專(zhuān)利名稱(chēng)：一種從制備當(dāng)歸注射液的廢棄物中提取當(dāng)歸多糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從制備當(dāng)歸注射液的廢棄物中提取當(dāng)歸多糖的方法。
多聚糖簡(jiǎn)稱(chēng)多糖(Polysaccharides)，是由十個(gè)以上的單糖基通過(guò)甙鏈連接而成。可以以均多糖或雜多糖形式存在。近年來(lái)多糖的生物活性(主要是調(diào)節(jié)免疫功能)逐漸為人們所認(rèn)識(shí)，多糖類(lèi)藥物被認(rèn)為是一類(lèi)新型、高效、低毒類(lèi)藥物，引起國(guó)內(nèi)外醫(yī)藥學(xué)界重視。
當(dāng)歸的化學(xué)成分復(fù)雜，主要分為揮發(fā)油及水溶性組分兩大部分。日本學(xué)者Yamade等從東當(dāng)歸根中分離出分子量13500、結(jié)構(gòu)為6位分枝α(1→4)的水溶性葡聚糖，其多糖組分還含有鼠李糖、巖藻糖、甘露糖、木糖等。然而因產(chǎn)地來(lái)源及制備方法的不同，導(dǎo)致多糖組分中總糖醛酸、蛋白質(zhì)、己糖種類(lèi)和比例不同，生物學(xué)活性差異很大。為此，找到一種簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、對(duì)環(huán)境污染小的方法分離制備當(dāng)歸多糖，且保證其具有穩(wěn)定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)于充分開(kāi)發(fā)傳統(tǒng)植物藥物當(dāng)歸具有重要指導(dǎo)意義，也將取得良好的經(jīng)濟(jì)效益。
本發(fā)明提供的技術(shù)方案是一種從當(dāng)歸注射液提取廢棄物制備當(dāng)歸多糖的方法，將制備當(dāng)歸注射液所得醇沉物，加水溶解，0～10℃靜置后過(guò)濾，去沉淀，濃縮至0.1～2.0g/ml；加入2.0～10.0倍體積的無(wú)水乙醇，0～10℃靜置后過(guò)濾，沉淀、加水溶解、離心、除去沉淀，上清液進(jìn)一步濃縮后，加入2.0～10.0倍體積的無(wú)水乙醇，靜置，棄上清，沉淀以無(wú)水乙醇洗滌、過(guò)濾，至乙醇洗滌沉淀時(shí)黃色褪盡；沉淀物干燥，得到當(dāng)歸多糖(ASP)。
在上述方法中，將制備當(dāng)歸注射液所得醇沉物，加水溶解，靜置后過(guò)濾，去沉淀，濃縮至0.5～1.0g/ml；加入4.0～8.0倍體積的無(wú)水乙醇，0～10℃靜置后過(guò)濾，沉淀、加水溶解、離心、除去沉淀，上清液進(jìn)一步濃縮后，加入4.0～8.0倍體積的無(wú)水乙醇，靜置，棄上清，沉淀以無(wú)水乙醇洗滌、過(guò)濾，至乙醇洗滌沉淀時(shí)黃色褪盡；沉淀物經(jīng)真空干燥或40～70℃烘干，得到當(dāng)歸多糖。
本發(fā)明利用制備當(dāng)歸注射液所得廢棄物來(lái)提取多糖，變“廢”為寶，充分利用中藥資源，簡(jiǎn)便、快捷且對(duì)環(huán)境污染小。
實(shí)施例2從當(dāng)歸注射液提取廢棄物制備當(dāng)歸多糖的方法，取制備當(dāng)歸注射液所得醇沉物，稱(chēng)重，加適量水溶解，3℃靜置10小時(shí)，過(guò)濾，除去沉淀，將上清液濃縮至約0.3g/ml后，加入8倍體積的無(wú)水乙醇，6℃靜置11h，過(guò)濾，沉淀加入適量的水溶解，3500rpm離心10min，除去沉淀，上清液進(jìn)一步濃縮后，加入2倍體積的無(wú)水乙醇，4℃靜置24h，棄上清，沉淀部分用無(wú)水乙醇洗滌、過(guò)濾，反復(fù)數(shù)次，至乙醇洗滌沉淀時(shí)黃色褪盡。沉淀物經(jīng)真空干燥，即得到當(dāng)歸多糖ASP。1.ASP的定性實(shí)驗(yàn)及糖含量測(cè)定1.1試驗(yàn)方法1.1.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作精密稱(chēng)取105℃恒重的葡萄糖0.10g于100ml容量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，取此溶液10ml置于100ml容量瓶中，定容至刻度，制成標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml分別試管中，加蒸餾水稀釋至2ml，兩管平行；另精密吸取蒸餾水2ml作空白對(duì)照，置刻度試管中，分別加入水飽和酚溶液0.5ml，濃硫酸5.0ml，劇烈振蕩10min，于30℃水浴中保溫20min，在島津UV1601分光光度計(jì)490nm處比色。1.1.2 ASP糖含量測(cè)定精密稱(chēng)取制得的ASP0.051g，置100ml容量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，吸取該溶液2、4ml分別置于100ml容量瓶中加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻，取上述兩種濃度溶液各2ml，兩管平行，分別加入水飽和酚溶液0.5ml，濃硫酸5.0ml，劇烈振蕩10min，于30℃水浴中保溫20min，在島津UV1601分光光度計(jì)490nm處比色。1.2試驗(yàn)結(jié)果及分析以不同濃度的葡萄糖溶液與其OD490作回歸分析得直線方程Y＝0.1426+5.08x(回歸系數(shù)r＝0.998)，式中Y表示光密度，x表示葡萄糖的量。將當(dāng)歸多糖溶液加入苯酚和硫酸后由無(wú)色變?yōu)槌壬?，表明由?dāng)歸醇沉物精制而得的物質(zhì)確屬糖類(lèi)。將測(cè)定結(jié)果代入回歸方程Y＝0.1426+5.08x計(jì)算，得出ASP的平均糖含量為65.5％。
進(jìn)一步檢驗(yàn)硫酸-苯酚顯色反應(yīng)的穩(wěn)定性，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品(葡萄糖)和ASP在顯色后不同時(shí)間的OD490值進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)品(ASP)在顯色后的0min～90min內(nèi)OD490無(wú)明顯變化，至反應(yīng)后120min時(shí)，各管OD490值開(kāi)始有所下降。說(shuō)明硫酸--苯酚顯色反應(yīng)在90min以?xún)?nèi)顯色穩(wěn)定。結(jié)果見(jiàn)表1。
表1.硫酸—苯酚顯色反應(yīng)OD490值隨時(shí)間變化表管號(hào) 糖含量OD490(顯色后)/mg0min 15min 30min 60min 90min 120min空白管 0 00 0 0 0 0標(biāo)準(zhǔn)管1 0.01 0.1960.195 0.198 0.199 0.197 0.1711’ 0.01 0.1970.200 0.199 0.196 0.209 0.176標(biāo)準(zhǔn)管2 0.02 0.2460.248 0.249 0.249 0.247 0.2242’ 0.02 0.2400.236 0.236 0.239 0.238 0.219標(biāo)準(zhǔn)管3 0.03 0.3090.310 0.309 0.309 0.307 0.2933’ 0.03 0.3070.309 0.308 0.309 0.305 0.290標(biāo)準(zhǔn)管4 0.04 0.3710.370 0.368 0.372 0.365 0.3504’ 0.04 0.3720.369 0.371 0.369 0.368 0.349標(biāo)準(zhǔn)管5 0.05 0.3990.401 0.403 0.400 0.398 0.3895’ 0.05 0.3970.400 0.398 0.396 0.394 0.386測(cè)定管1 0.02 0.2240.222 0.221 0.223 0.217 0.2061’ 0.02 0.2230.222 0.222 0.221 0.218 0.207測(cè)定管2 0.04 0.2920.294 0.292 0.292 0.293 0.2732’ 0.04 0.2940.293 0.292 0.292 0.288 0.275上表中n’為n的平行管，n＝1、2、3、4或5。2.DEAE-纖維素層析柱分離ASP灌制DEAE-纖維素層析柱稱(chēng)取DEAE-纖維素40克，用適量去離子水潤(rùn)濕，緩慢將潤(rùn)濕的DEAE-纖維素灌入直徑4.5cm的層析柱中，同時(shí)緩慢攪拌以完全除去氣泡，保持DEAE-纖維素層析柱頂端呈水平。用200ml 10％的氫氧化鈉過(guò)柱，再用大量蒸餾水過(guò)柱，至從層析柱中流出的蒸餾水的pH值為7.0。至此DEAE-纖維素層析柱灌制完畢。
將ASP溶液上樣于DEAE-纖維素層析柱，依次以去離子水、酸性洗脫液(冰乙酸∶正丁醇∶蒸餾水＝2∶9∶17，體積比)及堿性洗脫液(10％NaOH，w/v)將ASP洗脫得三種組分ASP-1、ASP-2、ASP-3。ASP的3種分離組分經(jīng)濃縮后，ASP-3溶液在滴入少量乙醇(約溶液體積的10％)即有大量沉淀，ASP-1溶液和ASP-2溶液中仍需加入終濃度為80％的無(wú)水乙醇才能完全沉淀。
3種組分60℃烘干后，ASP-1呈棕灰色粉末狀，ASP-2呈深棕色塊狀，ASP-3呈白色塊狀。3種組分久置空氣中不吸潮。3.ASP分離組分糖含量測(cè)定精密稱(chēng)取制得的ASP的3種分離組分ASP-1、ASP-2、ASP-3各0.05g，其余步驟同ASP糖含量的測(cè)定。將測(cè)得的待測(cè)品的OD490值代入方程Y＝0.1426+5.08x計(jì)算，得ASP-1的糖含量均值為72.14％，ASP-2的糖含量均值為66.11％，ASP-3的糖含量均值為63.53％。4.ASP與其分離組分糖成分分析稱(chēng)取ASP、ASP-1、ASP-2、ASP-3各10mg，各加入4ml 2N H2SO4，封管，100℃水解5小時(shí)，水解液以BaCO3中和，60℃濃縮。在距濾紙底邊2.5cm處用鉛筆劃一直線為起點(diǎn)線，在距濾紙側(cè)邊1.5cm處為第一點(diǎn)樣點(diǎn)，再每隔2.5cm為一點(diǎn)樣點(diǎn)，用玻璃毛細(xì)管將1％標(biāo)準(zhǔn)品溶液和待測(cè)品溶液點(diǎn)樣于各點(diǎn)樣點(diǎn)，標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)品在濾紙上的擴(kuò)散直徑需控制在0.5cm內(nèi)。將濾紙底邊浸入以正丁醇∶乙醇∶水＝40∶11∶19(體積比)混合而成的展開(kāi)劑中，上行法層析12小時(shí)后，將濾紙用吹風(fēng)吹干，均勻噴涂顯色劑(鄰苯二甲酸1.66g和苯胺0.93g共溶于100ml水中，再以正丁醇飽和)，用吹風(fēng)加熱濾紙至各糖點(diǎn)顯色。
ASP、ASP-1、ASP-2、ASP-3被水解為單糖后，經(jīng)過(guò)紙色譜展開(kāi)，可見(jiàn)各標(biāo)準(zhǔn)品在濾紙上的移動(dòng)距離不同，各顯色點(diǎn)的直徑均在1cm內(nèi)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ASP主要含有D-半乳糖和D-阿拉伯糖，ASP-1主要含有D-阿拉伯糖和α-葡萄糖醛酸，ASP-2主要含D-阿拉伯糖，ASP-3主要含D-半乳糖和D-阿拉伯糖。各樣品的RF值見(jiàn)表2。表2.樣品RF值標(biāo)準(zhǔn)品 RF值 標(biāo)準(zhǔn)品 RF值 待測(cè)品 RF值D-核糖 0.16 α-葡萄糖酚醛 0.17 ASP0.10/0.31D-半乳糖 0.10 D-木糖 0.28 ASP-1 0.17/0.31L-鼠李糖 0.37 D-阿拉伯糖 0.31 ASP-2 0.31D-果糖 0.23 D-葡萄糖0.14 ASP-3 0.10/0.315.試劑和材料無(wú)水葡萄糖，北京車(chē)華化學(xué)試劑廠；D-核糖、D-半乳糖、L-鼠李糖、D-果糖、α-葡萄糖醛酸、D-木糖、D-阿拉伯糖、D-葡萄糖，上海化學(xué)試劑三廠；所用試劑均為分析純?？讖?5μm半透膜，Sigma公司，內(nèi)徑1.0mm的玻璃毛細(xì)管，華西醫(yī)科大學(xué)儀器廠；中速定性分析濾紙，杭州富陽(yáng)特種紙廠。
權(quán)利要求
1.一種從制備當(dāng)歸注射液的廢棄物中提取當(dāng)歸多糖的方法，其特征在于將制備當(dāng)歸注射液所得醇沉物，加水溶解，0～10℃靜置后過(guò)濾，去沉淀，濃縮至0.1～2.0g/ml；加入2.0～10.0倍體積的無(wú)水乙醇，0～10℃靜置后過(guò)濾，沉淀、加水溶解、離心、除去沉淀，上清液進(jìn)一步濃縮后，加入2.0～10.0倍體積的無(wú)水乙醇，靜置，棄上清，沉淀以無(wú)水乙醇洗滌、過(guò)濾，至乙醇洗滌沉淀時(shí)黃色褪盡；沉淀物干燥，得到當(dāng)歸多糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于將制備當(dāng)歸注射液所得醇沉物，加水溶解，靜置后過(guò)濾，去沉淀，濃縮至0.5～1.0g/ml；加入4.0～8.0倍體積的無(wú)水乙醇，0～10℃靜置后過(guò)濾，沉淀、加水溶解、離心、除去沉淀，上清液進(jìn)一步濃縮后，加入4.0～8.0倍體積的無(wú)水乙醇，靜置，棄上清，沉淀以無(wú)水乙醇洗滌、過(guò)濾，至乙醇洗滌沉淀時(shí)黃色褪盡；沉淀物經(jīng)真空干燥或40～70℃烘干，得到當(dāng)歸多糖。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從制備當(dāng)歸注射液的廢棄物中提取當(dāng)歸多糖的方法，其特征在于將制備當(dāng)歸注射液所得醇沉物，加水溶解，0～10℃靜置后過(guò)濾，去沉淀，濃縮至0.1～2.0g/ml；加入2.0～10.0倍體積的無(wú)水乙醇，0～10℃靜置后過(guò)濾，沉淀、加水溶解、離心、除去沉淀，上清液進(jìn)一步濃縮后，加入2.0～10.0倍體積的無(wú)水乙醇，靜置，棄上清，沉淀以無(wú)水乙醇洗滌、過(guò)濾，至乙醇洗滌沉淀時(shí)黃色褪盡；沉淀物干燥，得到當(dāng)歸多糖。本發(fā)明利用制備當(dāng)歸注射液所得廢棄物來(lái)提取多糖，變“廢”為寶，充分利用中藥資源，簡(jiǎn)便、快捷且對(duì)環(huán)境污染小。
文檔編號(hào)C08B37/00GK1434059SQ0311853
公開(kāi)日2003年8月6日 申請(qǐng)日期2003年1月27日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月27日
發(fā)明者彭仁琇, 夏雪雁, 李穎, 王智勇, 楊靜 申請(qǐng)人:武漢大學(xué)