目前每年以數(shù)百萬噸從化石原料生產(chǎn)苯胺，例如以生產(chǎn)聚氨酯?；诳稍偕Y源的苯胺來源也稱為“生物苯胺(bioaniline)”,對于化學(xué)工業(yè)而言是強(qiáng)烈需求的，從而不依賴于化石資源。更重要的是，對于化學(xué)加工以及通過增加可再生資源在原料中的使用，存在降低二氧化碳(CO2)排放的強(qiáng)烈需求。生物苯胺對于減少CO2排放具有高度潛力。本發(fā)明還涉及微生物的工程化以及從其生產(chǎn)芳香化合物。具體而言，本發(fā)明涉及在合適的重組微生物宿主中從可再生資源諸如例如生物質(zhì)生產(chǎn)鄰氨基苯甲酸和/或鹽（o-aminobenzoate）（oAB）的領(lǐng)域。通常，使用含有顯著比例的可發(fā)酵糖的來源。這些糖可以包括多糖諸如二糖，例如蔗糖，或三糖例如蔗果三糖，以及C-6單糖諸如葡萄糖、果糖或甘露糖以及C-5單糖諸如木糖和阿拉伯糖。能夠?qū)⑻寝D(zhuǎn)化為鄰氨基苯甲酸和/或鹽（2-氨基苯甲酸和/或鹽、鄰-氨基苯甲酸和/或鹽、o-氨基苯甲酸和/或鹽、oAB）的重組微生物菌株將能夠從廣泛的可再生資源包括糖用甜菜和糖用甘蔗、含淀粉的植物諸如玉米、小麥和黑麥、以及木質(zhì)纖維素例如從麥秸、木材或甘蔗渣中生產(chǎn)鄰氨基苯甲酸和/或鹽。目前，尚無鄰氨基苯甲酸和/或鹽的可再生的或生物衍生的來源或相應(yīng)的可商購的酸，并且沒有描述鄰氨基苯甲酸和/或鹽的大規(guī)模生物生產(chǎn)的已知實(shí)例。鄰氨基苯甲酸和/或鹽是莽草酸途徑的天然中間體和芳香氨基酸L-色氨酸生物合成的前體。鄰氨基苯甲酸和/或鹽的生物合成途徑在原核生物和真核生物中是相對充分了解的?？梢詫?shí)現(xiàn)鄰氨基苯甲酸和/或鹽至苯胺的化學(xué)轉(zhuǎn)化。目前生產(chǎn)苯胺的方法依賴于從石油來源的原料的化學(xué)合成。此類石油來源的原料相對于可再生的原料諸如可再生資源“生物質(zhì)”，是不可再生的?；瘜W(xué)合成中涉及的若干化學(xué)步驟導(dǎo)致化學(xué)品的高生產(chǎn)成本。苯胺的轉(zhuǎn)化化學(xué)合成可以與有害的中間體、溶劑以及可能對環(huán)境具有實(shí)質(zhì)性影響的廢品相關(guān)。芳環(huán)上非特異性的副反應(yīng)導(dǎo)致產(chǎn)物產(chǎn)率的降低。石油來源的原料受全球石油價(jià)格導(dǎo)致的成本波動(dòng)的影響。WO2013/103894A1公開了經(jīng)生物來源的對氨基苯甲酸（4-氨基苯甲酸）生產(chǎn)芳香胺的方法。然而，該文件公開了在大腸桿菌或在釀酒酵母(S.cerevisiae)中生產(chǎn)對氨基苯甲酸，但沒有意識(shí)到谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)作為宿主的優(yōu)點(diǎn)。此外，該文件也沒有公開如何將發(fā)酵方法與將生物來源的對氨基苯甲酸轉(zhuǎn)化為芳香胺的下游化學(xué)方法成功地結(jié)合。如果基于包括鄰氨基苯甲酸至苯胺的酶促體內(nèi)脫羧反應(yīng)作為最后反應(yīng)步驟的生物合成途徑的話，作為一步轉(zhuǎn)化的糖至苯胺的直接發(fā)酵被認(rèn)為是最有效的。由于氨基苯甲酸脫羧酶無法經(jīng)蛋白質(zhì)工程成功地鑒定并開發(fā)，因此鄰氨基苯甲酸至苯胺的脫羧反應(yīng)無法通過純酶促方法來進(jìn)行。由于此類一步方法技術(shù)上不可行，因此考慮與酶促步驟相反，例如通過化學(xué)步驟進(jìn)行將鄰氨基苯甲酸脫羧為苯胺的最終反應(yīng)步驟作為最終反應(yīng)步驟的替代方法。因此，本發(fā)明的技術(shù)問題已是提供基于可再生資源生產(chǎn)苯胺的方法，所述方法優(yōu)于現(xiàn)有的發(fā)酵和化學(xué)方法并且其實(shí)現(xiàn)了相比于成熟的基于石油的生產(chǎn)方法的二氧化碳排放的大幅降低，不依賴于化石資源，以及相似的或更低的生產(chǎn)成本。本發(fā)明已經(jīng)通過提供重組微生物宿主細(xì)胞來解決了所述問題，所述重組微生物宿主細(xì)胞能夠?qū)砂l(fā)酵碳底物的原料生物轉(zhuǎn)化為鄰氨基苯甲酸和/或鹽。本發(fā)明通過提供生產(chǎn)苯胺的方法進(jìn)一步解決了所述問題，所述方法包括以下步驟：a）使用如本文所述且如權(quán)利要求中要求保護(hù)的本發(fā)明的重組微生物宿主細(xì)胞，通過發(fā)酵包含至少一種可發(fā)酵的碳底物的原料來生產(chǎn)鄰氨基苯甲酸和/或鹽，所述重組微生物宿主細(xì)胞能夠?qū)⑺霭辽僖环N可發(fā)酵的碳底物的原料生物轉(zhuǎn)化為鄰氨基苯甲酸和/或鹽，其中所述鄰氨基苯甲酸和/或鹽包含鄰氨基苯甲酸陰離子，b）通過酸質(zhì)子化將所述鄰氨基苯甲酸和/或鹽從所述鄰氨基苯甲酸陰離子轉(zhuǎn)化為鄰氨基苯甲酸，c）通過沉淀或通過溶解于有機(jī)溶劑回收所述鄰氨基苯甲酸，以及d）通過在有機(jī)溶劑中的熱脫羧反應(yīng)將所述鄰氨基苯甲酸轉(zhuǎn)化為苯胺。基于可再生資源例如生物質(zhì)或可發(fā)酵的碳源改變苯胺生產(chǎn)提供了顯著降低CO2排放的優(yōu)點(diǎn)，允許不依賴于化石資源，且實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)成本中可能的降低。本發(fā)明的另外的優(yōu)點(diǎn)在于將有害化學(xué)品的使用和產(chǎn)生的廢料保持在最低。另外，生物來源的鄰氨基苯甲酸和/或鹽可以在對環(huán)境具有低得多的總體影響的方法中生產(chǎn)并轉(zhuǎn)化為苯胺。具體而言，本發(fā)明提供能夠?qū)砂l(fā)酵碳底物的原料生物轉(zhuǎn)化為鄰氨基苯甲酸和/或鹽的重組微生物宿主細(xì)胞。此類根據(jù)本發(fā)明的重組微生物宿主細(xì)胞可以是用于從可再生資源諸如例如生物質(zhì)發(fā)酵生產(chǎn)鄰氨基苯甲酸和/或鹽的基因工程改造的微生物。例如，本發(fā)明提供谷氨酸棒桿菌的基因工程化菌株作為生物催化劑，其適合于從可發(fā)酵的碳源有效發(fā)酵生產(chǎn)鄰氨基苯甲酸和/或鹽。谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)是生活在土壤中的革蘭氏陽性細(xì)菌。其屬于高GC含量的革蘭氏陽性放線菌。谷氨酸棒桿菌是具有年生產(chǎn)超過兩百萬噸氨基酸（主要為l-谷氨酸和l-賴氨酸）的生物技術(shù)上最重要的細(xì)菌物種之一。由于這一巨大的工業(yè)重要性，谷氨酸棒桿菌從其于1956年發(fā)現(xiàn)以后很短時(shí)間內(nèi)已經(jīng)開始被廣泛地研究。谷氨酸棒桿菌的基因組在2003年進(jìn)行測序并發(fā)表(IkedaM,NakagawaS,ApplMicrobiolBiotechnol,2003,62:99.;KalinowskiJ,BatheB,BartelsD,BischoffN,BottM,BurkovskiA,DuschN,EggelingL,EikmannsBJ,GaigalatL,GoesmannA,HartmannM,等人,JBiotechnol,2003,104:5)。谷氨酸棒桿菌展示出作為微生物工廠以生產(chǎn)不止氨基酸還有其他化學(xué)品的眾多理想的內(nèi)在屬性。棒桿菌生理學(xué)的深入的基礎(chǔ)知識(shí)和用于在組合方法中建模過程或涉及合成途徑的后基因組工具構(gòu)成了設(shè)計(jì)有效且多能的棒桿菌生物精煉廠(biorefineries)的重要基礎(chǔ)。產(chǎn)生oAB的谷氨酸棒桿菌的生物合成途徑已廣泛地研究并且可以分為主要三個(gè)部分：中心代謝、共有的芳香族途徑和L-色氨酸分支途徑。oAB是L-色氨酸生物合成的中間體（圖1）。然而，以菌株改進(jìn)氨基酸生產(chǎn)的前期嘗試主要依賴于經(jīng)典的隨機(jī)誘變和篩選程序，旨在刪除競爭途徑并消除生物合成途徑中的反饋調(diào)節(jié)。經(jīng)典方法的可用性有限，因?yàn)檎{(diào)節(jié)步驟的完全失調(diào)和合適的生物合成酶活性的增強(qiáng)是難于實(shí)現(xiàn)的。此外，隨機(jī)誘變常常在基因組中的一些位置在期望的突變以外還產(chǎn)生不期望的突變。由于難以確定這些未鑒定的突變的影響，因此會(huì)影響進(jìn)一步的菌株改進(jìn)。這些問題廣泛地存在于由隨機(jī)誘變構(gòu)成的工業(yè)菌株中。在最近十年中主要報(bào)道的文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，用通過經(jīng)典方法產(chǎn)生的菌株的目前生產(chǎn)產(chǎn)生使糖（wt％）大約20-23流向l-色氨酸和約25流向l-苯丙氨酸。相反，對于許多其他氨基酸已經(jīng)報(bào)道了糖流向（wt％）高得多的生產(chǎn)產(chǎn)率，例如，l-賴氨酸，40-50；l-谷氨酸，45-55；l-精氨酸，30-40；l-蘇氨酸，40-50；l-纈氨酸，30-40；和；l-丙氨酸，45-55(LeuchtenbergerW,HuthmacherK,DrauzK,ApplMicrobiolBiotechnol,2005,69:1.;IkedaM,NakagawaS,ApplMicrobiolBiotechnol,2003,62:99)。基于分子生物學(xué)中以及對導(dǎo)致糖至l-色氨酸（和oAB）的生物合成途徑的功能性的理解中產(chǎn)生的近期優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明提供了能夠?qū)砂l(fā)酵碳底物的原料生物轉(zhuǎn)化為鄰氨基苯甲酸和/或鹽的重組微生物宿主細(xì)胞，并且更具體而言，基于定向誘變和代謝工程方法的來自谷氨酸棒桿菌ATCC13032的oAB生產(chǎn)者。用以產(chǎn)生oAB生產(chǎn)者的代謝工程的某些基因靶點(diǎn)位于產(chǎn)生oAB并隨后為l-色氨酸的芳香族生物合成途徑中（圖1）。l-色氨酸的生物合成在谷氨酸棒桿菌中在若干步驟中嚴(yán)格受控。因此，過量產(chǎn)生oAB需要基因去除存在于共有的芳香族途徑中和l-色氨酸分支中的代謝控制。此外，擴(kuò)增DAHP合成酶（其抑制芳香族途徑）是作為本發(fā)明的另外的實(shí)施方案的增加向共有途徑的凈碳流的重要策略。這些突變與生成芳香族氨基酸緩慢生長型(bradytroph)菌株組合以繞開芳香族氨基酸補(bǔ)充的恒定需求。考慮到從葡萄糖生物合成1mol的oAB需要1mol赤蘚糖-4-磷酸（E4P）和2mol磷酸烯醇丙酮酸（PEP）作為開始前體，此外，在其途徑中消耗1mol的L-谷氨酸并釋放1mol的丙酮酸，針對前體的平衡供應(yīng)來實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物的有效生產(chǎn)。在下文中，本發(fā)明人聚焦于谷氨酸棒桿菌作為用于生物生產(chǎn)鄰氨基苯甲酸和/或鹽的重組微生物菌株。因此，本發(fā)明提供能夠?qū)砂l(fā)酵碳底物的原料生物轉(zhuǎn)化為鄰氨基苯甲酸和/或鹽的重組微生物宿主細(xì)胞。所述谷氨酸棒桿菌優(yōu)選為谷氨酸棒桿菌ATCC13032，最優(yōu)選為重組的谷氨酸棒桿菌ATCC13032。在本發(fā)明的另外的實(shí)施方案中，谷氨酸棒桿菌，優(yōu)選谷氨酸棒桿菌ATCC13032可以包含編碼鄰氨基苯甲酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的trpD基因(Cgl3032,SEQIDNO:1)的遺傳修飾，其中所述遺傳修飾優(yōu)選自SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7和SEQIDNO:8，其均具有降低trpD基因表達(dá)的作用以產(chǎn)生色氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株。單一的前述遺傳修飾已經(jīng)導(dǎo)致產(chǎn)生鄰氨基苯甲酸和/或鹽（oAB）的重組谷氨酸棒桿菌ATCC13032菌株。在下文中，定義用于描述本發(fā)明的一些術(shù)語。根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語“生物苯胺”指基于來自可再生資源的原料的苯胺，所述原料諸如糖用甜菜、糖用甘蔗、含淀粉的植物，優(yōu)選玉米、小麥和黑麥，和木質(zhì)纖維素，優(yōu)選麥秸、木材和甘蔗渣，甘油和C1化合物，優(yōu)選CO，或諸如可發(fā)酵糖，優(yōu)選C-5單糖、C-6單糖、二糖和三糖，其中所述C-5單糖優(yōu)選為木糖和阿拉伯糖，且其中所述C-6單糖優(yōu)選為蔗糖、果糖或甘露糖，且其中所述二糖優(yōu)選為蔗糖，且其中所述三糖優(yōu)選為蔗果三糖。根據(jù)本發(fā)明的“鄰氨基苯甲酸和/或鹽(o-aminobenzoate)”指鄰-氨基苯甲酸和/或鹽（鄰氨基苯甲酸和/或鹽、“oAB”）。鄰氨基苯甲酸和/或鹽可以以包含鄰氨基苯甲酸陰離子C6H4COO-和合適的陽離子諸如NH4+或Na+的鄰氨基苯甲酸鹽、或作為鄰氨基苯甲酸(anthranilicacid)（其為兩性離子C6H4COO-NH3+和C6H4COO-NH2）的形式存在?！班彴被郊姿岷?或鹽”（“oAB”）與“4-氨基苯甲酸和/或鹽”（“pAB”）的區(qū)別在于氨基在C4-位(對位)連接至苯環(huán)，與鄰氨基苯甲酸和/或鹽（“oAB”）的情況中的C2-位(鄰位)不同。在本發(fā)明的涵義內(nèi)的術(shù)語“宿主”可以包括任何能夠天然地或僅在轉(zhuǎn)化后作為“重組微生物宿主”通過發(fā)酵產(chǎn)生鄰氨基苯甲酸和/或鹽、或轉(zhuǎn)化后除了天然存在的鄰氨基苯甲酸和/或鹽外以鄰氨基苯甲酸陰離子或鄰氨基苯甲酸的形式通過發(fā)酵產(chǎn)生鄰氨基苯甲酸和/或鹽的宿主。根據(jù)本發(fā)明的“微生物宿主”可以選自細(xì)菌、酵母和真菌。所述宿主可以選自細(xì)菌、酵母和真菌，其中所述細(xì)菌優(yōu)選為大腸桿菌菌株、棒桿菌菌株或假單胞菌菌株，其中所述棒桿菌菌株優(yōu)選為谷氨酸棒桿菌且其中所述假單胞菌菌株優(yōu)選為惡臭假單胞菌（Pseudomonasputida）。優(yōu)選地，所述微生物宿主可以是重組微生物宿主。此類重組微生物宿主可以為大腸桿菌W3110trpD9923，如實(shí)施例1中所示。此類重組宿主可以為惡臭假單胞菌KT2440，如實(shí)施例4中所示。此類重組宿主也可以為谷氨酸棒桿菌ATCC13032，如實(shí)施例3中所示。在本發(fā)明的涵義內(nèi)的術(shù)語“遺傳修飾”指微生物宿主的給定基因的核酸序列與野生型序列比較的改變。此類遺傳修飾可以包括一個(gè)或多個(gè)脫氧核糖核酸的缺失以及插入。此類遺傳修飾可以包括通過轉(zhuǎn)化入微生物宿主的基因組引入的部分或全部缺失以及插入。此類遺傳修飾可以產(chǎn)生重組微生物宿主，其中所述遺傳修飾可以包括至少一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或更多個(gè)單一核苷酸與各微生物宿主的野生型序列比較的改變。例如，遺傳修飾可以為至少一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或更多個(gè)單一核苷酸的缺失或插入或者至少一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或更多個(gè)單一核苷酸的轉(zhuǎn)變。根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾可以具有例如各基因降低的表達(dá)或例如各基因增強(qiáng)的表達(dá)的作用。在根據(jù)本發(fā)明的此類遺傳修飾的一個(gè)實(shí)例中，重組微生物宿主例如谷氨酸棒桿菌可以包含編碼鄰氨基苯甲酸磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶的trpD基因(Cgl3032,SEQIDNO:1)的遺傳修飾，其中所述遺傳修飾可以具有經(jīng)修飾的trpD基因的降低的表達(dá)。此類經(jīng)修飾的trpD基因可以選自SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7,和SEQIDNO:8。上述遺傳修飾的單獨(dú)一個(gè)已經(jīng)產(chǎn)生重組谷氨酸棒桿菌ATCC13032菌株，其顯示產(chǎn)生鄰氨基苯甲酸和/或鹽（oAB）的經(jīng)修飾的trpD基因的降低的表達(dá)。在本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方案中，此類遺傳修飾也可以是trpD基因的缺失，例如如在谷氨酸棒桿菌trpD中。在本發(fā)明的涵義內(nèi)的術(shù)語“分批發(fā)酵”指具有確定的起始點(diǎn)和確定的終止點(diǎn)的單一發(fā)酵反應(yīng)。分批發(fā)酵也可以用于在其中微生物的生產(chǎn)速率無法以高速率以持續(xù)的發(fā)酵模式維持的情況下的根據(jù)本發(fā)明的方法的步驟a）中。在本發(fā)明的涵義內(nèi)的術(shù)語“補(bǔ)料分批發(fā)酵”，補(bǔ)料分批發(fā)酵指在生物技術(shù)方法中的操作技術(shù)，其中一種或多種營養(yǎng)物（底物）在培養(yǎng)過程中補(bǔ)料（供應(yīng)）至生物反應(yīng)器，且其中生物反應(yīng)器中的產(chǎn)物保持直至運(yùn)行結(jié)束。“補(bǔ)料分批發(fā)酵”也可以用于在其中微生物的生產(chǎn)速率無法以高速率以持續(xù)的發(fā)酵模式維持的情況下的根據(jù)本發(fā)明的方法的步驟a）中。在本發(fā)明的涵義內(nèi)的術(shù)語“連續(xù)發(fā)酵”指這樣的發(fā)酵方法，其中在根據(jù)本發(fā)明的方法的步驟a）的發(fā)酵過程中持續(xù)添加底物并移除產(chǎn)物（即鄰氨基苯甲酸和/或鹽，oAB）。在下文中，更詳細(xì)地描述了本發(fā)明。本發(fā)明提供能夠?qū)砂l(fā)酵碳底物的原料生物轉(zhuǎn)化為鄰氨基苯甲酸和/或鹽（oAB）的重組微生物宿主細(xì)胞。此類微生物宿主細(xì)胞可以選自細(xì)菌、酵母和真菌，其中所述細(xì)菌優(yōu)選為大腸桿菌菌株、棒桿菌菌株或假單胞菌菌株，且其中所述棒桿菌菌株優(yōu)選為谷氨酸棒桿菌，更優(yōu)選為谷氨酸棒桿菌ATCC13032，且其中所述假單胞菌菌株優(yōu)選為惡臭假單胞菌（Pseudomonasputida），更優(yōu)選為惡臭假單胞菌KT2440。在本發(fā)明的重組微生物宿主細(xì)胞的另外的實(shí)施方案中，重組微生物宿主細(xì)胞可以為谷氨酸棒桿菌。在本發(fā)明更具體的實(shí)施方案中，谷氨酸棒桿菌ATCC13032是用于生產(chǎn)鄰氨基苯甲酸和/或鹽的優(yōu)選的重組微生物宿主，這是由于本發(fā)明人觀察到該生物體對鄰氨基苯甲酸和/或鹽具有高耐受性，而對于其他微生物，例如大腸桿菌K12，僅低濃度的鄰氨基苯甲酸和/或鹽就是有毒的。在本發(fā)明的重組微生物宿主細(xì)胞的另外的實(shí)施方案中，所述谷氨酸棒桿菌（優(yōu)選谷氨酸棒桿菌ATCC13032）可以包含編碼鄰氨基苯甲酸磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶的trpD基因的遺傳修飾（圖3）。所述編碼鄰氨基苯甲酸磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶的trpD基因(Cgl3032,SEQIDNO:1)的遺傳修飾可以選自SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7和SEQIDNO:8，且其中所述遺傳修飾具有trpD基因降低的表達(dá)的作用。更具體而言，上述序列中的突變可以改變trpD基因的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和起始密碼子之間的間隔區(qū)。此外，trpD基因的天然起始密碼子的變更可以導(dǎo)致trpD的翻譯降低因而導(dǎo)致朝向l-色氨酸的緩慢生長型菌株，其在不添加l-色氨酸的情況下產(chǎn)生以數(shù)克規(guī)模的鄰氨基苯甲酸和/或鹽。因此此類菌株特別優(yōu)選作為根據(jù)本發(fā)明的重組微生物宿主。在本發(fā)明的重組微生物宿主細(xì)胞的另外的實(shí)施方案中，微生物宿主細(xì)胞可以為谷氨酸棒桿菌，優(yōu)選為谷氨酸棒桿菌ATCC13032，其中所述谷氨酸棒桿菌或谷氨酸棒桿菌ATCC13032可以包含編碼分支酸變位酶的csm基因(Cgl0853,SEQIDNO:9)的遺傳修飾（圖3），其中所述遺傳修飾優(yōu)選選自SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15和SEQIDNO:16，且其中所述遺傳修飾具有csm基因降低的表達(dá)的作用。具體而言，可以操縱csm基因來進(jìn)一步通過將l-苯丙氨酸和l-色氨酸的產(chǎn)率降至最低來提高鄰氨基苯甲酸和/或鹽的產(chǎn)率。降低csm基因表達(dá)的作用為朝向l-酪氨酸和l-苯丙氨酸結(jié)果的緩慢生長型菌株，其在不添加l-酪氨酸和l-苯丙氨酸的情況下以數(shù)克規(guī)模產(chǎn)生鄰氨基苯甲酸和/或鹽。這防止由于在l-酪氨酸和/或l-苯丙氨酸的芳香酸途徑中催化反應(yīng)的酶的反饋抑制而降低鄰氨基苯甲酸和/或鹽，如在添加有l(wèi)-酪氨酸和/或l-苯丙氨酸的l-酪氨酸和/或l-苯丙氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株中可能的那樣。因此此類菌株特別優(yōu)選作為根據(jù)本發(fā)明的重組微生物宿主。這一結(jié)果可以導(dǎo)致更高產(chǎn)量的鄰氨基苯甲酸和/或鹽。在本發(fā)明的重組微生物宿主細(xì)胞的另外的實(shí)施方案中，谷氨酸棒桿菌微生物宿主細(xì)胞（優(yōu)選谷氨酸棒桿菌ATCC13032）可以進(jìn)一步包含選自以下的一個(gè)或多個(gè)缺失：hpr(Cgl1937–SEQIDNO:17或SEQIDNO:18)、ptsG(Cgl1537-SEQIDNO:19或SEQIDNO:20)、pepco(Cgl1523–SEQIDNO:21或SEQIDNO:22)、pyk(Cgl2089–SEQIDNO:23或SEQIDNO:24)和gpi(Cgl0851–SEQIDNO:27或SEQIDNO:28)?；騢pr(Cgl1937–SEQIDNO:17或SEQIDNO:18)和基因ptsG(SEQIDNO:19或SEQIDNO:20):這些基因的每一個(gè)均編碼多酶復(fù)合體PEP-磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（PTS）的單元（圖1、2）。谷氨酸棒桿菌的PTS的兩個(gè)單元Hpr和PtsG被操作并關(guān)于其對生長、細(xì)胞活力以及oAB產(chǎn)生的影響進(jìn)行比較，如實(shí)施例3中所示?；騪epco(Cgl1523–SEQIDNO:21或SEQIDNO:22)編碼酶磷酸烯醇丙酮酸羧化酶。磷酸烯醇丙酮酸羧化酶通過將PEP（磷酸烯醇丙酮酸）轉(zhuǎn)化為草酰乙酸而將其消耗（圖1、2）。該反應(yīng)是不供氧下的主要添補(bǔ)反應(yīng)，而在標(biāo)準(zhǔn)的充足的氧供應(yīng)下，丙酮酸激酶消耗大部分PEP以在獲得一ATP的同時(shí)產(chǎn)生丙酮酸。谷氨酸棒桿菌的基因pepco進(jìn)行操作并關(guān)于生長、細(xì)胞活力以及oAB產(chǎn)生與其他谷氨酸棒桿菌菌株進(jìn)行比較，如實(shí)施例3中所示?；騪yk(Cgl1937–SEQIDNO:23或SEQIDNO:24)編碼酶丙酮酸激酶。丙酮酸激酶通過產(chǎn)生丙酮酸和ATP而消耗PEP（磷酸烯醇丙酮酸）（圖1、2）。該反應(yīng)是谷氨酸棒桿菌中糖酵解的部分。Pyk編碼基因（在谷氨酸棒桿菌基因組中注釋的）如實(shí)施例3中所述缺失?；騡pi(Cgl0851–SEQIDNO:27或SEQIDNO:28)編碼酶葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶。該酶催化將葡萄糖-6-磷酸轉(zhuǎn)化為果糖-6-磷酸的糖酵解的第一步（圖1、2）。在本發(fā)明的重組微生物宿主細(xì)胞的更具體的實(shí)施方案中，谷氨酸棒桿菌微生物宿主細(xì)胞（優(yōu)選谷氨酸棒桿菌ATCC13032）可以進(jìn)一步過表達(dá)選自以下的一個(gè)或多個(gè)基因：galP(SEQIDNO:30)、iolT2(SEQIDNO:31)、ppgk(SEQIDNO:32)、pps(SEQIDNO:33-35)、ppk(SEQIDNO:36)、zwf1(SEQIDNO:37)、opcA(SEQIDNO:38-39)、tktCg(SEQIDNO:40)、tktEc(SEQIDNO:41)、talCg(SEQIDNO:42)、talEc(SEQIDNO:43)、編碼TrpEGS38F的基因(trpEGS38F,SEQIDNO:50)、編碼TrpEGS38R的基因(trpEGS38R,SEQIDNO:51)、編碼TrpEGS40R的基因(trpEGS40R,SEQIDNO:52)、編碼TrpEGS40F的基因(trpEGS40F,SEQIDNO:53)、編碼AroGD146N的基因(aroGD146N,SEQIDNO:55)、大腸桿菌LJ110的aroL(SEQIDNO:93)、aroK(SEQIDNO:94)、glnA(SEQIDNO:95)和qsuA(SEQIDNO:96)。谷氨酸棒桿菌微生物宿主（優(yōu)選谷氨酸棒桿菌ATCC13032）中反饋抗性的trpEG基因(鄰氨基苯甲酸合成酶基因)（編碼TrpEGS38F的基因(trpEGS38F–SEQIDNO:50)、編碼TrpEGS38R的基因(trpEGS38R–SEQIDNO:51)、編碼TrpEGS40R的基因(trpEGS40R–SEQIDNO:52)、編碼TrpEGS40F的基因(trpEGS40F–SEQIDNO:53)），單獨(dú)表達(dá)或與本發(fā)明的其他遺傳修飾的任一者組合表達(dá)，是本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案。所述基因均具有共同的特征，即它們編碼鄰氨基苯甲酸合成酶單元的突變形式，其在形成鄰氨基苯甲酸和/或鹽和l-谷氨酸下釋放丙酮酸分子（圖3）。這些是TrpEG的反饋抗性形式，這即是為何相應(yīng)的突變基因被稱為trpEGfbr。谷氨酸棒桿菌微生物宿主（優(yōu)選谷氨酸棒桿菌ATCC13032）中反饋抗性aroG基因（3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸合成酶基因）諸如編碼AroGD146N的基因(aroGD146N–SEQIDNO:55)，單獨(dú)或與本發(fā)明的其他遺傳修飾的任一者組合過表達(dá)，是本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案。編碼AroGD146N的基因(aroGD146N–SEQIDNO:55)編碼AroG的突變形式，其是在大腸桿菌中催化從赤蘚糖-4-磷酸（E4P）至3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸的反應(yīng)的酶（圖3）?；騡alP(Cgl2409-SEQIDNO:30)編碼酶半乳糖通透酶?？梢酝ㄟ^表達(dá)半乳糖通透酶在PTS破壞后恢復(fù)葡萄糖攝入（圖1、2）。在谷氨酸棒桿菌中，鑒定基因并注釋為半乳糖通透酶且因此是此類表達(dá)的良好候選。該候選在PTS遭破壞的谷氨酸棒桿菌中表達(dá)，如實(shí)施例3中所示?；騣olT2(Cgl3058–SEQIDNO:31)編碼肌醇通透酶T2單元?？梢酝ㄟ^表達(dá)肌醇通透酶T2單元在PTS破壞后恢復(fù)葡萄糖攝入（圖1、2）。作為過表達(dá)肌醇通透酶以在谷氨酸棒桿菌中PTS破壞后恢復(fù)葡萄糖攝入的替代方法，進(jìn)行肌醇通透酶的肌醇通透酶T2單元的過表達(dá)。將所產(chǎn)生的菌株特征與過表達(dá)半乳糖通透酶的菌株比較，如在實(shí)施例3中所示?；騪pgk(Cgl1910–SEQIDNO:32)編碼酶聚磷酸葡萄糖激酶。半乳糖通透酶以及肌醇通透酶T2單元僅能攝入葡萄糖，但它們無法將糖分子磷酸化（圖1、2）。然而，磷酸化對于能夠代謝葡萄糖分子是必需的。因此，將不同通透酶的表達(dá)與葡萄糖磷酸化酶的表達(dá)組合。該P(yáng)pgk在本發(fā)明的不同的表達(dá)通透酶且PTS缺失菌株中共表達(dá)?；騪ps(Cgl0551和Cgl0552–SEQIDNO:33-35)編碼酶PEP（磷酸烯醇丙酮酸）合成酶。與消耗PEP的反應(yīng)破壞分開后，促進(jìn)了導(dǎo)致生成PEP的生物合成步驟。PEP合成酶催化PEP的形成，其通過丙酮酸回收和消耗ATP為AMP，作為谷氨酸棒桿菌中糖異生的部分（圖1、2）。pps基因的過表達(dá)導(dǎo)致谷氨酸棒桿菌菌株中的oAB庫增加，如實(shí)施例3中所述?；騪pk(Cgl2862–SEQIDNO:36)編碼酶PEP羧激酶。作為乙醛酸途徑的部分，草酰乙酸可以通過PEP羧激酶再循環(huán)為PEP（圖1、2）。過表達(dá)基因可以是通向oAB生物合成可用的更大的PEP庫的另一途徑，如實(shí)施例3中所述。基因zwf1(Cgl1576–SEQIDNO:37)和基因(opcA(Cg1577–SEQIDNO:38-39)編碼酶葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（圖1、2）。催化戊糖磷酸途徑（PPP）的第一反應(yīng)（從葡萄糖-6-磷酸形成核酮糖-5-磷酸）的酶的產(chǎn)量提高可以導(dǎo)致向PPP的流增加，導(dǎo)致產(chǎn)生更高量的E4P并經(jīng)果糖-6-磷酸（Frc-6-P）產(chǎn)生且可以進(jìn)一步增加細(xì)胞PEP庫，最終導(dǎo)致谷氨酸棒桿菌菌株中oAB庫的增加。當(dāng)將該操作應(yīng)用于谷氨酸棒桿菌菌株并且進(jìn)行Zop酶的表達(dá)時(shí)，實(shí)現(xiàn)該效果，如實(shí)施例3中所述?；騮ktCG(Cgl1574–SEQIDNO:40)和基因tktEC(ECDH10B_3110–SEQIDNO:41)編碼酶轉(zhuǎn)酮酶。經(jīng)PPP增強(qiáng)的流和增加的E4P庫、和甚至oAB和芳香族氨基酸增加的產(chǎn)生由在谷氨酸棒桿菌菌株中表達(dá)轉(zhuǎn)酮酶而觀察到（圖1、2）。來自大腸桿菌的轉(zhuǎn)酮酶以及谷氨酸棒桿菌中編碼的轉(zhuǎn)酮酶進(jìn)行過表達(dá)，如實(shí)施例3中所述?；騮alCG(Cgl1575–SEQIDNO:42)和基因talEC(ECDH10B_2629–SEQIDNO:43)編碼酶轉(zhuǎn)醛醇酶。如通過轉(zhuǎn)酮酶過表達(dá)的對E4P產(chǎn)生的相當(dāng)?shù)挠欣饔每梢詫τ谠诖竽c桿菌中過表達(dá)轉(zhuǎn)醛醇酶而觀察到（圖1、2）。由于大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌轉(zhuǎn)醛醇酶的序列差異顯著，因此本發(fā)明人繼續(xù)在本發(fā)明的谷氨酸棒桿菌菌株中表達(dá)描述的大腸桿菌基因和天然谷氨酸棒桿菌基因，如實(shí)施例3中所述。將編碼轉(zhuǎn)醛醇酶和轉(zhuǎn)酮酶的基因合并在一個(gè)載體上并共表達(dá)于谷氨酸棒桿菌菌株中以進(jìn)一步增強(qiáng)oAB生產(chǎn)菌株特征，如實(shí)施例3中所述?；騫suA(Cgr0492–SEQIDNO:96)編碼藥物抗性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白QsuA。在谷氨酸棒桿菌菌株中表達(dá)該基因?qū)е耾AB轉(zhuǎn)運(yùn)的優(yōu)化，如實(shí)施例3中所述?；騛roL(B0388–SEQIDNO:93)來自大腸桿菌LJ110，編碼在大腸桿菌中催化從莽草酸（SHI）至莽草酸-3-磷酸（SHI3P）的反應(yīng)的酶。在谷氨酸棒桿菌菌株中表達(dá)來自大腸桿菌的aroL基因，如實(shí)施例3中所述?；騛roK(Cgl1622–SEQIDNO:94)編碼催化在谷氨酸棒桿菌ATCC13032中從莽草酸（SHI）至莽草酸-3-磷酸（SHI3P）的反應(yīng)的酶。在谷氨酸棒桿菌菌株中表達(dá)aroK基因，如實(shí)施例3中所述。基因glnA(Cgl2214–SEQIDNO:95)編碼谷氨酸棒桿菌ATCC13032中的酶谷氨酰胺合成酶（圖3）。在谷氨酸棒桿菌菌株中表達(dá)glnA基因，如實(shí)施例3中所述。在本發(fā)明的特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，重組微生物宿主細(xì)胞可以是谷氨酸棒桿菌?trpD、谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5、谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5?pepco、谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5?gpi、谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5?pyk、谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5/pEKEx2-trpEGS40F、谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5/pEKEx2-aroGD146N、谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5/pEKEx2-aroGD146N-trpEGS40F、谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5/pEKEx2-aroL、谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5/pSB072、谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5/pSB073,C.glutamicum?trpD::trpD5/pSB074、谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5/pSB075、谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5/pSB076、谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5/pSB077、谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5/pSB078、谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5/pSB085或谷氨酸棒桿菌??trpD::trpD5/pSB096，如實(shí)施例3和表4中進(jìn)一步所述。在下文中，描述了本發(fā)明的另外的重組微生物宿主。在本發(fā)明的重組微生物宿主細(xì)胞的又另一個(gè)的實(shí)施方案中，微生物宿主細(xì)胞可以為惡臭假單胞菌，優(yōu)選為惡臭假單胞菌KT2440。在本發(fā)明的重組微生物宿主細(xì)胞的另外的實(shí)施方案中，所述惡臭假單胞菌（優(yōu)選惡臭假單胞菌KT2440）可以包含編碼鄰氨基苯甲酸磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶和吲哚-3-甘油磷酸合成酶(PP_0421和PP_0422–SEQIDNO:63-64)的trpDC基因的缺失、或編碼分支酸變位酶和預(yù)苯酸脫水酶(PP_1769–SEQIDNO:65-66)的pheA基因的缺失、或兩者，如實(shí)施例4中所述（圖4）。在本發(fā)明的重組微生物宿主細(xì)胞的另外的實(shí)施方案中，所述惡臭假單胞菌，優(yōu)選惡臭假單胞菌KT2440，其中所述惡臭假單胞菌或惡臭假單胞菌KT2440可以表達(dá)一個(gè)或多個(gè)選自編碼TrpEGS40F的基因(trpEGS40F–SEQIDNO:53)和編碼AroGD146N的基因(aroGD146N–SEQIDNO:55)的基因（圖4）。在本發(fā)明的重組微生物宿主細(xì)胞的某些實(shí)施方案中，上述的一個(gè)或多個(gè)表達(dá)的基因可以通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)化或通過染色體轉(zhuǎn)化而整合入所述惡臭假單胞菌微生物宿主細(xì)胞中，如實(shí)施例4中所述。由重組微生物宿主細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化為鄰氨基苯甲酸和/或鹽（oAB）的包含可發(fā)酵碳底物的原料可以選自糖用甜菜、糖用甘蔗、含淀粉的植物、優(yōu)選玉米、小麥和黑麥，和木質(zhì)纖維素，優(yōu)選麥秸、木材和甘蔗渣，甘油和C1化合物，優(yōu)選CO。在本發(fā)明另外的實(shí)施方案中，包含于原料中的可發(fā)酵碳底物可以選自C-5單糖、C6-單糖、二糖和三糖，其中所述C-5單糖優(yōu)選為木糖和阿拉伯糖，且其中所述C-6單體優(yōu)選為葡萄糖、果糖或甘露糖，且其中所述二糖優(yōu)選為蔗糖，且其中所述三糖優(yōu)選為蔗果三糖。本發(fā)明已通過提供生產(chǎn)苯胺的方法進(jìn)一步解決了以上問題，所述方法包括以下步驟：a)使用如本文所述且如權(quán)利要求中要求保護(hù)的重組微生物宿主細(xì)胞，通過發(fā)酵包含至少一種可發(fā)酵的碳底物的原料來生產(chǎn)鄰氨基苯甲酸和/或鹽，所述重組微生物宿主細(xì)胞能夠?qū)⑺霭辽僖环N可發(fā)酵的碳底物的原料生物轉(zhuǎn)化為鄰氨基苯甲酸和/或鹽，其中所述鄰氨基苯甲酸和/或鹽包含鄰氨基苯甲酸陰離子，b)通過酸質(zhì)子化將所述鄰氨基苯甲酸和/或鹽從所述鄰氨基苯甲酸陰離子轉(zhuǎn)化為鄰氨基苯甲酸和/或鹽，c)通過沉淀或通過溶解于有機(jī)溶劑回收所述鄰氨基苯甲酸，以及d)通過在有機(jī)溶劑中的熱脫羧反應(yīng)將所述鄰氨基苯甲酸轉(zhuǎn)化為苯胺。根據(jù)本發(fā)明的方法提供相比于基于化石資源的方法在產(chǎn)生苯胺同時(shí)實(shí)現(xiàn)CO2排放中的大量降低法技術(shù)優(yōu)點(diǎn)，不依賴于此類化石資源，以及相比于成熟的基于石油的苯胺生產(chǎn)方法實(shí)現(xiàn)相似的或更低的生產(chǎn)成本。根據(jù)本發(fā)明的方法包括兩個(gè)主要部分，其中第一部分步驟a）基于發(fā)酵（生物技術(shù)）且包括通過合適的重組微生物宿主通過發(fā)酵將包含至少一種可發(fā)酵碳底物的原料轉(zhuǎn)化為鄰氨基苯甲酸和/或鹽，其中所述鄰氨基苯甲酸和/或鹽包含鄰氨基苯甲酸陰離子(C6H4COO-NH2)。第二部分更具化學(xué)性質(zhì)且在步驟a）的下游，并且包括以下步驟a）至d），且任選e）：b）通過酸質(zhì)子化將所述鄰氨基苯甲酸和/或鹽從所述鄰氨基苯甲酸陰離子轉(zhuǎn)化為鄰氨基苯甲酸，c）通過沉淀或通過溶解于有機(jī)溶劑回收所述鄰氨基苯甲酸，以及d）通過在有機(jī)溶劑中的熱脫羧反應(yīng)將所述鄰氨基苯甲酸轉(zhuǎn)化為苯胺。綜上，本發(fā)明因此提供了生產(chǎn)苯胺的方法，其結(jié)合了第一生物技術(shù)發(fā)酵步驟a）與隨后下游的、包括至少步驟b）、c）和d）且任選步驟e）的化學(xué)方法。在下文中，進(jìn)一步詳細(xì)描述了本發(fā)明。根據(jù)本發(fā)明的方法的總體概念描繪于圖5中，且更詳盡的概覽呈現(xiàn)于圖6中。本發(fā)明還提供了生產(chǎn)苯胺的方法，其包括步驟：a）使用如本文所述且如權(quán)利要求中要求保護(hù)的重組微生物宿主細(xì)胞，通過發(fā)酵包含至少一種可發(fā)酵的碳底物的原料來生產(chǎn)鄰氨基苯甲酸和/或鹽，所述重組微生物宿主細(xì)胞能夠?qū)⑺霭辽僖环N可發(fā)酵的碳底物的原料生物轉(zhuǎn)化為鄰氨基苯甲酸和/或鹽，其中所述鄰氨基苯甲酸和/或鹽包含鄰氨基苯甲酸陰離子，b）通過酸質(zhì)子化將所述鄰氨基苯甲酸和/或鹽從所述鄰氨基苯甲酸陰離子轉(zhuǎn)化為鄰氨基苯甲酸，c）通過沉淀或通過溶解于有機(jī)溶劑回收所述鄰氨基苯甲酸，以及d）通過在有機(jī)溶劑中的熱脫羧反應(yīng)將所述鄰氨基苯甲酸轉(zhuǎn)化為苯胺。步驟a）的發(fā)酵可以是分批發(fā)酵、補(bǔ)料分批發(fā)酵或連續(xù)發(fā)酵。在步驟a）中連續(xù)發(fā)酵的情況下，細(xì)胞保留裝置可以用于從發(fā)酵步驟a）中使用的水相中分離宿主且保留宿主在用于進(jìn)行步驟a）的發(fā)酵罐中。細(xì)胞保留裝置可以整合在此類發(fā)酵罐中，或者，作為優(yōu)選選項(xiàng)，其可以位于發(fā)酵罐外作為分開的裝置。此類分離可以通過離心實(shí)現(xiàn)，例如在碟式分離器或傾析器中，通過沉降裝置中的重力，或者通過過濾技術(shù)諸如錯(cuò)流過濾。分離可以設(shè)計(jì)成具有有限的保留時(shí)間，使得當(dāng)處于分離裝置中時(shí)，宿主（例如細(xì)菌、酵母和真菌的細(xì)胞）在發(fā)酵罐外耗費(fèi)有限的時(shí)間且不會(huì)損失其生長或產(chǎn)生鄰氨基苯甲酸的能力。具有細(xì)胞保留的連續(xù)發(fā)酵允許發(fā)酵步驟a）以高細(xì)胞密度和因此高空間時(shí)間產(chǎn)率來運(yùn)行。更重要的是，步驟a）中的發(fā)酵可以非常低的生長速率運(yùn)行。這導(dǎo)致更高的總體產(chǎn)率（g產(chǎn)物/g原料），這是因?yàn)楦俚奶怯糜诋a(chǎn)生生物質(zhì)而更多用于產(chǎn)生oAB。連續(xù)發(fā)酵相對于分批發(fā)酵的另外的優(yōu)點(diǎn)在于所謂的發(fā)酵罐的“停止時(shí)間(downtime)”可以降至最低。連續(xù)發(fā)酵具有比分批發(fā)酵長得多的生產(chǎn)期，因此耗費(fèi)在清潔、滅菌、填充和收獲上的時(shí)間也成比例地短得多。這一方面有助于增加空間時(shí)間產(chǎn)率且因此降低對于給定工廠容量的投資成本（其用于運(yùn)行根據(jù)本發(fā)明的方法）。如果方法的步驟a）作為分批或補(bǔ)料分批發(fā)酵來運(yùn)行，總發(fā)酵能力可以分散在若干發(fā)酵罐中，且斷流罐(breaktank)可用于實(shí)現(xiàn)步驟a）的發(fā)酵材料向包括步驟b）至d）或甚至e）的下游部分的連續(xù)供應(yīng)。在其中微生物的生產(chǎn)速率無法在持續(xù)發(fā)酵模式下維持高速率的情況下，分批或補(bǔ)料分批發(fā)酵也可以用于根據(jù)本發(fā)明的方法的步驟a）中。根據(jù)本發(fā)明的方法的步驟a）通過使用宿主（優(yōu)選能夠通過發(fā)酵將糖轉(zhuǎn)化至鄰氨基苯甲酸和/或鹽的重組宿主）通過發(fā)酵包含可發(fā)酵糖的原料提供鄰氨基苯甲酸和/或鹽。優(yōu)選地，包含此類宿主的發(fā)酵反應(yīng)器用添加碳源（例如玉米糖漿、甘蔗汁、糖蜜等）和氮源（例如氨氣、氫氧化銨溶液、硫酸銨、硝酸銨、玉米漿等）以及微生物存活所需的各種微量元素來培養(yǎng)。步驟a）的發(fā)酵中的pH可以在3-9的范圍內(nèi)，優(yōu)選pH4-8，最優(yōu)選保持在6.5-7.5的值。步驟a）的pH可以例如通過添加堿（例如氨氣、氫氧化銨或氫氧化鈉）來調(diào)節(jié)。在根據(jù)本發(fā)明的方法的另外的實(shí)施方案中，至少通過發(fā)酵產(chǎn)生鄰氨基苯甲酸和/或鹽的步驟a）和通過酸質(zhì)子化將所述鄰氨基苯甲酸和/或鹽從鄰氨基苯甲酸陰離子轉(zhuǎn)化為鄰氨基苯甲酸的步驟b）可以持續(xù)運(yùn)行。在該實(shí)施方案中，其中進(jìn)行步驟a）的發(fā)酵罐持續(xù)操作，其中步驟a）中產(chǎn)生的發(fā)酵液可以持續(xù)抽出且經(jīng)設(shè)備（例如過濾器、離心機(jī)、膜等）加工以分離包含生長至某一密度的宿主的生物質(zhì)。該生物質(zhì)可以在清洗小部分包含重組微生物宿主的生物質(zhì)后回收至在步驟a）的發(fā)酵中使用的發(fā)酵罐。來自生物質(zhì)的此類清洗流可用以避免生物質(zhì)積累。因此可以移除在發(fā)酵罐中復(fù)制的微生物宿主細(xì)胞的一部分以及死細(xì)胞以保持發(fā)酵步驟a）的反應(yīng)器中活宿主細(xì)胞的濃度在確定限值內(nèi)，最優(yōu)選是恒定的。這可能在補(bǔ)料分批發(fā)酵的情況中是不同的，其中重組宿主細(xì)胞和發(fā)酵產(chǎn)物保持在生物反應(yīng)器中直至運(yùn)行結(jié)束，其因此不是持續(xù)發(fā)酵而是補(bǔ)料分批發(fā)酵。足夠的氧可以純氧、空氣、或富集空氣形式添加至步驟a）中使用的反應(yīng)器。發(fā)酵步驟a）的無細(xì)胞發(fā)酵液可以基本上為包含鄰氨基苯甲酸陰離子和合適的抗衡陽離子（諸如NH4+或Na+）的鄰氨基苯甲酸鹽的溶液。發(fā)酵步驟a）中產(chǎn)生的鄰氨基苯甲酸溶液可以具有5g/L-500g/L、優(yōu)選20g/L-200g/L、最優(yōu)選50g/L-150g/L的鄰氨基苯甲酸鹽的濃度。在根據(jù)本發(fā)明的方法的另外的實(shí)施方案中，步驟a）的發(fā)酵中使用的重組微生物宿主在進(jìn)行將所述鄰氨基苯甲酸和/或鹽從所述鄰氨基苯甲酸陰離子轉(zhuǎn)化為鄰氨基苯甲酸的步驟b）之前被去除。優(yōu)選地，將去除的重組微生物宿主重新補(bǔ)料至步驟a）的發(fā)酵中。這具有允許持續(xù)發(fā)酵過程的技術(shù)優(yōu)點(diǎn)，其可能是特別有效且成本節(jié)約的。鄰氨基苯甲酸和/或鹽（oAB）是氨基酸；因此其離子化狀態(tài)和在水中的溶解度取決于pH；其中兩性離子是最不可溶的形式。在pH7（其在可能用于發(fā)酵步驟a）中的發(fā)酵罐中處于主流），oAB作為用陽離子（諸如Na+或NH4+）緩沖的陰離子存在。添加酸，諸如HCl，直至pH降至等電點(diǎn)，因此引起oAB晶體的沉淀。因此，根據(jù)本發(fā)明的方法的方法步驟b）包含通過酸質(zhì)子化由此形成包含鄰氨基苯甲酸晶體的沉淀來將鄰氨基苯甲酸陰離子轉(zhuǎn)化為鄰氨基苯甲酸。為此原因，方法步驟b）也稱為“結(jié)晶”。具體地，步驟a）的鄰氨基苯甲酸溶液可以與酸優(yōu)選HCl混合。因此，pH可以降低至2-4的值，優(yōu)選3.2-3.6。這引起溶解度的改變且導(dǎo)致鄰氨基苯甲酸晶體的沉淀。鄰氨基苯甲酸晶體可以被回收，優(yōu)選在隨后的步驟c）（“回收”）中通過過濾進(jìn)行。沉淀的鄰氨基苯甲酸晶體（“餅”）中的殘余水分和無機(jī)鹽濃度取決于固液分離操作。當(dāng)進(jìn)行方法步驟b）時(shí)，發(fā)酵步驟a）中產(chǎn)生的無細(xì)胞含水發(fā)酵液中的鄰氨基苯甲酸鹽首先通過與更強(qiáng)的酸（優(yōu)選HCl）反應(yīng)而質(zhì)子化為鄰氨基苯甲酸，其中鄰氨基苯甲酸沉淀且隨后作為方法步驟c）（“回收”）中的固體材料回收。鄰氨基苯甲酸隨后在隨后的方法步驟d）中通過熱脫羧轉(zhuǎn)化為苯胺。在根據(jù)本發(fā)明的方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，在方法步驟b）中通過酸質(zhì)子化從鄰氨基苯甲酸陰離子將鄰氨基苯甲酸和/或鹽轉(zhuǎn)化為鄰氨基苯甲酸可以通過添加HCl，優(yōu)選2.5-4.5的pH，更優(yōu)選3-4的pH、最優(yōu)選3.2-3.6的pH來完成。在根據(jù)本發(fā)明的方法的另外的實(shí)施方案中，在方法步驟c）中通過沉淀回收鄰氨基苯甲酸包括過濾，由此產(chǎn)生包含所述回收的鄰氨基苯甲酸的漿液，其中所述包含所述回收的鄰氨基苯甲酸的漿液優(yōu)選溶解于有機(jī)溶劑中。優(yōu)選地，用于該階段中的有機(jī)溶劑為苯胺或1-十二烷醇或其混合物。在根據(jù)本發(fā)明的方法的另外的實(shí)施方案中，通過在方法步驟c）中溶解所述鄰氨基苯甲酸于有機(jī)溶劑中回收鄰氨基苯甲酸包括添加所述有機(jī)溶劑，優(yōu)選苯胺或1-十二烷醇或其混合物至所述鄰氨基苯甲酸，使得所述鄰氨基苯甲酸作為有機(jī)溶劑中的溶質(zhì)回收。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的方法的回收步驟c）可以隨后為在進(jìn)行步驟d）的熱脫羧前洗滌和干燥經(jīng)回收的鄰氨基苯甲酸沉淀。在根據(jù)本發(fā)明的方法的另外的實(shí)施方案中，熱脫羧步驟d）可以在催化劑存在的情況下進(jìn)行。優(yōu)選的此類催化劑可以為沸石催化劑，其中所述沸石催化劑優(yōu)選為沸石H-Y（例如獲自ZeolystInternational,目錄號CBV600）。酸催化劑沸石H-Y（SiO2/Al2O3可以為5-7，優(yōu)選其為5.5）具有特別高的酸特征且具有比例如ZSM5-27(例如，如獲自ClariantSuedChemie,目錄號MFI-27,SiO2/Al2O3=27)更寬的孔徑（0.7-0.8nm），其也具有強(qiáng)酸特征，但其具有更小的孔徑（0.5nm），因此AA分子無法有效滲透入它們且因此無法容易接近酸催化劑的活性部位，由此降低其有效性。方法步驟d）包括通過在有機(jī)溶劑中的熱脫羧反應(yīng)將步驟c）的所述鄰氨基苯甲酸轉(zhuǎn)化為苯胺。將鄰氨基苯甲酸（例如呈鄰氨基苯甲酸晶體形式，具有或不具有殘余水分）熱脫羧，優(yōu)選通過將鄰氨基苯甲酸加入到脫羧反應(yīng)器中，在其中可以進(jìn)行步驟d）。步驟d）的熱脫羧可以在150℃-250℃、優(yōu)選160℃-220℃、更優(yōu)選180℃-200℃的溫度下操作。步驟d）的熱脫羧可以運(yùn)行足夠的時(shí)間以將鄰氨基苯甲酸反應(yīng)為苯胺。優(yōu)選地，步驟d）可以運(yùn)行0.5小時(shí)至3小時(shí)。熱脫羧步驟d）可以在酸催化劑存在的情況下進(jìn)行以加速熱脫羧。熱脫羧步驟d）可以在溶劑諸如水、苯胺中、或在1-十二醇、優(yōu)選在1-十二醇中、或在1-十二醇和苯胺的混合物中運(yùn)行。另外，熱脫羧步驟d）可以在反應(yīng)器中進(jìn)行，其中反應(yīng)器中的壓力可以選擇為在反應(yīng)過程中允許多少液相蒸發(fā)的函數(shù)并且反應(yīng)器保留作為脫羧產(chǎn)物的二氧化碳(CO2)。另外，熱脫羧步驟d）可以產(chǎn)生苯胺有機(jī)溶劑混合物，其可以隨后用苯胺和其中攜帶或溶解的任何水來蒸餾。回收步驟c）中使用的任何有機(jī)溶劑可以回收為“塔頂餾出物(overheadproduct)”。溶劑可以隨后冷卻并再循環(huán)用于蒸餾。包含苯胺的塔頂餾出物流(overheadstream)可以隨后加入到蒸餾步驟中，例如，不均勻非共沸的蒸餾(heteroazeotropicdistillation)。在根據(jù)本發(fā)明的方法的另外的實(shí)施方案中，熱脫羧步驟d）可以后接純化苯胺（優(yōu)選通過蒸餾）的另外的步驟e）。在根據(jù)本發(fā)明的方法的一個(gè)實(shí)施方案中，回收步驟c）之后，溶液（“母液”）可以仍具有高至3-10g/l鄰氨基苯甲酸。因此，在根據(jù)本發(fā)明的方法的另外的實(shí)施方案中，回收步驟c）之后，殘余鄰氨基苯甲酸陰離子可以如下回收，通過吸附至離子交換樹脂或活性碳材料或沸石，優(yōu)選用Fe3+或Ca2+修飾的沸石，優(yōu)選可以通過離子交換可商購的沸石H-Y（例如，如獲自ZeolystInternational–CBV600）產(chǎn)生的Fe-Y沸石，例如如實(shí)施例6中所述，諸如Fe-Y，隨后經(jīng)回收的鄰氨基苯甲酸陰離子的解吸附，并將所述鄰氨基苯甲酸陰離子再加入至轉(zhuǎn)化步驟b）用于酸質(zhì)子化?；厥盏泥彴被郊姿彡庪x子的解吸附可以優(yōu)選在5-10的pH下進(jìn)行。例如，解吸附可以用pH5-10的水進(jìn)行，例如可以使用具有中性或堿性pH的水。解吸附后的溶液可以在步驟b）中酸添加的上游或者發(fā)酵步驟a）后去除生物質(zhì)的下游進(jìn)行循環(huán)。回收步驟c）之后，殘余鄰氨基苯甲酸陰離子可以通過吸附至離子交換樹脂或活性炭材料或沸石上來回收。優(yōu)選的沸石用Fe3+或Ca2+修飾，優(yōu)選為Fe-Y沸石。此類Fe-Y可以如實(shí)施例6中所述制備。吸收殘余的鄰氨基苯甲酸陰離子后，進(jìn)行經(jīng)回收的鄰氨基苯甲酸陰離子解吸附入液相。經(jīng)回收的鄰氨基苯甲酸陰離子的此類解吸附可以進(jìn)入有機(jī)溶劑相或水相。圖7顯示沸石Fe-Y上吸附的AA解吸附的質(zhì)量概況。圖8顯示AA從沸石Fe-Y解吸附入有機(jī)溶劑1-十二烷醇，其由于AA在其中的高溶解度以及其在水中的低可混合性(0.004g/L)而是優(yōu)選的有機(jī)溶劑。圖9顯示鄰氨基苯甲酸（AA）從吸附劑解吸附入液相。優(yōu)選將經(jīng)回收和解吸附的殘余鄰氨基苯甲酸陰離子至少部分地再補(bǔ)料到轉(zhuǎn)化步驟b）用于通過酸質(zhì)子化將所述鄰氨基苯甲酸陰離子轉(zhuǎn)化為鄰氨基苯甲酸。這具有改進(jìn)方法的效率甚至導(dǎo)致相關(guān)的經(jīng)濟(jì)益處的技術(shù)優(yōu)勢。在根據(jù)本發(fā)明的方法的特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，回收步驟c）后通過吸附回收殘余的鄰氨基苯甲酸陰離子后，沒有被吸附的鄰氨基苯甲酸陰離子的水流可以至少部分地再補(bǔ)料入步驟a）的發(fā)酵中。同樣地，這具有甚至進(jìn)一步改進(jìn)方法的效率的技術(shù)優(yōu)勢。在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟a）至d）可以作為整體過程連續(xù)運(yùn)行。在本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟a）至e）可以作為整體過程連續(xù)運(yùn)行。在此類整體和連續(xù)過程中，步驟a）的發(fā)酵可以用細(xì)胞保留和從步驟a）的發(fā)酵中的發(fā)酵液中連續(xù)去除鄰氨基苯甲酸，隨后通過在之后的步驟b）至d）或b）至e）中熱脫羧連續(xù)加工為苯胺而連續(xù)運(yùn)行。根據(jù)本發(fā)明的方法可以因此是整體和連續(xù)過程，其針對生產(chǎn)成本進(jìn)行了優(yōu)化。根據(jù)本發(fā)明的方法因此相比于以非連續(xù)方式運(yùn)行的更傳統(tǒng)的現(xiàn)有技術(shù)方法，提供了導(dǎo)致苯胺更高產(chǎn)率與相應(yīng)的經(jīng)濟(jì)益處的顯著的技術(shù)優(yōu)勢。在根據(jù)本發(fā)明的方法的另外的實(shí)施方案中，發(fā)酵步驟a）的原料可以選自甜菜、甘蔗、含淀粉的植物，優(yōu)選玉米、小麥和黑麥，和木質(zhì)纖維素，優(yōu)選麥秸、木材和甘蔗渣，甘油和C1-化合物，優(yōu)選CO。在根據(jù)本發(fā)明的方法的另外的實(shí)施方案中，發(fā)酵步驟a）的所述可發(fā)酵的碳底物可以選自C-5單糖、C-6單糖、二糖和三糖，其中所述C-5單糖優(yōu)選為木糖和阿拉伯糖，且其中所述C-6單糖優(yōu)選為葡萄糖、果糖或甘露糖，且其中所述二糖優(yōu)選為蔗糖，且其中所述三糖優(yōu)選為蔗果三糖。在根據(jù)本發(fā)明的方法的另外的實(shí)施方案中，發(fā)酵步驟a）的所述重組微生物宿主可以選自細(xì)菌、酵母和真菌，其中所述細(xì)菌優(yōu)選為大腸桿菌菌株、棒桿菌菌株或假單胞菌菌株，且其中所述棒桿菌菌株優(yōu)選為谷氨酸棒桿菌，更優(yōu)選為谷氨酸棒桿菌ATCC13032，且其中所述假單胞菌菌株優(yōu)選為惡臭假單胞菌（Pseudomonasputida），更優(yōu)選為惡臭假單胞菌KT2440。本質(zhì)上，上述本發(fā)明的任何重組微生物宿主細(xì)胞均可以用于根據(jù)本發(fā)明的方法的發(fā)酵步驟a）中。在本發(fā)明的不同的實(shí)施方案中，提供了用于生產(chǎn)苯胺的另一種方法，其包括步驟：a)提供鄰-氨基苯甲酸鹽，其中所述鄰-氨基苯甲酸鹽包含鄰氨基苯甲酸陰離子和合適的陽離子，b）通過存在或不存在催化劑的情況下熱脫羧將所述鄰氨基苯甲酸陰離子轉(zhuǎn)化為苯胺，c)在有機(jī)溶劑中萃取步驟b）中產(chǎn)生的苯胺至少一次，以及d）通過蒸餾純化步驟b）和c）中產(chǎn)生的苯胺，其中所述蒸餾產(chǎn)生苯胺和水相。在該實(shí)施方案中，步驟a）中的所述鄰-氨基苯甲酸鹽可以化學(xué)提供或者生物學(xué)產(chǎn)生，優(yōu)選其使用能夠通過發(fā)酵將所述包含可發(fā)酵碳底物的原料轉(zhuǎn)化為鄰-氨基苯甲酸鹽的重組微生物宿主細(xì)胞通過發(fā)酵包含至少一種可發(fā)酵碳底物的原料來生物學(xué)產(chǎn)生，其中所述鄰-氨基苯甲酸鹽包含鄰氨基苯甲酸陰離子和合適的陽離子。步驟a）的所述發(fā)酵可以是分批發(fā)酵、補(bǔ)料分批發(fā)酵或連續(xù)發(fā)酵。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟a）可以連續(xù)運(yùn)行。步驟a）的合適的陽離子可以是NH4+或Na+。步驟a）的重組微生物宿主可以在步驟b）中通過熱脫羧隨后轉(zhuǎn)化所述鄰氨基苯甲酸陰離子為苯胺之前被去除，其中所述去除的重組微生物宿主優(yōu)選可以再補(bǔ)料入步驟a）的發(fā)酵中。本發(fā)明的該實(shí)施方案中使用的催化劑可以是異質(zhì)的酸催化劑，優(yōu)選沸石，最優(yōu)選沸石H-Y。然而，所述催化劑也可以是異質(zhì)的堿催化劑，優(yōu)選層狀雙氫氧化物，最優(yōu)選鎂鋁水滑石。在根據(jù)本發(fā)明的另一種方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，步驟c）中有機(jī)溶劑中苯胺的萃取可以進(jìn)行不止一次，用于在蒸餾之前進(jìn)一步預(yù)濃縮苯胺。在根據(jù)本發(fā)明的另一種方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述方法可以包括回收步驟c）的萃取中使用的有機(jī)溶劑，其中所述回收可以優(yōu)選通過蒸餾來完成，其中所述經(jīng)回收的有機(jī)溶劑優(yōu)選可以再補(bǔ)料入步驟c）中以再次重新用于萃取步驟b）中產(chǎn)生的苯胺。所述有機(jī)溶劑可以選自醇類、酚類、酰胺類、醚和芳香烴，其中所述醇優(yōu)選為1-十二烷醇。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的該另一種方法可以包括將步驟c）中進(jìn)行的萃取的水相再補(bǔ)料和/或步驟d）中進(jìn)行的蒸餾的水相再補(bǔ)料入步驟a）的發(fā)酵中的另外的步驟e）。NH4+陽離子可以在步驟d）的蒸餾后以NH3形式回收并且可以再補(bǔ)料入步驟a）的發(fā)酵中。最后，本發(fā)明還提供了根據(jù)本發(fā)明的方法生產(chǎn)的苯胺的用途，其中步驟d）和/或e）中產(chǎn)生的苯胺進(jìn)一步在水和催化劑存在的情況下用甲醛轉(zhuǎn)化為亞甲基二苯胺（MDA）。以這種方式產(chǎn)生的MDA可以進(jìn)一步用光氣轉(zhuǎn)化為亞甲基二異氰酸酯（MDI）。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是可以對本發(fā)明的方法和重組宿主菌株進(jìn)行各種修改。因此，本發(fā)明旨在覆蓋此類修改和變化，只要它們在所附權(quán)利要求及其等同方案的范圍之內(nèi)。附圖和表格附圖列表圖1顯示谷氨酸棒桿菌中從葡萄糖到oAB（鄰氨基苯甲酸和/或鹽）的生物合成途徑的概覽展示，顯示了增加來自中心代謝的前體供應(yīng)的策略（PTS:磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)；PEP:磷酸烯醇丙酮酸；TCA：三羧酸；IolT2：肌醇通透酶單元T2；PorA/H：豬PorA和PorH的復(fù)合體；MFS：主要促進(jìn)系統(tǒng)(mayorfacilatingsystem)）粗箭頭展示被增強(qiáng)的生物合成步驟，而十字交叉標(biāo)記被阻斷的生物合成步驟。圖2谷氨酸棒桿菌中中心碳代謝的概覽。顯示了葡萄糖攝入的磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（PTS）、糖酵解、磷酸戊糖途徑和相關(guān)的回補(bǔ)反應(yīng)。展示TCA（三羧酸）循環(huán)和莽草酸途徑來解釋進(jìn)入這些途徑的位置和轉(zhuǎn)變（GAPDH=甘油醛-3-磷酸脫氫酶；G6PDH=葡萄糖-6-磷酸脫氫酶；6PGD=磷酸葡萄糖酸脫氫酶；PEP=磷酸烯醇丙酮酸）。圖3谷氨酸棒桿菌中從前體分子至芳香族氨基酸的莽草酸途徑的概覽。給出了中心中間體的結(jié)構(gòu)式。圖4顯示惡臭假單胞菌KT2440中芳香族氨基酸生物合成的遺傳背景。進(jìn)行的遺傳操作用灰色突出顯示。圖5顯示根據(jù)本發(fā)明的方法的總體概念，所述方法包括在發(fā)酵步驟中將原料轉(zhuǎn)化為鄰氨基苯甲酸，隨后在下游處理中化學(xué)轉(zhuǎn)化和純化為苯胺。圖6更詳細(xì)地顯示根據(jù)本發(fā)明的方法的總體概念。NaOH和NH3兩者均可用作發(fā)酵罐中的緩沖液。圖7顯示100-550℃溫度范圍內(nèi)Fe-Y上吸附的鄰氨基苯甲酸分解的質(zhì)量概況。圖8顯示鄰氨基苯甲酸從Fe-Y解吸附至1-十二烷醇。通過將包含10.8mg鄰氨基苯甲酸的0.2gFe-Y懸浮在2mL1-十二烷醇中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將漿料在25-120℃溫度范圍下攪拌0.5h。解吸附結(jié)果顯示于圖2中，其中120℃下最多27.8％鄰氨基苯甲酸可以被吸附至1-十二烷醇相中。圖9顯示鄰氨基苯甲酸從吸附劑解吸附入液相。鄰氨基苯甲酸從Fe-Y進(jìn)入水中的解吸附測試顯示水溶液中通過金屬交換的沸石的鄰氨基苯甲酸的吸附是可逆的。測試了鄰氨基苯甲酸解吸附入有機(jī)溶劑。選擇1-十二烷醇作為有機(jī)溶劑，這是由于鄰氨基苯甲酸在其中的高溶解度以及其在水中非常低的可混合性(0.004g/L)。圖10顯示鄰氨基苯甲酸在含催化劑的有機(jī)培養(yǎng)基中的分解。顯示了在160℃和180℃下存在沸石Y的情況下3wt%溶解于1-十二烷醇中的鄰氨基苯甲酸的脫羧動(dòng)力學(xué)。將鄰氨基苯甲酸（3wt%）溶解于1-十二烷醇。在該濃度下，酸甚至在室溫下也完全地可溶于有機(jī)溶劑中。隨后將80mL以上溶液轉(zhuǎn)移至160mL的高壓滅菌器中，加入1.5g沸石催化劑并加熱至160℃-180℃。對于比較，還測試了不具有催化劑（空白）和具有堿性水滑石（HTC）、H-ZSM5、摻入鈉的沸石Y(NaY)、沸石Y銨形式(NH4-Y)的空白測試。以不同時(shí)間間隔取樣并通過HPLC方法分析以測定苯胺形成的速率。圖11顯示了大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、谷氨酸棒桿菌、惡臭假單胞菌和釀酒酵母菌株的pH5下100-mL搖瓶培養(yǎng)物（具有MES緩沖液）經(jīng)33h（三次測定）后在600nm的光密度(OD600)。谷氨酸棒桿菌在pH7（補(bǔ)充有MOPS緩沖液）下另外培養(yǎng)。圖12顯示了大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、谷氨酸棒桿菌、惡臭假單胞菌和釀酒酵母菌株的pH7下100-mL搖瓶培養(yǎng)物（具有MOPS緩沖液）經(jīng)25h（兩次測定）后在600nm的光密度(OD600)。圖13顯示了大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、谷氨酸棒桿菌、惡臭假單胞菌和釀酒酵母菌株的pH7下補(bǔ)充有3g/LoAB的100-mL搖瓶培養(yǎng)物（具有MOPS緩沖液）經(jīng)25h（兩次測定）后在600nm的光密度(OD600)。圖14顯示谷氨酸棒桿菌菌株的pH7下未補(bǔ)充（黑色）或補(bǔ)充有3g/LoAB（灰色）的100-mL搖瓶培養(yǎng)物（具有MOPS緩沖液）經(jīng)25h（兩次測定）后在600nm的光密度(OD600)。圖15顯示惡臭假單胞菌菌株的pH7下未補(bǔ)充（黑色）或補(bǔ)充有3g/LoAB（灰色）的100-mL搖瓶培養(yǎng)物（具有MOPS緩沖液）經(jīng)25h（兩次測定）后在600nm的光密度(OD600)。圖16顯示了大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、谷氨酸棒桿菌、惡臭假單胞菌和釀酒酵母菌株的pH7下補(bǔ)充有3g/LpAB的100-mL搖瓶培養(yǎng)物（具有MOPS緩沖液）經(jīng)27h（兩次測定）后在600nm的光密度(OD600)。圖17顯示谷氨酸棒桿菌菌株的pH7下補(bǔ)充有0.1g/L辛醇（黑色和灰色中一式兩份）的100-mL搖瓶培養(yǎng)物（具有MOPS緩沖液）經(jīng)25h（兩次測定）后在600nm的光密度(OD600)。圖18顯示惡臭假單胞菌菌株的pH7下補(bǔ)充有0.1g/L辛醇（黑色和灰色中一式兩份）的100-mL搖瓶培養(yǎng)物（具有MOPS緩沖液）經(jīng)25h（兩次測定）后在600nm的光密度(OD600)。圖19顯示谷氨酸棒桿菌的pH7下100-mL搖瓶培養(yǎng)物（如圖中所示補(bǔ)充的；一式兩份）經(jīng)25h后在600nm的光密度(OD600)。圖20顯示谷氨酸棒桿菌的pH5下100-mL搖瓶培養(yǎng)物（如圖中所示補(bǔ)充的；一式兩份）經(jīng)25h后在600nm的光密度(OD600)。圖21顯示谷氨酸棒桿菌的pH7(MOPS)和pH5（MES）下100-mL搖瓶培養(yǎng)物（如圖中所示補(bǔ)充的；一式兩份）經(jīng)28h后在600nm的光密度(OD600)。圖22顯示3、4和5h后補(bǔ)充至0g/L補(bǔ)充劑(方形)、7g/LoAB(圓形)、7g/LpAB(十字)、40mg/L十二烷醇(三角形)的終濃度的谷氨酸棒桿菌在pH7下的發(fā)酵培養(yǎng)物經(jīng)50h后在600nm的光密度(OD600)。圖23顯示2h（補(bǔ)充oAB之前）、5h（補(bǔ)充7g/LoAB之后）、25h和49.5h之后用7g/LoAB的谷氨酸棒桿菌發(fā)酵的培養(yǎng)上清液在254nm處的HPLC層析圖。加上oAB標(biāo)準(zhǔn)品。圖24顯示3、4、5、6和7h后補(bǔ)充至0g/L補(bǔ)充劑(方形)、15g/LoAB(三角形)、35g/LoAB(十字)和80g/LoAB(圓形)的終濃度的谷氨酸棒桿菌在pH7下的發(fā)酵培養(yǎng)物經(jīng)58h后在600nm的光密度(OD600)。圖25顯示3、4、5、6和7h后補(bǔ)充至35g/LoAB的終濃度的谷氨酸棒桿菌在pH7下的發(fā)酵培養(yǎng)物經(jīng)58h后在600nm的光密度(OD600)。圖26顯示3、4、5、6和7h后補(bǔ)充至80g/LoAB的終濃度的谷氨酸棒桿菌在pH7下的發(fā)酵培養(yǎng)物經(jīng)58h后在600nm的光密度(OD600)。圖27顯示基于載體系統(tǒng)pEMG的敲除程序圖示。圖28顯示惡臭假單胞菌KT2440trpEGDC簇的遺傳圖(上面)和惡臭假單胞菌KT2440trpDC缺失的遺傳圖(下面)(gph:磷酸乙醇酸磷酸酶(部分的);trpE:鄰氨基苯甲酸合成酶組分I;GDSL:GDSL家族脂肪酶(與l-色氨酸生物合成無關(guān));hyp:假定蛋白;trpG:鄰氨基苯甲酸合成酶組分II;crg:cAMP-調(diào)控蛋白(分布的);TS1:缺失側(cè)翼1;TS2:缺失側(cè)翼2)。圖29顯示惡臭假單胞菌KT2440serCpheAtyrA簇的遺傳圖(上面)和惡臭假單胞菌KT2440pheA缺失的遺傳圖(下面)(gyrA:DNA旋轉(zhuǎn)酶亞基A(部分的);serC:磷酸絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶;pheA:分支酸變位酶/預(yù)苯酸脫水酶;tyrA:預(yù)苯酸脫氫酶/3-磷酸莽草酸1-羧基乙烯基轉(zhuǎn)移酶;cmk:胞苷酸激酶;TS1:缺失側(cè)翼1;TS2:缺失側(cè)翼2)。圖30顯示在1L實(shí)驗(yàn)室規(guī)模生物反應(yīng)器中具有細(xì)胞保留的連續(xù)發(fā)酵的切向流超濾模塊（750kDa的截止值）的集成。圖31顯示在1L實(shí)驗(yàn)室規(guī)模生物反應(yīng)器中具有細(xì)胞保留的連續(xù)發(fā)酵的離心機(jī)(CentritechLabIII)的集成。圖32顯示使用1L培養(yǎng)體積、稀釋速率0.05L/h、培養(yǎng)溫度30℃以1MNH4OH控制的pH7、通氣的空氣流速0.2L/min、通過調(diào)節(jié)攪拌器速度200-1200rpm將pO2控制在30％空氣飽和，在分批和連續(xù)模式過程中谷氨酸棒桿菌?trpD發(fā)酵生產(chǎn)oAB。細(xì)胞保留通過切向流超濾實(shí)現(xiàn)。圖33顯示使用1L培養(yǎng)體積、稀釋速率0.01L/h、培養(yǎng)溫度30℃以1MNH4OH控制的pH7、通氣的空氣流速0.2L/min、通過調(diào)節(jié)攪拌器速度200-1400rpm以將pO2控制在30％空氣飽和，在分批和連續(xù)模式過程中谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5?gpi發(fā)酵生產(chǎn)oAB。細(xì)胞保留通過離心實(shí)現(xiàn)。圖34顯示使用1L培養(yǎng)體積、如圖中所示0.025L/h或0.05L/h的稀釋速率、培養(yǎng)溫度30℃、以1MNH4OH控制的pH7、通氣的空氣流速0.2L/min、通過調(diào)節(jié)攪拌器速度200-1200rpm將pO2控制在30％空氣飽和，谷氨酸棒桿菌?trpD發(fā)酵連續(xù)生產(chǎn)oAB。細(xì)胞保留通過切向流超濾實(shí)現(xiàn)。圖35顯示用催化劑2-氨基苯甲酸（鄰氨基苯甲酸，AA）在苯胺中的分解。顯示了在160℃、180℃和200℃下存在沸石Y的情況下40wt%溶解于苯胺中的鄰氨基苯甲酸（AA）的脫羧動(dòng)力學(xué)。圖36顯示用催化劑2-氨基苯甲酸（鄰氨基苯甲酸，AA）在苯胺中的分解。顯示了在200℃下存在沸石Y的情況下40wt%溶解于苯胺和10%水-90%苯胺中的鄰氨基苯甲酸（AA）的脫羧動(dòng)力學(xué)。圖37顯示用催化劑2-氨基苯甲酸（鄰氨基苯甲酸，AA）在苯胺中的分解。顯示了在180℃下存在沸石Y的情況下40wt%溶解于苯胺中的鄰氨基苯甲酸（AA）的脫羧動(dòng)力學(xué)。圖38顯示用催化劑2-氨基苯甲酸（鄰氨基苯甲酸，AA）在苯胺中的分解。顯示了在180℃下存在沸石Y的情況下40wt%溶解于苯胺中的鄰氨基苯甲酸（AA）的脫羧動(dòng)力學(xué)。圖39顯示新鮮制備的H-Y催化劑和如上使用從水解玉米淀粉中分離的AA的反應(yīng)后的H-Y催化劑的IR譜。標(biāo)記苯胺的典型帶。發(fā)生這種高度堿性種類的吸附。將OH區(qū)也突出顯示。OH信號減少與可以在存在痕量元素情況下發(fā)生的一些部分離子交換相容，但OH基團(tuán)似乎在催化中無活性，但可能是Al-O-Si橋鍵的作用。表格列表表1顯示本研究中使用和/或生成的載體和質(zhì)粒。表2顯示本研究中使用和/或生成的細(xì)菌菌株。表3顯示本研究中使用的引物。表4顯示針對本研究中使用和/或生成的細(xì)菌菌株的oAB生產(chǎn)的特征（CDW：細(xì)胞干重；Y：產(chǎn)率；μmax:最大生長速率；STY：時(shí)空產(chǎn)率）。表5顯示產(chǎn)生針對TrpEG活性的TrpEG不同變體的谷氨酸棒桿菌?trpD粗提取物的生物化學(xué)特征。表6顯示如實(shí)施例6中所述，AA0.5％在水中被HAP、沸石Y(GO257和GO55)和ZSM5(ZSM5-27和ZSM5-55)的吸附。表7顯示如實(shí)施例6中所述，10和60分鐘后在蒸餾水和緩沖的水溶液中以gAA/kg吸附劑計(jì)的金屬交換的沸石GO257的AA吸附能力。實(shí)施例實(shí)施例1-用大腸桿菌產(chǎn)生氨基苯甲酸大腸桿菌W3110trpD9923(大腸桿菌::trpD9923;表2)購自YaleUniversity的大腸桿菌GeneticResourceCenter。菌株已通過隨機(jī)誘變產(chǎn)生并包含稱為trpD9923的突變的trpD基因。酶的失活通過在相關(guān)基因中隨機(jī)點(diǎn)突變(GT)導(dǎo)致轉(zhuǎn)移酶活性編碼區(qū)中無義突變來實(shí)現(xiàn)。結(jié)果是，僅原始轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域中的七個(gè)氨基酸被翻譯(IkedaM,ApplMicrobiolBiotechnol,2006,69:615)。trpD9923基因的相關(guān)截短的酶失去其催化鄰氨基苯甲酸磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶的反應(yīng)的能力，但保留其鄰氨基苯甲酸合成酶的活性。因此菌株可以合成鄰氨基苯甲酸，但無法將其進(jìn)一步代謝為l-色氨酸并因此為l-色氨酸營養(yǎng)缺陷型。這導(dǎo)致鄰氨基苯甲酸的積累。將菌株在具有10mL培養(yǎng)體積的50mL搖瓶中在28℃下以140rpm生長。所用的培養(yǎng)基為含有20mg/Ll-色氨酸的礦物培養(yǎng)基M9(1g/L(NH4)2Cl、0.5g/LNaCl、0.05g/L硫銨、1g/LKH2PO4、1g/LK2HPO4、0.247g/LMgSO4?7H2O(Merck,Darmstadt)、0.015g/LCaCl2、和10g/L葡萄糖。用5mol/L氫氧化鈉溶液將pH調(diào)節(jié)至7。）。菌株在25.5h后產(chǎn)生如通過HPLC-DAD(254nm)測量的60mg/L鄰氨基苯甲酸（表4和實(shí)施例3）。將菌株通過使用敲除缺失將磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（PTS）失活來進(jìn)一步優(yōu)化。因此，產(chǎn)生了得到的PTS缺乏菌株大腸桿菌::trpD9923?hpr(表2)并且適于使用25mL搖瓶發(fā)酵以10mL培養(yǎng)體積在37℃下以150rpm在葡萄糖上生長并測試鄰氨基苯甲酸產(chǎn)量。對于pts陽性菌株使用相同的培養(yǎng)基。其在25h后產(chǎn)生如通過HPLC-DAD(254nm)測量的69mg/L鄰氨基苯甲酸（表4和實(shí)施例3）。實(shí)施例2-開發(fā)產(chǎn)生鄰氨基苯甲酸和/或鹽的微生物菌株的菌株選擇研究了工業(yè)生物技術(shù)中通常使用的若干菌株關(guān)于其對oAB和對所討論的后期產(chǎn)物提取的有機(jī)溶劑（例如1-十二烷醇或辛醇）的天然耐受性。此外，研究了所用的pH值的影響。從之前實(shí)驗(yàn)中已知至少對于大腸桿菌而言，芳香化合物的毒性主要取決于pH值，可能是由于質(zhì)子化的酸可以有效得多地滲透細(xì)胞膜并因此其毒性嚴(yán)重提高。假定oAB在有機(jī)相中的提取在低pH值（接近oAB的等電點(diǎn)）工作最佳。所考慮的最相關(guān)的宿主菌株為：大腸桿菌K12、谷氨酸棒桿菌DSM20300（=ATCC13032）、惡臭假單胞菌KT2440、枯草芽孢桿菌亞種168、釀酒酵母DSM70449和巴斯德畢赤酵母X33(DSM70382)。為了針對所述特性研究所選菌株，進(jìn)行搖瓶和小規(guī)模發(fā)酵實(shí)驗(yàn)并且以不同濃度、不同pH值向生物體添加有毒物質(zhì)（氨基苯甲酸，溶劑），并且研究菌株行為。將生物體（商業(yè)獲得自訂購自DSMZ，德國微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物中心，Braunschweig）首先在搖瓶且其每一種在合適的公開的標(biāo)準(zhǔn)基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下表征其生長(谷氨酸棒桿菌：預(yù)培養(yǎng):BHI培養(yǎng)基(37g/L;腦心浸出物;BectonDickensonandCompany,Heidelberg);主要培養(yǎng)pH7:CGXII-MOPS培養(yǎng)基(42g/LMOPS緩沖液、20g/L(NH4)2SO4、5g/L尿素(FisherScientific、Schwerte)、1g/LKH2PO4、1g/LK2HPO4、0.25g/LMgSO4?7H2O(Merck,Darmstadt)、0.01g/LCaCl2、和10g/L葡萄糖(分開高壓滅菌)。用5mol/L氫氧化鈉溶液將pH調(diào)節(jié)至7。無菌過濾后加入以下組分：2mg/L生物素、0.01g/LMnSO4·H2O(Merck,Darmstadt)、0.01g/LFeSO4·7H2O(Merck、Darmstadt)、1mg/LZnSO4?7H2O、0.2mg/LCuSO4·5H2O(Merck,Darmstadt)、0.02mg/LNiCl2?6H2O(Merck,Darmstadt)、和0.03g/L3.4-二羥基苯甲酸(AcrosOrganics,Nidderau);主要培養(yǎng)pH5:CGXII-MES培養(yǎng)基(39g/LMES緩沖液、20g/L(NH4)2SO4、5g/L尿素(FisherScientific,Schwerte)、1g/LKH2PO4、1g/LK2HPO4、0.25g/LMgSO4?7H2O(Merck,Darmstadt)、0.01g/LCaCl2、和10g/L葡萄糖(分開高壓滅菌)。用5mol/L氫氧化鈉溶液將pH調(diào)節(jié)至5。無菌過濾后加入以下組分：2mg/L生物素、0.01g/LMnSO4·H2O(Merck、Darmstadt)、0.01g/LFeSO4·7H2O(Merck,Darmstadt)、1mg/LZnSO4?7H2O、0.2mg/LCuSO4·5H2O(Merck,Darmstadt)、0.02mg/LNiCl2?6H2O(Merck,Darmstadt)、和0.03g/L3.4-二羥基苯甲酸(AcrosOrganics,Nidderau);大腸桿菌:預(yù)培養(yǎng)：LB培養(yǎng)基(Luria-Bertani;Roth,Karlsruhe);主要培養(yǎng)pH7:M9培養(yǎng)基(1g/L(NH4)2Cl、0.5g/LNaCl、0.05g/L氯化硫胺、1g/LKH2PO4、1g/LK2HPO4、0.247g/LMgSO4?7H2O(Merck,Darmstadt)、0.015g/LCaCl2、和10g/L葡萄糖。用5mol/L氫氧化鈉溶液將pH調(diào)節(jié)至7。）；主要培養(yǎng)pH5：M9-MES培養(yǎng)基(19.5g/LMES緩沖液，1g/L(NH4)2Cl、0.5g/LNaCl、0.05g/L氯化硫胺、1g/LKH2PO4、1g/LK2HPO4、0.247g/LMgSO4?7H2O(Merck,Darmstadt)、0.015g/LCaCl2、和10g/L葡萄糖。用5mol/L氫氧化鈉溶液將pH調(diào)節(jié)至7。）；枯草芽孢桿菌：預(yù)培養(yǎng)：LB培養(yǎng)基；主要培養(yǎng)pH7:M9-SL培養(yǎng)基(1g/L(NH4)2Cl、0.5g/LNaCl、0.05g/L硫銨、1g/LKH2PO4、1g/LK2HPO4、0.247g/LMgSO4?7H2O、0.015g/LCaCl2、1.0mg/LMnCl·H2O、1.35mg/LFeCl·6H2O、1.7mg/LZnSO4?7H2O、0.04mg/LCuCl·2H2O、0.06mg/LCoCl2?6H2O、0.06mg/LNa2MoO4?2H2O、和10g/L葡萄糖。用5mol/L氫氧化鈉溶液將pH調(diào)節(jié)至7。）；主要培養(yǎng)pH5：M9-SL-MES培養(yǎng)基(19.5g/LMES緩沖液，1g/L(NH4)2Cl、0.5g/LNaCl、0.05g/L硫銨、1g/LKH2PO4、1g/LK2HPO4、0.247g/LMgSO4?7H2O、0.015g/LCaCl2、1.0mg/LMnCl·H2O、1.35mg/LFeCl·6H2O、1.7mg/LZnSO4?7H2O、0.04mg/LCuCl·2H2O、0.06mg/LCoCl2?6H2O、0.06mg/LNa2MoO4?2H2O、和10g/L葡萄糖。用5mol/L氫氧化鈉溶液將pH調(diào)節(jié)至5。）；惡臭假單胞菌：預(yù)培養(yǎng)：LB培養(yǎng)基；主要培養(yǎng)pH7:Brunner培養(yǎng)基(0.5g/L(NH4)2SO4、1g/LKH2PO4、1g/LK2HPO4、0.2g/LMgSO4?7H2O、0.05g/LCaCl2、5.0mg/LEDTA、2.0mg/LFeSO4·7H2O、0.03mg/LMnCl·H2O、0.1mg/LZnSO4?7H2O、0.01mg/LCuCl·2H2O、0.2mg/LCoCl2?6H2O、0.03mg/LNa2MoO4?2H2O、0.3mg/LH3BO3、0.02mg/LNiCl2?6H2O、和10g/L葡萄糖。用5mol/L氫氧化鈉溶液將pH調(diào)節(jié)至7。）；主要培養(yǎng)pH5：Brunner-MES培養(yǎng)基(19.5g/LMES緩沖液，0.5g/L(NH4)2SO4、1g/LKH2PO4、1g/LK2HPO4、0.2g/LMgSO4?7H2O、0.05g/LCaCl2、5.0mg/LEDTA、2.0mg/LFeSO4·7H2O、0.03mg/LMnCl·H2O、0.1mg/LZnSO4?7H2O、0.01mg/LCuCl·2H2O、0.2mg/LCoCl2?6H2O、0.03mg/LNa2MoO4?2H2O、0.3mg/LH3BO3、0.02mg/LNiCl2?6H2O、和10g/L葡萄糖。用5mol/L氫氧化鈉溶液將pH調(diào)節(jié)至5。）；釀酒酵母：預(yù)培養(yǎng)：YPD培養(yǎng)基(10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨、20g/L葡萄糖);主要培養(yǎng)pH5:SCM培養(yǎng)基(5g/L(NH4)2SO4、3g/LKH2PO4、2.5g/LMgSO4?7H2O、0.5g/LNaCl、20mg/L肌醇、5mg/L硫銨、1.32mg/L核黃素、17.8mg/L泛酸鈣、18.4mg/L鹽酸、5.16mg/L吡哆醇-HCl、0.18mg/L生物素、0.12mg/L葉酸、40.6mg/LFeCl3·6H2O、6.0mg/LZnCl2·4H2O、3.0mg/LCaCl2?2H2O、5.76mg/LCuSO4·5H2O、6.0mg/LCoCl2?6H2O、6.0mg/LNa2MoO4?2H2O、1.56mg/LH3BO3、和5g/L葡萄糖。用5mol/L氫氧化鈉溶液將pH調(diào)節(jié)至5。）(SambrockJ;Fritsch,EF,andManiatis,T:MolecularCloning-alaboratorymanual.ColdSpringLarborLaboratoryPress;1989;NewYork;HarwoodCR,CuttingSM:MolecularbiologicalmethodsforBacillus.Chichester,England:JohnWiley&SonsLtd;1990;Keilhauer,C,Eggeling,L,Sahm,H:JBacteriol,1993,175(17):5595)。這些實(shí)驗(yàn)用pH7和pH5的培養(yǎng)基進(jìn)行以評價(jià)氨基苯甲酸在低pH值下的毒性中的差異。酵母菌株僅在低于7（5.5和3.5）的pH值下研究。通過添加不同的緩沖系統(tǒng)（MOPS、MES）穩(wěn)定不同的pH值。將菌株的100-mL搖瓶培養(yǎng)物（pH5（與MES緩沖液）溫育33h并且通過隨時(shí)間測量在600nm的光密度(OD600)來跟蹤生長（三次測定）。谷氨酸棒桿菌另外在pH7下（與MOPS緩沖液）培養(yǎng)。圖11顯示結(jié)果。收集的數(shù)據(jù)顯示在所有研究的生物體中谷氨酸棒桿菌在pH5表現(xiàn)出最佳生長。大腸桿菌、惡臭假單胞菌和釀酒酵母的確在pH5下生長非常差。盡管如此，在一些培養(yǎng)物中，由于代謝活性，pH額外下降低于4。為了排除由于代謝活性的生長影響，實(shí)驗(yàn)在具有自動(dòng)pH調(diào)節(jié)的發(fā)酵罐中進(jìn)行。如預(yù)期地，已經(jīng)可見的是在低pH下的培養(yǎng)降低了所有測試的生物體的生長速率。然而，為了比較所有考慮的生物體在pH7下標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下的生長，用添加有MOPS緩沖液的所有基本培養(yǎng)基進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)。另外，類似的培養(yǎng)物添加有oAB（終濃度3g/L，分三次在指數(shù)生長期開始時(shí)添加（2、3、4h溫育時(shí)間后））。將菌株的100-mL搖瓶培養(yǎng)物（pH7（添加或不添加3g/LoAB）溫育25h并且通過隨時(shí)間測量在600nm的光密度(OD600)來跟蹤生長（兩次測定）（圖12和圖13）。谷氨酸棒桿菌在所選的培養(yǎng)條件下達(dá)到最高的值，并且此外其生長不受添加3g/LoAB的抑制，而其他生物體例如枯草芽孢桿菌的生長在3g/LoAB下已經(jīng)強(qiáng)烈降低。從這些結(jié)果中，將谷氨酸棒桿菌鑒定為在pH7下oAB生產(chǎn)的優(yōu)選候選者（圖14和圖15）。為了研究所考慮的菌株針對對氨基苯甲酸（pAB）和溶劑（辛醇和1-十二烷醇）的耐受性，將菌株如之前所述在pH7下培養(yǎng)（釀酒酵母于pH5.5）并添加有3g/LpAB（圖16）。谷氨酸棒桿菌、大腸桿菌、惡臭假單胞菌和巴斯德畢赤酵母的生長在這些條件下不受pAB的抑制，而釀酒酵母和枯草芽孢桿菌的生長嚴(yán)重降低。研究了提取溶劑辛醇的毒性。辛醇在水中的溶解度約為0.1g/L，因此將培養(yǎng)物添加有這樣的辛醇量和額外添加3g/L。顯示在0.1g/L辛醇下所有生物體已經(jīng)無法生長，但在3g/L辛醇下更為明顯。僅惡臭假單胞菌在添加辛醇后顯示出最小的生長活性（圖17和圖18）。如在所有進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中，谷氨酸棒桿菌顯示最高的細(xì)胞密度和最佳的耐受性能力，該菌株用5g/LoAB和5g/LpAB分別在pH5和pH7下類似地培養(yǎng)。在這些條件下沒有檢測到生長抑制（圖19和圖20）。在pH5下，細(xì)胞密度減半，導(dǎo)致結(jié)論為：發(fā)酵應(yīng)該更優(yōu)選在pH7下進(jìn)行。研究十二烷醇作為替代的提取溶劑。十二烷醇在水中具有約40mg/L的溶解度。谷氨酸棒桿菌如上所述在pH5和7下在補(bǔ)充有40mg/L1-十二烷醇的情況下進(jìn)行培養(yǎng)。十二烷醇沒有影響所述菌株在這些條件下的生長（參見圖19和圖20）。在小規(guī)模發(fā)酵罐中重復(fù)在搖瓶實(shí)驗(yàn)中用谷氨酸棒桿菌獲得的結(jié)果（圖21）。為了進(jìn)一步表征谷氨酸棒桿菌針對氨基苯甲酸和1-十二烷醇應(yīng)激的耐受性，在pH7下使用具有受調(diào)節(jié)的pH、攪拌、氧供應(yīng)、溫度的1L-4倍發(fā)酵單元(HiTecZang)和在葡萄糖補(bǔ)料下進(jìn)行生物體的小規(guī)模發(fā)酵。葡萄糖補(bǔ)料允許菌株生長至更高的細(xì)胞密度。用谷氨酸棒桿菌在基本培養(yǎng)基pH7（如上所述但不添加MOPS、生物素、兒茶酸和尿素）中進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，且一個(gè)發(fā)酵罐不補(bǔ)充任何物質(zhì)（陽性對照），一個(gè)發(fā)酵罐補(bǔ)充有7g/LoAB，一個(gè)發(fā)酵罐補(bǔ)充有7g/LpAB且一個(gè)發(fā)酵罐補(bǔ)充有40mg/L1-十二烷醇。所得到的生長曲線顯示谷氨酸棒桿菌的生長不受所添加的1-十二烷醇的影響。這證實(shí)了在搖瓶中獲得的結(jié)果（參見圖22）。分別補(bǔ)充oAB和pAB導(dǎo)致延長的滯后期但最終達(dá)到相同的細(xì)胞密度（參見圖22）。結(jié)論是：1-十二烷醇是合適的oAB提取溶劑。進(jìn)一步增加氨基苯甲酸的濃度以尋找其顯著抑制谷氨酸棒桿菌生長的邊界。需要排除氨基苯甲酸被生物體降解并因此在延長的滯后期之后恢復(fù)生長。為了研究在發(fā)酵罐中氨基苯甲酸的穩(wěn)定性，在發(fā)酵過程中收集培養(yǎng)物上清液樣品并通過HPLC-DAD（254nm）分析（參見圖23和實(shí)施例3）。在培養(yǎng)過程中氨基苯甲酸沒有顯著降解。在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中，增加oAB的濃度以研究對谷氨酸棒桿菌的作用。四個(gè)發(fā)酵罐至此補(bǔ)充有0g/L、15g/L、35g/L和80g/L的oAB。為了實(shí)現(xiàn)酸在pH7以這樣的高濃度的溶解度，將酸用氫氧化銨滴定以形成oAB在儲(chǔ)存溶液中相應(yīng)的銨鹽，其隨后在5h內(nèi)分五次添加至發(fā)酵罐（在培養(yǎng)3、4、5、6和7h之后）。其余的培養(yǎng)條件保持如上所述。添加80g/LoAB導(dǎo)致細(xì)胞在54小時(shí)內(nèi)死亡（裂解）并且35g/LoAB導(dǎo)致生長抑制（參見圖24、圖25和圖26）。添加有15g/LoAB的培養(yǎng)物已顯示34-48h的延長的滯后期，之后恢復(fù)生長并且細(xì)胞進(jìn)入指數(shù)期（參見圖24）。發(fā)酵過程中oAB降解再次通過HPLC測量培養(yǎng)物上清液來排除（數(shù)據(jù)未顯示）?？傊?，結(jié)論是：oAB的產(chǎn)生應(yīng)該最優(yōu)選用谷氨酸棒桿菌ATCC13032菌株來完成。此外，結(jié)論是：發(fā)酵過程應(yīng)優(yōu)選在pH5-7下進(jìn)行，且更優(yōu)選在pH7下進(jìn)行并且提?。ㄈ缧枰?yīng)優(yōu)選用1-十二烷基作為提取溶劑來進(jìn)行。辛醇不是合適的提取溶劑。實(shí)施例3-用谷氨酸棒桿菌產(chǎn)生鄰氨基苯甲酸和/或鹽開發(fā)了以g/L規(guī)模計(jì)產(chǎn)生鄰氨基苯甲酸的細(xì)菌菌株。該工作基于色氨酸生產(chǎn)者（例如在大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌中）的遺傳操作，并且包括開發(fā)和實(shí)現(xiàn)這樣的策略以遺傳操作中心代謝、共同芳香族生物合成和l-色氨酸分支途徑以獲得鄰氨基苯甲酸和/或鹽（oAB）生產(chǎn)者。基于上述結(jié)果，代謝工程優(yōu)選基于谷氨酸棒桿菌ATCC13032?；诖竽c桿菌DH5α菌株的一般培養(yǎng)如果未另行指明，所有化學(xué)品均獲自Sigma-Aldrich(Sternheim)并且所有酶均來自NewEnglandBiolabs(Schwalbach)。大腸桿菌在無菌條件下在LB培養(yǎng)基(Luria-Bertani;Roth,Karlsruhe)或在LB-瓊脂(AbcrGmbH&Co.Kg,Karlsruhe)板在37℃下進(jìn)行培養(yǎng)。通過添加抗生素(100mg/L氨芐青霉素鈉鹽;50/25mg/L硫酸卡那霉素;100mg/L硫酸壯觀霉素)來實(shí)現(xiàn)選擇性培養(yǎng)。對于質(zhì)粒制備，菌株已在15mL管中在3mLLB培養(yǎng)基和選擇性抗生素中在37℃下以200rpm恒定搖動(dòng)培養(yǎng)14h-16h(KuhnerShakerISF-4-W;AdolfKühnerAG,Basel(Switzerland))。一般分子生物學(xué)方法PCR反應(yīng)通常使用Platinum?TaqDNAPolymerase(5U/μL;Lifetechnologies,Darmstadt)用約50ngPCR模板和10pmol相應(yīng)的引物對（參見表3）來進(jìn)行。PCR條件：98℃5min,98℃30sec,56℃30sec,72℃1min/kb,30x,16℃保持(Mastercycler?nexus–Cycler;Eppendorf,Hamburg)。使用NucleoSpin?PlasmidPure試劑盒(Macherey&Nagel,Düren)按照制造商說明書進(jìn)行質(zhì)粒DNA純化。質(zhì)粒DNA消化以20μL規(guī)模用5U相關(guān)的限制酶和約1μg質(zhì)粒DNA在由酶供應(yīng)商推薦的緩沖液中完成并在37℃下溫育約2h，隨后通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。瓊脂糖凝膠用溶解于1xTAE電泳緩沖液(Promega,FitchburgUSA)中的1%瓊脂糖(AbcrGmbH&Co.Kg,Karlsruhe)制備。提供的電場為90V-120V(EPS300;PharmaciaBiotech;VWRInternationalGmbH,Darmstadt)并且DNA經(jīng)溴化乙錠(0.3-0.5mg/L)或MidoriGreen(MidoriGreenAdvanceDNAStrain;NIPPONGeneticsEUROPEGmbH,Düren)來檢測。凝膠文件：GeneGenius?;VWR;Darmstadt。對于瓊脂糖凝膠DNA提取，如制造商所說明使用NucleoSpin?GelandPCRClean-up(Macherey&Nagel,Düren)試劑盒。對于DNA連接，在由制造商提供的緩沖液中使用T4-DNA連接酶（20U）。所用的插入片段與質(zhì)粒的重量比為4:1。將混合物在16℃下溫育約15h，隨后在65℃下溫育10min。將質(zhì)粒和連接反應(yīng)物引入電感受態(tài)大腸桿菌DH5α細(xì)胞(ElectroMAX?DH5α-E?CompetentCells;LfeTechnologies,Darmstadt)。使用GenePulserXcellSystem(BioRad,Hercules,CA)在0.2cm縫隙的電擊杯(BioRad,Hercules,CA)中電轉(zhuǎn)化(條件:~20ms指數(shù)式衰變脈沖,2.5kV/cm,25F,200Ω)后，將800μLLB回收培養(yǎng)基立即加入并且將懸浮液轉(zhuǎn)移至1.5mL微量離心管中。在37℃下1h后，將細(xì)胞懸浮液鋪至添加有合適抗生素的LB瓊脂板上，并在37℃下溫育過夜。收集克隆并經(jīng)限制性分析、菌落PCR和/或測序驗(yàn)證正確的轉(zhuǎn)化。對于菌落的菌落PCR分析，用無菌牙簽挑取菌落，轉(zhuǎn)移至單獨(dú)的平板（主平板），溶解于1μLDMSO并在98℃下煮10min，隨后添加至標(biāo)準(zhǔn)PCR混合物中。通過PCR和/或DNA測序驗(yàn)證所有專利的正確克隆和相關(guān)突變體的產(chǎn)生。基于谷氨酸棒桿菌ATCC13032菌株的一般培養(yǎng)將谷氨酸棒桿菌在無菌條件下在BHI培養(yǎng)基(37g/L;腦心浸出物;BectonDickensonandCompany,Heidelberg)管、搖瓶或在瓊脂板上在30℃下培養(yǎng)。通過添加抗生素(15mg/L硫酸卡那霉素；100mg/L硫酸壯觀霉素)實(shí)現(xiàn)選擇性培養(yǎng)。對于菌株表征，第一預(yù)培養(yǎng)物從分離的菌落開始并且在4mLBHI培養(yǎng)基中用恒定搖動(dòng)以400rpm培養(yǎng)10h，并且取決于菌株，補(bǔ)充有合適的抗生素或芳香族氨基酸。第二預(yù)培養(yǎng)物在50mLCGXII-MES培養(yǎng)基中生長(42g/LMOPS緩沖液、20g/L(NH4)2SO4、5g/L尿素(FisherScientific,Schwerte)、3.7g/L腦心浸出物、1g/LKH2PO4、1g/LK2HPO4、0.25g/LMgSO4?7H2O(Merck,Darmstadt)、0.01g/LCaCl2、和10g/L葡萄糖(分開高壓滅菌)。用5mol/L氫氧化鈉溶液將pH調(diào)節(jié)至7。無菌過濾后在用1mL第一預(yù)培養(yǎng)物接種后在250mL搖瓶中加入以下組分：2mg/L生物素、0.01g/LMnSO4·H2O(Merck、Darmstadt)、0.01g/LFeSO4·7H2O(Merck、Darmstadt)、1mg/LZnSO4?7H2O、0.2mg/LCuSO4·1H2O(Merck,Darmstadt)、0.02mg/LNiCl2?6H2O(Merck,Darmstadt)、和0.03g/L3.4-二羥基苯甲酸(AcrosOrganics,Nidderau))，并以400rpm恒定搖動(dòng)培養(yǎng)16h-18h。發(fā)酵培養(yǎng)物在100mLCGXII培養(yǎng)基(20g/L(NH4)2SO4、5g/L尿素、1g/LKH2PO4、1g/LK2HPO4、0.25g/LMgSO4?7H2O、0.01g/LCaCl2、100μL/L聚丙二醇(分開高壓滅菌)和18g/L葡萄糖(分開高壓滅菌)中生長。用5mol/L氫氧化鈉溶液將pH調(diào)節(jié)至7。無菌過濾后加入以下組分：2mg/L生物素、0.01g/LMnSO4·H2O、0.01g/LFeSO4·7H2O、1mg/LZnSO4?7H2O、0.2mg/LCuSO4·5H2O、0.02mg/LNiCl2?6H2O、和0.03g/L3.4-二羥基苯甲酸)。將每一生物反應(yīng)器(DasBox,Eppendorf,Hamburg)用第二預(yù)培養(yǎng)物接種至0.5的終OD600。將初始攪拌速度設(shè)定為100rpm并且以2.2L/h(0.37V/(V*min)供應(yīng)空氣。持續(xù)監(jiān)測溶解氧(OxyFermFDA120;Hamilton,Bonaduz(Switzerland))并且通過自動(dòng)調(diào)節(jié)攪拌速度來維持30%空氣飽和。測量pH(EasyFermPlusK8120;Hamilton,Bonaduz(Switzerland))并且通過自動(dòng)添加1MNaOH來維持在7，且溫度保持在30℃。為了防止泡沫產(chǎn)生，通過測量發(fā)酵液上的電導(dǎo)率的電導(dǎo)率傳感器來自動(dòng)添加10%聚丙二醇的添加。將發(fā)酵作為重復(fù)的分批過程來進(jìn)行。進(jìn)行用18g/L葡萄糖（分開高壓滅菌）的額外補(bǔ)料三次。在發(fā)酵過程中，從1.5mL發(fā)酵罐樣品中離線測量發(fā)酵細(xì)胞干重（BDW）、葡萄糖濃度和鄰氨基苯甲酸濃度。將1mL等分試樣的每一樣品在稱重的反應(yīng)管中以16000xg(5415R;Eppendorf,Hamburg)離心5min。為了測定細(xì)胞干重，將沉淀在60℃下(雜交爐;AppligeneOncorLifescreen,Watford(UK))干燥至少72h。隨后使用分析天平(La230S;SatoriusAG,G?ttingen)來測定準(zhǔn)確的沉淀重量。經(jīng)HPLC-DAD(1100;AgilentTechnologies,SantaClara(USA))和YSI(YSI-Select2700;KreienbaumNeoscienceGmBH,Langenfeld)分析上清液。收集的數(shù)據(jù)顯示于圖4中。谷氨酸棒桿菌ATCC13032菌株的一般操作通過電穿孔將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)移入谷氨酸棒桿菌ATCC13032中。對于轉(zhuǎn)化，將細(xì)胞通過離心(4000g,10min,4℃(5810R;Eppendorf,Hamburg))從生長在BHI培養(yǎng)基且在指數(shù)生長期(OD600=1.75-2.0)的200mL培養(yǎng)物中收獲并且用20mL冰冷的TG緩沖液(1mMTris-HCl,10%甘油,pH7.0)洗滌三次。將沉淀重懸于2mL10%的甘油溶液并且直接用于轉(zhuǎn)化或者在-80℃下儲(chǔ)存直至使用。對于轉(zhuǎn)化，將質(zhì)粒DNA(約1μg)首先吸取到冰冷的0.2cm縫隙的電擊杯隨后為150μL細(xì)胞懸浮液。冰上溫育5min后，進(jìn)行電穿孔（條件：~20ms指數(shù)式衰變脈沖,2.5kV/cm,25F,200Ω)。將懸浮液轉(zhuǎn)移至具有500μL預(yù)熱(46℃)的BHI培養(yǎng)基并且在30℃下以400rpm恒定搖動(dòng)溫育1h。將細(xì)胞鋪在含有相應(yīng)抗生素的BHI培養(yǎng)基瓊脂板上。對于指定靶基因的表達(dá)，采用大腸桿菌-谷氨酸棒桿菌穿梭載體pEKEx2(EikmannsBJ,KleinertzE,LieblW,SahmH,Gene,1991,102:93)。8.16kb載體來源于載體pU18并且編碼卡那霉素抗性盒、用于在谷氨酸棒桿菌中增殖的起點(diǎn)V（oriV）的pBL1點(diǎn)、用于在大腸桿菌中增殖的pU18oriV、強(qiáng)tac-啟動(dòng)子(異丙基β-d-1-硫代半乳糖苷(IPTG)-誘導(dǎo)的)和lacIQ基因?？蛇x地，采用大腸桿菌-谷氨酸棒桿菌穿梭載體pCRB210(YukawaH,InuiM,US20130302860(A1),2013)，其適合于用pEKEx2共轉(zhuǎn)化。4.96kb載體編碼壯觀霉素抗性盒、用于在谷氨酸棒桿菌中復(fù)制的起點(diǎn)V（oriv）的pCASE1點(diǎn)、用于在大腸桿菌中復(fù)制的oriV和用于組成型基因表達(dá)的gapA啟動(dòng)子。選擇用于在谷氨酸棒桿菌或其突變體中過表達(dá)的基因片段通過MWGOperonGmbH合成，通過單核苷酸交換（沉默突變）去除了所有天然存在的SbfI、BamHI、BglII、NcoI和NdeI限制性位點(diǎn)并且在相應(yīng)的ORF上游插入核糖體結(jié)合位點(diǎn)（與aroG、aroK、glnA和aroL的基因序列分開，其通過PCR從其天然位點(diǎn)上擴(kuò)增，參見引物（表3））。在trpEG和aroG基因的情況下，將單核苷酸交換包括到基因中以獲得相關(guān)酶的反饋抗性形式。將所得的序列經(jīng)SbfI和BamHI限制性切割和再連接而克隆入pEKEx2載體的多克隆位點(diǎn)。與glnA基因序列分開，將其經(jīng)限制性切割和再連接而克隆入pCRB210載體，產(chǎn)生pCRB-glnA（表1）。合成的基因片段基本上具有結(jié)構(gòu)：“SbfI-BglII-RBS-基因-BamHI”。這允許靶基因(作為BglII-BamHI-片段)經(jīng)單一BamHI限制性位點(diǎn)反復(fù)連接入載體。測序質(zhì)粒以驗(yàn)證正確的克隆和序列。對谷氨酸棒桿菌（及其變體）轉(zhuǎn)化子進(jìn)行抗生素抗性篩選并且通過PCR驗(yàn)證相關(guān)的突變體的正確產(chǎn)生。對于靶基因的缺失，以及基因或其他序列片段插入谷氨酸棒桿菌的基因組中，采用大腸桿菌-谷氨酸棒桿菌穿梭載體pK19mobsacB(Sch?ferA,TauchA,J?gerW,KalinowskiJ,ThierbachG,PühlerA,Gene,1994,145:69)。5.72kb載體來源于載體pU18并且編碼卡那霉素抗性盒、沒有在谷氨酸棒桿菌中復(fù)制的起點(diǎn)、用于在大腸桿菌中增殖的pU18oriV、acZα基因和sacB基因。通過MWGOperonGmbH合成靶序列(與trpD和csm分開,其用特異性引物從谷氨酸棒桿菌ATCC13032基因組中PCR擴(kuò)增（表3）），且通過單核苷酸交換（沉默突變）去除所有天然存在的HindIII和EcoRI限制性位點(diǎn)，并將其經(jīng)HindIII和EcoRI限制性切割和再連接而克隆入載體的多克隆位點(diǎn)中。對于基因缺失（或整合），克隆的DNA序列由靶基因的300-500bp的5'側(cè)翼區(qū)（包含基因的前6個(gè)密碼子）、21bp的外源錯(cuò)義序列（或者待整合入基因組中的序列）、和靶基因的300-500bp的3'側(cè)翼區(qū)（包含目標(biāo)基因的最后6個(gè)密碼子）組成。通過卡那霉素選擇篩選谷氨酸棒桿菌轉(zhuǎn)化子的將質(zhì)粒整合入基因組的單交換事件，因?yàn)樗玫馁|(zhì)粒自身無法在谷氨酸棒桿菌中復(fù)制。將攜帶轉(zhuǎn)化子的BHI培養(yǎng)基瓊脂板（包含15mg/L卡那霉素）在30℃下培養(yǎng)1-7天。隨后通過用蔗糖選擇（將克隆在5mLBHI培養(yǎng)基中培養(yǎng)4h-6h，并隨后以兩個(gè)不同的稀釋度(1:100和1:10000)鋪板在包含10%(w/v)蔗糖的BHI培養(yǎng)基瓊脂板上）來篩選分離的克隆的雙交換事件，其導(dǎo)致框內(nèi)缺失靶基因，僅留下后面的21bp的外源無義序列（或待整合入基因組的代替序列）。載體上的sacB基因編碼果聚糖蔗糖酶，其將蔗糖轉(zhuǎn)化為致死性產(chǎn)物，而結(jié)果是防止其基因組中仍攜帶質(zhì)粒序列的所有克隆生長。在含蔗糖平板上生長的所有菌落通過共轉(zhuǎn)移至補(bǔ)充有15mg/L卡那霉素的BHI培養(yǎng)基瓊脂板以及BHI培養(yǎng)基瓊脂板上來分析并且在30℃下培養(yǎng)1-7天。通過菌落PCR分析僅在沒有補(bǔ)充卡那霉素的平板上生長的菌落以確認(rèn)正確重組。通過PCR和/或DNA測序驗(yàn)證所有質(zhì)粒的正確克隆和相關(guān)突變體的生成。高效液相色譜使用Agilent1100系列HPLC-DAD系統(tǒng)(具有二極管陣列檢測器；AgilentTechnologies,SantaClara(USA))來定量培養(yǎng)上清液中oAB濃度。在20℃下使用C18柱Luna?HPLC-柱(4.6×250mm;3μm;Phenomenex)作為固定相，并且使用由甲醇（溶劑B）和包含0.1%甲酸的水（溶劑A）組成的雙元溶劑。注射10μL的稀釋的培養(yǎng)上清液。應(yīng)用具有0.5mL/min流速的以下梯度：0-1min,2%B;1-2min,2-10%B;2-12min,10-70%B;12-23min,70-90%B;23-25min,90-98%B,25-27min,98%B;27-27.5min,98%-2%B;27.5-30min,2%B。使用外部校準(zhǔn)曲線從在254nm（保留時(shí)間：18.9min）的信號整合測定oAB濃度。谷氨酸棒桿菌菌株中trpD基因的工程改造通過使用大腸桿菌-谷氨酸棒桿菌穿梭載體pK19mobsacB框內(nèi)缺失trpD基因（編碼鄰氨基苯甲酸磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶;Cgl3032;SEQIDNO:1）產(chǎn)生菌株谷氨酸棒桿菌?trpD(參見表2)。trpD開放閱讀框的5'側(cè)翼區(qū)（包括基因的前7個(gè)密碼子）和靶基因的3'側(cè)翼區(qū)（包括trpD開放閱讀框的最后8個(gè)密碼子）通過PCR分別使用引物對Del-trpD-1和Del-trpD-2、以及Del-trpD-3和Del-trpD-4(表3,SEQIDNO:66-69)從分離自谷氨酸棒桿菌ATCC13032的基因組DNA擴(kuò)增。所得到的兩個(gè)片段通過交換PCR使用引物對Del-trpD-1和Del-trpD-4進(jìn)行組合。將所得的片段經(jīng)SmaI限制性和再連接克隆入pK19mobsacB載體的多克隆位點(diǎn)。所得載體應(yīng)用于從谷氨酸棒桿菌ATCC13032的基因組中框內(nèi)缺失trpD并且框內(nèi)引入24bp外源無義序列入基因組,其用于交換PCR（trpD位點(diǎn)中的所得序列：SEQIDNo.2）。正確突變體如上所述進(jìn)行分離并且正確基因缺失通過PCR驗(yàn)證。這產(chǎn)生具有oAB積累的l-色氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株。將該菌株針對其在添加0.1mMl-色氨酸或0.1mM吲哚的情況下如上所述作為oAB生產(chǎn)者的特性進(jìn)行表征（參見表4）。將trpD基因的六種形式經(jīng)如上所述的SbfI和BamHI限制性切割和再連接而克隆入載體pEKEx2。trpD基因的六種不同形式通過PCR使用谷氨酸棒桿菌基因組DNA作為模板用不同的起始密碼子以及核糖體結(jié)合位點(diǎn)和trpD的起始密碼子之間的間隔序列長度(SEQIDNo.3-8)產(chǎn)生。用于六種片段產(chǎn)生的引物為正向引物(Ex-trpD-1至-6,表2,SEQIDNo.70-75)，其包括改變的起始密碼子以及核糖體結(jié)合位點(diǎn)和起始密碼子之間的間隔序列，連同每一形式未改變的反向引物(Ex-trpD-rev,表2,SEQIDNo.76)。選擇該方法以實(shí)現(xiàn)產(chǎn)生的菌株中TrpD蛋白翻譯的降低。用所得質(zhì)粒（表1）轉(zhuǎn)化菌株谷氨酸棒桿菌?trpD(表2)，并且所得菌株谷氨酸棒桿菌?trpD/pEKEx2-trpD1-6(表2)在沒有添加l-色氨酸的情況下生長，且因此，針對其如上所述在向培養(yǎng)基補(bǔ)充25mg/L卡那霉素和1μMIPTG(異丙基-β-d-硫代半乳糖苷)的情況下作為oAB生產(chǎn)者的特性進(jìn)行表征（參見表4）。而且菌株谷氨酸棒桿菌?trpD/pEKEx2-trpD5-6生產(chǎn)足夠的l-色氨酸以實(shí)現(xiàn)生物質(zhì)形成；它們積累顯著量的oAB（表4）。trpD基因的形式trpD1-3、trpD5和trpD6此外通過同源重組使用如上所述的pK19mobsacB載體各自整合入菌株谷氨酸棒桿菌?trpD（表2）的基因組。trpD基因形式的5'側(cè)翼區(qū)和靶基因的3'側(cè)翼區(qū)通過PCR分別使用引物對Del-trpD-1和Ko-trpD-1以及Del-trpD-3和Del-trpD-4(表3,SEQIDNo.66、77、68和69)從分離自谷氨酸棒桿菌ATCC13032的基因組DNA擴(kuò)增。通過交換PCR使用引物對Ex-trpD-1-3、-5或-6和Ko-trpD-2(表3,SEQIDNo.70-72、74、75和78)將所得的兩個(gè)片段與不同的trpD變體組合。將所得的五個(gè)片段經(jīng)SmaI限制性和再連接克隆入pK19mobsacB載體的多克隆位點(diǎn)。將所得的質(zhì)粒（表1）應(yīng)用于將六個(gè)trpD形式引入到菌株谷氨酸棒桿菌?trpD的基因組中。此外，將10個(gè)外源核苷酸(GCCCTGCAGG,SEQIDNO:92)整合到基因組中，由于克隆程序，其位于trpD基因的核糖體結(jié)合位點(diǎn)上游，其應(yīng)用于交換PCR。如上所述分離正確的突變體并通過測序trpD區(qū)域驗(yàn)證整合。所得菌株谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD1-3、trpD5或trpD6(表2)在不添加l-色氨酸或卡那霉素的情況下生長且因此，針對其如上所述在沒有其他培養(yǎng)基補(bǔ)充劑的情況下作為oAB生產(chǎn)者的特性進(jìn)行表征（參見表4）?？梢詫⒂糜诮档突虮磉_(dá)的上述方法應(yīng)用于其他基因，而不進(jìn)行基因缺失。谷氨酸棒桿菌菌株中csm基因的工程改造使用大腸桿菌-谷氨酸棒桿菌穿梭載體pK19mobsacB通過csm基因(編碼分支酸變位酶；Cgl0853)的框內(nèi)缺失產(chǎn)生菌株谷氨酸棒桿菌?csm、谷氨酸棒桿菌?trpD?csm，和谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5?csm(表2)。csm開放閱讀框的5'側(cè)翼區(qū)（包括基因的前6個(gè)密碼子）和靶基因的3'側(cè)翼區(qū)（包括csm開放閱讀框的最后6個(gè)密碼子）通過PCR分別使用引物對Del-csm-1和Del-csm-2，和Del-csm-3和Del-csm-4(表3,SEQIDNO:79-82)從分離自谷氨酸棒桿菌ATCC13032的基因組DNA擴(kuò)增。所得到的兩個(gè)片段通過交換PCR使用引物對Del-csm-1和Del-csm-4進(jìn)行組合。如上所述，將所得的片段經(jīng)SmaI限制性切割和再連接而克隆入pK19mobsacB載體的多克隆位點(diǎn)。將所得載體分別應(yīng)用于從谷氨酸棒桿菌ATCC13032、谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5和菌株谷氨酸棒桿菌?trpD的基因組框內(nèi)缺失csm，并且框內(nèi)引入24bp外源無義序列入基因組,其用于交換PCR（csm位點(diǎn)中的所得序列：SEQIDNo.10）。正確突變體如上所述進(jìn)行分離并且通過PCR驗(yàn)證正確的基因缺失。這產(chǎn)生l-酪氨酸和l-苯丙氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株谷氨酸棒桿菌?csm和谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5?csm，以及l(fā)-酪氨酸、l-苯丙氨酸和l-色氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株谷氨酸棒桿菌?trpD?csm。對于谷氨酸棒桿菌?csm菌株，將菌株針對其如上所述在向培養(yǎng)基補(bǔ)充0.1mMl-酪氨酸和0.1mMl-苯丙氨酸的情況下作為oAB生產(chǎn)者的特性進(jìn)行表征，對于谷氨酸棒桿菌?trpD?csm菌株，將菌株針對在向培養(yǎng)基補(bǔ)充0.1mMl-酪氨酸、0.1mMl-苯丙氨酸和0.1mMl色氨酸的情況下作為oAB生產(chǎn)者的特性進(jìn)行表征（表2）。與野生型菌株以及菌株谷氨酸棒桿菌?trpD相比，所產(chǎn)生的菌株均有受損的生長速率，并且在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下它們沒有積累顯著量的oAB(表4)。將csm基因的六種形式經(jīng)如上所述的SbfI和BamHI限制性切割和再連接而克隆入載體pEKEx2。csm基因的六種不同形式通過PCR使用谷氨酸棒桿菌基因組DNA作為模板用不同的起始密碼子以及核糖體結(jié)合位點(diǎn)和csm的起始密碼子之間的間隔序列長度(SEQIDNo.11-16)產(chǎn)生。用于六種片段產(chǎn)生的應(yīng)用引物為正向引物(Ex-csm-1至-6)，其包括改變的起始密碼子以及核糖體結(jié)合位點(diǎn)和起始密碼子之間的間隔序列，連同每一形式未改變的反向引物(Ex-csm-rev,表3,SEQIDNo.89)。選擇該方法以實(shí)現(xiàn)產(chǎn)生的菌株中Csm蛋白翻譯的降低。用所得質(zhì)粒（表1）轉(zhuǎn)化菌株谷氨酸棒桿菌?csm(表2)，并且所得菌株谷氨酸棒桿菌?csm/pEKEx2-csm1-6(表2)在沒有添加l-酪氨酸、l-苯丙氨酸和l-色氨酸的情況下生長，且因此，針對其如上所述在向培養(yǎng)基補(bǔ)充25mg/L卡那霉素和1μMIPTG的情況下作為oAB生產(chǎn)者的特性進(jìn)行表征（參見表4）。用空載體pEKEx2（表1）轉(zhuǎn)化菌株谷氨酸鈉棒桿菌?trpD::trpD5?csm(表2)并且所得菌株谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5?csm/pEKEx2(表2)在沒有添加l-色氨酸的情況下生長，并且因此針對其如上所述在向培養(yǎng)基補(bǔ)充25mg/L卡那霉素和0.1mMIPTG的情況下作為oAB生產(chǎn)者的特性進(jìn)行表征（表4）。生成的菌株產(chǎn)生足夠的芳香族氨基酸以實(shí)現(xiàn)生物質(zhì)形成，但在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下它們沒有積累顯著量的oAB（表4）。谷氨酸棒桿菌菌株的共同芳香族途徑和l-色氨酸分支的工程改造谷氨酸棒桿菌菌株中trpEG基因的工程改造谷氨酸棒桿菌的芳香族生物合成途徑已經(jīng)闡明并且與編碼oAB生物合成相關(guān)的基因是已知的(IkedaM,ApplMicrobiolBiotechnol,2006,69:615)。oAB是L-色氨酸生物合成途徑的中間體且通過鄰氨基苯甲酸合成酶（由酰胺轉(zhuǎn)移酶(TrpE;供體：L-谷氨酰胺)和鄰氨基苯甲酸合成酶單元（TrpEG）組成）來源于分支酸（CHO），其在形成oAB和L-谷氨酰胺時(shí)釋放丙酮酸分子。編碼TrpEG的基因的表達(dá)增加已顯示導(dǎo)致大腸桿菌菌株中積累L-色氨酸(IkedaM,ApplMicrobiolBiotechnol,2006,69:615)。盡管如此，據(jù)報(bào)道，該酶受L-色氨酸的強(qiáng)烈反饋抑制(IkedaM,ApplMicrobiolBiotechnol,2006,69:615)，導(dǎo)致應(yīng)用TrpEG蛋白的反饋抗性形式?；趤碜匀樗岚l(fā)酵短桿菌(Brevibacteriumlactofermentum)（谷氨酸棒桿菌）、大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)的trpEG序列已經(jīng)報(bào)道了TrpEG蛋白的反饋抗性形式(Calguri等人,JBioChem,1991,8328-8335;Kwak等人,JBiochemMolBio,1999,20-24,IkedaM,ApplMicrobiolBiotechnol,2006,69:615andMatsui等人,JBac,1987,5330-5332)。基于大腸桿菌基因的最有利的trpEG形式在谷氨酸棒桿菌菌株中表達(dá)，以及谷氨酸棒桿菌ATCC13032的天然TrpEG蛋白的trpEG序列上的所選的氨基酸交換在谷氨酸棒桿菌菌株中實(shí)現(xiàn)并表達(dá)?？傊?，相比于谷氨酸棒桿菌的天然TrpEG蛋白，表征了四種反饋抗性TrpEG蛋白（基于大腸桿菌TrpEG：TrpEGS40R和TrpEGS40F(SEQIDNo.50-51)；和基于谷氨酸棒桿菌TrpEG:TrpEGS38R和TrpEGS38F)(SEQIDNo.52-53）。五種形式的trpEG基因通過EurofinsMWGOperonGmbH合成并且經(jīng)SbfI和BamHI限制性切割和再連接而克隆入載體pEKEx2，并且通過測序驗(yàn)證正確克隆。用所得質(zhì)粒（表3）轉(zhuǎn)化菌株谷氨酸棒桿菌ATCC13032和谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5(表2)(谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5僅具有質(zhì)粒pEKEx2-trpEGS40F)，并且所得菌株谷氨酸棒桿菌/pEKEx2-trpEG、谷氨酸棒桿菌/pEKEx-trpEGS38F、谷氨酸棒桿菌/pEKEx2-trpEGS38R、谷氨酸棒桿菌/pEKEx2-trpEGS40F、谷氨酸棒桿菌/pEKEx2-trpEGS40R、谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5/pEKEx2-trpEGS40F(表2)針對其如上所述在向培養(yǎng)基補(bǔ)充25mg/L卡那霉素和0.1mMIP的情況下作為oAB生產(chǎn)者的特性進(jìn)行表征（參見表4）。另外，根據(jù)Caliguri和Bauerle(1991)對攜帶pEKEx2-trpEG變體的五種基于谷氨酸棒桿菌?trpD的菌株的細(xì)胞裂解物的鄰氨基苯甲酸合成酶活性進(jìn)行分析。從在具有補(bǔ)充有25mg/L卡那霉素和1mMIPTG的30mLBHI培養(yǎng)基的300mL搖瓶中且在30℃下以150rpm搖動(dòng)生長（終OD6004）的來自30mL基于攜帶pEKEx2-trpEG變體的谷氨酸棒桿菌?trpD的菌株的培養(yǎng)物產(chǎn)生的細(xì)胞沉淀產(chǎn)生細(xì)胞裂解物。將細(xì)胞沉淀使用0.1mm氧化鋯珠粒(ZymoResearchCoperation,Irvine,CA)裂解并且根據(jù)Caliguri和Bauerle(1991)于25℃下重懸于測定緩沖液(50mMKH2PO4/K2HPO4,20mMl-谷氨酰胺，10mMMgCl2和25μM分支酸)。使用熒光分光計(jì)（激發(fā)：390nm）在390nm處測量發(fā)射。所有測試的變體相對于具有天然谷氨酸棒桿菌TrpEG蛋白的細(xì)胞裂解物顯示更高的鄰氨基苯甲酸合成酶的比活性。使用了三個(gè)生物學(xué)重復(fù)用于測量。相比于谷氨酸棒桿菌TrpEG蛋白變體大腸桿菌TrpEG蛋白變體具有更高的活性和更低的KM（KM和vmax值的測定用GraphpadPrism(LaJolla,CA)進(jìn)行）。菌株谷氨酸棒桿菌?trpD/pEKEx2-trpEGS40F的細(xì)胞裂解物已顯示最佳性能（參見表5）。表5產(chǎn)生TrpEG的不同變體的谷氨酸棒桿菌?trpD粗提取物對于TrpEG活性的生物化學(xué)表征菌株KM(μmol)Vmax(mU/mg)谷氨酸棒桿菌?trpD/pEKEx2-trpEG11.412.7谷氨酸棒桿菌?trpD/pEKEx2-trpEGS38F16.268.8谷氨酸棒桿菌?trpD/pEKEx2-trpEGS38R21.6231.2谷氨酸棒桿菌?trpD/pEKEx2-trpEGS40F1.9427.5谷氨酸棒桿菌?trpD/pEKEx2-trpEGS40R1.9317.9谷氨酸棒桿菌菌株中aroG基因的工程改造在谷氨酸棒桿菌和大腸桿菌兩者中，已報(bào)道經(jīng)共同芳香族途徑直至分支酸的碳流(carbonflux)主要在3-脫氧-D-阿拉伯-庚酮糖7-磷酸合成酶的第一反應(yīng)處受到控制(IkedaM,ApplMicrobiolBiotechnol,2006,69:615)。在谷氨酸棒桿菌中，存在具有不同亞基大小的兩種類型的DS。一個(gè)是具有39kDa預(yù)測分子量的L-酪氨酸敏感的DS（I型-DS;aro產(chǎn)物;Cgl0950），而另一個(gè)為具有51kDa預(yù)測分子量的L-苯丙氨酸-和L-酪氨酸-敏感的DS(II型-DS;aroII產(chǎn)物;Cgl2098)。II型-DS與將分支酸轉(zhuǎn)化為預(yù)苯酸的分支酸變位酶形成多肽復(fù)合體。II型-DS通過其自身展示出活性，而CM活性需要存在II型-DS蛋白(IkedaM,ApplMicrobiolBiotechnol,2006,69:615)。已經(jīng)描述了反饋抗性的AroIDS(AroIS187C)(IkedaM,ApplMicrobiolBiotechnol,2006,69:615)。將來自大腸桿菌的AroII的反饋抗性等同物DSAroGfbr(AroGD146N;SEQIDNo.55)（其不受芳香族氨基酸的抑制）在谷氨酸棒桿菌菌株中表達(dá)以增強(qiáng)經(jīng)共同芳香族途徑向CHO和oAB的碳流。使用引物Ex-aroG-1和Ex-aroG-2(表3,SEQIDNo.109-110)通過PCR擴(kuò)增aroGD146N基因，所述引物包含如上所述的限制性位點(diǎn)和核糖體位點(diǎn)。將所得的DNA片段如上所述經(jīng)SbfI和BamHI限制性切割和再連接而克隆入載體pEKEx2，并且通過測序驗(yàn)證正確的克隆。用所得質(zhì)粒（表1）轉(zhuǎn)化菌株谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5(表2)并且所得菌株谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5/pEKEx2-aroGD146N(表2)對其如上所述在向培養(yǎng)基補(bǔ)充有25mg/L卡那霉素和0.1mMIPTG的情況下作為oAB生產(chǎn)者的特性進(jìn)行表征（參見表4）。谷氨酸棒桿菌菌株中trpEG和aroG基因的工程改造為了允許研究AroGD146N和TrpEGS40F在谷氨酸棒桿菌菌株中組合表達(dá)的影響，將編碼這些蛋白的DNA序列融合入pEKEx2載體上。將aroGD146N序列融合入pEKEx2-trpEGS40F以獲得pEKEx2-trpEGS40F-aroGD146N（表1）并且將基因trpEGS40F融合入質(zhì)粒pEKEx2-aroGD146N以獲得pEKEx2-aroGD146N-trpEGS40F(表1)，其如上所述均通過BglII和BamHI限制性切割和再連接，且通過測序驗(yàn)證正確克隆。用每一所得的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5（表2）并將所得菌株谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5/pEKEx2-aroGD146N-trpEGS40F和谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5/pEKEx2-trpEGS40F-aroGD146N(表2)針對其如上所述在向培養(yǎng)基補(bǔ)充有25mg/L卡那霉素和0.1mMIPTG的情況下作為oAB生產(chǎn)者的特性進(jìn)行表征（參見表4）。另外，用質(zhì)粒pEKEx2-aroGD146N-trpEGS40F轉(zhuǎn)化菌株谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5?csm(表2)并且將所得菌株谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5?csm/pEKEx2-aroGD146N-trpEGS40F(表2)針對其如上所述在向培養(yǎng)基補(bǔ)充25mg/L卡那霉素、0.1mMl-酪氨酸、0.1mMl-苯丙氨酸和0.1mMIPTG的情況下作為oAB生產(chǎn)者的特性進(jìn)行表征（參見表4）。谷氨酸棒桿菌菌株中aroK和aroL基因的工程改造為了防止谷氨酸棒桿菌菌株的共同芳香族氨基酸生物合成途徑中中間體的積累，研究了來自谷氨酸棒桿菌的基因aroK(編碼莽草酸激酶；Cgl1622;SEQIDNo.94)和來自大腸桿菌的基因aroL(編碼莽草酸激酶；CP000948;SEQIDNo.93)。aroK和aroL基因單獨(dú)通過PCR分別使用引物Ex-aroK-1和Ex-aroK-2(表3,SEQIDNo.101-102)和Ex-aroL-1和Ex-aroL-2(表3,SEQIDNo.99-100)進(jìn)行擴(kuò)增。引物包含如上所述的限制性位點(diǎn)和核糖體結(jié)合位點(diǎn)。將所得DNA片段單獨(dú)經(jīng)SbfI和BamHI限制性和再連接整合入載體pEKEx2，如上所述，以產(chǎn)生質(zhì)粒pEKEx2-aroK和pEKEx2-aroL，并通過測序驗(yàn)證正確克隆。用所得質(zhì)粒（表3）轉(zhuǎn)化菌株谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5(表2)并且將所得菌株谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5/pEKEx2-aroL和谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5/pEKEx2-aroK(表2）針對其如上所述在向培養(yǎng)基補(bǔ)充有25mg/L卡那霉素和0.1mMIPTG的情況下作為oAB生產(chǎn)者的特性進(jìn)行表征（參見表4）。在菌株谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5/pEKEx2-aroL中，通過HPLC-DAD分析培養(yǎng)上清液無法檢測到莽草酸和3-脫羥基莽草酸的顯著積累。谷氨酸棒桿菌菌株中g(shù)lnA基因的工程化為了分析L-谷氨酰胺合成酶(GlnA;Cgl2214,SEQIDNo.95)活性對由谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)oAB的影響，在菌株谷氨酸棒桿菌菌株中表達(dá)L-谷氨酰胺合成酶基因glnA。使用引物Ex-glnA-1和Ex-glnA-2(表3,SEQIDNo.97-98)通過PCR擴(kuò)增glnA基因，所述引物包含如上所述的限制性位點(diǎn)和核糖體位點(diǎn)。將所得的DNA片段如上所述經(jīng)NcoI限制性和再連接克隆入載體pCRB210，并且通過測序驗(yàn)證正確的克隆。用所得質(zhì)粒（表3）轉(zhuǎn)化菌株谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5并且所得菌株谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5/pCRB-glnA(表2)對其如上所述在向培養(yǎng)基補(bǔ)充有25mg/L卡那霉素和0.1mMIPTG的情況下作為oAB生產(chǎn)者的特性進(jìn)行表征（參見表4）。作為對照，用空載體對照pCRB210（表1）轉(zhuǎn)化菌株谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD并且所得菌株谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5/pCRB210(表2)對其如上所述在向培養(yǎng)基補(bǔ)充有25mg/L卡那霉素和0.1mMIPTG的情況下作為oAB生產(chǎn)者的特性進(jìn)行表征（參見表4）。盡管菌株生長降低，但無法觀察到對谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5的鄰氨基苯甲酸積累的有益效果。不能排除GlnA增加的活性將在更高級的oAB生產(chǎn)者菌株中增加鄰氨基苯甲酸的積累，因?yàn)槠湟言诖竽c桿菌(Sun等人,ApplEnvironMicrobiol,2013,4024-4030)中觀察到。谷氨酸棒桿菌的中心代謝的工程改造谷氨酸棒桿菌菌株中pyk基因的工程改造丙酮酸激酶（Pyk）通過產(chǎn)生丙酮酸和ATP消耗磷酸烯醇丙酮酸。研究了框內(nèi)缺失pyk基因(SEQIDNO:23)在谷氨酸棒桿菌菌株中的影響。如上所述使用大腸桿菌-谷氨酸棒桿菌穿梭載體pK19mobsacB通過框內(nèi)缺失pyk基因（編碼丙酮酸激酶；Cgl2089）產(chǎn)生菌株谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5?pyk(表2)。所得質(zhì)粒pSB082（表1）應(yīng)用于從谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5的基因組中框內(nèi)缺失pyk基因并且向基因組內(nèi)框內(nèi)引入24bp外源錯(cuò)義序列（pyk基因座中的所得序列：SEQIDNo.24）。正確突變體如上所述進(jìn)行分離并且正確基因缺失通過PCR驗(yàn)證。這產(chǎn)生菌株谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5?pyk，其如上所述針對其作為oAB生產(chǎn)者菌株的特性進(jìn)行表征（表4）。谷氨酸棒桿菌菌株中g(shù)pi基因的工程改造為了將碳流導(dǎo)向磷酸戊糖途徑，研究了谷氨酸棒桿菌菌株中框內(nèi)缺失葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶（Gpi）編碼基因(SEQIDNO:27)的影響。如上所述使用大腸桿菌-谷氨酸棒桿菌穿梭載體pK19mobsacB通過框內(nèi)缺失gpi基因（編碼葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶；Cgl0851）產(chǎn)生菌株谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5?gpi(表2)。所得質(zhì)粒pSB064（表1）應(yīng)用于從谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5的基因組中框內(nèi)缺失gpi基因并且向基因組內(nèi)框內(nèi)引入24bp外源錯(cuò)義序列（gpi基因座中的所得序列：SEQIDNo.28）。正確突變體如上所述進(jìn)行分離并且正確基因缺失通過PCR驗(yàn)證。這產(chǎn)生菌株谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5?gpi，其如上所述針對其作為oAB生產(chǎn)者菌株的特性進(jìn)行表征（表4）。谷氨酸棒桿菌菌株中pepco基因的工程改造磷酸烯醇丙酮酸羧化酶（Pepco）通過將PEP轉(zhuǎn)化為草酰乙酸而將其消耗。為了獲得增加的PEP池，研究了谷氨酸棒桿菌菌株中框內(nèi)缺失磷酸烯醇丙酮酸羧化酶編碼基因(SEQIDNO:21)。如上所述使用大腸桿菌-谷氨酸棒桿菌穿梭載體pK19mobsacB通過框內(nèi)缺失pepco基因（編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶；Cgl1585）產(chǎn)生菌株谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5?pepco(表2)。所得質(zhì)粒pSB061（表1）應(yīng)用于從谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5的基因組中框內(nèi)缺失pepco基因并且向基因組內(nèi)框內(nèi)引入24bp外源錯(cuò)義序列（pepco基因座中的所得序列：SEQIDNo.22）。如上所述分離正確突變體（向BHI培養(yǎng)基瓊脂板上額外補(bǔ)充1%乙酸）并且通過PCR驗(yàn)證正確基因缺失。這產(chǎn)生菌株谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5?pepco，其如上所述針對其作為oAB生產(chǎn)者菌株的特性進(jìn)行表征（表4）。谷氨酸棒桿菌菌株中ptsG和hpr基因的工程改造谷氨酸棒桿菌的葡萄糖和果糖攝取主要通過磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（PTS）利用。該多酶復(fù)合體經(jīng)由磷酸烯醇丙酮酸介導(dǎo)的磷酸化級聯(lián)進(jìn)行葡萄糖的易位，并伴隨跨過細(xì)胞膜的葡萄糖磷酸化為葡萄糖-6-磷酸(Siebold等人2001)。所述系統(tǒng)由兩個(gè)可溶組分酶I和組氨酸富含蛋白（Hpr）以及膜結(jié)合/相關(guān)酶復(fù)合體組成(Tanaka等人2008)。如上所述，使用大腸桿菌-谷氨酸棒桿菌穿梭載體pK19mobsacB，通過框內(nèi)缺失hpr基因(編碼組氨酸富含蛋白;Cgl1937,SEQIDNO:17)和ptsG基因(編碼磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)單元G;Cgl1360,SEQIDNO:19)產(chǎn)生菌株谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5?hpr和谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5?ptsG（表2）。所得質(zhì)粒pSB060和pSB079（表1）分別應(yīng)用于從谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5的基因組中框內(nèi)缺失hpr基因和ptsG基因并且向基因組內(nèi)框內(nèi)引入24bp外源錯(cuò)義序列（hpr/ptsG基因座中的所得序列：SEQIDNo.18;ptsG基因座:20)。如上所述分離正確突變體（向BHI培養(yǎng)基瓊脂板上額外補(bǔ)充5g/L核糖）并且通過PCR驗(yàn)證正確基因缺失。這產(chǎn)生菌株谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5?hpr和谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5?ptsG，其如上所述針對其作為oAB生產(chǎn)者菌株的特性進(jìn)行表征（表4）。兩種菌株在標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵條件下均未顯示顯著生長，如上所述，且結(jié)果是沒有積累oAB。谷氨酸棒桿菌菌株中ppk基因的工程改造磷酸烯醇丙酮酸羧激酶（Ppk）作為乙醛酸途徑的部分可以將草酰乙酸再循環(huán)為PEP。為了獲得增加的PEP池，研究了谷氨酸棒桿菌菌株中基于質(zhì)粒表達(dá)磷酸烯醇丙酮酸羧激酶編碼基因(Cgl2862;SEQIDNO:36)。ppk基因通過EurofinsMWGOperonGmbH合成并且經(jīng)SbfI和BamHI限制性切割和再連接而克隆入載體pEKEx2，如上所述，產(chǎn)生質(zhì)粒pSB072（表1），且通過測序驗(yàn)證正確克隆。通過用質(zhì)粒pSB072轉(zhuǎn)化菌株谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5產(chǎn)生菌株谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5/pSB072（表2），如上所述。正確突變體如上所述進(jìn)行分離并且通過菌落PCR驗(yàn)證含靶基因的成功轉(zhuǎn)化。這產(chǎn)生菌株谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5/pSB072，其如上所述針對其作為oAB生產(chǎn)者菌株的特性進(jìn)行表征（表4）。谷氨酸棒桿菌菌株中pps基因的工程改造磷酸烯醇丙酮酸合成酶（Pps）作為糖異生的部分通過丙酮酸再循環(huán)和消耗ATP為AMP來催化PEP形成。為了獲得增加的PEP池，研究了谷氨酸棒桿菌菌株中基于質(zhì)粒表達(dá)磷酸烯醇丙酮酸合成酶編碼基因連同PEP合成酶結(jié)合結(jié)構(gòu)域編碼基因(Cgl0551和Cgl0552;SEQIDNO:33-35)。pps基因一起通過EurofinsMWGOperonGmbH合成并且經(jīng)SbfI和BamHI限制性和再連接克隆入載體pEKEx2，如上所述，產(chǎn)生質(zhì)粒pSB073，且通過測序驗(yàn)證正確克隆。通過用質(zhì)粒pSB073轉(zhuǎn)化菌株谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5產(chǎn)生菌株谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5/pSB073（表2），如上所述。正確突變體如上所述進(jìn)行分離并且通過菌落PCR驗(yàn)證含靶基因的成功轉(zhuǎn)化。這產(chǎn)生菌株谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5/pSB073，其如上所述針對其作為oAB生產(chǎn)者菌株的特性進(jìn)行表征（表4）。谷氨酸棒桿菌菌株中zwf1連同opcA基因的工程改造在運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌（Zymomonasmobilis）和大腸桿菌中，催化戊糖磷酸途徑(PPP)的第一個(gè)反應(yīng)（核酮糖-5-磷酸從葡萄糖-6-磷酸通過葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的形成(Zwf1和OpcA)）的酶的增強(qiáng)產(chǎn)生被報(bào)道導(dǎo)致碳流入PPP增加，且因而導(dǎo)致赤蘚糖-4-磷酸(E4P)池增加。為了獲得增加的E4P池，研究了谷氨酸棒桿菌菌株中基于質(zhì)粒表達(dá)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶編碼基因(zwf1(Cgl1576)和opcA(Cgl1577;SEQIDNO:37-39)?；蛲ㄟ^EurofinsMWGOperonGmbH合成并且經(jīng)SbfI和BamHI限制性切割和再連接而克隆入載體pEKEx2，如上所述，產(chǎn)生質(zhì)粒pSB078（表1），且通過測序驗(yàn)證正確克隆。通過用質(zhì)粒pSB078轉(zhuǎn)化菌株谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5產(chǎn)生菌株谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5/pSB078（表2），如上所述。正確突變體如上所述進(jìn)行分離并且通過菌落PCR驗(yàn)證含靶基因的成功轉(zhuǎn)化。這產(chǎn)生菌株谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5/pSB078，其如上所述針對其作為oAB生產(chǎn)者菌株的特性進(jìn)行表征（表4）。谷氨酸棒桿菌菌株中tal和tkt基因的工程改造經(jīng)PPP的增加的碳流和增加的E4P池已通過大腸桿菌中轉(zhuǎn)酮醇酶和轉(zhuǎn)醛醇酶的表達(dá)增加來描述。將大腸桿菌的轉(zhuǎn)酮醇酶（Tkt）和轉(zhuǎn)醛醇酶（Tal）編碼基因(tktEC(ECDH10B_3110)和talEC(ECDH10B_2629);SEQIDNO:41和43)以及谷氨酸棒桿菌的等同基因(tktCG(Cgl1574)和talCG(Cgl1575);SEQIDNO:40和42)在谷氨酸棒桿菌中進(jìn)行基于質(zhì)粒的表達(dá)。四個(gè)基因通過EurofinsMWGOperonGmbH合成并且經(jīng)SbfI和BamHI限制性切割和再連接而單獨(dú)整合入載體pEKEx2，如上所述，產(chǎn)生質(zhì)粒pSB074-pSB077（表1），且通過測序驗(yàn)證正確克隆。通過用每種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌株谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5產(chǎn)生菌株谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5/pSB074-pSB077（表2），如上所述。正確突變體如上所述進(jìn)行分離并且通過菌落PCR驗(yàn)證含靶基因的成功轉(zhuǎn)化。這產(chǎn)生菌株谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5/pSB074-pSB077，其如上所述針對其作為oAB生產(chǎn)者菌株的特性進(jìn)行表征（表4）。為了允許研究轉(zhuǎn)酮醇酶和轉(zhuǎn)醛醇酶在谷氨酸棒桿菌菌株中組合表達(dá)的影響，將編碼這些蛋白的DNA序列融合入pEKEx2載體上。將talCG序列融合入pSB075以獲得pSB085（表1）并且將基因talEC融合入質(zhì)粒pSB077以獲得pSB086（表1），均經(jīng)過BglII和BamHI限制性切割和再連接，如上所述，并且通過測序驗(yàn)證正確克隆。用每種所得質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌株谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5并且將所得菌株谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5/pSB085和谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5/pSB086(表2）針對其如上所述在向培養(yǎng)基補(bǔ)充有25mg/L卡那霉素和0.1mMIPTG的情況下作為oAB生產(chǎn)者的特性進(jìn)行表征（表4）。谷氨酸棒桿菌菌株中g(shù)alP、iolT2和ppgk基因的工程改造為了恢復(fù)Pts缺陷谷氨酸棒桿菌菌株中有效的葡萄糖攝入，研究了谷氨酸棒桿菌菌株中半乳糖通透酶編碼基因(galP,Cgl2409;SEQIDNO:30)與聚磷酸葡萄糖激酶(葡萄糖磷酸化酶)編碼基因(ppgk(Cg1910;SEQIDNO:32)的組合的基于質(zhì)粒的表達(dá)。此外，研究了谷氨酸棒桿菌菌株中（肌醇通透酶的）肌醇通透酶T2單元編碼基因(iolT2,Cgl3058;SEQIDNO:31)與聚磷酸葡萄糖激酶編碼基因(ppgk(Cg1910;SEQIDNO:32)的組合。四個(gè)基因通過EurofinsMWGOperonGmbH合成并且各自經(jīng)SbfI和BamHI限制性切割和再連接而整合入載體pEKEx2，如上所述，產(chǎn)生質(zhì)粒pSB068、pSB070和pSB071（表1），且通過測序驗(yàn)證正確克隆。將ppgk序列分別融合至pEKEx2載體上的galP序列和iolT2。將galP序列融合入pSB071以獲得pSB083（表1）并且將基因iolT2融合入質(zhì)粒pSB071以獲得pSB084（表1），均經(jīng)過BglII和BamHI限制性切割和再連接，如上所述，并且通過測序驗(yàn)證正確克隆。將谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5?ptsG和谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5?hpr(表2)各自分別用質(zhì)粒pSB083和pSB084轉(zhuǎn)化，并且將所得菌株?trpD::trpD5?ptsG/pSB083、谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5?ptsG/pSB084、谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5?hpr/pSB083和谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5?hpr/pSB084(表2)針對其如上所述在向培養(yǎng)基補(bǔ)充25mg/L卡那霉素和0.1mMIPTG的情況下作為oAB生產(chǎn)者的特性進(jìn)行表征（表4）。菌株?trpD::trpD5?hpr/pSB083在標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵條件下沒有顯示顯著生長，如上所述，且結(jié)果是沒有積累oAB。谷氨酸棒桿菌菌株的oAB輸出的工程改造隨著oAB生產(chǎn)速率增加，從生產(chǎn)細(xì)胞輸出產(chǎn)物可能容易地成為生產(chǎn)限速步驟。此外，oAB的胞內(nèi)積累非常容易地可能對細(xì)胞具有顯著的毒性作用。目前尚未描述任何oAB輸出蛋白。近期，屬于主要促進(jìn)者系統(tǒng)(mayorfacilatorsystme)家族的莽草酸通透酶（QsuA）由Kubota等人描述，所述酶促進(jìn)谷氨酸棒桿菌中莽草酸和奎尼酸的輸出(Kubota等人,MolecularMicrobiol,2014,92(2),356)。為了測試莽草酸通透酶對谷氨酸棒桿菌菌株中oAB的胞內(nèi)和胞外濃度的影響，由EurofinsMWGOperonGmbH合成了相關(guān)基因(qsuA,Cgl0492;SEQIDNO:96)并且經(jīng)SbfI和BamHI限制性切割和再連接而整合入載體pEKEx2，如上所述，產(chǎn)生質(zhì)粒pSB096（表1），并且通過測血驗(yàn)證正確克隆。通過用質(zhì)粒pSB096轉(zhuǎn)化菌株谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5產(chǎn)生菌株谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5/pSB096（表2），如上所述。正確突變體如上所述進(jìn)行分離并且通過菌落PCR驗(yàn)證含靶基因的成功轉(zhuǎn)化。這產(chǎn)生菌株谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5/pSB096，其如上所述針對其作為oAB生產(chǎn)者菌株的特性進(jìn)行表征（表4）。實(shí)施例4-用惡臭假單胞菌產(chǎn)生鄰氨基苯甲酸和/或鹽開發(fā)了來源自惡臭假單胞菌KT2440的菌株，其產(chǎn)生oAB。為了實(shí)現(xiàn)由惡臭假單胞菌菌株的oAB積累，選擇編碼鄰氨基苯甲酸磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶和吲哚-3-甘油磷酸合成酶的trpDC基因(PP_0421和PP_0422;SEQIDNO:63)在惡臭假單胞菌KT2440中進(jìn)行破壞。通過Martinez-Garcia等人(Martinez-Garcia等人,EnvironMicrobiol,2011,13(10),2702)中描述的方法使用載體pEMG進(jìn)行基于敲除質(zhì)粒pEMG-Del-trpDC(表1)的缺失突變體惡臭假單胞菌?trpDC的構(gòu)建。該方法導(dǎo)致去除基因序列（目標(biāo)基因，GOI）而沒有殘余克隆印記(scars)或標(biāo)志物。該方法的概念顯示在圖27中。在步驟A-B中，將攜帶破壞側(cè)翼TS1和TS2、卡那霉素標(biāo)志物和I-SceI位點(diǎn)的設(shè)計(jì)的敲除載體整合入惡臭假單胞菌的基因組中。在步驟C中，通過轉(zhuǎn)化攜帶大核酸酶I-SceI基因的第二質(zhì)粒(pSW-2)誘導(dǎo)雙鏈斷裂。通過TS1或TS2區(qū)域的同源重組體內(nèi)修復(fù)斷裂，產(chǎn)生惡臭假單胞菌野生型或惡臭假單胞菌ΔtrpDC（步驟D）。步驟E顯示分辨和分離不同菌株所需的PCR篩選。選擇缺失側(cè)翼使得去除基因的開放閱讀框同時(shí)保持鄰近基因完整（圖28）。該策略可以導(dǎo)致在長期持續(xù)培養(yǎng)中更高的菌株穩(wěn)定性。使用Phusion?High-FidelityDNAPolymerase(NewEnglandBiolabs)擴(kuò)增800bp的破壞側(cè)翼TS1和TS2。根據(jù)制造商手冊進(jìn)行PhusionPCR(25個(gè)循環(huán),61,8℃(TS1),70,2℃(TS2)1:30分鐘)。用BamHI和XhoI消化PCR片段TS1并且用XhoI和SbfI消化PCR片段TS2。用BamHI和SbfI消化質(zhì)粒pEMG和融合的TS1-TS2PCR產(chǎn)物。所有限制性混合物使用HighPurePCRProductPurificationKit(Roche)進(jìn)行純化。使用單獨(dú)側(cè)翼TS1和TS2連接pEMG-Del-trpDC使用T4DNA連接酶(ThermoFisherScientific)根據(jù)制造商說明書進(jìn)行。將連接混合物轉(zhuǎn)化入化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌DH5αλpir菌株。來自由兩個(gè)單獨(dú)側(cè)翼和經(jīng)消化的載體pEMG組成的三個(gè)點(diǎn)連接混合物的陽性質(zhì)粒通過限制性分析鑒定并通過測序驗(yàn)證，其證實(shí)pEMG-Del-trpDC的成功構(gòu)建（表1）。將敲除載體pEMG-Del-trpDC通過三親本雜交使用受體菌株惡臭假單胞菌、供體菌株大腸桿菌DH5αλpir/pEMG-Del-trpDC和輔助菌株大腸桿菌HB101pRK2013整合入惡臭假單胞菌的基因組(圖27,步驟A-B)(Martinez-Garcia等人,EnvironMicrobiol,2011,13(10),2702)。通過使用具有50mg/L卡那霉素的西曲溴銨瓊脂板從細(xì)胞混合物分離惡臭假單胞菌/pEMG-Del-trpDC并且將單菌落再次在LB-卡那霉素平板上劃線。經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證單菌落中敲除載體的基因組整合。為了在基因組中引入雙鏈斷裂（圖27，步驟C），將攜帶I-SceI大核酸酶基因的第二質(zhì)粒（pSW-2）轉(zhuǎn)化入新構(gòu)建的菌株中。因此，根據(jù)Choi等人(Choi等人,JMicrobiolMethods,2005,64(3),391)獲得電感受態(tài)惡臭假單胞菌/pEMG-Del-trpDC細(xì)胞。使用BioradGenePulserXcellElectroporator(2.5kV,200ohm,25μF)進(jìn)行電穿孔并且將細(xì)胞懸浮液鋪板到LB-慶大霉素（30mg/L）和LB-卡那霉素-慶大霉素平板（分別30mg/L和50mg/L）上。按照Martinez-Garcia等人中描述的敲除程序的方案，誘導(dǎo)I-SceI大核酸酶是必需的。然而，由于實(shí)際情況顯示出I-SceI大核酸酶的泄露表達(dá)，因此取消了該步驟。為了區(qū)分期望的惡臭假單胞菌ΔtrpDC敲除菌株與惡臭假單胞菌和惡臭假單胞菌/pEMG-Del-trpDC菌株，將單一菌落在LB和LB-卡那霉素平板上劃線。經(jīng)如上所述的菌落PCR檢查卡那霉素敏感的菌落。此外，在含有20mM葡萄糖和含有或不含有0.1mMl-色氨酸的基本培養(yǎng)基上檢查卡那霉素敏感菌落的l-苯丙氨酸營養(yǎng)缺陷型。通過PCR分析和測序驗(yàn)證基因缺失。所得菌株惡臭假單胞菌ΔtrpDC(表2)無法在不含l-色氨酸補(bǔ)充的基本培養(yǎng)基上生長。此外，破壞惡臭假單胞菌?trpDC菌株中編碼分支酸變位酶的pheA基因(PP_1769,SEQIDNO:64)。pheA基因編碼l-苯丙氨酸和l-酪氨酸生物合成的第一步，其可能與鄰氨基苯甲酸的生產(chǎn)發(fā)生競爭。通過Martinez-Garcia等人(Martinez-Garcia等人,EnvironMicrobiol,2011,13(10),2702)中描述的方法使用載體pEMG如上所述進(jìn)行給予敲除質(zhì)粒pEMG-Del-pheA的缺失突變體惡臭假單胞菌?trpDCΔpheA的構(gòu)建。選擇缺失側(cè)翼使得去除基因的開放閱讀框同時(shí)保持鄰近基因完整（圖29）。該策略可以導(dǎo)致在長期持續(xù)培養(yǎng)中更高的菌株穩(wěn)定性。在pheA的情況下，這意指由于與serC基因的重疊而保留基因的八個(gè)5'核苷酸。為了構(gòu)建800bp的破壞側(cè)翼TS1和TS2，使用以下引物JK038f、JK039r、JK040f和JK041r(表3,SEQIDNO:103-106)。用BamHI和XhoI消化PCR片段TS1并且用XhoI和SbfI消化PCR片段TS2。用BamHI和SbfI消化質(zhì)粒pEMG和融合的TS1-TS2PCR產(chǎn)物。所有限制性混合物使用HighPurePCRProductPurificationKit(Roche)進(jìn)行純化。使用單獨(dú)側(cè)翼TS1和TS2連接pEMG-Del-pheA使用T4DNA連接酶(ThermoFisherScientific)根據(jù)制造商說明書進(jìn)行。將連接混合物轉(zhuǎn)化入化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌DH5αλpir菌株。來自由兩個(gè)單獨(dú)側(cè)翼和經(jīng)消化的載體pEMG組成的三個(gè)點(diǎn)連接混合物的陽性質(zhì)粒通過限制性分析鑒定并通過測序驗(yàn)證，其證實(shí)pEMG-Del-pheA的成功構(gòu)建（表1）。將敲除載體pEMG-Del-pheA通過三親本雜交使用受體菌株惡臭假單胞菌ΔtrpDC、供體菌株大腸桿菌DH5αλpir/pEMG-Del-pheA和輔助菌株大腸桿菌HB101pRK2013整合入惡臭假單胞菌ΔtrpDC的基因組(圖27,步驟A-B)(Martinez-Garcia等人,EnvironMicrobiol,2011,13(10),2702)。通過使用具有50mg/L卡那霉素的西曲溴銨瓊脂板從細(xì)胞混合物分離惡臭假單胞菌ΔtrpDC/pEMG-Del-pheA并且將單菌落再次在LB-卡那霉素平板上劃線。經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證單菌落中敲除載體的基因組整合。為了在基因組中引入雙鏈斷裂（圖27，步驟C），將攜帶I-SceI大核酸酶基因的第二質(zhì)粒（pSW-2）轉(zhuǎn)化入新構(gòu)建的菌株中。因此，根據(jù)Choi等人(Choi等人,JMicrobiolMethods,2005,64(3),391)獲得電感受態(tài)惡臭假單胞菌ΔtrpDC/pEMG-Del-pheA細(xì)胞。使用BioradGenePulserXcellElectroporator(2.5kV,200ohm,25μF)進(jìn)行電穿孔并且將細(xì)胞懸浮液鋪板到LB-慶大霉素（30mg/L）和LB-卡那霉素-慶大霉素平板（分別30mg/L和50mg/L）上。按照Martinez-Garcia等人中描述的敲除程序的方案，誘導(dǎo)I-SceI大核酸酶是必需的。然而，由于實(shí)際情況顯示出I-SceI大核酸酶的泄露表達(dá)，因此取消了該步驟。為了分辨期望的惡臭假單胞菌ΔtrpDCΔpheA(表2)敲除菌株與惡臭假單胞菌ΔtrpDC和惡臭假單胞菌ΔtrpDC/pEMG-Del-pheA菌株，將單菌落在LB和LB-卡那霉素平板上劃線。經(jīng)如上所述的菌落PCR檢查卡那霉素敏感的菌落。此外，在含有20mM葡萄糖、0.1mMl-色氨酸和含有或不含有1mMl-苯丙氨酸的基本培養(yǎng)基上檢查卡那霉素敏感菌落的l-苯丙氨酸營養(yǎng)缺陷型。通過PCR分析和測序驗(yàn)證基因缺失。由于惡臭假單胞菌KT2440具有l(wèi)-苯丙氨酸-4-羥化酶(PheA)（其轉(zhuǎn)化l-苯丙氨酸為l-酪氨酸），因此通過添加l苯丙氨酸來拯救l-色氨酸-營養(yǎng)缺陷型。由于l-色氨酸和l-苯丙氨酸營養(yǎng)缺陷型均通過單基因破壞獲得，因此假定在惡臭假單胞菌KT2440中不存在編碼替代酶的冗余基因。芳香族氨基酸生物合成途徑的第一專屬反應(yīng)由DAHP合成酶同工酶催化。在若干生物體中已顯示該酶的反饋不敏感突變體的過表達(dá)導(dǎo)致經(jīng)芳香族生物合成途徑的流增加(IkedaM,ApplMicrobiolBiotechnol,2006,69:615)。因此，為了提高鄰氨基苯甲酸產(chǎn)量，將由aroGD146N基因(SEQIDNO:55)編碼的反饋不敏感的3-脫氧-D-阿拉伯-庚酮糖7-磷酸(DAHP)合成酶經(jīng)載體pSEVA234在菌株惡臭假單胞菌KT2440、惡臭假單胞菌ΔtrpDC和惡臭假單胞菌ΔtrpDCΔpheA中表達(dá)（在lacIq-Ptrc系統(tǒng)的控制下；編碼卡那霉素抗性和pBBR1復(fù)制起點(diǎn)）(Silva-Rocha等人,NucleicAcidsResearch,2013,D666-75)。使用EcoRI和BamHI限制酶和標(biāo)準(zhǔn)條件如上所述（實(shí)施例3）從供體質(zhì)粒(pCAS-2JF-aroGD146N)將aroGD146N基因限制化，產(chǎn)生1117bp片段。用相同的酶將載體pSEVA234限制性切割。使用HighPurePCRProductPurificationKit(Roche)純化片段。根據(jù)制造商說明書用T4DNA連接酶(ThermoFisherScientific)進(jìn)行片段連接以獲得pSEVA234-aroGD146N（表1）。將連接混合物引入電感受態(tài)大腸桿菌DH5α細(xì)胞(ElectroMAX?DH5α-E?CompetentCells;LifeTechnologies,Darmstadt)。使用GenePulserXcellSystem(BioRad,Hercules,CA)在0.2cm縫隙的電擊杯(BioRad,Hercules,CA)中電轉(zhuǎn)化(條件:~20ms指數(shù)式衰變脈沖,2.5kV/cm,25F,200Ω)后，將800μLLB回收培養(yǎng)基(Luria-Bertani;Roth,Karlsruhe)立即加入并且將懸浮液轉(zhuǎn)移至1.5mL微量離心管中。在37℃下1h后，將細(xì)胞懸浮液鋪至添加有50mg/L卡那霉素的LB瓊脂板(AbcrGmbH&Co.Kg,Karlsruhe)上，并在37℃下溫育過夜。收集克隆并經(jīng)限制性分析和測序驗(yàn)證正確的轉(zhuǎn)化。對于質(zhì)粒制備，菌株在15mL管中在3mLLB培養(yǎng)基和50mg/L卡那霉素中在37℃下以200rpm恒定搖動(dòng)培養(yǎng)14h-16h(KuhnerShakerISF-4-W;AdolfKühnerAG,Basel(Switzerland))。使用NucleoSpin?PlasmidPure試劑盒(Macherey&Nagel,Düren)按照制造商說明書進(jìn)行質(zhì)粒DNA純化。根據(jù)Choi等人(Choi等人,JMicrobiolMethods,2005,64(3):391)獲得電感受態(tài)惡臭假單胞菌KT2440、惡臭假單胞菌ΔtrpDC和惡臭假單胞菌ΔtrpDCΔpheA細(xì)胞。使用BioradGenePulserXcellElectroporator(2.5kV,200ohm,25μF)進(jìn)行電穿孔并且將細(xì)胞懸浮液鋪板到補(bǔ)充有50mg/L卡那霉素的LB瓊脂板上。這導(dǎo)致產(chǎn)生菌株惡臭假單胞菌KT2440/pSEVA234-aroGD46N、惡臭假單胞菌ΔtrpDC/pSEVA234-aroGD46N和惡臭假單胞菌ΔtrpDCΔpheA/pSEVA234-aroGD46N(表2)。另外，將空載體pSEVA234轉(zhuǎn)化入菌株惡臭假單胞菌ΔtrpDC和惡臭假單胞菌ΔtrpDCΔpheA以獲得菌株惡臭假單胞菌ΔtrpDC/pSEVA234和惡臭假單胞菌ΔtrpDCΔpheA/pSEVA234(表2)。oAB是L-色氨酸生物合成途徑的中間體并且通過鄰氨基苯甲酸合成酶來源于分支酸，所述鄰氨基苯甲酸合成酶由酰胺轉(zhuǎn)移酶（TrpE；供體：L-谷氨酰胺）和鄰氨基苯甲酸合成酶單元（TrpEG）組成，其在形成oAB和L-谷氨酸時(shí)釋放丙酮酸分子。編碼TrpEG的基因的表達(dá)增加已顯示導(dǎo)致大腸桿菌菌株中積累L-色氨酸(IkedaM,ApplMicrobiolBiotechnol,2006,69:615)。盡管如此，據(jù)報(bào)道，該酶受L-色氨酸的強(qiáng)烈反饋抑制，導(dǎo)致應(yīng)用TrpEG蛋白的反饋抗性形式。TrpEG蛋白的反饋抗性形式已基于來自鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)的trpEG序列進(jìn)行報(bào)道(IkedaM,ApplMicrobiolBiotechnol,2006,69:615)?；谑髠抽T氏菌基因，將最有利的trpEG形式trpEGS40F(SEQIDNo.53)在惡臭假單胞菌菌株中進(jìn)行表達(dá)。將trpEG基因的反饋抑制抗性形式克隆入惡臭假單胞菌載體pSEVA234以實(shí)現(xiàn)在菌株惡臭假單胞菌KT2440、惡臭假單胞菌ΔtrpDC和惡臭假單胞菌ΔtrpDCΔpheA中基于質(zhì)粒的表達(dá)(在lacIq-Ptrc系統(tǒng)的控制下；編碼卡那霉素抗性和pBBR1復(fù)制起點(diǎn))(Silva-Rocha等人,NucleicAcidsResearch,2013,D666-75)。使用BglII和BamHI限制酶和標(biāo)準(zhǔn)條件如上所述（實(shí)施例3）從供體質(zhì)粒將trpEGS40F基因限制性切割，產(chǎn)生2200bp片段。將載體pSEVA234用BamHI限制性切割，產(chǎn)生4550bp片段。使用HighPurePCRProductPurificationKit(Roche)純化片段。根據(jù)制造商說明書用T4DNA連接酶(ThermoFisherScientific)進(jìn)行片段連接以獲得pSEVA234-trpEGS40F（表1）。將連接混合物引入電感受態(tài)大腸桿菌DH5α細(xì)胞(ElectroMAX?DH5α-E?CompetentCells;LifeTechnologies,Darmstadt)。使用GenePulserXcellSystem(BioRad,Hercules,CA)在0.2cm縫隙的電擊杯(BioRad,Hercules,CA)中電轉(zhuǎn)化(條件:~20ms指數(shù)式衰變脈沖,2.5kV/cm,25F,200Ω)后，將800μLLB回收培養(yǎng)基(Luria-Bertani;Roth,Karlsruhe)立即加入并且將懸浮液轉(zhuǎn)移至1.5mL微量離心管中。在37℃下1h后，將細(xì)胞懸浮液鋪至添加有50mg/L卡那霉素的LB瓊脂板(AbcrGmbH&Co.Kg,Karlsruhe)上，并在37℃下溫育過夜。收集克隆并經(jīng)限制性分析和測序驗(yàn)證正確的轉(zhuǎn)化。對于質(zhì)粒制備，菌株在15mL管中在3mLLB培養(yǎng)基和50mg/L卡那霉素中在37℃下以200rpm恒定搖動(dòng)培養(yǎng)14h-16h(KuhnerShakerISF-4-W;AdolfKühnerAG,Basel(Switzerland))。使用NucleoSpin?PlasmidPure試劑盒(Macherey&Nagel,Düren)按照制造商說明書進(jìn)行質(zhì)粒DNA純化。根據(jù)Choi等人(Choi等人,JMicrobiolMethods,2005,64(3):391)獲得電感受態(tài)惡臭假單胞菌KT2440、惡臭假單胞菌ΔtrpDC和惡臭假單胞菌ΔtrpDCΔpheA細(xì)胞。使用BioradGenePulserXcellElectroporator(2.5kV,200ohm,25μF)進(jìn)行電穿孔并且將細(xì)胞懸浮液鋪板到補(bǔ)充有50mg/L卡那霉素的LB瓊脂板上。這導(dǎo)致產(chǎn)生菌株惡臭假單胞菌KT2440/pSEVA234-trpEGS40F、惡臭假單胞菌ΔtrpDC/pSEVA234-trpEGS40F和惡臭假單胞菌ΔtrpDCΔpheA/pSEVA234-trpEGS40F(表2)。將所產(chǎn)生的惡臭假單胞菌菌株(惡臭假單胞菌KT2440、惡臭假單胞菌ΔtrpDC/pSEVA234、惡臭假單胞菌ΔtrpDCΔpheA/pSEVA234、惡臭假單胞菌/pSEVA234-aroGD146N、惡臭假單胞菌/pSEVA234-trpEGS40F、惡臭假單胞菌ΔtrpDC/pSEVA234-aroGD146N、惡臭假單胞菌ΔtrpDC/pSEVA234-trpEGS40F、惡臭假單胞菌ΔtrpDCΔpheA/pSEVA234-aroGD146N、和惡臭假單胞菌ΔtrpDCΔpheA/pSEVA234-trpEGS40F(表2)針對其在搖瓶培養(yǎng)中作為oAB生產(chǎn)者的特性進(jìn)行表征。根據(jù)Wierckx等人(Wierckx等人,AEM,2005,71:8221)菌株在30℃下且以250rpm搖動(dòng)生長在基本培養(yǎng)基?；九囵B(yǎng)基的組成為：2g/L(NH4)2SO4,1.63g/LNaH2PO4,3.88g/LK2HPO4,0.1g/LMgSO4?7H2O,1.0mg/LCaCl2,10mg/LEDTA,5.0mg/LFeSO4·7H2O,1.0mg/LMnCl·H2O,2.0mg/LZnSO4?7H2O,0.2mg/LCuSO4·5H2O,0.4mg/LCoCl2?6H2O,0.2mg/LNa2MoO4?2H2O和5g/L葡萄糖。用5mol/L氫氧化鈉溶液將pH調(diào)節(jié)至7。將菌株在基本培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)并且以約0.1的OD600接種至500mL搖瓶中50mL的主培養(yǎng)物中。將攜帶質(zhì)粒菌株的培養(yǎng)物補(bǔ)充50mg/L卡那霉素。破壞trpDC基因的菌株的培養(yǎng)物另外補(bǔ)充有0.1mMl-色氨酸和破壞pheA基因的菌株的培養(yǎng)物另外補(bǔ)充有1mMl-苯丙氨酸。在中指數(shù)期開始時(shí)通過加入1mMIPTG誘導(dǎo)lacIq系統(tǒng)以實(shí)現(xiàn)oAB產(chǎn)生。菌株作為oAB生產(chǎn)者的特征如實(shí)施例3中所述進(jìn)行測量。在培養(yǎng)過程中，從1.5mL培養(yǎng)樣品中離線測量發(fā)酵OD600、葡萄糖濃度和鄰氨基苯甲酸濃度。使用光度計(jì)進(jìn)行OD600測量后，將每一樣品的1mL等分試樣在反應(yīng)管中以16000xg(5415R;Eppendorf,Hamburg)離心5min。經(jīng)HPLC-DAD(1100;AgilentTechnologies,SantaClara(USA))和YSI(YSI-Select2700;KreienbaumNeoscienceGmBH,Langenfeld)分析上清液。實(shí)施例3和實(shí)施例4的收集的數(shù)據(jù)顯示于表4。表1本發(fā)明中使用和/或生成的載體和質(zhì)粒表2本發(fā)明中使用和/或生成的細(xì)菌菌株名稱描述和相關(guān)基因型來源/參考大腸桿菌菌株DH5α;supE44,DlacU169(f80lacZDM15),hsdR17(rk-mk+),recA1,endA1,thi1,gyrA,relAHanahanandMeselson,1983大腸桿菌::trpD9923菌株W3110具有trpD9923突變E.coliGeneticResourceCenter(YaleUniversity)大腸桿菌::trpD9923?hpr框內(nèi)缺失trpD9923菌株中的hprBalderas-Hernandez等人,2009谷氨酸棒桿菌菌株ATCC13032DSMZ谷氨酸棒桿菌/pEKEx2菌株ATCC13032具有空表達(dá)載體pEKEx2本研究谷氨酸棒桿菌?trpD框內(nèi)缺失trpD(Cgl3032)本研究谷氨酸棒桿菌?csm框內(nèi)缺失csm(Cgl0853)本研究谷氨酸棒桿菌?trpD?csm框內(nèi)缺失trpD和csm本研究谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD1整合trpD1至谷氨酸棒桿菌?trpD本研究谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD2整合trpD2至谷氨酸棒桿菌?trpD本研究谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD3整合trpD3至谷氨酸棒桿菌?trpD本研究谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5整合trpD5至谷氨酸棒桿菌?trpD本研究谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD6整合trpD6至谷氨酸棒桿菌?trpD本研究谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5/pEKEx2?trpD::trpD5菌株具有空表達(dá)載體pEKEx2本研究谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5?csm?trpD::trpD5?csm菌株具有空表達(dá)載體pEKEx2本研究谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5?ptsG?trpD::trpD5菌株中框內(nèi)缺失ptsG(Cgl1360)本研究谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5?hpr?trpD::trpD5菌株中框內(nèi)缺失hpr(Cgl1937)本研究谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5?pepco?trpD::trpD5菌株中框內(nèi)缺失pepco(Cgl1585)本研究谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5?gpi?trpD::trpD5菌株中框內(nèi)缺失gpi(Cgl0851)本研究谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5?pyk?trpD::trpD5菌株中框內(nèi)缺失pyk(Cgl2089)本研究谷氨酸棒桿菌?trpD/pEKEx2-trpD1?trpD菌株中表達(dá)trpD1本研究谷氨酸棒桿菌?trpD/pEKEx2-trpD2?trpD菌株中表達(dá)trpD2本研究谷氨酸棒桿菌?trpD/pEKEx2-trpD3菌?trpD株中表達(dá)trpD3本研究谷氨酸棒桿菌?trpD/pEKEx2-trpD4?trpD菌株中表達(dá)trpD4本研究谷氨酸棒桿菌?trpD/pEKEx2-trpD5?trpD菌株中表達(dá)trpD5本研究谷氨酸棒桿菌?trpD/pEKEx2-trpD6?trpD菌株中表達(dá)trpD6本研究谷氨酸棒桿菌?csm/pEKEx2-csm1?csm菌株中表達(dá)csm1本研究谷氨酸棒桿菌?csm/pEKEx2-csm2?csm菌株中表達(dá)csm2本研究谷氨酸棒桿菌?csm/pEKEx2-csm3?csm菌株中表達(dá)csm3本研究谷氨酸棒桿菌?csm/pEKEx2-csm4?csm菌株中表達(dá)csm4本研究谷氨酸棒桿菌?csm/pEKEx2-csm5?csm菌株中表達(dá)csm5本研究谷氨酸棒桿菌?csm/pEKEx2-csm6?csm菌株中表達(dá)csm6本研究谷氨酸棒桿菌/pEKEx2-trpEGATCC13032菌株中表達(dá)trpEG(Cgl3029/31)本研究谷氨酸棒桿菌/pEKEx2-trpEGS38FATCC13032菌株中表達(dá)trpEGS38F本研究谷氨酸棒桿菌/pEKEx2-trpEGS38RATCC13032菌株中表達(dá)trpEGS38R本研究谷氨酸棒桿菌/pEKEx2-trpEGS40FATCC13032菌株中表達(dá)trpEGS40F本研究谷氨酸棒桿菌/pEKEx2-trpEGS40RATCC13032菌株中表達(dá)trpEGS40R本研究谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5/pEKEx2-trpEGS40F?trpD::trpD5菌株中表達(dá)trpEGS40F本研究谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5/pEKEx2-aroGD146N?trpD::trpD5菌株中表達(dá)aroGD146N(CP000948)本研究谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5/pEKEx2-aroGD146N-trpEGS40F?trpD::trpD5菌株中表達(dá)aroGD146N和trpEGS40F本研究谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5/pEKEx2-trpEGS40F-aroGD146N?trpD::trpD5菌株中表達(dá)trpEGS40F和aroGD146N本研究谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5?csmpEKEx2-aroGD146N-trpEGS40F?trpD::trpD5?csm菌株中表達(dá)aroGD146N和trpEGS40F本研究谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5/pEKEx2-aroK?trpD::trpD5菌株中表達(dá)aroK(Cgl1622)本研究谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5/pEKEx2-aroL?trpD::trpD5菌株中表達(dá)aroL(CP000948)本研究谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5/pCRB210菌株?trpD::trpD5具有空表達(dá)載體pCRB210本研究谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5/pCRB-glnA?trpD::trpD5菌株中表達(dá)glnA(Cgl2214)本研究谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5?ptsG/pSB084?trpD::trpD5?ptsG菌株中表達(dá)ppgk(Cgl1910)和iolT2本研究谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5?ptsG/pSB083?trpD::trpD5?ptsG菌株中表達(dá)ppgk和galP(Cgl2409)本研究谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5?hpr/pSB084?trpD::trpD5?hpr菌株中表達(dá)ppgk和iolT2(Cgl3058)本研究谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5?hpr/pSB083?trpD::trpD5?hpr菌株中表達(dá)ppgk和galP本研究谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5/pSB072?trpD::trpD5菌株中表達(dá)ppk(Cgl2862)本研究谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5/pSB073?trpD::trpD5菌株中表達(dá)pps(Cgl0552/1)本研究谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5/pSB074?trpD::trpD5菌株中表達(dá)talCG(Cgl1575)本研究谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5/pSB075?trpD::trpD5菌株中表達(dá)tktCG(Cgl1574)本研究谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5/pSB076?trpD::trpD5菌株中表達(dá)talEC(ECDH10B_2629)本研究谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5/pSB077?trpD::trpD5菌株中表達(dá)tktEC(ECDH10B_3110)本研究谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5/pSB078?trpD::trpD5菌株中表達(dá)zwf1(Cgl1576)和opcA(Cgl1577)本研究谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5/pSB085?trpD::trpD5菌株中表達(dá)tktCG和talCG本研究谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5/pSB086?trpD::trpD5菌株中表達(dá)tktEC和talEC本研究谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5/pSB096?trpD::trpD5菌株中表達(dá)qsuA(CgR0492)本研究惡臭假單胞菌菌株KT2440mt-2衍生物恢復(fù)TOL質(zhì)粒pWW0Bagdasarian等人,1981惡臭假單胞菌?trpDC/pSEVA234框內(nèi)缺失trpDC(PP_0422)具有空表達(dá)載體pSEVA234本研究惡臭假單胞菌?trpDC?pheA/pSEVA234框內(nèi)缺失pheA(PP_1769)具有空表達(dá)載體pSEVA234本研究惡臭假單胞菌/pSEVA234-aroGD46NKT2440菌株中表達(dá)aroGD46N本研究惡臭假單胞菌/pSEVA234-trpEGS40FKT2440菌株中表達(dá)trpEGS40F本研究惡臭假單胞菌?trpDC/pSEVA234-aroGD46N?trpDC菌株中表達(dá)aroGD46N本研究惡臭假單胞菌?trpDC/pSEVA234-trpEGS40F?trpDC菌株中表達(dá)trpEGS40F本研究惡臭假單胞菌?trpDC?pheA/pSEVA234-aroGD46N?trpDC?pheA菌株中表達(dá)aroGD146N本研究惡臭假單胞菌?trpDC?pheA/pSEVA234-trpEGS40F?trpDC?pheA菌株中表達(dá)trpEGS40F本研究表3本發(fā)明中使用的引物表4針對本發(fā)明中使用和/或生成的細(xì)菌菌株的oAB生產(chǎn)的表征（CDW：細(xì)胞干重；Y：產(chǎn)率；μmax:最大生長速率；STY:時(shí)空產(chǎn)率）。實(shí)施例5-在具有細(xì)胞保留的連續(xù)發(fā)酵罐中培養(yǎng)谷氨酸棒桿菌使用連續(xù)發(fā)酵用于生產(chǎn)鄰氨基苯甲酸以實(shí)現(xiàn)優(yōu)化的時(shí)空產(chǎn)率。在連續(xù)發(fā)酵過程中應(yīng)用細(xì)胞保留系統(tǒng)以增加生物質(zhì)濃度而不增加補(bǔ)料溶液的葡萄糖濃度。使用兩種不同的系統(tǒng)用于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的細(xì)胞保留：來自JMWaterSeparations(WaterSepTechnologyCorporation,Marlborough,MA,USA)的具有750kDa的截止值的空纖維過濾模塊和來自PneumaticScaleAngelus(AllenRoad,Stow,OH,USA)的一次性離心機(jī)(CentritechLabIII)。兩種系統(tǒng)均連接至1L實(shí)驗(yàn)室規(guī)模生物反應(yīng)器(OmniFerm,HiTecZang,Herzogenrath,Germany)。過濾模塊的整合顯示于圖30且離心機(jī)的整合顯示于圖31。菌株谷氨酸棒桿菌?trpD的連續(xù)發(fā)酵使用填充有50mL無菌BHIS培養(yǎng)基（其含有37g/L心腦浸出物（BHI）和91g/L山梨醇）的無菌250mLErlenmeyer瓶制備谷氨酸棒桿菌?trpD（參見表2）的預(yù)培養(yǎng)物。在28℃下以140rpm搖動(dòng)頻率溫育24h導(dǎo)致6.0的OD600。將9mL的培養(yǎng)體積轉(zhuǎn)移至91mL新鮮CGXII-MOPS來源的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基包含42g/LMOPS緩沖劑、20g/L(NH4)2SO4、5g/L尿素、3.7g/L腦心浸出物、9.1g/L山梨醇、1g/LKH2PO4、1g/LK2HPO4、0.25g/LMgSO4?7H2O、0.01g/LCaCl2和10g/L葡萄糖（分開高壓滅菌）。無菌過濾后加入以下組分：2mg/L生物素、0.1mMl-色氨酸、0.01g/LMnSO4·H2O、0.01g/LFeSO4·7H2O、1mg/LZnSO4?7H2O、0.2mg/LCuSO4·5H2O、0.02mg/LNiCl2?6H2O和0.03g/L3.4-二羥基苯甲酸。在500mLErlenmeyer瓶中在28℃下以140rpm的搖動(dòng)頻率溫育100mL培養(yǎng)體積產(chǎn)生18.7的OD600。將27mL的培養(yǎng)體積離心，丟棄上清液并將沉淀重懸于25mL無菌等滲PBS緩沖液中。將懸浮液用1L無菌CGXII來源培養(yǎng)基注射入發(fā)酵罐中，所述CGXII培養(yǎng)基包含20g/L(NH4)2SO4,1g/LKH2PO4,1g/LK2HPO4,0.25g/LMgSO4?7H2O,0.01g/LCaCl2,100μL/L聚丙二醇和10g/L葡萄糖(分開高壓滅菌)。無菌過濾后加入以下組分：2mg/L生物素、0.1mMl-色氨酸、0.01g/LMnSO4·H2O、0.01g/LFeSO4·7H2O、1mg/LZnSO4?7H2O、0.2mg/LCuSO4·5H2O、0.02mg/LNiCl2?6H2O和0.03g/L3.4-二羥基苯甲酸。在連續(xù)操作過程中對補(bǔ)料使用相同培養(yǎng)基。通過調(diào)節(jié)攪拌器速度為200-1200rpm將溶解氧濃度控制在30%。對于充氣調(diào)節(jié)0.2l/h空氣的恒定氣流速率并且用1MNH4OH將pH控制在pH7。發(fā)酵結(jié)果顯示于圖32中。在前24h內(nèi)的批次時(shí)期過程中，消耗葡萄糖和產(chǎn)生生物質(zhì)和oAB。24h的培養(yǎng)時(shí)間后通過給料50mL/h無菌培養(yǎng)基并清除50mL/h包含生物質(zhì)和oAB的發(fā)酵液將發(fā)酵罐切換至連續(xù)操作。在連續(xù)培養(yǎng)過程中實(shí)現(xiàn)oAB的恒定生產(chǎn)。100h的培養(yǎng)時(shí)間后，使用圖30中說明的切向流超濾開始細(xì)胞保留。通過如圖32中顯示的細(xì)胞保留實(shí)現(xiàn)干細(xì)胞重的增加。菌株谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5?gpi的連續(xù)發(fā)酵使用填充有50mL無菌BHIS培養(yǎng)基（其含有37g/L腦心浸出物（BHI）和91g/L山梨醇）的無菌250mLErlenmeyer瓶制備谷氨酸棒桿菌?trpD::trpD5?gpi（表2）的預(yù)培養(yǎng)物。在28℃下以140rpm搖動(dòng)頻率溫育24h得到8.2的OD600。將10mL的培養(yǎng)體積轉(zhuǎn)移至90mLCGXII-MOPS來源的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基包含42g/LMOPS緩沖劑、20g/L(NH4)2SO4、5g/L尿素、3.7g/L腦心浸出物、9.1g/L山梨醇、1g/LKH2PO4、1g/LK2HPO4、0.25g/LMgSO4?7H2O、0.01g/LCaCl2和10g/L葡萄糖（單獨(dú)高壓滅菌）。無菌過濾后加入以下組分：2mg/L生物素、0.01g/LMnSO4·H2O、0.01g/LFeSO4·7H2O、1mg/LZnSO4?7H2O、0.2mg/LCuSO4·5H2O、0.02mg/LNiCl2?6H2O、和0.03g/L3.4-二羥基苯甲酸。在兩個(gè)250mLErlenmeyer瓶中在30℃下以300rpm的搖動(dòng)頻率溫育100mL培養(yǎng)體積產(chǎn)生20.5的OD600。將55mL培養(yǎng)液體積用1L無菌CGXII來源培養(yǎng)基注射入發(fā)酵罐中，所述CGXII培養(yǎng)基包含20g/L(NH4)2SO4、1g/LKH2PO4、1g/LK2HPO4、0.25g/LMgSO4?7H2O、0.01g/LCaCl2、100μL/L聚丙二醇和10g/L葡萄糖(單獨(dú)高壓滅菌)。無菌過濾后加入以下組分：2mg/L生物素、0.01g/LMnSO4·H2O、0.01g/LFeSO4·7H2O、1mg/LZnSO4?7H2O、0.2mg/LCuSO4·5H2O、0.02mg/LNiCl2?6H2O、和0.03g/L3.4-二羥基苯甲酸。將包含20g/L(NH4)2SO4、10g/LKH2PO4、10g/LK2HPO4、2.5g/LMgSO4?7H2O、0.1g/LCaCl2、2mL/L聚丙二醇和100g/L葡萄糖(單獨(dú)高壓滅菌)的高濃縮培養(yǎng)基用于補(bǔ)料。無菌過濾后加入以下組分：20mg/L生物素、0.1g/LMnSO4·H2O、0.1g/LFeSO4·7H2O、10mg/LZnSO4?7H2O、2mg/LCuSO4·5H2O、0.2mg/LNiCl2?6H2O、和0.3g/L3.4-二羥基苯甲酸。通過調(diào)節(jié)攪拌器速度為200-1400rpm將溶解氧濃度控制在30%。對于充氣調(diào)節(jié)0.2l/h空氣的恒定氣流速率并且用1MNH4OH和1MHCl將pH控制在pH7。發(fā)酵結(jié)果顯示于圖33中。在前40h內(nèi)的批次時(shí)期過程中，消耗葡萄糖和產(chǎn)生生物質(zhì)和oAB。40h的培養(yǎng)時(shí)間后通過給料10mL/h培養(yǎng)基并清除10mL/h包含生物質(zhì)和oAB的發(fā)酵液將發(fā)酵罐切換至連續(xù)操作。在連續(xù)操作開始時(shí)，生物質(zhì)濃度沒有高至足以完全消耗補(bǔ)料溶液中添加的葡萄糖，導(dǎo)致如圖33中顯示的反應(yīng)器中葡萄糖的積累。136h后，細(xì)胞濃度高至足以完全消耗添加的葡萄糖。184h后使用離心機(jī)開始細(xì)胞保留，如圖31中所示。通過如圖33中圖示的細(xì)胞循環(huán)實(shí)現(xiàn)干細(xì)胞重的增加。在400h連續(xù)發(fā)酵過程中實(shí)現(xiàn)oAB的恒定生產(chǎn)。菌株谷氨酸棒桿菌?trpD用復(fù)雜碳源的連續(xù)發(fā)酵使用填充有50mL無菌BHIS培養(yǎng)基（其含有37g/L心腦浸出物（BHI）和91g/L山梨醇）的無菌250mLErlenmeyer瓶制備谷氨酸棒桿菌?trpD（表2）的預(yù)培養(yǎng)物。在28℃下以140rpm搖動(dòng)頻率溫育24h得到7.53的OD600。將7mL的培養(yǎng)體積轉(zhuǎn)移至93mL新鮮CGXII-MOPS來源的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基包含42g/LMOPS緩沖劑、20g/L(NH4)2SO4、5g/L尿素、3.7g/L腦心浸出物、9.1g/L山梨醇、1g/LKH2PO4、1g/LK2HPO4、0.25g/LMgSO4?7H2O、0.01g/LCaCl2和10g/L葡萄糖（單獨(dú)高壓滅菌）。無菌過濾后加入以下組分：2mg/L生物素、0.1mMl-色氨酸、0.01g/LMnSO4·H2O、0.01g/LFeSO4·7H2O、1mg/LZnSO4?7H2O、0.2mg/LCuSO4·5H2O、0.02mg/LNiCl2?6H2O和0.03g/L3.4-二羥基苯甲酸。在500mLErlenmeyer瓶中在28℃下以140rpm的搖動(dòng)頻率溫育100mL培養(yǎng)體積產(chǎn)生21.3的OD600。將25mL的培養(yǎng)體積離心，丟棄上清液并將沉淀重懸于25mL無菌等滲PBS緩沖液中。將懸浮液用1L無菌CGXII來源培養(yǎng)基注射入發(fā)酵罐中，所述CGXII培養(yǎng)基包含20g/L(NH4)2SO4、1g/LKH2PO4、1g/LK2HPO4、0.25g/LMgSO4?7H2O、0.01g/LCaCl2、100μL/L聚丙二醇2000和10g/L葡萄糖(單獨(dú)高壓滅菌)。無菌過濾后加入以下組分：2mg/L生物素、0.1mMl-色氨酸、0.01g/LMnSO4·H2O、0.01g/LFeSO4·7H2O、1mg/LZnSO4?7H2O、0.2mg/LCuSO4·5H2O、0.02mg/LNiCl2?6H2O和0.03g/L3.4-二羥基苯甲酸。相同培養(yǎng)基用于在連續(xù)操作的前772小時(shí)過程中補(bǔ)料（補(bǔ)料培養(yǎng)基1）。772小時(shí)后，將補(bǔ)料組合物改變?yōu)檠a(bǔ)料培養(yǎng)基2，其包含40g/L(NH4)2SO4、0,5g/LKH2PO4、5mL/L玉米漿(SigmaAldrich、C4648,批號:MKBP5720V)、1mL/L聚丙二醇、267g/L葡萄糖漿(CargillC*SweetD02767,批號:03285882)（單獨(dú)高壓滅菌，以實(shí)現(xiàn)補(bǔ)料溶液中200g/L的終葡萄糖濃度）和0.1mMl-色氨酸（高壓滅菌后無菌過濾和添加）。通過調(diào)節(jié)攪拌器速度為200-1200rpm將溶解氧濃度控制在30%。對于充氣調(diào)節(jié)0.2l/h空氣的恒定氣流速率并且用1MNH4OH將pH控制在pH7。用補(bǔ)料培養(yǎng)基2連續(xù)發(fā)酵的結(jié)果顯示于圖34中。用補(bǔ)料培養(yǎng)基1連續(xù)進(jìn)行的772h沒有顯示。連續(xù)細(xì)胞保留通過如圖30中說明的切向流超濾實(shí)現(xiàn)并且在如圖34中所示的培養(yǎng)過程中實(shí)現(xiàn)鄰氨基苯甲酸的連續(xù)生產(chǎn)。由于葡萄糖的積累，連續(xù)操作如通過圖34中的停止期所示臨時(shí)中斷。待葡萄糖水平降低后重啟補(bǔ)料和收獲。實(shí)施例6-鄰氨基苯甲酸（AA）的吸附/解吸附為了獲得鄰氨基苯甲酸（AA），具有更高濃度的溶液，通過進(jìn)行吸附-解吸附操作將AA從水溶液中轉(zhuǎn)移至有機(jī)溶劑中。為此，測試了AA對不同類型的吸附劑的吸附能力。選擇ZeoliteY(ZeolystInternational,目錄號CBV600)andZSM5(Süd-Chemie/Clariant目錄號H-MFI-27)作為沸石，其作為不同分子的分子篩起作用。由于羥磷灰石(Ca10(PO4)6(OH)2)(Sigma-Aldrich目錄號289396)吸附AA和不同溶劑中的一些其他類似化合物的能力而對其進(jìn)行測試。吸附測試：將吸附劑在300℃下煅燒3h以釋放任何殘留水分。制備AA在水中（0.5wt%）的溶液。將20mL的該溶液轉(zhuǎn)移至包含0.2g吸附劑的50mL瓶中。攪拌下的某一段時(shí)期后，通過HPLC分析AA在水中的濃度。水中AA濃度的降低被視為經(jīng)吸附的AA。金屬交換的沸石的合成：給定包含Ca的沸石的改進(jìn)的吸附能力(根據(jù)W.H.Goodman,US4910336,1990)，通過例子交換制備Ca交換的沸石以在AA吸附中測試(S.M.Seo,S.Y.Coi,J.M.Suh,K.J.Jung,N.H.HeoandW.T.Lim,Bull.KoreanChem.Soc.2009,30:1703)。將3g作為粉末的沸石加入到Ca(NO3)2.4H2O(0.5M)溶液中。將漿液攪拌4h并隨后通過新鮮的溶液將溶液進(jìn)行置換并將該程序再重復(fù)兩次。最后，通過離心分離固體并在80℃下干燥并在300℃下焙燒3h。用如上所述的相同方法制備使用K、Na、Mg和Fe的四種其他金屬交換的沸石Y。隨后將樣品標(biāo)記為K-Y、Na-Y、Ca-Y、Mg-Y和Fe-Y。沸石H-ZSM5的孔徑可以在0.4-0.6nm的范圍內(nèi)，優(yōu)選0.5nm。沸石H-Y的孔徑可以在0.6nm-0.9nm范圍內(nèi)，優(yōu)選0.7-0.9nm(例如，如獲自ZeolystInternational,目錄號CBV600)。使用上文提及的吸附劑進(jìn)行AA的吸附測試。這些測試的結(jié)果顯示于表6中。表6：AA0.5%的吸附吸附劑HAPH-ZSM5H-YNa-YK-YMg-YCa-YFe-Y吸附能力（gAA/kg吸附劑）10.8g/kg11.6g/kg24.8g/kg25.0g/kg27.4g/kg27.6g/kg36.8g/kg51.2g/kg沸石Y在從水溶液吸附AA上顯示出最高能力。Ca交換的沸石Y可以改進(jìn)AA的吸附至接近50%。Fe交換的沸石Y可以改進(jìn)AA的吸附至接近翻倍。利用在蒸餾水中以及在包含(NH4)2SO4(20g/L)、Na2HPO4(1g/L)、KH2PO4(1g/L)和MgSO4(0.25g/L)的緩沖液中的AA溶液進(jìn)行測試。稍后，從緩沖液中消除MgSO4，因?yàn)槠湟鸩蝗苄脏彴被郊姿徭V鹽的形成。在上述金屬交換的沸石中，F(xiàn)e-Y顯示出最高的AA吸附能力（高于50gAA/kgFe-Y）。幸運(yùn)地是，緩沖液內(nèi)容物不影響AA的吸附并且吸附能力與在蒸餾水中的那些類似。吸附測試后Fe-Y樣品的IR譜顯示AA的一些特征峰，其可以是在最可能與Fe螯合的Fe-Y表面上存在AA的證據(jù)。表7：在蒸餾水和緩沖水溶液中接觸10和60分鐘后金屬交換的沸石Y的AA吸附能力a。吸附劑Na-YK-YMg-YCa-YFe-Y蒸餾水（10min）24.229.629.236.250.6蒸餾水（60min）22.631.63442.254.2緩沖溶液（10min）2527.427.636.851.2緩沖溶液（60min）25.922.322.825.645.3agAA/kg吸附劑。通過ICP-MS分析吸附測試后的Fe-Y和新鮮的Fe-Y樣品。該分析顯示在兩種樣品中Fe/Al比率分別為1.25和1.3，其彼此非常接近。因此，F(xiàn)e浸出的量是可忽略的。在Ca-Y的情況下，吸附測試后檢測到64%Ca浸出。使用裝備有質(zhì)量分析儀的熱重量分析儀(TGA-MS)在高至550℃的溫度下研究在Fe-Y上解吸附的AA的分解。如圖7中可見，在低于400℃的溫度下沒有形成ANL。在高于400℃下，AA直接分解為聚苯胺，其作為樣品架上的黑色材料被觀察到。在高于400℃下檢測到小量的ANL。因此，吸附劑上吸附的AA直接熱轉(zhuǎn)化為ANL是不成功的。AA從吸附劑解吸附至液相AA從Fe-Y至水中的解吸附測試顯示通過金屬交換的沸石在水溶液中吸附AA是可逆的。隨后，測試AA解吸附進(jìn)入有機(jī)溶劑中。選擇1-十二烷醇作為有機(jī)溶劑，這是由于AA在其中的高溶解度以及其在水中非常低的可混合性(0.004g/L)。此外，其沸點(diǎn)(259℃)比苯胺(183℃)和水高得多，從而其從最終混合物中分離更為方便。通過將包含10.8mgAA的0.2gFe-Y懸浮在2mL1-十二烷醇中進(jìn)行AA從Fe-Y解吸附至1-十二烷醇。將漿料在25-120℃溫度范圍下攪拌0.5h。解吸附結(jié)果顯示于圖8中，其中最多27.8%AA可以在120℃下解吸附至1-十二烷醇相中。實(shí)施例7-通過在有機(jī)溶劑中熱脫羧的鄰氨基苯甲酸脫羧為苯胺的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)溶解于1-十二烷醇的AA的脫羧測試160℃下溶解于1-十二烷醇中的AA3wt%的脫羧。篩選具有不同特征的催化劑。結(jié)果可見于圖9中。沒有任何催化劑的空白測試顯示僅1.4%轉(zhuǎn)化，而在沸石Y(CBV600,“GO257”)存在的情況下導(dǎo)致在1h內(nèi)超過70%轉(zhuǎn)化為ANL。經(jīng)沸石Y(CBV600,“GO257”)的高AA轉(zhuǎn)化可能是由于其高度的酸性特征以及孔徑(0.7-0.8nm)。盡管具有酸性特征，但ZSM5(MFI-27)具有更小的孔徑（0.5nm）從而AA分子無法滲透入它們并且因此無法接近活性位點(diǎn)。鋁碳酸鎂(HTC,Mg6Al2(CO3)(OH)16.4H2O)具有堿性特征并且AA的低轉(zhuǎn)化表明堿性位點(diǎn)在AA脫羧中不像酸性位點(diǎn)一樣有活性。向沸石H-Y(“GO257”)添加Na降低其酸性特征并且因此實(shí)現(xiàn)AA的低轉(zhuǎn)化。氨形式(CBV500,“GO55”)也比H-Y(CBV600,“GO257”)具有更低數(shù)目的酸性位點(diǎn)。如圖10中可見，在160℃和180℃下1-十二烷醇中AA脫羧概況顯示AA轉(zhuǎn)化和ANL形成遵循零級動(dòng)力學(xué)。在160℃和180℃下反應(yīng)的模擬模型可以計(jì)算速率系數(shù)分別為0.235molL-1.h-1和0.522mol.L-1.h-1。這些反應(yīng)至ANL的選擇性為100%且觀察到95-110%(平均值為100.4%)的質(zhì)量平衡。溶解于苯胺的AA的脫羧苯胺對于AA是比十二烷醇好得多的溶劑并且也是脫羧的產(chǎn)物，相比于1-十二烷醇，其使用具有大的優(yōu)勢。我們發(fā)現(xiàn)高至30%AA可以在室溫(20℃)下溶解于苯胺中，高至40%AA可以在50℃下溶解于苯胺中，且高至50%AA可以在90℃下溶解。測試160、180和200℃下溶解于苯胺中的AA40wt%的脫羧。沒有任何催化劑的空白測試如之前顯示出可忽略的轉(zhuǎn)化，而在沸石Y(CBV600,“GO257”)存在的情況下導(dǎo)致在2h內(nèi)超過99%轉(zhuǎn)化為ANL。結(jié)果顯示于圖35中。我們還可以根據(jù)簡單動(dòng)力學(xué)模型擬合數(shù)據(jù)：其中“r”為以g苯胺/g催化劑/小時(shí)計(jì)的反應(yīng)速率，“k0”為也以g苯胺/g催化劑/小時(shí)計(jì)的動(dòng)力學(xué)常數(shù)，“Ea”為以kJ/mol計(jì)的反應(yīng)活化能，“R”為8.31J/Kmol的理想氣體常數(shù)，“T”為以K計(jì)的溫度，“AA”為AA的濃度，而“n”為反應(yīng)級數(shù)。圖35還顯示在不同溫度下擬合該反應(yīng)模型。擬合結(jié)果可以概述如下：k0=55492gAN/gCAThEa=37.4kJ/moln=0.16。圖35顯示在含催化劑的苯胺中2-氨基苯甲酸（鄰氨基苯甲酸，AA）的分解。顯示了在160℃、180℃和200℃下在沸石Y存在的情況下40wt%溶解于苯胺中的鄰氨基苯甲酸（AA）的脫羧動(dòng)力學(xué)。將鄰氨基苯甲酸（40wt%）溶解于苯胺中。在該濃度，酸一旦加熱至約50℃則完全可溶于有機(jī)溶劑。將80mL上述溶液隨后轉(zhuǎn)移至160mL的高壓滅菌器中，加入1.5g沸石催化劑并加熱至160℃、180℃或200℃。以不同時(shí)間間隔取樣并且通過HPLC方法分析以確定苯胺形成速率。在水存在的情況下溶解于苯胺的AA的脫羧由于從結(jié)晶過程中分離的鄰氨基苯甲酸可能存在一些殘留水分（約10%），我們決定在存在水的情況下看看反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。進(jìn)行與之前類似的實(shí)驗(yàn)，例外是目的性地向反應(yīng)混合物中加入10wt%水。我們發(fā)現(xiàn)總體動(dòng)力學(xué)和反應(yīng)概況保持不變。反應(yīng)溫度200℃的結(jié)果顯示于圖36中。圖36顯示在含催化劑的苯胺中2-氨基苯甲酸（鄰氨基苯甲酸，AA）的分解。顯示了在200℃下在沸石Y存在的情況下40wt%溶解于苯胺中和10%水-90%苯胺中的鄰氨基苯甲酸（AA）的脫羧動(dòng)力學(xué)。將鄰氨基苯甲酸（40wt%）溶解于苯胺中。在該濃度，酸一旦加熱至約50℃則完全可溶于有機(jī)溶劑。將80mL上述溶液隨后轉(zhuǎn)移至160mL的高壓滅菌器中，隨后加入10%(8g)的水，加入1.5g沸石催化劑并加熱至160℃、180℃或200℃。以不同時(shí)間間隔取樣并且通過HPLC方法分析以確定苯胺形成速率。來自不同有機(jī)來源的溶解于苯胺的AA的脫羧根據(jù)本發(fā)明，可以通過發(fā)酵不同糖培養(yǎng)基生物產(chǎn)生鄰氨基苯甲酸?？梢灶A(yù)期不同培養(yǎng)基中存在的痕量元素（即水解玉米淀粉、甘蔗汁或葡萄糖）中的差異可能影響應(yīng)該進(jìn)一步脫羧為苯胺的鄰氨基苯甲酸。為了驗(yàn)證這些差異是否干擾催化劑和脫羧反應(yīng)，測試通過結(jié)晶從不同生長培養(yǎng)基中分離的不同鄰氨基苯甲酸。比較始終針對由實(shí)驗(yàn)室供應(yīng)商SigmaAldrich購買的化學(xué)純的鄰氨基苯甲酸來進(jìn)行。不同AA在相同條件中如之前測試來進(jìn)行測試，在180℃從40%AA的苯胺溶液開始。結(jié)果概述于圖47中。所有AA來源在低于90分鐘內(nèi)完全轉(zhuǎn)化為苯胺。最快的轉(zhuǎn)化由純化學(xué)品材料(Aldrich)顯示。這與由化學(xué)純的葡萄糖（VN35）發(fā)酵產(chǎn)生的材料是相當(dāng)?shù)?。略微更低的是分離自水解玉米淀粉（VN32和33）的材料，隨后是分離自甘蔗汁（VN34）的材料。該順序遵循所用培養(yǎng)基的精煉程度。最純的糖源導(dǎo)致從中分離的AA更快地分解。這可以通過存在痕量元素如鐵或礦物質(zhì)來解釋，其能夠干擾沸石催化劑。然而，該影響如此有限以至于無法干擾脫羧反應(yīng)，其迅速進(jìn)行至完成而與AA來源無關(guān)。圖37顯示在含催化劑的苯胺中2-氨基苯甲酸（鄰氨基苯甲酸，AA）的分解。顯示了在180℃下在沸石Y存在的情況下40wt%溶解于苯胺中的鄰氨基苯甲酸（AA）的脫羧動(dòng)力學(xué)。通過結(jié)晶從不同的糖培養(yǎng)基（如化學(xué)純的葡萄糖、水解玉米淀粉和甘蔗汁）獲得鄰氨基苯甲酸。將所分離的鄰氨基苯甲酸（40wt%）溶解于苯胺中。在該濃度，酸一旦加熱至約50℃則完全可溶于有機(jī)溶劑。將80mL上述溶液隨后轉(zhuǎn)移至160mL的高壓滅菌器中，加入1.5g沸石催化劑并加熱至180℃。以不同時(shí)間間隔取樣并且通過HPLC方法分析以確定苯胺形成速率。來自水解玉米淀粉的溶解于苯胺中的AA脫羧的催化劑穩(wěn)定性考慮之前觀察的痕量元素的影響，我們測試了若干運(yùn)行中的催化劑穩(wěn)定性。我們這樣進(jìn)行：通過循環(huán)催化劑并且通過將其用于以下反應(yīng)而無任何洗滌步驟，隨后為之前所述的反應(yīng)程序。結(jié)果顯示于圖38中。新鮮制備的催化劑和重復(fù)使用的催化劑之間的活性差異很小。重復(fù)使用的似乎比新鮮系統(tǒng)甚至更快或更好。這顯示痕量元素對催化劑沒有毒性或抑制影響，所述催化劑在脫羧基反應(yīng)中保持活性。為了進(jìn)一步驗(yàn)證，我們事后分析了催化劑并將其與新鮮制備的催化劑進(jìn)行了比較。2種催化劑的IR譜顯示于圖39中。除了一些被吸收的苯胺種類，僅存在OH信號的小幅降低。該OH可以在與其他離子（痕量元素）交換后淬滅，然而它們可能不是用于催化反應(yīng)的活性位點(diǎn)，因?yàn)榉惺膹?qiáng)酸性來自Al-O-Si橋鍵。圖38顯示在含催化劑的苯胺中2-氨基苯甲酸（鄰氨基苯甲酸，AA）的分解。顯示了在180℃下在沸石Y存在的情況下40wt%溶解于苯胺中的鄰氨基苯甲酸（AA）的脫羧動(dòng)力學(xué)。通過從水解玉米淀粉結(jié)晶獲得鄰氨基苯甲酸。將所分離的鄰氨基苯甲酸（40wt%）溶解于苯胺中。在該濃度，酸一旦加熱至約50℃則完全可溶于有機(jī)溶劑。將80mL上述溶液隨后轉(zhuǎn)移至160mL的高壓滅菌器中，加入1.5g沸石催化劑并加熱至180℃。分離催化劑并在沒有進(jìn)一步處理或洗滌的情況下再循環(huán)用于后續(xù)的反應(yīng)。以不同時(shí)間間隔取樣并且通過HPLC方法分析以確定苯胺形成速率。圖39顯示了新鮮制備的H-Y催化劑的IR譜和如上使用分離自水解的玉米淀粉的AA的反應(yīng)后的催化劑的IR譜。標(biāo)記苯胺的典型條帶。的確發(fā)生了這種高度堿性種類的吸收。也凸顯了OH區(qū)。OH信號的減少與一些部分離子交換一致，其利用存在的痕量元素發(fā)生，然而，OH組似乎在催化反應(yīng)中沒有活性，但可能是Al-O-Si橋鍵的作用。實(shí)施例8來自發(fā)酵液的oAB的溶解和結(jié)晶將工業(yè)糖源用于谷氨酸棒桿菌的發(fā)酵。將具有21.5g/L葡萄糖、3.7g/L乳酸含量的100ml培養(yǎng)基與10g鄰氨基苯甲酸在250ml實(shí)驗(yàn)室反應(yīng)器中混合。漿料具有4.7的pH值。oAB室溫下在pH4.5的溶解度約為4.5g/L。隨后，將9.12gNaOH（32%）分4次加入直至形成溶液。溶液具有8.3的pH值。隨后，在1小時(shí)內(nèi)加入7gHCl(37%)。通過添加HCl，第一次成核從5.8的pH值發(fā)生。添加過程中晶體數(shù)目增加。添加結(jié)束時(shí)，懸浮液具有3.6的pH值。隨后，將漿料攪拌1小時(shí)。最后，過濾漿料。過濾：根據(jù)VDI指南“VDI2762”在0.2bar和12.6cm2的濾器面積進(jìn)行過濾。將125g懸浮液過濾并用25g水洗滌。測量91g的母液和23.1g濕固體。根據(jù)“VDI2762”測定的濾餅阻抗計(jì)算為5x10101/m2。將濾餅在干燥爐中干燥。干燥后，測量到9.1g干固體，對應(yīng)于91%的產(chǎn)率。母液中的鄰氨基苯甲酸的分?jǐn)?shù)為0.72%。測定固體的灰分含量作為鄰氨基苯甲酸的鹽含量的指示。測定的灰分含量為0.55%。實(shí)施例9-oAB在1-十二烷醇中的溶解度用漸增溫度測試oAB在十二烷醇中的溶解度。SLE=固液平衡oAB在1-十二烷醇中的溶解度隨溫度升高而增加。序列表<110>BayerMaterialScienceAG<120>生產(chǎn)鄰氨基苯甲酸和/或鹽的重組菌株和經(jīng)2-氨基苯甲酸從可再生資源發(fā)酵生產(chǎn)苯胺<130>BMS131142WO<150>EP14155936.9<151>2014-02-20<160>110<170>PatentIn版本n3.5<210>1<211>1047<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<400>1atgacttctccagcaacactgaaagttctcaacgcctacttggataaccccactccaacc60ctggaggaggcaattgaggtgttcaccccgctgaccgtgggtgaatacgatgacgtgcac120atcgcagcgctgcttgccaccatccgtactcgcggtgagcagttcgctgatattgccggc180gctgccaaggcgttcctcgcggcggctcgtccgttcccgattactggcgcaggtttgcta240gattccgctggtactggtggcgacggtgccaacaccatcaacatcaccaccggcgcatcc300ctgatcgcagcatccggtggagtgaagctggttaagcacggcaaccgttcggtgagctcc360aagtccggctccgccgatgtgctggaagcgctgaatattcctttgggccttgatgtggat420cgtgctgtgaagtggttcgaagcgtccaacttcaccttcctgttcgcacctgcgtacaac480cctgcgattgcgcatgtgcagccggttcgccaggcgctgaaattccccaccatcttcaac540acgcttggaccattgctgtccccggcgcgcccggagcgtcagatcatgggcgtggccaat600gccaatcatggacagctcatcgccgaggtcttccgcgagttgggccgtacacgcgcgctt660gttgtgcatggcgcaggcaccgatgagatcgcagtccacggcaccaccttggtgtgggag720cttaaagaagacggcaccatcgagcattacaccatcgagcctgaggaccttggccttggc780cgctacacccttgaggatctcgtaggtggcctcggcactgagaacgccgaagctatgcgc840gctactttcgcgggcaccggccctgatgcacaccgtgatgcgttggctgcgtccgcaggt900gcgatgttctacctcaacggcgatgtcgactccttgaaagatggtgcacaaaaggcgctt960tccttgcttgccgacggcaccacccaggcatggttggccaagcacgaagagatcgattac1020tcagaaaaggagtcttccaatgactag1047<210>2<211>69<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工構(gòu)建體<400>2atgacttctccagcaacactgtgtttaagtttagtggatcccggggaaaaggagtcttcc60aatgactag69<210>3<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工構(gòu)建體<400>3gccctgcaggtaaaaaaaggatttgattcatg32<210>4<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工構(gòu)建體<400>4gccctgcaggtaaaaaaaggatttgattcgtg32<210>5<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工構(gòu)建體<400>5gccctgcaggtaaaaaaaggatttgattcttg32<210>6<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工構(gòu)建體<400>6gccctgcaggtaaaaaaaggattatg26<210>7<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工構(gòu)建體<400>7gccctgcaggtaaaaaaaggattgtg26<210>8<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工構(gòu)建體<400>8gccctgcaggtaaaaaaaggattttg26<210>9<211>312<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<400>9gtgtgcatgactaatgcaggtgacaacttcgagatcaggatgccttctggcacggatgac60ccattgtccgatgcggagatccaaaagtatcgcgaggagatcaaccgcttggaccgcgaa120atcctcgatgcggtgaaacgccgcacgaagatttcccaaaccatcggaaaaacacgcatg180agctcgggcggaacacgtctcgtgcacacccgagaagtagcaatcatcaaccaattccgt240gaagagatcggcgaggaaggccctgccctcgctggaattttgctgcgcatgggacgcgga300aaactcggataa312<210>10<211>60<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工構(gòu)建體<400>10atgactaatgcaggtgactgt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