專利名稱：應用重組質粒制備反義寡脫氧核苷酸的方法
本專利屬于生物技術領域一種制備反義寡聚脫氧核糖核苷酸的方法，具有制藥應用前景。
反義寡核苷酸(包括反義DNA和反義RNA)是一段能與基因轉錄后的RNA特異互補結合，長度為14-25堿基的核苷酸單鏈片段。當此段反義寡核苷酸進入細胞，與相對應mRNA互補結合成雙鏈時，能有效地阻斷該基因翻譯成功能蛋白，從而干擾生物有機體或細胞的功能。應用反義寡核苷酸在醫(yī)學上能起到治療疾病的作用，如治療病毒性疾病、腫瘤以及其它感染性疾病(如細菌感染)方面已證實有獨特的療效。但目前制備反義寡核苷酸的方法主要靠DNA合成儀，其昂貴的成本和低產出率是反義寡核苷酸進入臨床中的最大障礙之一。本專利開創(chuàng)性地發(fā)明了應用基因工程重組質粒技術來大量制備反義寡脫氧核糖核苷酸(即反義DNA，以下稱反義寡脫氧核苷酸)的方法。此方法不僅在以下的抗人乙型肝炎病毒(HBV)方面得到了有效的證實，其最大優(yōu)點在于可適用于任何情況下的反義寡脫氧核苷酸的重組質粒制備。本專利申請的制備方法大體是化學合成含反義寡脫氧核苷酸的雙鏈(根據(jù)其末端堿基不同獨特地選用內切酶酶切位點順序)→此雙鏈和質粒用相同的酶切后，構建重組質?！D化大腸桿菌→挑選含高拷貝重組質?？寺　l(fā)酵菌種→提取質粒，酶切回收含反義寡脫氧核苷酸順序的粘性片段→核酸酶S1除去粘性末端→磷酸三酯單鏈化和乙基化成高效與RNA(特別是mRNA)結合的反義寡脫氧核苷酸。
反義寡脫氧核苷酸如何插入重組質粒后，經(jīng)內切酶切下的雙鏈片段保證其堿基順序與所設計的反義寡核苷酸堿基順序完全一致是本專利的核心之處。首先，任何一種反義寡脫氧核苷酸順序，無論其長度如何，它的5′和3′末端的堿基有以下二種，即嘌呤AT和嘧啶GC。如

圖1中所示，以EcoRI內切酶(GAATTC)為例的一類內切酶在酶切核苷酸順序后，其末端的堿基為G或C的嘧啶堿基。以HindIII內切酶(AAGCTT)為例的一類內切酶在酶切核苷酸順序后，其末端堿基為A或T的嘌呤堿基。根據(jù)反義寡脫氧核苷酸的兩末端堿基的不同可分為三類(1)兩末端全為嘌呤(A.T或AT)。(2)兩端全為嘧啶(G.C或GC)。(3)一末端為嘌呤(A.T)，另一末端為嘧啶(G.C)，見圖2。當?shù)谝环N情況時，將HindIII的酶切位點的順序如圖2所示的方法設計到待插入的含反義寡脫氧核苷酸的雙鏈片段中；當?shù)诙N情況時，將EcoR I的酶切位點順序設計避去；為第三種情況時，含嘌呤末端加上HindIII，含嘧啶末端加上EcoR I。用DNA合成儀合成設計好的互為互補兩股單鏈，經(jīng)退火成互補雙鏈后，如圖3所示的方法，將含有EcoR I或/和Hind III單一酶切位點的質粒與待插入的含反義寡脫氧核苷酸的雙鏈經(jīng)相同酶切后，在T4連接酶作用下，構建重組質粒，轉化大腸桿菌，篩選出含高拷貝插入片段的菌種。
從重組質粒中大量制備反義寡脫氧核苷酸單鏈的過程如圖4所示。含重組質粒的菌種發(fā)酵，收集菌體后大量提取質粒，將質粒用相應內切酶完全酶切，純化含反義寡核苷酸順序的短片段，此片段含有粘性末端，可用S1核酸酶切除。此時的雙鏈片段順序與所需的反義寡脫氧核酸酶的順序完全一致。經(jīng)乙?；?、磷酸三酯化和水解處理后，即可得到與mRNA互補結合的反義寡脫氧核苷酸。實例抗入乙型肝炎病毒聚合酶的反義寡脫氧核苷酸的制備用本專利的方法構建了含抗人乙型肝炎病毒聚合酶的反義寡脫氧核苷酸的重組質粒，并有效地制備出抗乙型肝炎病毒復制的反義寡核苷酸單鏈。人乙型肝炎病毒聚合酶位于基因組的P區(qū)，選用第2791至2810的基因順序為反義寡脫氧核苷酸作用區(qū)，其反義順序為5′-GAGGGAAACCACACGTAGC-3′。如圖3所示，用DNA合成儀合成二條順序互補的單鏈(兩末端有EcoR I酶切位點)，經(jīng)退火成雙鏈后，用EcoR I酶切處理，同時提取pUC18質粒，同樣用EcoR I酶切。將酶切的雙鏈片段和pUC18在T4連結酶作用下，連結成重組質粒。因pUC18中單一EcoR I位點位于LacZ的區(qū)域，故選用氨芐青霉素和IPTG/X-gal選擇雙標記，挑選出白色菌落。然后經(jīng)EcoR I鑒定出重復含反義寡脫氧核苷酸片段的高拷貝菌株(pHBV1)。發(fā)酵培養(yǎng)(37℃高密度發(fā)酵，無需IPTG誘生)，提取質粒。質粒經(jīng)EcoR I酶切(如圖4)，HPLC純化出含反義寡脫氧核苷酸短片段，用S1核酸酶切除粘性末端。經(jīng)50％acetic anhydride-puridine乙?；Ｗo，再經(jīng)30％ethanol，30％lutidene，30％NN-dimethylformamide和17％p-tuluenesulfonyl chloride磷酸三酯化成單鏈。最后在加入0.5體積氨水情況下，將乙?；Ｗo基團水解成可在體內抗核酸酶降解的乙基磷酸三酯化修飾的反義寡脫氧核苷酸單鏈。
用重組質粒制備的抗人乙型肝炎病毒聚合酶的反義寡脫氧核苷酸在體外用HepG2/2215細胞做抗乙型肝炎病毒的實驗證實，在加入重組質粒制備的反義寡脫氧核苷酸(5μmol/ml)72小時后，其抑制乙型肝炎病毒HBsAg表達的抑制率為91％。DNA合成儀合成的同順序無修飾反義寡脫氧核苷酸抑制HBsAg表達70％以上時，其終濃度10μmol/ml。
權利要求
此專利是一種獨創(chuàng)的適用于所有反義寡脫氧核糖核苷酸的大量制備方法，其專利權保護內容是。(1)用質粒將含反義寡脫氧核苷酸片段插入，經(jīng)重組質粒在大腸桿菌中高拷貝后，再從質粒上切下含反義順序的短片段，此片段經(jīng)乙?；?、磷酸三酯化和水解成所需的反義寡脫氧核苷酸單鏈。
(2)如果反義寡脫氧核苷酸順序兩末端均為同一嘌呤即A.T或者一個A和一個T的情況下，選用Hind III的內切酶切點順序(AGCTT)加入此反義順序的兩邊。
(3)如果反義寡脫氧核苷酸順序兩末端均為同一嘧啶即G.C或一個G和一個C的情況下，選用EcoR I的內切酶切點順序(AATTC)加入此反義順序的兩邊。
(4)如果反義寡脫氧核苷酸順序兩邊為一個嘌呤和一個嘧啶即AC.AG.TC.TG或CA.CT.GA.GT的情況下，則選用Hind III酶切位點順序加在嘌呤末端，EcoR I酶切位點順序加嘧啶末端。
(5)如果反義寡脫氧核苷酸順序兩邊正好含有一平頂末端內切酶的順序，如Mbo I(GATC)，Alu I(CTAG)的情況下，則選用相對應的有此平頂末端的順序的內切酶加在此末端。
(6)任何一種帶EcoR I和/或Hind III單一酶切位點的質粒均可作為此方法的載體，pUC，pBR，pET系列為佳。
(7)權利要求2和4中Hind III內切酶可被相類似內切酶替代，如Nco I和Spe I等。
(8)權利要求3和4中EcoR I內切酶可被相類似內切酶替代，如BamH I和Apa I等。
全文摘要
反義寡核苷酸(Antisense Oligonucletides)是一類具有抗病毒、抗癌等潛力的核酸類藥物。應用重組質粒生產反義寡脫氧核糖核苷酸(即反義DNA)為反義核酸低成本大規(guī)模生產提供了一條開創(chuàng)性的方法。本發(fā)明大體可概括為將含反義寡核苷酸順序的雙鏈用內切酶的方法插入質粒中，待重組質粒擴增后，用內切酶切下含反義寡核苷酸順序的雙鏈，核酸酶S
文檔編號C07H21/00GK1138047SQ9510684
公開日1996年12月18日 申請日期1995年6月14日 優(yōu)先權日1995年6月14日
發(fā)明者范開 申請人:范開