進行氫化而得到。對于降冰片烯系單體的加成聚合物、或降冰片烯系單體和能夠與其共聚的其它單體的加成聚合物，可以在公知的加成聚合催化劑的存在下聚合單體成分而得到。作為加成聚合催化劑，可以使用例如包含鈦、鋯或釩化合物和有機鋁化合物的催化劑。(2)單環(huán)的環(huán)狀烯烴系聚合物作為單環(huán)的環(huán)狀烯烴系聚合物，可以使用例如環(huán)己烯、環(huán)庚系、環(huán)辛烯等單環(huán)的環(huán)狀烯烴系單體的加成共聚物。(3)環(huán)狀共軛二烯系聚合物作為環(huán)狀共軛二烯系聚合物，可以使用例如將環(huán)戊二烯、環(huán)己二烯等環(huán)狀共軛二烯系單體進行了1,2-或1,4-加成聚合而得到的聚合物及其氫化物等。(4)乙烯基脂環(huán)式烴聚合物作為乙烯基脂環(huán)式烴聚合物，可列舉出例如：乙烯基環(huán)己烯、乙烯基環(huán)己烷等乙烯基脂環(huán)式烴系單體的聚合物及其氫化物；苯乙烯、α-甲基苯乙烯等乙烯基芳香族系單體的聚合物的芳香環(huán)部分的氫化物等。乙烯基脂環(huán)式烴聚合物也可以是這些單體和能夠與這些單體進行共聚的其它單體的共聚物。含脂環(huán)結(jié)構(gòu)的聚合物的分子量沒有特別的限制，以環(huán)己烷溶液(聚合物不溶解的情況下使用甲苯溶液)的凝膠滲透色譜法測定的聚苯乙烯換算的重均分子量計通常為5000以上，優(yōu)選為5000～500000，更優(yōu)選為8000～200000，特別優(yōu)選為10000～100000。當(dāng)重均分子量在這個范圍內(nèi)時，機械強度和成型加工性高度平衡，因此優(yōu)選。含脂環(huán)結(jié)構(gòu)的聚合物的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度只要根據(jù)使用目的適宜選擇即可，通常為50～300℃、優(yōu)選為100～280℃、更優(yōu)選為115～250℃，進一步優(yōu)選為130～200℃。當(dāng)玻璃化轉(zhuǎn)變溫度在該范圍內(nèi)時，機械強度和成型加工性高度平衡，因此優(yōu)選。在本發(fā)明中的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度是根據(jù)JISK7121進行測定的。這些含脂環(huán)結(jié)構(gòu)的聚合物可以分別單獨使用，或者組合兩種以上使用。此外，可以在含脂環(huán)結(jié)構(gòu)的聚合物中添加通常采用量的在熱塑性樹脂材料中通常使用的配合劑，例如，軟質(zhì)聚合物、抗氧化劑、紫外線吸收劑、光穩(wěn)定劑、近紅外線吸收劑、脫模劑、染料、顏料等著色劑、增塑劑、防靜電劑、熒光增白劑等配合劑。此外，也可以在含脂環(huán)結(jié)構(gòu)的聚合物中混合軟質(zhì)聚合物以外的其它聚合物(以下，僅稱為“其它聚合物”)。混合在含脂環(huán)結(jié)構(gòu)的聚合物中的其它聚合物的量相對于含脂環(huán)結(jié)構(gòu)的聚合物100重量份，通常為200重量份以下，優(yōu)選為150重量份以下，更優(yōu)選為100重量份以下。當(dāng)相對于含脂環(huán)結(jié)構(gòu)的聚合物配合的各種配合劑、其它聚合物的比例過多時，細(xì)胞的分化促進性降低，因此優(yōu)選在均不損害含脂環(huán)結(jié)構(gòu)的聚合物的性質(zhì)的范圍進行配合。配合劑、其它聚合物的混合方法，只要是使配合劑充分分散在聚合物中的方法即可，沒有特別的限定。此外，配合的順序也沒有特別的限制。作為配合方法，可列舉出例如：使用混合機、單軸混煉機、雙軸混煉機、輥式混煉機、布拉本德混煉機、擠出機等在熔融狀態(tài)下混煉樹脂的方法；在適當(dāng)?shù)娜軇┲腥芙馐蛊浞稚⒑?，通過凝固法、流延法、或直接干燥法除去溶劑的方法等。使用雙軸混煉機的情況下，多在混煉后，通常以熔融狀態(tài)擠出成棒狀，用線料切粒機(strandcutter)切成合適的長度，使其顆粒化來使用。含脂環(huán)結(jié)構(gòu)的聚合物的成型方法可以根據(jù)使其與細(xì)胞接觸時使用的含脂環(huán)結(jié)構(gòu)的聚合物成型體的形狀任意地選擇。作為成型方法，可列舉出例如注射成型法、擠出成型法、流延成型法、吹脹成型法、吹塑成型法、真空成型法、壓制成型法、壓縮成型法、旋轉(zhuǎn)成型法、壓延(calender)成型法、壓延成型法、切割成型法、紡絲等，也可以使這些成型法組合使用、或成型后根據(jù)需要進行拉伸等后處理。這樣得到的成形體是本發(fā)明的培養(yǎng)細(xì)胞分化促進劑。含脂環(huán)結(jié)構(gòu)的聚合物成型體的形狀沒有特別的限制，可以是板狀、粉狀、粒狀、繩狀、片狀、其它任何的形狀。此外，其表面可以平坦的，也可以具有凹凸形狀，還可以為中空狀的成型體。此外，也可以使不同的形狀的成型體經(jīng)由或不經(jīng)由粘接劑進行組合而制成其它的成型體。此外，只要能夠與細(xì)胞接觸即可，可以是構(gòu)成下述的一部分或全部的構(gòu)件：皿、盤、袋、管、支持物、杯、廣口瓶·發(fā)酵罐等培養(yǎng)容器；攪拌翼、攪拌子、擋板(baffle)、連接管等培養(yǎng)裝置的零件；移液器、攪拌元件、過濾器、細(xì)胞刮刀等培養(yǎng)操作中使用的培養(yǎng)工具等。在本發(fā)明的方法中，對于培養(yǎng)中的細(xì)胞，不管其是粘附型細(xì)胞還是懸浮細(xì)胞，都有在培養(yǎng)基中以懸浮狀態(tài)生存的傾向。因此，含脂環(huán)結(jié)構(gòu)的聚合物成型體和細(xì)胞的接觸方法的選項非常廣泛。在本發(fā)明中，優(yōu)選在使成型體與培養(yǎng)細(xì)胞接觸時，對成型體進行滅菌處理。滅菌處理的方法沒有特別的限定，能夠根據(jù)成型體的形狀、使用的細(xì)胞從高壓蒸汽法、干熱法等加熱法；照射γ射線、電子束等放射線的放射線法、照射高頻波的照射法；使其接觸環(huán)氧乙烷氣體(EOG)等氣體的氣體法；使用滅菌過濾器的過濾法等在醫(yī)藥領(lǐng)域一般采用的方法中進行選擇。此外，也可以對這些成型體表面進行等離子體處理、電暈放電處理、臭氧處理、紫外線照射處理等通常對培養(yǎng)容器實施的滅菌目的以外的處理。使培養(yǎng)細(xì)胞和本發(fā)明的作為培養(yǎng)細(xì)胞分化促進劑的含脂環(huán)結(jié)構(gòu)的聚合物成型體接觸的方法只要根據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞分化促進劑的形狀采用任意的方法即可?？闪信e出例如：在混合了作為細(xì)胞分化促進劑的含脂環(huán)結(jié)構(gòu)的聚合物成型體的培養(yǎng)基中對細(xì)胞進行培養(yǎng)的方法；在使用含脂環(huán)結(jié)構(gòu)的聚合物成型的培養(yǎng)容器內(nèi)對細(xì)胞進行培養(yǎng)的方法；用使用含脂環(huán)結(jié)構(gòu)的聚合物成型的培養(yǎng)器具進行培養(yǎng)操作的方法等，也可以將這些方法組合使用。另外，因此在細(xì)胞中有信息傳達能力，所以沒有必要使培養(yǎng)中的全部的培養(yǎng)細(xì)胞接觸含脂環(huán)結(jié)構(gòu)的聚合物成型體，此外，也沒有必要在整個培養(yǎng)期間使兩者接觸。但是，因為接觸所帶來的效果隨時間降低，所以優(yōu)選接觸時間長。培養(yǎng)細(xì)胞和含脂環(huán)結(jié)構(gòu)的聚合物成型體的接觸溫度只要是細(xì)胞能增殖的溫度即可，沒有特別的限定。實施例以下，列舉實施例對本發(fā)明進行具體地說明，但是本發(fā)明并不限定于這些實施例。[制造例1]作為使用了含脂環(huán)結(jié)構(gòu)的聚合物[降冰片烯系聚合物(日本瑞翁公司制，“ZEONEX(注冊商標(biāo))790R”；降冰片烯系開環(huán)聚合物氫化物)]的培養(yǎng)器具，通過以下的方法制作了底面直徑為3cm的培養(yǎng)用皿(以下，稱為“790R制皿”)。首先，通過注射成型法成型了皿之后，通過使用了EOG(環(huán)氧乙烷氣體)的氣體法，進行了790R制皿的滅菌處理。[實施例1]將JapanTissueEngineering公司制的用于三維皮膚再生試劑盒的人表皮角化細(xì)胞(制作人表皮模型用)以1.25×104cells/cm2的細(xì)胞密度接種于790R制皿，在CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)6日。以下，稱該試樣為“790R制皿試樣”。[比較例1]代替實施例1中的790R制皿而使用Corning公司制的細(xì)胞培養(yǎng)用皿[FALCON(注冊商標(biāo))(型號353001)](以下，稱為“聚苯乙烯制皿”)，除此之外，和實施例1同樣地進行，對細(xì)胞進行培養(yǎng)。以下，稱該試樣為“聚苯乙烯制皿試樣”。[比較例2]和實施例1、比較例1同時地，在以下的條件下實施分化誘導(dǎo)而進行細(xì)胞的培養(yǎng)。首先，將表皮細(xì)胞以1.25×104cells/cm2的細(xì)胞密度接種于聚苯乙烯制皿，在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，和上述的培養(yǎng)試樣一并進行而開始培養(yǎng)，在培養(yǎng)經(jīng)過第1日時，作為鈣化劑，添加氯化鈣，進一步進行培養(yǎng)5日。稱該試樣為“添加鈣的聚苯乙烯制皿試樣”。[細(xì)胞的分化狀態(tài)的評價]在實施例1、比較例1、2中，為了評價細(xì)胞的分化狀態(tài)，按照以下的方式進行了細(xì)胞內(nèi)表達的分化標(biāo)記的分析。作為分化標(biāo)記，以兜甲蛋白為指標(biāo)，所述兜甲蛋白是作為表皮細(xì)胞的最終分化狀態(tài)的細(xì)胞的角質(zhì)細(xì)胞的構(gòu)成蛋白質(zhì)。經(jīng)過培養(yǎng)期后，從各試樣回收細(xì)胞，通過以下的方式利用RealTimePCR法定量細(xì)胞內(nèi)所含的兜甲蛋白mRNA的量。使用GAPDH的mRNA作為內(nèi)標(biāo)。使用QuickGeneRNAculturedcellkitS(倉敷紡績有限公司制)從細(xì)胞中提取RNA。從RNA至DNA的轉(zhuǎn)換通過使用PrimerScriptRTase(TaKaRabio公司制)的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)來進行。使用PCR-CFX96(BioRad公司制)系統(tǒng)進行以逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中制備的DNA作為模板的RealTimePCR。反復(fù)進行2次培養(yǎng)實驗，使用兜甲蛋白mRNA的表達量的平均值，求得在將添加鈣的聚苯乙烯制皿試樣(比較例2)的兜甲蛋白mRNA量設(shè)為1.0的情況下的790R制皿試樣(實施例1)的兜甲蛋白mRNA的值和聚苯乙烯制皿試樣(比較例1)的兜甲蛋白mRNA的值。結(jié)果如表1所示。[表1](表1)兜甲蛋白mRNA表達量相對值實施例11.10比較例10.087比較例21.00從比較例1和2的比較可知，通過添加鈣劑從而促進了細(xì)胞的分化，兜甲蛋白mRNA量大幅增加。另一方面，可知，在790R制皿試樣(實施例1)中，雖然沒有添加促進細(xì)胞的分化的鈣劑，但是因為該兜甲蛋白mRNA成為與添加了鈣劑的苯乙烯制皿試樣(比較例2)的兜甲蛋白mRNA量的相同量以上，所以通過使其與含脂環(huán)結(jié)構(gòu)的聚合物成型體接觸，從而可促進培養(yǎng)細(xì)胞的分化。[實施例2]為了評價在鈣劑存在下對細(xì)胞進行培養(yǎng)的情況下的本發(fā)明的培養(yǎng)器具(培養(yǎng)細(xì)胞分化促進劑)的效果，在培養(yǎng)開始第1日在培養(yǎng)基中添加鈣，除此以外，和實施例1同樣地進行，對細(xì)胞進行培養(yǎng)，對分化標(biāo)記的兜甲蛋白的mRNA的表達量進行定量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在將添加鈣的聚苯乙烯制皿試樣(比較例2)的兜甲蛋白mRNA的量設(shè)為1.0的情況下的添加鈣的790R制皿試樣(實施例2)的兜甲蛋白mRNA量為2.397，在實施例2中，兜甲蛋白mRNA量飛躍性地增加。從這些結(jié)果來看，通過使細(xì)胞與含脂環(huán)結(jié)構(gòu)的聚合物成型體接觸，從而可以使對于分化所需要的細(xì)胞內(nèi)成分比現(xiàn)有技術(shù)的方法分泌得多，因此可以期待將分化誘導(dǎo)操作所需要的時間縮短。此外，兜甲蛋白是角質(zhì)層的主要的構(gòu)成要素，發(fā)揮維持角質(zhì)細(xì)胞和脂質(zhì)的多層結(jié)構(gòu)的作用。如果兜甲蛋白充分地表達，則可期待表皮變得更加肌理細(xì)膩。[制造例2～11]代替制造例1中的ZEONEX(注冊商標(biāo))790R，使用三井化學(xué)公司制“APEL(注冊商標(biāo))APL6013T”(降冰片烯系聚合物)、Polyplastics公司制“TOPAS(注冊商標(biāo))6013”(降冰片烯系聚合物)、JSR公司制“ARTON(注冊商標(biāo))D4540”(降冰片烯系聚合物)、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、以及聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)，除此之外，和制造例1同樣地進行，制作底面直徑為3cm的培養(yǎng)用皿。將得到的皿各自稱為“APEL制皿”、“TOPAS制皿”、“ARTON制皿”、“聚碳酸酯制皿”、“PMMA制皿”、“聚苯乙烯制皿”、“聚乙烯制皿”、“聚丙烯制皿”、“PET制皿”。此外，對ZEONEX(注冊商標(biāo))790R制皿實施等離子體處理，制作完成等離子體表面處理的790R制皿。[實施例3]在790R制皿中以細(xì)胞密度1.25×104cells/cm2接種人表皮角化細(xì)胞(制作人表皮模型用)(試樣重復(fù)N＝1)，在37℃、5％CO2環(huán)境下進行培養(yǎng)6日。[實施例4～7]代替實施例3中的790R制皿，分別使用完成等離子體表面處理的790R制皿、APEL制皿、TOPAS制皿、ARTON制皿，除此之外，和實施例3同樣地進行細(xì)胞培養(yǎng)。[比較例3～9]代替實施例3中的790R制皿，分別使用BectonDickinson公司制皿[FALCON(注冊商標(biāo))、聚苯乙烯制皿、等離子體處理品]、聚碳酸酯制皿、PMMA制皿、聚苯乙烯制皿、聚乙烯制皿、聚丙烯制皿、PET制皿，除此之外，和實施例3同樣地進行細(xì)胞培養(yǎng)。在實施例3～7、比較例3～9中，利用和實施例1同樣的方法，進行從細(xì)胞中提取RNA、從RNA轉(zhuǎn)換至DNA，mRNA的表達的分析。另外，將定量對象的基因設(shè)為兜甲蛋白基因，使用GAPDH基因作為內(nèi)標(biāo)的基因，通過將兜甲蛋白基因的增幅信號除以GAPDH基因的增幅信號而進行歸一化。將用比較例3的FALCON(注冊商標(biāo))皿培養(yǎng)的細(xì)胞試樣中的兜甲蛋白基因的表達量設(shè)為1時的各例中的兜甲蛋白基因的表達量示于圖1。從該結(jié)果來看，即使是ZEONEX(登錄商標(biāo))790R以外的含脂環(huán)結(jié)構(gòu)的聚合物制的皿，與FALCON(登錄商標(biāo))皿相比，也表達了約6倍的兜甲蛋白基因，另一方面，由含脂環(huán)結(jié)構(gòu)的聚合物以外的材料得到的皿的表達量，與FALCON(登錄商標(biāo))相比，最多是2～3倍，可知含脂環(huán)結(jié)構(gòu)的聚合物有促進角化細(xì)胞的分化誘導(dǎo)的效果。為了評價在進行向角化細(xì)胞的分化誘導(dǎo)的培養(yǎng)條件下的角化細(xì)胞中的分化誘導(dǎo)基因的表達狀態(tài)的差異，使用在實施例3～7、比較例3～9中培養(yǎng)的細(xì)胞，比較作為推進向角化細(xì)胞的分化的基因的GATA3的表達的差異。將定量對象的基因設(shè)為GATA3基因，使用GAPDH基因作為內(nèi)標(biāo)的基因，通過將GATA3基因的增幅信號除以GAPDH基因的增幅信號而歸一化。將用比較例3的FALCON(注冊商標(biāo))皿培養(yǎng)的細(xì)胞試樣中的GATA3基因的表達量設(shè)為1時的各例中的GATA基因的表達量示于圖2。從該結(jié)果來看，使用聚碳酸酯制皿、PMMA制皿以及聚丙烯制皿的情況下的表達量和使用FALCON(注冊商標(biāo))制皿的表達量為同等量，使用聚苯乙烯制皿、聚乙烯制皿以及PET制皿的情況下的表達量比使用FALCON(注冊商標(biāo))皿的量少，可知分化誘導(dǎo)被抑制。另一方面，在含脂環(huán)結(jié)構(gòu)的聚合物制的皿中，與FALCON(注冊商標(biāo))皿相比，表達了1.3～1.5倍的GATA3基因。對于790R制皿，不論等離子表面處理的有無，與FALCON(注冊商標(biāo))皿相比，都增加了1.3倍以上的GATA3基因，因此可知含脂環(huán)結(jié)構(gòu)的聚合物具有促進角化細(xì)胞的分化誘導(dǎo)的效果。當(dāng)前第1頁1 2 3