一種融合蛋白質(zhì)、制備方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種融合蛋白質(zhì)、制備方法及其應(yīng)用，屬于蛋白質(zhì)生產(chǎn)，分析和應(yīng)用領(lǐng)域。本發(fā)明通過(guò)建立鈣調(diào)素融合蛋白質(zhì)的分離，純化，性能分析和利用鈣調(diào)素融合蛋白質(zhì)柱來(lái)分離提取和濃縮樣本中的目標(biāo)蛋白質(zhì)和相關(guān)的生物分子，介紹了一種新的生物樣本配制，前處理和提高生物檢測(cè)靈敏度的技術(shù)和方法。
【專利說(shuō)明】—種融合蛋白質(zhì)、制備方法及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)生產(chǎn)，分析和應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及一種融合蛋白質(zhì)的制備方法及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]鈣調(diào)素蛋白是一種重要的蛋白質(zhì)，在與細(xì)胞內(nèi)鈣離子相關(guān)的信息傳遞中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，具有調(diào)解多種酶的功能。市場(chǎng)上，除了作為研究鈣調(diào)素結(jié)合蛋白質(zhì)需要大量的鈣調(diào)素蛋白外，利用鈣調(diào)素和鈣調(diào)素結(jié)合蛋白依賴鈣離子存在的關(guān)系，近來(lái)也有通過(guò)添加或消除鈣離子的存在來(lái)達(dá)到結(jié)合和分離鈣調(diào)素結(jié)合蛋白質(zhì)的目的的報(bào)道。但是利用融合蛋白(此處是麥芽糖結(jié)合蛋白-鈣調(diào)素蛋白融合蛋白)來(lái)達(dá)到分離，濃縮樣本中的靶物質(zhì)的方法還沒(méi)有任何報(bào)道。
[0003]最近有報(bào)道指出，熱休克蛋白90是很好的癌癥檢測(cè)標(biāo)記物，但還沒(méi)有一種可以從生物樣本中濃縮該熱休克蛋白90，便于提高該蛋白質(zhì)的檢測(cè)靈敏度的報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種通過(guò)融合蛋白質(zhì)來(lái)簡(jiǎn)化蛋白質(zhì)的生產(chǎn)，純化，分析過(guò)程以及利用融合蛋白質(zhì)所依附的條件來(lái)分離，濃縮相關(guān)的蛋白質(zhì)結(jié)合物的方法及其應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:
[0006]一種融合蛋白質(zhì)的制備方法，包括以下步驟:
[0007](I)將完整的靶基因的cDNA片段克隆到融合蛋白的表達(dá)載體，cDNA克隆時(shí)，在完整基因的cDNA片段前，起始密碼子(ATG)之后，加上Xa因子位點(diǎn)異亮氨酸-谷氨酸-甘氨酸-精氨酸(Ile-Glu-Gly-Arg)的脫氧核糖核酸序列；
[0008](2)將步驟(1)得到的含有完整目的基因的亞克隆表達(dá)載體，轉(zhuǎn)型或轉(zhuǎn)染到表達(dá)宿主細(xì)胞內(nèi)，使之在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)所需融合蛋白質(zhì)，通過(guò)接種培養(yǎng),獲得含有完整目的基因載體的純克隆細(xì)胞株；
[0009](3)使用步驟(2)含有完整目的基因載體的純克隆細(xì)胞株，進(jìn)行量化培養(yǎng)，蛋白表達(dá)處理，獲得量化的，有目的融合蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞；
[0010](4)將步驟(3)得到的宿主細(xì)胞進(jìn)行裂解，獲取細(xì)胞裂解液，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行純化，獲得分離，純化的融合蛋白質(zhì)；
[0011](5)使用因子X(jué)a處理融合蛋白質(zhì)，可獲得純化的目的基因蛋白質(zhì)。
[0012]進(jìn)一步地，所述步驟(1)中加上Xa因子位點(diǎn)異亮氨酸-谷氨酸-甘氨酸-精氨酸(Ile-Glu-Gly-Arg)的脫氧核糖核酸序列，可以保證所表達(dá)的蛋白質(zhì)在Xa切割后，獲得的目的蛋白質(zhì)的氨基酸順序是所需的，完整的。
[0013]進(jìn)一步地，所述步驟(4)和(5)是通過(guò)親和柱來(lái)進(jìn)行蛋白質(zhì)分離和純化的。
[0014]優(yōu)選地，所述一種代表性融合蛋白為鈣調(diào)素融合蛋白，是以鈣調(diào)素為目的蛋白質(zhì)的鈣調(diào)素蛋白和麥芽糖結(jié)合蛋白的融合蛋白質(zhì)。
[0015]通過(guò)上述的制備方法，制備得到的融合蛋白。
[0016]一種融合蛋白質(zhì)的應(yīng)用，利用分離純化獲得的融合蛋白，分離、純化和濃縮目的蛋白質(zhì)，可用于蛋白質(zhì)的性能分析和應(yīng)用。
[0017]進(jìn)一步地，利用融合蛋白，富集生物樣本中的靶分子，達(dá)到分離、純化、濃縮和提高檢測(cè)靈敏度的目的。
[0018]優(yōu)選地，所述目的融合蛋白質(zhì)為麥芽糖結(jié)合蛋白-鈣調(diào)素蛋白的融合蛋白，可用來(lái)結(jié)合和濃縮樣本中的一種靶分子為熱休克蛋白90。
[0019]本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0020]本專利所介紹的融合蛋白質(zhì)生產(chǎn)，分離純化和分析方法，以及利用融合蛋白質(zhì)來(lái)分離，濃縮相關(guān)的結(jié)合蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)結(jié)合物，達(dá)到分離，純化和提高分析，檢測(cè)靶分子的靈敏度的目的，是首次提出由融合蛋白質(zhì)來(lái)富集樣本中的蛋白質(zhì)結(jié)合物的新方法，其方法和產(chǎn)品，可彌補(bǔ)特定蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)結(jié)合物的分離，純化和檢測(cè)方法等方面的許多不足，或提供更有效的蛋白質(zhì)生產(chǎn)系統(tǒng)，其應(yīng)用價(jià)值很大。本發(fā)明使用融合蛋白質(zhì)的表達(dá)，生產(chǎn)方式，首先可提高可溶性比例，同時(shí)又簡(jiǎn)化了分離純化的操作過(guò)程，降低了成本(利用親和柱，方法簡(jiǎn)單，成本低)；利用設(shè)計(jì)在兩種蛋白質(zhì)連接處切割部位，可以容易地獲得符合所需氨基酸順序的融合蛋白質(zhì)和目的蛋白質(zhì)(不多一個(gè)氨基酸，也不少一個(gè)氨基酸)，便于比較融合蛋白質(zhì)和目的蛋白質(zhì)的可利用性能；利用融合蛋白質(zhì)作為載體來(lái)分離，濃縮相關(guān)的結(jié)合蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)的結(jié)合物，可用于結(jié)合蛋白質(zhì)的分離，濃縮，性能分析，檢測(cè)，同時(shí)也可以作為提高生物檢測(cè)靈敏度的一種新的有效方法。例如，鈣調(diào)素蛋白在有鈣離子存在的條件下，可與多種熱休克蛋白質(zhì)結(jié)合，而熱休克蛋白質(zhì)特別是腫瘤細(xì)胞可以分泌熱休克蛋白質(zhì)90，所以熱休克蛋白質(zhì)90又是癌癥檢測(cè)的重要標(biāo)記物，利用此發(fā)明技術(shù)產(chǎn)品，濃縮相關(guān)樣本中(如:血液等樣本)的熱休克蛋白質(zhì)，將有助于癌癥的早期的高靈敏度檢測(cè)。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0021]圖1是顯不麥芽糖結(jié)合蛋白質(zhì)和鈣調(diào)素蛋白質(zhì)融合蛋白質(zhì)的克隆不意圖；
[0022]圖2是顯不鈣調(diào)素蛋白質(zhì)的生廣和純化不意圖；
[0023]圖3是顯示鈣調(diào)素蛋白質(zhì)和融合蛋白質(zhì)鈣離子結(jié)合實(shí)驗(yàn)示意圖；
[0024]圖4顯示鈣調(diào)素融合蛋白質(zhì)具有和鈣調(diào)素相同的，激活磷酸二酯酶的功能；
[0025]圖5顯示鈣調(diào)素融合蛋白質(zhì)和熱休克蛋白質(zhì)90的結(jié)合實(shí)驗(yàn)；
[0026]圖6是用鈣調(diào)素融合蛋白柱濃縮鈣調(diào)素蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)或結(jié)合物實(shí)驗(yàn)圖；
[0027]圖7是利用鈣調(diào)素融合蛋白質(zhì)分離，純化和濃縮鈣調(diào)素結(jié)合蛋白質(zhì)或結(jié)合物的原理圖。

【具體實(shí)施方式】
[0028]下面結(jié)合附圖和實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。
[0029] 參照?qǐng)D1，圖1是顯不麥芽糖結(jié)合蛋白質(zhì)和鈣調(diào)素蛋白質(zhì)融合蛋白質(zhì)的克隆不意圖。以大腸桿菌表達(dá)載體(pMAL — c2)為實(shí)驗(yàn)載體(購(gòu)于New England B1lab),通過(guò)PCR(Polymerase Chain React1n,聚合酶鏈反應(yīng))的探針設(shè)計(jì),將鈣調(diào)素蛋白的完整基因cDNA (Complimentary deoxyribonucleic acid,互補(bǔ)脫氧核糖核酸)復(fù)制，復(fù)制后的基因片段，既含有完整的鈣調(diào)素蛋白cDNA，又在其啟動(dòng)密碼子之后，加入了因子X(jué)a的DNA(Deoxyribonucleic acid,脫氧核糖核酸)序列。在啟動(dòng)密碼子之前和基因序列之后，有克隆酶位點(diǎn)，PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)酶切后，就可以克隆到載體內(nèi)。轉(zhuǎn)型到大腸桿菌細(xì)胞后，有鈣調(diào)素蛋白基因插入的，在接種挑選細(xì)胞株時(shí)，可以獲得所需克隆細(xì)胞株。
[0030]參照?qǐng)D2，圖2是顯示鈣調(diào)素蛋白質(zhì)的生產(chǎn)和純化示意圖，其中槽I是未誘導(dǎo)處理的大腸桿菌細(xì)胞裂解液；槽 2 是 IPTG (Isopropyl β -D-1-Th1galactopyranoside,異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)誘導(dǎo)鈣調(diào)素融合蛋白質(zhì)表達(dá)處理后的大腸桿菌細(xì)胞裂解液；槽3是使用直鏈淀粉親和柱分離，純化后的鈣調(diào)素融合蛋白質(zhì)(麥芽糖結(jié)合蛋白和鈣調(diào)素蛋白的融合蛋白質(zhì))；槽4是對(duì)上述融合蛋白質(zhì)進(jìn)行因子X(jué)a酶切后，顯示麥芽糖結(jié)合蛋白和鈣調(diào)素蛋白的融合蛋白質(zhì)被切開(kāi)，分離成麥芽糖結(jié)合蛋白質(zhì)(大)和鈣調(diào)素蛋白(小)兩種蛋白質(zhì)；槽5是因子X(jué)a酶切后的蛋白質(zhì)溶液，再次作直鏈淀粉親和柱分離處理，麥芽糖結(jié)合蛋白質(zhì)被親和柱吸附，可獲得分離純化的鈣調(diào)素蛋白質(zhì)。與未作誘導(dǎo)處理相比，IPTG誘導(dǎo)后的大腸桿菌細(xì)胞裂解液中，鈣調(diào)素蛋白質(zhì)的表達(dá)量很高(槽2)。經(jīng)過(guò)直鏈淀粉親和柱分離，純化后，獲得了高純度的融合蛋白質(zhì)(槽3)。用因子X(jué)a切割純化的融合蛋白質(zhì)，可獲得麥芽糖結(jié)合蛋白質(zhì)和鈣調(diào)素蛋白質(zhì)(槽4)。因子X(jué)a切割后的蛋白質(zhì)溶液，再次經(jīng)過(guò)直鏈淀粉親和柱分離純化后，可獲得高度純化的鈣調(diào)素蛋白質(zhì)(槽5)。從圖2可以看出，該系統(tǒng)成功生產(chǎn)，分離和純化出所需融合蛋白質(zhì)和目的基因的蛋白質(zhì)。
[0031]參照?qǐng)D3，圖3是顯示鈣調(diào)素蛋白質(zhì)和融合蛋白質(zhì)鈣離子結(jié)合實(shí)驗(yàn)示意圖，其中槽I是鈣調(diào)素在無(wú)EGTA(ethylene glycol tetraacetic acid,乙二醇雙(2_氛基乙基醚)四乙酸)和無(wú) CaCl2 (氯化?丐)條件下，在 SDS-PAGE (SDS:Sodium dodecyl sulfate ；PAGE:Polyacrylamide gel electrophoresis ;十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳)膠上，無(wú)結(jié)構(gòu)上的變化；槽2是鈣調(diào)素在5mM EGTA存在但沒(méi)有CaC12條件下，在SDS-PAGE膠上，也無(wú)結(jié)構(gòu)上的變化 ；槽3是鈣調(diào)素在無(wú)EGTA但有5mMCaCl2鈣離子存在的條件下，在SDS-PAGE膠上，顯示了和鈣離子的結(jié)合，而產(chǎn)生了結(jié)構(gòu)上的變化。從圖3可以看出，不管是鈣調(diào)素蛋白質(zhì)本身，還是鈣調(diào)素蛋白質(zhì)融合蛋白質(zhì)，在有鈣離子的條件下，都顯示了和鈣離子結(jié)果的功能，在SDS - PAGE膠上，顯示了分子結(jié)構(gòu)變化后的超前移動(dòng)。
[0032]參照?qǐng)D4，圖4顯示鈣調(diào)素融合蛋白質(zhì)具有和鈣調(diào)素相同的，激活磷酸二酯酶(PDE)的功能。和無(wú)激活基質(zhì)的緩沖液(Buffer)相比，不同濃度的麥芽糖結(jié)合蛋白質(zhì)和鈣調(diào)素蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)(MBP-CAM)具有和鈣調(diào)素蛋白(CAM)本身一樣的激活磷酸二酯酶的效果。
[0033]參照?qǐng)D5，圖5顯示鈣調(diào)素融合蛋白質(zhì)和熱休克蛋白質(zhì)90的結(jié)合實(shí)驗(yàn)。從圖5看出，無(wú)變性膠同位素顯影實(shí)驗(yàn)顯示，與體外合成的有同位素S35標(biāo)記的熱休克蛋白90相比(槽9)，鈣調(diào)素融合蛋白質(zhì)和體外合成的有同位素S35標(biāo)記的熱休克蛋白90形成了特有的結(jié)合帶(槽2);體外合成的有同位素S35標(biāo)記的熱休克蛋白90也和鈣調(diào)素蛋白質(zhì)形成了特有的結(jié)合帶(槽4)，而麥芽糖結(jié)合蛋白質(zhì)和體外合成的有同位素S35標(biāo)記的熱休克蛋白90之間則沒(méi)有特別結(jié)合的帶(槽8)，由此可知，鈣調(diào)素融合蛋白質(zhì)具有和鈣調(diào)素蛋白一樣的，和熱休克蛋白90結(jié)合能力。
[0034]參照?qǐng)D6，圖6是用鈣調(diào)素融合蛋白柱濃縮鈣調(diào)素蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)或結(jié)合物實(shí)驗(yàn)圖。從圖6可以看出，本發(fā)明生產(chǎn)的鈣調(diào)素融合蛋白質(zhì)柱具有濃縮了特定的蛋白質(zhì)帶或結(jié)合物帶，顯示該融合蛋白柱是有功能的。
[0035]參照?qǐng)D7，圖7是利用鈣調(diào)素融合蛋白質(zhì)分離，純化和濃縮鈣調(diào)素結(jié)合蛋白質(zhì)或結(jié)合物的原理圖。生物樣本中，有時(shí)某些鈣調(diào)素結(jié)合蛋白質(zhì)或結(jié)合物質(zhì)的濃度或純度不夠，或在檢測(cè)時(shí)，因?yàn)闈舛炔粔蚧蚣兌炔粔?，而檢測(cè)不到時(shí)，需要分離，純化或濃縮來(lái)提高其濃度，就可以利用融合蛋白質(zhì)柱來(lái)對(duì)生物樣本做一次前處理，達(dá)到分離，純化或濃縮靶蛋白質(zhì)或結(jié)合物的目的。
[0036]本專利所介紹的融合蛋白質(zhì)生產(chǎn)，分離純化和分析方法，以及利用融合蛋白質(zhì)來(lái)分離，濃縮相關(guān)的結(jié)合蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)結(jié)合物，達(dá)到分離，純化和提高分析，檢測(cè)的靈敏度的目的，是首次提出由融合蛋白質(zhì)來(lái)富集樣本中的蛋白質(zhì)結(jié)合物的新方法，其方法和產(chǎn)品，可彌補(bǔ)特定蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)結(jié)合物的分離，純化和檢測(cè)方法等方面的許多不足，或提供更有效的蛋白質(zhì)生產(chǎn)系統(tǒng)，其應(yīng)用價(jià)值很大。本發(fā)明使用融合蛋白質(zhì)的表達(dá)，生產(chǎn)方式，首先可提高可溶性比例，同時(shí)又簡(jiǎn)化了分離純化的操作過(guò)程，降低了成本(利用親和柱，方法簡(jiǎn)單，成本低)；利用設(shè)計(jì)在兩種蛋白質(zhì)連接處切割部位，可以容易地獲得符合所需氨基酸順序的融合蛋白質(zhì)和目的蛋白質(zhì)(不多一個(gè)氨基酸，也不少一個(gè)氨基酸)，便于比較融合蛋白質(zhì)和目的蛋白質(zhì)的可利用性能；利用融合蛋白質(zhì)作為載體來(lái)分離，濃縮相關(guān)的結(jié)合蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)的結(jié)合物，可用于結(jié)合蛋白質(zhì)的分離，濃縮，性能分析，檢測(cè)，同時(shí)也可以作為提高生物檢測(cè)靈敏度的一種新的，有效方法。例如，鈣調(diào)素蛋白在有鈣離子存在的條件下，可與多種熱休克蛋白質(zhì)結(jié)合，而熱休克蛋白質(zhì)特別是腫瘤細(xì)胞可以分泌熱休克蛋白質(zhì)90，所以熱休克蛋白質(zhì)90又是癌癥檢測(cè)的重要標(biāo)記物，利用此發(fā)明技術(shù)產(chǎn)品，濃縮相關(guān)樣本中(如:血液等樣本)的熱休克蛋白質(zhì)，將有助于癌癥的早期有效檢測(cè)。
[0037]最后所應(yīng)說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。
【權(quán)利要求】
1.一種融合蛋白質(zhì)的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)將完整的靶基因的CDNA片段克隆到融合蛋白的表達(dá)載體，CDNA克隆時(shí)，在完整基因的cDNA片段前，起始密碼子(ATG)之后，加上Xa因子位點(diǎn)異亮氨酸-谷氨酸-甘氨酸-精氨酸(Ile-Glu-Gly-Arg)的脫氧核糖核酸序列； (2)將步驟(1)得到的含有完整目的基因的亞克隆表達(dá)載體，轉(zhuǎn)型或轉(zhuǎn)染到表達(dá)宿主細(xì)胞內(nèi)，使之在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)所需融合蛋白質(zhì)，通過(guò)接種培養(yǎng)，獲得含有完整目的基因載體的純克隆細(xì)胞株； (3)使用步驟(2)含有完整目的基因載體的純克隆細(xì)胞株，進(jìn)行量化培養(yǎng)，蛋白表達(dá)處理，獲得量化的，有目的融合蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞； (4)將步驟(3)得到的宿主細(xì)胞進(jìn)行裂解，獲取細(xì)胞裂解液，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行純化，獲得分離，純化的融合蛋白質(zhì)； (5)使用因子X(jué)a處理融合蛋白質(zhì)，可獲得純化的目的基因蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白質(zhì)的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中加上Xa因子位點(diǎn)異亮氨酸-谷氨酸-甘氨酸-精氨酸(Ile-Glu-Gly-Arg)的脫氧核糖核酸序列，可以保證所表達(dá)的蛋白質(zhì)在Xa切割后，獲得的目的蛋白質(zhì)的氣基酸順序是所需的，完整的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1 所述的融合蛋質(zhì)白的制備方法，其特征在于，所述步驟(4)和(5)是通過(guò)親和柱來(lái)進(jìn)行蛋白質(zhì)分離和純化的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白質(zhì)的制備方法，其特征在于，所述一種代表性融合蛋白為鈣調(diào)素融合蛋白，是以鈣調(diào)素為目的蛋白質(zhì)的鈣調(diào)素蛋白和麥芽糖結(jié)合蛋白的融合蛋白質(zhì)。
5.一種權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的制備方法，制備得到的融合蛋白。
6.一種融合蛋白質(zhì)的應(yīng)用，其特征在于，利用分離純化獲得的融合蛋白，分離、純化和濃縮目的蛋白質(zhì)，可用于蛋白質(zhì)的性能分析和應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的融合蛋白質(zhì)的應(yīng)用，其特征在于，利用融合蛋白，富集生物樣本中的靶分子，達(dá)到分離、純化、濃縮和提高檢測(cè)靈敏度的目的。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的融合蛋白質(zhì)的應(yīng)用，其特征在于，所述目的融合蛋白質(zhì)為麥芽糖結(jié)合蛋白-鈣調(diào)素融合蛋白，可用來(lái)結(jié)合和濃縮樣本中的一種靶分子為熱休克蛋白90。
【文檔編號(hào)】C07K1/14GK104164444SQ201410377969
【公開(kāi)日】2014年11月26日 申請(qǐng)日期:2014年7月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月31日
【發(fā)明者】鄧亞光, 歐陽(yáng)慭, 鄧偉平, 曾支農(nóng) 申請(qǐng)人:宜昌美光硅谷生命科技有限公司