專利名稱：一株枯草芽孢桿菌及其在生產(chǎn)抗菌肽中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株枯草芽孢桿菌及其在生產(chǎn)抗菌肽中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
Sublancin抗菌肽是枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)產(chǎn)生一種具有抗菌活性的內(nèi)源性多肽，主要通過(guò)核糖體途徑合成，主要通過(guò)前導(dǎo)序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后修飾和轉(zhuǎn)運(yùn)。Sublancin抗菌肽的分子量為3877U，為無(wú)色結(jié)晶和白色結(jié)晶性粉末，易溶于水。Sublancin抗菌肽含有二硫鍵,具有較好的穩(wěn)定性。Sublancin抗菌肽對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌具有較強(qiáng)的抑制和殺滅作用，可應(yīng)用于食品保鮮、抗感染以及環(huán)境消毒。目前，國(guó)內(nèi)外尚未有可實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的sublancin抗菌肽的生
產(chǎn)方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株枯草芽孢桿菌及其在生產(chǎn)抗菌肽中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)BF168,已于2013年01月25日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCCJia:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號(hào)為CGMCC N0.7200?？莶菅挎邨U菌(Bacillus subtilis) BF168CGMCC N0.7200簡(jiǎn)稱枯草芽孢桿菌BF168。本發(fā)明還保護(hù)枯草芽孢桿菌BF168在生產(chǎn)sublancin抗菌肽或抗菌物質(zhì)中的應(yīng)用。本發(fā)明還保護(hù)一種生產(chǎn)sublancin抗菌肽或抗菌物質(zhì)的方法,包括如下步驟:發(fā)酵枯草芽孢桿菌BF168,得到sublancin抗菌肽或抗菌物質(zhì)。所述發(fā)酵采用的培養(yǎng)基由水和溶質(zhì)組成；每立方米培養(yǎng)基中含如下溶質(zhì):玉米面25-35kg (如 25-30kg 或 30-35kg)，豆柏 15_20kg (如 15_18kg 或 18_20kg)，蛋白胨 15_25kg(如 15-20kg 或 20-25kg)，葡萄糖 l-5kg (如 l_3kg 或 3_5kg)，KH2P042_5kg (如 2_3kg 或3_5kg),硫酸銨 3-8kg (如 3-5kg 或 5_8kg)。所述發(fā)酵的參數(shù)如下:發(fā)酵時(shí)間為32小時(shí)，攪拌速度為150r/min，溫度為36-37°C，壓力為0.02-0.04Mpa ;發(fā)酵過(guò)程中，前31個(gè)小時(shí)pH為6.5，之后I個(gè)小時(shí)pH為
6.0 ;發(fā)酵過(guò)程中，前8個(gè)小時(shí)通氣量為500m3/h，之后24個(gè)小時(shí)通氣量為750m3/h。所述方法中，在所述發(fā)酵之前還包括種子培養(yǎng)的步驟。所述種子培養(yǎng)采用的培養(yǎng)基如下:將25-35g(如25-30g或30_35g)玉米面、15_20g(如 15-18g 或 18-20g)豆柏、10-15g (如 10-12.5g 或 12.5_15g)蛋白胨、10_20g (如 10_15g或 15-20g)葡萄糖、2-5g (如 2-3g 或 3_5g)KH2P04 和 1-1.5g (如 1-1.25g 或 1.25-1.5g)硫酸銨溶于水并用水定容至1L。所述種子培養(yǎng)的參數(shù)如下:培養(yǎng)時(shí)間為12小時(shí)，攪拌速度為80_90r/min，溫度為36-370C，pH為7.0-7.5，壓力為0.04Mpa ;發(fā)酵過(guò)程中，前4個(gè)小時(shí)通氣量為13m3/h，之后4個(gè)小時(shí)通氣量為20m3/h，最后4個(gè)小時(shí)通氣量為25m3/h。所述種子培養(yǎng)中，可以進(jìn)行一次轉(zhuǎn)接，并采用相同條件培養(yǎng)一次。所述方法中，在所述發(fā)酵之后還包括將所述發(fā)酵得到的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行純化的步驟；所述純化依次包括如下步驟:(I)陶瓷膜過(guò)濾；(2)蒸發(fā)干燥；(3)噴霧干燥。所述陶瓷膜過(guò)濾的參數(shù)如下:陶瓷膜孔徑為50nm，進(jìn)膜壓力為0.5-0.7MPa (如
0.5-0.6MPa 或 0.6-0.7MPa),出膜壓力為 0.2-0.4MPa (如 0.2-0.3MPa 或 0.3-0.4MPa),進(jìn)膜溫度彡 430C (如 32-43°C、32-40°C或 40-43°C )，進(jìn)料溫度彡 39°C (如 30-39°C、30-35°C或 35-39。。)。所述蒸發(fā)干燥的參數(shù)如下:一效溫度68_78°C (如68_75°C或75_78°C )，二效溫度49-590C (如 49-54°C或 54-59°C)，殺菌溫度 86°C-94°C (如 86_90°C或 90_94°C )。蒸發(fā)干燥時(shí)，可進(jìn)行兩次處理，第一次處理2個(gè)小時(shí)，第二次處理1.5個(gè)小時(shí)。所述噴霧干燥的參數(shù)如下:進(jìn)風(fēng)溫度160-185 °C (如160-175 °C或175-185 °C );塔內(nèi)溫度 95-115 °C (如 95-105 °C 或 105-115 °C);塔內(nèi)壓力-0.05 至-0.1MPa (如-0.05至-0.075IMPa 或-0.075IMPa 至-0.1MPa)。所述種子培養(yǎng)的初始時(shí)刻，將枯草芽孢桿菌BF168的菌液接種至所述種子培養(yǎng)基(所述菌液與所述種子培養(yǎng)基的體積比具體可為1:100)。所述枯草芽孢桿菌BF168的菌液的制備方法具體如下:(I)取菌落接種于LB液體培養(yǎng)基、37°C、220rpm振蕩培養(yǎng)30小時(shí)；(2)將 步驟(I)得到的菌液按1:100的體積比接種至所述種子培養(yǎng)基，37°C、220rpm振蕩培養(yǎng)30小時(shí)。將所述種子培養(yǎng)得到的菌液接種至所述發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí)，所述菌液與所述發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比可為1:20。所述抗菌物質(zhì)具體可為抗細(xì)菌的物質(zhì)。所述細(xì)菌可為金黃色葡萄球菌、嗜水氣單胞菌、蠟樣芽孢桿菌、鰻弧菌或魏氏梭菌。本發(fā)明的方法具體有如下優(yōu)點(diǎn):(1)以玉米和大豆加工品等糧食產(chǎn)品為主要原料，代替了實(shí)驗(yàn)室中化學(xué)試劑級(jí)別的原料，降低了生產(chǎn)成本；(2)可以實(shí)現(xiàn)sublancin抗菌肽或抗菌物質(zhì)的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)；(3)可以提高sublancin抗菌肽或抗菌物質(zhì)的生產(chǎn)效率,發(fā)酵液中的sublancin抗菌肽的含量可達(dá)80-150mg/L ; (4)產(chǎn)量高、成本低、產(chǎn)物純度高，生產(chǎn)過(guò)程中對(duì)操作人員要求低、工藝簡(jiǎn)單，易于推廣。


圖1為標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。LB液體培養(yǎng)基:將IOg胰蛋白胨、5g酵母提取物和IOg NaCl溶于水并用水定容至1L，自然pH。LB固體培養(yǎng)基:將IOg胰蛋白胨、5g酵母提取物、IOg NaCl和15g瓊脂溶于水并用水定容至1L,自然pH。載體pBluescriptll SK(+),其核苷酸序列見(jiàn) GENBANK ACCESSIONN0.X52328.10 載體 pGJ103:參考文獻(xiàn):Ming-Ming, Y.，Z.We1-Wei, Z.X1-Feng, andC.Pe1-LinConstruction and characterization of a novel maltose inducibleexpressionvector in Bacillus subtilis[J].Biotechnol Lett..2006.28:1713-8?？莶菅勘U菌 1A747:購(gòu)自 Bacillus Genetic Stock Centre of the Ohio StateUniversity (Columbus, OH, USA),序列號(hào)為 1A747。實(shí)施例1、枯草芽孢桿菌BF168的獲得和保藏一、枯草芽孢桿菌BF168的獲得1、將載體pBluescriptll SK (+)作為骨架載體，在其EcoRI和BamHI酶切位點(diǎn)之間正向插入sumo蛋白酶的表達(dá)操縱子(序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子),在其BamHI和SacI酶切位點(diǎn)之間正向插入釀酒酵母小分子泛素樣蛋白與sublancin抗菌肽的融合蛋白表達(dá)操縱子(序列表的序列3所示的雙鏈DNA分子，其中sublancin抗菌肽基因如序列表的序列I所示)，得到重組質(zhì)粒D1778-1。2、合成序列表的序列4所示的雙鏈DNA分子(枯草芽孢桿菌p43啟動(dòng)子)，插入載體PGJ103，得到重組質(zhì)粒pGJ284。3、用限制性內(nèi)切酶EcoR I與Sac I雙酶切重組質(zhì)粒D1778-1，回收約1485bp的片段。4、用限制性內(nèi)切酶EcoR I與Sac I雙酶切重組質(zhì)粒pGJ284，回收約752bp的片段。5、將步驟3回收的片段和步驟4回收的片段連接，得到重組質(zhì)粒pNFll。6、將重組質(zhì)粒pNFll電擊(2500V、5ms)轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌1A747的感受態(tài)細(xì)胞，然后立即轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的LBSPG培養(yǎng)基(溶劑為pH7.2、50mM的PBS緩沖液，溶質(zhì)及其濃度為:胰蛋白胨0.1g/1OOmL,酵母提取物0.5g/100mL,蔗糖0.5g/100mL)，37°C、200rpm恢復(fù)培養(yǎng)I小時(shí)，然后4500rpm離心并收集菌體，涂布于含有5 μ g/ml氯霉素的LB培養(yǎng)基平板，37°C培養(yǎng)至單菌落出現(xiàn)。7、挑取單菌落，擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，采用Fl和Rl組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR鑒定，如果顯示1300bp的特異條帶，該菌為重組枯草芽孢桿菌。挑取單菌落，擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，采用Fl和Rl組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR鑒定，如果顯示1300bp的特異條帶，該菌為重組枯草芽孢桿菌。Fl:5，-CGTTTGCGCTTGTTCCGGAAC-3，；Rl:5，-CTGCCGGGCCTGCAGAAATAAC-3，。共得到4株重組枯草芽孢桿菌。8、分別將步驟7得到的4株枯草芽孢桿菌進(jìn)行如下鑒定:將單菌落接種到25ml LB液體培養(yǎng)基，32°C、200rpm振蕩培養(yǎng)12小時(shí)(此時(shí)OD6tltol為2-4);加5ml30g/100mL麥芽糖水溶液，32°C、250rpm振蕩培養(yǎng)36小時(shí)；調(diào)整pH至8.5，25°C、200rpm振蕩培養(yǎng)12小時(shí)；10000rpm離心10分鐘，收集上清液。用高效液相色譜法檢測(cè)上清液中的S ublancin抗菌肽濃度。高效液相色譜儀為Agilentl260,色譜柱為 Z0RBAX300SB-C8 (4.6 X 150mm，5 μ m)，流速為 lml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm，柱溫為25°C。洗脫液由溶液A和溶液B組成。溶液A為0.1%三氟乙酸水溶液。溶液B為含80% (體積比)乙腈和0.085%三氟乙酸的水溶液。洗脫過(guò)程:第O-1min,溶液A占洗脫液的體積比為80% ;第l-15min，溶液A占洗脫液的體積比由80%線性下降至47% ;第15-15.0lmin,溶液B占洗脫液的體積比由53%線性上升至100% ;第15.01_17min，溶液B占洗脫液的體積比為100% ;第17-17.0lmin，溶液A占洗脫液的體積比由0%線性上升至80%。Sublancin抗菌肽標(biāo)準(zhǔn)品的出峰位置為12.5min_14min保留時(shí)間，峰面積與Sublancin抗菌肽濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=47.614x+7.1974 (x為標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量、單位為ng, y為平均峰面積)。收集目標(biāo)峰并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算上清液中的Sublancin抗菌肽濃度。4株枯草芽孢桿菌得到的上清液中的Sublancin抗菌肽濃度分別為2mg/L、2.3mg/L、2.5mg/L 和 L 8mg/L。將產(chǎn)量最高的一株菌命名為枯草芽孢桿菌BF168。二、枯草芽孢桿菌BF168的保藏枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)BF168已于2013年Ol月25日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCCJia:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號(hào)為CGMCC N0.7200?？莶菅挎邨U菌(Bacillus subtilis) BF168CGMCC N0.7200 簡(jiǎn)稱枯草芽孢桿菌 BF168。實(shí)施例2、應(yīng)用枯草芽孢桿菌BF168生產(chǎn)Sublancin抗菌肽或抗菌物質(zhì)種子培養(yǎng)基:將30g玉米面、18g豆柏、12.5g蛋白胨、15g葡萄糖、3g KH2PO4和1.25g硫酸銨溶于水并用水定容至1L。發(fā)酵罐培養(yǎng)基:30kg玉米面、18kg豆柏、20kg蛋白胨、3kg葡萄糖、3kg KH2PO4和5kg硫酸銨溶于水并用水定容至I立方米 。一、菌種活化從_70°C冰箱取出凍干保存的枯草芽孢桿菌BF168，接種于LB斜面培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)30小時(shí)。二、菌種擴(kuò)大培養(yǎng)1、從步驟一的斜面上取菌落接種于LB液體培養(yǎng)基(每個(gè)250ml的錐形瓶裝有30mlLB液體培養(yǎng)基)、371:、220印111振蕩培養(yǎng)30小時(shí)。2、將步驟I得到的菌液按1:100的體積比接種至種子培養(yǎng)基(每個(gè)500ml的錐形瓶裝有50ml培養(yǎng)基)，371:、220印111振蕩培養(yǎng)30小時(shí)。三、種子罐培養(yǎng)種子罐KMYR09040-30L和種子罐KMYR09040-3M3:浙江科美制藥機(jī)械有限公司。1、將步驟二得到的菌液按1:100的體積比接種至種子罐KMYR09040-30L (30L種子罐，裝有15L種子培養(yǎng)基)，按照表I的參數(shù)進(jìn)行培養(yǎng)。2、將步驟I得到的菌液按1:100的體積比接種至種子罐KMYR09040-3M3 (3立方米種子罐，裝有1.5立方米種子培養(yǎng)基)，按照表I的參數(shù)進(jìn)行培養(yǎng)。表I培養(yǎng)參數(shù)
權(quán)利要求
1.枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) BF168，其保藏編號(hào)為 CGMCC N0.7200。
2.權(quán)利要求1所述枯草芽孢桿菌在生產(chǎn)sublancin抗菌肽或抗菌物質(zhì)中的應(yīng)用。
3.—種生產(chǎn)sublancin抗菌肽或抗菌物質(zhì)的方法,包括如下步驟:發(fā)酵權(quán)利要求1所述枯草芽孢桿菌，得到sublancin抗菌肽或抗菌物質(zhì)。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于:所述發(fā)酵采用的培養(yǎng)基由水和溶質(zhì)組成；每立方米培養(yǎng)基中含如下溶質(zhì):玉米面25-35kg,豆柏15-20kg,蛋白胨15_25kg,葡萄糖l-5kg，KH2P042-5kg，硫酸銨 3-8kg。
5.如權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于:所述發(fā)酵的參數(shù)如下:發(fā)酵時(shí)間為32小時(shí)，攪拌速度為150r/min，溫度為36_37°C，壓力為0.02-0.04Mpa ;發(fā)酵過(guò)程中，前31個(gè)小時(shí)pH為6.5，之后I個(gè)小時(shí)pH為6.0 ;發(fā)酵過(guò)程中，前8個(gè)小時(shí)通氣量為500m3/h，之后24個(gè)小時(shí)通氣量為750m3/h。
6.如權(quán)利要求3或4或5所述的方法，其特征在于:所述方法中，在所述發(fā)酵之前還包括種子培養(yǎng)的步驟。
7.如權(quán)利要求3或4或5或6所述的方法，其特征在于:所述種子培養(yǎng)采用的培養(yǎng)基如下:將 25-35g 玉米面、15-20g 豆柏、10-15g 蛋白胨、10-20g 葡萄糖、2-5g KH2PO4 和 1-1.5g硫酸銨溶于水并用水定容至1L。
8.如權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于:所述種子培養(yǎng)的參數(shù)如下:培養(yǎng)時(shí)間為12小時(shí)，攪拌速度為80-90r/min，溫度為36-37。。，pH為7.0-7.5，壓力為0.04Mpa ;發(fā)酵過(guò)程中，前4個(gè)小時(shí)通氣量為13m3/h，之后4個(gè)小時(shí)通氣量為20m3/h，最后4個(gè)小時(shí)通氣量為25m3/h。
9.如權(quán)利要求3至8中任一所述的方法，其特征在于:所述方法中，在所述發(fā)酵之后還包括將所述發(fā)酵的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行純化的步驟；所述純化依次包括如下步驟:(I)陶瓷膜過(guò)濾；(2)蒸發(fā)干燥；(3)噴霧干燥。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于:所述陶瓷膜過(guò)濾的參數(shù)如下:陶瓷膜孔徑為50nm，進(jìn)膜壓力為0.5-0.7MPa，出膜壓力為0.2-0.4MPa，進(jìn)膜溫度彡43 V，進(jìn)料溫度< 39°C ;所述蒸發(fā)干燥的參數(shù)如下:一效溫度68-78°C，二效溫度49-59°C，殺菌溫度860C -940C ;所述噴霧干燥的參數(shù)如下:進(jìn)風(fēng)溫度160-185°C，塔內(nèi)溫度95_115°C，塔內(nèi)壓力-0.05 至-0.1MPa0
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一株枯草芽孢桿菌及其在生產(chǎn)抗菌肽中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)BF168，保藏編號(hào)為CGMCC No.7200。本發(fā)明還保護(hù)枯草芽孢桿菌BF168在生產(chǎn)sublancin抗菌肽或抗菌物質(zhì)中的應(yīng)用。本發(fā)明的方法具體有如下優(yōu)點(diǎn)(1)以玉米和大豆加工品等糧食產(chǎn)品為主要原料，代替了實(shí)驗(yàn)室中化學(xué)試劑級(jí)別的原料，降低了生產(chǎn)成本；(2)可以實(shí)現(xiàn)sublancin抗菌肽或抗菌物質(zhì)的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)；(3)可以提高sublancin抗菌肽或抗菌物質(zhì)的生產(chǎn)效率，發(fā)酵液中的sublancin抗菌肽的含量可達(dá)80-150mg/L；(4)產(chǎn)量高、成本低、產(chǎn)物純度高，生產(chǎn)過(guò)程中對(duì)操作人員要求低、工藝簡(jiǎn)單，易于推廣。
文檔編號(hào)C12P21/00GK103194411SQ201310119518
公開(kāi)日2013年7月10日 申請(qǐng)日期2013年4月8日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月8日
發(fā)明者譙仕彥 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)