專利名稱：由酵母生產(chǎn)和分泌重組血纖維蛋白原的制作方法
政府權(quán)利本項工作得到聯(lián)邦政府部分資助，批準(zhǔn)號為HL37457。政府對本發(fā)明具有一定的權(quán)利。
背景技術(shù)：
1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及重組血纖維蛋白原、血纖維蛋白原變體及其亞基的一種新表達(dá)系統(tǒng)、用該表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化的酵母、利用該表達(dá)系統(tǒng)克隆血纖維蛋白原、血纖維蛋白原變體及其亞基的用途，以及利用重組血纖維蛋白原、血纖維蛋白原變體及其亞基作為研究工具或在醫(yī)學(xué)上，例如在診斷測定中或作為治療某些適應(yīng)癥的治療手段的用途。
2.對相關(guān)技術(shù)的描述血纖維蛋白原是血纖維蛋白的可溶性前體，為血塊的主要成分。對血纖維蛋白原的結(jié)構(gòu)已進(jìn)行廣泛的研究。關(guān)于其結(jié)構(gòu)，可參見M.Furlon的“血纖維蛋白原、血纖維蛋白穩(wěn)定作用和血纖維蛋白溶解作用”、J.L.Francis編著，Chichester，Ellis Horwood，1988，17-64頁；M及R.F.Doolittle，1984，《生物化學(xué)年鑒》，53195。
血纖維蛋白原由三種不同的多肽鏈(稱做Aα、Bβ和γ)構(gòu)成，是以二聚體排列的且每個半分子含有一組每種鏈。兩個半分子在多肽的氨基末端部分通過三個二硫鍵連接起來。兩個對稱鍵位于相鄰γ鏈之間。另一個位于Aα鍵之間。另外，一組綜合的鏈間或鍵內(nèi)二硫鍵(有29個二硫鍵，沒有自由巰基)與保持適當(dāng)?shù)慕Y(jié)構(gòu)有關(guān)。
血纖維蛋白原基本為直線型，由限定于一較小中心區(qū)的兩個末端兩葉區(qū)域構(gòu)成。多肽α，β和γ的氨基末端包含在中心區(qū)中并相連。
血纖維蛋白原對凝血酶是敏感的。凝血酶從血纖維蛋白原的α及β鏈的末端切割肽。所釋放的鏈被分別稱為血纖維蛋白肽A和B。從血纖維蛋白原α及β鏈的氨基末端去除血纖維蛋白原A和B可產(chǎn)生稱為“血纖維蛋白單體”的實體，其自發(fā)性聚合可產(chǎn)生血纖維蛋白。
每一個血纖維蛋白單體在中心區(qū)都含有特定的聚合位點(或“結(jié)”)，其在血纖維白原中被血纖維蛋白肽A及B遮住。血纖維蛋白肽A及B的釋放暴露了這些結(jié)，其帶正電并可與位于鄰近分子末端區(qū)上的互補性帶負(fù)電的“洞”連接。
開始時，血纖維蛋白單體聚合而形成了雙股原纖維，其中，一個分子的中心區(qū)與交迭的半分子中兩個鄰近分子的每一個之末端區(qū)締合。這些原纖維在存在因子XIIIa(血纖維蛋白穩(wěn)定因子)和Ca++的條件下相交聯(lián)而形成血纖維蛋白。交聯(lián)也可以由凝血酶催化，凝血酶可以使無活性的酶前體因子XIII轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚孕问降囊蜃覺IIIa。
血纖維蛋白凝塊將成為臨時性的密封劑，因而可作為正常愈傷過程的一部分被頂換。血纖維蛋白溶酶可降解血纖維蛋白凝塊并且血纖維蛋白溶酶原轉(zhuǎn)為血纖維蛋白溶酶可調(diào)整溶解的速度。最重要的血纖維蛋白溶酶原轉(zhuǎn)變過程涉及到組織血纖維蛋白溶酶原激活子(t-PA)，它是從受損傷的內(nèi)皮細(xì)胞中釋放出來的。t-PA本身在激活血纖維蛋白溶酶原方面并不是非常有效，但是血纖維蛋白和各種血纖維蛋白分解產(chǎn)物的存在會極大地加快激活過程。
除了其在凝塊形成中的作用，血纖維蛋白原還參與血小板的聚集作用。高親和性“血小板識別位點”已經(jīng)定位在兩γ鏈(殘基397-411)的相反末端處的親水性羧基末端五十肽上?？磥磉@個片段可形成適合血小板血纖維蛋白原受體的鹽橋γ環(huán)。在血纖維蛋白原被血小板受體在任一γ末端結(jié)合以后，該分子就具有足夠的“區(qū)域”以在其自由末端至相鄰血小板上的血纖維蛋白原受體上形成橋路。而后，兩個血小板上的受體彼此遷移，因而加強了橋路。另一些血小板類似地卷入，因而導(dǎo)致了網(wǎng)絡(luò)的形成。
雖然血纖維蛋白原的主要功能是凝塊形成和血小板降聚集，但血纖維蛋白原也與廣泛種類的其它蛋白質(zhì)和細(xì)胞相互作用。例如，當(dāng)受到刺激或損傷時，沿血管系統(tǒng)排列的內(nèi)皮細(xì)胞也會結(jié)合血纖維蛋白原。血纖維蛋白原上的內(nèi)皮細(xì)胞的主要結(jié)合位點似乎與結(jié)合血小板時所涉及的位點是相同的。參見D.A.Cheresch等人，1989，“細(xì)胞”，58945。另外，在能夠“凝聚”某些金黃色葡萄球菌菌株的血漿蛋白質(zhì)之中，血纖維蛋白原是獨特的。血纖維蛋白原上的主要“凝聚”位點似乎也與結(jié)合血小板時所涉及的那些位點是相同的。參見J.Hawiger等人，1982，“生物化學(xué)”，211407。
哺乳動物體內(nèi)主要(也許是唯一)的血纖維蛋白原生物合成位點是肝臟。肝細(xì)胞是合成的主要位點，而血纖維蛋白原的每一個組分鏈?zhǔn)怯梢粋€獨立的基因編碼的。這些基因被表達(dá)，鏈締合，形成適宜的二疏鏈，六聚體被釋放到循環(huán)系統(tǒng)中并轉(zhuǎn)運至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，在那里它們被糖基化、磷酸化以及硫酸化。
由于其臨床結(jié)果或在常規(guī)篩選過程中，已經(jīng)鑒定出了數(shù)百種天然存在的血纖維蛋白原變體。這些變體對于了解血纖維蛋白原-血纖維蛋白的生物化學(xué)十分有益，在許多情況下對了解結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系提供了重要幫助。雖然天然存在的變體具有價值，但它們不久就要因利用在重組系統(tǒng)中表達(dá)的重組性血纖維蛋白原而進(jìn)行的位點針對性誘變實驗而變得相形見絀。
例如，為了研究在二硫鍵γCys326-γCys339的鈣結(jié)合中的作用，有一家實驗室已經(jīng)利用位點針對性誘變通過在大腸桿菌中表達(dá)編碼修飾多肽的DNA合成了一種缺乏Cys326及Cys339的多肽。參見M.G.Bolyard等人，1990，“生物化學(xué)及生物物理研究通訊”，174853。
有趣的是，在凝血能力中也牽涉到相同的γCys326-γCys339鍵。R.Procyk等人(1990，“生物化學(xué)”，291501-1507)表明，該鍵是在缺少鈣的條件下在用低濃度二硫蘇糖醇對血纖維蛋白原進(jìn)行適度還原期間發(fā)生斷裂的鍵之一。有限的還原的結(jié)果是凝血能力的喪失，后來確定了這顯然是由血纖維蛋白原上的羧基末端聚合位點的微擾造成的。這種羧基末端聚合位點的微擾又顯然是γCys326-γCys339鍵斷裂的后果。參見R.Procyk等人，1992，“生物化學(xué)”，312273。共同未決的美國專利申請NO.071946，826(其全部內(nèi)部合并于本文作為參考)授說，以該方式還原的血纖維蛋白原具有與血纖維蛋白及血纖維蛋白單體基本相同的生化和免疫學(xué)等價性，因此在需要這些種類的測定中可用作血纖維蛋白或備纖維蛋白單體的替代物。這樣的測定包括，例如，對下列項目的常規(guī)定量測定(i)血纖維蛋白單體，(ii)血纖維蛋白溶酶激活子抑制劑活性，(iii)組織血纖維蛋白溶酶原激活子活性，(iv)免疫測定。
利用位點針對性誘變來構(gòu)建編碼這種還原性血纖維蛋白原或一些另外的血纖維蛋白原變體的DNA序列，然后構(gòu)建含有這種DNA的表達(dá)載體，用這種表達(dá)載體來轉(zhuǎn)化適宜的宿主并隨后誘導(dǎo)該宿主以表達(dá)DNA，這樣做是可行的。
我們的實驗室及其他人士已描述過轉(zhuǎn)染的動物細(xì)胞產(chǎn)生重組血纖維蛋白原的系統(tǒng)。參見S.N.Roy等人，1991，生物化學(xué)雜志，2664758(在COS-1及Hep G2細(xì)胞中的表達(dá))；R.Hartwig等人，生物化學(xué)雜志，2666578(在COS-1細(xì)胞中的表達(dá))及D.H.Farrell等人，1991，生物化學(xué)，309414[在幼倉鼠腎(BHK)細(xì)胞中的表達(dá)]。然而，這些系統(tǒng)只能產(chǎn)生少量的血纖維蛋白原，其很難形成規(guī)模化。
作為研究工具，重組血纖維蛋白原無疑是很有用的，而且除此之外在醫(yī)學(xué)上也是很有用的，例如在制備用于傷口愈合或在某些病例中用于輸入血纖維蛋白原過少患者體內(nèi)的“血纖維蛋白膠”方面。
本發(fā)明概述本發(fā)明的主要目的在于提供一種用于較大量地表達(dá)重組血纖維蛋白原、重組血纖維蛋白原變體及重組血纖維蛋白原亞基的系統(tǒng)。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種重組血纖維蛋白原，重組血纖維蛋白原變體及重組血纖維蛋白原亞基的表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)容易形成規(guī)?；?br> 本發(fā)明還有一個目的就是提供重組血纖維蛋白原、重組血纖維蛋白原變體及重組血纖維蛋白原亞基以及這類重組蛋白質(zhì)在研究中和在醫(yī)學(xué)中作為治療手段不在診斷測定中的應(yīng)用。
這些及其它目的與在本發(fā)明相符合，本發(fā)明一般涉及到含有至少一種編碼血纖維蛋白原或其變體的多肽鏈的cDNA的酵母的表達(dá)載體。一種具體實例包括含編碼血纖維蛋白原或其變體的Aα鏈的cDNA、編碼纖維蛋白原或其變體的Bβ鏈的cDNA及編碼血纖維蛋白原或其變體的γ鏈的cDNA的酵母的表達(dá)載體。
本發(fā)明的第二個具體實例涉及用這種載體轉(zhuǎn)化的酵母。
本發(fā)明的第三個具體實例包括在酵母中表達(dá)血纖維蛋白原或其變體或亞基的方法，包括以下步驟(a)構(gòu)建或得到含至少一種編碼血纖維蛋白原或其變體的多肽鏈的cDNA的酵母的表達(dá)載體；(b)用所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化酵母，篩選穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體；(c)將轉(zhuǎn)化體保持在培養(yǎng)基中，條件為使血纖維蛋白原或其變體或亞基分泌到上述培養(yǎng)基中；和(d)從培養(yǎng)基中回收血纖維蛋白原或其變體或亞基。
本發(fā)明的第四個具體實例涉及通過本發(fā)明方法產(chǎn)生的重組纖維蛋白原或其變體或亞基。
與可能使用的其它表達(dá)系統(tǒng)相比，本發(fā)明的酵母系統(tǒng)可令人驚奇地產(chǎn)生至少多10倍的重組血纖維蛋白原。另外，采用本發(fā)明的酵母系統(tǒng)很容易生產(chǎn)大量的重組血纖維蛋白原。此外，利用本發(fā)明的酵母系統(tǒng)，重組血纖維蛋白原是主要的分泌蛋白質(zhì)，因而很容易從培養(yǎng)基中純化出來。
附圖的簡要說明

圖1的質(zhì)粒pYES2圖譜。
圖2表示人血漿及酵母重組血纖維蛋白原的SDS-PAGE及Western印跡分析。
圖3表示人血漿及酵母重組血纖維蛋白原的凝血酶誘導(dǎo)性凝血及交聯(lián)的SDS-PAGE和Western印跡分析。
本發(fā)明詳述本發(fā)明提供了重組人血纖維蛋白原或其變體或亞基，其可以用于研究或用作醫(yī)學(xué)上的治療手段或用作診斷測定的試劑?！把w維蛋白原變體”或簡稱“變體”意指實質(zhì)上具有人血纖維蛋白原氨基酸序列的多肽，但其中已通過常規(guī)方法有目的地進(jìn)行了一個或多個插入、缺失、增加和/或置換?！把w維蛋白原亞基”或簡稱“亞基”意指具有人血纖維蛋白原或血纖維蛋白原變體的單體α，β或γ鏈或者除含每兩種鏈的完整分子外的這些鏈的任意組合的氨基酸序列之多肽。這些鏈的各種組合可作為研究工具用于研究功能蛋白質(zhì)的生物合成和組裝。
人血纖維蛋白原的α、β及γ鏈的cDNA已經(jīng)得到分離和表征?？煞謩e參見M.W.Rixon等人，1983，生物化學(xué)，223237；D.W.Chung等人，1983。生物化字，223244；以及D.W.Chung等人，1983，生物化學(xué)，223250。然而，由于密碼簡并，在編碼相同氨基酸序列的核苷酸序列中會有相當(dāng)大的變異。對于本發(fā)明的目的而言，當(dāng)提到“編碼血纖維蛋白原多肽鏈的cDNA”時，這種“簡并變體”也可以利用和予以考慮。這里所用的術(shù)語“簡并變體”指由于遺傳密碼的簡并性而可以編碼與另一種DNA序列所編碼者相同的氨基酸序列的任何DNA序列。
本發(fā)明還提供在酵母中產(chǎn)生有用量的純化血纖維蛋白原或其變體或亞基的表達(dá)載體。這里所使用的術(shù)語“酵母”意欲包括任何酵母菌株，尤其是釀酒酵母或栗酒酵母，還包括其它屬的菌株(如畢赤酵母屬或克魯維酵母屬)，它們也已被用作生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的菌株。
一般來說，該載體可含有至少一種編碼血纖維蛋白原或其變體多肽鏈(α、β和/或γ)的cDNA，它可操作地聯(lián)結(jié)于來自酵母的調(diào)節(jié)元件上。酵母細(xì)胞系用該載體轉(zhuǎn)化之后，可以誘發(fā)該載體表達(dá)所編碼的多肽鏈或當(dāng)該載體含有所有三種鏈時表達(dá)適當(dāng)組裝的血纖維蛋白原或其變體。酵母中所使用的載體是領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的。該載體包括所謂的“穿梭載體”，其在大腸桿菌和酵母中都可以復(fù)制。對該載體的一般描述見J.D.Watson等人，重組DNA，第2版，紐約，W.H.Treeman及Company，1992，235-253頁。對該載體以及酵母遺傳學(xué)基本技術(shù)(包括酵母培養(yǎng)基的制備、菌株貯存和再生、菌株生長和操作、誘變、高效轉(zhuǎn)化、可選擇標(biāo)記物、表達(dá)暗盒、復(fù)制子、啟種子、引導(dǎo)子、終止子、分泌的信號序列等等)的詳細(xì)描述見F.M.Ausubel等人，(編著)“釀酒醇母”，引自F.M.Ausubel等人(編著)，“分子生物學(xué)的簡短方案”，第2版，紐約，John Wiley和Sons，1992，13-1-13-49頁，其全部內(nèi)容合并于此供參考。
一般來說，酵母既可以在液體培養(yǎng)基中也可以在固體瓊脂平板表面(或包埋其中)生長，但優(yōu)選液體培養(yǎng)。酵母最好是生長在含葡萄糖、氮、磷、痕量金屬及蛋白質(zhì)和酵母-細(xì)胞提取液水解產(chǎn)物的液體培養(yǎng)基上，該培養(yǎng)基可以提供細(xì)胞正常性全面合成所需的氨基酸、核苷酸前體，維生素及其它代謝物。除葡萄糖以外，酵母也可在多種其它碳源上生長，例如半乳糖、麥芽糖、果糖及棉子糖。在特別優(yōu)選的實施方案中(下面將詳述)，我們在Gal-1啟動子元件的控制下進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，其可用半乳糖來誘導(dǎo)。培養(yǎng)基應(yīng)進(jìn)行滅菌(如在151b/in2下高壓滅菌15分鐘，而制備大量培養(yǎng)基時該消毒時間還需延長)。在這種培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)時，酵母細(xì)胞大約每90分鐘分裂一次。
依據(jù)其在酵母中的復(fù)制模式，酵母載體可分成五大類YIp(酵母整合質(zhì)粒)、YRp(酵母復(fù)制質(zhì)粒)、YCp(酵母著絲粒質(zhì)粒)、YEp(醇母附加型質(zhì)粒)和YLp(酵母線性質(zhì)粒)。除YLp之外，其余都是穿梭載體。YIp質(zhì)粒含可選擇的醇母基團，但缺少可使質(zhì)粒在酵母中自我復(fù)制的序列。相反，可經(jīng)過把YIp質(zhì)粒整合入酵母基因組中而發(fā)生酵母的轉(zhuǎn)化。YRp質(zhì)粒含有來自酵母基因組(它可以賦予自我復(fù)制的能力)的序列。YRp質(zhì)粒具較高的轉(zhuǎn)化頻率(103-104轉(zhuǎn)化體/μgDNA)，但有時轉(zhuǎn)化體在有絲分裂和減數(shù)絲分裂期間是不穩(wěn)定的。YCp質(zhì)粒含有來自酵母著絲粒的DNA片段，它可以極大地提高減數(shù)分裂和有絲分裂期間的穩(wěn)定性。YLp質(zhì)粒在其末端含某些富含G的重復(fù)序列，其行使端粒的功能，可使質(zhì)粒復(fù)制成線性分子。然而，對本發(fā)明的目的來說，YEp質(zhì)粒是優(yōu)選的。這些質(zhì)粒含有來自稱為“2μm圈”的天然存在的酵母質(zhì)粒的序列。這些2μm序列可使染色體外復(fù)制發(fā)生并賦予高轉(zhuǎn)化效率(～104-105轉(zhuǎn)化體/μgDNA)。在減數(shù)分裂和有絲分裂期間這些質(zhì)粒是相對穩(wěn)定的，因而一般可用于酵母的高水平基團表達(dá)。
一般來說，異源結(jié)構(gòu)序列是在具轉(zhuǎn)譯起始及終止序列、可選擇的標(biāo)記物及優(yōu)選地能夠指導(dǎo)轉(zhuǎn)譯蛋白質(zhì)分泌入胞外培養(yǎng)基中的先導(dǎo)序列的適宜的閱讀框架中進(jìn)行組裝的。通常使用的可選擇標(biāo)記物為野生型基因，如URA3、LEU2、HIS3及TRP1，以及最好是一齊利用。這些基因可補償酵母宿主中的特殊代謝缺陷(營養(yǎng)缺陷體)，因而可在選擇性培養(yǎng)基上根據(jù)其生長情況鑒別出成功的轉(zhuǎn)化體。在優(yōu)選的實施方案中(下面將詳細(xì)描述)，使用的是MF21先導(dǎo)序列。雖然其它序列也同樣可用。使用MFα1先導(dǎo)序列時，異源蛋白質(zhì)被酵母KEX蛋白質(zhì)切掉。正如W.Fiers等人建議的(見“醫(yī)學(xué)研究及臨床應(yīng)用上具重要意義的異源蛋白質(zhì)在微生物中的分泌及表面表達(dá)”，引自“駕馭21世紀(jì)的生物技術(shù)”，M.R.Ladisch等人編著，美國化學(xué)學(xué)會，1992，23-25頁)，在這些案例中，把一或兩個Glu-Ala二肽置于前序列和異源基因序列之間可能是有益處的，這樣做可以促進(jìn)前序列的斷裂。
上述所有載體都可以攜帶RNA聚合酶II所使用的強啟動子。該啟動子既可以是誘導(dǎo)性的(如Gal-1，Gal-10，pH0.5)，也可以是組成性的(如ADHI，PGK或GPD)。由這些啟動子的轉(zhuǎn)錄依賴于結(jié)合于轉(zhuǎn)錄起始位點上游的位點(在酵母中，被稱為上游激活位點或USA)的激活蛋白。優(yōu)選Gal啟動子，特別是Gal-1(半乳糖激酶)啟動子。Gal啟動子受到激活子Gal-4(結(jié)合于轉(zhuǎn)錄起點的UAS上游)和負(fù)調(diào)節(jié)子Gal-80(它通過激活子來抑制活化作用)的調(diào)節(jié)。當(dāng)細(xì)胞在含半乳糖(作為唯一碳源)的培養(yǎng)基中生長時，例如可大規(guī)模誘發(fā)由Gal-1啟動子的轉(zhuǎn)錄；在這些條件下Gal-80與Gal-4解離，而Gal-4則與Gal-1 UAS相結(jié)合。因此，優(yōu)選的是連同含作為唯一碳源的半乳糖的培養(yǎng)基一起使用Gal-1啟動子。
適宜的酵母轉(zhuǎn)化方案是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟悉的；酵母轉(zhuǎn)化藥盒可購自BIO 101公司(La Jolla，CA)，在以下的實施例中對藥盒方案略有修改。Gal-1啟動子的脫阻抑發(fā)生在培養(yǎng)基中半乳糖耗盡時。而后用過濾法收獲粗酵母上清液。在進(jìn)一步純化之前在約4℃條件下放置。
在優(yōu)選的實施方案中，我們利用表達(dá)載體pYES2已達(dá)到了較高的產(chǎn)量，其構(gòu)建的詳細(xì)情況如下列實施例所描述。載體pYES2是用全部三種血纖維蛋白原cDNA串聯(lián)而構(gòu)建成的，每一種都在與MFα1前原分泌信號級聯(lián)融合的Gal-1-啟動子元件的控制下。正如以下將詳細(xì)討論的那樣，在聚丙烯酰胺凝膠上分析時，分泌自酵母的同重組血纖維蛋白原同血漿血纖維蛋白原是相似的；另外，同天然存在的血漿血纖維蛋白原一樣，分泌自酵母的重組血纖維蛋白原能夠形成凝血酶誘導(dǎo)的凝塊。
在酵母系統(tǒng)中，血纖維蛋白原是培養(yǎng)基中的主要分泌蛋白質(zhì)，因而可以很容易地通過常規(guī)的蛋白質(zhì)純化方法進(jìn)行純化，例如可通過鹽析、超濾、透析、離子交換層析、凝膠過濾、電泳、親和色譜法等配合進(jìn)行。
通過把酵母細(xì)胞與每種血纖維蛋白原cDNA在單獨的表達(dá)載體中(而非一前一后地在單一的載體中)共轉(zhuǎn)染，也有可能得到適宜組裝的血纖維蛋白原。如果利用這個具體實例，那么每一載體必須要含不同的選擇載體，以便于含全部三種cDNA的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體的選擇。
對于血纖維蛋白原變體或變體亞基的制備來說，利用常規(guī)誘變技術(shù)改變天然cDNA的DNA序列。例如，可以使用寡核苷酸針對性位點特異性誘變程序提供一種改變的“基因”，它具有因所需置換、缺失或插入而改變的特別密碼子。在欲將血纖維蛋白原變體用于研究的領(lǐng)域，可利用具有簡并寡核苷酸的盒式誘變在單個實驗中建立大批隨機突變。這些技術(shù)的細(xì)節(jié)是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員熟知的。在此不再重復(fù)。不過，可參考J.D.Watson等人，如上述，191-211頁；F.M.Ausubel等人，如前述，8-1頁8-25頁；J.Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊，第二版，plainview，紐約，冷泉港實驗室出版社，1989，15-1至15-113頁，每篇文獻(xiàn)的全部內(nèi)容都合并于此做參考。
這樣，如上面所述，在凝血能力中牽涉到γCys326-γCys339鍵。對于多種診斷測定來說，需要使用在測定中不會凝塊的試劑，使該試劑在生化及免疫上與血纖維蛋白或血纖維蛋白單體是難區(qū)分的。根據(jù)美國專利申請NO.07/946,826(如前述)，可通過對血纖維蛋白原進(jìn)行有限的還原處理而得到適用于本目的的試劑，依據(jù)R.Procyk等人，1992(如前述)，這樣做可引起某些Cys-Cys鍵的斷裂。通過重組方法有可能制備出這種“還原性血纖維蛋白原”。比如，利用寡核苷酸針對性位點特異性誘發(fā)程序，有可能通過用其它氨基酸(例如甘氨酸或也許還有甲硫氨酸，同半胱氨酸一樣，其為疏水性的，并在側(cè)鏈中含硫)的密碼子置換在有限的還原過程中發(fā)生斷裂位置上的半胱氨酸密碼子來修飾編碼各種鏈的cDNA。
另外，重組血纖維蛋白原及其變體還可作為治療劑而用于醫(yī)學(xué)中。血纖維蛋白原是“急性期蛋白”中的一種，其生物合成在受創(chuàng)傷及損害時會顯著增加。參見R.F.Doolittle“血纖維蛋白的分子生物學(xué)。引自G.Stamatoyanropoulous等人(編著)的”血液疾病的分子基礎(chǔ)，第2版，費城，W.B.Saunders公司，1994，712頁。在患肝衰竭或散布性血管內(nèi)血凝固(DIC)的患者或患先天性血纖維蛋白原缺乏癥患者中可能需要血纖維蛋白原補充。目前，施用低溫沉淀的抗血發(fā)病因子(AHF，亦稱為因子VIII)是血纖維蛋白原補充的優(yōu)選治療方法。每袋低溫沉淀的AHF含有約250mg血纖維蛋白原。血纖維蛋白原的血漿水平為至少50mg/d1是手術(shù)或外傷充分止血所必需的。參見M.S.Kennedy“轉(zhuǎn)輸療法”，引自D.Harmening-Pittiglion等人(編著)，“現(xiàn)代血庫及轉(zhuǎn)輸實踐”，第2版，費城，F(xiàn).A.Davis公司，1989，268頁。給這樣的患者施用重組血纖維蛋白原或其變體將通過靜脈內(nèi)途徑，其典型日劑量需保持在血纖維蛋白原的最低血漿水平50mg/d1。為了這樣的目的，可以把重組血纖維蛋白原或其變體加入全血或血液產(chǎn)物，如血漿，低溫沉淀物等等中，或加入常規(guī)的藥物媒介中。
參考下列非限制性實施例可更詳細(xì)地描述本發(fā)明。
材料從Invitrogen公司得到表達(dá)載體體(pYES2)和酵母菌株(IN8VC1 MATα his3-Δ1 len 2 trp-1-289 ura 3-52)。從Bio 101公司購得在選擇性條件下生長酵母的培養(yǎng)基。從Sigma得到半乳糖、棉子糖、衣霉素。人血纖維蛋白質(zhì)的抗體來自Dako公司，限制酶、Klenow片段、小牛腸道磷酸酶(CIP)來自Boehringer，Mannheim，內(nèi)切糖苷酶-H來自Genzyme，T4 DNA連接酶來自新英格蘭生物實驗室，L-[35S]甲硫氨酸(1100 Ci/mmol)來自新英格蘭核公司-杜邦。所使用的其它試劑如前所述[參見S.N.Roy等人，生物化學(xué)雜志，26723151(1992)；S.N.Poy等人，生物化學(xué)雜志，269691(1994)；S.N.Roy等人，生物化學(xué)雜志，266；4758(1991)]。
實施例1表達(dá)載體的構(gòu)建將含單鏈、組合2鏈及全部3鏈的血纖維蛋白原cDNA的表達(dá)載體插入Gal-1啟動子(與pYES2質(zhì)粒中MFα1前原分泌信號(SS)級聯(lián)相隔合)3’末端處的多克隆位點，如圖1所示。為了制備pYES2AαpYES2Bβ和pYES2γ，用分別來自上述構(gòu)建體的適宜的限制酶來釋放全長cDNA[參見S.N.Roy等人，生物化學(xué)雜志，269691(1994)；S.N.Roy等人，生物化學(xué)雜志，2664758(1991)]。通過串聯(lián)連接血纖維蛋白原鏈cDNA制得其它構(gòu)建體pYES2AαBβ、pYES2Aαγ、pYES2Bβγ和pYES2AαBβγ，各鏈均在Gal-1-SS啟動子的控制之下。從瓊脂糖凝膠中洗脫DNA片段、用CIP對質(zhì)粒進(jìn)行去磷酸化，用Klenow片段進(jìn)行補平反應(yīng)和連接的操作程序如另述[參見S.N.Roy等人，生物化學(xué)雜志，26723151(1992)；S.N.Roy等人，生物化學(xué)雜志，269691(1994)；S.N.Roy等人，生物化學(xué)雜志，2664758(1991)]。
實施例2酵母的轉(zhuǎn)化通過堿性阻離子方法，用含血纖維蛋白原cDNA的pYES2載體來進(jìn)行釀酒酵母(INVSC1)的轉(zhuǎn)化，并將細(xì)胞涂布在SC-ura平板上培養(yǎng)[參見L.D.Schultz等人，基因，54113(1987)]。將得自每一平板的單一菌落在SC-ura培養(yǎng)基(含4％的棉子糖)上生長，溫度30℃，強烈震蕩過夜，作為貯存培養(yǎng)物保存。用上述構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞被命名為INVSC1Aα，INVSC1Bβ和INVSC1γ、INVSC1AαBβ、INVSC1Aαγ、INVSC1Bβγ和INVSC1AαBβγ。
用前述方法制備出用載體pYES2AαBβγ穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的釀酒酵母細(xì)胞(INVSC1)并保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(馬里蘭州羅克維爾市)，保藏日為1994年8月12日，注冊號為ATCC 74296。該保藏是遵循布達(dá)佩斯條約進(jìn)行的。
實施例3用衣霉素進(jìn)行表達(dá)和處理將貯存培養(yǎng)物在5ml的SC-ura培養(yǎng)基中生長過夜，密度為1×108/ml。以500xg收縮細(xì)胞，重懸浮在含2％半乳糖的SC-ura培養(yǎng)基中，再生長16小時來誘發(fā)血纖維蛋白原鏈合成。以500xg收獲細(xì)胞，重懸浮在含50μCi/ml L-[35S]甲硫氨酸的SC-ura-met培養(yǎng)基中，在30℃下溫育1小時。在某些情況下，用含10μg/ml衣霉素的培養(yǎng)基對細(xì)胞預(yù)溫育1小時并照例加入L-[35S]。當(dāng)確定胞內(nèi)血纖維蛋白原時，收獲細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)沖洗，用0.5ml的IP緩沖液(50mMTris.HCl，pH7.4，190 Triton X-100，0.2％SDS，150mM NaCl，5mMEDTA，10U/ml Trasylol，1mM PMSF，0.1mM TPCK，1μg/ml大豆一胰蛋白酶抑制劑)和200mg(0.5mm直徑)的酸洗玻璃珠/108細(xì)胞渦旋攪拌2次，進(jìn)行溶胞，時間為45秒[見J.R.Tranzusoff等人，酶學(xué)方法，194662]。用水把胞溶產(chǎn)物稀釋到1ml，以15000xg在4℃下離心15分鐘。如其它文獻(xiàn)所述用人多克隆血纖維蛋白原抗體免疫沉淀細(xì)胞溶質(zhì)而分離出血纖維蛋白原(參見S.N.Roy等人，生物化學(xué)雜志，26723151(1992)；S.N.Roy等人，生物化學(xué)雜志，269691(1994)；S.N.Roy等人，生物化學(xué)雜志，2664758(1991)。
實施例4血纖維蛋白原的分泌把用pYES2AαBβγ，轉(zhuǎn)化并由單一菌落生長的酵母細(xì)胞接種到50ml含4％棉子糖的SC-ura培養(yǎng)基中并在30℃下生長過夜。然后用2％半乳糖誘導(dǎo)細(xì)胞，另外再溫育16小時。在室溫下以500xg將培養(yǎng)基離心15分鐘。用1M Tris-HCl緩沖液(pH8.0)把培養(yǎng)基pH值調(diào)到7.0，加入蛋白酶抑制劑混合物(10U/ml Trasylol，1mM PMSF，0.1mM TPCK，1μg/ml大豆-胰蛋白酶抑制劑，1mg/mlpapstatin)。利用硫酸魚精蛋白一瓊脂糖6B柱[10ml，用緩沖液A(50mM Tris.HCl，pH7.4，5mM EDTA)標(biāo)定]上的吸附作用從培養(yǎng)基中分離出血纖維蛋白原。用含0.8M NaCl的緩沖液A沖洗柱，用0.1M的乙酸鈉(pH4.5)洗脫結(jié)合的血纖維蛋白原。用1M Tris.HCl(pH8.0)將其pH調(diào)到7.0[參見C.E.Dempfle等人，血栓形成研究，4619(1987)]。
實施例5分泌性血纖維蛋白原的定量測定利用兩種不同的血纖維蛋白原鏈特異性單克隆抗體[1-8C6(抗Bβ1-21)和Fd-7B3(抗血纖維蛋白原片段D)]，通過競爭性ELSA測定了從培養(yǎng)基中分泌出的血纖維蛋白原的量。利用Fd4-7B3進(jìn)行測定的細(xì)節(jié)以前已有過報導(dǎo)[參見S.N.Roy等人，生物化學(xué)雜志，2664758(1991)]。最近已經(jīng)開發(fā)出一種利用抗體1-8C6的新測定法，該抗體的特異性已有人做過描述[參見B.Kudryk等人，分子免疫，201191(1983)]。在這種測定法中利用了辣根過氧化物酶標(biāo)記形式的抗體1-8C6，可以很容易地測定到低至0.05μg/ml的血纖維蛋白原濃度。
實施例6人血漿與酵母重組血纖維蛋白原二者特性的比較利用凝血酶(6.8NIH U/ml)及用或不用因子XIII(1.0U/ml)來處理所分泌的重組血纖維蛋白原，以確定其形成凝血酶誘導(dǎo)性血塊及交聯(lián)的能力。通過SDS-PAGE分離血纖維蛋白復(fù)合體，利用考馬斯藍(lán)染色和利用鏈特異性抗體1C2-2(抗血纖維蛋白原Aα/血纖維蛋白α)(R.Procyk等人，血栓研究，71127(1993))、Ea3(抗血纖維蛋白原Bβ/血纖維蛋白β)(B.Kudryk等人)，“作為血纖維蛋白(原)蛋白水解探針的單克隆克體”，引自免疫閃規(guī)照相法中的單克隆抗體，(J.F.Chatal(編著)，CRC出膠社，Boca Raton，F(xiàn)L，365-398頁)、T2G1(抗血纖維蛋白β)(B.Kudryk等人，分子免疫，2189(1984))和4-2(抗血纖維蛋白原γ/血纖維蛋白γ-二聚體)(R.Procyk等人，血液，771469(1991))通過Western免疫印跡法來進(jìn)行檢測。
為了評估酵母重組血纖維蛋白原與人血漿血纖維蛋白原的相似性，在聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行了兩種產(chǎn)物的比較。
圖2表明重組血纖維蛋白原與鏈特異性抗體的免疫反應(yīng)性。在還原或非還原條件下，在4-10％梯度SDS-PAGE上分離重組血纖維蛋白原，利用不同的鏈特異性抗體通過Western免疫印跡法進(jìn)行分析。
框A用考馬斯藍(lán)染色的還原凝膠。
框B與MAb到Aα/α鏈反應(yīng)的還原樣品的免疫印跡。
框C同B，與MAbBβ/β鏈進(jìn)行反應(yīng)。
框D同B，與MAb至γ鏈進(jìn)行反應(yīng)。
框E與MAb至γ鏈反應(yīng)的非還原性樣品的免疫印跡。
泳道1，分子大小標(biāo)記物；泳道2，血漿Fbg；泳道3，重組酵母Fbg。
數(shù)據(jù)表明，由轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞分泌的重組血纖維蛋白原與血漿血纖維蛋白原具有類似的電泳和免疫反應(yīng)特性。
圖3表示重組酵母血纖維蛋白原的凝血特性。使用凝血酶或凝血酶＋因子XIII對酵母細(xì)胞所分泌的純化重組血纖維蛋白原進(jìn)行溫育(溫度37℃)4小時。凝血后，把每個樣品溶解于含DTT和SDS的緩沖液中，通過SDS-PAGE(5-15％梯度凝膠)進(jìn)行分離，用MAb(它可與血纖維蛋白β鏈或與血纖維蛋白原γ鏈或血纖維蛋白γ-二聚體反應(yīng))來進(jìn)行Western印跡分析。
框A用馬考斯藍(lán)染色的免疫印跡。
框B與血纖維蛋白β-鏈(T2G1)抗體反應(yīng)的免疫印跡。
框C與血纖維蛋白原γ鏈/血纖維蛋白γ-二聚體(4-2)抗體反應(yīng)的免疫印跡。
泳道1，分子大小標(biāo)記物；泳道2，血漿Fbg；泳道3，酵母Fbg；泳道4，由酵母Fbg制備的非交聯(lián)性血纖維蛋白；泳道5，由酵母Fbg制備的因子XIII交聯(lián)血纖維蛋白。
數(shù)據(jù)顯示，像血漿血纖維蛋白原一樣，重組血纖維蛋白原能夠形成凝血酶誘導(dǎo)性凝塊并發(fā)生因子XIII誘導(dǎo)性交聯(lián)。
應(yīng)該認(rèn)識到，通過本說明書和權(quán)利要求是以說明和非限制性方式敘述的，可以在不背離本發(fā)明宗旨和范圍的條件下做出多種改動和變化。
權(quán)利要求
1.一種酵母的表達(dá)載體，其含有至少一種編碼血纖維蛋白原或其變體的多肽鏈的cDNA。
2.依據(jù)權(quán)利要求1的表達(dá)載體，含有編碼血纖維蛋白原或其變體Aα鏈的cDNA，編碼血纖維蛋白原或其變體Bβ鏈的cDNA，編碼血纖維蛋白原或其變體γ鏈的cDNA。
3.依據(jù)權(quán)利要求2的表達(dá)載體，其為2pYES2表達(dá)載體，其中在T7啟動子3’末端已一前一后地插入了三種cDNA。
4.依據(jù)權(quán)利要求3的表達(dá)載體，其中三種cDNA至Gal-1啟動子的控制之下。
5.用依據(jù)權(quán)利要求1的表達(dá)載體所轉(zhuǎn)化的酵母。
6.用依據(jù)權(quán)利要求2的表達(dá)載體所轉(zhuǎn)化的酵母。
7.用依據(jù)權(quán)利要求3的表達(dá)載體所轉(zhuǎn)化的酵母。
8.用依據(jù)權(quán)利要求4的表達(dá)載體所轉(zhuǎn)化的酵母。
9.在酵母中表達(dá)血纖維蛋白原或其變體或亞基的方法，包括(a)構(gòu)建或得到酵母的表達(dá)載體，其含有至少一種編碼血纖維蛋白原或其變體之多肽鏈的cDNA；(b)用所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化酵母并篩選穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體；(c)將轉(zhuǎn)化體保持在培養(yǎng)基中，條件為使血纖維蛋白原或其變體或亞基分泌到所述培養(yǎng)其中；和(d)從培養(yǎng)基中回收血纖維蛋白原或其變體或亞基。
10.依據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述表達(dá)載體含有編碼血纖維蛋白原或其變體Aα鏈的cDNA，編碼血纖維蛋白原或其變體Bβ鏈的cDNA，編碼血纖維蛋白原或其變體γ鏈的cDNA。
11.依據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述表達(dá)載體是pYES2表達(dá)載體，其中在T7啟動子3’末端已一前一后地插入了三種cDNA。
12.依據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中三種cDNA處于GAl-1-啟動子的控制之下。
13.依據(jù)權(quán)利要求9的方法所產(chǎn)生的血纖維蛋白原或其變體。
14.依據(jù)權(quán)利要求10的方法所產(chǎn)生的血纖維蛋白原或其變體。
15.依據(jù)權(quán)利要求11的方法所產(chǎn)生的血纖維蛋白原或其變體。
16.依據(jù)權(quán)利要求12的方法所產(chǎn)生的血纖維蛋白原或其變體。
全文摘要
本發(fā)明涉及重組血纖維蛋白原，血纖維蛋白原變體及其亞基的一種新表達(dá)系統(tǒng)，用該表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化的酵母，利用該表達(dá)系統(tǒng)克隆血纖維蛋白原，血纖維蛋白原變體及其亞基的用途，以及利用重組血纖維蛋白原、血纖維蛋白原變體及其亞基作為研究工具或在醫(yī)學(xué)上，例如在診斷測定中或作為治療某些適應(yīng)癥的治療手段的用途。與可能使用的其它表達(dá)系統(tǒng)相比、本發(fā)明的酵母系統(tǒng)能產(chǎn)生至少多10倍的重組蛋白質(zhì)。另外，本發(fā)明的酵母系統(tǒng)很容易用來生產(chǎn)大量的重組蛋白質(zhì)。而且，利用本發(fā)明的酵母系統(tǒng)，重組血纖維蛋白原是主要的分泌蛋白質(zhì)，因而很容易從培養(yǎng)基中純化。
文檔編號C07K14/75GK1159206SQ95195339
公開日1997年9月10日 申請日期1995年9月1日 優(yōu)先權(quán)日1994年9月2日
發(fā)明者S·N·羅伊 申請人:紐約血庫公司