專利名稱：：Cpg寡聚脫氧核苷酸用于皮膚病的治療用途的制作方法
技術領域：
：本申請要求2004年11月5日提交的韓國專利申請NO.10-2004-0090000的優(yōu)先權，其內容在此通過參考引入。本發(fā)明涉及CpG寡聚脫氧核苷酸用于皮膚病的治療用途。
背景技術：
：皮膚病是指包括人類在內的動物的皮膚上出現(xiàn)的所有疾病。在皮膚病當中，過敏性皮炎是一種慢性炎癥皮膚病，其主要癥狀包括嚴重的瘙癢、皮膚干燥和濕疹(Rudikoff，D.etal.，Lancet.3511715-1721，1998)。一般地，特應性皮炎具有遺傳性，且根據(jù)個體特征伴有特應性哮喘、過敏性鼻炎、過敏性結膜炎、和蕁麻疹。關于患有特應性皮炎的患者出現(xiàn)的免疫疾病的報道癥狀包括IgE的產生增加，Th1(T輔助細胞1型)淋巴細胞分泌的IFN-γ數(shù)量下降等。另外，當從組織學的角度考慮時，特應性皮炎的皮膚損害顯示出具有CD4+表現(xiàn)型的T淋巴細胞增加，單核細胞/巨噬細胞，以及肥大細胞和噬酸細胞的浸潤。此外，特應性皮炎的皮膚損害顯示出樹突狀細胞(DCs)和表皮朗氏細胞的增加(Imokawa，G.，etal.，J.Invest.Dermatol.，96523-526，1991)。據(jù)報道，在正常的皮膚部位以及損傷部位都會發(fā)生這種狀況(LeungDY，BhanAK，SchneebergerEE，GehaRS.JAllergyClinImmunol.，71(1Pt1)，47-56，1983)。最近，據(jù)報道，在特應性皮炎的損傷部位表達記憶性CD4+T淋巴細胞的CCR-4的數(shù)量增加了(Imai，T.etal.，Int.Immunol.，1181-88，1999)。另外，據(jù)VanderHeijdenFL等報道，浸潤到損傷部位的具有CD4+表現(xiàn)型的T淋巴細胞釋放IL-4(VanderHeijdenFLetal.，JInvestDermatol.，97389-394，1991)，且IL-4起到加速Fc受體對抗原呈遞細胞內免疫球蛋白E的低親和性的作用。此外，最近報道的實驗結果顯示T淋巴細胞以及從中釋放的各種細胞因子與特應性皮炎的免疫病理機理緊密相關。此外，據(jù)報道，產生IL-4、IL-5和IL-10的過敏原特異的T輔助2型淋巴細胞增加患有特應性皮炎的患者的損傷，從而對特應性反應和IgE的增加都產生顯著的影響(hussain，I.etal.，CurrDrugTargetsInflammAllergy.，2199-120，2003)。與此同時，其它研究者研究了與特應性皮炎有關的趨化因子及其受體對皮膚屏障的影響。結果，據(jù)報道從患有特應性皮炎的患者的角化細胞中產生大量的TSLP(胸腺基質淋巴細胞生成素)和MDC(巨噬細胞-衍生的趨化因子)，且一旦刺激IFN-γ，則產生大量的RANTES、TARC和MDC(Giustizieri，ML.，etal.，J.AllergyClinImmunol.，107871-877，2001)。一般地，脊椎動物的免疫體系以下述方式進化發(fā)展即通過識別微生物中的數(shù)種特征分子免疫活性快速提高以應答微生物的攻擊。根據(jù)許多研究者的研究，表明細菌DNA具有脊椎動物DNA沒有的的各種結構決定因子，并且這些因子激活免疫細胞(Gillkeson，GS.etal.，J.Clin.Invest.，951398-1402，1995)。脊椎動物DNA和細菌DNA的顯著區(qū)別是，脊椎動物的基因組抑制CpG二核苷酸和在CpG基序(CpGmotif)中70％的胞嘧啶被甲基化(Krieg，AM.etal.，Nature374546-549，1995)。與哺乳動物不同的是，細菌富含未甲基化的CpG基序。含CpG基序的寡聚脫氧核苷酸(ODNs)激活寄主的保護機制，其范圍從先天的免疫應答到獲得性免疫應答(Akdis，CA.CurrOpinImmunol.，12641-646，2000)。一般地，CpGODNs可激活B細胞以及NK細胞。另外，CpG序列刺激巨噬細胞，以便分泌IL-12，其中IL-12是NK細胞產生IFN-γ的潛在衍生物(Krieg，AM.AnnualReviewImmunol.，20709-760，2002)。除了上述以外，這種細胞還分泌諸如IL-1，IL-6，IL-18和TNF-α的前炎性(pro-inflammatory)細胞因子，以及諸如IFN-γ和IL-12之類的細胞因子，這些細胞因子產生Th1-偏移的免疫環(huán)境或趨化因子。此外，CpGODNs提高體液應答誘導IgG2a同種型(Th1型指示劑)，并增加細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的活性(Warren，TL.etal.，J.Immunol.，1656244-6251，2000)。在動物模型中使用CpGODNs治療過敏性疾病和癌癥有效地提高直接或間接免疫應答。已知這種CpGODNs根據(jù)其核苷酸序列具有不同的生理活性，即使它們具有相同的CpG基序。最近，開發(fā)了具有改性骨架的CpGODNs，以便增加CpGODNs的可利用性。具有磷酸二酯骨架，即DNA基本骨架的CpGODNs對核酸酶敏感，因而在體內降解。因此，幾乎不能誘導體內毒性。然而，與具有其它骨架的CpGODNs相比，上述CpGODNs的活性低(Kwon，HJ.etal.，Biochem.Biophys.Res.Commun，311129-138，2003；和Lee，KW.etal.，Mol.Immunol，41955-964，2004)。相反，通過對其結構進行人工改性，從而制備具有硫代磷酸骨架的CpGODNs，以便防止其在體內被核酸酶降解。具有硫代磷酸酯骨架的CpGODNs在體內更加穩(wěn)定且與具有磷酸二酯骨架的CpGODNs相比，顯示出更加優(yōu)良的誘導B細胞的效果。因此，被改性具有硫代磷酸酯骨架的CpGODNs被廣泛使用。然而，具有硫代磷酸酯骨架的CpGODNs增加了非特異性ODN對各種蛋白質的結合，且不容易在體內降解，從而引起毒性。另外，據(jù)報道，具有硫代磷酸酯骨架的CpGODNs引起關節(jié)炎并加劇關節(jié)炎狀況(DengGMetal.，Arthritis&Rheumatisum，43(2)356-364，2000；MasayukiMiaytaetal.，Arthritis&Rheumatisum，43(11)2578-2582，2000)，且還可引起自身免疫疾病，例如SLE(系統(tǒng)性紅斑狼瘡)(Tanaka，T.etal.，JExp.Med.175597-607，1992；和Hans-JoachimAndersetal.，TheFASEBJournalexpressarticle10.1096/fj.03-0646fje.pubilishedonlineJanuary20，2004)。除了上述報道以外，許多研究者還報道了具有硫代磷酸酯骨架的CpGODNs的副作用(TsunodaI.etal.，BrainPathol.，9(3)481-493，1999；andBachmaierK.etal.，Science，283(5406)1335-1339，1999)。如上所述，盡管對使用CpGODNs作為免疫激活劑進行了廣泛研究，但卻沒有發(fā)現(xiàn)CpGODNs在預防和治療皮膚病中使用的任何公開。特別是，從未研究過具有磷酸二酯骨架的CpGODNs在預防和治療皮膚病中的應用。發(fā)明公開因此，鑒于以上提及的問題提出本發(fā)明。本發(fā)明的目的是提供CpG寡聚脫氧核苷酸的新型治療應用。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供抑制Th2細胞因子和/或誘導Th1細胞因子的方法，該方法包括給對其有需要的受試者施用有效量的下式表示的CpG寡聚脫氧核苷酸[化學式]SYYSSACGTTSNYRAWMYTC(SEQIDNO.1)其中S是G或C；Y是C或T；N是選自包括A，G，T和C的組中的任何一種，R是G或A；W是A或T；和M是A或C，其中CpG寡聚脫氧核苷酸包括至少兩個未甲基化的CpG基序。根據(jù)本發(fā)明另一方面，提供一種刺激免疫應答的方法，該方法包括給對其有需要的受試者施用有效量的CpG寡聚脫氧核苷酸。根據(jù)本發(fā)明再一方面，提供一種治療或預防皮膚病的方法，該方法包括給對其有需要的受試者施用有效量的CpG寡聚脫氧核苷酸。定義除非另有說明，此處所使用的所有科技術語具有與本發(fā)明所屬領域的普通技術人員通常理解的相同的含義。下述參考文獻提供本領域技術人員本發(fā)明所使用的許多術語通常的定義Singleton等，微生物和分子生物學詞典(1994年第二版)；劍橋科技詞典(Walkered.，1988)；和Hale&Marham，哈珀柯林斯生物辭典。另外，提供下述定義以輔助讀者實施本發(fā)明。此處所使用的術語“CpG基序”是指核苷酸序列，它含有通過磷酸酯鍵連接的未甲基化的胞嘧啶-鳥嘌呤二核苷酸(也被稱為“未甲基化的胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤二核苷酸”)并激活免疫應答。此處所使用的術語“CpG寡聚脫氧核苷酸”(下文被稱為“CpGODN”)是指包含至少兩個上述CpG基序的寡聚脫氧核苷酸。此處所使用的術語“受試者”是指動物，尤其哺乳動物。受試者可以是來自動物的細胞、組織或器官。此處所使用的術語“有效量”是指顯示出下述效果的用量抑制Th2細胞因子，誘導Th1細胞因子，激活樹突狀細胞，刺激免疫應答，或者治療或預防受試者的皮膚病。下文將更加詳細地描述本發(fā)明。本發(fā)明研究了CpGODN對治療或預防皮膚病的效果，且已發(fā)現(xiàn)下式表示的CpG寡聚脫氧核苷酸可用作治療或預防皮膚病的試劑[化學式]SYYSSACGTTSNYRAWMYTC(SEQIDNO.1)其中S是G或C；Y是C或T；N是選自包括A，G，T和C的組中的任何一種，R是G或A；W是A或T；和M是A或C，其中CpG寡聚脫氧核苷酸包括至少兩個未甲基化的CpG基序。優(yōu)選地，在上式中，YS或YR二核苷酸可以是CG。更優(yōu)選，本發(fā)明的CpGODN是選自包括下述SEQIDNOs.2-8的組中的任何一種。最優(yōu)選，本發(fā)明的CpGODN可具有由下述SEQIDNO.2或8表示的核苷酸序列。本發(fā)明的CpGODN可來自于天然來源(例如，大腸桿菌(E.coli)的染色體的DNA)。它也可被化學合成或者重組構建。本發(fā)明的CpGODN可通過使用本領域技術人員已知的各種核酸合成技術和儀器來制備(Ausubeletal.，CurrentProtocolsinMolecularBiology，Chs2.和4.，WileyInterscience，1989；Maniatis，etal.，MolecularCloningAlaboratoryManual，ColdSpringHarborLab.，NewYork，1982；以及美國專利Nos.4,458,066和4,650,675)。另外，本發(fā)明的CpGODN可通過使用限制酶，核酸外切酶或核酸內切酶，由已有的核酸序列來制備。優(yōu)選地，本發(fā)明的CpGODN具有磷酸二酯骨架。磷酸二酯骨架，是DNA的基本骨架，其在體內容易通過核酸酶降解，因此，其在體內引起毒性的可能性很小。本發(fā)明的CpGODN的特征在于，與其它CpGODNs不同，盡管它具有磷酸二酯骨架，但它在體內以及體外均顯示出優(yōu)良的免疫活性。本發(fā)明的CpGODN可具有改性骨架。已證明當在體內給藥時，改性的寡聚核苷酸骨架可提高CpGODN的活性和/或穩(wěn)定性。在本發(fā)明的CpGODN中，骨架的優(yōu)選改性包括改性成硫代磷酸酯，具有抗降解性?？稍贑pGODN的任何一個末端改性成硫代磷酸酯例如最后兩個或三個5’或3’核苷酸可與硫代磷酸酯鍵相連。此外，對本發(fā)明的CpGODN進行改性使其具有二級結構(例如，莖環(huán)結構)，使得它抗降解。優(yōu)選地，對CpGODN進行改性使其具有一個或多個部分硫代磷酸酯-改性的骨架。可通過使用氨基磷酸酯或H-膦酸酯(H-phosphate)化學自動技術，合成硫代磷酸酯(S.E.Beaucageetal.，TetrahedronLett.，221859，1981；Connollyetal.，Biochemistry，233443，1984；Agrawaletal.，Proc.Antl.Acad.Sci.U.S.A.857079-7083，1988；Gareggetal.，TetrahedronLett.，274051-4054，1986；Froehleretal.，Nucl.Acid.Res.，145399-5407，Gareggetal.，TetrahedronLett.，292619-2622，1988)。作為改性的另一實例，可按照已知方式，例如根據(jù)美國專利NO.4,469,863中所述，制備芳基-和烷基-膦酸酯。另外，可通過自動固相合成，使用商業(yè)試劑，制備烷基磷酸三酯(即根據(jù)美國專利NO.5,023,243或歐洲專利NO.092574所列出的將帶電的磷酸氧烷基化)。降低CpGODN的降解敏感性的另一改性包括將腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶和尿苷改性成其乙?；?和硫代-衍生物或類似的改性，以及包括非典型的堿基，例如肌苷和quesine。另外，用二醇，例如四乙基乙二醇(tetraethylglycol)或六乙基乙二醇(hexaethylglycol)封端的CpGODNs更加抗降解。此外，可使用磷酸二酯與硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、磷酸甲酯、硫代磷酸甲酯、二硫代磷酸酯的結合及其混合物(Khoranaetal.，J.Molec.Biol.，72209，1972；Reese，TetrahedronLett.，333143-3179，1978；Jagetetal.，Biochemistry.，277237，1988；Agrawaletal.，Proc.Antl.Acad.Sci.U.S.A.857079-7083，1988；Uhlmann，E.etal.，Chem.Rev.，90544，1990；Goodchild，J.BioconjugateChem.，4165，1990)。認為具有如上所述改性的骨架的CpGODNs可顯示出較強的免疫效果，這是由于抗核酸酶的提高、細胞吸收的增加、蛋白質吸收的增加和/或胞內定位的改變導致的。本發(fā)明的CpGODN的優(yōu)選骨架是磷酸二酯(在下文被稱為“O型”)或者硫代磷酸酯(在下文被稱為“S型”)。最優(yōu)選的骨架是O型骨架，該骨架在體內容易降解，因此不引起副作用。本發(fā)明的CpGODN通過抑制Th2細胞因子(例如，IL-4和IL-10)和/或通過誘導Th1細胞因子(例如，IL-12和IFN-γ)，從而具有調控Th1/Th2免疫應答平衡的生理活性。更特別地，本發(fā)明的CpGODN會激活巨噬細胞、白細胞和樹突狀細胞，以誘導IL-12和/或IFN-γ的表達。另外，本發(fā)明的CpGODN以依賴于濃度的方式增加樹突狀細胞(例如，第III組MHC、CD80和CD86)表面分子的表達，并誘導T淋巴細胞和外周血液單核細胞二者的增殖。此外，本發(fā)明的CpGODN減少了特應性皮炎的損傷處的CD4+和CD8+T淋巴細胞，并降低血清IgE水平。與本領域普通技術人員已知的常規(guī)CpGODNs相反，本發(fā)明的CpGODN顯示出幾乎相同的活性，而與骨架結構無關。因此，本發(fā)明提供一種抑制Th2細胞因子和/或誘導Th1細胞因子，和刺激免疫應答的方法，該方法包括給對其有需要的受試者施用本發(fā)明的CpGODN。通過本發(fā)明的CpGODN抑制的Th2細胞因子包括在Th2細胞內分泌的所有種類的細胞因子。例如，Th2細胞因子包括IL-4、IL-5、IL-10、IL-13或類似物。通過本發(fā)明的CpGODN誘導的Th1細胞因子包括在Th1細胞內分泌的所有種類的細胞因子，特別的實例包括IL-12、IFN-γ或類似物。此處所使用的“刺激免疫應答”包括激活樹突狀細胞，誘導免疫細胞(例如，T淋巴細胞和外周血液單核細胞)增殖，誘導與炎癥有關的細胞因子(例如，TNF-γ，MIP-2，IL-1，IL-12)，和/或誘導由UV輻射引起的免疫抑制應答的恢復。本發(fā)明的CpGODN借助以上所述的活性的優(yōu)點，還具有治療或改進皮膚病狀況的效果。因此，本發(fā)明的CpGODN可有效地用于治療或預防皮膚病。本發(fā)明還提供治療或預防皮膚病的方法，該方法包括對其有需要的受試者施用本發(fā)明的CpGODN。本發(fā)明可應用到其上的皮膚病包括因Th1/免疫應答的不平衡引起的疾病，即因選自下述組中的至少一種因素引起的皮膚病通過Th2-淋巴細胞介導的細胞因子的過表達；通過Th1-淋巴細胞介導的細胞因子的低表達；血清IgE水平的增加；CD8+表現(xiàn)型T淋巴細胞和/或CD4+表現(xiàn)型T淋巴細胞的數(shù)量與功能的異常；以及樹突狀細胞和/或巨噬細胞的失活。更特別地，可通過本發(fā)明的CpGODN治療或預防的皮膚病包括因Th1細胞因子，IL-12，的低表達引起的疾病，或者通過增加IL-12的表達或產生來治療的疾病。IL-12起到加強抗起始感染產生的先天免疫，以及通過參與包括樹突狀細胞和巨噬細胞在內的T細胞和APCs(遞呈抗原的細胞)之間的相互作用來誘導更有效的適應性免疫應答。通過兩類機制，即不依賴于T細胞的機制和依賴于T細胞的機制，由APCs例如樹突狀細胞或巨噬細胞，產生IL-12。通過包括病毒或細菌或者其產物，例如LPS或細菌的DNA在內的感染劑誘導不依賴于T細胞的機制(D′AndreaAetal.，J.Exp.Med.，1761387，1992；SatoTetal.，Science273352-354，1996)。該機制暗示IL-12作為連接先天免疫與適應性免疫的介導子(mediator)的免疫重要性。與此同時，依賴于T細胞的IL-12的產生機制主要通過激活的T細胞的相互作用來誘導，其中所述激活的T細胞通過諸如CD40配體之類的分子提供共刺激信號(ShuUetal.，Eur.J.Immunol.，251125-1128，1995；CellaMetal.，J.Exp.Med.，184747-752，1996)。這一機制表明IL-12在誘導T細胞免疫應答，例如細胞毒性T細胞的增殖和細胞毒性的增加，或者當形成適應性免疫時，Th1免疫應答的繼續(xù)維持方面扮演著重要的作用。IL-12主要由APCs產生，且它直接影響樹突狀細胞或巨噬細胞以誘導產生IFN-γ。此外，IL-12可作用于被激活的T細胞。在此情況下，它誘導T細胞產生IFN-γ并調控由IFN-γ誘導的免疫應答(ChanSHetal.，J.Exp.Med.，173869-879，1991)。已知IL-12與各種疾病有關。這種疾病的實例包括特應性皮炎和過敏性皮膚病(NeumannC.，etal.，JMolMed.，74401-406，1996；AibaS.，etal.，ExpDermatol.，1286-95，2003；NilssonC.，etal.，ClinExpAllergy.，34373-380，2004)；病毒性皮膚病(Katakura，T.，etal.，Clin.Immunol.105363-370，2002HenggeU.R.，etal.，Br.J.Dermatol.，14915-19，2003；AranyI.，etal.，AntiviralRes.，4355-63，1999)；皮膚癌(RookAH.，etalAnn.N.Y.Acad.Sci.，795310-318，1996；Gollob，JA.，etal.，J.Clin.Oncol.，212564-2573，2003；TrinchieriG.，etal.，AnnuRevImmunol.，13251-276，1995；andKreplerC.，etal.，JinvestDermatol.，122387-391，2004)或類似疾病。因此，可應用本發(fā)明的皮膚疾病是因Th1/Th2免疫應答的平衡失常引起的皮膚病。特別地，可應用本發(fā)明治療特應性皮炎、過敏性皮膚疾病、病毒性皮膚病和皮膚癌。本發(fā)明的CpGODN可直接施用到受試者上。另外，本發(fā)明的CpGODN可以以核酸釋出復合物形式通過與誘導高親和性地鍵合到靶細胞(例如樹突狀細胞的表面)的分子耦合，或者通過用這種分子包封而施用。本發(fā)明的CpGODN可借助離子鍵或共價鍵耦合到甾醇(例如，膽固醇)、類脂(例如，陽離子類脂、病毒體或脂質體)或者靶細胞特異的偶合劑(例如由靶細胞特異的受體識別的配體)上。合適的偶合劑或交聯(lián)劑的實例包括蛋白質A、碳二亞胺、N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶二硫)丙酸酯(SPDP)或類似物?？赏ㄟ^各種路線，以本領域普通技術人員已知的方式施用本發(fā)明的CpGODN(Donnellyetal.，J.Imm.Methods.，176145，1994；Vitrelloetal.，J.Clin.Invest.，95341，1995)。換句話說，可借助口服或者腸胃外路線，例如借助口服、肌內、靜脈內、皮內、動脈內、髓質內、硬膜內、腹膜內、鼻內、陰道內、直腸、舌下或皮下路線，或者借助胃腸道、粘膜或呼吸器官施用本發(fā)明的CpGODN。例如，可將本發(fā)明的CpGODN配制成注射用配方，通過使用30規(guī)格(gauge)的注射針，以給定的用量將其注射到皮下層。另外，可通過用30規(guī)格的注射針輕輕地刺穿皮膚施用這一注射用配方，或者可直接施加到皮膚上。另外，可通過本領域技術人員已知的常規(guī)方法，將本發(fā)明的CpGODN配制成口服或腸胃外施用的各種形式。在口服配方的情況下，可將本發(fā)明的CpGODN與載體混合，以便配制成口服片劑、口含片(buccaltablet)、錠劑、膠囊、酏劑、懸浮液、糖漿和威化餅(wafer)。除了活性成分以外，這種配方可進一步包括稀釋劑(例如，乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露糖、山梨醇、纖維素和/或糖膠)和表面活性劑(例如，氧化硅、滑石、硬脂酸、其鎂或鈣鹽和/或聚乙二醇)。片劑可包括粘合劑，例如硅酸鋁鎂、淀粉糊劑、明膠、黃蓍膠、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和/或聚乙烯吡咯烷酮。視需要，片劑可進一步包括崩解劑，例如淀粉、瓊脂、藻酸或其鈉鹽、吸收劑、著色劑、增味劑和/或甜味劑?？赏ㄟ^常規(guī)的混合、?；蛲坎脊に嚕苽溥@一配方。另外，腸胃外施用的配方包括注射用配方，例如等滲水溶液或懸浮液，或者皮膚涂覆的配方。可根據(jù)本領域已知的任何技術，通過使用合適的分散或潤濕劑，和懸浮劑，制備注射用配方。例如，可通過在鹽水或緩沖液內溶解每一成分，制備注射用配方?？赏ㄟ^將本發(fā)明的藥物組合物與藥學上可接受的載體混合，和將混合物配制成粉末、搽劑、凝膠、洗劑、霜、藥膏、糊劑、發(fā)泡劑(puff)、氣霧劑、栓劑或類似物形式，從而制備皮膚涂覆的配方。在這些配方當中，尤其優(yōu)選藥膏?？稍诿恳慌浞街惺褂玫妮d體包括烴，例如凡士林、液體石蠟、膠凝的烴或類似物；動物或植物油，例如重鏈脂肪酸三甘油酯、豬脂肪、脂肪酸甘油酯、可可油或類似物；高級脂肪酸醇及其酯，例如鯨蠟醇、十八烷醇、硬脂酸、棕櫚酸異丙酯或類似物；水溶性基質，例如聚乙二醇、1，3-丁二醇、甘油、明膠、白糖、糖醇或類似物；乳化丙烯酸酯，例如甘油脂肪酸酯、聚氧硬脂酸酯、聚氧乙烯固化蓖麻油或類似物；粘合劑，例如丙烯酸酯、藻酸鈉或類似物；和噴霧劑，例如液化石油氣體、二氧化碳或類似物；和防腐劑，例如對氧基苯甲酸酯。本發(fā)明的配方可進一步包括穩(wěn)定劑和防腐劑。合適的穩(wěn)定劑包括抗氧劑，例如，亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉或抗壞血酸。合適的防腐劑包括氯化芐烷銨、苯甲酸甲酯或丙酯和氯丁醇。對于其它藥學上可接受的載體來說，可參考下述文獻Remington′sPharmaceuticalSciences，19thed.，MackPublishingCompany，Easton，PA，1995?？梢圆捎脝我粍┝?，或者通過在較長時間段內多劑量的分批治療方案，給患者施用總有效量的本發(fā)明的CpGODN。含本發(fā)明的CpGODN的藥物組合物可依據(jù)疾病的嚴重度具有不同量的活性成分。在全身施用的情況下，本發(fā)明的藥物組合物可優(yōu)選作為日劑量形式施用，以獲得在血液內約0.01μM-100mM的寡聚核苷酸濃度。與借助其它路線施用相比，在局部施用的情況下，可施用較小劑量的活性成分。優(yōu)選地，本發(fā)明的CpGODN的總劑量范圍為約0.01μg-100mg/kg體重/天。然而，CpGODN的濃度要根據(jù)各種因素來決定，其中包括施用路線、治療頻率、年齡、體重、狀況、性別、疾病的嚴重度、飲食狀況和患者的排泄狀態(tài)。因此，考慮到上述因素，本領域的普通技術人員將很容易確定在治療或預防皮膚病中施用的CpGODN的有效量。然而，本發(fā)明的藥物組合物不限于上述配方、施用路線和施用方法，只要它顯示出本發(fā)明的所想要的效果即可。可單獨或者結合本領域技術人員已知的其它治療方法，其中包括化療、放療、外科手術、其它口腔處理劑和藥膏(例如Elidel，pimecrolimus)施用本發(fā)明的藥物組合物。此外，可結合本領域技術人員已知的其它免疫助劑施用本發(fā)明的藥物組合物?？墒┯玫拿庖咧鷦┌↖NF-γ，IL-12、環(huán)胞菌素A、FK506(他克莫司)，TP-5(胸腺五肽、胸腺噴丁)或類似物。視需要，含本發(fā)明的CpGOND的藥物組合物還可進一步包括選自下述組中的至少一種抗菌素，其中包括四環(huán)素、土霉素、慶大霉素、硫酸新霉素、桿菌肽、硫酸多粘霉素B和莫匹羅星；抗組胺劑，其中包括苯海拉明、prometadine、triperenamin，吩噻嗪、chloropeniramin、anthazoline和phantholyl；消炎藥；抗病毒劑；和抗菌劑。附圖簡述根據(jù)下述詳細說明，結合參考下述附圖，本發(fā)明的前述和其它目的、特征和優(yōu)點將變得顯而易見，其中FIG.1示出了在本發(fā)明的寡聚-4CpGODN上的堿基改性對激活IL-8啟動子和IL-12啟動子的影響。FIG.2示出了與現(xiàn)有技術的CpGODNs(1826和2006)以及非-CpGODN(2041)相比，在本發(fā)明的寡聚-4CpGODN上的骨架改性對激活IL-8啟動子的影響。對照未處理。FIG.3示出了與現(xiàn)有技術的CpGODNs(1826和2006)以及非-CpGODN(2041)相比，在本發(fā)明的寡聚-4CpGODN上的骨架改性對產生IL-12p40(A)和IFN-γ(B)的影響。FIG.4示出了與現(xiàn)有技術的O-型CpGODNs(1826和2006)相比，本發(fā)明的O-型寡聚-4CpGODN對巨噬細胞內與炎癥有關的細胞因子的表達的影響。FIG.5示出了本發(fā)明的O-型寡聚-4CpGODN對激活樹突狀細胞的細胞表面分子(MHC-II、CD80和CD86)的影響。對照未處理。LPS用脂多糖處理(正對照)。FIG.6示出了本發(fā)明的O-型CpGODN的濃度對激活樹突狀細胞的細胞表面分子(CD80和CD86)的影響。對照未處理。LPS用脂多糖處理(正對照)。FIG.7示出了與現(xiàn)有技術的O-型1826CpGODN和非-CpGODN(2041)相比，本發(fā)明的O-型寡聚-4CpGODN對樹突狀細胞中IL-12表達的影響。FIG.8示出了本發(fā)明的O-型CpGODNs(寡聚-4-11和寡聚-4)對同種異體T淋巴細胞的增殖的影響。FIG.9示出了O-型CpGODNs(寡聚-4-11和寡聚-4)對外周血液單核細胞(PBMC)的增殖的影響。FIG.10是顯示用FITC標記的本發(fā)明的O-型寡聚-4CpGODN浸潤到NC/Nga小鼠背部上皮內的照片。FIG.11示出了在動物模型中，通過施用本發(fā)明的O-型寡聚-4CpGODN治療特應性皮炎的結果。A在于NC/Nga小鼠背部的特應性皮炎損傷處涂覆本發(fā)明的O-型寡聚-4CpGODN之后的第5天和第7天時拍攝的照片，用肉眼觀察。B將本發(fā)明的O-型寡聚-4CpGODN涂覆到患有特應性皮炎的NC/Nga小鼠背部后將此處皮膚切除，并對皮膚進行H&E染色所拍攝的照片。_棘皮癥→皮膚過渡角化癥FIG.12示出了將本發(fā)明的O-型寡聚-4CpGODN施用到NC/Nga的小鼠的背部皮膚上細胞因子(IL-4、IL-10和IFN-γ)表達的免疫組織化學結果。箭頭表示細胞因子的表達。FIG.13示出了在治療之前和之后，將本發(fā)明的O-型寡聚-4CpGODN施用到NC/Nga的小鼠的背部皮膚上，浸潤的CD4+和CD8+淋巴細胞的免疫組織化學結果。箭頭表示CD4+和CD8+淋巴細胞。FIG.14示出了在施用本發(fā)明的O-型寡聚-4CpGODN之后，NC/Nga小鼠的血清IgE水平的結果。AD未處理的對照物。FIG.15示出了證明本發(fā)明的CpGODN引起的接觸性超過敏反應恢復效果的實驗過程，這與抑制在小鼠體內通過UV輻照引起的接觸性超敏反應相反。FIG.16示出了本發(fā)明的CpGODN引起的接觸性超敏反應的恢復效果，這與抑制在小鼠體內通過UV輻照引起的接觸性超敏反應相反。*是指p＜0.05，和**是指p＜0.01。FIG.17示出了本發(fā)明的CpGODN對通過UV輻照抑制接觸性超敏反應的小鼠脾臟中分離的T細胞的增殖應答誘導的影響。*是指p＜0.05。實施本發(fā)明的最佳方式現(xiàn)詳細地參考本發(fā)明的優(yōu)選實施例。要理解，下述實施例僅僅是例舉，本發(fā)明并不限于此。<實施例1>寡聚-4CpGODN的堿基改性對免疫應答的影響<1-1>分離寡聚-4CpGODN及其堿基改性用SEQIDNO.2表示的核苷酸序列的CpGODN(下文稱為“寡聚-4CpGODN”)是從用DNaseI部分剪切的大腸桿菌(E.coli)染色體的DNA片段中分離的，它可將免疫應答誘導到一個高的水平。接下來，通過改性寡聚-4CpGODN的核苷酸序列，制備各種突變體，并測試以確定其免疫應答。如下所述對寡聚-4CpGODN的堿基進行改性用CA和CT二核苷酸取代在寡聚-4CpGODN(SEQIDNO.2)的核苷酸序列內的5’-端的第二個CpG基序，將所得的ODNs分別表示為“寡聚-4-1”和“寡聚-4-2”。此外，用TG和CA二核苷酸取代在寡聚-4CpGODN(SEQIDNO.2)的核苷酸序列內的5’-端的第三個CpG基序，將所得的ODNs分別表示為“寡聚-4-3”和“寡聚-4-4”。接下來，用選自包括AA、CC和GG的組中的至少一種二核苷酸取代寡聚-4CpGODN的核苷酸序列內的第二個CpG基序和第三個CpG基序之間的四核苷酸(TTGC)中第二個CpG基序的3’-端處的二核苷酸(TT)，所得的ODNs分別表示為“寡聚-4-5”、“寡聚-4-6”和“寡聚-4-7”。接著，用選自包括GA、GT和CG組中的一種取代以上提及的四核苷酸(TTGC)中第三CpG基序的5’-端處的二核苷酸(GC)，將所得的ODNs分別表示為“寡聚-4-8”、“寡聚-4-9”和“寡聚-4-10”。最后，在寡聚-4CpGODN的核苷酸序列內，在第一個CpG基序的5’-端一側存在的二核苷酸(CT)；第一個CpG基序(CG)；在第一個CpG基序和第二個CpG基序之間存在的二核苷酸(CA)；在第三個CpG基序的5’-端處存在的二核苷酸(GC)；和在第三個CpG基序的3’-端處存在的六核苷酸(AACTTC)中的第二和第三個核苷酸(AC)分別用GC、TC、GA、GG和TA取代，將所得的ODN表示為“寡聚-4-11”。由Genotech有限公司.合成了每一個ODN。所有已合成的ODNs為磷酸二酯型寡聚核苷酸。下表1中示出了關于每一取代突變體的序列信息。在表1中，用方塊(block)表達的每一部分代表一個CpG基序，而每一下劃線部分表示改性部分。寡聚-4CpGODN的堿基改性<1-2>測定寡聚-4CpGODN的堿基改性對免疫應答的影響測定寡聚-4CpGODN以及在實施例<1-1>中制備的其各種取代突變體對激活巨噬細胞的IL-8和IL-12啟動子的影響。a)培養(yǎng)小鼠巨噬細胞在含有10％FBS(GibcoBRL)的DMEM基質內培養(yǎng)Raw264.7細胞(ATCC，Manassas，VA)。在培養(yǎng)箱(Forma)內，在37℃和5％CO2下培養(yǎng)細胞。在細胞培養(yǎng)過程中，根據(jù)臺盼藍(trypanblue)排除方法使用血細胞計數(shù)器周期性地測定細胞存活率和細胞數(shù)。在全部培養(yǎng)期間，維持細胞存活率為至少95％。b)構建IL-8/IL-12啟動子-Luc報道質粒為了擴增IL-8啟動子區(qū)，通過使用人類基因組DNA作為模板和一組用SEQIDNOs.14和15表示的引物，進行PCR(聚合酶鏈反應)。將IL-8啟動子區(qū)的擴增片段插入到由BglII和HindIII剪切的pGL3-Basic質粒(Promega)內，從而構建IL-8/啟動子-Luc報道質粒(WuG.D.etal.，J.Biol.Chem.，2722396-2403，1997)。與此同時，為了擴增IL-12啟動子區(qū)，通過使用人類基因組DNA作為模板和一組用SEQIDNOs.16和17表示的引物，進行PCR。將IL-12啟動子區(qū)的擴增片段插入到由SacI和XhoI剪切的pGL3-Basic質粒(Promega)內，從而構建IL-12啟動子-Luc報道質粒(WuG.D.etal.，J.Biol.Chem.，2722396-2403，1997)。c)激活啟動子的分析熒光素酶活性分析將Raw264.7細胞(ATCC，Rockviller，MID)以5×104個細胞/孔的濃度在12-孔板內鋪板(plate)。接下來，在培養(yǎng)箱內，在37℃和5％CO2下培養(yǎng)細胞24小時。用如在上述b)部分所述獲得的IL-8啟動子-Luc報道質?；騃L-12啟動子-Luc報道質粒以及pRL-null的質粒(Promega)共轉染細胞。接下來，在培養(yǎng)箱內，在37℃和5％CO2下培養(yǎng)細胞24小時。將上表1中所述的CpGODNs加入到每孔(10μg/孔)，接著在培養(yǎng)箱內，在37℃和5％CO2下培養(yǎng)6小時或12小時。用PBS處理對照物。在完成培養(yǎng)之后，除去培養(yǎng)液。然后，將獲自Promega的雙-熒光素酶報道分析體系中的PLB(被動裂解緩沖液)加入到每一孔內至100μl/孔的濃度，進行細胞的裂解。離心細胞裂解物并使用上清液(15μl)進行熒光素酶分析。通過使用TD-20/20光度計(Turner設計測量熒光素酶活性?；趯φ瘴?，以相對活性形式表達用CpGODN處理之后每一啟動子的活性。換句話說，通過相對于對照物活性的折合活性(foldactivation)，來表達啟動子的活性，其中對照物的活性為1。如圖1所示，實驗的結果是IL-8啟動子和IL-12啟動子的激活圖案非常類似。其中在寡聚-4CpGODN內的核苷酸序列中的第三個CpG基序被改性的突變體(寡聚-4-3和寡聚-4-4)，和其中在上述CpG基序的5’-端處存在的堿基被改性的突變體(寡聚-4-8、寡聚-4-9和寡聚-4-10)顯示出高的活性。更特別地，與寡聚-4CpGODN相比，寡聚-4-4、寡聚-4-8和寡聚-4-9ODNs顯示出較高的活性。在這些當中，寡聚-4-8ODN顯示出最高的活性。另外，寡聚-4-3和寡聚-4-10ODNs顯示出相對高的活性，但與寡聚-4CpGODN相比，它們提供較低的活性。另一方面，其中第二個CpG基序序列被改性的突變體(寡聚-4-1和寡聚-4-2)和其中在第二個CpG基序的3’-端處存在的二核苷酸序列被改性的突變體(寡聚-4-5、寡聚-4-6和寡聚-4-7)顯示出顯著降低的IL-8啟動子活性。此外，其中除了第二個CpG基序和在其3’端處的二核苷酸以及第三CpG基序以外的幾乎所有堿基被改性的突變體(寡聚-4-11)顯示出高的活性。上述結果表明，在寡聚-4CpGODN的核苷酸序列內，第二個CpG基序和在第二個CpG基序的3’-端處存在的兩個堿基與激活IL-8啟動子和IL-12啟動子密切相關。使用上表1中所述的CpGODNs取代突變體的母體的寡聚-4CpGODN，和對該核苷酸序列進行最大程度改性的寡聚-4-11CpGODN進行下述試驗。<實施例2>骨架改性的寡聚-4CpGODN對免疫應答的影響<2-1>激活IL-8啟動子的分析用上述實施例1-2的部分b)中所述構建的IL-8啟動子-Luc啟動子報道載體，和pRL-null質粒(Promega)一起共轉染Raw264.7細胞。分別用O-型(磷酸二酯骨架)和S-型(硫代磷酸酯骨架)寡聚-4CpGODN(0或10μg/ml)處理轉染細胞，然后培養(yǎng)8小時。另外，O-型1826ODN(SEQIDNO.18)和O-型2006ODN(SEQIDNO.19)用作對照物CpGODNs，以便將其活性與本發(fā)明的寡聚-4CpGODN的活性進行比較。此外，作為非-CpGODN，使用S-型2041ODN(SEQIDNO.20)。接下來，以與實施例<1-2>中所述相同的方式測定IL-8啟動子的活性。如圖2所示，實驗結果是，，IL-8啟動子的激活圖案根據(jù)CpGODN中核苷酸的序列而不同。本發(fā)明的寡聚-4CpGODN顯示出最高的活性，與其骨架結構無關(O-型以及S-型)。<2-2>產生細胞因子的比較分析從人的外周血液中收集白細胞，并以1.0×106個細胞/孔的濃度施加到每一孔內。接下來。用O-型或S-型寡聚-4CpGODN(0或10μg/ml)處理每一孔，接著培養(yǎng)24小時。作為對照物，使用與上述的實施例<2-1>中所述相同的對照物。在完成培養(yǎng)之后，分離細胞培養(yǎng)液。然后，為了測定在細胞培養(yǎng)液內的細胞因子水平，分別使用可商購的人IL-12p40試劑(R&D系統(tǒng)，Minneapolis，USA)和人IFN-γQuantikineM試劑(R&D系統(tǒng)，Minneapolis，USA)，進行夾心ELISA分析。用碳酸鹽緩沖液(SIGMA，C-3041)稀釋每一細胞因子(IL-12p40和IFN-γ)的抗體，并將所得稀釋液涂布到96孔板(NUNC.442404)的表面上。以3％BSA(SIGMA，A-2154)阻斷該表面。將細胞培養(yǎng)液稀釋至足夠的比例并施加到每一孔上，接著培養(yǎng)2小時。向其中添加生物素?；渭壙贵w并使之在37℃下反應1小時。然后，向其中添加SaV-HRP(Pharmingen，13047E)，并使之繼續(xù)反應30分鐘，然后洗滌該反應混合物以供顯色。計算在490nm處的吸收度。細胞因子水平以兩次實驗測量的平均值表示。如圖3所示，分析的結果是，本發(fā)明的寡聚-4CpGODN與其骨架結構無關，將白細胞內的IL-12p40的產生增加到最高的水平。另外，O-型寡聚-4CpGODN將IFN-γ的產生增加到最高的水平。此外，與其它對照的ODNs相比，S-型寡聚-4CpGODN將白細胞內的IFN-γ的產生增加到較高的水平。<2-3>O-型寡聚-4CpGODN對與炎癥有關的細胞因子的表達的影響用O-型寡聚-4CpGODN(10μl/ml)處理Raw264.7細胞系0.5、1、2、3、8和12小時。為了對照，在相同的濃度下，用O-型1826和2006ODNs處理細胞。通過使用MicroRNA分離試劑盒(Stratagene，LaJolla，CA)，從細胞中提取全部RNA。使用50UStrataScript逆轉錄酶和寡聚(dT)引物(Stratagene，LaJolla，CA)，由全部RNA(5μg)合成cDNA。然后，使用由全部RNA擴增的cDNA作為模板和下表2中所述的對每一細胞因子(TNF-γ，MIP-2，IL-1，IL-5，IL-10，GM-CSF和IL-12)特異的引物，進行PCR。在表2中，“F”代表正向引物和“R”代表反向引物。擴增與炎癥有關的細胞因子的引物序列PCR擴增重復30次，其中一次PCR循環(huán)由在94℃下DNA變性30秒，在57℃下引物退火40秒，和在72℃下DNA延伸1分鐘組成。作為內部對照物，還檢測了GAPDH的表達。如圖4所示，實驗的結果是，用本發(fā)明的O-型寡聚-4CpGODN的處理誘導TNF-γ、MIP-2、IL-1和IL-12的表達。特別地，作為在Th1/Th2免疫應答平衡中誘導Th1免疫應答的典型細胞因子的IL-12僅僅被本發(fā)明的寡聚-4CpGODN誘導。這表明本發(fā)明的CpGODN可誘導Th1免疫應答。從上述結果可看出，與常規(guī)的CpGODNs相反，本發(fā)明的CpGODN顯示出高的免疫活性，而與其骨架結構無關。<實施例3>體外分析與特應性皮炎有關的免疫應答<3-1>樹突狀細胞的激活分析檢測本發(fā)明的CpGODN，確定它是否激活從特應性皮炎的模型動物中分離的樹突狀細胞。a)分離樹突狀細胞和CpGODN處理從作為特應性皮炎模型動物的NC/Nga小鼠(SLC，Hamatsu，日本)的股骨區(qū)域的骨髓中分離原代細胞。向該分離的原代細胞中添加RBC裂解緩沖液(150mMNH4Cl、10mM碳酸鉀、0.1mMEDTApH7.4)，并使反應混合物在室溫下反應5分鐘。接下來，通過離心收集細胞，并用無血清的RPMI介質洗滌3次。用臺盼藍染色細胞，并采用血細胞計數(shù)器計算細胞數(shù)量。將細胞以2×106個細胞/孔的濃度施加到6孔板(Nunc)上。為了將骨髓中的原代細胞分化成樹突狀細胞，將IL-4和GM-CSF(生物源)以10ng/ml的濃度加入其中的含有10％FBS的RPMI介質添加到每一孔內(Ghosh，M.，JImmunol.1705625-5629，2003)。在培養(yǎng)箱內，在37℃和5％CO2下培養(yǎng)細胞。培養(yǎng)細胞6天，同時每隔一天更換介質。然后，用可變濃度(4μg/ml)的本發(fā)明的O-型CpGODN處理細胞。作為CpGODN，使用對寡聚-4CpGODN的核苷酸序列中進行最高程度改性的O-型寡聚-4CpGODN(SEQIDNO.2)和O-型寡聚-4-11ODN(SEQIDNO.8)。陰性對照物沒有進行任何處理。陽性對照物用LPS(100ng/ml)處理。b)FACS分析從細胞培養(yǎng)液中收集用CpGODNs(O-型骨架)或用上述a)部分的LPS處理的樹突狀細胞，然后洗滌。接下來，將樹突狀細胞的表面分子第II組MHC、CD80和CD86的每一抗體(Pharmingen)加入到細胞懸浮液中，并使反應混合物在4℃下反應30分鐘。通過離心除去上清液，并用PBS洗滌余留的細胞1次。此外，向其中添加第II組MHC、CD80和CD86的次級抗體，即抗倉鼠IgG2(CD80的次級抗體，BDpharmingen；和抗大鼠IgG2a(CD86和第II組MHC的次級抗體，BDpharmingen)，并使所得混合物在4℃下反應30分鐘。通過離心獲得細胞，然后洗滌。然后，通過PI染色方法染色細胞，并通過FACS分析，檢測表面分子的活化程度。如圖5所示，該分析的結果是，以與用LPS處理的組相同的方式，在用O-型CpGODNs(寡聚-4和寡聚-4-11)處理的組中激活樹突狀細胞的所有表面分子。此外，可看出，本發(fā)明的CpGODNs可以以依賴于濃度的方式激活樹突狀細胞的表面分子(參見圖6)。根據(jù)上述結果可看出，本發(fā)明的CpGODN誘導可激活體內免疫的樹突狀細胞。<3-2>分析樹突狀細胞內細胞因子的表達進行RT-PCR，以便檢測用本發(fā)明的O-型CpGODN處理的樹突狀細胞內的IL-12的表達。首先，在不同時間處(0、0.05、1、2、4和8小時)用O-型寡聚-4CpGODN處理在上述實施例<3-1>中從特應性皮炎的模型動物的NC/Nga小鼠中分離的樹突狀細胞。分別用1826CpGODN和2041非-CpGODN處理對照物。當它被改性成具有S-型骨架時，可知1826CpGODN誘導I1-12的表達到高的水平(Lee，KW.etal.，Mol.Immunol.41955-964，2004)。接下來，通過TRIzol(Invitrogen)從樹突狀細胞中分離全部RNA。用M-MLV逆轉錄酶(Invitrogen)處理全部RNA(5μg)，并使之在37℃下反應1小時。在70℃下滅活反應混合物5分鐘以制備cDNA。通過使用cDNA作為模板和對IL-12特異的一組引物(SEQIDNOs.33和34)，進行PCR。重復PCR的擴增25次，其中一次PCR循環(huán)由在95℃下DNA變性30秒，在57℃下引物退火40秒，和在72℃下DNA延伸1分鐘組成。在PCR反應完成之后，在1％瓊脂凝膠上測定擴增的PCR產品。該實驗的結果是，如圖7所示，僅僅通過本發(fā)明的O-型CpGODN可誘導IL-12表達。與此同時，與已知可以誘導IL-12的表達到高的程度的S-型1826CpGODN相反，(Lee，KW.etal.，Mol.Immunol.41955-964，2004)，O-型1826CpGODN不可能誘導IL-12的表達。<3-3>分析免疫細胞增殖的誘導a)誘導T淋巴細胞增殖進行下述實驗，檢測本發(fā)明的CpGODN是否誘導T淋巴細胞增殖。從作為特應性皮炎模型動物的NC/Nga小鼠(SLC，Hamatsu，日本)的股骨區(qū)域的骨髓中分離樹突狀細胞，并培養(yǎng)6天。接下來，用O-型寡聚-4和聚-4-11CpGODNS以16μg/ml的濃度處理樹突狀細胞48小時。沒有用CpGODN處理對照物。在48小時之后，以20格雷(Gray)的劑量的γ-射線輻照樹突狀細胞，并在圓底96孔板內以1.0×104個細胞/孔的濃度給細胞鋪板。接下來，以0∶1或1∶10的比例，向在板的每一孔內鋪板的樹突狀細胞中添加作為應答子的T淋巴細胞(從NC/Nga小鼠的脾臟中分離的)使其到達1.0×105個細胞/孔的濃度，接著在培養(yǎng)箱(37℃，5％CO2)內培養(yǎng)96小時。然后，將[3H]胸苷(1μCi；Amersham，USA)加入到每一孔中，然后使之反應16小時。使用細胞收集器，將每一孔中的細胞收集在濾紙上，接著在室溫下干燥。接下來，使用液體閃爍計數(shù)器(Amersham，USA)以2ml/小瓶的用量施加到小瓶內，并將上面的濾紙引入到小瓶內，以便在其內溶解。通過使用β-計數(shù)器，測量cpm(計數(shù)器/分鐘)值。通過重復測量3次，獲得每一數(shù)值。如圖8所示，該實驗的結果是，本發(fā)明的O-型CpGODN誘導樹突狀細胞的T淋巴細胞增殖。這表明當CpGODNs(寡聚-4和寡聚-4-11)被施用到患有特應性皮炎的患者上時，它們可通過T淋巴細胞的增殖來提高免疫。b)誘導外周血液單核細胞(PBMCs)的增殖據(jù)報道，在從患有特應性皮炎的患者中收集的外周血液內，AMLR(自身混合淋巴細胞反應)減少(LeungDYM.，J.Clin.，Invest.，721482-1486，1983)。因此，發(fā)明人檢測本發(fā)明的CpGODN是否誘導從患有特應性皮炎的患者中分離的PBMCs的增殖。通過使用Histopaque-1077(Sigma，Poole，UK)，從患有特應性皮炎的患者血液中分離PBMCs。將所分離的PMBCs以3×105個細胞/孔的濃度加入到96孔圓底板中。將本發(fā)明的O-型CpGODNs(寡聚-4和寡聚-4-11)分別加入到每一孔中，并使之在培養(yǎng)箱(37℃，5％CO2)內反應72小時。然后，將[3H]胸苷(1μCi；Amersham，USA)加入到每一孔中，然后使所得混合物反應16小時。使用細胞收獲器，將每一孔中細胞收集到濾紙上，接著在室溫下干燥。接下來，將含水閃爍計數(shù)器(Amersham，USA)以2ml/小瓶的用量施加到小瓶內，并將上面的濾紙引入到小瓶內，以便在其內溶解。通過使用β-計數(shù)器，測量cpm(計數(shù)器/分鐘)值。如圖9所示，該實驗的結果是，本發(fā)明的CpGODNs顯著地增加了PBMCs的增殖。<實施例4>分析本發(fā)明的CpGODN的皮膚滲透<4-1>制備含有本發(fā)明的CpGODN的藥膏按照本領域技術人員公知的常規(guī)方式，用FITC(異硫氰酸熒光素)標記本發(fā)明的O-型寡聚-4CpGODN。接下來，將10mg用FITC標記的O-型寡聚-4CpGODN與5g凡士林(Sam-APharmaceuticalInd.Co.，Ltd.，Korea)混合，制備藥膏。<4-2>分析皮膚滲透將特應性皮炎的動物模型，即NC/Nga小鼠(SLC，Hamatsu，日本)的背部毛剪去。接下來，將按上述實施例<4-1>中所述制備的含0.5mgCpG-ODN的藥膏施加在背上。然后，在施加藥膏之后的第1天和第5天，從小鼠上取下表面積為1.5×1.5cm2的背部皮膚，并用液氮冷凍。接下來，將冷凍的產品包埋在Tissue-TekOCT化合物(SakuraFinetekUSA，INC.)內，并通過使用切片機將其切割成5μm的厚度。在熒光顯微鏡下觀察組織切片。如圖10A所示，觀察的結果是，本發(fā)明的O-型CpGODN滲透到小鼠皮膚內，且甚至從施用點開始起一直到5天之后，仍保留在其內。另外，在施加之后24小時，CpGODN滲透到淋巴結內(參見圖10B)。<實施例5>測定治療特應性皮炎效果的體內分析<5-1>施用含本發(fā)明的CpGODN藥膏將6只NC/Nga小鼠分成兩組CpGODN-治療組和未治療組。在治療組的小鼠中，向小鼠背部的特應性皮炎損傷處施加按以上實施例<4-1>中所述制備的含O-型寡聚-4CpGODN的藥膏(0.2mgCpG-ODN/只小鼠)。在未治療組的小鼠中，在相同條件下，施加不含本發(fā)明的CpGODN的凡士林。<5-2>損傷處的觀察在施加含CpGODN的藥膏之后的第5天和第7天，用肉眼觀察特應性皮炎損傷。觀察的結果是，如圖11A所示，與未治療組的小鼠相比，用本發(fā)明的O-型CpGODN治療的小鼠在其背部顯示出特應性皮炎損傷的消失。另外，取下背部皮膚，并通過使用H&E染色方法染色，以檢測治療特應性皮炎的效果。檢測的結果是，如圖11B所示，用本發(fā)明的O-型CpGODN治療的小鼠的損傷在皮膚角化過度癥和棘皮癥中，以及淋巴細胞在真皮內的浸潤顯示出顯著下降(放大X200)。因此，可看出，通過使用本發(fā)明的CpGODN，可有效地治療特應性皮炎。<5-3>組織化學分析a)細胞因子表達的分析在施加含本發(fā)明O-型CpGODN的藥膏之后的第5天時，取下表面積為1.5×1.5cm2的小鼠皮膚。接下來，在4％福爾馬林溶液中固定皮膚至少1天。用石蠟處理被固定的皮膚組織，并切割成5μm的厚度。在除去石蠟之后，根據(jù)LSAB+試劑盒(DAKO，Denmark)提供的手冊，采用該皮膚樣品，進行下述實驗。用3％H2O2處理樣品10分鐘。接下來，向其中添加用含有0.1％BSA的TBS(Tris-緩沖的鹽水，pH7.4)稀釋的10％正常山羊血清，以在室溫下阻斷樣品1小時。在用PBS(pH7.4)洗滌之后，用初級抗體，即山羊的抗-小鼠IL-10、山羊的抗-小鼠IL-4(SantaCruz，USA)和大鼠的抗-小鼠IFN-γ(Pierce，USA)處理樣品，并使之在4℃下反應至少12小時。然后，向其中添加生物素標記的次級抗體，并使之在室溫下反應30分鐘。接下來，向其中添加過氧化酶標記的抗生蛋白鏈菌素，并使之在室溫下反應約30分鐘。在用DAB底物色原體系(DAKO，Denmark)進行染色之后，采用顯微鏡觀察樣品(放大X200)。根據(jù)這一觀察，如圖12所示，在用本發(fā)明的O-型CpGODN治療5天之后，小鼠的表皮顯示出IL-4和IL-10的表達下降。相反，IFN-γ的表達增加。這表明本發(fā)明的O-型CpGODN可降低由Th2表現(xiàn)型T淋巴細胞介導的細胞因子IL-4和IL-10的產生，其中Th2表現(xiàn)型T淋巴細胞在特應性皮炎中特別地的高。另一方面，本發(fā)明的CpGODN增加了由Th1表現(xiàn)型T淋巴細胞介導的細胞因子IFN-γ的產生。通過這樣，本發(fā)明的CpGODN可改進特應性皮炎的狀況并治療特應性皮炎。b)組織內的CD4+和CD8+淋巴細胞染色在施加含本發(fā)明O-型CpGODN的藥膏之后的第5天時，取下表面積為1.5×1.5cm2的小鼠皮膚。用液氮冷凍皮膚組織。接下來，將冷凍的組織包埋在Tissue-TekOCT化合物(SakuraSakuraFinetekUSA，INC.)內，并通過使用切片機將其切割成5μm的厚度。使該組織在4℃下，與初級抗體，即老鼠的抗-小鼠CD4mAb(BDphamingen，USA)或者老鼠的抗-CD8mAb(serotec，UK)反應12小時。然后向其中添加生物素標記的次級抗體，并使之在室溫下反應30分鐘。接下來，向其中添加過氧化酶標記的抗生蛋白鏈菌素，并使反應混合物在室溫下反應約30分鐘。在用DAB底物色原體系(DAKO，Denmark)進行染色之后，在顯微鏡下觀察樣品(放大X200)。如圖13所示，觀察的結果是，用本發(fā)明的O-型CpGODN治療的小鼠皮膚顯示出CD4+和CD8+淋巴細胞的細胞數(shù)量的下降。在特應性皮炎損傷中，CD4+和CD8+淋巴細胞數(shù)量的下降是治療上有利的現(xiàn)象(ChristianV.，etal.JClinInvest1041907-1105，1999)。<5-4>分析在血清中的IgE水平在用醚麻醉每一組內的小鼠之后，從小鼠的腔靜脈中收集血液，并引入到肝素化的(heparinized)管中。接下來，在1000g下離心10分鐘，獲得血漿，并在-20℃下儲存血漿直到使用。使用小鼠IgEBDOptEIA試劑盒(BDphamingen，USA)，測量總的IgE水平。根據(jù)由BDOptEIA試劑盒提供的制造商的方案，進行測量。首先，將100μlIgE捕捉抗體(捕捉Ab)加入到96孔板的每一孔內，并使之在4℃下反應至少12小時。除去存在于每一孔內的溶液，并用洗滌緩沖液(具有0.05％Tween-20的PBS)洗滌孔3次。然后，將200μl阻斷緩沖液(具有10％FBS的PBS)加入到每一孔中，并使之在室溫下反應1小時。除去阻斷緩沖液，接著用上述洗滌緩沖液洗滌孔3次。將從每一小鼠中獲得的血漿樣品以100μl的用量加入到每一孔中，然后使之在室溫下反應2小時。接下來，除去存在于每一孔內的溶液，并用上述洗滌緩沖液洗滌孔5次。，然后，將100μl與親和素-辣根過氧化物酶(親和素-HRP)共軛的生物素化小鼠IgE抗體(BDPharmingen，USA)加入到每一孔中，并使之在室溫下反應1小時。在完成反應之后，洗滌孔7次。然后，將100μlTMB底物溶液(BDpharmingen，USA)加入到每一孔中，并使之在室溫下避光反應30分鐘。接下來，將50μl1M磷酸(BDpharmingen，USA)作為終止溶液加入到每一孔中。通過使用ELISA讀數(shù)器，在30分鐘的終止反應內，測量在每一孔內的溶液在450nm處的吸收度。如圖14所示，測量的結果是，用含本發(fā)明O-型CpGODN的藥膏處理的小鼠顯示出血清IgE水平的顯著下降。根據(jù)上述結果可看出，本發(fā)明的O-型CpGODN降低由Th2-淋巴細胞介導的細胞因子的表達，同時它增加了由Th1-淋巴細胞介導的細胞因子的表達。因此，本發(fā)明的CpGODN降低了血清IgE水平，結果對于治療特應性皮炎來說，它是高度有效的。<實施例6>CpG-ODN對小鼠紫外輻射誘導的延遲-型超敏反應的的免疫抑制的恢復影響將8周齡的雌性Balb/c小鼠(體重約20g，韓國SLC，KR)分成下述5組，其中每一組包括5只小鼠。(1)陰性對照物；既沒有紫外輻照，也沒有敏化處理(2)陽性對照沒有使用紫外輻照，但敏化處理(3)紫外處理組用紫外線輻照小鼠，然后在紫外輻照3天之后敏化(4)寡聚-4處理組在紫外輻照24小時之后，將本發(fā)明的O-型寡聚-4通過腹膜內路線注入到小鼠體內，然后在紫外輻照3天之后敏化小鼠。(5)寡聚-11處理組在紫外輻照24小時之后，將本發(fā)明的O-型寡聚-11通過腹膜內路線注入到小鼠體內，然后在紫外輻照3天之后敏化小鼠。將小鼠的背部刮凈，進行紫外輻照，以及在其腹部誘導敏化。圖15中示出了實驗的步驟。將在每一組內的小鼠放入配有UVB燈的UV盒(4FSX24T12/UVB-HO，UBL，USA)內，并在0.6mW/cm2劑量下，用紫外線輻照28分鐘。輻照到小鼠上的UVB射線總的能量為10KJ/m2。通過這樣，由紫外輻照誘導延遲類型的超敏反應的免疫抑制。然后，在紫外輻照24小時之后，將以1mg/ml的濃度溶解在PBS中的本發(fā)明的CpGODNs，在20μg的劑量下，腹膜內注入到小鼠中。向對照物中注入相同量的PBS溶液。在注射2天之后，將100μl3％的TNCB溶液(三硝基氯苯；TokyoKaseiCo.，Tokyo，日本)施加到每一雌性脫毛的Balb/c小鼠腹部上，以便誘導敏化。在敏化5天之后，測量每一小鼠的耳朵厚度。進一步施加1％TNCB的溶液到每一小鼠的兩只耳朵上，以便誘導耳朵再次腫脹。在24小時之后，使用干分尺(Mitutyo，Tokyo，日本)測量小鼠耳朵的浮腫。如圖16所示，測量的結果是，在小鼠上，在脫毛小鼠的腹部上施加100μl3％的TNCB誘導接觸性超敏反應(陽性對照18.5±3.73×10-2mm)。在用紫外線輻照的小鼠中，小鼠耳朵的浮腫程度下降(8.3±1.66×10-2mm)。與此同時，本發(fā)明的CpGODN的腹膜內注射導致因紫外線抑制的接觸性超敏反應顯著恢復。這表明本發(fā)明的CpGODN可恢復因紫外線抑制的免疫應答。<實施例7>本發(fā)明的CpGODN對誘導TNP-特異的抗原T細胞的增殖反應的影響，其中所述的TNP-特異的抗原T細胞是從經紫外輻照使接觸性超敏反應受到抑制的小鼠脾臟中分離出來的將8周齡的雌性Balb/c小鼠(體重約20g)分成5組(陰性對照、陽性對照、UV處理組、寡聚-4處理組和寡聚-11處理組)，其中每一組包括5只小鼠。按與實施例6中所述相同的方式進行UV輻照、用本發(fā)明的CpGODN處理和敏化。為了誘導抗原特異的應答，使從其中既沒有UV輻照，也沒有敏化處理的陰性對照的小鼠中分離的脾臟細胞與10mMTNBSO3三硝基氯苯磺酸；TokyoKaseiCo.，Tokyo，日本)結合。結合的細胞用作刺激(stimulator)細胞。與此同時，從陽性對照、UV處理組、UV輻照/寡聚-4處理組和UV輻照/寡聚-11處理組中的小鼠中分離的脾臟細胞用作應答細胞。將應答細胞以1×105個細胞/孔的濃度接種到圓底96孔板的每一孔內。然后將刺激細胞加入到每一孔內，接著培養(yǎng)5天。刺激細胞和應答細胞以1∶1的比例混合。然后，在細胞收獲之前的18小時，將0.5μCi的[3H]胸苷加入到每一孔中，并使之反應18小時。通過使用細胞收獲器收集細胞，并收集在濾紙上，接著在室溫下干燥。接下來，將液體閃爍計數(shù)器(AmershamBiosciences，USA)以2ml的用量添加到小瓶內，以便濾紙在其內溶解。然后，通過使用β-閃爍計數(shù)器(AmershamBiosciences，USA)測量cpm(計數(shù)器/分鐘)值，以便檢測從小鼠脾臟中分離的免疫細胞(T細胞)的增殖程度。如圖17所示，檢測的結果是，通過用本發(fā)明的CpGODN治療，從小鼠體內分離出來的T細胞內TNP(三硝基苯基)特異的抗原T細胞的增殖應答顯著增加，其中所述的小鼠經紫外輻照對特異抗原(TNCB)的接觸性超敏反應受到抑制。這表明在接觸皮炎模型中通過紫外線引起的免疫抑制效果可通過本發(fā)明的CpGODN顯著恢復。<應用1>由病毒引起的皮膚病免疫力低的人或者患有慢性疾病的患者常常出現(xiàn)病毒性皮膚病。在這些人或患者中，1型T細胞免疫應答下降，而2型T細胞免疫應答增加(HenggeU.R.，etal.，BrJDermatol.，14915-19，2003；KatakuraT.，etal.，ClinicalImmunol，105363-370，2002)。這種病毒疾病包括尖銳濕疣、瘊/濕疣，皰疹病毒感染或類似疾病，且可通過直接注射IL-12或者通過增加IL-12水平的治療方式來有效地進行治療(AranyI.，etal.，AntiviralRes.，4355-63，1999；Matsuo，R.，etal.，59623-630，1996；andKatakura，T.，etal.，Clin.Immunol.105363-370，2002)。因此，具有增加IL-12水平效果的本發(fā)明的CpGODN對于治療病毒性皮膚病是非常有效的。<應用2>皮膚癌免疫力低或者免疫抑制的人常常出現(xiàn)皮膚癌。據(jù)報道，在這些人中，特別是，參與細胞介導的免疫疾病中的Th1免疫應答下降，而Th2免疫應答增加(RookAH.，etal.，AnnNYAcadSci.，795310-318，1996)。已知IL-12可作為對感染和癌癥引起免疫應答的細胞因子，因此可治療它們(？)。通過體內產生IFN-γ來提供這種效果(TrinchieriG.，etal.，AnnuRevImmunol，13251-276，1995)。此外，據(jù)報道，IL-12可用于治療皮膚癌和CpG-ODN對于治療惡性黑素瘤是有效的(GollobJA.，etal.，JClinOncology.，212564-2573，2003；KreplerC.，etal.，JinvestDermatol.，122387-391，2004)。因此，具有增加IL-12水平的效果的本發(fā)明的CpGODN對于治療皮膚癌是非常有效的。<應用3>特應性皮炎和過敏性皮膚病盡管迄今為止特應性皮炎病因學沒有得到確定，但認為產生包括IL-4和IL-5在內的Th2細胞因子的過敏原-特異的T細胞可引起特應性皮炎。此外，可證明這種細胞能浸潤到患有特應性皮炎的患者的損傷處(NeumannC.，etal.，JMolMed.，74401-406，1996)。另外，據(jù)報道，當用LPS(脂多糖)刺激患有特應性皮炎的患者的單核細胞或者由該單核細胞得到的樹突狀細胞時，與正常人相比，IL-12p40的產生顯著下降(AibaS.，etal.，ExpDermatol.，1286-95，2003)。此外，據(jù)報道，由嬰兒臍帶的臍血中產生IL-12的單核細胞數(shù)量的下降與IgE的產生有關，且常常在相同的狀態(tài)下出現(xiàn)特應性皮炎(NilssonC.，etal.，ClinExpAllergy.，34373-380，2004)。因此，尤其在考慮到決定Th1/Th2免疫應答的重要因素之一是IL-12的情況下，預期基于可增加樹突狀細胞中IL-12產生的本發(fā)明的CpG-ODN對于治療特應性皮炎和IgE-增加的過敏性皮膚病是有效的。工業(yè)實用性根據(jù)前述內容可看出，本發(fā)明的CpGODNs可誘導治療或預防皮膚病的有效免疫應答，而與其骨架結構無關。因此，本發(fā)明的CpGODNs，尤其O-型CpGODNs可用作治療獲預防皮膚病的治療劑。盡管結合目前認為最實際和優(yōu)選的實施例描述了本發(fā)明，但要理解本發(fā)明并不限于所披露的實施例和附圖。相反，本發(fā)明覆蓋了所附權利要求的精神與范圍內的各種改性和變化。序列表<110>KIM，Doo-SikKWON，Hyung-JooKIM，Tae-Yoon<120>TherapeuticuseofCpGoligodeoxynucleotideforskindisease<130>OP05-1057<150>KR10-2004-0090000<151>2004-11-05<160>34<170>Kopatentln1.71<210>1<211>20<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>CpGODN<400>1syyssacgttsnyrawmytc20<210>2<211>20<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>oligo-4CpGODN<400>2ctcgcacgttgccgaacttc20<210>3<211>20<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>oligo-4-3CpGODN<400>3ctcgcacgttgctgaacttc20<210>4<211>20<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>oligo-4-4CpGODN<400>4ctcgcacgttgccaaacttc20<210>5<211>20<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>oligo-4-8CpGODN<400>5ctcgcacgttgacgaacttc20<210>6<211>20<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>oligo-4-9CpGODN<400>6ctcgcacgttgtcgaacttc20<210>7<211>20<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>oligo-4-10CpGODN<400>7ctcgcacgttcgcgaacttc20<210>8<211>20<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>oligo-4-11CpGODN<400>8gctcgacgttggcgatactc20<210>9<211>20<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>oligo-4-1CpGODN<400>9ctcgcacattgccgaacttc20<210>10<211>20<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>oligo-4-2CpGODN<400>10ctcgcactttgccgaacttc20<210>11<211>20<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>oligo-4-5CpGODN<400>11ctcgcacgaagccgaacttc20<210>12<211>20<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>oligo-4-6CpGODN<400>12ctcgcacgccgccgaacttc20<210>13<211>20<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>oligo-4-7CpGODN<400>13ctcgcacggggccgaacttc20<210>14<211>27<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>forwardprimerforIL-8promoter<400>14gtgagatctgaagtgtgatgactcagg27<210>15<211>27<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>reverseprimerforIL-8promoter<400>15gtgaagcttgaagcttgtgtgctctgc27<210>16<211>25<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>forwardprimerforIL-12promoter<400>16oatgagctcagcctcccgtctgacc25<210>17<211>25<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>reverseprimerforIL-12promoter<400>17ctgggctcgagggagagtccaatgg25<210>18<211>20<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>1826CpGODN<400>18tccatgacgttcctgacgtt20<210>19<211>24<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>2006CpGODN<400>19tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt24<210>20<211>24<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>2041ODN(non-CpGODN)<400>20ctggtctttctggtttttttctgg24<210>21<211>20<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>forwardprimerforTNF-alpha<400>21tctcatcagttctatggccc20<210>22<211>20<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>reverseprimerforTNF-alpha<400>22gggagtagacaaggtacaac20<210>23<211>22<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>forwardprimerforMIP-2<400>23tgggtgggatgtagctagttcc22<210>24<211>22<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>reverseprimerforMIP-2<400>24agtttgccttgaccctgaagcc22<210>25<211>20<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>forwardprimerforIL-1<400>25ttgacggaccccaaaagatg20<210>26<211>20<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>reverseprimerforIL-1<400>26agaaggtgctcatgtcctca20<210>27<211>20<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>forwardprimerforIL-6<400>27gttctctgggaaatcgtgga20<210>28<211>20<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>reverseprimerforIL-6<400>28tgtactccaggtagctatgg20<210>29<211>20<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>forwardprimerforIL-10<400>29atgcaggactttaagggtta20<210>30<211>28<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>reverseprimerforIL-10<400>30atttcggagagaggtagaaacgaccttt28<210>31<211>26<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>forwardprimerforGM-CSF<400>31atgtggctgcagaatttacttttcct26<210>32<211>25<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>reverseprimerforGM-CSF<400>32tgggcttcctcatttttggcctggt25<210>33<211>19<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>forwardprimerforIL-12<400>33ctggtgcaaagaaacatgg19<210>34<211>20<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>reverseprimerforIL-12<400>34tggtttgatgatgtccctga20權利要求1.一種抑制Th2細胞因子和/或誘導Th1細胞因子的方法，該方法包括給對其有需要的病體施用有效量的用下式表示的CpG寡聚脫氧核苷酸[通式]SYYSSACGTTSNYRAWMYTC(SEQIDNO.1)其中，S是G或C；Y是C或T；N是選自包括A、G、T和C的組中的任何一種；R是G或A；W是A或T；以及M是A或C，和其中所述的CpG寡聚脫氧核苷酸包括至少兩個未甲基化的CpG基序。2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述的Th2細胞因子是IL-4或IL-10。3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述的Th1細胞因子是IL-12或IFN-γ。4.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中在所述的通式中的YS或YR二核苷酸是CG。5.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述的CpG寡聚脫氧核苷酸具有選自包括SEQIDNOs.2-8組中的任何一個核苷酸序列。6.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述的CpG寡聚脫氧核苷酸具有磷酸二酯或硫代磷酸酯骨架。7.一種刺激免疫應答所述的方法，該方法包括給對其有需要的病體施用有效量的用下式表示的CpG寡聚脫氧核苷酸[通式]SYYSSACGTTSNYRAWMYTC(SEQIDNO.1)其中，S是G或C；Y是C或T；N是選自包括A、G、T和C的組中的任何一種；R是G或A；W是A或T；以及M是A或C，和其中CpG寡聚脫氧核苷酸包括至少兩個未甲基化的CpG基序。8.根據(jù)權利要求7所述的方法，其中所述通式中的YS或YR二核苷酸是CG。9.根據(jù)權利要求7所述的方法，其中所述的CpG寡聚脫氧核苷酸具有選自包括SEQIDNOs.2-8的組中的任何一個核苷酸序列。10.根據(jù)權利要求7所述的方法，其中所述的CpG寡聚脫氧核苷酸具有磷酸二酯或硫代磷酸酯骨架.11.一種治療或預防皮膚病所述的方法，該方法包括給對其有需要的病體施用有效量的用下式表示的CpG寡聚脫氧核苷酸[通式]SYYSSACGTTSNYRAWMYTC(SEQIDNO.1)其中，S是G或C；Y是C或T；N是選自包括A、G、T和C的組中的任何一種；R是G或A；W是A或T；以及M是A或C，和其中所述CpG寡聚脫氧核苷酸包括至少兩個未甲基化的CpG基序。12.根據(jù)權利要求11所述的方法，其中所述通式中的YS或YR二核苷酸是CG。13.根據(jù)權利要求11所述的方法，其中所述的CpG寡聚脫氧核苷酸具有選自包括SEQIDNOs.2-8的組中的任何一個核苷酸序列。14.根據(jù)權利要求11所述的方法，其中所述的CpG寡聚脫氧核苷酸具有磷酸二酯或硫代磷酸酯骨架。15.根據(jù)權利要求11所述的方法，其中所述的皮膚病選自包括下面的組特應性皮炎、過敏性皮膚病、病毒性皮膚病和皮膚癌。16.一種治療或預防皮肽病的組合物，該組合物包括用下式表示的CpG寡聚脫氧核苷酸作為活性成分[通式]SYYSSACGTTSNYRAWMYTC(SEQIDNO.1)其中，S是G或C；Y是C或T；N是選自包括A、G、T和C的組中的任何一種；R是G或A；W是A或T；以及M是A或C，和其中所述的CpG寡聚脫氧核苷酸包括至少兩個未甲基化的CpG基序。17.一種刺激免疫應答的組合物，該組合物包括用下式表示的CpG寡聚脫氧核苷酸作為活性成分[通式]SYYSSACGTTSNYRAWMYTC(SEQIDNO.1)其中，S是G或C；Y是C或T；N是選自包括A、G、T和C的組中的任何一種；R是G或A；W是A或T；以及M是A或C，和其中所述的CpG寡聚脫氧核苷酸包括至少兩個未甲基化的CpG基序。18.用下式表示的CpG寡聚脫氧核苷酸在制備治療或預防皮膚病的試劑中的用途[通式]SYYSSACGTTSNYRAWMYTC(SEQIDNO.1)其中，S是G或C；Y是C或T；N是選自包括A、G、T和C的組中的任何一種；R是G或A；W是A或T；以及M是A或C，和其中所述的CpG寡聚脫氧核苷酸包括至少兩個未甲基化的CpG基序。19.用下式表示的CpG寡聚脫氧核苷酸在制備刺激免疫應答的試劑中的用途[通式]SYYSSACGTTSNYRAWMYTC(SEQIDNO.1)其中，S是G或C；Y是C或T；N是選自A、G、T和C組成的組中的任何一種；R是G或A；W是A或T；以及M是A或C，和其中CpG寡聚脫氧核苷酸包括至少兩個未甲基化的CpG基序。全文摘要本發(fā)明公開了CpG寡聚脫氧核苷酸治療皮膚病的用途。在具有硫代磷酸酯骨架的CpGODNs以及具有磷酸二酯骨架的CpGODNs這兩種情況下，本發(fā)明的CpG寡聚脫氧核苷酸(CpGODNs)對皮膚病顯示出優(yōu)良的免疫活性。文檔編號A61K31/7125GK1938035SQ200580007831公開日2007年3月28日申請日期2005年11月4日優(yōu)先權日2004年11月5日發(fā)明者金斗植,權瀅周,金良順,金泰潤申請人:金泰潤,申東憲,生物線索和解決方法有限公司