帶電的氟碳化合物組合物在純化生物分子的方法中的用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及新的且改進(jìn)的純化生物分子的方法。具體地，本發(fā)明涉及采用帶電的氟碳化合物組合物修飾的多孔固體支持物來純化蛋白的方法。
【專利說明】帶電的氟碳化合物組合物在純化生物分子的方法中的用途
[0001] 相關(guān)申請
[0002] 本申請要求提交日期為2012年3月26日的美國臨時專利申請第61/615,609號 和提交日期為2012年6月29日的美國臨時專利申請第61/666, 506的優(yōu)先權(quán)，上述申請各 自整體援引加入本文。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003] 本發(fā)明涉及新的且改進(jìn)的純化生物分子的方法。具體地，本發(fā)明涉及蛋白純化的 方法，其采用帶電的氟碳化合物組合物，例如磺化氟化組合物。

【背景技術(shù)】
[0004] 制備生物分子如靶蛋白（例如，重組治療蛋白和抗體）的一般方法通常包括兩個 主要步驟：（1)在宿主細(xì)胞中表達(dá)靶蛋白，以及（2)靶蛋白的純化。第一步一般包括使期望 的宿主細(xì)胞在生物反應(yīng)器中生長以促進(jìn)靶細(xì)胞的表達(dá)。一旦以期望的水平表達(dá)靶蛋白，則 從宿主細(xì)胞移出所述蛋白并收獲。通常通過過濾或離心從包含靶細(xì)胞的液流去除懸浮物質(zhì) 如細(xì)胞、細(xì)胞片段、脂質(zhì)和其他不溶性物質(zhì)，導(dǎo)致在溶液中包含靶蛋白與各種可溶性雜質(zhì)的 澄清液體?？扇苄噪s質(zhì)的實例包括宿主細(xì)胞蛋白（一般稱作HCP，其為期望的或靶蛋白以外 的細(xì)胞蛋白）、核酸、內(nèi)毒素、病毒、蛋白變體和蛋白聚集體。
[0005] 第二步一般包括一般或多個純化步驟，然后是一個或多個拋光步驟。純化步驟一 般旨在降低澄清溶液中各種可溶性雜質(zhì)的水平并提供濃縮的靶蛋白。純化步驟通常包括 幾個層析步驟，所述層析步驟可以包括一種或多種結(jié)合和洗脫層析技術(shù)，例如親和層析、疏 水相互作用層析（HIC)、疏水電荷誘導(dǎo)層析（HCIC)、陰離子交換和陽離子交換層析、混合模 式層析，并且可以利用樹脂如 ProSep-vA Ultra、ProSep Ultra Plus、MabSelect Ultra、 MabSelect SuRe、SP Sepharose、Q Sepharose、Eshmuno S、Eshmuno Q、Capto Adhere、Capto MMC、HEA Hypercel、PPA Hypercel 等。
[0006] 使包含靶蛋白的液流進(jìn)行一個或多個純化步驟之后，通常使包含靶蛋白的級 分（稱作流出物）進(jìn)行一個或多個拋光步驟。拋光步驟一般旨在進(jìn)一步降低包含靶 蛋白的流出物中各種可溶性雜質(zhì)的水平。已報道各種層析介質(zhì)結(jié)合可溶性雜質(zhì)，并且 通常用于拋光步驟。例如，已報道一種簡單的陰離子交換層析介質(zhì)（AEX)如包含季銨 配體的陰離子交換層析介質(zhì)結(jié)合帶負(fù)電荷的HCP、DNA、內(nèi)毒素和一些病毒（參見，例 如，U. Gottschalk，ed.，Process Scale Purification of Antibodies, John Wiley and Sons，2009, p. 147)。層析樹脂或膜可以用于這個步驟，包括Q Sepharose、Eshmuno Q、 Fractogel TMAE、Pall Mustang Q、ChromaSorb、Sartobind Q 等。此外，已開發(fā)某些"混 合模式"層析介質(zhì)，其包含陰離子交換以及陽離子交換基團(tuán)并可以用于拋光步驟。參 見， 例 如，F(xiàn). Oehme，J. Peters，Mixed-Mode Chromatography in Downstream Process Development, BioPharm Int. Supplements，March2, 2010。
[0007] 磺化氟聚合物是一類獨(dú)特的大分子，其設(shè)計用于需要極端的化學(xué)耐受性和高質(zhì)子 電導(dǎo)率的應(yīng)用。參見，例如，美國專利第3, 718, 627號，其描述基于單體CF2 = CFCF2CF2S02F 的磺化氟聚合物?；腔酆衔镆郧耙延糜诟叻肿游⒖啄さ谋砻嫘揎椧蕴岣咚鼈兊乃疂?潤性，增加對去濕的抗性以及使得它們能夠用于強(qiáng)腐蝕性液體的過濾，例如美國專利第 6, 273, 271號所教導(dǎo)的。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明提供純化生物分子的改進(jìn)方法，其中所述方法采用具有用帶電的氟碳化合 物組合物修飾的表面的固體支持物，所述帶電的氟碳化合物組合物包括但不限于氟化且?guī)?電的聚合物，例如磺化氟聚合物（在本文中稱作"SFP"）。
[0009] 在本文所述的各種實施方案中，具有用帶電的氟碳化合物組合物修飾的表面的多 孔固體支持物用于結(jié)合所關(guān)注的生物分子。結(jié)合至用帶電的氟碳化合物組合物修飾的固體 支持物的所關(guān)注的生物分子可以是可溶性雜質(zhì)，例如宿主細(xì)胞蛋白，意圖將其從包含靶蛋 白的液流中去除。或者，所關(guān)注的生物分子可以是意圖回收的分子，例如可以用于疫苗制備 的病毒或病毒顆粒，其中所述病毒或病毒顆粒結(jié)合具有用帶電的氟碳化合物組合物修飾的 表面的固體支持物。
[0010] 在各種實施方案中，本發(fā)明涉及一種從樣品去除生物分子的方法；所述方法 包括以下步驟：（i)提供包含所述生物分子的樣品；（ii)使所述樣品以流過模式（flow through)與包含用帶電的氟碳化合物組合物修飾的表面的固體支持物接觸，其中所述固體 支持物結(jié)合所述生物分子；以及（iii)回收流出物，從而導(dǎo)致去除所述生物分子。
[0011] 在一些實施方案中，所述生物分子是不期望的實體，例如可溶性雜質(zhì)。在其他實施 方案中，所述生物分子是期望的實體，例如可用于疫苗制備的病毒或病毒顆粒。
[0012] 在一些實施方案中，本發(fā)明涉及一種降低樣品中一種或多種可溶性雜質(zhì)的水平 的方法，所述方法包括以下步驟：（i)提供包含靶蛋白以及一種或多種可溶性雜質(zhì)的樣品； (ii)使所述樣品以流過方式與包含用帶電的氟碳化合物組合物修飾的表面的多孔固體支 持物接觸，其中所述固體支持物結(jié)合所述一種或多種可溶性雜質(zhì)；（iii)回收流出物，其中 所述流出物包含相對于（i)中的水平，水平降低的雜質(zhì)。
[0013] 在一些實施方案中，和與具有用帶電的氟碳化合物組合物修飾的表面的多孔固 體支持物接觸之前所述樣品中存在的水平相比，一種或多種可溶性雜質(zhì)的水平降低至少 10 %、或至少20 %、或至少30 %、或至少40 %、或至少50 %、或至少60 %、或至少70 %、或至 少80 %、或至少90 %、或至少95 %或更多。
[0014] 在其他實施方案中，本發(fā)明涉及一種從樣品回收生物分子的方法；所述方法包括 以下步驟：（i)提供包含所述生物分子的樣品；（ii)使所述樣品以流過模式與包含用帶電 的氟碳化合物組合物修飾的表面的多孔固體支持物接觸，其中所述固體支持物結(jié)合所述生 物分子；以及（iii)從所述固體支持物洗脫結(jié)合的分子，從而回收所述生物分子。
[0015] 在一些實施方案，帶電的氟碳化合物組合物為磺化氟聚合物。
[0016] 在一些實施方案，所述帶電的氟碳化合物組合物結(jié)合至固體支持物。
[0017] 在一些實施方案中，所述固體支持物是多孔的。示例性多孔固體支持物形式包括 但不限于膜、多孔整體柱（monolith)、紡織或無紡布、常見的層析樹脂和材料。
[0018] 在本發(fā)明的各種實施方案中，所述方法可以在高于約lOOmM的鹽濃度下進(jìn)行。
[0019] 在一些實施方案中，利用具有用帶電的氟碳化合物組合物修飾的表面的多孔固體 支持物去除一種或多種可溶性雜質(zhì)之后，使包含所述靶蛋白的流出物進(jìn)一步進(jìn)行一個或多 個選自以下的層析或連續(xù)層析步驟：離子交換層析、疏水相互作用層析、親和層析和混合模 式層析。
[0020] 在一些實施方案中，本文所述的組合物用于從樣品（例如細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)料）純化蛋 白的連續(xù)方法。在某些實施方案中，本文所述的組合物用作流過純化方法步驟的一部分。 所述流過純化方法步驟可以是較大的蛋白純化方法的一部分，所述較大的蛋白純化方法可 以包括幾個步驟，包括但不限于例如在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)表達(dá)蛋白的細(xì)胞；使所述細(xì)胞培 養(yǎng)物澄清，這可以采用沉淀、離心和/或深層過濾中的一種或多種；將澄清的細(xì)胞培養(yǎng)物轉(zhuǎn) 移至結(jié)合和洗脫層析捕獲步驟（例如，A蛋白親和層析）；使所述A蛋白洗脫液進(jìn)行病毒滅 活（例如，利用一個或多個靜態(tài)混合物和/或緩沖罐）；使來自病毒滅活的產(chǎn)物進(jìn)行流過純 化方法，所述流過純化方法采用選自活性炭、陰離子交換層析介質(zhì)、陽離子交換層析介質(zhì)和 病毒過濾介質(zhì)的兩種或更多種基質(zhì)；以及利用滲濾/濃縮和無菌過濾配制來自所述流過純 化步驟的流過液中的蛋白。這類方法的額外的細(xì)節(jié)可以例如在同時附上提交的參考號為 P12/107的共同待決的申請中找到，并且其整體援引加入本文。在一些實施方案中，在流過 純化期間，于陽離子交換介質(zhì)之前使用本文所述的CFC組合物。在另一實施方案中，在流過 純化步驟期間，于陽離子交換介質(zhì)之后使用本文所述的CFC組合物。
[0021] 在一些實施方案中，如上文所述，流體樣品從一個步驟至下一個步驟連續(xù)流過整 個過程。
[0022] 示例性靶蛋白包括但不限于重組蛋白、單克隆抗體和功能片段、人源化抗體、嵌合 抗體、多克隆抗體、多特異性抗體、免疫粘附素分子以及包含CH2/CH3區(qū)的蛋白。所述靶蛋 白可以在哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)（例如，CH0細(xì)胞）或非哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)（例如，細(xì)菌、酵母 或昆蟲細(xì)胞）中表達(dá)。本文所述的方法可以用于利用哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)以及非哺乳動物表 達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的蛋白的上下文。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023] 圖1為帶電的氟碳化合物組合物中存在的基團(tuán)的一般化學(xué)結(jié)構(gòu)的示意圖。這里，Ri 選自包含磺酸、硫酸、膦酸、磷酸和羧酸殘基的基團(tuán)；R2為任選存在的連接單元，其選自包含 短的飽和及不飽和烴基的基團(tuán)，例如其中X范圍為1至約10且y范圍為0至約20的C xHy、 烷氧基、酯、酰胺等；并且R3SF、C1或(^-(： 1(|全氟烷基基團(tuán)。
[0024] 圖2示出可以聚合或共聚合以獲得聚合的帶電的氟碳化合物組合物的前體的示 例性全氟單體的示意圖。
[0025] 圖3示出示例性全氟有機(jī)酸。
[0026] 圖4A和4B示出基于示例性實驗的結(jié)果的圖，所述實驗測量相對于未修飾的膜， CFC修飾的膜的靜態(tài)溶菌酶容量（EW830、EW1000和EW1100)，在pH5(4A)或pH8(4B)下進(jìn)行 測量。
[0027] 圖5A和5B示出基于示例性實驗的結(jié)果的圖，所述實驗測量相對于未修飾的膜， CFC修飾的膜的靜態(tài)BSA容量（EW830、EW1000和EW1100)，在pH5(5A)或pH8(5B)下進(jìn)行測 量。
[0028] 圖6示出基于示例性實驗的結(jié)果的圖，所述實驗測量CFC修飾的膜的靜態(tài)IgG容 量，在包含〇. 5M氯化鈉的緩沖溶液中于pH5和8下進(jìn)行測量。
[0029] 圖7示出基于示例性實驗的結(jié)果的圖，所述實驗測量與未修飾的膜相比，CFC修飾 的膜的靜態(tài)宿主細(xì)胞蛋白容量。
[0030] 圖8A和8B示出基于示例性實驗的結(jié)果的圖，所述實驗測量在低電導(dǎo)率（25mM，在 8A中示出）下或在高電導(dǎo)率（25mM緩沖液+250mM NaCl，在8B中示出）下單克隆抗體收率 以及宿主細(xì)胞蛋白減少的LRV。

【具體實施方式】
[0031] 本發(fā)明至少部分基于在蛋白純化的方法中使用具有用帶電的氟碳化合物組合物 (CFC)修飾的表面的固體支持物的發(fā)現(xiàn)，其中所述方法減少可能使用的拋光步驟的數(shù)目。此 夕卜，本文所述的方法中的拋光步驟可以在用設(shè)計用于拋光步驟的其他可商購的產(chǎn)品導(dǎo)致不 期望的結(jié)果的條件（例如，高鹽濃度）下進(jìn)行。最后，本文所述的用于蛋白純化方法的分子 可以比目前可用的以相似方式使用的產(chǎn)品更廉價。
[0032] 本領(lǐng)域已描述了摻入磺酸基團(tuán)的層析樹脂組合物以及物理上明顯與全氟基團(tuán)分 離的磺酸基團(tuán)（參見，例如，美國專利第8, 092, 683號）。但是，這類樹脂看來并不表現(xiàn)出靶 蛋白（即，胰島素）的任何實質(zhì)結(jié)合。
[0033] 相比之下，如圖1所示，本發(fā)明的組合物包括接近氟化基團(tuán)（例如，氟碳化合物基 團(tuán)）的帶電的基團(tuán)（例如，磺酸基團(tuán)）。換句話說，在本文所述的組合物的情況下，帶電的基 團(tuán)和氟化基團(tuán)不是像本領(lǐng)域所述的化合物的情況下的分開和不同的基團(tuán)。
[0034] 為了可以更容易地理解本公開，首先定義某些術(shù)語。額外的定義在整個詳細(xì)說明 書中示出。
[0035] I.定義
[0036] 如本文所用，術(shù)語"帶電的氟碳化合物組合物"指包含碳和氟原子以及一個或多個 帶電的基團(tuán)的化合物，所述帶電的基團(tuán)包括但不限于羧酸、磺酸、硫酸、膦酸、磷酸。具體地， 這類氟碳化合物組合物包括飽和、不飽和和環(huán)化的全氟化碳化合物。
[0037] 示例性帶電的氟碳化合物組合物代表一類以磺酸基團(tuán)終止的四氟乙烯和全氟 乙烯基醚的共聚物。如下圖所示，這些共聚物的化學(xué)結(jié)構(gòu)包括全氟化聚合物骨架和強(qiáng) 陽離子交換側(cè)基。側(cè)基和全氟化骨架之間的接頭長度不同，并且取決于共聚物等級和 制造商。例如，DuPont Nafion?.共聚單體具有化學(xué)結(jié)構(gòu)：全氟-3. 6-二氧雜-4-甲 基-7-辛烯磺?；铮∕W = 446) :CF2 = CF-0-CF2-CF(CF3)0CF2CF2-S0 2F，而 Solvay SolexisAquivion?單體具有化學(xué)結(jié)構(gòu)：全氟-3-氧雜-4-戊烯磺酰基氟化物（MW = 280): CF2 = cf-o-cf2cf2-so2f。
[0038]

【權(quán)利要求】
1. 一種從樣品去除靶生物分子的方法，所述方法包括： (i) 提供包含所述靶生物分子的樣品；以及 (ii) 使所述樣品與具有用帶電的氟碳化合物組合物修飾的表面的多孔固體支持物接 觸，其中所述靶生物分子結(jié)合至該經(jīng)修飾的固體支持物， 從而從所述樣品中去除所述靶生物分子。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中所述靶生物分子為可溶性雜質(zhì)。
3. 權(quán)利要求2的方法，其中所述可溶性雜質(zhì)為宿主細(xì)胞蛋白。
4. 權(quán)利要求1的方法，其中所述靶生物分子為病毒或病毒顆粒。
5. 權(quán)利要求4的方法，其還包括回收結(jié)合的靶生物分子的步驟。
6. -種降低包含靶蛋白以及一種或多種雜質(zhì)的樣品中所述一種或多種雜質(zhì)的水平的 方法，所述方法包括以下步驟： (i) 提供包含靶蛋白以及一種或多種雜質(zhì)的樣品； (ii) 使所述樣品與具有用帶電的氟碳化合物組合物修飾的表面的多孔固體支持物接 觸；以及 (iii) 獲得流出物， 其中相對于（i)中所述樣品中一種或多種雜質(zhì)的水平，所述流出物包含較低水平的所 述一種或多種雜質(zhì)。
7. 權(quán)利要求6的方法，其中所述樣品包括細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)料。
8. 權(quán)利要求1的方法，其中所述樣品包含至少lOOmM的鹽濃度。
9. 權(quán)利要求6的方法，其中所述樣品包含至少100mM的鹽濃度。
10. 權(quán)利要求1的方法，其中所述帶電的氟碳化合物組合物包含以下結(jié)構(gòu)：
其中&選自磺酸、硫酸、膦酸、磷酸和羧酸殘基；R2為任選存在的連接單元，其選自短的 飽和及不飽和烴基；R3為F、C1或全氟烷基基團(tuán)，并且F為氟基團(tuán)。
11. 權(quán)利要求6的方法，其中所述帶電的氟碳化合物組合物包含以下結(jié)構(gòu)：
其中&選自磺酸、硫酸、膦酸、磷酸和羧酸殘基；R2為任選存在的連接單元，其選自短的 飽和及不飽和烴基；R3為F、C1或全氟烷基基團(tuán)，并且F為氟基團(tuán)。
12. 權(quán)利要求10的方法，其中R2為X的范圍為1-約10且y的范圍為0-約20的CxHy 基團(tuán)或烷氧基、酯、酰胺等。
13. 權(quán)利要求11的方法，其中R2為x的范圍為1-約10且y的范圍為0-約20的CxHy 基團(tuán)或烷氧基、酯、酰胺等。
14. 一種從樣品純化靶分子的流過方法，所述方法包括以下步驟： (a) 使包含所述靶分子以及一種或多種雜質(zhì)的樣品進(jìn)行A蛋白親和層析方法； (b) 使來自步驟（a)的A蛋白洗脫液流過活性炭介質(zhì)； (c) 使來自（b)的產(chǎn)物流過陰離子交換層析介質(zhì)； (d) 使來自（c)的產(chǎn)物流過陽離子交換層析介質(zhì)； (e) 使來自（d)的產(chǎn)物流過具有用帶電的氟碳化合物組合物修飾的表面的多孔固體支 持物； (f) 使來自（e)的產(chǎn)物流過病毒過濾介質(zhì)；以及 (g) 回收來自（f)的產(chǎn)物，從而純化所述靶分子。
15. 權(quán)利要求14的方法，其中所述靶分子為抗體。
16. 權(quán)利要求15的方法，其中所述抗體為單克隆抗體。
【文檔編號】C07K1/16GK104105703SQ201380009032
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2013年3月18日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月26日
【發(fā)明者】M·科茲洛夫, W·莫亞, J·賈比爾, W·卡塔爾多, A·波蒂, C·希列斯彼 申請人:Emd密理博公司