一種布舍瑞林的固液合成方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種布舍瑞林的固液合成方法，包括以下步驟：1)用固相合成方法合成五肽片段H-Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-OH，2)用固相合成方法合成三肽片段H-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(HCl)-OH，然后液相合成方法連接特殊氨基酸Pro-NHEt·HCl合成4肽片段H-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(HCl)-Pro-NHEt；3)五肽片段與四肽片段液相縮合，經(jīng)過沉淀、純化、脫鹽、轉(zhuǎn)鹽，得布舍瑞林。本發(fā)明工藝步驟簡單，反應(yīng)條件溫和，易于控制，對人體和環(huán)境危害小，產(chǎn)率高，適合大規(guī)模生產(chǎn)。
【專利說明】一種布舍瑞林的固液合成方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種布舍瑞林的固液合成方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 布舍瑞林（Buserelin)，商品名為CinnaFact，CinnaGen公司生產(chǎn)的醋酸 Buserelin水針劑已投入市場。適應(yīng)癥：用于治療子宮內(nèi)膜異位、中樞性早熟、乳腺癌 和前列腺癌。布舍瑞林是促性腺素釋放激素類（LH-RH)藥物，LH-RH是由下丘腦分泌 的激素，能促進(jìn)垂體合成并釋放黃體生成素、卵細(xì)胞雌激素。該類激素的同系物包括 戈舍瑞林（Goserelin)、亮丙瑞林（Leuprorelin)、曲普瑞林（Triptorelin)、戈那瑞林 (Gonadoerlin)〇
[0003] 布舍瑞林為線性九肽，分子量為1239. 42, CAS登記號為57982-77-1，分子式為： C60H86N16O13，其氨基酸序列為 H-Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser (tBu) -Leu-Arg-Pro-NHEt。結(jié) 構(gòu)式如下：

【權(quán)利要求】
1. 一種布舍瑞林的固液合成方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟： (1) 采用Fmoc固相合成策略，利用偶聯(lián)劑依次將Fmoc-Tyr(tBu)-〇H、 Fmoc_Ser(tBu)-〇H、Fmoc_Trp(Boc)-〇H、Fmoc_His(Trt)-〇H、H-Pyr-OH 按照布舍瑞林前 5 個(gè)氨基酸的序列連接至樹脂上，得到全保護(hù)的五肽樹脂，即Pyr-His (Trt) -Trp (Boc) -Ser ( tBu)-Tyr (tBu)-樹脂；切割樹脂，同時(shí)脫除側(cè)鏈保護(hù)基，經(jīng)乙醚沉淀，得到線性五肽片段，即 H-Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-〇H ； (2) 采用Fmoc固相合成策略，利用偶聯(lián)劑依次將Fmoc-Arg(HCl)-〇H、Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-D-Ser (tBu)-OH按照布舍瑞林第6至第8個(gè)氨基酸的序列連接至樹脂上，得到全保護(hù) 的三肽樹脂，即Fmoc-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(HCl)-樹脂；切割樹脂，乙醚沉淀，得到全保護(hù) 的三膚片段，即 Fmoc-D-Ser (tBu)-Leu-Arg (HC1)-0H ; (3) 將步驟（2)得到的三肽片段與特殊氨基酸Pro-NHEt ? HC1液相中偶聯(lián)，脫除Fmoc 基團(tuán)，得到四肽片段，即：H-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(HCl)-Pr〇-NHEt ; (4) 將步驟⑴得到的五肽片段與步驟（3)得到的四肽片段液相中在偶聯(lián)劑的作用下 進(jìn)行縮合，乙醚沉淀，得到布舍瑞林粗肽，再經(jīng)脫鹽，轉(zhuǎn)鹽，得到布舍瑞林純肽。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的布舍瑞林的固液合成方法，其特征在于，步驟（1)和（2)中， 所用的樹脂為二氯三苯甲基氯樹脂。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的布舍瑞林的固液合成方法，其特征在于，步驟（1)和（2)中， 所使用的偶聯(lián)劑為以下三種混合物中的任選一種：HBTU、Y試劑和DIEA的混合物；HATU、Y 試劑和DIEA的混合物；DIC與Y試劑的混合物；其中，所述的Y試劑為HoBt或HoAt。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的布舍瑞林的固液合成方法，其特征在于，步驟⑴和⑵中， 按1: (1?6) : (2?12)的摩爾比分別稱取溶脹后的二氯三苯甲基氯樹脂、Fmoc保護(hù)氨基 酸和DIEA，將Fmoc保護(hù)氨基酸、DIEA溶于DMF，預(yù)活化，然后再加入到溶脹后的二氯三苯甲 基氯樹脂中，室溫震蕩反應(yīng)〇. 5?3小時(shí)連接第一個(gè)Fmoc保護(hù)氨基酸，連接下一個(gè)氨基酸 之前用哌啶的DMF溶液脫Fmoc保護(hù)基2次，時(shí)間分別為3?5分鐘和15?25分鐘，每次 連接上一個(gè)氨基酸之后和脫除Fmoc保護(hù)基之后都需要用DMF、DCM洗滌3?10次； 自連接第二個(gè)氨基酸起，按1: (1?6) : (1?6) : (1?6) : (2?12)的摩爾比分別計(jì)算 樹脂、Fmoc保護(hù)氨基酸、HoBt、HBTU和DIEA的量，將Fmoc保護(hù)氨基酸、HoBt溶于二甲基甲 酰胺，冰上預(yù)活化，加入HBTU和DIEA，然后再加入到樹脂中，室溫震蕩反應(yīng)0. 5?3小時(shí)連 接Fmoc保護(hù)氨基酸，重復(fù)上述過程，直至連接完畢。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的布舍瑞林的固液合成方法，其特征在于，步驟（1)、（2)和（3) 中，脫除Fmoc保護(hù)基的方法是用體積百分含量25%的哌啶的DMF溶液。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的布舍瑞林的固液合成方法，其特征在于，步驟（1)中，切割肽 樹脂的方法是將三氟乙酸、三異丙基硅烷、水按體積比95:2. 5:2. 5混合，加入全保護(hù)的五 肽樹脂中，室溫震蕩反應(yīng)〇. 5?4小時(shí)后，將反應(yīng)液過濾逐滴滴入冷乙醚中，沉淀，離心，洗 滌，干燥，得到布舍瑞林五肽片段；步驟（2)中，切割肽樹脂的方法是將三氟乙酸與二氯甲 烷按體積比1:99混合，加入全保護(hù)的三肽樹脂中，室溫震蕩反應(yīng)0. 5?4小時(shí)后，將反應(yīng)液 過濾逐滴滴入冷乙醚中，沉淀，離心，洗滌，干燥，得到布舍瑞林三肽片段。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的布舍瑞林的固液合成方法，其特征在于，步驟（3)中，按 1: (1?6) : (1?6) : (1?6) : (2?12)的摩爾比分別取羧基端三肽片段組分、特殊氨基酸 Pro-NHEt ? HC1、縮合劑X、試劑Y和DIEA，其中所述的縮合劑X為HATU、HBTU、PyBop、DCC、 DIC、EDC ? HC1其中一種或多種組合，試劑Y為HoBt或HoAt ;將羧基端三肽片段組分、試劑 Y溶于DMF，冰浴預(yù)活化，加入縮合劑X和DIEA，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)0. 5?4小時(shí)，水沉淀，離心， 洗滌，得到Fmoc保護(hù)的布舍瑞林四肽；將Fmoc保護(hù)的布舍瑞林四肽片段溶解于預(yù)先冰浴的 25% v/v的哌啶的DMF溶液，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)0. 5?2小時(shí)，乙醚沉淀，離心，洗漆，得到布舍 瑞林四肽片段。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的布舍瑞林的固液合成方法，其特征在于，步驟（4)中，按 1: (1?6) : (1?6) : (1?6) : (2?12)的摩爾比分別取氨基端四肽片段組分、羧基端五肽 片段組分、縮合劑X、試劑Y和DIEA，其中，所述的縮合劑X為HATU、HBTU、PyBop、DCC、DIC、 EDC ? HC1其中一種或多種組合，試劑Y為HoBt或HoAt ;將兩種片段組分、試劑Y溶于DMF， 冰浴預(yù)活化，加入縮合劑X和DIEA，室溫震蕩反應(yīng)0. 5?4小時(shí)，乙醚沉淀，離心，洗滌，得到 布舍瑞林粗肽。
【文檔編號】C07K1/04GK104402977SQ201410741975
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年12月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月8日
【發(fā)明者】董守良, 玄其存, 曹碩, 常民 申請人:泰州施美康多肽藥物技術(shù)有限公司