一種魚源抗凍多肽及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種魚源抗凍多肽及其制備方法，以魚皮膠原蛋白為原料，通過木瓜蛋白酶酶解，再經(jīng)過分離純化得到純化的特異性抗凍多肽，氨基酸全序列為：Lys-Gly-Glu-Ala-Gly-Asp-Asn-Gly-Ala-Lys-Gly-Asp-Ala-Gly-Ser-Pro-Gly。本發(fā)明突破了國內(nèi)外現(xiàn)存的抗凍蛋白的研究思路和方法，克服從天然生物體中純化抗凍蛋白數(shù)量的局限性以及國際FDA組織對轉(zhuǎn)基因抗凍蛋白在食品應(yīng)用中的安全性顧慮，獲得基于食品源的高效抗凍多肽，為開發(fā)基于食品源的抗凍多肽以及探索其在食品、醫(yī)學(xué)上的廣泛應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。
【專利說明】一種魚源抗凍多肽及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種抗凍多肽，更具體地涉及了一種魚源抗凍多肽及其制備方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]食品和醫(yī)藥產(chǎn)品在低溫儲存和運輸過程中由于環(huán)境溫度的波動變化而反復(fù)地遭受冰晶生長和重結(jié)晶的問題越來越受到人們的關(guān)注。溫度的反復(fù)升降使冰晶不斷生長、凍融和重結(jié)晶，嚴(yán)重破壞細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)而失去產(chǎn)品應(yīng)有的品質(zhì)。世界范圍內(nèi)的科學(xué)家正面臨嚴(yán)肅的挑戰(zhàn)：如何控制冰晶生長及重結(jié)晶，實現(xiàn)低溫冷鏈上的冰晶生長控制，是制約眾多食品和醫(yī)藥廣品品質(zhì)的關(guān)鍵所在。
[0003]抗凍蛋白，也稱“冰結(jié)構(gòu)蛋白”，是一類附著在冰晶體表面而抑制冰晶的生長和重結(jié)晶的活性蛋白質(zhì)?？箖龅鞍子捎谄渚哂锌刂票L、減少細(xì)胞損傷及保持產(chǎn)品原有組織結(jié)構(gòu)、質(zhì)地和品質(zhì)的特點和突出意義而成為熱點研究主題。同樣的研究還表明，抗凍蛋白的抗凍活性片斷只存在于局部的特異多肽鏈結(jié)構(gòu)域而并不是整體蛋白質(zhì)在起作用，即使是純化了的抗凍蛋白，抗凍活性往往不高，仍然需要探究其活性域來進(jìn)一步提高抗凍效率。所以，如何獲得食品源的結(jié)構(gòu)緊湊的高活性抗凍多肽，就成為抗凍蛋白迫切的研究方向。
[0004]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種利用木瓜蛋白酶酶解魚源膠原蛋白制備的抗凍多肽，使抗凍活性得以高 效地實現(xiàn)。
[0006]本發(fā)明的一種抗凍多肽，是由17個氨基酸所構(gòu)成的多肽。所述多肽的氨基酸序列為：Lys-Gly-Glu-Ala-Gly-Asp-Asn-Gly-Ala-Lys-Gly-Asp-Ala-Gly-Ser-Pro-Glyο
[0007]本發(fā)明提供的抗凍多肽的制備方法：以魚皮、魚鱗的魚源膠原蛋白為原料，對其進(jìn)行酶解，將酶解產(chǎn)物進(jìn)行分離純化得到所述抗凍多肽。
[0008]本發(fā)明進(jìn)一步提供一種所述抗凍多肽的制備方法的酶解條件為：木瓜蛋白酶：魚源膠原蛋白=1:10-15 (w/w)，pH為7.0、溫度是35°〇_40°C、酶解時間為20-40分鐘。其中優(yōu)選的方案為：木瓜蛋白酶：魚源膠原蛋白=1:10 (w/w)，pH為7.0、溫度是37°〇、酶解時間為30分鐘。
[0009]本發(fā)明還提供所述的抗凍多肽的制備方法的分離純化的步驟為：酶解產(chǎn)物首先利用Sephadex G-50凝膠色譜進(jìn)行分離,洗脫液為去離子水,流速為2mL/min,洗脫峰在225nm下進(jìn)行測量；收集具有最佳抗凍活性的峰，再用Sulfopropyl-Sepadex C-25陽離子交換色譜進(jìn)行分離，洗脫液為NaCl濃度梯度為0-0. 5 M的0.01mol/L pH7. O的磷酸緩沖液，流速為O. 5mL/min ;收集具有最佳抗凍活性的峰，利用RP-HPLC-C18反相高效液相色譜再進(jìn)行進(jìn)一步的分離，反相HPLC的分離條件是用10%-90% (v/v)乙腈溶液作為洗脫液梯度洗脫，流速為lmL/min,收集25%乙腈和75 %水(>八）處的洗脫峰，得到所述抗凍多肽。[0010]為了實現(xiàn)上述方案，本發(fā)明采取的具體步驟如下：
(I)明膠酶解條件的優(yōu)化
本技術(shù)所采用的酶和魚(魚皮、魚鱗）膠原蛋白購自Sigma生物試劑公司（中國?上海，酶活600u/mg)。采用單因素實驗，分別對三個酶解因素進(jìn)行考察，分別為酶解溫度35°C、37°C、40°C、45°C和50°C，酶解時間10、20、30、40和60分鐘以及酶-魚源膠原蛋白配比1:100、1:50、1:20、1:15和1:10 w/w。稱取I. 65克魚源膠原蛋白溶解于6ml Mili-Q水中，然后用2mol/L NaOH將其pH調(diào)節(jié)至7. O。先將該溶液水浴加熱到需要溫度，接著再按不同的酶-底物配比加入相應(yīng)量的酶，按照預(yù)定的反應(yīng)時間開始反應(yīng)。接著再在沸水浴中滅酶10分鐘，冷卻后再1000rpm離心10分鐘。上清液收集后，分別對其抗凍活性進(jìn)行測定，以確定最佳酶解條件。得到具有最大抗凍活性的酶解液的酶解條件是：PH為7. O、溫度是37°C、酶解時間為30分鐘、酶-底物配比為1:10。
[0011](2)酶解產(chǎn)物的分離、純化
先在最佳酶解條件下進(jìn)行酶解，得到的酶解產(chǎn)物先經(jīng)過Sephadex G-50凝膠色譜(長100cm,直徑2. 6cm)進(jìn)行分離,洗脫液為去離子水,流速為2mL/min,洗脫峰在225nm下進(jìn)行測量。收集具有最佳抗凍活性的峰，再用Sulfopropyl-Sepadex C-25陽離子交換色譜(長55cm,直徑2. Ocm)進(jìn)行分離,洗脫液為NaCl濃度梯度為0-0. 5 M的0.01mol/L pH7. O的磷酸緩沖液，流速為O. 5mL/min。收集具有最佳抗凍活性的峰，利用RP-HPLC反相高效液相色譜再進(jìn)行進(jìn)一步的分離，反相HPLC的分離條件是用10-90%乙腈溶液作為洗脫液，流速為lmL/min，得到高純度的特異性抗凍多肽。
[0012](3)抗凍活性的測試
本發(fā)明按照國際抗凍蛋白活性檢測的標(biāo)準(zhǔn)，建立抗凍活性檢測系統(tǒng)?？箖龌钚圆捎脵z測抗凍多肽對低溫凍融細(xì)菌的保護(hù)作`用來測試。
[0013](4)氨基酸序列測定
利用蛋白質(zhì)測序儀（Applied Biosystems Model 476A, Perkin Elmer Co. MA,U. S. A)測定特異性抗凍多肽的氨基酸全序列為：Lys-Gly-Glu-Ala-Gly-Asp-Asn-Gly-Ala-Lys-Gly-Asp-Ala-Gly-Ser-Pro-Glyο
[0014]本發(fā)明立足于抗凍蛋白的抗凍活性片斷只存在于特異的肽鏈結(jié)構(gòu)域而不是整體蛋白質(zhì)在起作用的理論基礎(chǔ)，以來自于魚源膠原蛋白為原材料，著眼于通過木瓜蛋白酶的切割條件控制，切割為具有特定的肽鏈長度和結(jié)構(gòu)域組成的活性多肽，而使抗凍活性得以高效地實現(xiàn)。本發(fā)明為開發(fā)基于食品源的抗凍多肽以及探索其在食品、醫(yī)學(xué)上的廣泛應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。
[0015]
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖I純化魚皮膠原蛋白抗凍多肽的CLC-HPLC-C18色譜圖；
圖2純化的特異性抗凍多肽對保加利亞乳酸桿菌的低溫保護(hù)作用；其中，圖中的A、B分別表示未添加特異性抗凍多肽樣品的保加利亞乳酸桿菌、添加O. 5% (w/w)特異性抗凍多肽樣品的保加利亞乳酸桿菌生長情況圖。
[0017]【具體實施方式】
[0018]本發(fā)明的抗凍多肽是由17個氨基酸所構(gòu)成的多肽。所述多肽的氨基酸全序列為：Lys-Gly-Glu-Ala-Gly-Asp-Asn-Gly-Ala-Lys-Gly-Asp-Ala-Gly-Ser-Pro-Glyο
[0019]制備方法如下：
以魚源膠原蛋白為原料，使用木瓜蛋白酶對其進(jìn)行酶解，并按照國際抗凍蛋白活性檢測的標(biāo)準(zhǔn)，建立抗凍活性檢測系統(tǒng)，優(yōu)化其酶解條件，得到具有最大抗凍活性的酶解液的酶解條件是：酶解PH為7. O、溫度是37°C、酶解時間為30分鐘、酶-底物配比為1:10 ;在最佳酶解條件下進(jìn)行酶解，得到的酶解產(chǎn)物先經(jīng)過S印hadex G-50凝膠色譜(長100cm，直徑2. 6cm)進(jìn)行分離，洗脫液為去離子水，流速為2mL/min，洗脫峰在225nm下進(jìn)行測量。收集具有最佳抗凍活性的峰，再用Sulfopropyl-Sepadex C-25陽離子交換色譜(長55cm,直徑2.Ocm)進(jìn)行分離，洗脫液為NaCl濃度梯度為0-0. 5M的O. Olmol/L pH7. O的磷酸緩沖液，流速為O. 5mL/min。收集具有最佳抗凍活性的峰，利用RP-HPLC-C18反相高效液相色譜(長15cm,直徑O. 8cm)再進(jìn)行進(jìn)一步的分離，反相HPLC的分離條件是用10-90%乙腈溶液作為梯度洗脫液，流速為lmL/min，洗脫液自含10%乙腈和90%水（v/v)的混合液開始，至90%乙腈和10%水（v/v)的混合液結(jié)束，進(jìn)行梯度洗脫，收集25%乙腈和75 %水（v/v)處的洗脫峰，得到高純度的特異性抗凍多肽。
[0020]冷凍干燥得到本發(fā)明的抗凍多肽，是由17個氨基酸所構(gòu)成的多肽。所述多肽的氨基酸全序列為：Lys-Gly-Glu-Ala-Gly-Asp-Asn-Gly-Ala-Lys-Gly-Asp-Ala-Gly-Ser-Pro-Gly。
[0021]本發(fā)明采用的儀器、檢測手段如下：
【權(quán)利要求】
1.一種抗凍多肽，其特征在于：所述多肽的氨基酸序列為：Lys-Gly-Glu-Ala-Gly-Asp-Asn-Gly-Ala-Lys-Gly-Asp-Ala-Gly-Ser-Pro-Glyο
2.一種如權(quán)利要求1所述的抗凍多肽的制備方法，其特征在于：以魚皮、魚鱗的魚源膠原 蛋白為原料，對其進(jìn)行酶解，將酶解產(chǎn)物進(jìn)行分離純化得到所述抗凍多肽。
3.—種如權(quán)利要求2所述的抗凍多肽的制備方法，其特征在于：所述酶解條件為：木瓜蛋白酶：魚源膠原蛋白=1:10-15 (w/w), pH為7.0、溫度是35°〇_40°C、酶解時間為20-40分鐘。
4.一種如權(quán)利要求3所述的抗凍多肽的制備方法，其特征在于：所述酶解條件為：木瓜蛋白酶：魚源膠原蛋白=1:10 (w/w)，pH為7.0、溫度是37°〇、酶解時間為30分鐘。
5.一種如權(quán)利要求2所述的抗凍多肽的制備方法，其特征在于：所述分離純化的步驟為：所述分離純化的具體步驟為：酶解產(chǎn)物首先利用Sephadex G_50凝膠色譜進(jìn)行分離，洗脫液為去離子水，流速為2mL/min，洗脫峰在225nm下進(jìn)行測量；收集具有最佳抗凍活性的峰，再用Sulfopropyl-Sepadex C-25陽離子交換色譜進(jìn)行分離，洗脫液為NaCl濃度梯度為0-0. 5 M的O. Olmol/L pH7. O的磷酸緩沖液，流速為O. 5mL/min ;收集具有最佳抗凍活性的峰，利用RP-HPLC反相高效液相色譜再進(jìn)行進(jìn)一步的分離，反相HPLC的分離條件是用10%-90% (v/v)乙腈溶液作為洗脫液梯度洗脫，流速為lmL/min，收集25%乙腈和75 %水&/V)處的洗脫峰，得到所述的抗凍多肽。
【文檔編號】C07K14/46GK103483440SQ201310441149
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年9月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月25日
【發(fā)明者】汪少蕓, 蔡茜茜, 王文龍, 饒平凡 申請人:福州大學(xué)