專(zhuān)利名稱(chēng)：乙型肝炎病毒前表面抗原蛋白導(dǎo)向藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因工程表達(dá)的融合蛋白，即將乙型肝炎病毒表面抗原(Pres1-65)與毒素蛋白相連接的融合蛋白。毒素蛋白應(yīng)選用對(duì)患病細(xì)胞有針對(duì)性作用的，例如人腫瘤壞死因子或其突變體，特別是第二位由Arg突變?yōu)長(zhǎng)ys的人腫瘤壞死因子突變體。
眾所周知，乙肝表面抗原(HBsAg)是乙型肝炎病毒(HBV)外膜蛋白，由HBV基因組的S開(kāi)放閱讀框架(S-ORF)所編碼，HBsAg含有大、中、小3種分子形式蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)C端具有相同的序列1、2。其中小分子蛋白(SHBs)即主要蛋白由226個(gè)氨基酸組成，中蛋白是在主要蛋白N端加上由55個(gè)氨基酸組成的preS2區(qū)，大分子蛋白(LHBs)則根據(jù)病毒亞型的不同在中蛋白的N端前面再加上由108或119個(gè)氨基酸組成的preS1區(qū)，這三種蛋白都存在糖基化和非糖基化的形式。Lin和Pontisso等實(shí)驗(yàn)表明，LHBs的preS1區(qū)參與病毒與肝細(xì)胞膜的結(jié)合，Petit等指出preS1(21-47)肽段是病毒與含有肝細(xì)胞受體的肝腫瘤細(xì)胞HepG2的結(jié)合位點(diǎn)，但也可能還有preS1(11-14)肽段。Rhyum等認(rèn)為，HBVadr亞型preS1(1-56)肽含有B細(xì)胞和T細(xì)胞抗原決定簇，preS1蛋白含有許多免疫原性比S蛋白更強(qiáng)的T細(xì)胞和B細(xì)胞表位，preS1特異性的細(xì)胞免疫可以幫助克服某些個(gè)體對(duì)S蛋白的免疫無(wú)反應(yīng)狀態(tài)或同時(shí)對(duì)S蛋白和preS2蛋白的雙重?zé)o反應(yīng)狀態(tài)9。實(shí)驗(yàn)還證明，化學(xué)合成的preS1(12-47)肽段接種黑猩猩后，能使黑猩猩對(duì)HBV攻擊獲得良好保護(hù)，因而有人提出基因工程疫苗也應(yīng)帶有preS1蛋自，以期獲得對(duì)HBV比較全面均衡的免疫效果。還有人報(bào)道，preS1抗原的出現(xiàn)與病毒的復(fù)制水平密切相關(guān)，而且乙肝病毒表面抗原上的preS1表位只有在病毒完全消除之后才會(huì)消失，從而可以用作指示病毒復(fù)制劑量以及預(yù)后和評(píng)價(jià)治療效果的檢驗(yàn)指標(biāo)。為此，汪垣等人采用化學(xué)合成preS1(20-47)肽段以及核心抗原與preS1(20-47)融合表達(dá)蛋白，Sidorkieovicz14等則采用與β半乳糖苷酶(450aa)融合表達(dá)得到的preS1(20-4退)四串聯(lián)肽段建立了preS1的抗原-抗體檢測(cè)試劑盒。
本發(fā)明利用乙肝病毒表面抗原preS1對(duì)肝細(xì)胞具有專(zhuān)一親和性和人腫瘤壞死因子具有抗腫瘤活性這兩方面的特點(diǎn)，將含有β細(xì)胞和T細(xì)胞抗原決定簇和肝細(xì)胞結(jié)合的全部位點(diǎn)在內(nèi)的preS1(1-65)肽段(或相關(guān)肽段)同人腫瘤壞死因子或其突變體的羧末端進(jìn)行融合并構(gòu)建成功同時(shí)具有HBV-preS1抗原活性和抗腫瘤活性的融合蛋白，它將有可能發(fā)展成為治療肝癌的導(dǎo)向藥物。
本發(fā)明的創(chuàng)新點(diǎn)和意義在于1、它為今后在人腫瘤壞死因子及其突變體的羧末端接上一個(gè)具有與腫瘤細(xì)胞特異抗原有高親和性的肽段進(jìn)行融合，構(gòu)建成功對(duì)某種腫瘤細(xì)胞具有高效的新的抗腫瘤藥物提示了可能性。
2、它開(kāi)創(chuàng)了乙肝病毒表面抗原PreS1與其它毒素或殺傷蛋白以融合的方式來(lái)構(gòu)建對(duì)肝區(qū)疾病有特異性療效的導(dǎo)向藥物的方向。
3、提供了一條制備乙肝病毒preS1抗原肽段的新方法。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是1、避免了毒素蛋白可能引起的臟器中毒或全身性副反應(yīng)。
2、排除了其他臟器對(duì)藥物的反應(yīng)，在劑量設(shè)置時(shí)只需單純考慮藥物對(duì)肝細(xì)胞的作用，有利于準(zhǔn)確給藥。
3、減少用藥量下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作一步說(shuō)明

圖1是P1、P2、P3、P4引物順序表圖2是preS1(1-65)肽基因序列3是腫瘤壞死因子(h-TNFα)基因序列4是hTNFα-PreS1融合基因序列圖1、preS1(1-65)肽基因的合成根據(jù)HBVadr亞型的基因核苷酸順序，設(shè)計(jì)并合成兩個(gè)PCR引物，其中P1位于PreS1(1-65)基因的5’端并帶有XhoⅠ酶切位點(diǎn)，P2互補(bǔ)于preS1(1-65)肽段末端氨基酸相應(yīng)的基因序列，并含有終止密碼子及BamHⅠ酶切位點(diǎn)，PCR反應(yīng)以含HBVADRⅠ基因的質(zhì)粒FNA為模板，反應(yīng)體積為100μl，含有100pmol的引物P1和P2,10μl10×Taq聚合酶緩沖液，200pmoldNTP，反應(yīng)于PCR自動(dòng)反應(yīng)儀(ThermOlyne公司產(chǎn)品)，按反應(yīng)程序自動(dòng)反應(yīng)30個(gè)循環(huán)，94℃30秒，50℃40秒，72℃40秒，最后于72℃保溫10分鐘，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)氯仿抽提，乙醇沉淀、備用，P1,P2引物順序見(jiàn)圖1。
2、PCR法改造腫瘤壞死因子(hTNFα)基因TNF基因5’端和3’端分別為EcoRⅠ和BamHⅠ識(shí)別位點(diǎn)，并有自己的終止密碼子TAA，為了使preS1(1-65)肽正確融合在hTNFα基因之后，必須消除hTNFα基因的終止密碼子及改變hTNFα3’端的BamHⅠ識(shí)別位點(diǎn)，以便和preS1(1-65)肽的5’端XhoⅠ位點(diǎn)相符，為此，我們?cè)O(shè)計(jì)合成了PCR突變引物P4改造hTNFα的3’端，該引物引進(jìn)了XhoⅠ識(shí)別序列，同時(shí)消除了hTNFα基因3’端的BamHⅠ酶切位點(diǎn)和終止密碼子TAA，5’端設(shè)計(jì)的引物P3含有EcoRⅠ識(shí)別位點(diǎn)，在上述PCR儀上按以下程序反應(yīng)30個(gè)循環(huán)，94℃40秒，52℃50秒，72℃70秒，最后于72℃保溫10分鐘，PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)氯仿抽提，乙醇沉淀、備用。P3,P4引物順序見(jiàn)圖1。
3、改造后的hTNFα基因和preS1(1-65)肽融合基因(簡(jiǎn)稱(chēng)TpreSⅠ)表達(dá)載體(PSB-TpreSⅠ)的構(gòu)建分別用EcoR1/Xhol酶和XhoⅠ/BamHⅠ酶處理TNF基因和preSI(1-65)肽基因的PCR產(chǎn)物，同時(shí)用EcoRⅠ/BamHⅠ酶消化表達(dá)載體PSB-92，酶切回收后，一起在4℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌YK537，酶切鑒定轉(zhuǎn)化子，將含融合基因的轉(zhuǎn)化子用于表達(dá)。
4、外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)含有重組質(zhì)粒(PSB-TpreS1)的大腸桿菌YK537于30℃活化過(guò)夜后，按1∶100轉(zhuǎn)接入2YT培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，迅速轉(zhuǎn)入42℃誘導(dǎo)4-6小時(shí)，5000rpm3分鐘，收集菌體備用。融合蛋白在菌體中以包涵體形式存在，經(jīng)細(xì)胞破碎并分離出包涵體，將純化的100毫克包涵體溶解于5毫升含8M尿素的Tris-Hcl(PH8.0)buffer溶液中，加入等體積的50mM Tris-Hcl(PH8.0)溶液，使尿素濃度為4M，用50mM Tris-Hcl(PH8.0)稀釋10倍，透析復(fù)性，經(jīng)活性測(cè)定粗純化的融合蛋白的TNF細(xì)胞毒比活性為2×104。
權(quán)利要求
1.一種對(duì)肝細(xì)胞具有專(zhuān)一親和性的融合蛋白，其特征在于是將乙型肝炎病毒表面抗原蛋白與人腫瘤壞死因子(hTNFα)或其突變體相融合的蛋白。
2.如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所說(shuō)的乙型肝炎病毒表面抗原蛋白是preS1區(qū)的1-65肽段或相關(guān)肽段。
3.如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所說(shuō)的人腫瘤壞死因子突變體是指其第二位由Arg突變?yōu)長(zhǎng)ys。
4.如權(quán)利要求2所述的融合蛋白，其特征在于為合成preS1(1-65)肽段設(shè)計(jì)了兩個(gè)PCR引物P1和P2。
5.如權(quán)利要求4所述的PCR引物，其特征在于P1位于5′端并帶XhoⅠ酶切位點(diǎn)，P2互補(bǔ)于preS1(1-65)肽段末端氨基酸相應(yīng)的基因序列。
6.如權(quán)利要求4和5所述的PCR引物，其特征在于P1的序列為5’AATCTCGAGATGGGAGGTTGGTCTTCCAAAC3’，P2的序列為CTCGGATCCTCATTATGGCCCGAATGCTCCCGCT3’。
7.如權(quán)利要求1所述的融合蛋自，在于所述的人腫瘤壞死因子(hTNFα)基因是經(jīng)過(guò)改造的，消除了(hTNFα)基因的終止密碼子及改變了hTNFα3′端的BamHⅠ識(shí)別位點(diǎn)，使其與preS1(1-65)肽的5′端XhoⅠ位點(diǎn)相符。
8.如權(quán)利要求7所述的人腫瘤壞死因子基因，其特征在于基因的改造是通過(guò)PCR方法實(shí)現(xiàn)的，為此設(shè)計(jì)了5′端引物P3和3′端突變引物P4。P3的序列為5’AGGAATTCATGGTAAAATCTAGCTCTCGC3’，P4的序列為5’AATCTCGAGCAGAGCGATAATACCGAA3’。
全文摘要
乙型肝炎病毒表面抗原PrdS1蛋白參與乙肝病毒與肝細(xì)胞受體的結(jié)合,同時(shí)也含有B細(xì)胞和T細(xì)胞的抗原決定簇,我們用PCR法合成了HBsAg preS1(1—65)肽段基因,將該基因融合在毒素蛋白基因(腫瘤壞死因子)之后,插入表達(dá)載體中,使融合基因的5’端直接置于大腸肝菌P1啟動(dòng)子下游,經(jīng)培養(yǎng)誘導(dǎo),獲得了毒素蛋白與preSl(1—65)融合蛋白的表達(dá)產(chǎn)物,以人腫瘤壞死因子(hTNFa)為例,SDS－PAGE電泳顯示表達(dá)產(chǎn)物為25KD,約占細(xì)菌總蛋白的35%。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Wertern－blot驗(yàn)證,能分別特異地與hTNFa抗體與preSI抗體結(jié)合,稀釋復(fù)性后,該融合蛋白還具有TNF的生理功能(對(duì)L－929細(xì)胞的細(xì)胞毒活性)經(jīng)DNA序列測(cè)定,preSl(1—65)肽基因正確地融合在hTBFa基因之后。
文檔編號(hào)C07K19/00GK1221753SQ9712521
公開(kāi)日1999年7月7日 申請(qǐng)日期1997年12月30日 優(yōu)先權(quán)日1997年12月30日
發(fā)明者陳常慶, 陳波 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生物工程研究中心