一種從三七莖葉中提取γ-氨基丁酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種從三七莖葉中提取γ-氨基丁酸的制備方法。該方法采用三七莖葉為原料，經(jīng)粉碎、浸提、醇沉、過濾、濃縮、納濾和732陽離子樹脂上柱等過程，獲得純化的γ-氨基丁酸。本項發(fā)明的γ-氨基丁酸的提取工藝操作簡單，原料來源充足，成本低廉，適合產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展。
【專利說明】—種從三七莖葉中提取Y-氨基丁酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種采用藥用植物提取有效成分的方法，具體涉及一種從三七莖葉中提取Y-氨基丁酸的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]Y-氨基丁酸(GABA )主要存在于動物腦、脊髓和肝臟中，是中樞神經(jīng)系中有效的抑制性神經(jīng)傳遞物質(zhì)。Y -氨基丁酸具有降血壓、安神、鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)激素分泌和改善記憶等作用，在醫(yī)藥領(lǐng)域已有廣泛的應(yīng)用。GABA除存在于動物體外，還廣泛地存在于高等植物中，目前已經(jīng)成功地開發(fā)了富含GABA的茶葉、桑葉、糙米、馬鈴薯等食品。
[0003]三七/--?:(Burk.) H.F.Chen是五加科人參屬三七的根,具有活血化瘀、消腫止痛等功效，目前多用于防治中樞神經(jīng)系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)等疾病。為擴大藥材資源，以滿足日益增加的需求量，科學(xué)工作者成功研究了三七其它部位的藥用價值，而三七地上部分即三七莖葉成為三七的主要替代品。產(chǎn)量最高的三七莖葉具有充足的資源，適合產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展，目前三七莖葉中的皂苷成分研究較多，對其它有效成分的研究較少。而Y-氨基丁酸作為三七莖葉中氨基酸的主要成分，未有文獻報道。因此，開發(fā)一種從三七莖葉中有效提取高含量的Y -氨基丁酸的方法，并將其應(yīng)用于食品及醫(yī)藥領(lǐng)域具有重要的意義。
[0004]目前，Y-氨基丁酸主要采用化學(xué)合成法、微生物發(fā)酵法以及植物富集法制備。化學(xué)合成法生產(chǎn)的Y-氨基丁酸純品，由于不屬于天然產(chǎn)物，不適合于食品工業(yè)的應(yīng)用。而植物富集法較微生物發(fā)酵法，生產(chǎn)的Y -氨基丁酸純度較高，且對生產(chǎn)環(huán)境要求較低，適合于生產(chǎn)富含GABA的功能性食品?，F(xiàn)在已有一些植物富集方法申請了專利，例如中國專利200910040513.4 “桑葉Y _氨基丁酸的提取方法及其應(yīng)用”,該技術(shù)采用干燥、粉碎、水浸提、超聲-微波協(xié)同萃取制得粗提液，粗提液再經(jīng)三級分離如S-8樹脂去色素、G-10、732陽離子交換，純化制得高純度Y-氨基丁酸；該技術(shù)的三級分離方法成本較高，尤其是采用葡聚糖凝膠G-1O不適合于工業(yè)生產(chǎn)；`如何開發(fā)一種簡單便捷、低成本、高純度的Y-氨基丁酸的制備方法，對于Y-氨基丁酸的工業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義。因此，本發(fā)明從藥用植物三七莖葉中有效提取高純度的Y -氨基丁酸，工藝操作簡單，適合大規(guī)模生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種從三七莖葉中提取Y-氨基丁酸的方法，該方法操作簡便、提取率聞。
[0006]本發(fā)明方法通過以下步驟實現(xiàn):
(1)粉碎和提取
三七莖葉經(jīng)粉碎后，用5~10倍莖葉質(zhì)量的去離子水在50~70°C下浸提2~4 h，過濾后濾渣再重復(fù)提取2次，合并濾液，濃縮至相對密度為1.02-1.05，用質(zhì)量百分比濃度為95%的乙醇溶液進行醇沉，過濾，濃縮除去乙醇后，制得三七莖葉提取液；
(2)膜分離將上述三七莖葉提取液加入納濾裝置中納濾，收集透過液；
(3)純化:
將透過液濃縮后過預(yù)處理好的732陽離子樹脂，采用檸檬酸緩沖液和氨水溶液依次洗脫，得到氨基酸粗樣，然后，將含有Y -氨基丁酸的粗樣用硅膠柱再次分離，洗脫溶劑系統(tǒng)為氯仿和甲醇混合液，洗脫液濃縮、干燥后得到白色粉末的Y -氨基丁酸。
[0007]本發(fā)明提供的Y-氨基丁酸的制備方法中，提取溫度優(yōu)選60°C。
[0008]本發(fā)明提供的Y-氨基丁酸的制備方法中，提取時間優(yōu)選3 h。
[0009]本發(fā)明中納濾膜為聚酰胺類的材質(zhì)，截留分子量為200~500，操作壓力為0.5~1.2 MPa，操作溫度為25~40 °C。
[0010]本發(fā)明中將透過液上柱，流速為200~300，收集0.45和0.50 mo I/L氨水洗脫的
洗脫液，濃縮后得到氨基酸粗樣。
[0011]本發(fā)明中將氨基酸粗樣上柱，采用200~300目硅膠，收集甲醇:氯仿體積比為40:60和50:50的洗脫液，濃縮、干燥，得到Y(jié)-氨基丁酸的白色粉末。
[0012]本發(fā)明的優(yōu)點是:
1、本發(fā)明的制備方法操作簡便、提取率高、成本低、易于工業(yè)化生產(chǎn)；
2、本發(fā)明采用納濾膜截留雜質(zhì)，可以有效去除蛋白質(zhì)、多糖以及皂苷類物質(zhì)等，得到小分子物質(zhì)氨基酸；
3、本發(fā)明采用三七廢棄物莖葉為原料，從其中有效地提取高含量的Y-氨基丁酸。證實了三七莖葉含有豐富的Y-氨基丁酸，屬于天然產(chǎn)物，可以應(yīng)用于食品工業(yè)及醫(yī)藥領(lǐng)域。
[0013]【專利附圖】

【附圖說明】
圖1 Y -氨基丁酸(GABA)對照品的高效液相色譜圖；
圖2三七莖葉提取物的高效液相色譜圖。
【具體實施方式】
[0014]下面通過附圖和實施例對本發(fā)明方法作進一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明保護范圍不局限于所述內(nèi)容。
[0015]實施例1:三七莖葉中Y -氨基丁酸的制備方法如下:
(1)三七莖葉粉碎、提取和醇沉
將三七莖葉500 g粉碎后，用10倍莖葉質(zhì)量的去離子水在50°C下攪拌浸提4 h，抽濾，濾渣采用相同條件重復(fù)浸提2次，合并濾液，濃縮至相對密度為1.03，然后在濃縮液中緩慢加入2倍濃縮液體積的質(zhì)量百分比濃度為95%乙醇進行醇沉，靜置3 h，過濾，濃縮除去乙醇后，制得三七莖葉提取液；
(2)分離和純化:
首先取三七莖葉提取液，加入聚酰胺復(fù)合納濾膜中納濾，截留分子量為200，操作壓力為1.2 MPa，操作溫度為25 °C，收集透過液；將透過液濃縮后，調(diào)節(jié)溶液pH為3，過預(yù)處理好的732陽離子樹脂(預(yù)處理是指將732陽離子樹脂先用2 mol/L的HCl浸泡4 h后，用蒸餾水洗至中性，接著用2 mol/L的NaOH浸泡4 h，用蒸餾水洗至中性，然后再用2 mol/L的HCl沖洗樹脂并用蒸餾水洗至中性即可，下同)，用pH3、pH6的檸檬酸緩沖液和0.25,0.35、
0.45、0.50 mol/L氨水依次洗脫，流速控制在2 mL.mirf1,收集0.45和0.50 mol/L氨水洗脫的洗脫液，濃縮后得到氨基酸粗樣；然后，將含有Y-氨基丁酸的氨基酸粗樣用硅膠開口柱再次分離(硅膠為200-300目)，溶劑系統(tǒng)氯仿和甲醇混合液，用體積比分別10:90，20:80,30:70, 40:60，50:50，100:0的混合液依次洗脫，收集甲醇:氯仿體積比為40:60和50:50的洗脫液，濃縮、干燥，得到白色粉末的Y-氨基丁酸，總收率為0.42%，Y-氨基丁酸的含量為97%。
[0016]實施例2:三七莖葉中Y -氨基丁酸的制備方法如下:
(1)三七莖葉粉碎、提取和醇沉
將三七莖葉500 g粉碎后，用8倍莖葉質(zhì)量的去離子水在60°C下攪拌浸提3 h，抽濾，濾渣采用相同條件重復(fù)浸提2次，合并濾液，濃縮至相對密度為1.05，然后在濃縮液中緩慢加入2倍濃縮液體積的質(zhì)量百分比濃度為95%的乙醇進行醇沉，靜置3 h，過濾，濃縮除去乙醇后，制得二七莖葉提取液；
(2)分離和純化:
首先取三七莖葉提取液，加入聚酰胺復(fù)合納濾膜中納濾，截留分子量為300，操作壓力為1.0 MPa，操作溫度為30°C，收集透過液；將透過液濃縮后，調(diào)節(jié)溶液pH為3，過預(yù)處理好的732陽離子樹脂，用pH3、pH6的檸檬酸緩沖液和0.25,0.35,0.45,0.50 mol/L氨水依次洗脫，流速控制在2 mL-min^1,收集0.45和0.50 mol/L氨水洗脫的溶液，濃縮后得到氨基酸粗樣；然后，將含有Y-氨基丁酸的氨基酸粗樣用硅膠開口柱再次分離(硅膠為200-300目)，溶劑系統(tǒng)氯仿和甲醇混合液，用體積比分別為10:90，20:80，30:70，40:60，50:50，100:0的混合液依次洗脫，收集甲醇:氯仿體積比為40:60和50:50的洗脫液，濃縮、干燥，得到白色粉末的Y -氨基丁酸，總收率為0.44%，Y -氨基丁酸的含量為98%。
[0017]實施例3:三七莖葉中Y -氨基丁酸的制備方法如下:` (1)三七莖葉粉碎、提取和醇沉
將三七莖葉500 g粉碎后，用5倍莖葉質(zhì)量的去離子水在70°C下攪拌浸提2 h，抽濾，濾渣采用相同條件重復(fù)浸提2次，合并濾液，濃縮至相對密度為1.04，然后在濃縮液中緩慢加入2倍濃縮液體積的質(zhì)量百分比濃度為95%乙醇進行醇沉，靜置3 h，過濾，濃縮除去乙醇后，制得三七莖葉提取液；
(2)分離和純化:
首先取三七莖葉提取液，加入聚酰胺復(fù)合納濾膜中納濾，截留分子量為500，操作壓力為0.5 MPa，操作溫度為40°C，收集透過液。將透過液濃縮后，調(diào)節(jié)溶液pH為3，過預(yù)處理好的732陽離子樹脂，用pH3、pH6的檸檬酸緩沖液和0.25,0.35,0.45,0.50 mol/L氨水依次洗脫，流速控制在2 mL-min^1,收集0.45和0.50 mol/L氨水洗脫的溶液，濃縮后得到氨基酸粗樣；然后，將含有Y-氨基丁酸的氨基酸粗樣用硅膠開口柱再次分離(硅膠為200-300目)，溶劑系統(tǒng)氯仿和甲醇混合液，用體積比分別10:90，20:80，30:70，40:60，50:50，100:0的混合液依次洗脫，收集甲醇:氯仿體積比為40:60和50:50的洗脫液，濃縮、干燥，得到白色粉末的Y-氨基丁酸，總收率為0.37%，Y-氨基丁酸的含量為97%。
[0018]實施例4 Y-氨基丁酸的純度鑒定
將實施例1制備的三七莖葉中的Y-氨基丁酸采用高效液相色譜法測定其純度，具體如下:
儀器:島津高效液相色譜儀(包括在線脫氣機D⑶-20A3R(C)、二元泵LC-20AB、自動進樣器SIL-20A、柱溫箱 CT0-20A、檢測器 SPD-20A)，色譜柱:Thermo Scientific Hypersil GOLDC18 色譜柱(5 Mm, 250 mmX4.6 mm)。
[0019]柱前衍生化:
取400.0 μ?樣品上清液和對照品溶液，加入200.0 μ? PITC:乙腈(25:1000，V/V)和400.0 PL三乙胺:乙腈(1.4:8.6，V/V)，渦旋振蕩，靜置2 11，加入2.0 mL正己烷萃取，渦旋振蕩，靜置待分層后吸取下層溶液，經(jīng)0.45 Mffl濾膜過濾，取300.0 PL氮氣吹干，加300.0μ?甲醇:水(1:1，V/V)復(fù)溶，待進液相檢測。
[0020]色譜條件:
色譜柱:Thermo Scientific Hypersil GOLD C18 色譜柱。流動相 A 液為 0.05 mol*L_1醋酸鈉緩沖鹽:乙腈(95:5，V/V);流動相B液為乙腈。流動相均以0.45 Mm濾膜過濾，超聲脫氣后使用。在O~15 min內(nèi)，由5%流動相B變化到10%流動相B，在15~20 min內(nèi)，由10%流動相B變化到100%流動相B，繼續(xù)用流動相B洗脫5 min。流速為1.0 mL-min^1,柱溫為30 °C，紫外檢測波長為254 nm，進樣量為10.0 μ?。
[0021]線性考察:
精量取配置好的10.0 mmol-L-1 GABA對照品溶液，配制成5.0、1.0,0.8,0.4,0.2,0.1mmol-L-1的系列對照品溶液，按照樣品衍生化步驟操作并用HPLC測定，以峰面積以GABA濃度(mmol.!/1)為橫坐標(biāo)，以GABA各濃度的峰面積(mAU*min)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示，線性回歸方程為Y=1.6X106X-1.1X105,r2=0.9996，最小檢出限為0.001 mmol.L'
[0022]精密度試驗:
取0.5 mmol-L-1 GABA對照品溶液連續(xù)5次進樣檢測，由相應(yīng)峰面積經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算其濃度，結(jié)果RSD值為0.26%。
[0023]回收率試驗:
取已知含量的樣品，加入一定質(zhì)量的GABA對照品，按上述提取步驟及衍生化步驟進行操作，進液相檢測，平均回收率為102.44%和98.37%，RSD值為0.21%和0.15% (見圖2)。
【權(quán)利要求】
1.一種從三七莖葉中提取Y-氨基丁酸的方法，其特征在于具體操作如下: (1)粉碎和提取 三七莖葉經(jīng)粉碎后，用5~10倍莖葉質(zhì)量的去離子水在50~70°C下浸提2~4 h，過濾后濾渣再重復(fù)提取2次，合并濾液，濃縮后，用質(zhì)量百分比濃度為95%的乙醇溶液進行醇沉，過濾，濃縮除去乙醇后，制得三七莖葉提取液； (2)膜分離 將上述三七莖葉提取液加入納濾裝置中納濾，收集透過液； (3)純化 將透過液濃縮后過預(yù)處理好的732陽離子樹脂，采用檸檬酸緩沖液和氨水溶液依次洗脫，洗脫液為氨基酸粗樣，然后，將含有Y -氨基丁酸的氨基酸粗樣用硅膠柱再次分離，洗脫溶劑系統(tǒng)為氯仿和甲醇混合液，洗脫液濃縮、干燥后得到白色粉末的Y-氨基丁酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述從三七莖葉中提取Y-氨基丁酸的方法，其特征在于:納濾膜為聚酰胺類的材質(zhì)，截留分子量為200~500，操作壓力為0.5~1.2 MPa，操作溫度為25~40。。。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述從三七莖葉中提取Y-氨基丁酸的方法，其特征在于:將透過液上柱，流速為2 mL-min^1,收集0.45和0.50 mol/L氨水洗脫的洗脫液，濃縮后得到氨基酸粗樣。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述從三七莖葉中提取Y-氨基丁酸的方法，其特征在于:將氨基酸粗樣上柱，采用200~300目硅膠，收集甲醇:氯仿體積比為40:60和50:50的洗脫液，濃縮、干燥，得到Y(jié)-氨基丁酸的白色粉末。
【文檔編號】C07C229/08GK103755580SQ201410014639
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月14日
【發(fā)明者】崔秀明, 曲媛, 楊晶晶, 劉 英, 李琳, 李云軍 申請人:昆明理工大學(xué)