專利名稱：抑制腫瘤的反義核苷酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)或醫(yī)學(xué)領(lǐng)域；更具體的，本發(fā)明涉及可用于調(diào)節(jié)Bcl-2表達(dá)水平的反義核苷酸，及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
腫瘤是威脅人類生命的第一大疾病，而傳統(tǒng)的治療腫瘤的方法，包括化療，放射性療法及切割手術(shù)，都存在著特異性低，副作用大等缺點。許多身體虛弱的腫瘤患者最終并非死于癌癥，而是死于化療，放療的巨大副作用。手術(shù)切除只適用于實體瘤，而且手術(shù)會給患者帶來巨大痛苦，還有可能促使腫瘤惡化。此外，腫瘤易對化療藥物產(chǎn)生耐藥性也是人們在治療癌癥的過程中遇到的一大問題。
基于上述原因，本領(lǐng)域研究人員一直在努力地尋找新的腫瘤治療靶點，以期開發(fā)出特異性高，副作用小的抗癌藥物，而Bcl-2蛋白就被認(rèn)為是具有如此潛力的抗腫瘤靶點。
Bcl-2蛋白是Bcl-2蛋白家族的一員，在細(xì)胞凋亡的調(diào)控過程中起到關(guān)鍵性作用。它通過BH3疏水結(jié)構(gòu)域?qū)儆谕坏鞍准易宓牡蛲龃龠M(jìn)因子“錨定”，從而限制后者發(fā)揮作用，避免了內(nèi)源性細(xì)胞凋亡的“啟動者”細(xì)胞色素C等從線粒體內(nèi)的釋放并最終阻止細(xì)胞凋亡。目前，一個被普遍接受的假設(shè)是“以Bcl-2為代表的凋亡抑制因子和以Bid，Bax為代表的凋亡促進(jìn)因子在細(xì)胞中的比率決定了細(xì)胞是否走向凋亡”，足見Bcl-2在細(xì)胞凋亡調(diào)控中的重要性。
目前，已知的大部分腫瘤細(xì)胞，包括肺癌，肝癌，乳腺癌，結(jié)腸癌等等，都發(fā)現(xiàn)了Bcl-2的高表達(dá)。通常認(rèn)為，這種重要的凋亡抑制因子的高表達(dá)使得腫瘤細(xì)胞逃脫了既定的凋亡進(jìn)程，無限增殖。另外，臨床上認(rèn)為，Bcl-2的高表達(dá)也同腫瘤耐藥性的產(chǎn)生相關(guān)。因此，腫瘤細(xì)胞內(nèi)的Bcl-2蛋白表達(dá)量的下調(diào)，將具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡并增加其對化療藥物敏感性的效果。
但是，Bcl-2功能的行使主要依靠蛋白之間的相互作用，而非與小分子配體的結(jié)合，開發(fā)出特異性的影響B(tài)cl-2蛋白結(jié)合功能的小分子的難度較大。
因此，本領(lǐng)域迫切需要進(jìn)一步在基因水平和蛋白水平深入研究Bcl-2，以期找到特異性高，副作用小的Bcl-2抑制藥物，從而為Bcl-2相關(guān)疾病，特別是腫瘤的預(yù)防、改善或治療提供新的途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種用于預(yù)防或治療Bcl-2相關(guān)疾病，特別是腫瘤的反義核苷酸。
在本發(fā)明的第一方面，提供一種反義核苷酸，其特征在于，所述的反義核苷酸具有通式(I)所示的結(jié)構(gòu)5’-CTC CCA GCG TGC GCC AT Z-3’(I)其中，Z選自C、或CC。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，所述的反義核苷酸的序列中至少2個磷酸鍵被硫代修飾。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的反義核苷酸的序列中所有磷酸鍵都被硫代修飾。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的反義核苷酸用于制備預(yù)防或治療Bcl-2相關(guān)疾病的藥物。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的Bcl-2相關(guān)疾病包括腫瘤。
在本發(fā)明更優(yōu)選的優(yōu)選例中，所述的腫瘤包括(但不限于)肺癌，肝癌，乳腺癌，宮頸癌，結(jié)腸癌，造血系統(tǒng)癌，內(nèi)分泌系統(tǒng)癌，或淋巴結(jié)癌，以及各種原發(fā)部位不明的癌。
在本發(fā)明的第二方面，提供一種藥物組合物，所述的藥物組合物含有有效量的所述的反義核苷酸，以及藥學(xué)上可接受的載體。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的藥物組合物中還可含有紫杉醇、氟達(dá)拉濱、阿糖胞苷、柔紅霉素、順鉑、5-氟尿嘧啶、多柔比星、依托泊苷、天冬酰胺酶、潑尼松、或甲氨蝶呤。
在本發(fā)明的第三方面，提供一種體外抑制腫瘤細(xì)胞生長的方法，所述的方法包括將所述的腫瘤細(xì)胞與所述的反義核苷酸接觸，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長。
另一方面，本發(fā)明還提供了一種預(yù)防或治療Bcl-2相關(guān)疾病的方法，包括給予受試者安全有效量的所述的反義核苷酸。
本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


圖1顯示了反義藥物以及傳統(tǒng)藥物的作用機(jī)理示意圖。
圖2顯示了在制備反義藥物時，將脫氧核苷酸鏈硫代修飾為硫代脫氧核苷酸鏈的一種步驟。
圖3A顯示了磷酸鍵被硫代后的結(jié)構(gòu)示意圖；圖3B顯示了四種脫氧核苷酸的堿基的結(jié)構(gòu)式。
圖4顯示了本發(fā)明的反義反義核苷酸藥物對人腫瘤細(xì)胞HT-29的生長抑制作用(3次實驗取均值，對不同用藥組進(jìn)行完全隨機(jī)資料的方差分析，P＜0.05)。
圖5顯示了集落實驗檢測腫瘤細(xì)胞集落形成抑制率。
圖6顯示了反義核苷酸KS0604和KS0605具有明顯的提高腫瘤細(xì)胞HT-29和H446對化療藥物依托泊苷敏感性的作用。
具體實施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，意外地找到一種可預(yù)防或治療Bcl-2相關(guān)疾病的反義核苷酸。所述反義核苷酸與現(xiàn)有的治療Bcl-2相關(guān)疾病的各種藥物相比，具有明顯更優(yōu)的預(yù)防或治療效果?；诖送瓿闪吮景l(fā)明。
如本文所用，“Bcl-2”相關(guān)疾病是指與Bcl-2的基因或蛋白的表達(dá)相關(guān)的疾病，包括但不限于細(xì)胞增生性疾病(如腫瘤)。
反義核苷酸藥物如本文所用，“反義核苷酸”又稱為“反義寡核苷酸(AS-ONs，antisense-oligonucleotides)”或“反義藥物”，是指長度約為15-22個堿基的DNA分子及其類似物，可與mRNA互補(bǔ)。根據(jù)核苷酸雜交原理，所述的反義核苷酸能與特定的基因發(fā)生雜交，激活內(nèi)源核酸酶(通常為RNase H)降解mRNA或者阻斷翻譯過程，從而導(dǎo)致細(xì)胞相關(guān)蛋白質(zhì)水平下調(diào)。反義藥物作用原理的示意圖見圖1，其不同于傳統(tǒng)的藥物。
在本發(fā)明中，所述的“反義核苷酸”還包括采用如基于核酸鏈骨架修飾技術(shù)等手段獲得的經(jīng)修飾的反義核苷酸，所述的修飾基本不改變反義核苷酸的活性，更佳地，所述修飾可提高反義核苷酸的活性或治療效果。例如，所述的修飾為硫代修飾，或在核糖的2’位置進(jìn)行烷基修飾。
迄今為止，本領(lǐng)域人員就已經(jīng)嘗試了包括N-myc，Raf，survivin，MDM-2等等作為反義藥物的靶點。但是，由于第一代反義藥物是單純的脫氧核苷酸鏈，溶解性，細(xì)胞攝取能力等都不夠理想，而且易被內(nèi)源性核酸酶降解，因此，不能達(dá)到良好的治療效果?；诤怂徭湽羌艿男揎椉夹g(shù)發(fā)展出的第二代反義藥物在可溶性，抗核酸酶降解等方面大有改善，且易于大量合成，能滿足臨床所需。寡核苷酸的骨架修飾方法有多種，包括硫代法，將脫氧核苷酸鏈硫代修飾為硫代脫氧核苷酸鏈的一種步驟見圖2。該方法是將DNA骨架上的磷酸鍵的氧原子用硫原子替代，使得藥物具有良好的水溶性，并可抵抗核酸酶降解。臨床試驗中，采用皮下、肌肉和靜脈注射等方法給藥，可分布于除腦組織外的各器官和組織中，可與血漿蛋白結(jié)合，主要從尿中排出。從理論上來講，根據(jù)反義技術(shù)獲得的反義分子可用于治療任何由基因表達(dá)或者基因缺失引起的疾病，比如病毒感染、癌癥和炎癥。盡管反義技術(shù)在理論上相當(dāng)完美，但是在實際應(yīng)用中還面臨著挑戰(zhàn)，并非所有的反義分子都能起到良好的作用。
本發(fā)明人以Bcl-2的mRNA作為模板，設(shè)計出了可特異性與該mRNA結(jié)合的反義核苷酸；具體地，本發(fā)明涉及的反義核苷酸序列通式如下(其中，A，G，C，T分別代表腺嘌呤，鳥嘌呤，胞嘧啶，胸腺嘧啶四種堿基，這些堿基的結(jié)構(gòu)式參見圖3B所示)5’-X CTC CCA GCG TGC GCC AT Y-3’其中，X選自空白、T、TT、或GTT；Y選自C、CC、或CCT。
此外，可對本發(fā)明提供的反義核苷酸進(jìn)行適當(dāng)?shù)男揎?，從而達(dá)到改善其Bcl-2抑制效果、提高活性、增加穩(wěn)定性、降低毒性、延長半衰期等目的。應(yīng)理解，任何能夠保持所述反義核苷酸的大部分或全部活性的修飾都包含在本發(fā)明中。
在本發(fā)明的一種優(yōu)選方式中，所述的反義核苷酸的序列中至少2個磷酸鍵被硫代修飾。磷酸鍵被硫代的結(jié)構(gòu)示意圖見圖3。
在本發(fā)明的一種更優(yōu)選的方式中，所述的反義核苷酸的序列中所有磷酸鍵都被硫代修飾。
在本發(fā)明的一種優(yōu)選方式中，本發(fā)明中涉及到具有相同序列骨架5’-CTCCCA GCG TGC GCC AT-3’的12種反義核苷酸序列的組合，詳見表1。
表1

在本發(fā)明的更優(yōu)選的方式中，所述的反義核苷酸序列通式如下5’-CTC CCA GCG TGC GCC AT Z-3’(I)其中，Z選自C、或CC。
也即，所述的反義核苷酸具有SEQ ID NO3或SEQ ID NO4所示的序列；更優(yōu)選的，所述的反義核苷酸中所有磷酸鍵都被硫代修飾。這兩種硫代形式的反義核苷酸的對Bcl-2的抑制效果是非常理想的，遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于與之具有一個或多個堿基差異的其它種類的反義核苷酸。
反義核苷酸藥物的用途本發(fā)明人的研究發(fā)現(xiàn)，使用上述反義核苷酸(優(yōu)選的為硫代反義核苷酸)，可抑制Bcl-2的表達(dá)，從而可達(dá)到預(yù)防或治療Bcl-2相關(guān)疾病的目的。在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，所述的反義核苷酸通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞內(nèi)的Bcl-2蛋白的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞增殖。
本發(fā)明的反義核苷酸還可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性。由于腫瘤抗藥性的產(chǎn)生同Bcl-2蛋白密切相關(guān)，本發(fā)明涉及的反義藥物可以降低細(xì)胞內(nèi)Bcl-2的水平，增強(qiáng)其對化療藥物的敏感性，從而減少化療藥物的使用量，將化療對患者造成的傷害大大降低，這是傳統(tǒng)藥物無法實現(xiàn)的。
所述的化療藥物包括(但不限于)紫杉醇、氟達(dá)拉濱、阿糖胞苷、柔紅霉素、順鉑、5-氟尿嘧啶、多柔比星、依托泊苷、天冬酰胺酶、潑尼松、或甲氨蝶呤。
抑制Bcl-2相關(guān)疾病的方法本發(fā)明還提供了一種抑制Bcl-2相關(guān)疾病的方法，所述的方法包括采用本發(fā)明的反義核苷酸，使之與Bcl-2的mRNA發(fā)生雜交，從而抑制Bcl-2的表達(dá)。
在本發(fā)明的一種優(yōu)選方式中，所述的Bcl-2相關(guān)疾病為腫瘤。因此，本發(fā)明提供了一種抑制腫瘤的方法，所述方法包括采用本發(fā)明的反義核苷酸，抑制腫瘤中Bcl-2的表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而達(dá)到抑制腫瘤的目的。
藥物組合物本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，所述的藥物組合物含有有效量的所述的反義核苷酸，以及藥學(xué)上可接受的載體。
所述“藥學(xué)上可接受的”的成分是適用于人和/或動物而無過度不良副反應(yīng)(如毒性、刺激和變態(tài)反應(yīng))的，即有合理的效益/風(fēng)險比的物質(zhì)。
所述“有效量”是指可對人和/或動物產(chǎn)生功能或活性的且可被人和/或動物所接受的量。
所述“藥學(xué)上可接受的載體”指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。該術(shù)語指這樣一些藥劑載體它們本身并不是必要的活性成分，且施用后沒有過分的毒性。合適的載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。在Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到關(guān)于藥學(xué)上可接受的賦形劑的充分討論。在組合物中藥學(xué)上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、甘油和乙醇。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質(zhì)，如填充劑、潤滑劑、助流劑、潤濕劑或乳化劑、pH緩沖物質(zhì)等。
本發(fā)明的反義核苷酸的有效量可隨給藥的模式和待治療的疾病的嚴(yán)重程度等而變化。優(yōu)選的有效量的選擇可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)各種因素來確定(例如通過臨床試驗)。所述的因素包括但不限于反義核苷酸的藥代動力學(xué)參數(shù)例如生物利用率、代謝、半衰期等；患者所要治療的疾病、患者的體重、患者的免疫狀況、給藥的途徑等。通常，當(dāng)本發(fā)明的反義核苷酸每天以約0.001-100mg/kg(優(yōu)選的為0.01-20mg/kg)動物體重的劑量給予時，能得到令人滿意的效果，較佳地每天以2-4次分開的劑量給予，或以緩釋形式給藥。對大部分大型哺乳動物而言，每天的總劑量約為0.005-100mg，較佳地約為0.008-50mg?？烧{(diào)節(jié)此劑量方案以提供最佳治療應(yīng)答。例如，由治療狀況的迫切要求，可每天給予若干次分開的劑量，或?qū)┝堪幢壤販p少。
任何適用的給藥途徑都是可以的，包括但不限于口服、靜脈內(nèi)注射、皮下注射、肌肉給予、局部給予、植入、緩釋給予、腫瘤內(nèi)給予等；優(yōu)選的，所述給藥方式是非腸道給予的。
在本發(fā)明的一種方式中，所述的藥物組合物中還可含有其他Bcl-2相關(guān)疾病的治療劑。所述治療劑比如腫瘤治療劑。
此外，本發(fā)明的藥物組合物可與其它的Bcl-2相關(guān)疾病的藥物聯(lián)合用藥；或者也可結(jié)合其它治療手段使用。
本發(fā)明的主要優(yōu)點在于1.傳統(tǒng)藥物的靶點通常為蛋白質(zhì)，而本藥物的作用靶點是細(xì)胞凋亡抑制因子Bcl-2的mRNA。本發(fā)明涉及的藥物是反義核苷酸、特別是反義硫代寡核苷酸，經(jīng)過證明，其比現(xiàn)有的其它Bcl-2抑制藥物效果更為理想。
2.藥物特異性高且具有廣譜性。反義藥物利用核酸雜交原理可與靶蛋白的mRNA特定序列高特異性結(jié)合。Bcl-2蛋白在多種人腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，并且同腫瘤細(xì)胞的抗凋亡相關(guān)，因此本藥物具有治療多種癌癥的潛力。
3.藥物用量小，副作用小。本發(fā)明涉及的藥物作用于基因水平，位于細(xì)胞生理活動的更上游，因此藥物用量更小。反義藥物的母體是人體遺傳物質(zhì)DNA，不含較大毒性基團(tuán)，毒副作用小。
4.可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性。前已述及，腫瘤抗藥性的產(chǎn)生同Bcl-2蛋白密切相關(guān)，本發(fā)明涉及的反義藥物可以降低細(xì)胞內(nèi)Bcl-2的水平，增強(qiáng)其對化療藥物的敏感性，從而減少化療藥物的使用量，將化療對患者造成的傷害大大降低，這是傳統(tǒng)藥物無法實現(xiàn)的。
下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室指南(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。
實施例1 反義藥物的生產(chǎn)反義藥物使用GE Amersham公司的AKTA oligopilot DNA/RNA Synthesizer合成，所用試劑的配制及合成操作均按照儀器操作手冊進(jìn)行，其中合成所用載體為Amersham公司的PS dC 30HL。純化和脫鹽過程同樣使用Amersham公司的AKTA離子交換純化系統(tǒng)完成，操作遵照儀器手冊進(jìn)行。
反義核苷酸的主要生產(chǎn)過程簡述如下1，依照GE Amersham公司的AKTA oligopilot DNA/RNA Synthesizer要求將質(zhì)量合格的乙腈，脫保護(hù)試劑，單體溶液，硫代和封閉試劑安裝于合成儀的相應(yīng)部位；2，使用AKTA Oligopilot Unicorn4.0合成控制系統(tǒng)編寫程序控制合成儀進(jìn)行自動合成；3，合成粗產(chǎn)物使用Amesham提供的強(qiáng)陰離子交換柱(柱體Fineline100，填料Source 30Q)純化，反相色譜柱(柱體Fineline100，填料Soucre 15RPC)脫鹽；4，脫鹽產(chǎn)物經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮；5，產(chǎn)品稀釋為一定濃度，真空冷凍干燥為白色粉末(GLZ-0.4型真空冷凍干燥機(jī))，封裝4℃保存。
整個生產(chǎn)過程均在百級潔凈區(qū)內(nèi)進(jìn)行。
合成樣品通過HPLC檢測，純度達(dá)95％以上，雜質(zhì)主要包括長度比目的片斷更短的寡核苷酸序列(N-x序列)，NaCl等。
實施例2 用于體外藥效學(xué)檢測的硫代反義核苷酸的合成依照反義藥物的生產(chǎn)方法合成了四條本發(fā)明涉及的序列，同時合成已知的陽性對照藥物G3139及K22和作為陰性對照的關(guān)鍵堿基錯配序列(TM，two-basemismatch，兩個關(guān)鍵堿基的錯配即會對藥效產(chǎn)生較大的影響)，相關(guān)藥物序列見表2。
表2 實施例中合成的硫代反義核苷酸序列

實施例3本發(fā)明的反義核苷酸對體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞的增殖的影響本實施例中，選擇人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29(購自上海申能博彩生物科技有限公司)為試驗對象。細(xì)胞庫中凍存的HT-29細(xì)胞復(fù)蘇后細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)傳代1周后檢測細(xì)胞狀態(tài)良好，開始實驗。
在六孔板中構(gòu)建2ml體積的細(xì)胞培養(yǎng)體系，其中每孔包含HT-29細(xì)胞500個，以不加藥物做空白對照，TM做陰性對照，G3139和K22作為陽性對照。反義藥物和陰性，陽性對照藥的最終濃度均為5μM。細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)15天后取出棄培養(yǎng)液，記錄每孔細(xì)胞集落數(shù)。
統(tǒng)計結(jié)果見圖4。結(jié)果顯示，本發(fā)明的反義藥物具有明顯的抑制人腫瘤細(xì)胞HT-29增殖的活性。四種反義序列的抑制程度存在差異，其中，KS0604，KS0605兩序列對細(xì)胞集落形成的抑制率可達(dá)50％以上，抑制效果好于與之具有一個或多個堿基差異的對照藥物G3139和K22，也好于與之具有一個或多個堿基差異的反義核苷酸KS0601和KS0602。
實施例4 本發(fā)明的反義核苷酸對人腫瘤細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)的影響使用蛋白免疫印記實驗(Western Blot)的方法，檢測反義藥物對人肺癌細(xì)胞H446(購自中國醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院研究所)，人宮頸癌細(xì)胞Hela(購自中科院上海生科院)，人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29(購自上海申能博彩生物科技有限公司)等人腫瘤細(xì)胞Bcl-2表達(dá)的抑制作用。
上述細(xì)胞復(fù)蘇后培養(yǎng)1周，檢查細(xì)胞狀態(tài)正常時開始實驗。
細(xì)胞接種于6孔板，每孔15×104個細(xì)胞，待長至60-70％滿度時加入反義藥物及對照藥物至終濃度1μM，繼續(xù)培養(yǎng)48小時后裂解細(xì)胞獲得總蛋白提取液用于實驗。蛋白提取液稀釋為1μg/μL，電泳上樣20μL。
Western Blot實驗操作遵照《分子克隆實驗指南》(第二版，科學(xué)出版社出版)的固定化蛋白質(zhì)的免疫學(xué)測定部分進(jìn)行，實驗中使用BIO-RAD的電泳和轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)，相關(guān)的緩沖液也依照《分子克隆實驗指南》(第二版，科學(xué)出版社出版)說明配制。
顯影膠片經(jīng)圖像掃描系統(tǒng)掃描后，以條帶灰度作為蛋白表達(dá)的量化值，以空白對照為100％計算蛋白表達(dá)抑制率。
實驗結(jié)果見表3。1μM劑量的反義藥物即可不同程度降低上述體外培養(yǎng)人腫瘤細(xì)胞的Bcl-2的水平，其中KS0604和KS0605對HT-29和H446細(xì)胞的Bcl-2表達(dá)的抑制率達(dá)到60％以上。
表3 硫代反義核苷酸藥物對不同腫瘤細(xì)胞Bcl-2表達(dá)的抑制作用 通過對本反義核苷酸藥物的體外藥效學(xué)檢測，得到如下結(jié)論本發(fā)明涉及的幾種硫代反義寡核苷酸藥物具有降低多種人腫瘤細(xì)胞的Bcl-2表達(dá)水平的作用，并且這種蛋白水平的下調(diào)抑制了人腫瘤細(xì)胞的增殖。
實施例5 集落實驗檢測腫瘤細(xì)胞集落形成抑制率采取的實驗步驟如下對數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞HT-29用胰酶消化，血球計數(shù)板計數(shù)；稀釋細(xì)胞并植入新的六孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)400個，終體積1ml，培養(yǎng)過夜；次日分組加入受試藥物并將體系補(bǔ)為終體積2ml；4，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7天后取出，低倍顯微鏡下計集落數(shù)；處理數(shù)據(jù)，計算集落形成抑制率。
結(jié)果見圖5。從結(jié)果可知，KS0604對腫瘤細(xì)胞HT-29的集落形成抑制效果顯著好于K22和G3139，在10uM劑量時KS0604可以達(dá)到45％的抑制率，相同濃度下K22和G3139的抑制率在30％-35％之間。
因此，KS0604體外抑制腫瘤的效果相對于G3139和K22高10個百分點以上。由于藥物的成本極高，相對比較有限的效果的提高將可能實現(xiàn)用藥量的大幅度降低，亦即成本的大幅度降低。
實施例6 藥物敏感性的檢測藥物敏感性測試的實驗步驟如下1，在對數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞(HT29或H446，均購自中國醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院研究所)培養(yǎng)液中添加終濃度為10uM的反義藥物，作用48小時，不加反義藥物組(溶劑對照；Solvent Control)和陰性藥物(2堿基錯配；Two-base Mismatch)組作為對照；2，消化細(xì)胞并計數(shù)，植入無菌96孔板，5000個細(xì)胞每孔，并加入一定濃度的依托泊苷，使用培養(yǎng)液將體系補(bǔ)齊為200uL；3，培養(yǎng)72小時后采用MTT法檢測細(xì)胞活性。
結(jié)果見圖6。從結(jié)果可知，KS0604以及KS0605具有明顯的提高腫瘤細(xì)胞HT-29和H446對化療藥物依托泊苷敏感性的作用。尤其在針對H446細(xì)胞的試驗中，依托泊苷10uM和30uM濃度下的藥物增敏效果最為明顯，反義藥物預(yù)處理組在依托泊苷10uM濃度下相對細(xì)胞活力降至40％左右，而相應(yīng)的非處理組仍為80％左右。
因此可見，本發(fā)明的反義核苷酸除了殺傷腫瘤細(xì)胞，其主要功能還在于提高腫瘤對各類化療藥物的敏感性，從而提高治療效果，減少副作用。
鑒于大劑量傳統(tǒng)化療藥物對腫瘤患者產(chǎn)生的巨大傷害，本發(fā)明涉及的反義藥物的良好的增敏效果將可以為之提供一個可能的解決方案，并產(chǎn)生較為深遠(yuǎn)的影響。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110>福建金山生物制藥股份有限公司<120>抑制腫瘤的反義核苷酸<130>063473<160>15<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>反義核苷酸<400>1tctcccagcg tgcgccatc19<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>反義核苷酸<400>2tctcccagcg tgcgccatcc 20<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
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<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>反義核苷酸<400>4ctcccagcgt gcgccatc 18<210>5<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
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<221>misc_feature<223>反義核苷酸<400>8ttctcccagc gtgcgccatc c 21<210>9<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>反義核苷酸<400>9ttctcccagc gtgcgccatc ct22<210>10<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>反義核苷酸<400>10gttctcccag cgtgcgccat c 21<210>11<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
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<400>12gttctcccag cgtgcgccat cct 23<210>13<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
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<221>misc_feature<223>反義核苷酸<400>15ctcccagcat gtgccat 1權(quán)利要求
1.一種反義核苷酸，其特征在于，所述的反義核苷酸具有通式(I)所示的結(jié)構(gòu)5’-CTC CCA GCG TGC GCC AT Z-3’ (I)其中，Z選自C、或CC。
2.如權(quán)利要求1所述的反義核苷酸，其特征在于，所述的反義核苷酸的序列中至少2個磷酸鍵被硫代修飾。
3.如權(quán)利要求2所述的反義核苷酸，其特征在于，所述的反義核苷酸的序列中所有磷酸鍵都被硫代修飾。
4.權(quán)利要求1所述的反義核苷酸的用途，其特征在于，用于制備預(yù)防或治療Bcl-2相關(guān)疾病的藥物。
5.如權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于，所述的Bcl-2相關(guān)疾病包括腫瘤。
6.如權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于，所述的腫瘤包括肺癌，肝癌，乳腺癌，宮頸癌，結(jié)腸癌，造血系統(tǒng)癌，內(nèi)分泌系統(tǒng)癌，或淋巴結(jié)癌。
7.一種藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物含有有效量的權(quán)利要求1所述的反義核苷酸，以及藥學(xué)上可接受的載體。
8.如權(quán)利要求7所述的藥物組合物，其特征在于，其中還可含有紫杉醇、氟達(dá)拉濱、阿糖胞苷、柔紅霉素、順鉑、5-氟尿嘧啶、多柔比星、依托泊苷、天冬酰胺酶、潑尼松、或甲氨蝶呤。
9.如權(quán)利要求8所述的藥物組合物，其特征在于，其中含有依托泊苷。
10.一種體外抑制腫瘤細(xì)胞生長的方法，其特征在于，所述的方法包括將所述的腫瘤細(xì)胞與權(quán)利要求1所述的反義核苷酸接觸，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)或醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，公開了一種反義核苷酸，所述的反義核苷酸具有通式5’－CTC CCA GCG TGC GCC AT Z－3’所示的結(jié)構(gòu)；更優(yōu)選的，所述的反義核苷酸是硫代反義核苷酸。經(jīng)過證明，本發(fā)明反義核苷酸比現(xiàn)有的其它Bcl－2抑制藥物效果更為理想，且毒副作用小。
文檔編號A61P35/00GK1887896SQ20061002920
公開日2007年1月3日 申請日期2006年7月21日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月21日
發(fā)明者翟培彬, 陳仁海, 陳希中, 林英略, 王巍, 黃旭華 申請人:福建金山生物制藥股份有限公司