一種肝干細(xì)胞的長(zhǎng)期體外培養(yǎng)和定向分化體系和方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種肝干細(xì)胞的長(zhǎng)期體外培養(yǎng)和定向分化體系和方法，包括一種化學(xué)成份明確的擴(kuò)增培養(yǎng)基，用于小鼠或人肝干細(xì)胞的體外培養(yǎng)；以及一種化學(xué)成份明確的分化培養(yǎng)基，用于將小鼠或人肝干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成熟肝細(xì)胞。本發(fā)明可以從小鼠胚胎肝臟組織或者由人多能干細(xì)胞分化獲得肝母細(xì)胞中選擇性擴(kuò)增肝干細(xì)胞，肝干細(xì)胞可在此條件下培養(yǎng)超過(guò)20代，并維持穩(wěn)定的肝干細(xì)胞分子表型；本發(fā)明進(jìn)一步將培養(yǎng)的小鼠或者人肝干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為可分泌白蛋白，代謝尿素等功能的成熟肝細(xì)胞。
【專利說(shuō)明】一種肝干細(xì)胞的長(zhǎng)期體外培養(yǎng)和定向分化體系和方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種肝干細(xì)胞的長(zhǎng)期體外培養(yǎng)和定向分化體系和方法，包括一種化學(xué)成份明確的擴(kuò)增培養(yǎng)基，用于小鼠或人肝干細(xì)胞的體外培養(yǎng)；以及一種化學(xué)成份明確的分化培養(yǎng)基，用于將小鼠或人肝干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成熟肝細(xì)胞。

【背景技術(shù)】
[0002]我國(guó)每年因肝病死亡的患者超過(guò)30萬(wàn)，但是每年可供移植肝臟僅能滿足5%肝病患者的需求?？晒┮浦哺闻K的匱乏嚴(yán)重限制了該治療手段的臨床應(yīng)用。已有的臨床前和臨床研究表明，成熟肝細(xì)胞或肝干細(xì)胞移植后可在損傷肝臟中再植并重建肝臟，但是無(wú)論是成熟肝細(xì)胞或者肝干細(xì)胞同樣存在來(lái)源匱乏的問(wèn)題。
[0003]將人多能干細(xì)胞(胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞)體外誘導(dǎo)分化為可體外穩(wěn)定培養(yǎng)的肝干細(xì)胞不僅可為肝病患者的細(xì)胞移植提供穩(wěn)定的細(xì)胞來(lái)源，且避免了利用胎肝組織所涉及的倫理學(xué)問(wèn)題，優(yōu)勢(shì)顯而易見(jiàn)。但是目前多能干細(xì)胞的定向誘導(dǎo)大多都是通過(guò)多步驟的時(shí)序性的分化過(guò)程，最終獲得有功能的、終末分化的細(xì)胞(Wobus AM & BohelerKR Embryonic Stem Cells:Prospects for Developmental B1logy and Cell Therapy.Phys1l.Rev.2005 ；85(2): 635-678。)目前，仍無(wú)法將分化體系穩(wěn)定地維持在特定的中間發(fā)育階段，比如組織干細(xì)胞階段。同時(shí)，目前也無(wú)有效的將人多能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為可穩(wěn)定擴(kuò)增的肝干細(xì)胞的方法。
[0004]因此，本領(lǐng)域尚缺乏有效手段擴(kuò)增肝干細(xì)胞，尤其是無(wú)法在化學(xué)成分明確的培養(yǎng)條件下實(shí)現(xiàn)肝干細(xì)胞的如長(zhǎng)期體外培養(yǎng)和定向分化。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種肝干細(xì)胞的長(zhǎng)期體外培養(yǎng)和定向分化體系，該體系包括一種化學(xué)成份明確的擴(kuò)增培養(yǎng)基，用于小鼠或人肝干細(xì)胞的體外培養(yǎng)；以及一種化學(xué)成份明確的分化培養(yǎng)基，用于將小鼠或人肝干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成熟肝細(xì)胞。
[0006]本發(fā)明的另一目的在于提供一種肝干細(xì)胞的長(zhǎng)期體外培養(yǎng)和定向分化的方法，該方法可將人多能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為肝干細(xì)胞，并且可以維持肝干細(xì)胞長(zhǎng)期穩(wěn)定擴(kuò)增并保持定向分化為成熟肝細(xì)胞的能力。
[0007]本發(fā)明的第一方面，是提供一種小鼠或人肝干細(xì)胞的長(zhǎng)期體外培養(yǎng)體系，該體系是一種化學(xué)成份明確的用于培養(yǎng)小鼠或人肝干細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)基，所述的擴(kuò)增培養(yǎng)基包括:
[0008]液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基，
[0009]0.1%-10% (體積百分含量)胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鈉混合液，
[0010]3ηΜ-10 μ M的糖原合成激酶3 β抑制劑，
[0011]0.1 μ Μ-50 μ M的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β受體抑制劑，
[0012]0.1 μ Μ-50 μ M的溶血磷脂酸，
[0013]0.1 μ Μ-50 μ M 的 1-磷酸鞘氨醇，
[0014]0.l-100ng/mL的表皮生長(zhǎng)因子，
[0015]和0.1-lmg/mL的人重組白蛋白或者牛血清白蛋白。
[0016]所述的液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基，選自MEM細(xì)胞培養(yǎng)基、DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基、IMDM細(xì)胞培養(yǎng)基、199細(xì)胞培養(yǎng)基、FlO細(xì)胞培養(yǎng)基、F12細(xì)胞培養(yǎng)基、1640細(xì)胞培養(yǎng)基中的一種或兩種以上。
[0017]優(yōu)選的，所述的擴(kuò)增培養(yǎng)基含有0.5 μ Μ-5 μ M的糖原合成激酶3 β抑制劑；
[0018]優(yōu)選的，所述的擴(kuò)增培養(yǎng)基含有I μ M-1O μ M的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β受體抑制劑；
[0019]優(yōu)選的，所述的擴(kuò)增培養(yǎng)基含有I μ M-1O μ M的溶血磷脂酸；
[0020]優(yōu)選的，所述的擴(kuò)增培養(yǎng)基含有0.1 μ Μ-5 μ M的1_磷酸鞘氨醇；
[0021]優(yōu)選的，所述的擴(kuò)增培養(yǎng)基含有l(wèi)_50ng/mL的表皮生長(zhǎng)因子。
[0022]優(yōu)選的，所述的擴(kuò)增培養(yǎng)基還包括:0.l-5mM尼克酰胺和0.1-100 μ g/mL的維生素C0
[0023]所述的糖原合成激酶3β抑制劑可以是CHIR99021或者其他小分子糖原合成激酶3 β抑制劑；
[0024]所述的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β受體抑制劑可以是Ε-616452或者其他轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β受體抑制劑。
[0025]本發(fā)明的第二方面，是提供一種小鼠或人肝干細(xì)胞的定向分化體系，該體系是一種化學(xué)成份明確的可以將肝干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成熟肝細(xì)胞的分化培養(yǎng)基，所述的分化培養(yǎng)基包括:
[0026]液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基，
[0027]0.1-lOOng/mL肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子，
[0028]0.Ι-lOOng/mL 抑瘤素 M，
[0029]1nM-1O μ M 的地塞米松，
[0030]1nM-1O μ M 的 Y -分泌酶抑制劑 Compound E,和
[0031]0.1 μ Μ-50 μ M的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β受體抑制劑Ε-616452。
[0032]所述的液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基，選自MEM細(xì)胞培養(yǎng)基、DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基、IMDM細(xì)胞培養(yǎng)基、199細(xì)胞培養(yǎng)基、FlO細(xì)胞培養(yǎng)基、F12細(xì)胞培養(yǎng)基、1640細(xì)胞培養(yǎng)基中的一種或兩種以上。
[0033]優(yōu)選的，所述的分化培養(yǎng)基含有5_50ng/mL肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子；
[0034]優(yōu)選的，所述的分化培養(yǎng)基含有5_50ng/mL抑瘤素M ；
[0035]優(yōu)選的，所述的分化培養(yǎng)基含有50ηΜ_5 μ M的地塞米松；
[0036]優(yōu)選的，所述的分化培養(yǎng)基含有100ηΜ-5 μ M的分泌酶抑制劑Compound E ；
[0037]優(yōu)選的，所述的分化培養(yǎng)基含有1μΜ-20μΜ的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β受體抑制劑Ε-616452。
[0038]本發(fā)明的第三方面，是提供一種小鼠或人肝干細(xì)胞的長(zhǎng)期體外培養(yǎng)和定向分化的方法，該方法包括以下步驟:
[0039]Α、利用前述的擴(kuò)增培養(yǎng)基,從肝母(Hepatoblasts)細(xì)胞中選擇性擴(kuò)增肝干細(xì)胞，并對(duì)肝干細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)和傳代；
[0040]B、利用前述的分化培養(yǎng)基，將步驟A獲得的肝干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成熟肝細(xì)胞。
[0041]步驟A中，所述的肝干細(xì)胞肝母細(xì)胞是從小鼠胚胎肝臟組織或者由人多能干細(xì)胞分化獲得的。
[0042]從小鼠胚胎肝臟組織獲得肝母細(xì)胞干細(xì)胞，為本領(lǐng)域公知常識(shí)，可參見(jiàn)文獻(xiàn):Weiss MCjStrick-Marchand H.1solat1n and characterizat1n of mouse hepatic stemcells in vitr0.Semin Liver Dis 2003 ；23:313-324.。
[0043]由人多能干細(xì)胞分化獲得肝母細(xì)胞干細(xì)胞，為本領(lǐng)域公知常識(shí)，可參見(jiàn)文獻(xiàn):Takayama K，Nagamoto Y，Mimura N，Tashiro K，Sakurai F，Tachibana Mj Hayakawa T，etal.Long-Term Self-Renewal of Human ES/iPS-Derived Hepatoblast-1ike Cells onHuman Laminin Ill-Coated Dishes.Stem Cell Reports 2013;1:322-335。
[0044]本發(fā)明的方法，可以從小鼠胚胎肝臟組織或者由人多能干細(xì)胞分化獲得肝母細(xì)胞中選擇性擴(kuò)增肝干細(xì)胞，將肝干細(xì)胞長(zhǎng)期體外培養(yǎng)，并定向誘導(dǎo)分化為成熟肝細(xì)胞。
[0045]本發(fā)明的第四方面，是提供根據(jù)前述的一種小鼠或人肝干細(xì)胞的長(zhǎng)期體外培養(yǎng)和定向分化的方法制備得到的肝干細(xì)胞和成熟肝細(xì)胞。
[0046]本發(fā)明的第五方面，是提供根據(jù)所述的肝干細(xì)胞和成熟肝細(xì)胞在制備肝臟疾病的治療細(xì)胞、肝臟組織工程、肝臟疾病體外藥物篩選中的應(yīng)用。
[0047]本發(fā)明的有益效果:使用本發(fā)明的化學(xué)成份明確的肝干細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基可以從小鼠胚胎肝臟組織或者由人多能干細(xì)胞分化獲得肝母細(xì)胞中選擇性擴(kuò)增肝干細(xì)胞，肝干細(xì)胞可在此條件下培養(yǎng)超過(guò)20代，并維持穩(wěn)定的肝干細(xì)胞分子表型；本發(fā)明的方法無(wú)需使用磁珠或者流式分選的復(fù)雜的、高成本的細(xì)胞純化手段，所培養(yǎng)的肝干細(xì)胞純度可以達(dá)到99%。使用本發(fā)明的化學(xué)成份明確的肝干細(xì)胞分化培養(yǎng)基可以將培養(yǎng)的小鼠或者人肝干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為可分泌白蛋白，代謝尿素等功能的成熟肝細(xì)胞。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0048]圖1為利用化學(xué)成份明確的擴(kuò)增培養(yǎng)基選擇性培養(yǎng)小鼠胚胎肝干細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)至第五代后，即無(wú)法檢測(cè)到內(nèi)皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞基因的表達(dá)(A);且EpCAM陽(yáng)性的肝干細(xì)胞純度可以達(dá)到98.5% (B);細(xì)胞培養(yǎng)至20代仍可保持正常的核型(C)，和穩(wěn)定的基因表達(dá)譜⑶。
[0049]圖2為培養(yǎng)的細(xì)胞具有肝干細(xì)胞的表型、表達(dá)肝干細(xì)胞的標(biāo)志分子，如共表達(dá)Albumin (ALB)和keratin 19 (K19)，肝前體細(xì)胞標(biāo)記物DLKl, EpCAM和CD 133，肝源性轉(zhuǎn)錄因子HNF4a和FoxA2，同時(shí)共表達(dá)上皮細(xì)胞分子標(biāo)記物E-Cadherin和β-Catenin (A);流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示細(xì)胞表達(dá)⑶133 (99%陽(yáng)性率)，K1-67 (88%陽(yáng)性率)，DLKl (94%陽(yáng)性率)，and K19(99% positive) (B);免疫熒光染色結(jié)果顯示，培養(yǎng)的單個(gè)肝干細(xì)胞具有雙向分化潛能，可以分化為ALB陽(yáng)性的肝細(xì)胞和K19陽(yáng)性的膽管上皮細(xì)胞(C)。圖3為培養(yǎng)的肝干細(xì)胞在三維Matrigel中形成的膽管樣結(jié)構(gòu)，A和B為在相差顯微鏡下觀察到的膽管養(yǎng)結(jié)構(gòu)，B為A圖中矩形框的放大圖；C為透射電子顯微鏡觀察到的膽管；免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示形成的膽管樣結(jié)構(gòu)表達(dá)膽管的標(biāo)志分子(D，E，F(xiàn))。
[0050]圖4培養(yǎng)人多能干細(xì)胞分化獲得的肝干細(xì)胞，培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)肝干細(xì)胞的標(biāo)志分子，如共表達(dá) CD54/DLK1 (A)，AFP/HNF4 (B)，EpCAM/HNF4 (C)，pan_CK/FoxA2 (D)，E-cad/K1-67 (E);流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示細(xì)胞K1-67的陽(yáng)性率可以達(dá)到99% ;EpCAM的陽(yáng)性率可以達(dá)到89% (F)。
[0051]圖5為肝干細(xì)胞分化為成熟肝細(xì)胞，在分化誘導(dǎo)條件下經(jīng)過(guò)兩周的體外培養(yǎng)，肝干細(xì)胞可以高比例的分化為表達(dá)并可分泌ALB的成熟肝細(xì)胞(A，B和C，B為A圖中矩形框的放大圖)；分化后的細(xì)胞具有攝取乙?；兔芏戎鞍椎哪芰?D)，同時(shí)可以攝入熒光素標(biāo)記的膽酸并將膽酸分泌到細(xì)胞間膽管(E);分化后的細(xì)胞具有合成尿素的能力(F)。

【具體實(shí)施方式】
[0052]下面結(jié)合本發(fā)明的附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施作詳細(xì)說(shuō)明，以下實(shí)施例是在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。
[0053]實(shí)施例1:擴(kuò)增小鼠胚胎肝干細(xì)胞
[0054]取懷孕12.5天的小鼠胚胎,取出胚胎肝臟,用Accutase酶(Invitrogen公司)消化后，將單細(xì)胞懸液接種于0.5% Matrigel基質(zhì)膠(BD B1science公司)或者20 μ g/mlLaminin (Invitrogen公司)包被的6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)基為DMEM/F12 (Invitrogen公司),包含胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鈉混合液(Invitrogen公司)，3 μ M CHIR99021 (Tocris公司),2 μ M E-616452 (Sigma-Aldrich 公司),5 μ M 的溶血憐脂酸(Sigma-Aldrich 公司)，0.5 μ M的1-磷酸鞘氨醇(Sigma-Aldrich公司)，20ng/mL的表皮生長(zhǎng)因子(R&D Systems公司)和50 μ g/mL的人重組白蛋白(R&D Systems公司)。細(xì)胞生長(zhǎng)至70%匯合時(shí)用Accutase酶進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
[0055]該培養(yǎng)條件可以選擇性的擴(kuò)增胚胎肝干細(xì)胞，如圖1所示，細(xì)胞培養(yǎng)五代后不再能檢測(cè)到血管內(nèi)皮和成纖維細(xì)胞的存在(圖1A)，且肝干細(xì)胞的純度可以達(dá)到95%以上(圖1B)。肝干細(xì)胞在此條件下可以連續(xù)傳代超過(guò)20代，并保持細(xì)胞核型(圖1C)和基因表達(dá)譜的穩(wěn)定(圖1D)。
[0056]在該條件培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)肝干細(xì)胞的標(biāo)志分子(圖2)，如共表達(dá)Albumin (ALB)和keratin 19 (K19)，肝前體細(xì)胞標(biāo)記物DLK1，EpCAM和⑶133，肝源性轉(zhuǎn)錄因子HNF4 α和FoxA2,同時(shí)共表達(dá)上皮細(xì)胞分子標(biāo)記物E-Cadherin和β -Catenin (圖2Α)。流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示細(xì)胞表達(dá)⑶133 (99%陽(yáng)性率)，K1-67 (88%陽(yáng)性率)，DLKl (94%陽(yáng)性率)，andK19(99% positive)(圖 2B)。
[0057]免疫熒光染色結(jié)果顯示，培養(yǎng)的單個(gè)肝干細(xì)胞具有雙向分化潛能，可以分化為ALB陽(yáng)性的肝細(xì)胞和K19陽(yáng)性的膽管上皮細(xì)胞(圖2C)。培養(yǎng)的肝干細(xì)胞在三維Matrigel中可以形成膽管樣結(jié)構(gòu)(圖3A，B)。電子顯微鏡觀察顯示膽管細(xì)胞的內(nèi)腔面有大量的微絨毛(圖3C);且形成的膽管樣結(jié)構(gòu)表達(dá)膽管的標(biāo)志分子,如K19, Integrin α 6, Integrin β 4和Aqul 等(圖 3D, Ε, F)。
[0058]以上結(jié)果表明本發(fā)明建立的肝干細(xì)胞培養(yǎng)體系可以從小鼠胚胎肝臟中選擇性的擴(kuò)增肝干細(xì)胞，并可以在體外維持肝干細(xì)胞的長(zhǎng)期穩(wěn)定自我更新。
[0059]實(shí)施例2:擴(kuò)增人多能干細(xì)胞分化獲得的肝干細(xì)胞
[0060]人多能干細(xì)胞Hl和Hues9細(xì)胞(Wicell公司)培養(yǎng)于0.5%基質(zhì)膠包被的6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)基為為 DMEM/F12，包含 I % N2 (Invitrogen 公司)，I % B27 (Invitrogen 公司)和20ng/ml bFGF(Invitrogen公司)。細(xì)胞生長(zhǎng)至50%融合時(shí)更換培養(yǎng)基為DMEM/F12，B27 (無(wú)胰島素)，100ng/ml Activin A (R&D Systems公司)培養(yǎng)四天誘導(dǎo)細(xì)胞分化為內(nèi)胚層細(xì)胞；然后更換培養(yǎng)基為 DMEM/F12，包含 I % N2, I % B27，5 μ M SB431542 (Sigma-Aldrich公司)和10ng/ml BMP4 (Invitrogen公司)培養(yǎng)2天誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)一部分化為腹側(cè)前腸；然后更換培養(yǎng)基為 DMEM/F12，包含 I % N2, I % B27,10ng/ml bFGF 和 10ng/mlBMP4 培養(yǎng) 5 天誘導(dǎo)細(xì)胞分化為肝母細(xì)胞。再次將培養(yǎng)基更換為DMEM/F12，包含胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鈉混合液，3 μ M CHIR99021,2yM E-616452，5 μ M的溶血磷脂酸，0.5 μ M的1-磷酸鞘氨醇，20ng/mL的表皮生長(zhǎng)因子和50 μ g/mL的人重組白蛋白，進(jìn)行肝干細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)至70%匯合時(shí)用Accutase酶進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
[0061]該培養(yǎng)條件可以選擇性的擴(kuò)增人多能干細(xì)胞分化獲得的肝干細(xì)胞，且獲得的人肝干細(xì)胞在該條件下可連續(xù)培養(yǎng)超過(guò)20代。如圖4所示，培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)肝干細(xì)胞的標(biāo)志分子，如共表達(dá) CD54/DLK1 (圖 4A)，AFP/HNF4 (圖 4B)，EpCAM/HNF4 (圖 4C)，pan_CK/FoxA2 (圖4D)，E-cad/K1-67 (圖4E)。流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示細(xì)胞Ki_67的陽(yáng)性率可以達(dá)到99% ；EpCAM的陽(yáng)性率可以達(dá)至Ij 89% (圖4F)。
[0062]以上結(jié)果表明本發(fā)明建立的肝干細(xì)胞培養(yǎng)體系可以從人多能干細(xì)胞分化獲得的肝母細(xì)胞中選擇性的擴(kuò)增人肝干細(xì)胞，并可以在體外維持人肝干細(xì)胞的長(zhǎng)期穩(wěn)定自我更新。
[0063]實(shí)施例3:誘導(dǎo)肝干細(xì)胞分化為成熟肝細(xì)胞
[0064]接種小鼠或者人體外培養(yǎng)的肝干細(xì)胞于0.5%基質(zhì)膠包被的6孔培養(yǎng)板(10000細(xì)胞/孔)。培養(yǎng)基為DMEM/F12，包含胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鈉混合液，20ng/mL肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子，20ng/mL抑瘤素M，10nM的地塞米松I μ M的Y -分泌酶抑制劑Compound E和2μ M的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β受體抑制劑Ε-616452。
[0065]經(jīng)過(guò)兩周的體外培養(yǎng)，成熟肝細(xì)胞標(biāo)志分子的表達(dá)顯著上調(diào)；在此誘導(dǎo)條件下肝干細(xì)胞可以高比例的分化為表達(dá)并可分泌ALB的成熟肝細(xì)胞；分化后的細(xì)胞具有攝取乙?；兔芏戎鞍椎哪芰?，同時(shí)可以攝入熒光素標(biāo)記的膽酸并將膽酸分泌到細(xì)胞間膽管；分化后的細(xì)胞具有合成尿素的能力(圖5)。
[0066]以上結(jié)果表明本發(fā)明建立的肝干細(xì)胞分化體系可以將肝干細(xì)胞高效的誘導(dǎo)分化為具有功能的成熟肝細(xì)胞。
[0067]以上已對(duì)本發(fā)明創(chuàng)造的較佳實(shí)施例進(jìn)行了具體說(shuō)明，但本發(fā)明創(chuàng)造并不限于所述實(shí)施例，熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不違背本發(fā)明創(chuàng)造精神的前提下還可作出種種的等同的變型或替換，這些等同的變型或替換均包含在本申請(qǐng)權(quán)利要求所限定的范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種小鼠或人肝干細(xì)胞的長(zhǎng)期體外培養(yǎng)體系，其特征在于，該體系是一種化學(xué)成份明確的用于培養(yǎng)小鼠或人肝干細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)基，所述的擴(kuò)增培養(yǎng)基包括: 液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基， 0.1% -10%的胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鈉混合液， 3ηΜ-10 μ M的糖原合成激酶3 β抑制劑， 0.1 μ Μ-50 μ M的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β受體抑制劑， 0.1 μ Μ-50 μ M的溶血磷脂酸， 0.1 μ Μ-50 μ M的1-磷酸鞘氨醇， 0.1-lOOng/mL的表皮生長(zhǎng)因子，和 0.1-lmg/mL的人重組白蛋白或者牛血清白蛋白； 所述的液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基，選自MEM細(xì)胞培養(yǎng)基、DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基、IMDM細(xì)胞培養(yǎng)基、199細(xì)胞培養(yǎng)基、FlO細(xì)胞培養(yǎng)基、F12細(xì)胞培養(yǎng)基、1640細(xì)胞培養(yǎng)基中的一種或兩種以上。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種小鼠或人肝干細(xì)胞的長(zhǎng)期體外培養(yǎng)體系，其特征在于，所述的擴(kuò)增培養(yǎng)基包括: 0.5 μ Μ-5 μ M的糖原合成激酶3 β抑制劑； I μ M-1O μ M的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β受體抑制劑； I μ M-1O μ M的溶血磷脂酸; 0.1 μ Μ-5 μ M的1-磷酸鞘氨醇； l-50ng/mL的表皮生長(zhǎng)因子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種小鼠或人肝干細(xì)胞的長(zhǎng)期體外培養(yǎng)體系，其特征在于，所述的擴(kuò)增培養(yǎng)基還包括:0.l_5mM尼克酰胺和0.1-100 μ g/mL的維生素C。
4.一種小鼠或人肝干細(xì)胞的定向分化體系，其特征在于，該體系是一種化學(xué)成份明確的可以將肝干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成熟肝細(xì)胞的分化培養(yǎng)基，所述的分化培養(yǎng)基包括: 液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基， 0.1-lOOng/mL肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子，
0.l-100ng/mL 抑瘤素 M, 1nM-1O μ M的地塞米松， 1nM-1O μ M的Y-分泌酶抑制劑Compound E,和 0.1 μ Μ-50 μ M的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β受體抑制劑Ε-616452 ； 所述的液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基，選自MEM細(xì)胞培養(yǎng)基、DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基、IMDM細(xì)胞培養(yǎng)基、199細(xì)胞培養(yǎng)基、FlO細(xì)胞培養(yǎng)基、F12細(xì)胞培養(yǎng)基、1640細(xì)胞培養(yǎng)基中的一種或兩種以上。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種小鼠或人肝干細(xì)胞的定向分化體系，其特征在于，所述的分化培養(yǎng)基包括: 5-50ng/mL肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子； 5-50ng/mL 抑瘤素 M ； 50ηΜ-5 μ M的地塞米松； 100ηΜ-5 μ M的y-分泌酶抑制劑Compound E ； 1μΜ-20μΜ的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β受體抑制劑Ε-616452。
6.—種小鼠或人肝干細(xì)胞的長(zhǎng)期體外培養(yǎng)和定向分化的方法,其特征在于,該方法包括以下步驟: Α、利用如權(quán)利要求1-3任一所述的擴(kuò)增培養(yǎng)基，從肝母細(xì)胞中選擇性擴(kuò)增肝干細(xì)胞，并對(duì)肝干細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)和傳代； B、利用如權(quán)利要求4或5所述的分化培養(yǎng)基，將步驟A獲得的肝干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成熟肝細(xì)胞。
7.—種如權(quán)利要求6所述的小鼠或人肝干細(xì)胞的長(zhǎng)期體外培養(yǎng)和定向分化的方法制備得到的肝干細(xì)胞和成熟肝細(xì)胞。
8.—種如權(quán)利要求7所述的肝干細(xì)胞和成熟肝細(xì)胞在制備肝臟疾病的治療細(xì)胞、肝臟組織工程、肝臟疾病體外藥物篩選中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12Q1/02GK104388383SQ201410635815
【公開(kāi)日】2015年3月4日 申請(qǐng)日期:2014年11月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月29日
【發(fā)明者】李文林, 呂林潔, 張木子, 孫平新 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)