專利名稱：增強型蛋白及其應用方法
本申請要求2001年9月17日提交的美國臨時申請60/322,461的優(yōu)先權。上述申請全文引入本文作為參考。
本發(fā)明主要涉及植物遺傳學和蛋白質化學領域。更具體地，本發(fā)明涉及包含了更多必需氨基酸的修飾蛋白。
全面補充氨基酸，在營養(yǎng)上對于所有動物，包括人，都是重要的，并且通常對于產生高質量牲畜和動物產品也是重要的。但是，一般動物膳食可缺乏具體動物不能合成的一或多種氨基酸。因此，所有動物都需要必需氨基酸來進行正常生長和發(fā)育。動物與動物之間的氨基酸需求是不同的。典型的氨基酸包括蘇氨酸、異亮氨酸、色氨酸、纈氨酸、精氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸和組氨酸。
在牲畜的膳食中添加必需氨基酸可以增加動物的商業(yè)價值。能提供并吸收充分的營養(yǎng)，對于動物產生具有重要商業(yè)價值的產物是十分關鍵的。在人的膳食中添加必需氨基酸，可以預防由營養(yǎng)不良或蛋白缺陷導致的一些疾病，并促進正常生長和發(fā)育。
已經有人嘗試改變動物的膳食，來增加動物飼料和人類食物(后文中統(tǒng)稱食物)中必需氨基酸的量。例如，食物中常常添加額外的蛋白。
遺傳工程技術提供了制造含有更多量的必需氨基酸的強化食物的更有效方法。例如，可以將食物蛋白中的非必需氨基酸替換為必需氨基酸，從而提高食物中該蛋白的營養(yǎng)價值。此外，這種強化蛋白可以在植物或者在摻入食物中的種子中組成型表達。結果是，該強化蛋白以相對較高水平出現(xiàn)在食物中，導致，例如，動物膳食的營養(yǎng)顯著改善。
顯然該領域存在著對包含更多量的必需氨基酸的強化蛋白的需要。這類蛋白可以顯著改進動物飼料的營養(yǎng)價值，從而提高商業(yè)化動物產品的質和量。這類蛋白也可以顯著改進內人類食物的營養(yǎng)價值，從而減少營養(yǎng)不良和相關健康問題的發(fā)生，并促進嬰兒和兒童的總體生長和發(fā)育。
發(fā)明概述本發(fā)明包括并提供了一種修飾的多肽，它在具有氨基酸序列SEQ IDNO1的未經修飾的多肽中摻入了一或多個選自異亮氨酸或色氨酸的必需氨基酸的取代，其中所述修飾的多肽能在種子中積累。
本發(fā)明包括并提供了一種修飾的多肽，它在未經修飾的氨基酸序列SEQ ID NO1中摻入了一或多個選自蘇氨酸，異亮氨酸，色氨酸，纈氨酸，精氨酸，賴氨酸，甲硫氨酸或組氨酸的必需氨基酸的取代，其中所述修飾的多肽能在種子中積累。
本發(fā)明包括并提供了一種修飾的β-伴大豆球蛋白(conglycinin)多肽，它在具有氨基酸序列SEQ ID NO1的未經修飾的β-伴大豆球蛋白多肽中摻入了一或多個選自蘇氨酸，異亮氨酸，色氨酸，纈氨酸，精氨酸，賴氨酸，甲硫氨酸或組氨酸的必需氨基酸的取代，其中所述修飾的β-伴大豆球蛋白多肽能在種子中積累。
本發(fā)明包括并提供了編碼修飾的β-伴大豆球蛋白多肽的重組核酸分子，所述多肽在具有氨基酸序列SEQ ID NO1的未經修飾的β-伴大豆球蛋白多肽中摻入了一或多個選自蘇氨酸，異亮氨酸，色氨酸，纈氨酸，精氨酸，賴氨酸，甲硫氨酸或組氨酸的必需氨基酸的取代，其中所述修飾的β-伴大豆球蛋白多肽能在種子中積累。
本發(fā)明包括并提供了一種細胞，在該細胞中，按照5’到3’的方向，包含異源啟動子以及與其可操作相連的重組核酸分子，所述核酸分子編碼修飾的β-伴大豆球蛋白多肽，該多肽在具有氨基酸序列SEQ ID NO1的未經修飾的β-伴大豆球蛋白多肽中摻入了一或多個選自蘇氨酸，異亮氨酸，色氨酸，纈氨酸，精氨酸，賴氨酸，甲硫氨酸或組氨酸的必需氨基酸的取代，其中所述修飾的β-伴大豆球蛋白多肽能在種子中積累。
本發(fā)明包括并提供了一種轉基因植物，在該植物中，按照5’到3’的方向，包含異源啟動子以及與其可操作相連的重組核酸分子，所述核酸分子編碼修飾的β-伴大豆球蛋白多肽，該多肽在具有氨基酸序列SEQ ID NO1的未經修飾的β-伴大豆球蛋白多肽中摻入了一或多個選自蘇氨酸，異亮氨酸，色氨酸，纈氨酸，精氨酸，賴氨酸，甲硫氨酸或組氨酸的必需氨基酸的取代，其中所述修飾的β-伴大豆球蛋白多肽能在種子中積累。
本發(fā)明包括并提供了一種轉基因植物種子，其中，按照5’到3’的方向，包含異源啟動子以及與其可操作相連的重組核酸分子，所述核酸分子編碼修飾的β-伴大豆球蛋白多肽，該多肽在具有氨基酸序列SEQ ID NO1的未經修飾的β-伴大豆球蛋白多肽中摻入了一或多個選自蘇氨酸，異亮氨酸，色氨酸，纈氨酸，精氨酸，賴氨酸，甲硫氨酸或組氨酸的必需氨基酸的取代，其中所述修飾的β-伴大豆球蛋白多肽能在種子中積累，且其中所述植物是苜蓿，蘋果，香蕉，大麥，菜豆，花椰菜，甘藍，胡蘿卜，蓖麻，芹菜，柑桔，三葉草，椰子，咖啡，玉米(corn)，棉花，黃瓜，道格拉斯冷杉(Douglas fir)，桉(Eucalyptus)，大蒜，葡萄，亞麻子，火炬松(Loblolly pine)，甜瓜，燕麥，油橄欖，洋蔥，棕櫚，防風，豌豆，花生，胡椒，楊樹，馬鈴薯，蘿卜，Radiatapine，油菜籽，稻，黑麥，高梁，狹葉羽扇豆(Lupinusangustifolius)，Southern pine，菠菜，草莓，甜菜，甘蔗，向日葵，楓香(Sweetgum)，茶，煙草，番茄，turf，或小麥植物。
本發(fā)明包括并提供了從轉基因植物的種子得到的植物，其中，按照5’到3’的方向，包含異源啟動子以及與其可操作相連的重組核酸分子，所述核酸分子編碼修飾的β-伴大豆球蛋白多肽，該多肽在具有氨基酸序列SEQID NO1的未經修飾的β-伴大豆球蛋白多肽中摻入了一或多個選自蘇氨酸，異亮氨酸，色氨酸，纈氨酸，精氨酸，賴氨酸，甲硫氨酸或組氨酸的必需氨基酸的取代，其中所述修飾的β-伴大豆球蛋白多肽能在種子中積累，且其中所述植物是苜蓿，蘋果，香蕉，大麥，菜豆，花椰菜，甘藍，胡蘿卜，蓖麻，芹菜，柑桔，三葉草，椰子，咖啡，玉米(corn)，棉花，黃瓜，道格拉斯冷杉，桉，大蒜，葡萄，亞麻子，火炬松，甜瓜，燕麥，油橄欖，洋蔥，棕櫚，防風，豌豆，花生，胡椒，楊樹，馬鈴薯，蘿卜，Radiata pine，油菜籽，稻，黑麥，高梁，狹葉羽扇豆，Southern pine，菠菜，草莓，甜菜，甘蔗，向日葵，楓香，茶，煙草，番茄，turf，或小麥植物。
本發(fā)明包括并提供了含有轉基因植物種子的動物飼料，其中，按照5’到3’的方向，包含異源啟動子以及與其可操作相連的重組核酸分子，所述核酸分子編碼修飾的β-伴大豆球蛋白多肽，該多肽在具有氨基酸序列SEQID NO1的未經修飾的β-伴大豆球蛋白多肽中摻入了一或多個選自蘇氨酸，異亮氨酸，色氨酸，纈氨酸，精氨酸，賴氨酸，甲硫氨酸或組氨酸的必需氨基酸的取代，其中所述修飾的β-伴大豆球蛋白多肽能在種子中積累，且其中所述植物是苜蓿，蘋果，香蕉，大麥，菜豆，花椰菜，甘藍，胡蘿卜，蓖麻，芹菜，柑桔，三葉草，椰子，咖啡，玉米(corn)，棉花，黃瓜，道格拉斯冷杉，桉，大蒜，葡萄，亞麻子，火炬松，甜瓜，燕麥，油橄欖，洋蔥，棕櫚，防風，豌豆，花生，胡椒，楊樹，馬鈴薯，蘿卜，Radiata pine，油菜籽，稻，黑麥，高梁，狹葉羽扇豆，Southern pine，菠菜，草莓，甜菜，甘蔗，向日葵，楓香，茶，煙草，番茄，turf，或小麥植物。
本發(fā)明包括并提供了含有轉基因植物的動物飼料，其中，按照5’到3’的方向，包含異源啟動子以及與其可操作相連的重組核酸分子，所述核酸分子編碼修飾的β-伴大豆球蛋白多肽，該多肽在具有氨基酸序列SEQ IDNO1的未經修飾的β-伴大豆球蛋白多肽中摻入了一或多個選自蘇氨酸，異亮氨酸，色氨酸，纈氨酸，精氨酸，賴氨酸，甲硫氨酸或組氨酸的必需氨基酸的取代，其中所述修飾的β-伴大豆球蛋白多肽能在種子中積累，且其中所述植物是苜蓿，蘋果，香蕉，大麥，菜豆，花椰菜，甘藍，胡蘿卜，蓖麻，芹菜，柑桔，三葉草，椰子，咖啡，玉米(corn)，棉花，黃瓜，道格拉斯冷杉，桉，大蒜，葡萄，亞麻子，火炬松，甜瓜，燕麥，油橄欖，洋蔥，棕櫚，防風，豌豆，花生，胡椒，楊樹，馬鈴薯，蘿卜，Radiata pine，油菜籽，稻，黑麥，高梁，狹葉羽扇豆，Southern pine，菠菜，草莓，甜菜，甘蔗，向日葵，楓香，茶，煙草，番茄，turf，或小麥植物。
本發(fā)明包括并提供了含有從轉基因植物種子得到的植物的動物飼料，其中，按照5’到3’的方向，包含異源啟動子以及與其可操作相連的重組核酸分子，所述核酸分子編碼修飾的β-伴大豆球蛋白多肽，該多肽在具有氨基酸序列SEQ ID NO1的未經修飾的β-伴大豆球蛋白多肽中摻入了一或多個選自蘇氨酸，異亮氨酸，色氨酸，纈氨酸，精氨酸，賴氨酸，甲硫氨酸或組氨酸的必需氨基酸的取代，其中所述修飾的β-伴大豆球蛋白多肽能在種子中積累，且其中所述植物是苜蓿，蘋果，香蕉，大麥，菜豆，花椰菜，甘藍，胡蘿卜，蓖麻，芹菜，柑桔，三葉草，椰子，咖啡，玉米(corn)，棉花，黃瓜，道格拉斯冷杉，桉，大蒜，葡萄，亞麻子，火炬松，甜瓜，燕麥，油橄欖，洋蔥，棕櫚，防風，豌豆，花生，胡椒，楊樹，馬鈴薯，蘿卜，Radiata pine，油菜籽，稻，黑麥，高梁，狹葉羽扇豆，Southern pine，菠菜，草莓，甜菜，甘蔗，向日葵，楓香，茶，煙草，番茄，turf，或小麥植物。
本發(fā)明包括并提供了含有從轉基因植物種子得到的植物的人類食物，其中，按照5’到3’的方向，包含異源啟動子以及與其可操作相連的重組核酸分子，所述核酸分子編碼修飾的β-伴大豆球蛋白多肽，該多肽在具有氨基酸序列SEQ ID NO1的未經修飾的β-伴大豆球蛋白多肽中摻入了一或多個選自蘇氨酸，異亮氨酸，色氨酸，纈氨酸，精氨酸，賴氨酸，甲硫氨酸或組氨酸的必需氨基酸的取代，其中所述修飾的β-伴大豆球蛋白多肽能在種子中積累，且其中所述植物是苜蓿，蘋果，香蕉，大麥，菜豆，花椰菜，甘藍，胡蘿卜，蓖麻，芹菜，柑桔，三葉草，椰子，咖啡，玉米(corn)，棉花，黃瓜，道格拉斯冷杉，桉，大蒜，葡萄，亞麻子，火炬松，甜瓜，燕麥，油橄欖，洋蔥，棕櫚，防風，豌豆，花生，胡椒，楊樹，馬鈴薯，蘿卜，Radiata pine，油菜籽，稻，黑麥，高梁，狹葉羽扇豆，Southern pine，菠菜，草莓，甜菜，甘蔗，向日葵，楓香，茶，煙草，番茄，turf，或小麥植物。
本發(fā)明包括并提供了含有轉基因植物的人類食物，其中，按照5’到3’的方向，包含異源啟動子以及與其可操作相連的重組核酸分子，所述核酸分子編碼修飾的β-伴大豆球蛋白多肽，該多肽在具有氨基酸序列SEQ IDNO1的未經修飾的β-伴大豆球蛋白多肽中摻入了一或多個選自蘇氨酸，異亮氨酸，色氨酸，纈氨酸，精氨酸，賴氨酸，甲硫氨酸或組氨酸的必需氨基酸的取代，其中所述修飾的β-伴大豆球蛋白多肽能在種子中積累，且其中所述植物是苜蓿，蘋果，香蕉，大麥，菜豆，花椰菜，甘藍，胡蘿卜，蓖麻，芹菜，柑桔，三葉草，椰子，咖啡，玉米(corn)，棉花，黃瓜，道格拉斯冷杉，桉，大蒜，葡萄，亞麻子，火炬松，甜瓜，燕麥，油橄欖，洋蔥，棕櫚，防風，豌豆，花生，胡椒，楊樹，馬鈴薯，蘿卜，Radiata pine，油菜籽，稻，黑麥，高梁，狹葉羽扇豆，Southern pine，菠菜，草莓，甜菜，甘蔗，向日葵，楓香，茶，煙草，番茄，turf，或小麥植物。
本發(fā)明包括并提供了含有從轉基因植物種子得到的植物的人類食物，其中，按照5’到3’的方向，包含異源啟動子以及與其可操作相連的重組核酸分子，所述核酸分子編碼修飾的β-伴大豆球蛋白多肽，該多肽在具有氨基酸序列SEQ ID NO1的未經修飾的β-伴大豆球蛋白多肽中摻入了一或多個選自蘇氨酸，異亮氨酸，色氨酸，纈氨酸，精氨酸，賴氨酸，甲硫氨酸或組氨酸的必需氨基酸的取代，其中所述修飾的β-伴大豆球蛋白多肽能在種子中積累，且其中所述植物是苜蓿，蘋果，香蕉，大麥，菜豆，花椰菜，甘藍，胡蘿卜，蓖麻，芹菜，柑桔，三葉草，椰子，咖啡，玉米(corn)，棉花，黃瓜，道格拉斯冷杉，桉，大蒜，葡萄，亞麻子，火炬松，甜瓜，燕麥，油橄欖，洋蔥，棕櫚，防風，豌豆，花生，胡椒，楊樹，馬鈴薯，蘿卜，Radiata pine，油菜籽，稻，黑麥，高梁，狹葉羽扇豆，Southern pine，菠菜，草莓，甜菜，甘蔗，向日葵，楓香，茶，煙草，番茄，turf，或小麥植物。
圖1是pMON39328的圖譜。
圖2是pMON39329的圖譜。
圖3是pMON39335的圖譜。
序列描述SEQ ID NO1是野生型大豆(Glycine max)7S-β-伴大豆球蛋白亞單位原蛋白氨基酸序列。
SEQ ID NO2是SEQ ID NO1所示野生型大豆(Glycine max)7S-β-伴大豆球蛋白亞單位原蛋白氨基酸序列，但其中的殘基1-25和416-439未顯示。
SEQ ID NO3 is a wild-type Glycine max 7S-β-伴大豆球蛋白β亞單位的cDNA序列。
SEQ ID NO4是寡核苷酸引物。
SEQ ID NO5是寡核苷酸引物。
SEQ ID NO6是寡核苷酸引物。
SEQ ID NO7是寡核苷酸引物。
SEQ ID NO8是編碼FLAG表位的DNA序列。
SEQ ID NO9是FLAG氨基酸表位序列。
SEQ ID NO10是寡核苷酸引物。
SEQ ID NO11是寡核苷酸引物。
SEQ ID NO12是由pMON39328編碼的β-伴大豆球蛋白β亞單位的表位(FLAG)-標記形式。
SEQ ID NO13是pMON39328中編碼β-伴大豆球蛋白β亞單位的表位(FLAG)-標記形式的核苷酸序列。
SEQ ID NO14是由pMON39329編碼的β-伴大豆球蛋白β亞單位氨基酸序列(加上由起始密碼子編碼的甲硫氨酸)的成熟形式，不帶有FLAG表位。
SEQ ID NO15是pMON39329中編碼不帶有FLAG表位的β-伴大豆球蛋白β亞單位成熟形式的核苷酸序列。
SEQ ID NOs16-83是寡核苷酸引物序列。
SEQ ID NO84是突變體39335-14的編碼序列。
SEQ ID NO85是突變體39335-41的編碼序列。
SEQ ID NO86是突變體39335-58的編碼序列。
SEQ ID NO87是突變體39335-78的編碼序列。
SEQ ID NO88是pMON69616中的核苷酸序列。
SEQ ID NO89是pMON69616的氨基酸序列。
SEQ ID NO90是pMON64016中的核苷酸序列。
SEQ ID NO91是pMON64016的氨基酸序列。
SEQ ID NO92是pMON64015中的核苷酸序列。
SEQ ID NO93是pMON64015的氨基酸序列。
SEQ ID NO94是pMON64019中的核苷酸序列。
SEQ ID NO95是pMON019的氨基酸序列。
SEQ ID NO96是pMON69621中的核苷酸序列。
SEQ ID NO97是pMON69621的氨基酸序列。
定義以下定義可以幫助理解對本發(fā)明的詳細描述。
本文中“序列同一性”是指，兩個最佳比對的多核苷酸或肽序列在諸如核苷酸或氨基酸等組分的整個比對窗中保持一致的程度。測試序列和參考序列的比對片段的“同一性分數”，是將這兩個比對序列共有的相同組分的數目除以參考序列片段(即整個參考序列或該參考序列的一部分)中組分總數得到的?！巴恍园俜直取笔菍⑼恍苑謹党艘?00得到的。
對于一種具體的生物而言，“必需氨基酸”是該生物本身不能合成、因此必需從其膳食中獲得的那些氨基酸。必需氨基酸在不同動物中是不同的，這取決于動物物種，可包括蘇氨酸，異亮氨酸，色氨酸，纈氨酸，精氨酸，賴氨酸，甲硫氨酸，組氨酸，亮氨酸和苯丙氨酸中的一或多種。
“抗原性表位”是指分子、蛋白、或核酸中能激發(fā)免疫應答、從而導致產生與該抗原性表位反應的抗體的任何不連續(xù)的片段。
短語“編碼序列”，“開放讀框”，“結構序列”以及“結構核酸序列”是指一種包含有序排列的核酸的物理結構。所述核酸以一組核酸三聯(lián)體的形式排列，其中每一個三聯(lián)體形成一個密碼子。每一密碼子編碼一種具體的氨基酸。因此，編碼序列、結構序列、和結構核酸序列編碼一系列氨基酸，這些氨基酸形成蛋白、多肽、或肽序列。編碼序列，結構序列，和結構核酸序列可以包含在較大的核酸分子、載體等結構中。此外，這些序列中核酸的有序排列可以用序列表、附圖、附表、電子媒介等形式進行描述。
術語“DNA序列”，“核酸序列”和“核酸分子”是指一種包含有序排列的核酸的物理結構。所述DNA序列或核酸序列可以包含在較大的核酸分子、載體等結構中。此外，這些序列中核酸的有序排列可以用序列表、附圖、附表、電子媒介等形式進行描述。
術語“表達”是指基因轉錄，產生相應的mRNA，并翻譯該mRNA以產生相應的基因產物(即，肽，多肽，或蛋白)。
術語“反義RNA的表達”是指對DNA進行轉錄，從而產生第一種RNA分子，后者能與第二種RNA分子雜交。
術語“基因”是指編碼肽、多肽、蛋白的染色體DNA、質粒DNA、cDNA、合成的DNA、或其它DNA，或者是RNA分子。
“同源性”是指兩個或多個核酸序列或氨基酸序列之間以位置同一性百分比表示的相似性(即，序列相似性或同一性)。
術語“異源”是指兩個或更多個不同來源的核酸序列或蛋白序列之間的關系。例如，啟動子如果在自然界通常的情況中不與編碼序列組合在一起，那么該啟動子相對于該編碼序列是異源的。此外，一個具體序列可以相對于它插入至其中的細胞或生物為“異源”的(即，并非該具體細胞或生物所天然具有的)。
“雜交”是指一條核酸鏈與一條互補鏈通過堿基配對來相連的能力。當兩條核酸鏈中的互補核酸序列在適當條件下彼此相遇，就可發(fā)生雜交。
“核酸”是指脫氧核糖核酸(DNA)以及核糖核酸(RNA)。
“表型”是指基因型與環(huán)境相互作用導致生物表現(xiàn)出的特性。
“聚腺苷酸化信號”或“polyA信號”是指一種核酸，它位于編碼區(qū)的3’側，它能啟動腺苷酸添加在由該編碼區(qū)轉錄的mRNA的3’末端。
術語“可操作相連”是指兩個或更多個核酸區(qū)域或核酸序列的功能性空間排列。例如，啟動子區(qū)相對于核酸序列的位置可以使該核酸序列在該啟動子區(qū)的指導下進行轉錄。此時，該啟動子區(qū)與該核酸序列“可操作相連”。
術語“啟動子”或“啟動子區(qū)”是指通常發(fā)現(xiàn)于編碼序列上游(5’)的、能指導該核酸序列轉錄為mRNA的一種核酸序列。啟動子或啟動子區(qū)通常提供RNA聚合酶的識別位點以及轉錄的正確起始所需的其它因子。本文中，啟動子或啟動子區(qū)包括通過插入或缺失調節(jié)區(qū)，對啟動子進行隨機或定點誘變等方式而進行改變的啟動子。啟動子的活性或強度如下測量將其在細胞或組織中產生的RNA的量，或積累的蛋白的量，與已經評估過轉錄活性的啟動子進行比較。
術語“重組核酸載體”和“重組載體”是指諸如質粒，粘粒，病毒，自我復制序列，噬菌體，線性單鏈、環(huán)狀單鏈、線性雙鏈、或環(huán)狀雙鏈DNA或RNA核苷酸序列等任何物質。重組載體可以來自任何來源，它能進行基因組整合或自我復制，它包含與一或多個核酸序列可操作相連的啟動子核酸序列。重組載體通常用于將所述可操作相連的序列引入適當的宿主。
“再生”是指從植物細胞或植物組織(例如植物原生質體或外植體)生長成植物的過程。
“選擇標記”是指一種核酸序列，其表達導致的表型有利于鑒定包含該核酸序列的細胞。選擇標記包括賦于對毒性化合物的抗性(例如，氨芐青霉素抗性，卡那霉素抗性)的那些，能彌補營養(yǎng)缺陷的那些(例如，尿嘧啶，組氨酸，亮氨酸)，或者帶來可以觀察的區(qū)別性特征的那些(例如，顏色改變或熒光)。
“轉錄”是指從DNA模板產生RNA拷貝的過程。
“轉基因”是指整合了外源核酸序列的生物。
“載體”是指將外源DNA帶入宿主生物中的質粒，粘粒，噬菌體或病毒。
“調節(jié)序列”是指位于編碼序列上游(5’)、內部或下游(3’)的核苷酸序列。編碼序列的轉錄和表達通常受到調節(jié)序列存在與否的影響。
術語“充分同源”(substantially homologous)是指，用本文所述BestFit程序(版本10；Genetics Computer Group，Inc.，University of WisconsinBiotechnology Center，Madison，WI)以默認參數測定，序列同一性至少90％的兩個序列。
術語“轉化”是指將核酸引入受體宿主的過程。術語“宿主”是指細菌細胞，真菌，動物或動物細胞，植物或種子，或植物的任何部分或組織，包括原生質體，愈傷組織，根，塊莖，種子，莖，葉，幼苗，胚和花粉。
本文中術語“轉基因植物”是指一種植物，其中所引入的核酸已經穩(wěn)定引入該植物的基因組，例如，核基因組或質體基因組中。
本文中術語“基本純”(substantially purified)是指一種分子，它與自然狀態(tài)下通常與它相伴的基本上所有其它分子分開。更優(yōu)選基本純的分子是制劑中的優(yōu)勢種類?；炯兊姆肿涌梢允羌s60％以上，優(yōu)選約75％以上，更優(yōu)選約90％以上，最優(yōu)選約95％以上與天然混合物中其它分子(除了溶劑以外)脫離。術語“基本純”并不想涵蓋處于天然狀態(tài)的分子。
具體實施方案本發(fā)明包括并提供鏈包含更高水平的必需氨基酸的修飾多肽，其應用方法，設計方法和制備方法。所述修飾多肽的特征在于，與改造前的未修飾多肽相比，營養(yǎng)含量增加。
多肽序列本發(fā)明包括并提供鏈一種修飾的多肽，它所包含的必需氨基酸的水平提高。所述修飾多肽的特征在于，與未修飾的多肽相比，營養(yǎng)含量增加。所述修飾的多肽通常在未修飾多肽的氨基酸序列中添加或取代鏈至少一個必需氨基酸。所述必需氨基酸選自蘇氨酸，異亮氨酸，色氨酸，纈氨酸，精氨酸，賴氨酸，甲硫氨酸，或組氨酸。在一個優(yōu)選實施方案中，所述修飾的多肽通常在未修飾多肽的氨基酸序列中取代至少一個必需氨基酸。在一個更優(yōu)選的實施方案中，所述修飾的多肽通常在未修飾多肽的氨基酸序列中取代至少一個色氨酸或異亮氨酸殘基。
本文中氨基酸的“取代”是指，將蛋白質中的一種氨基酸用另一種氨基酸代替。故“取代”不改變所修飾的蛋白質中氨基酸的總數。在一個優(yōu)選實施方案中，所修飾的多肽能在細胞中積累。在另一實施方案中，所修飾的多肽能在種子中積累。本文中“在種子中積累”或者“在細胞中積累”是指，該多肽在種子或細胞中產生和維持的速度大于被降解的速度。在另一個優(yōu)選實施方案中，所修飾的多肽能形成三聚體。本文中，當一種蛋白在細胞環(huán)境中被翻譯時能自我裝配并三聚體化，則該蛋白“能形成三聚體”。在一個優(yōu)選實施方案中，所修飾的多肽的三聚體化水平是未修飾的多肽的三聚體化水平的10％，更優(yōu)選20，30，40，50，60，70，80，90，95，和99％，如下文的實施例6所測定的那樣。
修飾的多肽通?？梢允沁m合于摻入動物膳食中的任何多肽。這種多肽優(yōu)選選自，在給定的植物組織中以相對較高濃度表達的多肽，如種子貯藏蛋白， 營養(yǎng)貯藏蛋白，酶，或結構蛋白。修飾的多肽更優(yōu)選修飾的β-伴大豆球蛋白，大豆球蛋白，7S貯藏球蛋白，11S貯藏球蛋白，清蛋白，谷醇溶蛋白，arcelin，或豆血紅蛋白多肽。
在本發(fā)明的一個實施方案中，修飾的多肽在相對于未修飾多肽而言的至少1個，更優(yōu)選2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，30，35，40，45，或50個氨基酸位置具有賴氨酸殘基取代。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，修飾的多肽在相對于未修飾多肽而言的至少1個，更優(yōu)選2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，30，35，40，45，或50個氨基酸位置具有甲硫氨酸殘基取代。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，修飾的多肽在相對于未修飾多肽而言的至少1個，更優(yōu)選2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，30，35，40，45，或50個氨基酸位置具有蘇氨酸殘基取代。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，修飾的多肽在相對于未修飾多肽而言的至少1個，更優(yōu)選2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，30，35，40，45，或50個氨基酸位置具有纈氨酸殘基取代。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，修飾的多肽在相對于未修飾多肽而言的至少1個，更優(yōu)選2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，30，35，40，45，或50個氨基酸位置具有精氨酸殘基取代。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，修飾的多肽在相對于未修飾多肽而言的至少1個，更優(yōu)選2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，30，35，40，45，或50個氨基酸位置具有組氨酸殘基取代。
在一個優(yōu)選實施方案中，修飾的多肽在相對于未修飾多肽而言的至少1個，更優(yōu)選2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，30，35，40，45，或50個氨基酸位置具有色氨酸殘基取代。
在一個優(yōu)選實施方案中，修飾的多肽在相對于未修飾多肽而言的至少1個，更優(yōu)選2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，30，35，40，45，或50個氨基酸位置具有異亮氨酸殘基取代。
在一個更優(yōu)選方面，修飾的多肽是β-伴大豆球蛋白多肽(SEQ ID NO1)，且該多肽在未修飾的β-伴大豆球蛋白序列(SEQ ID NO1，未顯示出末端時就是SEQ ID NO2)中，選自N32；Y35；N40；N50；Y72；H88；Y116；H119；Y132；Y133；P137；Y158；Y172；E200；P239；Y249；P265；P324；Y330；Y346；N368；或Y411的至少1個，更優(yōu)選2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，或22個氨基酸位置，具有必需氨基酸色氨酸的取代。
修飾的多肽優(yōu)選是β-伴大豆球蛋白多肽(SEQ ID NO1)，且該多肽在未修飾的β-伴大豆球蛋白序列(SEQ ID NO1，未顯示出末端時就是SEQ IDNO2)中至少兩個，更優(yōu)選選自N32；L36；F46；G51；L56；F59；Q65；L66；Y72；R73；V75；Q76；L85；H88；F94；L95；L96；F97；V98；L99；R102；L105；L107；N117；L118；D121；Q124；R125；P127；Y132；Y133；L134；V135；P137；L143；K147；L148；P151；Y158；F162；Q169；L173；L181；V209；P239；F240；P247；F256；E258；T264；P265；L267；F273；L274；L285；L286；H288；N290；V295；L297；V298；N300；L308；V309；K317；K319；P324；L334；V339；F340；V341；Y346；F348；V350；L356；F358；L359；F361；N368；F372；F393；Y411；F412；或V413的至少2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，或74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，或84個氨基酸位置，具有必需氨基酸異亮氨酸的取代。
在一個優(yōu)選實施方案中，所述修飾的多肽被進一步修飾，從而至少一種，更優(yōu)選2，3或4種選自組氨酸，賴氨酸，甲硫氨酸或苯丙氨酸的必需氨基酸的含量增加。也可以產生其它氨基酸取代，以便能增強該多肽的結構和營養(yǎng)。
在本發(fā)明另一個優(yōu)選實施方案中，修飾的多肽在未修飾的β-伴大豆球蛋白序列中，選自N32；Y35；N40；N50；Y72；H88；Y116；H119；Y132；Y133；P137；Y158；Y172；E200；P239；Y249；P265；P324；Y330；Y346；N368；或Y411的至少1個，更優(yōu)選2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，或22個氨基酸位置，具有必需氨基酸色氨酸的取代，并且在未修飾的β-伴大豆球蛋白序列中，選自N32；L36；F46；G51；L56；F59；Q65；L66；Y72；R73；V75；Q76；L85；H88；F94；L95；L96；F97；V98；L99；R102；L105；L107；N1 17；L118；D121；Q124；R125；P127；Y132；Y133；L134；V135；P137；L143；K147；L148；P151；Y158；F162；Q169；L173；L181；V209；P239；F240；P247；F256；E258；T264；P265；L267；F273；L274；L285；L286；H288；N290；V295；L297；V298；N300；L308；V309；K317；K319；P324；L334；V339；F340；V341；Y346；F348；V350；L356；F358；L359；F361；N368；F372；F393；Y411；F412；或V413的至少1個，更優(yōu)選至少2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，或74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，或84個氨基酸位置，具有必需氨基酸異亮氨酸的取代。
在一個優(yōu)選方面，修飾的β-伴大豆球蛋白多肽相對于未修飾的β-伴大豆球蛋白多肽包含一或多個必需氨基酸取代。在一個更優(yōu)選的方面，修飾的β-伴大豆球蛋白多肽包括兩個或更多個必需氨基酸取代，其中所述必需氨基酸是色氨酸和異亮氨酸。在一個優(yōu)選方面，修飾的多肽具有至少1個，更優(yōu)選2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，101，102，103，104，105，106個色氨酸或異亮氨酸取代，為任意組合，其中色氨酸取代是N32；Y35；N40；N50；Y72；H88；Y116；H119；Y132；Y133；P137；Y158；Y172；E200；P239；Y249；P265；P324；Y330；Y346；N368；和Y411中的一個或更多個，異亮氨酸取代是N32；L36；F46；G51；L56；F59；Q65；L66；Y72；R73；V75；Q76；L85；H88；F94；L95；L96；F97；V98；L99；R102；L105；L107；N117；L1 18；D121；Q124；R125；P127；Y132；Y133；L134；V135；P137；L143；K147；L148；P151；Y158；F162；Q169；L173；L181；V209；P239；F240；P247；F256；E258；T264；P265；L267；F273；L274；L285；L286；H288；N290；V295；L297；V298；N300；L308；V309；K3 1 7；K319；P324；L334；V339；F340；V341；Y346；F348；V350；L356；F358；L359；F361；N368；F372；F393；Y411；F412；和V413中的一個或更多個。
修飾的多肽還可以進一步修飾以便提供額外的所需特性。例如，修飾的多肽可以通過進一步修飾而增加其它必需氨基酸的含量，增強氨基酸序列的翻譯，改變翻譯后修飾(例如，磷酸化或糖基化位點)，將該多肽轉運到細胞內側或外側的空間中，插入或刪除細胞信號傳遞基元，等。
在本發(fā)明另一個實施方案中，修飾的多肽在相對于未修飾多肽的至少1個，更優(yōu)選至少2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，約30，約35，約40，約45，或約50個氨基酸位置，具有選自異亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸、色氨酸、纈氨酸、精氨酸或組氨酸的一個或更多個，兩個或更多個，或者三個或更多個氨基酸殘基的取代。
在一個優(yōu)選實施方案中，修飾的蛋白與未修飾的多肽相比，蘇氨酸，異亮氨酸，色氨酸，纈氨酸，或精氨酸，或它們的任意組合，的含量增加超過0.25％，0.5％，1％，2％，3％，5％，7％，10％，15％或20％(重量比)。
在一個優(yōu)選實施方案中，修飾的β-伴大豆球蛋白多肽未修飾的β-伴大豆球蛋白多肽相比，蘇氨酸，異亮氨酸，色氨酸，纈氨酸，或精氨酸，或它們的任意組合，的含量增加超過0.25％，0.5％，1％，2％，3％，5％，7％，10％，15％或20％(重量比)。
核酸分子本發(fā)明包括并提供一種編碼本發(fā)明修飾多肽的重組核酸分子，所述多肽的必需氨基酸水平增加。
核酸雜交是DNA操作領域技術人員已知的技術。一對具體核酸的雜交特性可指示它們的相似性或同一性。
核酸分子優(yōu)選在低度、中度、或高度嚴格條件下，與本發(fā)明的任何核酸序列雜交。
雜交條件通常包括在0.1X-約10X SSC(由含有3M氯化鈉和0.3M檸檬酸鈉，pH 7.0的20X SSC原液用蒸餾水稀釋而成)，約2.5X-約5XDenhardt溶液(由含有1％(w/v)牛血清白蛋白，1％(w/v)ficoll，和1％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮的50X原液用蒸餾水稀釋而成)，約10mg/mL-約100mg/mL魚精DNA，以及約0.02％(w/v)-約0.1％(w/v)SDS中進行核酸雜交，于大約20℃-大約70℃保溫數小時到保溫過夜。優(yōu)選雜交條件為6X SSC，5XDenhardt溶液，100mg/mL魚精DNA，和0.1％(w/v)SDS，55℃保溫數小時。
雜交之后通常進行數個洗滌步驟。洗滌組合物通常包含0.1X-約10XSSC，以及0.01％(w/v)-約0.5％(w/v)SDS，約20℃-約70℃保溫15分鐘。優(yōu)選地，當在0.1X SSC中65℃洗滌至少一次以后，核酸片段仍保持雜交。例如，洗滌步驟中的鹽濃度可以從低度嚴格條件的約2.0X SSC、50℃到約高度嚴格條件的0.2X SSC、65℃中選擇。此外，洗滌步驟中的溫度可以從低度嚴格條件的室溫，約22℃，增加到高度嚴格條件的約65℃。溫度和鹽都可以變動，也可以使溫度和鹽濃度這二者之一保持恒定而改變另一個。
低度嚴格條件可用于選擇與靶核酸序列的序列同一性較低的核酸序列?？梢圆捎弥T如如下的條件進行洗滌約6.0X SSC-約10X SSC、約20℃-約55℃，優(yōu)選核酸分子在約6.0X SSC和約45℃的低度嚴格條件下與本發(fā)明的一或多種核酸分子雜交。在一個優(yōu)選實施方案中，核酸分子在約2.0X SSC和約65℃的中度嚴格條件下與本發(fā)明的一或多種核酸分子雜交。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的核酸分子在約0.2X SSC和約65℃的高度嚴格條件下與上述核酸分子雜交。
本發(fā)明的核酸序列優(yōu)選與編碼本文所述任何多肽，其互補序列，或其任意片段的互補核酸序列雜交。
本發(fā)明的核酸序列優(yōu)選在低度嚴格條件下，與編碼本文所述任何多肽，其互補序列，或其任意片段的互補核酸序列雜交。
本發(fā)明的核酸序列優(yōu)選在高度嚴格條件下，與編碼本文所述任何多肽，其互補序列，或其任意片段的互補核酸序列雜交。
序列同一性百分比優(yōu)選用Sequence Analysis Software PackageTM(版本10；Genetics Computer Group，Inc.，University of Wisconsin BiotechnologyCenter，Madison，WI)的“Best Fit”或“Gap”程序來確定?！癎ap”是利用Needleman和Wunsch的算法(Needleman和Wunsch，1970)來找出兩個序列的對比排列，它使匹配數最大并使空隙數最小?！癇estFit”是對兩個序列之間的最相似片段進行最佳對比排列，它還利用Smith和Waterman的局部同源性算法(Smith和Waterman，1981；Smith等，1983)插入空隙以便使匹配數最大。同一性百分比最優(yōu)選用“Best Fit”程序及其默認參數來確定。
在一個實施方案中，所述片段為本發(fā)明核酸分子的3000-1000個連續(xù)核苷酸，1800-150個連續(xù)核苷酸，1500-500個連續(xù)核苷酸，1300-250個連續(xù)核苷酸，1000-200個連續(xù)核苷酸，800-150個連續(xù)核苷酸，500-100個連續(xù)核苷酸，300-75個連續(xù)核苷酸，100-50個連續(xù)核苷酸，50-25個連續(xù)核苷酸，或20-10個連續(xù)核苷酸。
在另一實施方案中，所述片段包含本發(fā)明核酸序列的至少20，30，40或50個連續(xù)核苷酸。
啟動子在一個優(yōu)選實施方案中，本文所公開的任何一種核酸分子可以與啟動子可操作相連。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，啟動子選自11S大豆球蛋白啟動子，USP蠶豆(Vicia faba)啟動子，或7Sα啟動子。在另一個實施方案中，啟動子具有組織或器官特異性，優(yōu)選種子特異性。
在一個方面，如果mRNA在一種組織或器官中的表達水平比在另一種組織或器官中的表達水平高出至少10倍，優(yōu)選至少約100倍或至少約1,000倍，則認為該啟動子是特異于該組織或器官的。mRNA的水平可以在單個時間點測量，也可以在多個時間點測量，從而倍數增加可以是平均倍數增加，或者是從實驗測量值外推得到的值。由于這是水平的比較，因此可以使用任何測量mRNA的方法。在一個優(yōu)選方面，進行比較的組織或器官是種子或帶有葉片或葉片組織的種子組織。在另一個優(yōu)選方面，對多個組織或器官進行比較。優(yōu)選的多重比較是將種子或種子組織與選自下組的二、三、四或更多種組織或器官進行比較花組織，花原端，花粉，葉，胚，苗，葉原基，苗端，根，根尖，維管組織和子葉。本文中植物器官的例子是，種子，葉，根等，組織的例子是葉原基，苗端，維管組織等。
啟動子的活性或強度可用mRNA的量或該RNA所特別產生的蛋白的積累量相對于mRNA或蛋白的總量來定量。所述啟動子優(yōu)選表達可操作連接的核酸序列，其水平占總mRNA的2.5％以上；更優(yōu)選占5，6，7，8，或9％以上；還更優(yōu)選占10，11，12，13，14，15，16，17，18，或19％以上；最優(yōu)選占20％以上。
或者，啟動子的活性或強度可表示為已知啟動子(其轉錄活性已經過評估)的相對量。例如，可將目標啟動子與報告序列(例如，GUS)可操作相連，并將其引入特定類型的細胞。用類似方法制備已知啟動子，將其引入相同的細胞內環(huán)境中。通過比較相對于已知啟動子而言的報告分子表達量，可確定目標啟動子的轉錄活性。細胞內環(huán)境優(yōu)選大豆。
修飾的結構核酸序列本發(fā)明的核酸還可與異源的修飾型結構核酸序列相連?？梢詫Y構核酸序列進行修飾，以便提供各種所需特性。例如，可以對結構核酸序列進行修飾以增加必需氨基酸的含量，促進對氨基酸序列的翻譯，改變翻譯后修飾(例如，磷酸化位點)，將翻譯出的產物轉運至細胞的內側或外側的空間中，增加蛋白的穩(wěn)定性，插入或刪除細胞信號傳遞基序，等等。
核酸序列中的密碼子應用特點由于遺傳密碼的簡并性，可以用不同的核苷酸密碼子編碼給定的氨基酸。宿主細胞常常表現(xiàn)出優(yōu)選的密碼子應用模式。優(yōu)選結構核酸序列經過構建能利用具體宿主細胞的密碼子應用模式。這通常能增強該結構核酸序列在轉化的宿主細胞中的表達?？蓪ι鲜鋈我环N核酸和氨基酸序列進行修飾，以反映容納它們的宿主細胞或生物所優(yōu)選的密碼子應用特性。在植物中修飾結構核酸序列，使密碼子應用最優(yōu)化的方法可參見美國專利5,689,052。
對結構核酸序列的其它修飾上述結構核酸序列中的其它變化可編碼出與改造前的蛋白相比等效或更優(yōu)秀的蛋白。突變包括對基序序列進行缺失，插入，截短，取代，融合，改組等。
對結構核酸序列的突變可通過特定方式或隨機方式引入，這兩種方式都是分子生物學領域技術人員已知的。定點誘變技術有很多種，它們通常利用寡核苷酸將突變引入結構核酸序列中的特定位置。實例包括單鏈拯救(Kunkel等，1985)，唯一位點的消除(Deng和Nickloff，1992)，切口(nick)保護(Vandeyar等，1988)，及PCR(Costa等，1996)。隨機或非特異性突變可通過化學試劑產生(綜述參見，Singer和Kusmierek，1982)，如亞硝基胍(Cerda-Olmedo等，1968；Guerola等，1971)和2-氨基嘌呤(Rogan和Bessman，1970)；或通過生物學方法產生，如由突變株傳代(Greener等，1997)。
對核酸序列的修飾可以導致或不導致氨基酸序列中的改變。由于遺傳密碼簡并性導致的改變不影響改變后的密碼子所編碼的氨基酸。在一個優(yōu)選實施方案中，編碼修飾蛋白的核酸有5-500個這樣的改變，更優(yōu)選10-300個改變，還更優(yōu)選25-150個改變，最優(yōu)選1-25個改變。在另一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明核酸分子包括與如此修飾的核酸分子有80，85，90，95或99％的序列同一性的那些核酸分子。在另一實施方案中，本發(fā)明的核酸分子包括與如此修飾的核酸分子雜交的那些核酸分子，以及在低度或高度嚴格條件下與如此修飾的核酸分子雜交的那些核酸分子。
第二種改變包括在核酸序列中進行添加、刪除和取代，它們可導致改變氨基酸序列。在一個優(yōu)選實施方案中，編碼修飾蛋白的核酸有5-500個這樣的改變，更優(yōu)選10-300個改變，還更優(yōu)選25-150個改變，最優(yōu)選1-25個改變。在另一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明核酸分子包括與如此修飾的核酸分子有80，85，90，95或99％的序列同一性的那些核酸分子。在另一實施方案中，本發(fā)明的核酸分子包括與如此修飾的核酸分子雜交的那些核酸分子，以及在低度或高度嚴格條件下與如此修飾的核酸分子雜交的那些核酸分子。
產生上述改變的其它方法參見Ausubel等(1995)；Bauer等(1985)；Craik(1985)；Frits Eckstein等(1982)；Sambrook等(1989)；Smith等(1981)；Osuna等(1994)。
可以對本發(fā)明的蛋白序列以及編碼它們的核酸節(jié)段進行修飾但保留所述分子的所需特性。以下是關于對蛋白的氨基酸序列進行改變來產生等效，或者可能更優(yōu)良的第二代分子的討論。氨基酸改變可以通過改變結構核酸序列的密碼子來實現(xiàn)，密碼子參見表1。
表1氨基酸的密碼子簡并性
可以在不明顯損失所需活性的前題下，將蛋白序列中特定的氨基酸取代為其它氨基酸。從這一點上來看，可以在所公開的蛋白序列的肽序列，或它們的相應核酸序列中進行多種改變而不明顯損失生物活性。
在制造這類改變時，可考慮氨基酸的疏水/親水傾向性指數。氨基酸的疏水/親水傾向性指數在賦于蛋白質以交互式生物功能方面的重要性已為領域內廣泛理解(Kyte和Doolittle，1982)?？梢越邮艿氖?，氨基酸的相對疏水/親水傾向性決定所得蛋白的二級結構，而后者又限定了該蛋白與其它分子，如酶，底物，受體，DNA，抗體，抗原等的相互作用。
每種氨基酸基于其疏水性和荷電特性而分配了一個疏水/親水傾向性指數。具體是異亮氨酸(+4.5)；纈氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/半胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；蘇氨酸(-0.7)；絲氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；組氨酸(-3.2)；谷氨酸/谷氨酰胺/天冬氨酸/天冬酰胺(-3.5)；賴氨酸(-3.9)；精氨酸(-4.5)。
本領域已知，特定氨基酸可以被具有相似疏水/親水傾向性指數或評分的其它氨基酸取代，所得蛋白質仍具有相似的生物活性，即，仍能獲得生物功能性蛋白。在制造這類改變時，疏水/親水傾向性指數在±2以內的氨基酸的取代為優(yōu)選，在±1以內的為更優(yōu)選，在±0.5以內的為最優(yōu)選。
本領域也能理解，可以在親水性的基礎上有效地進行相似氨基酸的取代。美國專利4,554,101(Hopp，T.P，1985年11月19日授權)稱，一種蛋白質上受其鄰接氨基酸的親水性控制的最大局部平均親水性與該蛋白的生物學特性相關。氨基酸的親水值如下精氨酸/賴氨酸(+3.0)；天冬氨酸/谷氨酸(+3.0±1)；絲氨酸(+0.3)；天冬酰胺/谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；蘇氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸/組氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；纈氨酸(-1.5)；亮氨酸/異亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。
可理解，一種氨基酸可以被具有相似的親水評分值的另一種氨基酸取代，所得蛋白質仍具有相似的生物活性，即，仍能獲得生物功能性蛋白。在制造這類改變時，疏水/親水傾向性指數在±2以內的氨基酸的取代為優(yōu)選，在±1以內的為更優(yōu)選，在±0.5以內的為最優(yōu)選。
綜上所述，氨基酸取代因此是基于氨基酸側鏈取代基的相對相似性，例如，它們的疏水性，親水性，電荷，大小，等等。涉及上述多種特性的取代實例為本領域眾所周知，它們包括精氨酸和賴氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；絲氨酸和蘇氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；纈氨酸，亮氨酸，和異亮氨酸。對于不能預計有利的那些改變，如果能使所得的蛋白質與原始未經改造的多肽相比，瘤胃抗性增強和/或對蛋白裂解性降解作用的抗性增強，則也可以使用。
重組載體上述任何啟動子和結構核酸序列都可提供在重組載體中。重組載體通常按5’至3’方向依次包含能指導結構核酸序列轉錄的啟動子，以及結構核酸序列。重組載體還可根據需要而包含3’轉錄終止子，3’聚腺苷酸化信號，其它非翻譯核酸序列，轉位及靶向核酸序列，選擇標記，增強子，和操縱子。
制備重組載體的方式為本領域已知。制備特別適于植物轉化的重組載體的方法可參見美國專利4,971,908，4,940,835，4,769,061和4,757,011。對這些類型的載體已有綜述(Rodriguez等，1988；Glick等，1993)。
用于在高等植物中進行核酸表達的典型載體為本領域已知，包括來自根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的腫瘤誘導(Ti)質粒的載體(Rogers等，1987)。其它可用于植物轉化的重組載體，包括pCaMVCN轉移控制載體，也已有記載(Fromm等，1985)。
重組載體中的附加啟動子重組載體中還可提供一個或更多個附加啟動子。這些啟動子可以，例如，但不限于，與上述任何結構核酸序列可操作相連。或者，所述啟動子可與其它核酸序列，如編碼轉位肽、選擇標記蛋白的那些序列、或反義序列，可操作相連。
這些附加啟動子可根據載體所要插入的細胞的類型來選擇。在細菌、酵母和植物中具有功能的啟動子為本領域已知。附加的啟動子還可以根據它們的調節(jié)特性來選擇。這些特性的實例包括對轉錄活性、誘導能力、組織特異性、以及發(fā)育階段特異性的強化作用。已有文獻描述了植物中的誘導型啟動子，病毒來源的或合成的啟動子，組成型啟動子，時間調節(jié)型啟動子，以及空間調節(jié)型啟動子(Poszkowski等，1989；Odell等，1985；Chau等，1989)。
常用的組成型啟動子包括CaMV 35S啟動子(Odell，J.T.等，1985)，增強型CaMV 35S啟動子，玄參花葉病毒(FMV)啟動子(Richins等，1987)，甘露氨酸合成酶(mas)啟動子，胭脂氨酸合成酶(nos)啟動子，以及章魚氨酸合成酶(ocs)啟動子。
有用的誘導型啟動子包括由水楊酸或聚丙烯酸誘導的啟動子(PR-1；Williams，S.W.等，1992)，由于應用安全劑而誘導的啟動子(取代的苯磺酰胺除草劑；Hershey and Stoner.，1991)，熱休克啟動子(Ou-Lee等，1986；Ainley等，1990)，來源于菠菜亞硝酸根還原酶結構核酸序列的硝酸根誘導型啟動子(Back等，1991)，激素誘導型啟動子(Yamaguchi-Shinozaki等，1990；Kares等，1990)，與RuBP羧化酶和LHCP家族的小亞單位結合的光誘導型啟動子(Kuhlemeier等，1989；Feinbaum等，1991；Weisshaar等，199l；Lam and Chua，1990；Castresana等，1988；Schulze-Lefert等，1989)。
有用的組織特異性或器官特異性啟動子的實例包括β-伴大豆球蛋白7Sα’啟動子(Doyle，J.J.等，1986；Slighton and Beachy，1987)，和其它種子-特異性啟動子(Knutzon等，1992；Bustos等，1991；Lam and Chua，1991；Stayton等，1991)?？捎糜谠诜N子質體中優(yōu)先表達的植物功能性啟動子，包括來自植物貯藏蛋白的啟動子，以及來自與含油種子中脂肪酸生物合成有關的蛋白的啟動子。這類啟動子的實例包括下列結構核酸序列的5’調節(jié)區(qū)napin(Kridl等，1991)，菜豆蛋白，玉米醇溶蛋白，大豆胰蛋白酶抑制劑，ACP，硬脂酰-ACP去飽和酶，和油質蛋白。對種子-特異性調節(jié)作用的描述可參見EP 0 255 378。
另一例種子特異性啟動子是凝集素啟動子。大豆種子中的凝集素蛋白由單個結構核酸序列(Lel)編碼，該序列僅在種子成熟期表達。凝集素結構核酸序列和種子特異性啟動子已被鑒定出，并用于指導轉基因煙草植物中的種子特異性表達(Vodkin等，1983；Lindstrom等，1990)。
重組載體中特別優(yōu)選的附加啟動子包括攜帶在根癌土壤桿菌腫瘤誘導質粒上的胭脂氨酸合成酶(nos)啟動子，甘露氨酸合成酶(mas)啟動子，以及章魚氨酸合成酶(ocs)啟動子；花椰菜花葉病毒(CaMV)19S和35S啟動子；增強型CaMV 35S啟動子；玄參花葉病毒(FMV)35S啟動子；核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(ssRUBISCO)小亞單位的光誘導型啟動子；煙草EIF4A啟動子(Mandel等，1995)；谷物蔗糖合成酶1(Yang和Russell，1990)；谷醇脫氫酶1(Vogel等，1989)；谷物光收獲復合物(Simpson，1986)；谷物熱休克蛋白(Odell等，1985)；擬南芥殼多糖酶啟動子(Samac等，1991)；花椰菜LTP(脂轉移蛋白)啟動子(Pyee等，1995)；矮牽牛查耳酮異構酶(Van Tunen等，1988)；菜豆甘氨酸富集蛋白1(Keller等，1989)；土豆patatin(Wenzler等，1989)；玉米遍在蛋白啟動子(Christensen等，1992)；以及水稻肌動蛋白啟動子(McElroy等，1990)。
附加啟動子優(yōu)選具有種子選擇性，組織選擇性，為組成型或誘導型。最優(yōu)選的啟動子為胭脂氨酸合成酶(nos)，章魚氨酸合成酶(ocs)，甘露氨酸合成酶(mas)，花椰菜花葉病毒19S和35S(CaMV19S，CaMV35S)，增強型CaMV(eCaMV)，核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(ssRUBISCO)，玄參花葉病毒(FMV)，CaMV衍生的AS4，煙草RB7，小麥POX1，煙草EIF-4，凝集素蛋白(Lel)，或水稻RC2的啟動子。
帶有附加的結構核酸序列的重組載體重組載體還可包含一或多個附加的結構核酸序列。這些附加結構核酸序列通常為適于在重組載體中使用的任何序列。這樣的結構核酸序列包括，但不限于，上述任一種結構核酸序列及其修飾形式。附加結構核酸序列還可與上述任一種啟動子可操作相連。所述一或多個結構核酸序列可分別與不同(separate)啟動子可操作相連?；蛘?，多個結構核酸序列可與單個啟動子可操作相連(即，單個操縱子)。
附加結構核酸序列優(yōu)選編碼種子貯藏蛋白，除草劑抗性蛋白，疾病抗性蛋白，脂肪酸生物合成酶，維生素E生物合成酶，氨基酸生物合成酶，或殺蟲蛋白。優(yōu)選的結構核酸序列包括，但不限于，γ甲基轉移酶、葉綠基異戊烯轉移酶、β-酮脂酰-CoA合酶、脂酰CoA還原酶、脂酰CoA脂醇轉酰酶、鄰氨基苯甲酸合酶、蘇氨酸脫氨酶、乙酰羥酸合成酶、天冬氨酸激酶、二羥酸合成酶、天冬氨酸激酶、二氫吡啶甲酸合成酶、硫酯酶、7Sa種子貯藏蛋白、11S種子貯藏蛋白、大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白、菜豆蛋白、玉米球蛋白-1、玉米醇溶蛋白、種子清蛋白、或種子凝集素。
或者，可將第二種結構核酸序列設計成能下調特定的核酸序列。這通常通過將第二種結構氨基酸按照反義方向與啟動子可操作相連來實現(xiàn)。本領域技術人員很熟悉這類反義技術。該方法也已在上文中簡述。任何核酸序列都可能以這種方式進行負調節(jié)。優(yōu)選的目標核酸序列包含低含量的必需氨基酸、但在特定組織中以相對較高水平表達。例如，β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白都在種子中大量表達，但在營養(yǎng)方面缺少必需氨基酸。這種反義方法也可用于有效除去植物來源的食物中其它不想要的蛋白，如拒食劑(例如，凝集素)，清蛋白，和變應原。
選擇標記重組載體還可包含選擇標記。能用作選擇標記的核酸序列產生細胞表型，使這些細胞比不含該標記的細胞更容易被鑒定。
選擇標記的實例包括，但不限于neo基因(Potrykus等，1985)，它編碼卡那霉素抗性基因，可用卡那霉素，G418等進行篩選；bar基因，它編碼bialaphos抗性；突變的EPSP合成酶基因(Hinchee等，1988)，它編碼草甘膦抗性；腈水解酶基因，它賦予對溴苯腈的抗性(Stalker等，1988)；突變的乙酰乳酸合成酶基因(ALS)，它賦予對咪唑啉酮或磺脲的抗性(歐洲專利申請0154204)；綠色熒光蛋白(GFP)；以及氨甲喋呤抗性DHFR基因(Thillet等，1988)。
選擇標記的其它實例包括β-葡萄糖醛酸糖苷酶或uidA基因(GUS)，它編碼一種酶，該酶的多種顯色底物是已知的(Jefferson(I)，1987；Jefferson(II)等，1987)；一種R-座基因，它編碼一種產物，該產物調節(jié)植物組織中花色素苷(紅色)的產生(Dellaporta等，1988)；β-內酰胺酶基因(Sutcliffe等，1978)，它編碼一種酶，該酶的多種顯色底物是已知的(例如，PADAC，一種顯色的頭孢菌素)；螢光素酶基因(Ow等，1986)；xy1E基因(Zukowsky等，1983)，它編碼一種兒茶酚雙加氧酶，此酶可轉化顯色型兒茶酚；α-淀粉酶基因(Ikatu等，1990)；酪氨酸酶基因(Katz等，1983)，它編碼一種能將酪氨酸氧化為DOPA和多巴醌(dopaquinone，進一步濃縮為黑色素)的酶；α-半乳糖苷酶，可使α-半乳糖底物顏色發(fā)生轉變。
術語“選擇標記”還包括編碼選擇標記的基因，所述選擇標記是指其檢測可作為鑒定或篩選轉化細胞的手段的那些。實例包括編碼可通過抗體相互作用予以鑒定的分泌型抗原的標記物，或甚至可通過催化檢測的分泌型酶。分泌型選擇標記蛋白可分為數類，包括可通過(例如，ELISA)檢測的小分子可擴散型蛋白，可在胞外溶液中檢測到的小分子活性酶(例如，α-淀粉酶，β-內酰胺酶，膦絲菌素轉移酶)，或者插入或陷落在細胞壁中的蛋白(如包含前導序列的蛋白，如發(fā)現(xiàn)于延伸的表達單元中的蛋白，或煙草PR-S)。其它可能的選擇標記基因對本領域技術人員而言是顯而易見的。
選擇標記優(yōu)選為GUS，綠色熒光蛋白(GFP)，新霉素磷酸轉移酶II(nptII)，螢光素酶(LUX)，抗生素抗性編碼序列，或除草劑(例如，草甘膦)抗性編碼序列。選擇標記最優(yōu)選卡那霉素，潮霉素，或除草劑抗性標記。
重組載體中的其它元件各種具有順式作用的非翻譯5’和3’調節(jié)序列也可以包括在重組核酸載體中。任何這類調節(jié)序列可在重組載體中伴有其它調節(jié)序列。可通過設計或改變這類組合來產生所需的調節(jié)特征。
3’非翻譯區(qū)通常提供轉錄終止信號，聚腺苷酸化信號，后者在植物中能導致腺苷酸添加在mRNA的3’末端。這可通過下述序列的3’區(qū)實現(xiàn)胭脂氨酸合成酶(nos)編碼序列，大豆7Sα’貯藏蛋白編碼序列，Arcelin-5編碼序列，清蛋白編碼序列，以及豌豆ssRUBISCO E9編碼序列。特別優(yōu)選的3’核酸序列包括Arcelin-5 3’，nos 3’，E9 3’，adr12 3’，7Sα 3’，11 S 3’，USP3’，以及清蛋白3’。
位于距聚腺苷酸化位點數百個堿基對的下游處的核酸序列通?？山K止轉錄。這些區(qū)是轉錄的mRNA進行有效腺苷酸化所必需的。
重組載體中還可摻入翻譯增強子。因此，重組載體優(yōu)選包含一或多個5’非翻譯前導序列，以便增強核酸序列的表達。這類增強子序列預計能增強或改變所得mRNA的翻譯效力。優(yōu)選的5’核酸序列包括dSSU 5’，PetHSP705’，和GmHSP17.95’。
重組載體還可包含編碼轉位肽的核酸序列。這種肽可用于將蛋白引到胞外空間，葉綠體，或細胞內側或外側的其它空間中(參見，例如歐洲專利申請公開號0218571)。
重組載體中的結構核酸序列可包含內含子。這些內含子可以與結構核酸序列有不同來源。優(yōu)選的內含子包括水稻肌動蛋白內含子和谷物HSP70內含子。
融合蛋白上述任一種結構核酸序列及其修飾形式可與附加的核酸序列相連，以編碼融合蛋白。所述附加的核酸序列優(yōu)選編碼至少一個氨基酸，肽，或蛋白。融合蛋白的制備是本領域的常規(guī)技術，有多種可能的融合組合。
例如，融合蛋白可提供便于檢測該融合蛋白的“標記”表位，如GST，GFP，F(xiàn)LAG或polyHIS。這類融合優(yōu)選編碼1-50個氨基酸，更優(yōu)選5-30個附加的氨基酸，還更優(yōu)選5-20個氨基酸。
或者，所述融合可提供調節(jié)功能、酶活性、細胞信號傳遞功能、或細胞內轉運功能。例如，可添加編碼葉綠體轉運肽的序列，以便將融合蛋白引向植物細胞內部的葉綠體。這類融合配對物優(yōu)選編碼1-1000個附加的氨基酸，更優(yōu)選5-500個附加的氨基酸，還更優(yōu)選10-250個氨基酸。
序列分析本發(fā)明中，序列相似性或同一性優(yōu)選用Sequence Analysis SoftwarePackage(Version 10；Genetics Computer Group，Inc.，University of WisconsinBiotechnology Center，Madison，WI)中的“Best Fit”或“Gap”程序來確定?！癎ap”程序利用Needleman和Wunsch的算法(Needleman和Wunsch，1970)尋找兩個序列之間能使匹配數最大而使空隙數最小的對比排列。“BestFit”程序是對兩個序列之間相似性的最佳節(jié)段進行最佳對比排列。用Smith和Waterman的局部同源性算法(Smith和Waterman，1981；Smith等，1983)，通過插入空隙，使匹配數最大化，可找出最佳對比排列。
上述Sequence Analysis Software Package還包含數個另外的序列分析工具，它們可用于鑒定本發(fā)明核苷酸和氨基酸序列的同源性。例如，“BLAST”程序(Altschul等，1990)在特定的數據庫(例如，National Center forBiotechnology Information(NCBI)，Bethesda，Maryland，USA的數據庫)中搜索與查詢(query)序列(肽或核酸)相似的序列；“FastA”(Lipman和Pearson，1985；see also Pearson and Lipman，1988；Pearson等，1990)對查詢序列與一組相同類型的序列(核酸或蛋白)之間的相似性進行Pearson and Lipman搜索；“TfastA”對查詢序列與任意組核苷酸序列之間的相似性進行Pearson andLipman搜索(它先翻譯出所有6個讀碼框中的核苷酸序列，然后進行比較)；“FastX”對核苷酸查詢序列與一組蛋白序列之間的相似性進行Pearson andLipman搜索，它考慮了移碼效應；“TfastX”對蛋白查詢序列與任意組核苷酸序列之間的相似性進行Pearson and Lipman搜索，它考慮了移碼效應(它先對核酸序列的兩條鏈都進行翻譯，然后進行比較)。
探針和引物本發(fā)明中，可制備并利用能與互補核酸序列特異性雜交的短核酸序列。這些短核酸分子可作為探針用于鑒定給定的樣品中互補核酸序列的存在。因此，通過構建與特定核酸序列的一小部分互補的核酸探針，可檢測和評估該核酸序列的存在。
本文公開的任何核酸序列都可以用作引物或探針。這些探針的應用可大大促進對含本文公開之啟動子和結構核酸序列的轉基因植物的鑒定。這些探針還可用于在cDNA文庫或基因組文庫中篩選與本文公開之啟動子和結構核酸序列相關或同源的其它核酸序列。
或者，可用上述短核酸序列作為寡核苷酸引物，利用PCR技術使互補核酸序列擴增或突變。這些引物還可促進對相關互補核酸序列的擴增(例如來自其它物種的相關核酸序列)。
短核酸序列可用作探針，尤其是作為PCR探針。PCR探針是在與另一核酸所形成的雙鏈結構中能啟動聚合酶活性的核酸分子。確定PCR探針的結構的各種方法以及PCR技術都是本領域已知的。例如，可用諸如Primer3(www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.cgi)，STSPipeline(www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/www.STS_Pipeline)，或GeneUp(Pesole等，1998)等計算機搜索程序來鑒定潛在的PCR引物。
引物或探針通常與將要被鑒定、擴增、或突變的核酸序列的一部分互補。引物或探針的長度應足以與其互補體形成穩(wěn)定的序列特異性雙鏈分子。引物或探針的長度優(yōu)選為約10-200個核苷酸，更優(yōu)選為約10-100個核苷酸，還更優(yōu)選為約10-50個核苷酸，最優(yōu)選為約14-30個核苷酸。
引物或探針可直接化學合成，通過PCR(美國專利4,683,195和4,683,202)制備，或通過從較大的核酸分子中切出特異性核酸片段而制備。
轉基因植物和經過轉化的植物宿主細胞本發(fā)明還涉及轉基因植物和轉化植物細胞，它們按照5’至3’方向包含啟動子以及與其可操作相連的異源結構核酸序列。其它核酸序列也可與上述啟動子和結構核酸序列一起引入植物或宿主細胞中。所述其它序列可包括3’轉錄終止子，3’聚腺苷酸化信號，其它非翻譯核酸序列，轉位或靶向序列，選擇標記，增強子，和操縱子。本發(fā)明優(yōu)選的核酸序列包括重組載體，結構核酸序列，啟動子，及其它調節(jié)元件，都已在上文中描述。
制備這樣的重組載體的方法是本領域已知的。例如，制備特別適于植物轉化的重組載體的方法可參見美國專利4,971,908，4,940,835，4,769,061和4,757,011。這些載體已有相關綜述(Rodriguez等，1988；Glick等，1993)并且已在上文中描述。
可用細胞和高等植物中的表達的典型載體是本領域已知的，如衍生自根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)腫瘤誘導(Ti)質粒的載體(Rogers等，1987)。其它可用于植物轉化的重組載體也已有描述(Fromm等，1985)。這類重組載體的元件如上文所述。
被轉化的植物細胞或植物通?？梢允悄苋萦诒景l(fā)明的任何細胞或植物。
植物或植物細胞優(yōu)選苜蓿，蘋果，香蕉，大麥，菜豆，花椰菜，甘藍，胡蘿卜，蓖麻，芹菜，柑桔，三葉草，椰子，咖啡，玉米(corn)，棉花，黃瓜，道格拉斯冷杉，桉，大蒜，葡萄，亞麻子，火炬松，甜瓜，燕麥，油橄欖，洋蔥，棕櫚，防風，豌豆，花生，胡椒，楊樹，馬鈴薯，蘿卜，Radiatapine，油菜籽，稻，黑麥，高梁，狹葉羽扇豆，Southern pine，菠菜，草莓，甜菜，甘蔗，向日葵，楓香，茶，煙草，番茄，turf，或小麥植物或細胞。在還更優(yōu)選的實施方案中，所述植物或植物細胞是大豆。
大豆細胞或大豆植物優(yōu)選大豆優(yōu)良品系?！皟?yōu)良品系”是經過育種和篩選而得到的具有出色的農藝表現(xiàn)的任何品系。優(yōu)良品系的實例有面向農民或大豆種植者出售的品系，如HARTZTM品種H4994，HARTZTM品種H5218，HARTZTM品種H5350，HARTZTM品種H5545，HARTZTM品種H5050，HARTZTM品種H5454，HARTZTM品種H5233，HARTZTM品種H5488，HARTZTM品種HLA572，HARTZTM品種H6200，HARTZTM品種H6104，HARTZTM品種H6255，HARTZTM品種H6586，HARTZTM品種H6191，HARTZTM品種H7440，HARTZTM品種H4452 Roundup Ready，HARTZTM品種H4994 Roundup Ready，HARTZTM品種H4988 Roundup Ready，HARTZTM品種H5000 Roundup ReadyTM，HARTZTM品種H5147 Roundup ReadyTM，HARTZTM品種H5247 Roundup Ready，HARTZTM品種H5350 RoundupReadyTM，HARTZTM品種H5545 Roundup ReadyTM，HARTZTM品種H5855Roundup Ready，HARTZTM品種H5088 Roundup ReadyTM，HARTZTM品種H5164 Roundup ReadyTM，HARTZTM品種H5361 Roundup ReadyTM，HARTZTM品種H5566 Roundup ReadyTM，HARTZTM品種H5181 Roundup ReadyTM，HARTZTM品種H5889 Roundup ReadyTM，HARTZTM品種H5999 RoundupReadyTM，HARTZTM品種H6013 Roundup ReadyTM，HARTZTM品種H6255Roundup ReadyTM，HARTZTM品種H6454 Roundup ReadyTM，HARTZTM品種H6686 Roundup ReadyTM，HARTZTM品種H7152 Roundup ReadyTM，HARTZTM品種H7550 Roundup ReadyTM，HARTZTM品種H8001 Roundup Ready(HARTZ SEED，Stuttgart，Arkansas，U.S.A.)；A0868，AG0901，A1553，A1900，AG1901，A1923，A2069，AG2101，AG2201，A2247，AG2301，A2304，A2396，AG2401，AG2501，A2506，A2553，AG2701，AG2702，A2704，A2833，A2869，AG2901，AG2902，AG3001，AG3002，A3204，A3237，A3244，AG3301，AG3302，A3404，A3469，AG3502，A3559，AG3601，AG3701，AG3704，AG3750，A3834，AG3901，A3904，A4045 AG4301，A4341，AG4401，AG4501，AG4601，AG4602，A4604，AG4702，AG4901，A4922，AG5401，A5547，AG5602，A5704，AG5801，AG5901，A5944，A5959，AG6101，QR4459和QP4544(Asgrow Seeds，DesMoines，Iowa，U.S.A.)；DeKalb品種CX445(DeKalb，Illinois)。
本發(fā)明還涉及制備轉化的植物的方法，所述植物包含按照5’至3’方向排列的本發(fā)明核酸序列。還可將其它序列與啟動子和結構核酸序列一起引入所述植物中。所述其它序列可包括3’轉錄終止子，3’聚腺苷酸化信號，其它非翻譯序列，轉位或靶向序列，選擇標記，增強子，以及操縱子。優(yōu)選的重組載體，結構核酸序列，啟動子，和其它調節(jié)元件，如本文所述。
所述方法通常包括選擇合適的植物，用重組載體轉化該植物，和獲得轉化的宿主細胞。
有多種方法可將核酸引入植物。適當的方法包括細菌感染(例如土壤桿菌)，二元細菌人工染色體載體，DNA的直接運送(例如經由PEG-介導的轉化，干燥/抑制作用-介導的DNA攝入，電穿孔，用碳化硅纖維進行的攪拌，以及對核酸包被的粒子進行加速，等等(見Potrykus等，1991的綜述)。
將核酸引入細胞的技術為本領域技術人員所熟知。這些方法通常被歸類為4類(1)化學方法(Graham和van der Eb，1973；Zatloukal等，1992)；(2)物理方法如顯微注射(Capecchi，1980)，電穿孔(Wong和Neumann，1982；Fromm等，1985；美國專利5,384,253)和粒子加速(Johnston和Tang，1994；Fynan等，1993)；(3)病毒載體(Clapp，1993；Lu等，1993；Eglitis和Anderson，1988)；以及(4)受體-介導的機制(Curiel等，1992；Wagner等，1992)。或者，可以直接將核酸引入花粉，方法是直接注射植物的繁殖器官(Zhou等，1983；Hess，1987；Luo等，1988；Pena等，1987)。也可以將核酸注入未成熟的胚(Neuhaus等，1987)。
用于轉化所述宿主細胞的重組載體通常按5’至3’方向依次包含能指導結構核酸序列轉錄的啟動子，結構核酸序列，3’轉錄終止子，3’聚腺苷酸化信號。重組載體還可以包含非翻譯核酸序列，轉位及靶向核酸序列，選擇標記，增強子，或操縱子。
適當的重組載體，結構核酸序列，啟動子，和其它調節(jié)元件如上文所述。
從轉化植物的原生質體或外植體再生、發(fā)育和培養(yǎng)植物的方法為本領域熟知(Weissbach和Weissbach，1988；Horsch等，1985)，在該方法中，通常在能選擇成功轉化的細胞并誘導植物苗枝再生的選擇培養(yǎng)基存在的條件下培養(yǎng)轉化體(Fraley等，1983)。這些苗枝通常在2-4個月內獲得。
然后將苗枝轉移至合適的根-誘生培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基中包含選擇試劑以及阻止細菌生長的抗生素。大多數苗枝將發(fā)育出根。然后將它們移植到土壤或其它基質中，以使根繼續(xù)發(fā)育。方法常常根據所用具體植物株系的不同而有變動。
優(yōu)選再生的轉基因植物能自花授粉，從而提供純合型轉基因植物?；蛘?，可將所述再生轉基因植物的花粉與非-轉基因植物雜交，優(yōu)選農藝上重要的物種的近交系。反過來，可用非-轉基因植物的花粉對所述再生轉基因植物授粉。
轉基因植物可將編碼抗真菌蛋白的核酸傳給它的后代。轉基因植物優(yōu)選為抗真菌蛋白的編碼核酸的純合型，能通過有性繁殖將該序列傳遞給它的所有后代。后代可以從轉基因植物所產生的種子發(fā)育而成。這些另外的植物然后可通過自花授粉產生純種植物品系。
可對這些植物的后代進行評估，例如，評估其基因表達?；虮磉_可通過多種常用方法來檢測，如western印跡，northern印跡，免疫沉淀，和EIISA。
種子容器可以將本發(fā)明的植物種子或植物放置在容器中。本文中，容器是指任何能夠容納所述種子的物體。容器優(yōu)選包含1,000，5,000，或25,000個以上的種子，其中至少10，25，50，75或100％的種子來自本發(fā)明的植物。
飼料(feed)，粗粉，蛋白和油制品本發(fā)明的任何植物或其部分可以經過加工制成飼料，粗粉，蛋白或油制品。為此目的的一個特別優(yōu)選的植物部分是種子。在一個優(yōu)選實施方案中，飼料，粗粉，蛋白或油制品是設計用于反芻動物的。制備飼料，粗粉，蛋白和油制品的方法是已知的。參見，例如，美國專利4,957,748、5,100,679、5,219,596、5,936,069、6,005,076、6,146,669和6,156,227。在一個優(yōu)選實施方案中，所述蛋白制品是高蛋白制品。這種高蛋白制品優(yōu)選蛋白含量5％w/v以上，更優(yōu)選10％w/v，還更優(yōu)選15％w/v。在優(yōu)選的油制品中，油制品可以是高油制品，其中來源于本發(fā)明植物或其一部分的油的含量為5％w/v以上，更優(yōu)選10％w/v以上，還更優(yōu)選15％w/v。在一個優(yōu)選實施方案中，油制品是液體，體積超過1升，5升，10升，或50升。在另一實施方案中，所述油制品可以是混合物，并且可以在該混合物總體積中占10％以上，25％以上，35％以上，50％以上，或75％以上。
其它生物可將上述任一種啟動子和結構核酸序列引入任何細胞或生物，如哺乳動物細胞，哺乳動物，魚的細胞，魚，鳥的細胞，鳥，藻類的細胞，藻類，真菌的細胞，真菌，或細菌的細胞。優(yōu)選的宿主和轉化體包括真菌細胞如曲霉菌，酵母，哺乳動物(尤其牛和豬)，昆蟲，細菌和藻類。特別優(yōu)選的細菌細胞為土壤桿菌和大腸桿菌。
在另一特別優(yōu)選的實施方案中，所述細胞選自細菌細胞，哺乳動物細胞，昆蟲細胞和真菌細胞。
轉化這類細胞或生物的方法是本領域已知的(EP 0238023；Yelton等，1984；Malardier等，1989；Becker和Guarente；Ito等，1983；Hinnen等，1978；Bennett和LaSure，1991)。從這類生物體產生本發(fā)明的蛋白的方法也是已知的(Kudla等，1990；Jarai and Buxton，1994；Verdier，1990；MacKenzie等.，1993；Hartl等，1994；Bergeron等，1994；Demolder等，1994；Craig，1993；Gething and Sambrook，1992；Puig and Gilbert，1994；Wang and Tsou，1993；Robinson等，1994；Enderlin and Ogrydziak，1994；Fuller等，1989；Julius等，1984；Julius等，1983).
本發(fā)明應用舉例本發(fā)明的應用包括動物(包括人)的營養(yǎng)添加劑。動物營養(yǎng)添加劑的形式包括飼料配給，粗粉，和源自谷物的蛋白制劑。人類添加劑的形式包括大豆蛋白制劑和嬰兒配方食品。
在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的蛋白，種子，和植物應用在人類食品中。本文中“人類食品”是指，適合于人類消費的任何食品。在一個優(yōu)選實施方案中，人類食品是農業(yè)生產獲得的任何食品，包括直接的植物產物形式的食品，以及間接由農業(yè)植物喂養(yǎng)的動物獲得的動物產物形式。在一個更優(yōu)選的實施方案中，人類食品是來源于本發(fā)明的植物或種子的任何食品，包括直接的植物產物形式的食品，以及間接由農業(yè)植物喂養(yǎng)的動物獲得的動物產物形式。在另一實施方案中，人類食品是來源于本發(fā)明大豆植物或種子的任何食品，包括直接的本發(fā)明大豆植物產物形式的食品，以及間接由本發(fā)明大豆植物喂養(yǎng)的動物獲得的動物產物形式。
以下實施例僅用于舉例。不應理解為本發(fā)明的范圍僅限于所舉例的實施方案。
實施例以下實施例僅用于舉例，并非限制本發(fā)明的范圍。
實施例1制備早期大豆種子mRNA從大豆種子分離細胞總RNA，其中包含從β-伴大豆球蛋白的β亞單位基因轉錄得到的mRNA。將未成熟的大豆種子碾成粉末(～180mg)，加入50ml的微量離心管中。加2.5ml TRIZOLTM(Invitrogen，Carlsbad，CA)，混合物在PoltronTM(型號PT 1200，Brinkmann Instruments，Inc.，Westbury，NY)中勻漿20-30秒。經過勻漿的混合物在室溫中保溫5分鐘。向勻漿物中加入0.5ml氯仿，將該試管蓋緊。劇烈搖動該試管，并使其在室溫中靜置2-3分鐘。將樣品在4℃以12,000Xg離心15分鐘。將澄清的水相轉移到一個新鮮的50ml試管中，將霧狀有機相棄去。在水相中加入1.25ml異丙醇，充分混合，室溫保溫10分鐘。將試管在4℃以12,000Xg離心10分鐘。除去上清，將沉淀用2.5ml 75％乙醇洗滌。通過渦旋使沉淀混合在乙醇中。將試管在4℃以7,500Xg離心5分鐘。除去上清，將沉淀風干5-10分鐘。再將沉淀重新懸浮在400μl DEPC H2O中。將樣品稀釋1∶100，通過測定OD260/280來確定RNA的濃度。RNA的存在通過進行非變性凝膠電泳并在UV光下觀察來證實。
實施例2早期大豆種子mRNA中β-伴大豆球蛋白β亞單位基因的RT-PCR針對出現(xiàn)在實施例1所分離的細胞總RNA中的β-伴大豆球蛋白β亞單位mRNA，用TitanTMOne Tube RT-PCR系統(tǒng)(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)制備其互補DNA序列。制備以下寡核苷酸引物，將它們脫鹽，凍干，以100mM的終濃度重懸在水中，作為原液。
BetaC-5′A
5′-ATA CTA TGA TGA GAG TGC GG-3′(SEQ ID NO4)BetaC-5′B5′-CAC TCC ATG TTT CAT CGT CC-3′(SEQID NO5)BetaC-3′A5′-GTT ATT CAG TAG AGA GCA CC-3′(SEQ ID NO6)BetaC-3′B5′-TCA CGA TGA GCT CTT ACA GC-3′(SEQ ID NO7)為了進行RT-PCR，將引物稀釋為最終工作濃度20mM。制備RT-PCR反應的以下反應混合物主混合物11234
主混合物2
將每一份主混合物1樣品加入0.2ml厚的PCR試管中。制備另一份不含任何模板RNA的平行反應混合物作為對照。每一試管中加入24μl主混合物2。在PTC-200 Peltier熱循環(huán)儀中進行RT-PCR，按照以下程序的順序操作1)50℃30分鐘；2)94℃2分鐘；3)94℃30秒；4)45℃30秒；5)68℃90秒；6)回到步驟(3)，重復額外9個循環(huán)；7)94℃30秒；8)45℃30秒；9)68℃90秒；10)回到步驟7，重復額外9個循環(huán)，每個循環(huán)加5秒；11)68℃7分鐘；12)冷卻到4℃，終止程序。
將PCR反應產物在瓊脂糖凝膠上分開。從凝膠上切取PCR片段，用標準方法純化。所得cDNA之一為SEQ ID NO3。該cDNA的翻譯產物為SEQID NO1。
實施例3制備含有編碼β-伴大豆球蛋白β亞單位的序列的重組核酸載體將實施例2所分離得到的PCR產物用TATM克隆試劑盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)連接到pCRIITM載體中。連接反應按照廠家的方案進行，使用以下10μl連接反應混合物
1凝膠純化的PCR產物2直接PCR產物(未經凝膠純化)實施例4制備轉化的宿主細胞，其包含編碼野生型β-伴大豆球蛋白β亞單位的載體將連接而成的包含所述PCR產物的pCRII載體轉化到One ShotTM感受態(tài)細胞(大腸桿菌INVαF’株)(Invitrogen，Carlsbad，CA)中，按照廠家方案離心。
按照廠家方案從QIAprepTM(Qiagen Inc.，Valencia，CA)微量制備試劑盒制備DNA。將每一份DNA微量制品的樣品用EcoRI/XbaI消化，得到DNA片段。EcoRI消化產生3.9，0.58，和0.75kb的片段。XbaI消化或者產生0.59和4.62kb的片段(pMON54419)，或者產生0.72和4.44kb的片段(pMON54418)。與β-伴大豆球蛋白β亞單位基因的DNA片段對應的正確大小的片段的存在通過凝膠電泳證實。選出具有β-伴大豆球蛋白β亞單位基因的DNA微量制品和轉化細胞。將β-伴大豆球蛋白β亞單位DNA的序列與已經公開的野生型序列比較，選出與已經公開的野生型β-伴大豆球蛋白β亞單位基因序列100％匹配的序列。
實施例5制備轉基因植物和種子設計轉化載體，使其能引入編碼修飾的β-伴大豆球蛋白β亞單位的核酸序列，所述載體通常包含一或多個目的核酸編碼序列，它們的翻譯受到5’和3’調節(jié)序列的控制。這類載體包含以下元件，它們按照5’-3’的方向可操作相連指導下游結構核酸序列在植物中轉錄的啟動子；5’非翻譯序列；編碼修飾的β-伴大豆球蛋白β亞單位序列的核酸序列，以及提供聚腺苷酸化信號和終止信號的3’非翻譯區(qū)。
將每一個修飾的β-伴大豆球蛋白序列插入植物轉化載體中，并轉化植物組織如大豆子葉。在適當的選擇性生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉化的植物組織，以便產生含有修飾的β-伴大豆球蛋白序列的轉基因植物。
有多種不同的方法可以用于將這類載體引入植物原生質體、細胞、愈傷組織、葉盤、分生組織，及其它植物組織，從而產生轉基因植物。用所述植物載體轉化植物細胞或植物組織，方式可以是土壤桿菌介導的轉化，粒子槍運送，顯微注射，電穿孔，聚乙二醇介導的原生質體轉化，脂質體介導的轉化，等等(綜述見Potrykus，1991)。植物細胞或組織因此而被含有β-伴大豆球蛋白β亞單位序列的植物載體轉化。
轉基因植物是這樣產生的如上所述用植物載體轉化植物細胞；選出已經被轉化的植物細胞或組織；使已經被轉化的植物細胞再生，產生轉基因植物；選出表達所需β-伴大豆球蛋白β亞單位序列的轉基因植物。
篩選轉基因植物中必需氨基酸的含量增加了的所需多肽的蛋白表達。也可以篩選植物中其它必需氨基酸(如組氨酸，賴氨酸，甲硫氨酸，和苯丙氨酸)的含量增加了的多肽。
實施例6在大腸桿菌中表達并自我裝配帶有表位標簽的β-伴大豆球蛋白β亞單位。
為了將β-伴大豆球蛋白β亞單位的修飾形式與積累在未轉化的大豆中的內源形式相區(qū)別，將“FLAG”表位編碼序列與代表β亞單位成熟形式(缺乏信號肽)氨基末端的編碼序列連接。FLAG表位由8個殘基組成Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(SEQID NO9)(5′GAC TAC AAG GACGAC GAT GAC AAG 3′(SEQ ID NO8)。用pMON54418作為模板，按照廠家(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN，Expand High Fidelity PCR System)建議，通過標準PCR技術，將FLAG編碼序列，以及用作翻譯起始密碼子的附加甲硫氨酸密碼子，添加在成熟β亞單位編碼序列的氨基末端，所用的引物是5’ATAGCCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAGTTAAAGGTGAGAGAGGATGAG 3’(SEQ ID NO10)和5’GTAAAACGA CGGCCAG3’(SEQ ID NO11)。所得1.4kb PCR產物用NcoI+NotI消化，克隆到大腸桿菌表達載體pET21d(+)的NcoI和NotI位點(Novagen，Madison，WI)，得到pMON39328，如圖1所示。
由pMON39328編碼的帶有(FLAG)標簽的β-伴大豆球蛋白β亞單位具有氨基酸序列SEQ ID NO12。
pMON39328中編碼帶有(FLAG)標簽的β-伴大豆球蛋白β亞單位的核苷酸序列具有SEQ ID NO13所示序列。
制備第二種質粒pMON39329，如圖2所示，它包含pET21d(+)中成熟形式的β亞單位(不帶FLAG表位)的編碼序列。
由pMON39329編碼的成熟形式β-伴大豆球蛋白β亞單位(外加起始密碼子編碼的甲硫氨酸)具有氨基酸序列SEQ ID NO14。
pMON39329中編碼β-伴大豆球蛋白β亞單位成熟形式的核苷酸序列具有SEQ ID NO15所示序列。
按照廠家(Strategene，La Jolla CA)建議，將質粒pMON39328和pMON39329轉化到大腸桿菌BL21(DE3)中。用單菌落接種2ml LB培養(yǎng)基。在37℃進行培養(yǎng)，直到細胞密度達到A600＝0.6。加入異丙基-1-硫代-β-D-半乳吡喃糖苷(IPTG)至終濃度為1mM，以便誘導蛋白表達，將培養(yǎng)物在20-37℃以225rpm保溫最多20個小時。4℃5,000rpm離心15分鐘，收獲細胞。將細胞沉淀重懸在蛋白提取液中，所述蛋白提取液組成如下20mMTris-HCI，pH 7.4，0.4M NaCl，0.1％TritonX-100，40μl/ml蛋白酶抑制劑混合物，(原液1片/2ml，Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)。然后在用冰維持的冷環(huán)境中，通過超聲處理(Branson Sonifier 450，Branson PrecisionProcessing，Danbury，CT)破碎細胞。通過13,000rpm離心5分鐘，將可溶性蛋白與不溶的組分分離?？捡R斯蘭染色和用抗-FLAG抗體進行的Western印跡表明，天然形式和FLAG-標記形式的溶解度和表達水平沒有差別。當表達在37℃被誘導時，兩種蛋白主要以不溶形式積累，當在20℃或30℃誘導時，約有50％的蛋白積累在可溶性級分中。
為了確定大腸桿菌中由pMON39328和pMON39329表達的β亞單位的重組形式是否可以自我裝配，形成三聚體，將源自大腸桿菌裂解物的可溶性蛋白級分的等份試樣覆蓋在12ml 5-25％蔗糖密度梯度的上層，在20℃以36,000rpm離心17.5小時(Sorvall TH-641轉子；Sorvall Ultra Pro 80超速離心機)。離心后，用Labconco Autodensi-Flow儀(Labconco，Kansas City，Missouri)將梯度分為多個級分，每個級分用抗-FLAG M2抗體(StratageneCorporation，LaJolla，CA)進行Western印跡分析，確定哪些級分包含β-伴大豆球蛋白β亞單位。7S和11S大豆蛋白級分，以及卵白蛋白(45kD)和醛縮酶(158kD)都作為分子量標志物在不同梯度上運行。結果表明，天然形式和FLAG-標記形式與從大豆分離的7S級分以及與醛縮酶標準品共沉淀，這說明，兩種重組蛋白都能自我裝配形成三聚體。
實施例7修飾β-伴大豆球蛋白β亞單位序列以便編碼水平增加的色氨酸進行定點誘變，在β-伴大豆球蛋白β亞單位序列中的以下一或多個位置進行色氨酸密碼子取代N32；Y35；N40；N50；Y72；H88；Y116；H119；Y132；Y133；P137；Y1 58；Y172；E200；P239；Y249；P265；P324；Y330；Y346；N368；和Y411。這些反應中所用的引物見下表，其中序列ID號和相應氨基酸以及密碼子取代在右欄中。氨基酸取代是在SEQ ID NO1所示未經修飾的β-伴大豆球蛋白β亞單位序列中進行取代，用以下形式表示被替換的氨基酸的單字母代碼/在SEQ ID NO1中的位置/加入的氨基酸的單字母代碼。例如，SEQ ID NO16是將SEQ ID NO1中第35位的氨基酸從酪氨酸更換為色氨酸。括號內的核苷酸取代用類似的形式表示，SEQ ID NO3所示β-伴大豆球蛋白β亞單位cDNA中的改變表示為以下形式的三聯(lián)體取代未經修飾的三聯(lián)體/SEQ ID NO3中三聯(lián)體的第一個核苷酸的位置/修飾的三聯(lián)體。例如，SEQID NO16是將SEQID NO3的位置103，104，和105的三聯(lián)體TAC變?yōu)門GG。
每一色氨酸取代的引物序列
用質粒pMON39328作為所有上述反應的模板。ID從39328-1到39328-28的突變用QuickChangeTM定點誘變試劑盒(Stratagene Corporation，La Jolla，CA)基本按照說明書來制備，ID從39328-31到39328-66的突變用GeneEditorTM體外定點誘變系統(tǒng)試劑盒(Promega Corporation，Madison，WI)來制備。每一誘變引物被設計為將編碼色氨酸殘基的核苷酸插入上述所列位置。引物從Invitrogen(Invitrogen，Carlsbad，CA)獲得，并在5’端磷酸化，經聚丙稀酰胺凝膠電泳純化。色氨酸突變體和突變位點，按照上述表示法，列于下表中
關于β-伴大豆球蛋白β亞單位編碼序列如何經過修飾而包含多重色氨酸取代，下面給出一個實例，它描述了突變體ID 39328-57的制備將2μg質粒pMON39328的DNA與2M NaOH和2mM EDTA混合，室溫保溫10分鐘，使質粒變性。接著，在變性的模板DNA中加入10μl 3M乙酸鈉(pH5.2)和75μl 100％乙醇，使DNA沉淀。離心后，將DNA沉淀溶于100μl TE緩沖液中。迅速使變性的DNA與誘變引物雜交，如下將10μl變性的pMON39328與1μl頂端選擇引物(top selection primer)(2.9ng/μl，來自試劑盒)，下述誘變引物各1.25pmolSEQ ID NO16，SEQ ID NO21，SEQ ID NO19，SEQ ID NO20，SEQ ID NO22，SEQ ID NO23，SEQ ID NO24，SEQ IDNO26，SEQ ID NO27，SEQ ID NO28，SEQ ID NO29，SEQID NO30，和SEQID NO32，2μl 10x退火緩沖液和ddH2O在20μl反應體積中混合。反應在75℃加熱5分鐘，然后在桌面上(bench-top)緩慢冷卻到37℃。突變鏈在20μl反應液中合成(并將新合成的DNA鏈中的缺口連接起來)，所述反應液包含5μl去離子水，3μl 10x合成緩沖液，1μl T4 DNA聚合酶(5-10U)，和1μlDNA連接酶(1-3U)。在37℃反應90分鐘。接著，將1.5μl反應液轉化到大腸桿菌菌株BMH71-18mutS(Promega Corporation，Madison，WI)中，轉化的細胞在4ml LB中培養(yǎng)，所述LB包含50μl GeneEditor抗生素選擇混合物(Promega Corporation，Madison，WI)。從該培養(yǎng)物的1.5ml等份試樣中分離質粒DNA(用Qiagen Miniprep試劑盒，Qiagen Inc.Valencia，CA)。分離的質粒DNA隨后被轉化到大腸桿菌JM109中，單個菌落在含有125μg/ml氨芐青霉素和50μl GeneEditor抗生選擇混合物(Promega Corporation，Madison，WI)的LB瓊脂平板上進行培養(yǎng)。從10個菌落分離質粒DNA(Qiagen Miniprep試劑盒，Qiagen Inc.，Valencia，CA)，測定β-伴大豆球蛋白β亞單位編碼區(qū)的序列。其中一個序列被鑒定為突變體ID 39328-32。用39328-32作為模板，進行第二輪誘變，所用引物為SEQ ID NO20，SEQ ID NO25，SEQ ID NO28，SEQ ID NO31和SEQ ID NO32。所有操作如上文所述。從該輪產生的突變體中鑒定出突變體ID 39328-57。
實施例8修飾β-伴大豆球蛋白β亞單位序列以編碼水平增加的異亮氨酸進行定點誘變，以便用異亮氨酸密碼子取代β-伴大豆球蛋白β亞單位序列中的以下一或多個位置N32；L36；F46；G51；L56；F59；Q65；L66；Y72；R73；V75；Q76；L85；H88；F94；L95；L96；F97；V98；L99；R102；L105；L107；N117；L118；D121；Q124；R125；P127；Y132；Y133；L134；V135；P137；L143；K147；L148；P151；Y158；F162；Q169；L173；L181；V209；P239；F240；P247；F256；E258；T264；P265；L267；F273；L274；L285；L286；H288；N290；V295；L297；V298；N300；L308；V309；K317；K319；P324；L334；V339；F340；V341；Y346；F348；V350；L356；F358；L359；F361；N368；F372；F393；Y411；F412；和V413。
這些反應中所用的引物見下表，其中序列ID號和相應氨基酸以及密碼子取代在右欄中，說明同實施例7每一異亮氨酸取代的引物序列
突變體ID 39328-67到39328-74用pMON39328作模板來制備，突變體ID 39335-1到39335-81用pMON39335作模板來制備。質粒pMON39335與pMON39328相同，區(qū)別僅在于，β-伴大豆球蛋白β亞單位蛋白序列(SEQ IDNO1)中編碼Leu24的核苷酸從TTA突變?yōu)镃TT，產生一個AflII限制酶位點。pMON39335見圖3。
所有突變體用GeneEditorTM體外定點誘變系統(tǒng)試劑盒(PromegaCorporation，Madison，WI)基本按照說明書來制備。每一誘變引物被設計為將編碼異亮氨酸殘基的核苷酸插入上述所列位置。引物從Invitrogen(Invitrogen，Carlsbad，CA)獲得，并在5’端磷酸化，經聚丙稀酰胺凝膠電泳純化。詳細的誘變過程如實施例7中引入色氨酸取代的過程一樣。
異亮氨酸突變體以及突變位點見下表，說明同實施例7
在約2.5小時內于封閉的小室內評價二氧化氯的產生(ppm)，使用正常的室內熒光照明進行活化并使用電化學電池測定二氧化氯的濃度。數據報道于以下表2。
表2
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關于β-伴大豆球蛋白β亞單位編碼序列如何經過修飾而包含多重異亮氨酸取代，下面給出一個實例，它描述了突變體ID 93995-14的制備將雙鏈質粒pMON39335變性，并與以下誘變引物雜交SEQ ID NO37，SEQ IDNO43，SEQ ID NO46，SEQ ID NO52，SEQID NO55，SEQ ID NO58和SEQ ID NO62。將誘變反應的等份試樣轉化到大腸桿菌菌株BMH 71-18mutS中，從耐受GeneEditor抗生素選擇混合物(Promega Corporation，Madison，WI)的細胞中分離質粒，然后轉化大腸桿菌菌株JM109。對來自轉化體的質粒DNA測序，鑒定出多個修飾形式，其中之一為突變體ID39335-14。
關于β-伴大豆球蛋白β亞單位編碼序列如何經過修飾而包含多重異亮氨酸取代，下面給出一個實例，它描述了用突變體ID39335-14作為模板制備突變體ID 39328-57的過程，如下在將包含突變體ID 39335-14的質粒(pMON39334-14)作為第二輪誘變的模板使用之前，回復(restore)氨芐青霉素抗性基因的GeneEditor(Promega Corporation，Madison，WI)抗生素混合敏感形式(mix-sensitive form)(它在第一輪誘變期間轉換為GeneEditor抗性形式)。為此，將突變體ID 39335-14的編碼序列從pMON39335-14中切出，為一個1.4kb的DNA片段，用它代替pMON39335中的β-伴大豆球蛋白β亞單位編碼序列。用所得質粒作為誘變反應(如上述)的模板，用誘變引物SEQ IDNO80進行反應，鑒定出突變體ID 39335-33。
實施例9。證實經過修飾而包含一或多個色氨酸或異亮氨酸殘基的β-伴大豆球蛋白β亞單位在大腸桿菌中的折疊和自我裝配本實施例證實鏈修飾型β-伴大豆球蛋白β亞單位克隆的表達的蛋白結構。β亞單位(以突變體ID號表示)的以下修飾形式(各自包含不同的色氨酸取代)的裝配特性如所述實施例6確定。按照實施例6所述，用-FLAG抗體對蔗糖梯度級分進行Western印跡分析。結果見下表。
Ile突變體的大腸桿菌裝配結果
Trp突變體的大腸桿菌裝配結果
實施例10本實施例證實經過修飾而包含多重異亮氨酸殘基的β-伴大豆球蛋白β亞單位在轉化植物的種子中積累。
載體構建對應于表位(FLAG)-標記的β-伴大豆球蛋白β亞單位編碼序列的DNA序列，以及對應于突變體39335-14，39335-41，3933558和39335-78(分別是上述SEQ ID NO84-87)的編碼序列的DNA序列，通過將β亞單位前25個殘基的編碼序列置于FLAG表位編碼序列的上游，而進行修飾。加入這25個殘基使β亞單位信號肽被恢復，并將修飾的β-伴大豆球蛋白β亞單位靶向植物種子中的蛋白貯藏液泡。所得編碼序列然后被克隆到植物轉化載體中，受arcelin 5啟動子的控制。
舉例來說，用于制備pMON64015的克隆技術在本文中簡短描述。將質粒pMON39335-41用HindIII和PstI消化。所得1.27kb片段包含β-伴大豆球蛋白β亞單位編碼序列，其中有16個異亮氨酸取代，電泳后從瓊脂糖凝膠中分離該片段。穿梭載體pMON68006包含Arcelin5啟動子-FLAG-βCG-10-Ile-Arc 3’UTR表達盒，它也用HindIII和PstI消化，產生5.7kb的片段。該5.7kb片段缺乏β-伴大豆球蛋白β亞單位成熟形式的編碼序列，但保留了arcelin 5啟動子的編碼序列，β亞單位信號肽，F(xiàn)LAG表位，以及arcelin 5 3’UTR。該5.7kb片段在電泳后從瓊脂糖凝膠中分離。然后將來自pMON39335-41的1.27kb片段與該5.7kb片段連接，得到載體pMON64017。再用NotI消化pMON64017，分離出Arc5啟動子-FLAG-βCG-16-Ile-Arc3’UTR表達盒，所得3.8kb片段在電泳后從瓊脂糖凝膠中分離。用于土壤桿菌介導的轉化的植物轉化骨架載體pMON38207包含F(xiàn)MV啟動子驅動的CP4基因作為選擇標記，將它NotI消化，連接來自pMON64017的3.8kb片段，得到質粒pMON64015。
用上述針對pMON64015的策略，制備以下植物轉化載體
轉基因的序列(arcelin 5啟動子-編碼序列-arcelin 5 3’非翻譯區(qū))和相應的蛋白編碼序列顯示在序列表中。為了更全面描述這些構建體，本文給出對應于上述質粒的核苷酸序列和氨基酸序列的以下重點說明pMON69616盒DNA序列(SEQ ID NO88)核苷酸1-3808包含在pMON69616中的完整表達盒核苷酸1-1161截短的Arcelin 5啟動子核苷酸1174-2523包含F(xiàn)LAG表位的β-伴大豆球蛋白編碼序列核苷酸2550-3808Arcelin 5 3’非翻譯區(qū)(UTR)pMON69616β-伴大豆球蛋白蛋白序列(SEQ ID NO89)氨基酸1-449完整的β-伴大豆球蛋白編碼序列，含有信號肽和插入的FLAG表位標簽氨基酸1-25野生型β-伴大豆球蛋白的前25個氨基酸，包括信號肽氨基酸26-33FLAG表位氨基酸34-449野生型(未修飾的)β-伴大豆球蛋白的成熟形式pMON64016盒DNA序列(SEQ ID NO90)核苷酸1-3808包含在pMON64016中的完整表達盒核苷酸1-1161截短的Arcelin 5啟動子核苷酸1174-2523修飾的β-伴大豆球蛋白編碼序列，包含F(xiàn)LAG表位核苷酸2550-3808Arcelin 5 3’非翻譯區(qū)(UTR)pMON64016β-伴大豆球蛋白蛋白序列(SEQ ID NO91)氨基酸1-449完整的修飾的β-伴大豆球蛋白編碼序列，包含信號肽和插入的FLAG表位標簽氨基酸1-25β-伴大豆球蛋白的前25個氨基酸，包括信號肽氨基酸26-33FLAG表位氨基酸34-449修飾的β-伴大豆球蛋白的成熟形式，包含10個異亮氨酸取代(對應于突變體39335-14)pMON64015盒DNA序列(SEQ ID NO92)核苷酸1-3808完整表達盒，包含在pMON64015中核苷酸1-1161截短的Arcelin 5啟動子核苷酸1174-2523修飾的β-伴大豆球蛋白編碼序列，包含F(xiàn)LAG表位核苷酸2550-3809Arcelin 5 3’非翻譯區(qū)(UTR)pMON64015β-伴大豆球蛋白蛋白序列(SEQ ID NO93)氨基酸1-449完整的β-伴大豆球蛋白編碼序列，含有信號肽和插入的FLAG表位標簽氨基酸1-25β-伴大豆球蛋白的前25個氨基酸，包括信號肽氨基酸26-33FLAG表位氨基酸34-449修飾的β-伴大豆球蛋白的成熟形式，包含16個異亮氨酸取代(對應于突變體39335-41)pMON64019盒DNA序列(SEQ ID NO94)核苷酸1-3808完整表達盒，包含在pMON64019中核苷酸1-1161截短的Arcelin 5啟動子核苷酸1174-2523修飾的β-伴大豆球蛋白編碼序列，包含F(xiàn)LAG表位核苷酸2550-3809Arcelin 5 3’非翻譯區(qū)(UTR)pMON64019修飾的β-伴大豆球蛋白蛋白序列(SEQ ID NO95)氨基酸1-449完整的修飾型β-伴大豆球蛋白編碼序列，含有信號肽和插入的FLAG表位標簽氨基酸1-25β-伴大豆球蛋白的前25個氨基酸，包括信號肽氨基酸26-33FLAG表位氨基酸34-449修飾的β-伴大豆球蛋白的成熟形式，包含21個異亮氨酸取代(對應于突變體39335-58)pMON69621盒DNA序列(SEQ ID NO96)核苷酸1-3808完整表達盒，包含在pMON69621中核苷酸1-1161截短的Arcelin 5啟動子核苷酸1174-2523修飾的β-伴大豆球蛋白編碼序列，包含F(xiàn)LAG表位核苷酸2550-3809Arcelin 5 3’非翻譯區(qū)(UTR)pMON69621β-伴大豆球蛋白蛋白序列(SEQ ID NO97)氨基酸1-449完整的修飾型β-伴大豆球蛋白編碼序列，含有信號肽和插入的FLAG表位標簽氨基酸1-25β-伴大豆球蛋白的前25個氨基酸，包括信號肽氨基酸26-33FLAG表位氨基酸34-449修飾的β-伴大豆球蛋白的成熟形式，包含21個異亮氨酸取代(對應于突變體39335-78)植物轉化擬南芥屬植物用上述載體轉化，方法采用Bechtold等(CR Acad Sci ParisSciences di la vie/life sciences 3161194-1199，1993)或Clough，S.和Bent，A.(The Plant Journal 16(6)，735-743，1998)所述的標準的根癌土壤桿菌介導性植物轉化方法。
簡言之，通過將次生木料(secondary bolt)和花瓣(rosette)浸沒在根癌土壤桿菌(ABI)溶液中并渦旋10-20秒，來轉化28-35日齡的擬南芥(Arabidopsisthaliana)生態(tài)型Columbia植物。從在YEP(5g/L氯化鈉，10g/L酵母浸出物和10g/L蛋白胨，pH 7.0)上過夜生長的培養(yǎng)物中獲得根癌土壤桿菌(ABI)，于次日早晨用保溫培養(yǎng)基(5％蔗糖加0.05％Silwet L77表面活性劑)稀釋，使600nm的光密度達到約0.8。轉化前，用植物繁殖室(plant propagation dome)將植物在高濕度條件中保持24小時，保持水份，共達5天。
然后用亞灌溉方法(sub-irrigation method)將植物培養(yǎng)在標準的一周兩次澆水和施肥的條件下。將bolts裝在授粉袋中，以便容納種子。將植物播種后(浸漬約4周后)，從水中取出，使種子干燥約一周，然后收獲。接著將種子置于氯氣環(huán)境中過夜以便進行表面除菌，再置于含有草甘膦(30-50μM)的選擇性培養(yǎng)基中或種植于土壤中并用Roundup Ultra(Monsanto Company，St.Louis，MO)噴灑，以便鑒定單個陽性植物。選擇平板在4℃培養(yǎng)48小時，然后轉移到設定為23.5℃的Percival培養(yǎng)室中(16:8小時光周期)。在約18-21天內，鑒定出具有伸展的初級和次極葉以及分支的根的陽性單個植物。相應的陰性單個植物的初級和次極葉不伸展，且根較矮小。
代表T2代的種子從單個草甘膦抗性植物中收獲。用本領域抑制的標準技術從種子中提取蛋白。然后用Western印跡分析所提取的蛋白。用于Western印跡的抗血清是從注射了修飾型β-伴大豆球蛋白β亞單位(10個帶有FLAG表位的異亮氨酸取代插入在氨基末端)的兔子中分離的，所述亞單位是從pMON39335-14(Cocalico Biologicals，Inc.，Reamstown，PA)轉化的大腸桿菌中分離的。野生型β-伴大豆球蛋白β亞單位，以及代表每一種修飾形式的β亞單位，都在轉基因種子中檢測到，但每種形式中的積累水平有差異。每種形式的相對積累水平通過檢查Western印跡中帶的強度來確定，結果見下表。
大豆植物用pMON69616和pMON64016轉化，采用Martinell等在美國專利6,384,301中所述的根癌土壤桿菌介導的植物轉化方法。從所得轉基因植物獲得種子，對單個種子進行SDS-PAGE分析，用與FLAG表位反應的抗體(抗-FLAG M2抗體；Stratagene)或者用與野生型β-伴大豆球蛋白β亞單位反應的抗血清(上述)進行Western印跡分析。表位(FLAG)-標記的未修飾形式和修飾形式(10個異亮氨酸取代；突變體39335-14)都是在總提取蛋白的7％以上的水平積累，這可通過對SDS PAGE凝膠進行密度計量，然后用膠體蘭染色試劑盒(Colloidal Blue Stain Kit，Invitrogen)染色來評估。密度計量用Biorad Gel Doc儀器實施。
表達修飾β亞單位(對應于突變體39335-14)的轉基因種子，用SDS-PAGE進行分析，并用膠體蘭染色試劑盒(Invitrogen)來觀察。結果表明，修飾蛋白的表達與對一或多個內源性β-伴大豆球蛋白亞單位(α亞單位，α’亞單位，β亞單位)的抑制相關。修飾型β亞單位的積累水平與內源性β亞單位的積累水平之間存在明顯的反相關性。故，修飾型β-伴大豆球蛋白在種子中的表達確實代表了一種降低內源性β-伴大豆球蛋白水平的方法。
實施例11修飾β-伴大豆球蛋白β亞單位序列以編碼水平增加的蘇氨酸、賴氨酸、和甲硫氨酸進行定點誘變，以便在β-伴大豆球蛋白β亞單位編碼序列(SEQID NO1)中的一或多個以下位置進行蘇氨酸密碼子取代S54，S225，S250，S251，S75，S90，S202，S16，S38，S139，S149，S197，S385，A65，A67，A78，A98，A124，A258，A279，A307，A327，A335，A268，A340，A367，V83，V284，V324，V186，V375，L171，L348，N275，N326，N346，N92，N216，N280，N332，N35，N168，Q53，Q303，Q32，R304，K201，K230，E276，E282，D68，D135，D89，D253，D389，D313，F(xiàn)136，P262，P62，P222，P318，P240。
進行定點誘變，以便在β-伴大豆球蛋白β亞單位編碼序列(SEQ ID NO1)中的一或多個以下位置進行賴氨酸密碼子取代R169，R194，R243，R361，R377，R37，R357，R304，R45，R132，R179，R199，R205，R883，S75，S202，S13，S210，S329，S371，T328，N84，N117，N225，N339，Q192，Q149，Q241，Q116，Q142，Q145，H153，V363，L379，L300，I155，I208，I223，I286，D89，E157，E166，E191，E365，E376。
進行定點誘變，以便在β-伴大豆球蛋白β亞單位編碼序列(SEQ ID NO1)中的一或多個以下位置進行甲硫氨酸密碼子取代L41，L156，L242，L245，L188，L379，I167，I193，I208，F(xiàn)34，Y386，N239，Q364，Q241。
所有突變體都用GeneEditorTM體外定點誘變系統(tǒng)試劑盒(PromegaCorporation，Madison，WI)基本按照說明書來制備。每一誘變引物被設計為將編碼蘇氨酸、賴氨酸或甲硫氨酸殘基的核苷酸插入上述所列位置。引物從Invitrogen(Invitrogen，Carlsbad，CA)獲得，并在5’端磷酸化，經聚丙稀酰胺凝膠電泳純化。詳細的誘變過程如實施例7中引入色氨酸取代的過程一樣。
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序列表<110>威廉.D.拉普(Rapp，William)彭潔心(Peng，Jiexin)高薩姆.納迪格(Nadig，Gautham)蒂亞麻岡德路.文卡泰什(Venkatesh，T)<120>增強型蛋白及其應用方法<130>16515.003<160>83<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>439<212>PRT<213>大豆(Glycine max)<400>1Met Met Arg Val Arg Phe Pro Leu Leu Val Leu Leu Gly Thr Val Phe1 5 10 15Leu Ala Ser Val Cys Val Ser Leu Lys Val Arg Glu Asp Glu Asn Asn20 25 30Pro Phe Tyr Phe Arg Ser Ser Asn Ser Phe Gln Thr Leu Phe Glu Asn35 40 45Gln Asn Val Arg Ile Arg Leu Leu Gln Arg Phe Asn Lys Arg Ser Pro50 55 60Gln Leu Glu Asn Leu Arg Asp Tyr Arg Ile Val Gln Phe Gln Ser Lys65 70 75 80
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<213>合成的<400>20cagctggaac cacttggtat ttggttaacc c 31<210>21<211>28<212>DNA<213>合成的<400>21ggaaccactt actggttggt taaccctc 28<210>22<211>34<212>DNA<213>合成的<400>22tactatttgg ttaactggca cgaccaccag aat 34<210>23<211>28<212>DNA<213>合成的<400>23caaacctggc agatgggatg atttcttc 28<210>24<211>26<212>DNA<213>合成的
<400>24cccaacagtc ctggttgcaa ggcttc 26<210>25<211>27<212>DNA<213>合成的<400>25ttgtttggag agtgggagga gcagagg27<210>26<211>33<212>DNA<213>合成的<400>26tcctccgaag atgaatggtt caacttgaga agc 33<210>27<211>28<212>DNA<213>合成的<400>27gcaaccccat ctggtccaac aactttgg 28<210>28<211>33<212>DNA<213>合成的<400>28acccctgaga aaaactggca gcttcgggac ttg 33
<210>29<211>33<212>DNA<213>合成的<400>29aaacaggaag aggaatggtt ggaagtgcaa agg 33<210>30<211>34<212>DNA<213>合成的<400>30ttggaagtgc aaaggtggag agctgaattg tctg 34<210>31<211>33<212>DNA<213>合成的<400>31gtaattccag cagcttggcc atttgtcgtc aac 33<210>32<211>30<212>DNA<213>合成的<400>32ctgagcatca acaaaccagg attccctctg 30<210>33<211>25
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cgcattcgtc tcattcagag attcaac27<210>38<211>19<212>DNA<213>合成的<400>38tccccacaaa ttgagaacc 19<210>39<211>32<212>DNA<213>合成的<400>39accttcgaga ctacattatt gtccagtttc ag 32<210>40<211>36<212>DNA<213>合成的<400>40cgagactacc ggattattat tattcagtca aaaccc 36<210>41<211>36<212>DNA<213>合成的<400>41cgagactaca ttattgtcat ttttcagtca aaaccc 36
<210>42<211>17<212>DNA<213>合成的<400>42attgtccaga ttcagtc 17<210>43<211>19<212>DNA<213>合成的<400>43aacacaatca ttctccccc 19<210>44<211>27<212>DNA<213>合成的<400>44atccttctcc ccattcatgc tgacgcc27<210>45<211>22<212>DNA<213>合成的<400>45gacgccgatt tcattctctt tg 22<210>46<211>42
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<400>50gccataatta ccattgtgaa caacgac27<210>51<211>27<212>DNA<213>合成的<400>51agagactcct acattcttca ccctggc 27<210>52<211>20<212>DNA<213>合成的<400>52tcctacaaca ttcaccctgg 20<210>53<211>27<212>DNA<213>合成的<400>53cttcaccctg gcattgccca gagaatc 27<210>54<211>28<212>DNA<213>合成的<400>54cctggcgatg ccattagaat cccagctg28
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<400>76gcttatccaa ttgtcgtcaa c21<210>77<211>26<212>DNA<213>合成的<400>77tatccatttg tcattaacgc tacctc 26<210>78<211>26<212>DNA<213>合成的<400>78gctacctcaa acattaattt ccttgc 26<210>79<211>20<212>DNA<213>合成的<400>79ctcaatttca ttgcttttgg 20<210>80<211>48<212>DNA<213>合成的<400>80gctacctcaa acctcaatat tattgctatt ggtatcaatg ctgagaac 48
<210>81<211>28<212>DNA<213>合成的<400>81aatgctgaga acattcagag gaacttcc 28<210>82<211>20<212>DNA<213>合成的<400>82gaatcctaca ttgttgatgc 20<210>83<211>23<212>DNA<213>合成的<400>83tcctacttta ttgatgctca gcc 2
權利要求
1.一種修飾的多肽，它在具有氨基酸序列SEQ ID NO1的未修飾多肽中包含選自異亮氨酸，賴氨酸，甲硫氨酸，蘇氨酸，或色氨酸的一或多個必需氨基酸的取代，其中所述修飾的多肽能在種子中積累。
2.權利要求1的修飾的多肽，其中加入2個或更多個所述必需氨基酸。
3.權利要求1的修飾的多肽，其中所述修飾的多肽中包含，相對于所述未修飾的多肽而言，異亮氨酸，賴氨酸，甲硫氨酸，蘇氨酸或色氨酸，或其任意組合增加0.25％(重量比)以上。
4.一種修飾的β-伴大豆球蛋白多肽，它在具有氨基酸序列SEQ IDNO1的未修飾的β-伴大豆球蛋白多肽中包含選自蘇氨酸，異亮氨酸，色氨酸，纈氨酸，精氨酸，賴氨酸，甲硫氨酸，或組氨酸的一或多個必需氨基酸的取代，其中所述修飾的β-伴大豆球蛋白多肽能在種子中積累。
5.權利要求4的β-伴大豆球蛋白多肽，其中加入2個或更多個所述必需氨基酸。
6.權利要求4的β-伴大豆球蛋白多肽，其中所述修飾的β-伴大豆球蛋白多肽中包含，相對于所述未修飾的β-伴大豆球蛋白多肽而言，蘇氨酸，異亮氨酸，色氨酸，纈氨酸，精氨酸，賴氨酸，甲硫氨酸，組氨酸，或其任意組合增加0.25％(重量比)以上。
7.權利要求4的β-伴大豆球蛋白多肽，其中用色氨酸殘基取代所述未修飾的β-伴大豆球蛋白多肽中選自下組的至少一個氨基酸N32，Y35，N40，N50，Y72，H88，Y116，H119，Y132，Y133，P137，Y158，Y172，E200，P239，Y249，P265，P324，Y330，Y346，N368，或Y411。
8.權利要求4的修飾的多肽，其中用異亮氨酸殘基取代所述未修飾的β-伴大豆球蛋白多肽中選自下組的至少一個氨基酸N32，L36，F(xiàn)46，G51，L56，F(xiàn)59，Q65，L66，Y72，R73，V75，Q76，L85，H88，F(xiàn)94，L95，L96，F(xiàn)97，V98，L99，R102，L105，L107，N117，L118，D121，Q124，R125，P127，Y132，Y133，L134，V135，P137，L143，K147，L148，P151，Y158，F(xiàn)162，Q169，L173，L181，V209，P239，F(xiàn)240，P247，F(xiàn)256，E258，T264，P265，L267，F(xiàn)273，L274，L285，L286，H288，N290，V295，L297，V298，N300，L308，V309，K317，K319，P324，L334，V339，F(xiàn)340，V341，Y346，F(xiàn)348，V350，L356，F(xiàn)358，L359，F(xiàn)361，N368，F(xiàn)372，F(xiàn)393，Y411，F(xiàn)412，或V413。
9.權利要求4的修飾的多肽，其中用蘇氨酸殘基取代所述未修飾的β-伴大豆球蛋白多肽中選自下組的至少一個氨基酸S54，S225，S250，S251，S75，S90，S202，S16，S38，S139，S149，S197，S385，A65，A67，A78，A98，A124，A258，A279，A307，A327，A335，A268，A340，A367，V83，V284，V324，V186，V375，L171，L348，N275，N326，N346，N92，N216，N280，N332，N35，N168，Q53，Q303，Q32，R304，K201，K230，E276，E282，D68，D135，D89，D253，D389，D313，F(xiàn)136，P262，P62，P222，P318，或P240。
10.權利要求4的修飾的多肽，其中用賴氨酸殘基取代所述未修飾的β-伴大豆球蛋白多肽中選自下組的至少一個氨基酸R169，R194，R243，R361，R377，R37，R357，R304，R45，R132，R179，R199，R205，R883，S75，S202，S13，S210，S329，S371，T328，N84，N117，N225，N339，Q192，Q149，Q241，Q116，Q142，Q145，H153，V363，L379，L300，I155，1208，I223，I286，D89，E157，E166，E191，E365，或E376。
11.權利要求4的修飾的多肽，其中用甲硫氨酸殘基取代所述未修飾的β-伴大豆球蛋白多肽中選自下組的至少一個氨基酸L41，L156，L242，L245，L188，L379，I167，I193，I208，F(xiàn)34，Y386，N239，Q364，或Q241。
12.一種編碼修飾的β-伴大豆球蛋白多肽的重組核酸分子，所述多肽在具有氨基酸序列SEQ ID NO1的未修飾的β-伴大豆球蛋白多肽中包含選自蘇氨酸，異亮氨酸，色氨酸，纈氨酸，精氨酸，賴氨酸，甲硫氨酸，或組氨酸的一或多個必需氨基酸的取代，其中所述修飾的多肽能在細胞中積累。
13.權利要求12的重組核酸分子，還包括，在5’到3’的方向，與所述核酸分子可操作相連的異源啟動子。
14.一種細胞，它包含權利要求13的重組分子。
15.權利要求14的細胞，其中所述細胞選自細菌細胞，哺乳動物細胞，昆蟲細胞，植物細胞，或真菌細胞。
16.權利要求14的細胞，其中所述細胞是大豆細胞。
17.一種轉基因植物，包含權利要求14的細胞。
18.權利要求17的轉基因植物，其中所述植物為大豆植物。
19.一種種子，來自權利要求18的轉基因植物。
20.一種動物飼料，包含權利要求19的種子。
全文摘要
本發(fā)明主要涉及植物遺傳學和蛋白質化學領域。更具體地，本發(fā)明涉及包含了更多必需氨基酸的修飾蛋白。本發(fā)明提供了經過修飾具有更多數量的必需氨基酸的蛋白，編碼該強化蛋白的核酸，以及設計、制備和應用該蛋白的方法。本發(fā)明還包括含有該強化蛋白的組合物、轉化植物細胞、轉基因植物和種子，及其制備和應用方法。
文檔編號C07K14/415GK1638785SQ02818159
公開日2005年7月13日 申請日期2002年9月17日 優(yōu)先權日2001年9月17日
發(fā)明者威廉·D·拉普, 彭潔心, 高薩姆·納迪格, 蒂亞馬岡德路·文卡泰什 申請人:孟山都技術公司