一種針對miR-99a種子序列的微小反義寡聚核苷酸及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于藥物制備領(lǐng)域，具體設(shè)及一種針對miR-99a種子序列的微小反義寡聚 核巧酸及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma,MM)是W骨髓中克隆性漿細胞惡性增殖為主要 特征的惡性腫瘤，MM多伴有復(fù)雜的染色體核型異常，基因組不穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)染色體崎變與 MM患者疾病分期及預(yù)后緊密相連。Lionetti等依據(jù)遺傳學(xué)免疫球蛋白重鏈的易位和細胞 周期蛋白D，即TC(易位/細胞周期蛋白D)將匪患者分為TC1群[t(ll;14)和U6;14) 易位的患者]、TC2群（未發(fā)生易位但中低度表達細胞周期蛋白D1的患者）、TC3 (未劃分 到其他組的患者）TC4[t(4;14)易位的患者]和TC5[t(6;14)或t(14;20)易位的患者]5 類。將近一半的MM患者是超二倍體伴有奇數(shù)染色體和染色體異位，如13號染色體缺失和 免疫球蛋白重鏈在14q32發(fā)生的染色體易位。
[0003] 研究表明染色體異常和其他類型的遺傳或表觀遺傳改變可能導(dǎo)致癌癥中的miRNA 下調(diào)。在腫瘤中顯著過表達的miRNA可W作為一個新型的致癌基因，并稱為"oncomiR"，該 些oncomiR通常通過負調(diào)節(jié)抑癌基因基因促進腫瘤發(fā)生。因此，改變oncomiR的表達是一 種很有前途的癌癥治療策略。
[0004] miRNA在基因表達調(diào)控中扮演著重要的角色，參與生命過程中一系列的重要進程， 包括細胞增殖分化和調(diào)亡，個體發(fā)育，機體代謝及免疫調(diào)節(jié)。miRNA能與祀mRNA的特異性結(jié) 合從而改變蛋白質(zhì)的表達，基于其作用機制miRNA既能發(fā)揮抑癌基因的作用也能起到致癌 基因的作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種針對miR-99a 種子序列的微小反義寡聚核巧酸。
[0006] 本發(fā)明的另一目的在于提供上述針對miR-99a種子序列的微小反義寡聚核巧酸 的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：
[000引一種針對miR-99a種子序列的微小反義寡聚核巧酸（tiny antimiR-99a， t-antimiR-99a)，其核巧酸序列如下；5' -TACGGGTT-3' ；
[0009] 所述的針對miR-99a種子序列的微小反義寡聚核巧酸經(jīng)過鎖核酸修飾；
[0010] 所述的針對miR-99a種子序列的微小反義寡聚核巧酸在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng) 用；
[0011] 所述的抗腫瘤藥物優(yōu)選為抗多發(fā)性骨髓瘤藥物；
[0012] 本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果：
[001引 （l)miRNA種子序列通過與其祀基因的mRNA的3' UTR進行堿基完全互補配對，促 進祀基因mRNA降解或抑制mRNA翻譯。針對miRNA種子序列反義核酸可W干擾miRNA與祀 mRNA的配對。本發(fā)明提供的針對miR-99a種子序列的微小反義寡聚核巧酸作用于多發(fā)性骨 髓瘤細胞RPMI-8266中的miR-99a，本發(fā)明探究了微小反義寡聚核巧酸t(yī)-antimiR-99a對多 發(fā)性骨髓瘤細胞的抑制效應(yīng)，為腫瘤基因治療尋找新的方法，同時也為傳統(tǒng)的抗腫瘤機制 提供新的視角。
[0014] 似相對于成熟miRNA而言，本發(fā)明提供的針對miR-99a種子序列的微小反義寡聚 核巧酸t(yī)-antimiR-99a具有分子量小，毒性小，特異性強，轉(zhuǎn)染效率高等優(yōu)點，可用于腫瘤 的實驗治療研究，有一定的藥物開發(fā)前景。
【附圖說明】
[0015] 圖 1 是 miR-99a 和 t-antimiR-99a 的序列不意圖。
[0016] 圖2是miRNA巧片分析小窠堿處理的RPMI-8266細胞miRNA族的結(jié)果分析圖，其 中，A ;巧片分析結(jié)果；B ;miR-99a~12化族成員，其中miR-99a是其中一個成員。
[0017] 圖3是miRFocus軟件分析miR-99a參與的信號通路的結(jié)果分析圖。
[001引圖4是轉(zhuǎn)染t-antimiR-99a對RPMI-8266細胞colony影響的結(jié)果分析圖，其中， A ;不同處理組顯微鏡下的集落形態(tài)巧：不同處理組的細胞克隆數(shù)統(tǒng)計分析。
[0019] 圖5是轉(zhuǎn)染t-antimiR-99a對RPMI8266細胞調(diào)亡影響的結(jié)果分析圖。
【具體實施方式】
[0020] 下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限 于此。
[0021] 本實施例中的數(shù)據(jù)W均數(shù)+標準差（mean±SD)表示，使用SPSS13. 0統(tǒng)計軟件， 采用單因素方差分析法（one-way AV0NA)分析各組數(shù)據(jù)差異的顯著性。WP<〇. 05為有顯 著性差異。
[0022] 實施例1微小反義寡聚核巧酸的設(shè)計與合成
[0023] 從 miRBase 數(shù)據(jù)庫中(http: //www. mirbase. org/)獲取人 microRNA-99a (序 列號；M1000 OIOI)的種子序列，根據(jù)序列互補原理設(shè)計針對種子序列的微小反義 寡聚核巧酸序列（t-antimiR-99a)，并采用BLAST軟件分析確定其反義寡核巧酸序 列及隨機對照序列（圖1)。針對miR-99a種子序列的微小反義寡聚核巧酸序列： t-antimiR-99a(5'-TACGGGTT-3'），隨機序列（scramble, SCR) ;5' -TCATACTA-3' (8bp); 均由上海生物工程有限公司合成鎖核酸修飾，高效液相色譜（hi曲perhrmance liquid chromatography, HPLC)純化。
[0024] 實施例2細胞培養(yǎng)
[0025] 將RPMI-8266細胞（多發(fā)性骨髓瘤細胞，購買于中國科學(xué)院上海細胞生化所）接 種于含體積分數(shù)為10%的胎牛血清，無抗生素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37°C、體積分數(shù) 為5%的C〇2培養(yǎng)箱，飽和濕度下培養(yǎng)。每2~3天換液傳代。實驗選用對數(shù)生長期、質(zhì)量 分數(shù)為0. 2 %的臺盼藍拒染率>95 %的細胞。
[0026] 實施例3小窠堿調(diào)節(jié)多發(fā)性骨髓瘤細胞系中的miRNA族的表達
[0027] 根據(jù)之前的研究（Luo X, Gu J, Feng M,化U X, Li Y and Fei J*. Integrative analysis of differential miRNA and functional study of miR_21by seed-targeting inhibition in multiple myeloma cells in response to berberine.BMC Systems Biology2014化 1 7 ;8:82. doi : 10. 1186/1752-0509-8-82.)，本實施例選擇終濃度為 75 u M 的小窠堿炬BR)處理實施例2培養(yǎng)得到的RPMI-8266細胞4她，然后按照miRVanaTM miRNA 分離試劑盒（Ambion，Austin USA)的說明書，分離RPMI-8266細胞的總miRNA。樣品經(jīng)過 切3