專利名稱：一種曲普瑞林及其固相合成制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及曲普瑞林原料藥的生產(chǎn)工藝，尤其是固相合成工藝以及純化方法。本發(fā)明還涉及一種曲普瑞林。
背景技術(shù)：
曲普瑞林，已以其醋酸鹽或者巴莫酸鹽的形式應(yīng)用于臨床，臨床適應(yīng)癥包括前列腺癌、性早熟、輔助生殖技術(shù)(ART)例如體外受精術(shù)(IVF)、子宮內(nèi)膜異位癥和子宮肌瘤等，已上市產(chǎn)品例如有達(dá)菲林 。曲普瑞林英文名為=Triptorelin,別名有垂普托雷林、色氨瑞林、Decapeptyl 等，其 CAS 登記號為 57773-63-4，分子式，C64H82N18013，分子量 1311. 45。曲普瑞林的妝序?yàn)镻yr_Hi S-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH20 曲普瑞林系合成的促性腺激素釋放激素(GnRH)的類似物。其結(jié)構(gòu)的改良是將天然分子結(jié)構(gòu)中的第六個(gè)左旋氨基酸(甘氨酸)，以右旋色氨酸取代以使其促效作用更為顯著。曲普瑞林作用與GnRH相同，但其血漿半衰期延長且對GnRH受體的親和力更強(qiáng)，因此曲普瑞林成為GnRH受體的強(qiáng)力激動劑。曲普瑞林注射后,最初會刺激垂體分泌促性腺激素(Gn)，即黃體生成素(LH)和卵泡刺激素(FSH)。當(dāng)垂體經(jīng)過長期的刺激后會進(jìn)入不應(yīng)期，促性腺激素的釋放會減少，因而使性類固醇(睪丸酮或雌激素)降低至去勢水平。上述作用是可逆轉(zhuǎn)的。1974年日本武天化工的Fujino Masahiko等人首先發(fā)明促黃體急速釋放激素的十肽酰胺類似物的合成工藝。并在日本，德國，美國等國家申請專利，專利號分別為JP19740027442、DE2446005、US4008209 (液相法)。此后，美國US4010125公開了曲普瑞林及其中間體以及它們的制備方法。該文獻(xiàn)所記載的方法包括使用Boc-保護(hù)氨基酸為原料,使用二苯甲基胺(Benzhydrylamine)樹脂進(jìn)行固相合成。在每一輪脫帽須用三氟醋酸，并且在最終將十肽從樹脂上切除時(shí)使用氫氟酸和苯甲醚。以Fmoc-保護(hù)氨基酸為原料制備曲普瑞林亦有相關(guān)報(bào)道。例如孫永強(qiáng)等(孫永強(qiáng)、錢明霞、嚴(yán)益民、馮曉暉、蔣偉，曲普瑞林的液相合成，中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2012，43 (7):532)公開了使用Fmoc-保護(hù)氨基酸為原料通過液相合成法來制備曲普瑞林，在該方法中使用HBTU為偶聯(lián)劑，據(jù)報(bào)道該工藝中每一次肽鏈延長步驟的收率僅在77°/Γ86%之間，純化收率為74%，總收率僅為12. 4%。因此提高產(chǎn)品收率以及獲得具有良好品質(zhì)的產(chǎn)品，仍然是本領(lǐng)域技術(shù)人員極其期待的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種制備曲普瑞林的方法，期待該方法可以得到高收率的曲普瑞林，并且期待所得曲普瑞林具有良好的品質(zhì)。本發(fā)明人令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，使用特定的工藝條件制備曲普瑞林，不但產(chǎn)率高，而且產(chǎn)品品質(zhì)優(yōu)良。本發(fā)明因此而得以完成。
為此，根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了一種固相合成曲普瑞林的方法，其包括以下步驟(I)向經(jīng)浸泡處理的固相合成用樹脂中加入溶解于溶劑中的Fmoc-Gly-OH、肽偶聯(lián)劑、酰胺鍵形成促進(jìn)劑和有機(jī)堿，使物料進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，以形成Fmoc-Gly-樹脂；(2)向上一步驟所得的肽偶合樹脂(即步驟(I)所得Fmoc-Gly-樹脂)中加入脫帽試劑，使物料進(jìn)行反應(yīng)以脫帽(即脫除Fmoc-保護(hù)基)；接著加入溶解于溶劑中的保護(hù)氨基酸F moc-Pro-OH、肽偶聯(lián)劑、酰胺鍵形成促進(jìn)劑和有機(jī)堿，使物料進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，以形成Fmoc-Pro-Gly-樹脂；(3)循環(huán)重復(fù)步驟(2)，并在每一循環(huán)操作的偶聯(lián)反應(yīng)中依次使用下列氨基酸以替換保護(hù)氨基酸Fmoc-Pro-OH Fmoc-L-Arg (pbf) -0H、Fmoc-L-Leu_0H、Fmoc-D-trp (bo c) _0H、Fmoc-L-Tyr(tBu)-0H>Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L_trp(boc)-0H>Fmoc-L-His(trt)-OH和 H-Pyr-OH,以最終形成十妝樹脂H-Pyr-His (Trt) -Trp (Boc) -Ser (tBu) -Tyr (tBu) -D-Trp (Boc) -Leu-Arg (Pbf) -Pro-Gly-樹脂；(4)向步驟(3)所得十肽樹脂中加入切割液進(jìn)行切肽反應(yīng)，以使十肽從樹脂上切割下來，得到曲普瑞林。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法,其中步驟(I)中，所述樹脂選自rink amide MBHA樹脂、rink amide am樹脂、knorr樹脂、或其組合。這類樹脂是可以從商業(yè)途徑獲得的,例如可以從阿拉丁試劑公司(http://www.aladdin_reagent.com)商業(yè)公司購得。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(I)中，所述樹脂浸泡處理是照如下方式進(jìn)行的取樹脂置于反應(yīng)器中，加入溶劑(例如二氯甲烷、甲醇、乙醇、氯仿、三氟乙酸、DMF、或其組合)振蕩并充分浸泡(例如浸泡l(T200min)，抽除溶劑(必要時(shí)，可再用上述溶劑重復(fù)清洗，并除去溶劑)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述樹脂浸泡處理是照如下方式進(jìn)行的稱取一定量樹脂于反應(yīng)器中，然后加入二氯甲烷，振蕩并浸泡60分鐘，用二氯甲烷、甲醇、二甲基甲酰胺分別交替清洗兩次，抽濾以除去溶劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述樹脂浸泡處理是照CN101357936A說明書第8頁第2_3行所述方式進(jìn)行的。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述樹脂浸泡處理是照US4010125說明書第10欄第35-43行所述方式進(jìn)行的。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(I)中，所述樹脂在經(jīng)浸泡處理后、進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)之前，還包括對該樹脂進(jìn)行脫帽處理的步驟。增加該脫帽處理步驟，使樹脂得以進(jìn)一步地活化，有助于增加Fmoc-Gly-樹脂的收率。該脫帽處理的步驟可以參照步驟(2)中的方式進(jìn)行。此外，在該脫帽處理期間或者脫帽處理后，可以使用茚三酮檢測法檢測脫帽完全程度，如果脫帽不完全，可重得進(jìn)行脫帽處理。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(I)中，所述肽偶聯(lián)劑例如但不限于DCC(N, N' - 二環(huán)己基碳二亞胺，N, N' -Dicyclohexylcarbodiimide)、DIC(N, N’- 二異丙基碳二亞胺，N, N，-Diisopropylcarbodiimide)、HATU (英文全稱 2- (ΙΗ-7-Azabenzotriazol-l-yl)-l, I, 3, 3-tetramethyl uronium hexafluorophosphate Methanaminium)、HBTU (英文全稱 O-Be nzotriazole-N, N, N’ , N’ -tetramethyl-uronium-hexafluoro-phosphate)、HCTU (英文全稱 IH-Benzotriazoliuml-[bis (dimethylamino)methylene] -5chloro-, hexaf luorophosphate (1-), 3-oxide)、TATU (英文全稱 0_ (7-Azabenzotriazole-l-yl) _N, N, N，,N’-tetramethyluroniu m tetrafluoroborate) > TBTU (英文全稱 0-(Benzotriazol-l-yl)-N, N, N’, N’ -tetramethylur onium tetraf luoroborate)、或其組合。妝偶聯(lián)劑可以容易地從商業(yè)途徑獲得的，例如可以從吉爾生化公司、阿拉丁試劑公司、上海庭園生化科技有限公司等商業(yè)途徑購得。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(I)中，所述酰胺鍵形成促進(jìn)劑例如但不限于HOAT、HOBT、6-C1 -HOBt、或其組合。這些試劑可以容易地從商業(yè)途徑獲得的，例如可以從吉爾生化公司、阿拉丁試劑公司、上海庭園生化科技有限公司等商業(yè)途徑購得。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(I)中，所述有機(jī)堿例如但不限于NMM、DIEA、三甲基吡啶、或其組合。這些試劑可以容易地從一般的商業(yè)途徑獲得特別是一般的化學(xué)試劑公司購得，例如可以從北京化學(xué)試劑公司購得。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(I)中，用于進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)的所述溶劑例如但不限于二氯甲烷、二甲基甲酰胺等。溶劑的用量以根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)公開的方法或者經(jīng)驗(yàn)容易地確定，例如用足以溶解各種物料的盡量少的溶劑；或者，例如在步驟(I)中進(jìn)行偶聯(lián) 反應(yīng)時(shí),通常可以是每摩爾樹脂使用5-25L溶劑，例如可以是每摩爾樹脂使用10-20L溶劑。在其它偶聯(lián)反應(yīng)步驟中亦可使用此比率范圍。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(I)中，所述樹脂與所述Fmoc-Gly-OH的投料比為1:2.5 5(摩爾比)，優(yōu)選1:3 5。進(jìn)一步地，在后續(xù)的各個(gè)肽偶聯(lián)反應(yīng)中，添加的該步驟的氨基酸(Fmoc保護(hù)的或未保護(hù)的)的量為步驟(I)中樹脂量的2 7倍(摩爾倍)，優(yōu)選:Γ6倍。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(I)中，所述Fmoc-Gly-OH、肽偶聯(lián)劑、酰胺鍵形成促進(jìn)劑和有機(jī)堿四者的投料比為1:1_3 1-3 :2-6(摩爾比)，例如四者的投料比為1:1-2:1-2:2-4。需要說明的是，當(dāng)某類物料(例如酰胺鍵形成促進(jìn)劑)以兩種或兩種以上組合使用時(shí)，其在上述投料比中的用量是以投入的全部該類物料計(jì)的，例如使用兩種酰胺鍵形成促進(jìn)劑時(shí)，它們的總摩爾數(shù)是Fmoc-Gly-OH摩爾數(shù)的1_3倍，優(yōu)選1_2倍；其它物料種表示它們的量時(shí)，亦有同樣含義，除非另有說明。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(I)中，還包括在偶聯(lián)反應(yīng)期間或者反應(yīng)后采用茚三酮檢測法檢測偶聯(lián)反應(yīng)進(jìn)行程度。如果發(fā)現(xiàn)偶聯(lián)反應(yīng)不夠完全，可以重復(fù)進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(I)中，還包括在完成偶聯(lián)反應(yīng)后對獲得的F moc-Gly-樹脂進(jìn)行清洗的操作，所述清洗是使用選自下列的溶劑清洗處理f 3次、甲醇、乙醇、氯仿、三氟乙酸、DMF、或其組合，特別是使用DMF、甲醇、二氯甲烷，三者交替清洗2次。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(2)中，所述脫帽試劑選自哌啶(亦稱為六氫吡唳，PIP)、二乙胺、三乙胺、三氟乙酸。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(2)中，所述脫帽反應(yīng)是在選自下列的溶劑中進(jìn)行的二氯甲烷、二甲基甲酰胺等，優(yōu)選二甲基甲酰胺。溶劑的用量以根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)公開的方法或者經(jīng)驗(yàn)容易地確定，例如用足以溶解各種物料的盡量少的溶劑。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(2)中，所述脫帽反應(yīng)是在15 25%的哌啶/二甲基甲酰胺溶液中進(jìn)行的，優(yōu)選是在20%的哌啶/ 二甲基甲酰胺溶液中進(jìn)行的。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(2)中，所述脫帽反應(yīng)是在1(T30° C溫度下進(jìn)行的，反應(yīng)時(shí)間為l(T200min，例如3(T90min，例如約60min。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述脫帽反應(yīng)是在室溫下進(jìn)行的。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述脫帽反應(yīng)是在室溫下進(jìn)行的反應(yīng)時(shí)間為l(T200min，例如30 90min,例如約60min。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(2)中，還包括在完成脫帽反應(yīng)后對獲得的Gly-樹脂進(jìn)行清洗的操作，所述清洗是使用選自下列的溶劑清洗處理f 3次、甲醇、乙醇、氯仿、三氟乙酸、DMF、或其組合，特別是使用DMF、甲醇、二氯甲烷，三者交替清洗2次。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(2)中，還包括在脫帽反應(yīng)期間或者脫帽反應(yīng)后采用茚三酮檢測法檢測脫帽反應(yīng)進(jìn)行程度。如果發(fā)現(xiàn)脫帽反應(yīng)不夠完全，可以重復(fù)進(jìn)行脫帽反應(yīng)。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(2)中，所述偶聯(lián)反應(yīng)是參照步驟(I)中的偶聯(lián)反應(yīng)進(jìn)行的。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟⑶中，第一循環(huán)操作使用 Fmoc-L-Arg (pbf) -OH 作為保護(hù)氨基酸,得到 H-Arg (Pbf) -Pro-Gly-樹脂。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(3)中，第二循環(huán)操作使用Fmoc-L-Leu-OH作為保護(hù)氨基酸，得到H-Leu-Arg (Pbf) -Pro-Gly-樹脂。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟⑶中，第三循環(huán)操作使用Fmoc-D-trp (boc) -OH 作為保護(hù)氨基酸，得到 H-D-Trp (Boc) -Leu-Arg (Pbf) -Pro-Gly-樹脂。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟⑶中，第四循環(huán)操作使用Fmoc-L-Tyr (tBu) -OH 作為保護(hù)氨基酸，得到 H-Tyr (tBu) -D-Trp (Boc) -Leu-Arg (Pbf) -Pro-Gly-樹脂。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟⑶中，第五循環(huán)操作使用Fmoc-L-Ser (tBu) -OH 作為保護(hù)氨基酸，得到 H-Ser (tBu) -Tyr (tBu) -D-Trp (Boc) -Leu-Arg (Pbf) -Pro-Gly-樹脂。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟⑶中，第六循環(huán)操作使用Fmoc-L-trp (boc) -OH 作為保護(hù)氨基酸，得到 H-Trp (Boc) -Ser (tBu) -Tyr (tBu) -D-Trp (Boc)-Leu-Arg (Pbf) -Pro-Gly-樹脂。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟⑶中，第七循環(huán)操作使用Fmoc-L-His (trt) -OH 作為保護(hù)氨基酸，得到 H-His (Trt) -Trp (Boc) -Ser (tBu) -Tyr (tBu) -D-Trp (Boc) -Leu-Arg (Pbf) -Pro-Gly-樹脂。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(3)中，第八循環(huán)操作使用H-Pyr-OH作為保護(hù)氨基酸，得到 H-Pyr-His (Trt) -Trp (Boc) -Ser (tBu) -Tyr (tBu) -D-Trp (Boc) -Leu-Arg (Pb f) -Pro-Gly-樹脂。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(I)中進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)時(shí)，酰胺鍵形成促進(jìn)劑是HOAT和HOBT兩者組合使用。在一個(gè)實(shí)施方案中，HOAT和HOBT 二者的用量比為1:1-4 (摩爾比)，優(yōu)選1:2-3(摩爾比)。發(fā)明人已經(jīng)出人意料地發(fā)現(xiàn)，組合使用酰胺鍵形成促進(jìn)劑對于提高第一步驟偶聯(lián)率進(jìn)而提高產(chǎn)品品質(zhì)是非常有益的。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(2)和步驟(3)中進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)時(shí)，使用的酰胺鍵形成促進(jìn)劑是HOAT。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟⑶中，在第一循環(huán)操作使用Fmoc-L-Arg (p bf) -OH作為保護(hù)氨基酸進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)的過程中，與Fmoc-L-Arg (pbf)-OH —起加入適量乳酸進(jìn)行反應(yīng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述Fmoc-L-Arg (pbf) -OH與乳酸的摩爾比為I 0. 1-0. 5，優(yōu)選I 0. 2-0. 3。所述的乳酸例如是符合2010年版二部480頁收載的“乳酸”的標(biāo)準(zhǔn)的產(chǎn)品。發(fā)明人已經(jīng)出人意料地發(fā)現(xiàn)，在該步驟中加入適量乳酸時(shí)，所得曲普瑞林氨基酸光學(xué)純檢測時(shí)D-Arg的含量低于約O. 10%，這對于提高產(chǎn)品品質(zhì)是非常有益的。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(I)、步驟(2)、和步驟(3)中的所述偶聯(lián)反應(yīng)是在10 30° C溫度下進(jìn)行的，反應(yīng)時(shí)間為l(T200min，例如3(T90min，例如約60min。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述偶聯(lián)反應(yīng)是在室溫下進(jìn)行的。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述偶聯(lián)反應(yīng)是在室溫下進(jìn)行的反應(yīng)時(shí)間為l(T200min，例如3(T90min，例如約60min。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中在各步驟中進(jìn)行脫帽反應(yīng)和/或偶聯(lián)反應(yīng)時(shí)，是在室溫進(jìn)行的，優(yōu)選是在20±5° C下進(jìn)行的，雖然本發(fā)明描述了一些優(yōu)選的反應(yīng)時(shí)間， 然而反應(yīng)時(shí)間可根據(jù)茚三酮檢測結(jié)果而隨時(shí)作適當(dāng)調(diào)整，例如如果經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)反應(yīng)尚不完全的情況下可適當(dāng)延長反應(yīng)，這些操作是本領(lǐng)域技術(shù)人員容易控制的。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟⑷所述切割液中包含TFA、TIS、EDT、H 20。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述切割液中四種組分的體積比為TFA:TIS:EDT:H20=50-98:1-10:1-10:0. 1-5。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述切割液中四種組分的體積比為TFA:TIS:EDT: H20=90-98:1-5:1-5:0. 5-2。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述切割液中四種組分的體積比為TFA:TIS:EDT:H20=95:2:2:1。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述切割液是預(yù)先冷卻到_20 ° C至10° C，優(yōu)選預(yù)先冷卻至0° C至10° C，優(yōu)選預(yù)先冷卻至約5° C。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(4)中，所述切肽反應(yīng)是在室溫進(jìn)行的，優(yōu)選是在20±5° C下進(jìn)行的。反應(yīng)時(shí)間為1-10小時(shí)，優(yōu)選1-5小時(shí)，優(yōu)選2-3小時(shí)。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(4)中，所述切肽反應(yīng)是將氨基酸的側(cè)鏈保護(hù)基及十肽從樹脂上同時(shí)切割下來從而獲得十肽曲普瑞林。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(4)中，在完成切肽反應(yīng)后，除去切割液(例如通過減壓的方式)，然后加入乙醚進(jìn)行沉淀，收集沉淀物，用乙醚洗滌數(shù)次，真空干燥，獲得曲普瑞林。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，在經(jīng)步驟(4)切肽反應(yīng)獲得曲普瑞林干燥品后，還進(jìn)一步包括對該曲普瑞林干燥品進(jìn)行純化的步驟。該純化步驟在本發(fā)明中亦可稱為步驟
(5)，純化前的曲普瑞林干燥品可以稱為曲普瑞林粗品。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(5)的純化步驟是照如下方式進(jìn)行的將曲普瑞林粗品用醋酸水溶液溶解，過濾，濾液過離子交換柱并用該醋酸水溶液洗脫，收集流出主峰，然后再經(jīng)過C18柱純化，收集主峰流出液，冷凍干燥，即得曲普瑞林精制品，其可以作為曲普瑞林的原料藥。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(5)中，所述的離子交換柱為陽離子交換柱(例如但不限于Shodex IEC CM-825,Shodex IEC SP-825,Shodex IEC SP_420N、S hodexAsahipak ES-502C7C)或陰離子交換柱(例如國產(chǎn)D201、D231、DK251、731、或290型陰離子交換樹脂，美國Amberlite IRA-900型陰離子交換樹脂，德國Lewatit MP-500型陰離子交換樹脂，日本 Diaion PA308 型陰離子交換樹脂，TOSOH TSK-GEL DEAE-5PW、ChrompackIonoSpher A)或其組合使用；優(yōu)選的離子交換柱為陰離子交換柱。優(yōu)選的離子交換柱是基質(zhì)為聚羥基甲基丙烯酸酯的陽離子交換柱，例如S hodex IEC CM-825,Shodex IEC SP-825、Shodex IEC SP-420N，它們可以容易地從商業(yè)途徑獲得，例如得自北京譜朋科技有限公司。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(5)中，所述的醋酸水溶液濃度為2%-20%(v/v)，例如 5%ο根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(5)中，所說的反向柱純化所用流動相為含有與含有15%-50%乙腈或甲醇的水溶液；在一個(gè)實(shí)施方案中，所說的反向柱純化所用流動相為含20%乙腈的水溶液。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述反向柱是LichiOspher RP-18色譜柱(德國產(chǎn))。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述反向柱純化的流速為10ml/min。在一個(gè)實(shí)施方案中，由于最終純化步驟中使用到乙腈，因此本發(fā)明終產(chǎn)物中可能殘余有微量的乙腈，控制乙腈的量是有必要的，通過減壓干燥或 真空干燥或者冷凍干燥是可以容易地除去乙腈的，或者可以容易地除去乙腈以使乙腈量降低到O. 04%以下(可照氣相色譜法測定)。本發(fā)明后文各實(shí)施例所得精制醋酸曲普瑞林中中，乙腈含量均低于O. 03%。因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種曲普瑞林，其中乙腈含量低于O. 03%。進(jìn)一步地，本發(fā)明第二方面提供了本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)所述方法獲得的曲普瑞林。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明曲普瑞林經(jīng)氨基酸光學(xué)純檢測，除了 Try以外，其它7個(gè)氨基酸的D-型對映體比例相對于其相應(yīng)氨基酸酸而言均小于O. 2%。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明曲普瑞林經(jīng)氨基酸光學(xué)純檢測，除了 Try以外，其它7個(gè)氨基酸的D-型對映體比例相對于其相應(yīng)氨基酸酸而言均小于O. 15%。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明曲普瑞林經(jīng)氨基酸光學(xué)純檢測，其中D-Arg相對于全部精氨酸而言均小于O. 2%，優(yōu)選小于O. 15。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種曲普瑞林，其中乙腈含量低于O. 03%。下面對本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。在本發(fā)明中，使用的氨基酸如未特別標(biāo)示其構(gòu)型時(shí)，均指-L型氨基酸。在本發(fā)明中，使用到如下的一些Fmoc保護(hù)或未保護(hù)的氨基酸作為起始原料Fmo c-L-Gly-OH、Fmoc-L-Pro-OH、Fmoc-L-Arg (pbf) -0H> Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-D-trp (boc)-OH、Fmoc-L-Tyr (tBu) -0H> Fmoc-L-Ser (tBu) -0H> Fmoc-L-trp (boc) -0H> Fmoc-L-His (trt)-0H、H_Pyr-0H。在本發(fā)明中還使用到Rink-amide MBHA樹脂作為載體,其取代量為O. 84mmol/g，在標(biāo)示樹脂投料量時(shí)均有類似含義；如果直接以摩爾量標(biāo)示樹脂投料量，表示所加入的樹脂的取代量，以摩爾(mol)或者毫摩爾(mmol)計(jì)。固相多肽合成中一般需要將α-氨基以及側(cè)鏈活性基團(tuán)保護(hù)起來。目前使用比較多的α-氨基保護(hù)基為叔丁氧羰基(Boc)和9-芴甲氧羰基(Fmoc)兩種。Boc基團(tuán)需要反復(fù)采用50%的三氟乙酸(TFA)來脫除，肽樹脂切割一般采用氫氟酸(HF)，對環(huán)境以及實(shí)驗(yàn)設(shè)備都有較高的要求，而Fmoc基團(tuán)可以使用哌啶輕易地脫除，切割采用TFA，與Bo c法相t匕，具有反應(yīng)條件溫和、合成效率高以及切割條件溫和等優(yōu)點(diǎn)，逐漸取代了 Boc基團(tuán)而成為目前固相多肽合成的首選α-氨基保護(hù)基。在本發(fā)明中使用經(jīng)Fmoc保護(hù)的氨基酸。酰胺鍵形成促進(jìn)劑例如但不限于H0AT (CAS No. 39968-33-7)、HOBT (1-Hydroxybenzotriazole)、6-Cl-H0Bt (6-Chloro-l-Hydroxy-lH-Benzotriazole)、或其組合。有機(jī)堿例如但不限于NMM、DIEA、三甲基吡啶、或其組合。本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是公開一種固相合成曲普瑞林的合成方法以及純化工藝，解決目前現(xiàn)有的技術(shù)存在的上述缺陷。本發(fā)明固相合成曲普瑞林的方法大體上包括如下步驟(I)以rink amide MBHA樹脂、rink amide am樹脂或knorr樹脂(這些樹脂是容易從商業(yè)途徑購得的)為起始原料，用固相合成的方法按照曲普瑞林氨基酸序列依次連接保護(hù)氨基酸，最后得到氨基酸側(cè)鏈被保護(hù)的多肽；(2)用切割液將氨基酸的側(cè)鏈保護(hù)基及多肽從樹脂上同時(shí)切割下來，用乙醚沉淀洗滌后，獲得粗品；(3)將粗品用醋酸水溶液溶解，依次經(jīng)過離子交換柱和C18反相柱，凍干后，得到曲普瑞林(其為符合國家藥典標(biāo)準(zhǔn)的曲普瑞林原料藥產(chǎn)品)。
在本發(fā)明的上下文中，對脫帽反應(yīng)或者肽偶聯(lián)反應(yīng)進(jìn)行反應(yīng)程度檢測時(shí)，如未另外說明，均是采用如下方式的茚三酮檢測法進(jìn)行1、脫帽反應(yīng)程度檢測法每次用小試管取大約O. 5-lmg樹脂，用乙醇洗滌后，往試管中依次加入4滴緩沖液(20mg苯酚溶于50ml乙醇+25ml吡啶)，I滴Vc-乙醇溶液(4X 10_5mOl/L)，2滴茚三酮溶液(500mg茚三酮溶于IOml乙醇，50g/L)，用超聲波進(jìn)行脫氨處理。然后在沸水浴中加熱5min，觀察樹脂及試管中溶液的顏色，進(jìn)而判斷反應(yīng)的進(jìn)行程度；若顯藍(lán)色則反應(yīng)完全，若不顯藍(lán)色則反應(yīng)不完全需重新進(jìn)行此步。2、肽偶聯(lián)反應(yīng)程度檢測試劑(I) Ig茚三酮，溶于10_50ml無水乙醇；(2) 3. 2g苯酚，溶于l-20ml無水乙醇；(3)0. 4ml KCN儲液(O. OlM KCN)，溶于19. 6ml吡啶。3、肽偶聯(lián)反應(yīng)程度檢測方法在待檢測的經(jīng)肽偶聯(lián)反應(yīng)的樹脂中，將上述三種試劑按1:1 1比例依次各滴加2滴，通過顏色觀察來判斷反應(yīng)是否完全，此法靈敏度達(dá)到99%以上。若溶液及樹脂為黃色，則表明樹脂上無殘留一 NH2;若溶液及樹脂為紫色、淡藍(lán)色或藍(lán)色，則表明樹脂上仍有殘留的一 NH2，顏色越深，表明殘留的-NH2越多，肽的耦聯(lián)反應(yīng)越不完全，需延長反應(yīng)時(shí)間。按照本發(fā)明，所說的依次連接具有保護(hù)基團(tuán)的氨基酸，獲得保護(hù)十肽樹脂，其間依次脫去Fmoc保護(hù)基團(tuán)的方法,包括如下步驟Fmoc-Gly-樹脂的制備、Fmoc-Pro-Gly-樹脂的制備、Fmoc-Arg (Pbf) -Pro-Gly-樹脂的制備、Fmoc-Leu-Arg (Pbf) -Pro-Gly-樹脂的制備、Fmoc-D-Trp (Boc) -Leu-Arg (Pbf) -Pro-Gly-樹脂的制備、Fmoc-Tyr (Tbu) -D-Trp (Boc)-Leu-Arg (Pbf) -Pro-Gly-樹脂的制備、Fmoc-Ser (tBu) -Tyr (tBu) -D-Trp (Boc) -Leu-Arg (Pbf)-Pro-Gly-樹脂的制備、Fmoc-Trp (Boc) -Ser (tBu) -Tyr (tBu) -D-Trp (Boc) -Leu-Arg (Pbf)-Pro-Gly-樹脂的制備、Fmoc-His (Trt) -Trp (Boc) -Ser (tBu) -Tyr (tBu) -D-Trp (Boc) -Leu-Arg (Pbf) -Pro-Gly-樹脂的制備、H-Pyr-His (Trt) -Trp (Boc) -Ser (tBu) -Tyr (tBu) -D-Trp (Boc) -Leu-Arg (Pbf) -Pro-Gly-樹脂的制備。在本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)moc-Gly-樹脂的制備包括以下步驟稱取一定量樹脂(O. 3-1. 2mmol/g)于反應(yīng)柱中，然后加入二氯甲烷，振蕩并浸泡20-90分鐘，用二氯甲烷、甲醇、二甲基甲酰胺分別交替清洗兩次，抽濾以除去溶劑。加入脫帽試劑室溫下振蕩反應(yīng)5-50分鐘，去掉氮端Fmoc保護(hù)基。抽濾除去溶劑后，再分別用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗樹脂兩次，并抽濾除去溶劑。取少量樹脂利用茚三酮檢測法進(jìn)行檢測，顯藍(lán)色。若不顯藍(lán)色，則需重新進(jìn)行此步。稱取Fmoc-Gly-OH適量、DCC/DIC/HATU/HCTU/HBTU適量、Η0ΒΤ/Η0ΑΤ適量，加入二甲基甲酰胺待其溶解后再加入適量DIEA/NMM，攪拌混勻后，倒入反應(yīng)器中，一定溫度下振蕩反應(yīng)O. 5-2. 5小時(shí)。抽濾除去反應(yīng)液，再分別用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗樹脂兩次，抽濾除去溶劑。茚三酮檢測法進(jìn)行檢測，顯黃色。若不是黃色，則需延長反應(yīng)時(shí)間。上述DCC/DIC/HATU/HCTU/HBTU表示一種或者多種組合使用作為肽偶聯(lián)劑；HOBT/HOAT表示一種或者兩種作為酰胺鍵形成促進(jìn)劑，即其中“/”如未另外特別說明，表示“和或者或”的關(guān)系。在上述反應(yīng)中，所添加的保護(hù)氨基酸與樹脂的摩爾比為2. 5飛1，優(yōu)選Γ5 :1。上述脫帽試劑可以為哌唳，可以溶于DMF中(濃度1:1_5)或者溶于二氯甲烷(DCM)中(濃度1:1-0. 5);上述反應(yīng)溫度可以為5-70°C;上述肽偶聯(lián)反應(yīng)加入試劑的摩爾數(shù)比例為保護(hù)氨基酸DCC/DIC/HATU/HCTU/HBTU HOBT/HOAT DIE A/NMM=1 1-3 l-3 :2-6。在本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)moc-Pro-Gly-樹脂的制備包括以下步驟向上一肽偶聯(lián)反應(yīng)步驟獲得的Fmoc保護(hù)氨基酸樹脂中加入脫帽試劑，在一定溫度下振蕩反應(yīng)5-50分鐘，去掉氮端Fmoc保護(hù)基。抽濾除去溶劑后，再分別用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗樹脂兩次，并抽濾除去溶劑。取少量樹脂利用茚三酮檢測法進(jìn)行檢測，顯藍(lán) 色。若不顯藍(lán)色，則需重新進(jìn)行此步。稱取Fmoc-Pro-OH適量、DCC/DI C/HATU/HCTU/HBTU適量、Η0ΒΤ/Η0ΑΤ適量，加入二甲基甲酰胺待其溶解后再加入適量DIEA/NMM，攪拌混勻后，倒入反應(yīng)器中，一定溫度下振蕩反應(yīng)O. 5-2. 5小時(shí)。抽濾除去反應(yīng)液，再分別用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗樹脂兩次，抽濾除去溶劑。茚三酮檢測法進(jìn)行檢測，顯黃色。若不是黃色，則需延長反應(yīng)時(shí)間。在上述反應(yīng)中，所添加的保護(hù)氨基酸與樹脂的摩爾比為
2.5 5 :1，優(yōu)選:Γ5 :1。上述脫帽試劑可以為哌唳，可以溶于DMF中(濃度1:1_5)或者溶于二氯甲烷(DCM)中(濃度1:1-0. 5);上述反應(yīng)溫度可以為5-70°C;上述肽偶聯(lián)反應(yīng)加入試劑的摩爾數(shù)比例為保護(hù)氨基酸DCC/DIC/HATU/HCTU/HBTU H0BT/H0AT DIEA/NMM=1 :1_3 1-3 :2-6。在本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案中,Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂的制備包括以下步驟向上一肽偶聯(lián)反應(yīng)步驟獲得的Fmoc保護(hù)氨基酸樹脂中加入脫帽試劑，在一定溫度下振蕩反應(yīng)5-50分鐘，去掉氮端Fmoc保護(hù)基。抽濾除去溶劑后，再分別用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗樹脂兩次，并抽濾除去溶劑。取少量樹脂利用茚三酮檢測法進(jìn)行檢測，顯藍(lán)色。若不顯藍(lán)色，則需重新進(jìn)行此步。稱取Fmoc-Arg (Pbf) -OH適量、DCC/DIC/HATU/HCTU/HBTU適量、Η0ΒΤ/Η0ΑΤ適量，加入二甲基甲酰胺待其溶解后再加入適量DIEA/NMM，攪拌混勻后，倒入反應(yīng)器中，一定溫度下振蕩反應(yīng)O. 5-2. 5小時(shí)。抽濾除去反應(yīng)液，再分別用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗樹脂兩次，抽濾除去溶劑。茚三酮檢測法進(jìn)行檢測，顯黃色。若不是黃色，則需延長反應(yīng)時(shí)間。在上述反應(yīng)中，所添加的保護(hù)氨基酸與樹脂的摩爾比為2. 5 5 :1，優(yōu)選:Γ5 :1。上述脫帽試劑可以為哌啶，可以溶于DMF中(濃度1:1_5)或者溶于二氯甲烷(DCM)中(濃度1:1-0. 5);上述反應(yīng)溫度可以為5-70°C ;上述肽偶聯(lián)反應(yīng)加入試劑的摩爾數(shù)比例為保護(hù)氨基酸DCC/DIC/HATU/HCTU/HBTU H0BT/H0AT DIEA/NMM=I 1-3 1-3 :2-6。在本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案中,Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂的制備包括以下步驟向上一肽偶聯(lián)反應(yīng)步驟獲得的Fmoc保護(hù)氨基酸樹脂中加入脫帽試劑，在一定溫度下振蕩反應(yīng)5-50分鐘，去掉氮端Fmoc保護(hù)基。抽濾除去溶劑后，再分別用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗樹脂兩次，并抽濾除去溶劑。取少量樹脂利用茚三酮檢測法進(jìn)行檢測，顯藍(lán)色。若不顯藍(lán)色，則需重新進(jìn)行此步。稱取Fmoc-Leu-OH適量、DCC/DIC/HATU/HCTU/HBTU適量、Η0ΒΤ/Η0ΑΤ適量，加入二甲基甲酰胺待其溶解后再加入適量DIEA/NMM，攪拌混勻后，倒入反應(yīng)器中，一定溫度下振蕩反應(yīng)O. 5-2. 5小時(shí)。抽濾除去反應(yīng)液，再分別用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗樹脂兩次，抽濾除去溶劑。茚三酮檢測法進(jìn)行檢測，顯黃色。若不是黃色，則需延長反應(yīng)時(shí)間。在上述反應(yīng)中，所添加的保護(hù)氨基酸與樹脂的摩爾比為2. 5 5 :1，優(yōu)選:Γ5 :1。上述脫帽試劑可以為哌啶，可以溶于DMF中(濃度1:1_5)或者溶于二氯甲烷(DCM)中(濃度1:1-0. 5);上述反應(yīng)溫度可以為5-70°C ;上述肽偶聯(lián)反應(yīng)加入試劑的摩爾數(shù)比例為保護(hù)氨基酸DCC/DIC/HATU/HCTU/HBTU H0BT/H0AT DIEA/NMM=I 1-3 1-3 :2-6。在本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)moc-D-Trp(Boc) -Leu-Arg(Pbf) -Pro-Gly-樹脂的制備包括以下步驟向上一肽偶聯(lián)反應(yīng)步驟獲得的Fmoc保護(hù)氨基酸樹脂中加入脫帽試劑，在一定溫度下振蕩反應(yīng)5-50分鐘，去掉氮端Fmoc保護(hù)基。抽濾除去溶劑后，再分別用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗樹脂兩次，并抽濾除去溶劑。取少量樹脂利用茚三 酮檢測法進(jìn)行檢測，顯藍(lán)色。若不顯藍(lán)色，則需重新進(jìn)行此步。稱取Fmoc-D-Trp (Boc)-OH適量、DCC/DI C/HATU/HCTU/HBTU適量、Η0ΒΤ/Η0ΑΤ適量，加入二甲基甲酰胺待其溶解后再加入適量DIEA/NMM，攪拌混勻后，倒入反應(yīng)器中，一定溫度下振蕩反應(yīng)O. 5-2. 5小時(shí)。抽濾除去反應(yīng)液，再分別用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗樹脂兩次，抽濾除去溶劑。茚三酮檢測法進(jìn)行檢測，顯黃色。若不是黃色，則需延長反應(yīng)時(shí)間。在上述反應(yīng)中，所添加的保護(hù)氨基酸與樹脂的摩爾比為2. 5飛1，優(yōu)選3飛1。上述脫帽試劑可以為哌啶，可以溶于DMF中(濃度1:1_5)或者溶于二氯甲烷(DCM)中(濃度1:1-0. 5);上述反應(yīng)溫度可以為5-70°C;上述肽偶聯(lián)反應(yīng)加入試劑的摩爾數(shù)比例為保護(hù)氨基酸DCC/DIC/HATU/HCTU/HBTU =HOBT/HOAT DIEA/NMM=1 :1_3 :1_3 :2_6。在本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)moc-Tyr(Tbu) -D-Trp (Boc) -Leu-Arg(Pbf)-PiO-Gly-樹脂的制備包括以下步驟向上一肽偶聯(lián)反應(yīng)步驟獲得的Fmoc保護(hù)氨基酸樹脂中加入脫帽試劑，在一定溫度下振蕩反應(yīng)5-50分鐘，去掉氮端Fmoc保護(hù)基。抽濾除去溶劑后，再分別用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗樹脂兩次，并抽濾除去溶劑。取少量樹脂利用茚三酮檢測法進(jìn)行檢測，顯藍(lán)色。若不顯藍(lán)色，則需重新進(jìn)行此步。稱取Fmoc-Tyr (Tbu) -OH 適量、DCC/DI C/HATU/HCTU/HBTU 適量、Η0ΒΤ/Η0ΑΤ 適量，加入二甲基甲酰胺待其溶解后再加入適量DIEA/NMM，攪拌混勻后，倒入反應(yīng)器中，一定溫度下振蕩反應(yīng)O. 5-2. 5小時(shí)。抽濾除去反應(yīng)液，再分別用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗樹脂兩次，抽濾除去溶劑。茚三酮檢測法進(jìn)行檢測，顯黃色。若不是黃色，則需延長反應(yīng)時(shí)間。在上述反應(yīng)中，所添加的保護(hù)氨基酸與樹脂的摩爾比為2. 5飛1，優(yōu)選3 5 :1。上述脫帽試劑可以為哌啶，可以溶于DMF中(濃度1:1-5)或者溶于二氯甲烷(DCM)中(濃度1:1-0. 5);上述反應(yīng)溫度可以為5-70°C ;上述肽偶聯(lián)反應(yīng)加入試劑的摩爾數(shù)比例為保護(hù)氨基酸DCC/DI C/HATU/HCTU/HBTU H0BT/H OAT DIEA/NMM=1 :1_3 :1_3 :2_6。在本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)moc-Ser(tBu) -Tyr (tBu) -D-Trp (Boc) -Leu-Arg (Pbf) -Pro-Gly-樹脂的制備包括以下步驟向上一肽偶聯(lián)反應(yīng)步驟獲得的Fmoc保護(hù)氨基酸樹脂中加入脫帽試劑，在一定溫度下振蕩反應(yīng)5-50分鐘，去掉氮端Fmoc保護(hù)基。抽濾除去溶劑后，再分別用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗樹脂兩次，并抽濾除去溶齊 。取少量樹脂利用茚三酮檢測法進(jìn)行檢測，顯藍(lán)色。若不顯藍(lán)色，則需重新進(jìn)行此步。稱取 Fmoc-Ser (Tbu) -OH 適量、DCC/DI C/HATU/HCTU/HBTU 適量、Η0ΒΤ/Η0 AT 適量，加入二甲基甲酰胺待其溶解后再加入適量DIEA/NMM，攪拌混勻后，倒入反應(yīng)器中，一定溫度下振蕩反應(yīng)O. 5-2. 5小時(shí)。抽濾除去反應(yīng)液，再分別用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗樹脂兩次，抽濾除去溶劑。茚三酮檢測法進(jìn)行檢測，顯黃色。若不是黃色，則需延長反應(yīng)時(shí)間。在上述反應(yīng)中，所添加的保護(hù)氨基酸與樹脂的摩爾比為2. 5飛1，優(yōu)選3飛1。上述脫帽試劑可以為哌啶，可以溶于DMF中(濃度1:1-5)或者溶于二氯甲烷(DCM)中(濃度1:1-0. 5);上述反應(yīng)溫度可以為5-70°C ;上述肽偶聯(lián)反應(yīng)加入試劑的摩爾數(shù)比例為保護(hù)氨基酸DCC/DI C/HATU/HCTU/HBTU Η 0ΒΤ/Η0ΑΤ DIEA/NMM=1 :1_3 :1_3 :2_6。在本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)moc-Trp(Boc) -Ser (tBu) -Tyr (tBu) -D-Trp (Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂的制備包括以下步驟向上一肽偶聯(lián)反應(yīng)步驟獲得的Fmoc保護(hù)氨基酸樹脂中加入脫帽試劑，在一定溫度下振蕩反應(yīng)5-50分鐘，去掉氮端Fmoc保護(hù) 基。抽濾除去溶劑后，再分別用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗樹脂兩次，并抽濾除去溶劑。取少量樹脂利用茚三酮檢測法進(jìn)行檢測，顯藍(lán)色。若不顯藍(lán)色，則需重新進(jìn)行此步。稱取 Fmoc-Trp (Boc) -OH 適量、DCC/DIC/HATU/HCTU/HBTU 適量、Η0ΒΤ/Η0ΑΤ 適量，加入二甲基甲酰胺待其溶解后再加入適量DIEA/NMM，攪拌混勻后，倒入反應(yīng)器中，一定溫度下振蕩反應(yīng)O. 5-2. 5小時(shí)。抽濾除去反應(yīng)液，再分別用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗樹脂兩次，抽濾除去溶劑。茚三酮檢測法進(jìn)行檢測，顯黃色。若不是黃色，則需延長反應(yīng)時(shí)間。在上述反應(yīng)中，所添加的保護(hù)氨基酸與樹脂的摩爾比為2. 5飛1，優(yōu)選:Γ5 :1。上述脫帽試劑可以為哌啶，可以溶于DMF中(濃度1:1-5)或者溶于二氯甲烷(DCM)中(濃度1:1-0. 5);上述反應(yīng)溫度可以為5-70°C ;上述肽偶聯(lián)反應(yīng)加入試劑的摩爾數(shù)比例為保護(hù)氨基酸DCC/DIC/HATU/HCTU/HBT U H0BT/H0AT DIEA/NMM=1 :1_3 :1_3 :2_6。在本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)moc-His(Trt) -Trp (Boc) -Ser (tBu) -Tyr (tBu)-D-Tr P (Boc)-Leu-Arg (Pbf)-Pro-Gly-樹脂的制備包括以下步驟向上一肽偶聯(lián)反應(yīng)步驟獲得的Fmoc保護(hù)氨基酸樹脂中加入脫帽試劑，在一定溫度下振蕩反應(yīng)5-50分鐘，去掉氮端F moc保護(hù)基。抽濾除去溶劑后，再分別用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗樹脂兩次，并抽濾除去溶劑。取少量樹脂利用茚三酮檢測法進(jìn)行檢測，顯藍(lán)色。若不顯藍(lán)色，則需重新進(jìn)行此步。稱取 Fmoc-His (Trt) -OH 適量、DCC/DI C/HATU/HCTU/HBTU 適量、Η0ΒΤ/Η0ΑΤ 適量，加入二甲基甲酰胺待其溶解后再加入適量DIEA/NMM，攪拌混勻后，倒入反應(yīng)器中，一定溫度下振蕩反應(yīng)O. 5-2. 5小時(shí)。抽濾除去反應(yīng)液，再分別用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗樹脂兩次，抽濾除去溶劑。茚三酮檢測法進(jìn)行檢測，顯黃色。若不是黃色，則需延長反應(yīng)時(shí)間。在上述反應(yīng)中，所添加的保護(hù)氨基酸與樹脂的摩爾比為2. 5飛1，優(yōu)選:Γ5 :1。上述脫帽試劑可以為哌唳，可以溶于DMF中(濃度1:1_5)或者溶于二氯甲烷(DCM)中(濃度1:1-0. 5);上述反應(yīng)溫度可以為5-70°C ;上述肽偶聯(lián)反應(yīng)加入試劑的摩爾數(shù)比例為保護(hù)氨基酸DCC/DIC/HATU/HC TU/HBTU H0BT/H0AT DIEA/NMM=1 :1_3 :1_3 :2_6。在本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案中，H-Pyr-His(Trt) -Trp (Boc) -Ser (tBu) -Tyr (tBu)-D-T rp (Boc) -Leu-Arg (Pbf) -Pro-Gly-樹脂的制備包括以下步驟向上一肽偶聯(lián)反應(yīng)步驟獲得的Fmoc保護(hù)氨基酸樹脂中加入脫帽試劑，在一定溫度下振蕩反應(yīng)5-50分鐘，去掉氮端Fmoc保護(hù)基。抽濾除去溶劑后，再分別用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗樹脂兩次，并抽濾除去溶劑。取少量樹脂利用茚三酮檢測法進(jìn)行檢測，顯藍(lán)色。若不顯藍(lán)色，則需重新進(jìn)行此步。稱取H-Pyr-OH適量、DCC/DI C/HATU/HCTU/HBTU適量、Η0ΒΤ/Η0ΑΤ適量，加入二甲基甲酰胺待其溶解后再加入適量DIEA/NMM，攪拌混勻后，倒入反應(yīng)器中，一定溫度下振蕩反應(yīng)O. 5-2. 5小時(shí)。抽濾除去反應(yīng)液，再分別用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗樹脂兩次，抽濾除去溶劑。茚三酮檢測法進(jìn)行檢測，顯黃色。若不是黃色，則需延長反應(yīng)時(shí)間。在上述反應(yīng)中，所添加的保護(hù)氨基酸與樹脂的摩爾比為2. 5 5 :1，優(yōu)選:Γ5:1。上述脫帽試劑可以為哌唳，可以溶于DMF中(濃度1:1-5)或者溶于二氯甲烷(DCM)中(濃度1:1-0. 5);上述反應(yīng)溫度可以為5-70°C ;上述肽偶聯(lián)反應(yīng)加入試劑的摩爾數(shù)比例為保護(hù)氨基酸DCC/DIC/HATU/HCTU/HBT U H0BT/H0AT DIEA/NMM=1 :1_3 :1_3 :2_6。在本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案中，用切割液將氨基酸的側(cè)鏈保護(hù)基及十肽從樹脂上同時(shí)切割下來包括如下步驟將上述步驟中獲得的H-Pyr-His (Trt) -Trp (Boc) -Ser (tBu)-Tyr (tBu) -D-Trp (Boc) -Leu-Arg (Pbf) -Pro-Gly-樹脂加入預(yù)冷的切割液(零下 20°C至零上10°C )，在一定溫度下反應(yīng)1-10小時(shí)(例如1-5小時(shí)，例如約3小時(shí))。減壓除去切割液，加入大量乙醚沉淀，收集沉淀物，用乙醚洗滌數(shù)次(例如4-10次)，真空干燥，獲得曲普瑞林粗品。所述切割液中包含TFA、TIS、EDT、H20。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述切割液中四種組 分的體積比為TFA:TIS:EDT:H20=50-98:1-10:1-10:0. 1-5。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述切割液中四種組分的體積比為TFA: TIS:EDT:H20=90-98:1-5:1-5:0. 5-2。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述切割液中四種組分的體積比為TFA: TIS: EDT: H20=95:2:2:1。在本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案中，對獲得的曲普瑞林粗品進(jìn)行純化的過程包括如下步驟將切肽步驟中得到的干燥的曲普瑞林粗品用醋酸水溶液溶解，過濾，濾液經(jīng)過離子交換柱，收集流出主峰,然后再經(jīng)過C18 (例如5 μ m)反相柱純化，收集主峰，合并合格溶液，凍干。獲得曲普瑞林精制品，可作為曲普瑞林的原料藥。純化的工藝細(xì)節(jié)如本發(fā)明上、下文所述。在本發(fā)明中，測定氨基酸與樹脂之間的偶聯(lián)率可以采用重量法和比色法兩種方法測定。特別是，如未另外說明，本發(fā)明上下文中測定氨基酸(特別是第一個(gè)氨基酸甘氨酸)與樹脂之間的偶聯(lián)率采用如下步驟所示比色法進(jìn)行采用比色法的根據(jù)是脫保護(hù)的氨基酸暴露出來的氨基基團(tuán)可以和專門的檢測試劑發(fā)生顏色反應(yīng)，這個(gè)反應(yīng)是定量的，顏色的深淺和氨基基團(tuán)的數(shù)量成正比。顏色的深淺可以用分光光度計(jì)測量，據(jù)此可以計(jì)算出來偶聯(lián)率的數(shù)值。準(zhǔn)確稱取2-4毫克的連接了第一個(gè)氨基酸的樹脂，放入EP管中，加入2-3滴冰乙酸和I毫升甲醇，洗滌后用I毫升甲醇洗滌3次。然后凍干，準(zhǔn)確稱重。加入偶聯(lián)率檢驗(yàn)專用試劑250微升，同時(shí)制空白。沸水浴反應(yīng)5min，其間振蕩2-3次。取出來后立即加入2. 8毫升乙醇至總體積為3毫升。充分搖勻，然后用乙醇掃基線，在570nm處測定樣品和空白的吸光度。按照下列公式計(jì)算(-NH2mmoI/g)=[(樣品-空白)X 體積(ml) XlO6]/ (15000 X 樣品重量)偶聯(lián)率=l-[(-NH2mmol/g)/(1000X理論交換當(dāng)量)]在本發(fā)明中，可以通過測定曲普瑞林的氨基酸光學(xué)純來考察產(chǎn)品的品質(zhì)。曲普瑞林肽鏈中的十個(gè)肽中，有兩個(gè)Trp氨基酸，其中一個(gè)是D-構(gòu)型，而另一個(gè)Trp以及其它8個(gè)氨基酸均為L-型。在本發(fā)明中，如未另外說明，曲普瑞林氨基酸光學(xué)純檢測方法如下對經(jīng)純化的曲普瑞林水解后，經(jīng) CAT GmbH&Co. Chromatographie Und A nalysentechnik KG 光學(xué)純檢測各手性氨基酸的光學(xué)純。測定本發(fā)明實(shí)施例1所得曲普瑞林精制品，結(jié)果顯示除Trp外，其它8個(gè)L-氨基酸光學(xué)純度均大于99. 5%，這8個(gè)氨基酸的D-型對映體的比例均小于O. 2%(D-Pro和D-His在O. 14^0. 18%之間，其它6個(gè)氨基酸的D-型對映體的比例均小于O. 13%)% ;并且對于精氨酸而言，其中D-型對映體的比例小于O. 1%。本發(fā)明設(shè)計(jì)的技術(shù)路線具有以下特點(diǎn)操作簡單 化，適合大規(guī)模生產(chǎn)，原料得到方便，收率高，成本低，生產(chǎn)周期短，質(zhì)量穩(wěn)定，所得樣品符合國家藥典中規(guī)定的曲普瑞林原料藥的各項(xiàng)檢測標(biāo)準(zhǔn)。極具有市場競爭力。在本發(fā)明中，使用到的一些試劑或原材料，它們的名稱、來源等信息列舉如下實(shí)施例與前述過程中所采用的原料列表如下

原料供應(yīng)商純度(5;)
Fmoc-D-trp(boc)-OH百事興科技98%
Fmoc-L-Arg(pbf)-OH吉爾生化98%
F moc-L-trp(boc)-OH吉爾生化98%
Pmoc-L-Gly-OH吉爾生化98%
Fmoc-L-Leu-OH吉爾生化98%
Fmoc-L-Pro-OH吉爾生化98%
Fmoc-L-Ser(tBu)-OH吉爾生化98%
Fmoc-L-Tyr{tBu)-OH吉爾生化98%
Fmoc-L-His(trt)-OH吉爾生化98%
H-Pyr-OH吉爾生化98%
Rink-amidMBHA resin(0.84mmol/g) 吉爾生化未檢測
HBTU(苯并三氮唑四甲基吉爾生化98%
脲六氟嶙酸鹽)
ΗΟΒΤ(1-羥基苯并三唑)吉爾生化98'Λ
DIEA上海達(dá)瑞精細(xì)化學(xué)品有限公司 98%
茚三酮天津市大茂化學(xué)試劑廠分析純
吡啶成都市科龍化工試劑廠分析純
醋酐上海晶純試劑有限公司分析純
DCM無錫化工試劑廠工業(yè)級

權(quán)利要求
1.固相合成曲普瑞林的方法，其包括以下步驟(1)向經(jīng)浸泡處理的固相合成用樹脂中加入溶解于溶劑中的Fmoc-Gly-OH、肽偶聯(lián)劑、 酰胺鍵形成促進(jìn)劑和有機(jī)堿，使物料進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，以形成Fmoc-Gly-樹脂；(2)向上一步驟所得的肽偶合樹脂中加入脫帽試劑，使物料進(jìn)行反應(yīng)以脫帽；接著加入溶解于溶劑中的保護(hù)氨基酸Fmoc-Ρ -ΟΗ、肽偶聯(lián)劑、酰胺鍵形成促進(jìn)劑和有機(jī)堿，使物料進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，以形成Fmoc-Pro-Gly-樹脂；(3)循環(huán)重復(fù)步驟(2)，并在每一循環(huán)操作的偶聯(lián)反應(yīng)中依次使用下列氨基酸以替換保護(hù)氨基酸 Fmoc-Pro-OH Fmoc-L-Arg (pbf) -OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-D-trp (bo c) -OH、 Fmoc-L-Tyr(tBu)-0H>Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L_trp(boc)-0H>Fmoc-L-His(trt)-OH和 H-Pyr-OH,以最終形成十妝樹脂H-Pyr-His (Trt) -Trp (Boc) -Ser (tBu) -Tyr (tBu) -D-Trp (B oc) -Leu-Arg (Pbf) -Pro-Gly-樹脂；(4)向步驟(3)所得十肽樹脂中加入切割液進(jìn)行切肽反應(yīng)，以使十肽從樹脂上切割下來，得到曲普瑞林。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，其中步驟(I)中所述樹脂選自rink amide MBHA樹脂、rink amide am樹脂、knorr樹脂、或其組合； 所述肽偶聯(lián)劑選自DCC、DIC、HATU, HBTU, HCTU, TATU, TBTU、或其組合；所述酰胺鍵形成促進(jìn)劑選自H0AT、H0BT、6-Cl-H0Bt、或其組合；所述有機(jī)堿選自NMM、DIEA、三甲基吡啶、或其組合；用于進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)的所述溶劑選自二氯甲烷、二甲基甲酰胺；所述樹脂浸泡處理是照如下方式進(jìn)行的取樹脂置于反應(yīng)器中，加入溶劑振蕩并充分浸泡，抽除溶劑；所述樹脂在經(jīng)浸泡處理后、進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)之前，還包括對該樹脂進(jìn)行脫帽處理的步驟；所述樹脂與所述Fmoc-Gly-OH的投料比為1:2. 5 5 (摩爾比)；進(jìn)一步地，在后續(xù)的各個(gè)肽偶聯(lián)反應(yīng)中，添加的該步驟的氨基酸(Fmoc保護(hù)的或未保護(hù)的)的量為步驟(I)中樹脂量的2 7倍(摩爾倍)；所述Fmoc-Gly-OH、肽偶聯(lián)劑、酰胺鍵形成促進(jìn)劑和有機(jī)堿四者的投料比為1:1_3 1-3 :2-6(摩爾比)；和/或步驟(I)中，還包括在完成偶聯(lián)反應(yīng)后對獲得的Fmoc-Gly-樹脂進(jìn)行清洗的操作，所述清洗是使用選自下列的溶劑清洗處理廣3次、甲醇、乙醇、氯仿、三氟乙酸、DM F、或其組合， 特別是使用DMF、甲醇、二氯甲烷，三者交替清洗2次。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，其中步驟(2)中所述脫帽試劑選自哌啶、二乙胺、三乙胺、三氟乙酸。所述脫帽反應(yīng)是在選自下列的溶劑中進(jìn)行的二氯甲烷、二甲基甲酰胺等，優(yōu)選二甲基甲酰胺；所述脫帽反應(yīng)是在15 25%的哌啶/ 二甲基甲酰胺溶液中進(jìn)行的，優(yōu)選是在20%的哌啶 /二甲基甲酰胺溶液中進(jìn)行的；步驟(2)中，還包括在完成脫帽反應(yīng)后對獲得的Gly-樹脂進(jìn)行清洗的操作，所述清洗是使用選自下列的溶劑清洗處理廣3次、甲醇、乙醇、氯仿、三氟乙酸、DMF、或其組合，特別是使用DMF、甲醇、二氯甲烷，三者交替清洗2次；和/或所述偶聯(lián)反應(yīng)是參照步驟(I)中的偶聯(lián)反應(yīng)進(jìn)行的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，其中步驟(3)中第一循環(huán)操作使用Fmoc-L-Arg(pbf)-OH作為保護(hù)氨基酸，得到 H-Arg (Pbf) -Pro-Gly-樹脂；第二循環(huán)操作使用Fmoc-L-Leu-OH作為保護(hù)氨基酸，得到 H-Leu-Arg (Pbf) -Pro-Gly-樹脂；第三循環(huán)操作使用Fmoc-D-trp (boc) -OH作為保護(hù)氨基酸，得到H-D-Trp (Boc) -Le u-Arg (Pbf) -Pro-Gly-樹脂；第四循環(huán)操作使用Fmoc-L-Tyr (tBu) -OH作為保護(hù)氨基酸，得到H-Tyr (tBu) -D-Tr P (Boc) -Leu-Arg (Pbf) -Pro-Gly-樹脂；第五循環(huán)操作使用Fmoc-L-Ser (tBu) -OH作為保護(hù)氨基酸,得到H-Ser (tBu) -Tyyr (t B u) -D-Trp (Boc) -Leu-Arg (Pbf) -Pro-Gly-樹脂；第六循環(huán)操作使用Fmoc-L-trp (boc) -OH作為保護(hù)氨基酸,得到H-Trp (Boc) -Ser (t Bu )-Tyr (tBu) -D-Trp (Boc) -Leu-Arg (Pbf) -Pro-Gly-樹脂；第七循環(huán)操作使用Fmoc-L-His (trt) -OH作為保護(hù)氨基酸,得到H-His (Trt) -Trp (Bo c )-Ser (tBu) -Tyr (tBu) -D-Trp (Boc) -Leu-Arg (Pbf) -Pro-Gly-樹脂；第八循環(huán)操作使用H-Pyr-OH作為保護(hù)氨基酸,得到H-Pyr-His (Trt) -Trp (Boc) -Ser (t Bu) -Tyr (tBu) -D-Trp (Boc) -Leu-Arg (Pbf) -Pro-Gly-樹脂。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，步驟(I)中進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)時(shí)，酰胺鍵形成促進(jìn)劑是HOAT和HOBT兩者組合使用；優(yōu)選地，HOAT和HOBT 二者的用量比為1:1-4(摩爾比)，優(yōu)選1:2_3(摩爾比)；和/或步驟(2)和步驟(3)中進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)時(shí)，使用的酰胺鍵形成促進(jìn)劑是H0AT。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中步驟(3)中，在第一循環(huán)操作使用Fmoc-L-Arg(pb f) -OH作為保護(hù)氨基酸進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)的過程中，與Fmoc-L-Arg (pbf) -OH 一起加入適量乳酸進(jìn)行反應(yīng)；在一個(gè)實(shí)施方案中，所述Fmoc-L-Arg(pbf)-OH與乳酸的摩爾比為1:0. 1-0. 5，優(yōu)選 I 0. 2-0. 3。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中步驟(I)、步驟(2)、和步驟(3)中的所述偶聯(lián)反應(yīng)是在 10 30° C溫度下進(jìn)行的，反應(yīng)時(shí)間為l(T200min，例如3(T90min，例如約60min。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，其中步驟(4)中所述切割液中包含TFA、TIS、EDT、H20 ;在一個(gè)實(shí)施方案中，所述切割液中四種組分的體積比為TFA:TIS:EDT:H20=50-98:1-10:1-10:0. 1-5 ；所述切肽反應(yīng)是在室溫進(jìn)行的，優(yōu)選是在20±5° C下進(jìn)行的；反應(yīng)時(shí)間為1-10小時(shí)； 所述切肽反應(yīng)是將氨基酸的側(cè)鏈保護(hù)基及十肽從樹脂上同時(shí)切割下來從而獲得十肽曲普瑞林；和/或在完成切肽反應(yīng)后，除去切割液(例如通過減壓的方式)，然后加入乙醚進(jìn)行沉淀，收集沉淀物，用乙醚洗滌數(shù)次，真空干燥，獲得曲普瑞林。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，在經(jīng)步驟(4)切肽反應(yīng)獲得曲普瑞林干燥品后，還進(jìn)一步包括對該曲普瑞林干燥品進(jìn)行純化的步驟；所述純化步驟是照如下方式進(jìn)行的將曲普瑞林粗品用醋酸水溶液溶解，過濾，濾液過離子交換柱并用該醋酸水溶液洗脫，收集流出主峰,然后再經(jīng)過C18柱純化，收集主峰流出液，冷凍干燥，即得曲普瑞林精制品；所述過離子交換柱并用該醋酸水溶液洗脫，所述的醋酸水溶液濃度為2%-20%(v/v)； 所說的反向C18柱純化所用流動相為含O. 3%乙酸和18%乙腈的水溶液。
10.一種曲普瑞林，其特征在于其經(jīng)氨基酸光學(xué)純檢測，除了 Try以外，其它7個(gè)氨基酸的D-型對映體比例相對于其相應(yīng)氨基酸酸而言均小于O. 2% ；其經(jīng)氨基酸光學(xué)純檢測，除了 Try以外，其它7個(gè)氨基酸的D-型對映體比例相對于其相應(yīng)氨基酸酸而言均小于O. 15% ；其經(jīng)氨基酸光學(xué)純檢測，其中D-Arg相對于全部精氨酸而言均小于O. 2%，優(yōu)選小于 O. 15 ；其中乙腈含量低于O. 03% ;和/或其是通過權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述方法制備得到的。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種優(yōu)良的曲普瑞林及其固相合成制備方法。本發(fā)明曲普瑞林氨基酸光學(xué)純度高，殘余溶劑量少，其制法包括步驟向樹脂中加入Fmoc-Gly-OH、肽偶聯(lián)劑、酰胺鍵形成促進(jìn)劑和有機(jī)堿進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，形成Fmoc-Gly-樹脂；加入脫帽試劑進(jìn)行反應(yīng)；接著加入保護(hù)氨基酸Fmoc-Pro-OH、肽偶聯(lián)劑、酰胺鍵形成促進(jìn)劑和有機(jī)堿，進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)形成Fmoc-Pro-Gly-樹脂；循環(huán)重復(fù)步驟(2)，并在每一循環(huán)操作的偶聯(lián)反應(yīng)中依次使用曲另外9個(gè)氨基酸以替換Fmoc-Pro-OH；向所得十肽樹脂中加入切割液進(jìn)行切肽，使十肽切離樹脂，任選地對曲普瑞林進(jìn)行純化。本發(fā)明可得到符合國家藥典標(biāo)準(zhǔn)的曲普瑞林原料藥產(chǎn)品。生產(chǎn)工藝穩(wěn)定，原料來源方便，收率高，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，生產(chǎn)成本低，操作簡單，適合大生產(chǎn)。
文檔編號C07K7/23GK103012565SQ20131001488
公開日2013年4月3日 申請日期2013年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月15日
發(fā)明者趙東明, 張明義, 張 林, 董國明, 王虎 申請人:成都天臺山制藥有限公司