抗草魚出血病病毒工程蛋白tat-vp7-tat及制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及抗草魚出血病病毒工程蛋白 TAT-VP7-T AT及制備方法和應(yīng)用，更具體涉及到一種5'和3'端分別連接蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu) 域多肽（TAT-PTD)的基因序列的融合蛋白基因 TAT-VP7-TAT亞單位疫苗，同時還涉及到一 種大腸桿菌基因工程菌株一種N端和C端都帶有蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域多肽的草魚出血病病毒 (GCRV)衣殼蛋白VP7融合蛋白的基因工程菌株；還涉及上述菌株表達(dá)的融合蛋白在抗草魚 出血病病毒的藥物中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 草魚（Ctenopharyngodon idellus)是中國淡水的主要養(yǎng)殖品種，是"四大家魚"之 一。草魚的飼養(yǎng)成本低，養(yǎng)殖范圍廣，產(chǎn)量約占中國淡水養(yǎng)殖總產(chǎn)量的20%，對中國農(nóng)業(yè)經(jīng) 濟的發(fā)展具有重要的意義。但其養(yǎng)殖過程病害較多，除了細(xì)菌性疾病和寄生蟲病之外，草魚 出血病可引起草魚大批死亡，其中草魚種苗階段受感染的死亡率高達(dá)90%，給生產(chǎn)養(yǎng)殖帶 來了巨大的損失。
[0003] 草魚呼腸孤病毒（Grass carp reovirus, GCRV)又稱草魚出血病病毒（Grass Carp Hae morrhage Virus, GCHV)主要引起草魚在魚種階段發(fā)生出血病。該病主要在草魚魚種階 段出現(xiàn)，它能引起魚種的大量死亡，具有極高的感染率和致死率，并且流行范圍廣、發(fā)病季 節(jié)長。1983年從草魚出血病中分離出一株草魚出血病病毒，根據(jù)其特性將其定名為草魚呼 腸孤病毒，該病毒隸屬水生呼腸孤病毒屬，是中國分尚的第一種魚類病毒。GCRV病毒粒子為 二十面體，呈5 : 3 : 2對稱球形顆粒，直徑為65~72nm，核心直徑約為50nm，無囊膜，具 有雙層衣殼。GCRV是雙鏈RNA(dsRNA)病毒，基因組由11條分節(jié)段的dsRNA組成，基因組 片段按分子量分為三組，即大片段（L1-L3)、中片段（M4-M6)和小片段（S7-S11)。這11條 dsRNA共編碼12種蛋白，包含7種結(jié)構(gòu)蛋白和5種非結(jié)構(gòu)蛋白，根據(jù)蛋白電泳迀移率將7種 結(jié)構(gòu)蛋白按從大到小的順序依次命名為VP1-VP7,其中VP1、VP3、VP5、VP6、VP7蛋白是構(gòu)成 病毒蛋白衣殼的組分；5種非結(jié)構(gòu)蛋白分別命名為NS16、NS26、NS31、NS38、NS80,它們在病 毒的復(fù)制過程中發(fā)揮著重要的作用。
[0004] 免疫預(yù)防是有效防治草魚出血病的主要方法，盡管中國已有滅活的草魚出血熱 病毒的傳統(tǒng)疫苗，在應(yīng)用上也有一定的效果，但這種傳統(tǒng)的疫苗，用活體魚來擴增病毒， 其病毒來源十分困難、難以形成產(chǎn)業(yè)化；即便如此，如采用注射免疫，實際應(yīng)用不可取，如 苗期采用浸泡使用，則到了大塘也用不起，且浸泡法在免疫機制上也說不清道不明，故 病毒亞單位疫苗的研宄對于防治此病至關(guān)重要。VP5-VP7蛋白復(fù)合體形成草魚出血病 病毒的外層蛋白衣殼，其中VP5蛋白由M6基因編碼，含有648個氨基酸殘基，分子量約 為68. 6kDa，可能在病毒感染過程中起到諸如細(xì)胞滲透的作用。VP7蛋白由SlO基因編 碼，含有276個氨基酸殘基，分子量約為29. 8kDa，它含有1個鋅指序列，可以調(diào)芐基因表 達(dá)，該蛋白可能與病毒與宿主細(xì)胞的相互作用以及病毒入侵宿主有關(guān)。研宄表明，VP5和 VP7 抗體都能與抗原中和（Yongxing He, Hongxu Xu, Qian Yang, Dan Xu, Liqun Lu. The use of an in vitro micr oneutralization assay to evaluate the potential of recombinant VP5protein as an antigen fo r vaccinating against Grass carp reovirus[J]. Virology Journal, 20118:132)(Zhang L L, She n J Y, Fang Q,et al. High level expression of grass carp reovirus VP7protein in prokar yotic cells[J]. Virologica Siniea, 2008, 23(1) :51-56)。VP7蛋白具有較好的抗原性，其抗體中和活性是 VP5的3倍，表明VP7可能是GCRV主要的抗原決定簇（Shao L，Sun X，F(xiàn)ang Q, Antibodies against outer-capsid proteins of grass carp reovirus expressed in E. coli are c apable of neutralizing viral infectivity. Virology Journal, 2011，8:347) 〇體外中和 試驗也表明VP7多克隆抗體具有中和活性，使研制GCRV亞單位疫苗成為可能（He Y X，Yang Q，Xu H X，et al. Prokaryotic expression and purification of grass carp reovirus capsid protei n VP7and its vaccine potential. African Journal of Microbiology Research，2011，5 (13) :1643-1648)。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，口服疫苗是一種最有效的防病治病方 法。利用基因工程技術(shù)，大腸桿菌作為宿主菌表達(dá)出亞單位疫苗蛋白，經(jīng)過分離純化后作為 飼料添加劑，是符合水產(chǎn)養(yǎng)殖的有效途徑。
[0005] 蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域（protein transduction domain，PTD)是一條以肽為載體的 有效運輸各種物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞及細(xì)胞核的系統(tǒng)。通過PTD攜帶的物質(zhì)有全長蛋白質(zhì)、DNA、化 學(xué)藥物、寡核苷酸、40nm磁珠和200nm脂質(zhì)體等?，F(xiàn)在研宄最多、應(yīng)用最廣的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域來 源于人免疫缺陷病毒1型（HIV-I)的轉(zhuǎn)錄激活因子（Trans-activating transcriptional activator，Tat)。T at蛋白中存在3個功能結(jié)構(gòu)域：位于N-端的酸性區(qū)，主要起反式激 活的功能；位于第22-37位氨基酸之間的DNA結(jié)合區(qū)，該區(qū)域富含半胱氨酸；位于第47-60 位氨基酸之間的堿性區(qū)，是主要的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，參與Tat蛋白的細(xì)胞內(nèi)化作用。Tat蛋 白共有86個氨基酸，Schwarze等確定具有蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的最小肽段是47-57,由11個氨 基酸組成，其序列為YG RKKRRQRRR，含有6個精氨酸和2個賴氨酸殘基，等電點為12. 7， 因此是帶有高度正電荷的多肽。以不帶電荷的丙氨酸替代其中的任何一個堿性氨基酸殘 基都會使穿膜活性降低，而替代序列中的其他氨基酸殘基時穿膜活性則不會發(fā)生改變，說 明TAT穿膜肽所帶的正電荷是其穿膜功能所必需的，因此推測這些正電荷很可能是能夠 與真核細(xì)胞的細(xì)胞膜發(fā)生強的靜電作用，從而介導(dǎo)了穿膜過程。TAT可以將與之相連的 多肽或蛋白質(zhì)在數(shù)分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞，而且在體內(nèi)可以通過血液循環(huán)運輸至腦組織，跨 越血腦屏障進(jìn)入神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)，轉(zhuǎn)導(dǎo)速度快，效率高。已有研宄顯示，幾十種化合 物和蛋白質(zhì)被成功轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入不同的細(xì)胞或者跨越血腦屏障，并表現(xiàn)出了相應(yīng)的生物活性 (Yi Zhang1Jian-Fang Ning, Xing-qin Qu, X iao-Lin Meng, Jin-Ping Xu〇 TAT-mediated oral subunit vaccine against white spot syndro me virus in crayfish, Journal of Virological Methods, 2012, 181:59 - 67.專利號：CN 102206660B)。
[0006] 盡管對于TAT蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的穿膜功能研宄的比較多，但是到目前為止，TAT 蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域進(jìn)入細(xì)胞的分子機制還沒有完全研宄清楚。早期研宄認(rèn)為是通過直接轉(zhuǎn) 運機制穿過細(xì)胞膜，且是不依賴于能量的，但最近的研宄也有與這一觀點不同的結(jié)果。盡管 其進(jìn)入細(xì)胞的機制還沒有完全研宄透徹，但TAT蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的應(yīng)用已經(jīng)十分廣泛。 將TA T的跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)域編碼的基因與外源蛋白基因進(jìn)行融合表達(dá)，為異緣蛋白穿過細(xì)胞 膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部提供了一條新的途徑。因此，利用首尾TAT與VP7蛋白融合，經(jīng)草魚口服 產(chǎn)生免疫，是防治草魚出血病的有效方法，具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種融合蛋白TAT-VP7-TAT，其序列為SEQ ID NO. 2所示。
[0008] 本發(fā)明的另一個目的在于提供融合蛋白TAT-VP7-TAT對應(yīng)的的核苷酸序列，優(yōu)選 編碼序列為SEQ ID NO. 1所示。
[0009] 本發(fā)明的另一個目的在于提供一種大腸桿菌基因工程菌株，該菌株可以高效表 達(dá)N端和C端都帶有蛋白