專利名稱：分離基質(zhì)和純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從液體中分離生物分子的領(lǐng)域，例如抗體純化，更具體地涉及適合于純化抗體的分離基質(zhì)。本發(fā)明也包括含有新基質(zhì)的層析柱以及分離抗體的方法。
背景技術(shù)：
免疫系統(tǒng)由多種相互獨(dú)立的細(xì)胞類型構(gòu)成，這些類型共同地保護(hù)身體免受細(xì)菌、寄生蟲、真菌、病毒感染及癌細(xì)胞生長(zhǎng)的傷害。免疫系統(tǒng)的警衛(wèi)是巨噬細(xì)胞，其不斷在它們宿主的血液系統(tǒng)中流動(dòng)。受感染或免疫刺激時(shí)，巨噬細(xì)胞通過吞噬已知為抗原的用外來分子所標(biāo)記的入侵者來作出反應(yīng)。由助手T細(xì)胞介導(dǎo)這個(gè)事件，經(jīng)一系列復(fù)雜的連鎖反應(yīng)導(dǎo)致對(duì)B細(xì)胞的刺激。接著這些B細(xì)胞產(chǎn)生被稱為抗體的蛋白質(zhì)，其與外來入侵者結(jié)合。抗體與抗原結(jié)合事件標(biāo)志著通過噬菌作用或激活補(bǔ)體系統(tǒng)破壞外來侵入者。存在五種不同種類的抗體或免疫球蛋白IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。它們不但生理作用不同，結(jié)構(gòu)也不同。從結(jié)構(gòu)上說，已經(jīng)被廣泛研究的IgG抗體是特殊的免疫球蛋白，或許因?yàn)槠湓诔墒烀庖邞?yīng)答中起主要作用。
免疫球蛋白擁有的生物活性，如今已被開發(fā)用于人畜診斷、衛(wèi)生保健和治療不同的應(yīng)用范圍。事實(shí)上，最近幾年，單克隆抗體和重組抗體構(gòu)建已經(jīng)成為當(dāng)前臨床試驗(yàn)研究和被FDA作為療法和診斷許可最多的蛋白質(zhì)種類。表達(dá)系統(tǒng)和生產(chǎn)策略互補(bǔ)，設(shè)計(jì)出純化試驗(yàn)方案，以簡(jiǎn)單和成本有效的方式獲得高純抗體。
傳統(tǒng)分離免疫球蛋白的方法基于選擇性地可逆沉淀蛋白質(zhì)片斷，該片斷由免疫球蛋白組成，在溶液里留下其它種蛋白質(zhì)。典型的沉淀試劑是乙醇、聚乙二醇、感膠的(即抗離液鹽，例如硫酸銨和磷酸鉀)和辛酸。通常，這些析出方法得到非常不純的產(chǎn)物，并且同時(shí)耗時(shí)耗力。此外，在原料中添加沉淀試劑使得難于將上清液用作其它目的，并產(chǎn)生處理的問題，特別是當(dāng)論及大規(guī)模純化免疫球蛋白時(shí)尤其涉及該問題。
離子交換層析法是另外熟知的蛋白質(zhì)分離法，常用于免疫球蛋白的分離。但是，因?yàn)閹щ姷碾x子交換配體會(huì)同所有帶相反電荷的化合物反應(yīng)，離子交換層析法的選擇性可能要比其它層析分離法低。
蛋白質(zhì)A和蛋白質(zhì)G親和層析法是免疫球蛋白分離和純化的流行和普遍的方法，特別是單克隆抗體的分離，主要因?yàn)槠涫褂煤?jiǎn)便，可獲得高純度。與離子交換、疏水作用、羥基磷灰石和/或膠體過濾步驟聯(lián)合使用，尤其是基于蛋白質(zhì)A的方法已經(jīng)成為許多生物制藥公司抗體純化法的選擇。然而，盡管它們被普遍應(yīng)用，存在對(duì)有效解決常見問題不斷增長(zhǎng)的要求和需求，這些常見問題同基于蛋白質(zhì)A的介質(zhì)相關(guān)，例如成本、泄漏和pH值增加時(shí)的不穩(wěn)定性。
疏水作用層析法(HIC)也是一種廣泛記載的免疫球蛋白分離法。然而，疏水基質(zhì)要求向原材料中加入感膠鹽，以使免疫球蛋白有效凝結(jié)。通過連續(xù)的或階式梯度降低感膠鹽的濃度而從基質(zhì)中釋放結(jié)合的抗體。如果目標(biāo)是高純度產(chǎn)物，推薦將疏水層析與其它步驟聯(lián)合。因此，該程序的缺點(diǎn)是必須在原材料中加入感膠鹽類，這帶來個(gè)比重問題，也增加了大規(guī)模使用者的成本。對(duì)于除細(xì)胞培養(yǎng)上清液外的其它原材料，如乳清、血漿、蛋黃，大規(guī)模應(yīng)用時(shí)，在許多情況下禁止向原材料中添加感膠鹽類，因?yàn)辂}類消耗原材料而阻止了免疫球蛋白的任何可行的經(jīng)濟(jì)應(yīng)用。大規(guī)模應(yīng)用的另一個(gè)問題是數(shù)千升廢料的處理。
J.Porath于1985年引入作為分離免疫球蛋白的新層析吸附法的親硫吸附層析法(J.Porath等人；FEBS Letters，185卷，306頁，1985)。在這篇論文里描述了與包含游離巰基的多種配體偶聯(lián)二乙烯基砜活化的瓊脂糖如何顯示在0.5M硫酸鉀即感膠鹽的存在下與免疫球蛋白的特異性結(jié)合。假定來自二乙烯基砜間隔基的砜基和在配體中產(chǎn)生的硫醚是獲得所描述的抗體結(jié)合的特異性和能力必需的結(jié)構(gòu)。然而隨后表明硫醚可以被氮或氧替代，如果配體進(jìn)一步包含芳基(K.L.Knudsen等人，Analytical Biochemistry，201卷，170頁，1992)。雖然描述用于親硫吸附層析法的基質(zhì)有良好表現(xiàn)，但是它也有個(gè)主要的缺點(diǎn)，即需要在原材料中添加感膠鹽類來確保免疫球蛋白的有效結(jié)合，這是針對(duì)上述原因的問題。
由(J.Porath等人，Makromol.Chem.，Makromol.Symp.，17卷，359頁，1988)和(A.Schwarz等人，Journal of Chromatography B，664卷，83-88頁，1995)公開了其它與環(huán)氧基激活的偶聯(lián)瓊脂糖偶聯(lián)的親硫配體，例如2-巰基吡啶、2-巰基嘧啶和2-巰基噻唑啉。然而，所有這些親和基質(zhì)仍不具有充分的親和力，來確保不添加感膠鹽類時(shí)抗體的有效結(jié)合。US6,498,236(Upfront Chromatography)涉及免疫球蛋白的分離。該方法公開了包括將包含相反電荷的洗脫劑和含有免疫球蛋白的溶液與固相基質(zhì)接觸的步驟，其中至少一部分免疫球蛋白與固相基質(zhì)結(jié)合，和用洗脫液接觸固相基質(zhì)以從固相基質(zhì)中釋放出免疫球蛋白。含有免疫球蛋白的溶液的其它特征在于在pH范圍為2.0～10.0，相應(yīng)于最高2.0的離子強(qiáng)度的總鹽濃度，最高0.4M濃度的感膠鹽。溶液中的洗滌劑據(jù)信抑制了基質(zhì)與其它生物分子的粘附，可以用辛基硫酸鹽、溴酚蘭、磺酸辛烷、十二烷基硫酸鈉、磺酸己烷來例證。液相基質(zhì)用式子M-SP1-L來定義，其中M是指基質(zhì)骨架，SP1是指包含一個(gè)或兩個(gè)芳香或雜芳香部分的配體。
Liu等人(Yang Liu，Rui Zhao，Dihua Shangguan，Hongwu Zhang，Guoquan LiuNovel sulphmethazine ligand used for one-steppurification of immunoglobulin G from human plasma，Journal ofChromatography B，792(2003)177-185)研究了磺胺甲唑(SMZ)與人IgG的親和性。因此，公開了配體，其包含磺酰基，其中R基是雜環(huán)。根據(jù)這篇文章，SMZ被固定在單分散、無孔、交聯(lián)的聚(甲基丙烯酸縮水甘油酯)珠上。珠子隨后被用在高效親和層析法來分離人血漿中的IgG。pH5.5時(shí)達(dá)最大吸附。珠子與其它蛋白質(zhì)呈現(xiàn)最小的非特異性的相互作用。因此，配體能夠吸附抗體，在吸附中使用緩沖液使配體同其它蛋白質(zhì)的相互作用恰好被延緩。然而，眾所周知，酯類化合物例如異丁烯酸酯在高pH下易于水解。因此，與蛋白質(zhì)A和蛋白質(zhì)G基質(zhì)類似，所公開的分離基質(zhì)將被期望在普遍使用的適當(dāng)清洗程序(cip)中不穩(wěn)定。US4,725,355(Terumo Kabushiki Kaisha)涉及一種體液純化介質(zhì)和設(shè)備，尤其涉及用于具有吸附固定裝置的支撐物，用于去除致病物質(zhì)，如體液中的血漿蛋白。根據(jù)US4,725,355，為了治療病人時(shí)完成體外血液凈化療，優(yōu)選更高效排除致病物，并降低血液中的不利影響至極小。根據(jù)US4,725,355提供的吸附劑包含至少一種磺胺類藥物。根據(jù)US4,725,355磺胺藥物中的吡咯環(huán)顯示疏水特性，環(huán)中的雜原子具有單獨(dú)的電子對(duì)，成為蛋白質(zhì)受體?；前奉愃幬镏械牧虬凡糠志哂袣浣Y(jié)合能力。
因此，仍然需要純化抗體或抗體結(jié)構(gòu)物的可供選擇的方法，以觀察對(duì)純度、安全、效力和成本效率的要求。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)目的是提供分離基質(zhì)，其能夠在低離子強(qiáng)度、中性pH值附近吸附抗體，可以通過如權(quán)利要求1中所述的分離基質(zhì)實(shí)現(xiàn)該目的。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供分離基質(zhì)，它能夠高效地選擇性地吸附抗體。
本發(fā)明的特定目的是提供一種分離基質(zhì)，其可以吸附抗體，允許其它蛋白質(zhì)通過并沒有任何實(shí)質(zhì)的相互作用。
本發(fā)明的其它目的是提供制備抗體分離所需基質(zhì)的方法，包含能吸附抗體的官能團(tuán)，其通過親硫性、疏水性或氫鍵作用吸附抗體，并且該方法易于改變配體結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種方法，它通過吸附于分離基質(zhì)從液相中分離抗體，本方法不需要添加任何洗滌劑即可完成吸附。
將在下面對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步的目的和優(yōu)點(diǎn)進(jìn)行詳細(xì)描述。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示根據(jù)本發(fā)明的6個(gè)不同芳香硫胺類配體的說明性配體結(jié)構(gòu)。
圖2是顯示根據(jù)本發(fā)明的IgG在原型配體上的吸附和解吸附的色譜圖，如根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例部分實(shí)施例2。
圖3是顯示根據(jù)本發(fā)明的BSA在原型配體上的吸附和解吸附的色譜圖，如根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例部分實(shí)施例3。
圖4是顯示根據(jù)本發(fā)明的RIB在原型配體上的吸附和解吸附的色譜圖，如根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例部分實(shí)施例4。
圖5是顯示根據(jù)本發(fā)明的TRANSF在原型配體上的吸附和解吸附的色譜圖，如根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例部分實(shí)施例5。
定義術(shù)語“抗體”和“免疫球蛋白”在這里可以交換使用。
術(shù)語“配體”是指能與靶化合物相互作用的分子或化合物，例如抗體。
術(shù)語“間隔臂”此處是指將配體與分離基質(zhì)的支撐物隔開的元件。
“伯胺”用公式RNH2定義，其中R表示一個(gè)有機(jī)基團(tuán)。
“仲胺”用公式R2NH定義，其中R表示一個(gè)有機(jī)基團(tuán)。
磺?；霉?S(＝O)2R定義，其中R表示一個(gè)有機(jī)基團(tuán)。
術(shù)語“芳香基”是指一個(gè)基團(tuán)，其π電子數(shù)目可以根據(jù)Huckels規(guī)則(4n+2)計(jì)算，n是一個(gè)正整數(shù)或零。
術(shù)語“芳香磺酰胺”是指磺酰胺，其中R基包括一個(gè)或多個(gè)芳香基。
術(shù)語“雙環(huán)”和“三環(huán)”分別指包含2個(gè)或3個(gè)環(huán)的殘基。所述環(huán)可能是稠合環(huán)或分開的環(huán)。同樣地，由更多數(shù)目環(huán)組成的殘基可以用稠合環(huán)或分開的環(huán)構(gòu)成。
術(shù)語“可質(zhì)子化的”基團(tuán)是指能添加一個(gè)氫原子的基團(tuán)。
術(shù)語“親和基”是指一對(duì)親和物，以生物學(xué)上的“鎖/鑰”方式互相結(jié)合。例如眾所周知的親和對(duì)是酶和它們各自的受體、生物素和抗生物素蛋白、葡萄球菌表面蛋白抗原A/抗體。
術(shù)語“表面”當(dāng)用于多孔支撐物語境時(shí)，既包含孔的表面又包括實(shí)際的外表面。
術(shù)語“洗脫液”使用其在這個(gè)領(lǐng)域的常用涵義，即用來從分離基質(zhì)釋放一種或多種化合物的具有適當(dāng)pH值或離子強(qiáng)度的緩沖液。
發(fā)明詳述第一方面，本發(fā)明是分離基質(zhì)，它由任選地經(jīng)由間隔臂固定了配體的多孔支撐物構(gòu)成，其中所述配體包括一個(gè)或多個(gè)磺酰胺并且磺酰基中的R基包括一個(gè)或多個(gè)芳香基。
在有利的實(shí)施方案中，本發(fā)明是由任選地經(jīng)間隔臂固定了配體的多孔支撐物組成的分離基質(zhì)，其中所述配體包括一個(gè)或多個(gè)磺酰胺，并且基本上不含可質(zhì)子化的基團(tuán)。在上下文中，術(shù)語“基本不含可質(zhì)子化的基團(tuán)”理解為沒有這樣的基團(tuán)構(gòu)成配體的一部分，并且因此與目標(biāo)分子的相互作用在任意實(shí)質(zhì)上的程度上不涉及可質(zhì)子化的基團(tuán)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的配體包括至少一個(gè)伯胺或仲胺。
分離基質(zhì)可用來分離(例如純化或分析)抗體和其它具有相同結(jié)合性質(zhì)化合物，例如包含免疫球蛋白部分或抗體片段的融合蛋白。本發(fā)明人表明通過使用包含一個(gè)或多個(gè)磺酰胺的分離基質(zhì)，能夠以高容量和優(yōu)異的選擇性大規(guī)模純化抗體。與上述討論的US6,498,236相反，在與使用不帶電配體的基質(zhì)接觸前，本發(fā)明不需要向包含抗體的液體中添加任何洗滌劑即可完成純化。更進(jìn)一步地，如下面實(shí)施例中顯示的，本發(fā)明在同樣條件下，三種不同類蛋白質(zhì)不被吸附，而允許吸附免疫球蛋白。這種選擇性使此處描述的芳香磺酰胺類配體在單克隆抗體的純化上具有很大價(jià)值。
眾所周知，磺酰胺類藥物由胺構(gòu)成，其中至少一個(gè)上述胺的R基是磺酰基。本發(fā)明人表明通過在配體中包括一種磺酰胺，其中磺酰R基是芳香基，本分離基質(zhì)將會(huì)展示增強(qiáng)的結(jié)合性能。因此，在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，R基包括至少一個(gè)芳香基。
更進(jìn)一步地，在一個(gè)實(shí)施方案中，磺?；蠷基是取代的或未取代的芳香族或雜芳香族基團(tuán)，例如單或多芳香基。更具體而言，例如R基可能是單環(huán)、雙環(huán)或三環(huán)。芳香殘基的例子是苯基、芐基、苯甲酰基、萘基和甲苯磺?；ｋs芳族基團(tuán)可包含一或多個(gè)雜原子N、O和S，例如作為實(shí)例的噻吩基、呋喃基和吡啶基。
在一個(gè)實(shí)施方案中，取代基是吸電子的。取代基可能是單個(gè)原子，例如鹵素或碳原子；或基團(tuán)如-N(O)2。另外，取代基可以為直鏈或支鏈碳鏈。
同樣地，磺胺類配體可以包含進(jìn)一步的取代基。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將明白，取代基的性質(zhì)可用來增強(qiáng)配體結(jié)合性能。然而，也可以理解的是應(yīng)該選擇好配體的性質(zhì)和大小，特別是R基和它的取代基，以免抑制(例如通過位阻效應(yīng))與目標(biāo)分子(如抗體)的結(jié)合。
在具體的實(shí)施方案中，除了芳香基外，磺?；腞基包括一個(gè)或多個(gè)脂肪族基。
在本發(fā)明的分離基質(zhì)的一個(gè)實(shí)施方案中，配體是磺酰基化的一元胺。在另一個(gè)實(shí)施方案中，配體是磺酰基化的多胺。這種磺?；亩喟房砂我鈹?shù)目的胺，如2-10個(gè)。在例證性的實(shí)施方案中，每個(gè)多胺包含2-6個(gè)胺。在另一個(gè)實(shí)施方案中，配體包括多于一個(gè)磺?；＿@種其它的磺?；梢允腔酋０分蠷基的一部分；并或形成間隔臂的一部分，該間隔臂將配體與支撐物相連。
在本發(fā)明的分離基質(zhì)的具體實(shí)施方案中，配體是固定在支撐物上的聚合物的重復(fù)單元。聚合物可以是任何合適的多胺，例如聚乙烯亞胺。在一個(gè)實(shí)施方案中，聚合物是聚乙烯胺。本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，這種聚合物中的胺的含量可以被改變，例如以任意期望的次序包括伯胺和/或仲胺。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，聚合物具有兩個(gè)或多個(gè)不同的配體基團(tuán)。根據(jù)本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)方法，很容易從合適的單體生產(chǎn)聚合物。將聚合偶聯(lián)到支撐物上的方法也是眾所周知，本領(lǐng)域技術(shù)人員易于完成，例如通過原位聚合作用或接枝聚合物，例如參見PCT/SE02/02159(Ihre等人)。該實(shí)施方案的優(yōu)點(diǎn)是，能易于優(yōu)化分離基質(zhì)的性質(zhì)，例如通過改變聚合物的長(zhǎng)度、分支等等?？蛇x擇地，通過磺?；械牧?qū)⒕酆衔锱c支撐物偶聯(lián)。
然而，根據(jù)本發(fā)明的分離基質(zhì)也可包含與別的官能團(tuán)結(jié)合的一個(gè)或多個(gè)芳香磺酰胺配體。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，分離基質(zhì)的配體是多元配體，在某種意義上它們能夠用兩個(gè)或多個(gè)官能團(tuán)與目標(biāo)相互作用。附加的或第二官能團(tuán)可以被容易地引入，例如經(jīng)由在磺酰胺上引入不同的取代基，或通過間隔臂，或通過烷化磺酰胺中的氮原子，或只是通過在上述磺酰胺基質(zhì)上引入新配體(兩個(gè)或多個(gè)不同配體結(jié)構(gòu))的隨機(jī)方法引入。例如附加的官能團(tuán)選自芳基、雜環(huán)和脂肪族基團(tuán)、含氫鍵供體和受體的基團(tuán)、可帶電荷的官能團(tuán)如胺或酸基、聚羥基化的基團(tuán)如葡聚糖、聚乙二醇衍生物、包含氟原子的基團(tuán)。
因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本分離基質(zhì)由多孔支撐物構(gòu)成，在該支撐物上已經(jīng)固定了包括一個(gè)或多個(gè)芳香磺酰胺基團(tuán)和離子交換基團(tuán)。因此，該實(shí)施方案可以被表示為基于磺酰胺的離子交換分離基質(zhì)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，分離基質(zhì)是基于多元磺酰胺的分離基質(zhì)，其包含與至少一個(gè)附加的官能團(tuán)結(jié)合的一個(gè)或多個(gè)芳香磺酰胺，該官能團(tuán)選自疏水相互作用層析(HIC)基團(tuán)、離子交換基團(tuán)、親和基團(tuán)和螯合金屬的基團(tuán)。在一個(gè)實(shí)施方案中，配體的芳香磺酰胺可以是可質(zhì)子化的或不可質(zhì)子化的。
本發(fā)明的分離基質(zhì)的多孔支持物可以是任何合適的材料的。在一個(gè)實(shí)施方案中，支持物由交聯(lián)的碳水化合物材料構(gòu)成，例如由瓊脂糖、瓊脂、纖維素、葡聚糖、殼聚糖、魔芋糖、角叉菜聚糖、凝膠糖、藻酸鹽等。支撐物易于用標(biāo)準(zhǔn)方法制備，例如由反相懸浮凝膠制備(SHjertenBiochim Biophys Acta 79(2)，393-398(1964))。作為選擇，載體是商業(yè)上可獲得的產(chǎn)品，如SepharoseTMFF(AmershamBiosciences AB，Uppsala，瑞典)。因此，在本發(fā)明基質(zhì)的一個(gè)實(shí)施方案中，支撐物是交聯(lián)的多糖。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述多糖是瓊脂糖。這種碳水化合物在配體的固定化之前通常是烯丙基化的。簡(jiǎn)而言之，烯丙基化可以采用烯丙基縮水甘油醚、烯丙基溴或任何其它合適活化劑按照標(biāo)準(zhǔn)的方法實(shí)現(xiàn)。
在可替代的實(shí)施方案里，本發(fā)明的分離基質(zhì)的多孔支撐物由交聯(lián)的合成聚合物構(gòu)成，例如由苯乙烯或苯乙烯衍生物、二乙烯基苯、丙烯酰胺、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、乙烯基酯類、乙烯基酰胺等等構(gòu)成。按照標(biāo)準(zhǔn)方法由這樣的聚合物構(gòu)成的支撐物易于被制備，參見例如“Styrene based polymer supports developed by suspensionpolymerization”(R ArshadyChimica e L′Industria 70(9)，70-75(1988))。作為選擇，商用可獲得產(chǎn)品，例如SourceTM(AmershamBiosciences AB，Uppsala，瑞典)可以根據(jù)本發(fā)明對(duì)其表面進(jìn)行改性。然而，在該實(shí)施方案中，優(yōu)選改良載體表面來增加其親水性，通常轉(zhuǎn)化大部分暴露的殘余雙鍵為羥基。
在一個(gè)實(shí)施方案中，配體被固定到增量劑中或涂層聚合物層中，存在于多孔支撐物的表面上。這種增量劑，也稱為“可彎曲臂”，可以是有機(jī)或合成聚合物。因此，例如支撐物可以被葡聚糖包被，給支撐物提供親水性，按照本領(lǐng)域常用方法將配體固定在該支撐物上。
本發(fā)明的分離基質(zhì)可以呈任何合適的形態(tài)，如層析基質(zhì)，例如呈基本上球粒或整塊的形式、過濾膜、碎片、面、毛細(xì)管或類似物。因此，本發(fā)明也包含填充了如上述分離基質(zhì)的層析柱。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，層析柱由任意常規(guī)的物質(zhì)制成，例如由生物相容性塑料，如聚丙烯或玻璃制成。層析柱可以具有適合實(shí)驗(yàn)室規(guī)?；虼笠?guī)模純化抗體時(shí)的尺寸。在具體的實(shí)施方案中，給根據(jù)本發(fā)明的層析柱提供了路厄氏接頭、管狀連接器和半球形螺母。因此，本發(fā)明也包含由層析柱、至少一種緩沖劑和在單獨(dú)隔間中的用于純化抗體的書面說明構(gòu)成的試劑盒，其中該層析柱填充有上述的分離基質(zhì)。在具體的實(shí)施方案中，本試劑盒也包括路厄氏接頭、管狀連接器和圓形螺母。
第二方面，本發(fā)明涉及制備用于分離抗體的基質(zhì)的方法，本方法經(jīng)由它們的胺或經(jīng)由它們的磺?；牧?qū)⒒酋０饭潭ㄓ诙嗫字挝锷系牡谝徊健Ｔ诰唧w的實(shí)施方案中，通過將胺或多胺固定于多孔支撐物，并隨后磺?；龅陌?，來制備磺酰胺配體。多孔支撐物可以是如上述的，并可以使用任意標(biāo)準(zhǔn)的用于固定的方法，參見例如ImmobilizedAffinity Ligand Techniques，Hermanson等人，Greg T.Hermanson，A.Krishna Mallia和Paul K.Smith，Academic Press，INC，1992。固定芳香化合物的具體公開內(nèi)容，參見上文討論的US6,498,26(層析前沿)。然而，本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員將理解，根據(jù)配體性質(zhì)，可以通過直接在支撐物上固定磺酰胺類物質(zhì)來同樣制備一些分離基質(zhì)。此外，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員將會(huì)理解，配體密度可用來或多或少地補(bǔ)償配體的疏水性。換句話說，如果選擇一種高疏水性的配體，可能因表現(xiàn)出太高疏水性而不允許輕易解吸所吸附的抗體，它需要在支撐物上用稍微低一些的密度而不是更低的疏水性來補(bǔ)償。然而，這是一種常見的眾所周知的情況，熟練的技術(shù)人員可容易地適當(dāng)調(diào)節(jié)配體密度使其適于例行檢驗(yàn)。
第三方面，本發(fā)明是一種從液體中純化抗體的方法，該方法包括下述步驟(a)提供包含至少一種抗體的液體；(b)使所述液體與分離基質(zhì)接觸，該基質(zhì)包含一個(gè)或多個(gè)磺酰胺基團(tuán)來在基質(zhì)上吸附一種或多種抗體；并且，任選地(c)讓洗脫劑通過所述基質(zhì)以釋放一種或多種抗體；以及(d)從洗脫劑的餾分中回收至少一種抗體。
在本文中，可以理解術(shù)語“抗體”也包括抗體片斷和任何融合蛋白，融合蛋白包括抗體或抗體片斷。因此，本方法用來分離任意的免疫球蛋白樣分子，其具有與抗體結(jié)合的性質(zhì)。例如包含抗體的液體可以是來源于生產(chǎn)抗體的細(xì)胞培養(yǎng)物或發(fā)酵肉湯，期望從中純化一種或多種所期望抗體。作為選擇，液體也可是血液或血漿，期望從中移去一種或多種抗體來獲得在某方面來說純凈的液體。因此，在本方法的一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(a)中提供的液體也包含除抗體外的一種或多種別的蛋白質(zhì)。如下列試驗(yàn)部分所示，一般來說，本方法允許在低離子強(qiáng)度下選擇性地吸附抗體。出乎意料地，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)使用含一個(gè)或多個(gè)磺酰胺基團(tuán)的多孔分離基質(zhì)能吸附抗體，而除抗體外不吸附其它蛋白質(zhì)。因此，本方法能提供高收率的純抗體制劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員用例行試驗(yàn)?zāi)芤子谶x擇每一磺酰胺配體結(jié)構(gòu)的最佳條件，下述試驗(yàn)部分會(huì)予以討論。例如，本領(lǐng)域公知，可以通過改變凝膠性質(zhì)來優(yōu)化分離基質(zhì)的特性；在這種情況下，改變磺酰胺中的R基團(tuán)、或取代度即支撐物上配體密度。也可根據(jù)每種配體來優(yōu)化吸附緩沖液中的鹽濃度。因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，在大約0.25M Na2SO4鹽濃度下提供步驟(b)的吸附。在具體的實(shí)方案中，配體包括單胺，步驟(b)在鹽濃度大約為0.5M Na2SO4下進(jìn)行。
本發(fā)明方法可用呈任何合適的形態(tài)的分離基質(zhì)，例如層析基質(zhì)，如呈基本上球形顆?；蛘麎K的形式，過濾器或?yàn)V過膜，碎片或其類似物。因此，在有利的實(shí)施方案中，以層析柱形式來提供步驟(b)的分離基質(zhì)。
步驟(b)的分離基質(zhì)的支撐物和配體可以是上述基質(zhì)中的任何一種。
如上所述，本發(fā)明意外地證明，使用根據(jù)本發(fā)明制作的新分離基質(zhì)，在中性pH值下能高度選擇性地吸附抗體。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(b)在PH6.5-8.3，例如7.2-7.6，如約7.4下進(jìn)行。
吸附到層析柱上的抗體能通過標(biāo)準(zhǔn)的洗脫被輕易地釋放，如通過使用離子強(qiáng)度逐漸降低的洗脫液。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，步驟(c)是一個(gè)梯度洗脫過程，通過在分離基質(zhì)中添加鹽濃度逐漸降低的洗脫液進(jìn)行，更優(yōu)選通過讓所述洗脫液通過基質(zhì)。梯度可以是任何形狀的，如線性的或階梯狀的。其它洗脫方案也很有用，如在洗脫液中添加一種競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合劑、在洗脫液中添加一種替代基質(zhì)中吸附的抗體的化合物，例如酒精、鹽等等，或提供溫度的變化等等。
作為選擇，步驟(c)可通過調(diào)整PH值而完成，例如降低或升高pH值。pH值的調(diào)整可與上述鹽梯度組合，如上面討論的。在具體實(shí)施方案中，步驟(b)在pH值高于中性時(shí)完成，步驟(c)是通過添加逐漸降低的pH值的洗脫液進(jìn)行的梯度洗提。
本方法可用于回收任意種類的單克隆或多克隆抗體，如來源于哺乳動(dòng)物宿主的抗體，例如老鼠、嚙齒類、靈長(zhǎng)類和人類；或培養(yǎng)的細(xì)胞如雜交瘤細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，在步驟(d)中回收的抗體是人或人源化抗體?？贵w可以是任何種類，即選自IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。在具體實(shí)施方案中，在步驟(d)中回收的抗體是免疫球蛋白G(IgG)。本發(fā)明也包含純化上文提及的任何抗體的片斷以及包含這些抗體的融合蛋白。分離或純化的目標(biāo)分子在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域用作抗體藥物，例如個(gè)性化的藥物，為每個(gè)需要的個(gè)體設(shè)計(jì)特異性的藥物。
本方法允許定量地吸附抗體。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本方法包含上述定義的方法和附加的步驟(f)，步驟(f)通過分光光度法測(cè)定抗體的量。這樣的方法和可使用的設(shè)備為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知。本方法在分析程序時(shí)也有用，可以作為診斷領(lǐng)域的工具。
附圖詳述圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明六種不同的芳香磺酰胺的示例性配體結(jié)構(gòu)。
圖2顯示了根據(jù)本發(fā)明IgG在原型配體上的吸附和解吸附的層析圖，如試驗(yàn)部分的實(shí)施例2中所描述的。在280nm處的紫外吸收曲線(藍(lán)線)表示IgG樣品被吸附(緩沖液A3)，以及使用緩沖液B1洗脫23-26ml。緩沖液A3＝20mM磷酸鹽緩沖液(pH7.4)與0.50MNa2SO4；緩沖液B1＝100mM醋酸鹽緩沖液(pH4.0)。
圖3顯示了根據(jù)本發(fā)明BSA在原型配體中的吸附和解吸附的層析圖，如試驗(yàn)部分的實(shí)施例3中所描述。在280nm處的紫外吸收曲線(藍(lán)線)表示BSA樣品沒有被吸附，以及使用緩沖液A3洗脫7.5-9ml。緩沖液A3＝20mM磷酸鹽緩沖液(pH7.40)與0.50M Na2SO4；緩沖液B1＝100mM醋酸鹽緩沖液(pH4.0)。
圖4顯示了根據(jù)本發(fā)明RIB在原型配體中的吸附和解吸附的層析圖，如試驗(yàn)部分的實(shí)施例4中所描述的。在280nm處的紫外吸收曲線(藍(lán)線)表示RIB樣品沒有被吸附，以及使用緩沖液A3洗脫7.5-9ml。緩沖液A3＝20mM磷酸鹽緩沖液(pH7.4)與0.50M Na2SO4；緩沖液B1＝100mM醋酸鹽緩沖液(pH4.0)。
圖5顯示了根據(jù)本發(fā)明TRANSF在原型配體中的吸附和解吸附的層析圖，如試驗(yàn)部分的實(shí)施例5中所描述的。在280nm處的紫外吸收曲線(藍(lán)線)表示TRANSF樣品沒有被吸附，以及使用緩沖液A3洗脫7.5-9ml。緩沖液緩沖液A3＝20mM磷酸鹽緩沖液(pH7.4)與0.50M Na2SO4；緩沖液B1＝100mM醋酸鹽緩沖液(pH4.0)。
實(shí)驗(yàn)部分本發(fā)明實(shí)施例僅僅用于說明，不應(yīng)將其理解為對(duì)本發(fā)明范圍的限制，其由附加的權(quán)利要求書來定義。本說明書中下面及別處給出的所有參考文獻(xiàn)在此引入作為參考。
實(shí)施例1磺酰胺分離基質(zhì)的制備下面提供的是根據(jù)本發(fā)明制備多種分離基質(zhì)，其磺酰部分的R基包括芳香族基團(tuán)。
概要基質(zhì)容積是指澄清床的容積。
以克計(jì)的基質(zhì)重量是指吸干后的凈重?？梢岳斫膺@些基質(zhì)仍是水溶劑化的物質(zhì)。
對(duì)于大規(guī)模反應(yīng)，攪拌是指懸浮的馬達(dá)驅(qū)動(dòng)的攪拌器，因?yàn)槭褂么帕Π魯嚢杵鲿?huì)迅速地破壞珠子。小規(guī)模的反應(yīng)(最多20ml或g凝膠)在封閉的燒瓶中進(jìn)行，攪拌是指使用搖動(dòng)工作臺(tái)。
常規(guī)方法用來分析官能度、測(cè)定烯丙基化程度、或珠子上離子交換基團(tuán)的取代程度。這些方法最終通過對(duì)凝膠，特別是對(duì)于硫原子進(jìn)行附加的元素分析而得到補(bǔ)充。
根據(jù)本發(fā)明制備分離基質(zhì)的一種方法在下面舉例說明，從交聯(lián)瓊脂糖凝膠開始(SepharoseTM6 FF，Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)。對(duì)于每一步，都有具體描述。
A.在基質(zhì)上引入烯丙基將SepharoseTM用烯丙基縮水甘油基醚修飾，如下1)將200ml的SepharoseTM6 FF與0.2g NaBH4、24g Na2SO4、8g的50％NaOH水溶液和40ml水混合。在50℃攪拌混合物1小時(shí)。加入烯丙基縮水甘油基醚(100ml)，另外在50℃強(qiáng)力攪拌懸浮液18小時(shí)。然后連續(xù)加入5M AcOH中和到pH7，過濾混合物，依次相繼地用1L乙醇、2L蒸餾水、400ml 0.2M乙酸和500ml蒸餾水連續(xù)洗滌凝膠。
滴定得到每ml凝膠0.124mmol的烯丙基取代度。
2)將225ml的SepharoseTM6FF與0.22g NaBH4、7.2g的50％NaOH水溶液和110ml水混合。在30℃攪拌混合物1小時(shí)。加入烯丙基縮水甘油基醚(61.8ml)，另外在30℃強(qiáng)力攪拌懸浮液17小時(shí)。然后連續(xù)地添加5M AcOH中和到pH7，過濾混合物，接著用1L乙醇、2L蒸餾水、400ml 0.2M乙酸、500ml蒸餾水連續(xù)地洗滌凝膠。滴定得到每ml凝膠0.042mmol的烯丙基取代度。
B.在基質(zhì)上引入胺基團(tuán)可直接經(jīng)由胺基團(tuán)的N原子將胺基引到基質(zhì)上。通過在堿性條件下烯丙基的溴化和親核取代來實(shí)現(xiàn)與基質(zhì)的結(jié)合。
通過溴化作用活化烯丙基SepharoseTM向100ml的經(jīng)如上所述的烯丙基化后(0.042或0.124mmol烯丙基每ml去水凝膠)的SepharoseTM6 FF、4g AcONa和100ml蒸餾水的攪拌的懸浮液中添加溴，直到獲得持續(xù)的黃色。然后添加甲酸鈉直到懸浮液完全被脫色。過濾反應(yīng)混合物，用500ml蒸餾水洗滌凝膠。然后將活化的凝膠直接轉(zhuǎn)移至反應(yīng)器中，進(jìn)一步與合適的配體反應(yīng)。
二乙撐三胺SepharosTM將30g數(shù)量的溴活化的凝膠(0.124mmol烯丙基基團(tuán)/每ml瀝干的凝膠)轉(zhuǎn)移至反應(yīng)燒瓶中，該燒瓶中含有二乙撐三胺(24ml)和水(10ml)，加入少量6M HCL調(diào)節(jié)pH至12。在50℃下攪拌反應(yīng)20小時(shí)。過濾反應(yīng)混合物后，依次用3×30ml蒸餾水、3×30ml 0.5M HCl水溶液洗滌，最后用3×30ml蒸餾水洗滌凝膠。得到所得的二乙撐三胺SepharosTM凝膠，每ml凝膠0.158mmol胺的取代度。
胺-SepharosTM1)將33g數(shù)量的溴活化的凝膠(0.124mmol烯丙基基團(tuán)/每ml瀝干的凝膠)轉(zhuǎn)移至反應(yīng)燒瓶中，燒瓶中含有疊氮化鈉(2g)的水溶液(10ml)，通過添加幾滴50％NaOH水溶液將反應(yīng)瓶調(diào)節(jié)到pH12.3。在50℃下攪拌反應(yīng)20小時(shí)。過濾反應(yīng)混合物，依次用3×60ml蒸餾水和3×30ml DMF洗滌凝膠。然后將瀝干后的凝膠以DTE(4.5g)和DBU(3.75ml)在DMF(22ml)中的溶液處理，在室溫下攪拌混合物18小時(shí)。過濾反應(yīng)后的混合物，依次用3×30ml DMF、3×30ml乙醇，最后3×30ml的蒸餾水連續(xù)洗滌凝膠。
得到的胺-SepharosTM凝膠，每ml凝膠0.083mmol胺取代度。
2)6g數(shù)量的溴活性的凝膠(0.042mmol烯丙基基團(tuán)/每ml瀝干的凝膠)轉(zhuǎn)移至反應(yīng)燒瓶中，燒瓶中含有疊氮化鈉(84mg)的水溶液(3ml)，該溶液已通過添加幾滴50％NaOH水溶液而被調(diào)整至pH12.2。在50℃攪拌反應(yīng)17小時(shí)。過濾反應(yīng)混合物后，依次用3×20ml蒸餾水和3×10ml DMF洗滌凝膠。然后將瀝干后的凝膠以DTE(0.86g)和DBU(0.8ml)在DMF(5ml)中的溶液處理，在室溫下攪拌混合物18小時(shí)。過濾反應(yīng)混合物后，依次用3×10ml DMF、3×10ml乙醇，最后用3×10ml蒸餾水洗滌凝膠。
得到的胺-SepharosTM凝膠，每ml凝膠0.026mmol胺基團(tuán)的取代度。
C.用芳基磺酰氯衍生物將胺基團(tuán)衍化一般方法5g數(shù)量的胺偶聯(lián)的凝膠用10ml 0.2M NaOH溶液、3×10ml乙醇、然后用3×10ml DCM(二氯甲烷)洗滌。把凝膠轉(zhuǎn)移入燒瓶中，并加入DCM(2ml)和3.3當(dāng)量的DIPEA，攪拌混合物5分鐘。在滴加3當(dāng)量的芳基磺酰氯后，用DCM(3ml)溶解，在室溫下攪拌反應(yīng)混合物18小時(shí)。過濾反應(yīng)混合物后，依次用3×10ml DCM，3×10ml乙醇、3×10ml蒸餾水、3×10ml 0.5M HCl，最后3×10ml蒸餾水洗滌凝膠。
N，N’，N”-三(五氟代苯磺?；?二亞乙基三胺SepharosTM依據(jù)一般程序，將二亞乙基三胺SepharosTM凝膠(0.158mmol胺/每ml凝膠)以五氟代苯磺酰氯(335μl)處理，產(chǎn)生標(biāo)題的原型物，在圖1中用L1A表示。
N，N’，N”-三(4-硝基苯磺?；?二亞乙基三胺SepharosTM依據(jù)一般程序，將二亞乙基三胺SepharosTM凝膠(0.158mmol氨/每ml凝膠)以4-硝基苯磺酰氯(540mg)處理，產(chǎn)生標(biāo)題的原型物，在圖1中用L1B表示。
N，N’，N”-三(p-甲苯磺酰)二亞乙基三胺SepharosTM依據(jù)一般程序，將二亞乙基三胺SepharosTM凝膠(0.158mmol氨/每ml凝膠)對(duì)-甲苯磺酰氯(460mg)處理，產(chǎn)生標(biāo)題原型物，在圖1中用L1C表示。
五氟代苯磺酰胺-SepharosTM依據(jù)一般程序，將胺-SepharosTM凝膠(0.083mmol胺/每ml凝膠)以五氟代苯磺酰氯(290mg)處理，產(chǎn)生標(biāo)題的原型物，在圖1中用L2A表示。
4-硝基苯磺酰胺SepharosTM依據(jù)一般程序，將胺-SepharosTM凝膠(0.083mmol胺/每ml凝膠)以4-硝基苯磺酰氯(290mg)處理，產(chǎn)生標(biāo)題的原型物，在圖1中用L2B表示。
p-甲苯磺酰胺SepharosTM1)依據(jù)一般程序，將胺-SepharosTM凝膠(0.026mmol胺/每ml凝膠)以p-甲苯磺酰氯(207mg)處理，產(chǎn)生標(biāo)題的原型物(低取代)，在試驗(yàn)部分中用L2Ca表示。
2)依據(jù)一般程序，將胺-SepharosTM凝膠(0.083mmol胺每ml凝膠)以對(duì)-甲苯磺酰氯(207mg)處理，產(chǎn)生標(biāo)題的原型物(高取代)，在試驗(yàn)部分中用L2Cb表示。
實(shí)施例2-5層析評(píng)估原料和方法(普通)為了測(cè)試根據(jù)本發(fā)明芳香磺酰胺配體是否吸附人免疫球蛋白(IgG)，在不同條件下測(cè)試了IgG和三種不同蛋白質(zhì)的吸光系數(shù)。另外，也測(cè)試了一種單克隆抗體。測(cè)試方法的原理是將蛋白質(zhì)(15μl)注射入HR5/5柱，該柱包含固定在SepharosTM6 Fast Flow上的磺酰胺配體，以含有鹽和緩沖成分的緩沖液A平衡過。然后將15ml緩沖液A泵過層析柱，接著施加5ml從緩沖液A到緩沖液B的線性梯度，緩沖液B包括緩沖成分而不含鹽(參見下述UNICORN法)。然后在280、254和215nm處檢驗(yàn)層析剖面圖。
為了評(píng)價(jià)吸附的樣品數(shù)量和從層析柱洗脫的樣品數(shù)量，將與應(yīng)用于層析柱同樣數(shù)量的樣品也直接注入檢測(cè)器中并對(duì)響應(yīng)進(jìn)行積分。
實(shí)驗(yàn)使用三種不同的吸附緩沖液(緩沖液A#)和兩種不同的解吸附緩沖液(緩沖液B#)緩沖液A120mM磷酸鹽緩沖液(pH7.4)+0.25M NaCl緩沖液A220mM磷酸鹽緩沖液(pH7.4)+0.25M Na2SO4
緩沖液A320mM磷酸鹽緩沖液(pH7.4)+0.50M Na2SO4緩沖液B1100mM醋酸鹽緩沖液(pH4.0)緩沖液B2100mM醋酸鹽緩沖液(pH4.0)+20％(v/v)異丙醇樣品使用的樣品是牛血清白蛋白(BSA)、核糖核酸酶A(RIB A)、轉(zhuǎn)鐵球蛋白(TRANSF)和人免疫球蛋白(IgG，微克，Pfizer)。用濃度為15mg/ml的緩沖液A溶解蛋白質(zhì)，每次只能在層析柱中使用一種蛋白。含有配體L2C的介質(zhì)也被制造，配體濃度已經(jīng)被調(diào)整為26μmol/mL(L2Ca)和16μmol/mL(L2Cb)。
儀器設(shè)備(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)LC系統(tǒng)AKT ATMExplorer 10 XT軟件UNICORNTM注射環(huán)Superloop 15 μl柱HR 5/5設(shè)備參數(shù)流速0.5ml/min檢測(cè)器單元10mm波長(zhǎng)280、254和215nmUNICORN方法主要方法mL0.00基礎(chǔ)閉合容積，1.00{ml}，任何0.00柱位置位置1旁路0.00紫外自動(dòng)歸零0.00波長(zhǎng)280{nm}254{nm}215{nm}1.00波長(zhǎng)280{nm}254{nm}215{nm}1.10部分注射(1)#于小瓶，10#INJVOL1{μl}，無，無空氣直接注入樣品至檢測(cè)器1.10紫外自動(dòng)歸零4.00柱位置(位置2)7.00部分注射(1)#于小瓶2，10#INJVO2{μl}，無，無空氣直接注入樣品至檢測(cè)器22.00梯度100{％B}，2.00{基礎(chǔ)}，用緩沖液B洗脫27.00梯度100{％B}，0.00{基礎(chǔ)}27.10梯度0{％B}，1{基礎(chǔ)}，用緩沖液A洗脫31.00梯度0{％B}，0{基礎(chǔ)}36.00梯度0{％B}，0{基礎(chǔ)}36.10方法結(jié)束實(shí)施例2IgG吸附于L2Ca為了證明芳香磺酰胺是否吸附免疫球蛋白，將人IgG應(yīng)用于1ml層析柱(HR5/5)，將其用根據(jù)本發(fā)明的新分離基質(zhì)填充。在該實(shí)施例中，依照主要方法檢測(cè)IgG在低配體密度原型L2C的變體上的吸附和解吸附，這里用L2Ca表示。用上述實(shí)施例1描述方法制備L2Ca，配體密度是26μmol/mL。
用緩沖液A3(20mM磷酸鹽緩沖液，pH7.4和0.50M Na2SO4)檢測(cè)IgG的吸收。當(dāng)使用緩沖液A3時(shí)，發(fā)現(xiàn)IgG吸附到L2Ca。如圖2所示，吸附到L2Ca上的IgG能被易于洗脫23-26ml，使用沒有添加鹽的100mM醋酸緩沖液(pH4.0)。吸附IgG，使用緩沖液A3作為流動(dòng)相，導(dǎo)致當(dāng)使用解吸附緩沖液B1時(shí)，吸附的IgG的回收率大約為100％。
實(shí)施例3-5蛋白質(zhì)吸附于L2Ca在下面的例子中，采用芳香磺酰胺配體L2Ca檢驗(yàn)以下述物質(zhì)的相互作用牛血清白蛋白(BSA)、核糖核酸酶A(RIB A)轉(zhuǎn)鐵蛋白(TRANSF)。
配體最重要的一個(gè)特性是其選擇性，該配體以純化單克隆抗體為目標(biāo)。因此，除了IgG外，也研究了在上述IgG吸附的使用條件下蛋白質(zhì)牛血清白蛋白(BSA)、核糖核酸酶A(RIB A)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(TRANSF)的吸附。
實(shí)施例3牛血清白蛋白(BSA)在該實(shí)施例中，依照主要方法檢驗(yàn)了BSA在按上文所述制備的(26μmol/mL)L2Ca上的吸附和解吸附。如圖3所示，在280nm處的紫外吸收曲線(藍(lán)線)表明BSA樣品不被吸附，使用洗脫液A3洗脫7.5-9mL。洗脫液A3＝20mM磷酸鹽洗脫液(pH7.4)+0.5M Na2SO4，洗脫液B1＝100mM醋酸鹽洗脫液(pH4.0)。
實(shí)施例4核糖核酸酶A(RIB A)在該實(shí)施例中，依照主要方法檢驗(yàn)了RIB在按上文所述制備的(26μmol/mL)L2Ca上的吸附和解吸附。如圖4所示，在280nm處的紫外吸收曲線(藍(lán)線)表明RIB樣品不被吸附，使用洗脫液A3洗脫7.5-9mL。洗脫液A3＝20mM磷酸鹽洗脫液(pH7.4)+0.5M Na2SO4，洗脫液B1＝100mM醋酸鹽洗脫液(pH4.0)。
實(shí)施例5轉(zhuǎn)鐵蛋白(TRANSF)在該實(shí)施例中，依照主要方法檢驗(yàn)了TRANSF在按上文所述制備的(26μmol/mL)L2Ca上的吸附和解吸附。如圖5所示，在280nm處的紫外吸收曲線(藍(lán)線)表明TRANSF樣品不被吸附，使用洗脫液A3洗脫7.5-9mL。洗脫液A3＝20mM磷酸鹽洗脫液(pH7.4)+0.5MNa2SO4，洗脫液B1＝100mM醋酸鹽洗脫液(pH4.0)。
權(quán)利要求
1.一種分離基質(zhì)，它由任選地經(jīng)間隔臂固定了配體的多孔支撐物構(gòu)成，其中所述配體包含一或多個(gè)芳香磺酰胺并且基本上不含可質(zhì)子化基團(tuán)。
2.如權(quán)利要求1所述的基質(zhì)，其中磺酰胺的氮是伯胺或仲胺。
3.如權(quán)利要求1或2所述的基質(zhì)，其中所述配體是一元胺。
4.如上述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的基質(zhì)，其中所述配體是多胺。
5.如權(quán)利要求4所述，其中每個(gè)多胺包括2至6個(gè)胺。
6.如上述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的基質(zhì)，其中所述配體作為固定于支撐物上的聚合物的重復(fù)單元存在。
7.如權(quán)利要求6所述的基質(zhì)，其中所述聚合物是聚乙烯亞胺。
8.如權(quán)利要求6或7所述的基質(zhì)，其中所述聚合物顯示了兩個(gè)或更多個(gè)不同的配體基團(tuán)。
9.如上述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的基質(zhì)，其中所述支撐物是交聯(lián)的多糖。
10.填充了權(quán)利要求1-9中任意一項(xiàng)所定義的分離基質(zhì)的層析柱。
11.制備用于純化抗體基質(zhì)的方法，該方法包含通過胺中的N或通過磺?；械腟將磺酰胺固定于多孔支撐物上的第一步。
12.一種從液體中分離抗體的方法，該方法包括下列步驟(a)提供包含至少一種抗體的液體；(b)將所述的液體與包含一個(gè)或多個(gè)磺酰胺基的分離基質(zhì)接觸，以吸附一或多個(gè)抗體至基質(zhì)；并且，任選地(c)將洗脫劑通過上述基質(zhì)，以釋放一種或多種抗體；以及(d)從洗脫劑餾分中回收至少一種抗體。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中在步驟(a)中提供的液體也包含一種或多種其它蛋白質(zhì)。
14.如權(quán)利要求12或13所述的方法，其中在層析柱中包含步驟(b)中的分離基質(zhì)。
15.如權(quán)利要求12-14中任意一項(xiàng)所述的方法，其中步驟(b)中的分離基質(zhì)如權(quán)利要求1-9的任意一項(xiàng)中所定義。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中步驟(b)在接近中性的pH，如pH 7.2-7.6，優(yōu)選約pH 7.4下進(jìn)行。
17.如權(quán)利要求12-16中任意一項(xiàng)所述的方法，其中步驟(c)是梯度洗脫，通過向分離基質(zhì)中添加鹽濃度遞減的洗脫液而進(jìn)行。
18.如權(quán)利要求12-17中任意一項(xiàng)所述的方法，其中步驟(b)在pH中性或高于中性下完成，并且步驟(c)是通過添加pH遞降的洗脫液而完成的梯度洗脫過程。
19.如權(quán)利要求12-18中任意一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟(d)中回收的抗體是人或人源化抗體。
20.如權(quán)利要求12-19中任意一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟(d)中回收的抗體是免疫球蛋白G(IgG)。
21.如權(quán)利要求12-20中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述抗體是單克隆抗體。
22.測(cè)定抗體量的方法，該方法包含如步驟12-20中任意一項(xiàng)定義的方法以及另外的通過分光光度法測(cè)定抗體的量的步驟(f)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種分離基質(zhì)，它由固定了配體的多孔支撐物構(gòu)成，其中所述的配體包含至少一個(gè)磺酰胺，并且所述磺酰基中的R基包含芳香基。所述磺酰胺中的氮可以是仲胺或叔胺。本發(fā)明也涉及含有上述分離基質(zhì)的層析柱，以及通過吸附于分離基質(zhì)上來分離免疫球蛋白樣化合物的方法。
文檔編號(hào)C08F251/00GK1972746SQ200580020972
公開日2007年5月30日 申請(qǐng)日期2005年6月22日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月24日
發(fā)明者J·-L·馬洛塞爾, B·-L·約漢遜, G·格拉德, N·諾爾曼 申請(qǐng)人:通用電氣健康護(hù)理生物科學(xué)股份公司