專利名稱：利用鮮海參加工廢液制備海參皂苷Holotoxin A₁對(duì)照品的工藝方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用鮮海參加工廢液制備海參皂苷Holotoxin A1對(duì)照品的工藝 方法。
背景技術(shù)：
海參皂苷具有重要的生物學(xué)活性，如抗真菌、抗腫瘤、抗炎、抗病毒、提高免疫力 等，1976年，日本學(xué)者Kitagawa便從刺參(stichopus japonicus shlenka)中分離出具有 顯著抗真菌活性的皂苷類物質(zhì)，holotoxin A和B，現(xiàn)已經(jīng)成為腳氣和腳癬的治療藥物。此 后，對(duì)海參皂苷的研究倍受學(xué)者們關(guān)注。我國(guó)對(duì)于海參皂苷的研究始于上世紀(jì)80年代，已先后分離純化出100余種不同結(jié) 構(gòu)的海參皂苷。海參皂苷分離純化方法有多種，包括如下如2005年，第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院海洋藥物中心在《第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)》第沈卷 第6期，發(fā)表了 “糙海參中三萜活性成分的研究”，分離鑒定了 5個(gè)三萜皂苷化合物，分別為 24-dehydroechinoside A(I), echinoside B(2), echinoside A(3), holothurin B(4)禾口 holothurin A (5)，其分離純化的主要特點(diǎn)是糙海參干燥、粉碎(7. 0kg)，用70%乙醇冷浸 提取(200LX3次)，回收乙醇得流浸膏，分散在水中，依次用石油醚、三氯甲烷、正丁醇萃 取，得到石油醚部分、三氯甲烷部分和正丁醇部分，糙海參皂苷主要集中于正丁醇部分。正 丁醇部位減壓濃縮得糙海參總皂苷(75. Sg)。總皂苷經(jīng)大孔樹脂柱層析和kphadex LH-20 葡聚糖凝膠過(guò)濾純化，經(jīng)反復(fù)的正相硅膠柱層析處理，氯仿甲醇水(7 3 1，下層) 洗脫，再經(jīng)反相硅膠柱層析分離(洗脫劑為62%甲醇溶液)，最后通過(guò)HPLC純化(流動(dòng)相 為60%甲醇溶液，流速為1. 5ml/min)。2006年，第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院海洋藥物中心在《中草藥》第4期，發(fā)表了 “黑乳海 參中兩個(gè)新的三萜皂苷”，其分離純化的主要特點(diǎn)新鮮黑乳海參材料洗凈、切碎后，用85% 乙醇冷浸提取，回收乙醇得流浸膏。將流浸膏均勻分散在水中，用二氯甲烷萃取，待二氯甲 烷萃取液顏色變得極淺后，再用正丁醇萃取?；厥照〈技纯傻玫胶谌楹⒋衷碥?。取粗 皂苷60mg，溶于120mL由吡啶-二氧六環(huán)等體積混合的溶劑中，120°C加熱21 ！。反應(yīng)物冷 卻后，回收溶劑，所得浸膏用硅膠低壓柱色譜處理，氯仿甲醇水(7.5 2.5 1，下層) 洗脫，得到的主成分再進(jìn)行高效液相柱色譜純化，色譜柱為hbax SB C218型ODS反相柱， 洗脫劑為80%甲醇，體積流量為1. 5mL/min，得到2個(gè)化合物。2006年，第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院海洋藥物中心在《中國(guó)天然產(chǎn)物》第4卷，發(fā)表了“花 刺參中兩個(gè)新的三萜皂苷”，其分離純化的主要特點(diǎn)新鮮花刺參(約15kg)，絞碎，用70% 的乙醇冷浸3次，每次7d,減壓回收乙醇提取液得流浸膏。用甲醇反復(fù)多次溶解，過(guò)濾除去 不溶物，甲醇組分減壓回收至浸膏狀。再將其分散在水中，水溶液用石油醚萃取3次，脫脂 后的溶液用正丁醇萃取6次，減壓回收正丁醇部分得到粗總皂苷(17. 6g)?？傇碥战?jīng)反復(fù) 的正相和反相硅膠柱層析分離，以及kphadex LH-20純化，所得主成分進(jìn)行制備HPLC純化(流動(dòng)相為65%甲醇)，流速為1. 5mL · min-l，得到化合物I (19. 6mg)，化合物II。2008年，第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院海洋藥物中心在《中國(guó)海洋藥物雜志》第27卷，發(fā)表 了 “丑海參的化學(xué)成分研究”，分離鑒定了 3個(gè)海參皂苷Holothurin Al ( I ), Holothurin A( II ) ^PPervicoside C(III)，其分離純化的主要特點(diǎn)是丑海參干品3. 8kg粉碎，用70% 乙醇加熱回流提取4次，合并提取液，減壓濃縮至無(wú)醇味，分散水中，進(jìn)行大孔樹脂柱分離， 依次用水、70%乙醇和95%乙醇洗脫，70%乙醇洗脫液濃縮得總皂苷(83g)?？傇碥者M(jìn)行快 速硅膠柱色譜分離，用CHCl3 MeOH H2O梯度洗脫(8 2 1,7 3 1,6. 5 3. 5 1)， 分為A J 10個(gè)組分，TLC檢測(cè)表明海參皂苷主要在J組分中(7. 03g)。取J組分1. Og, 進(jìn)行MPLC(0DS反相硅膠)分離，以70% MeOH洗脫，得到J 1，J 2和J 33個(gè)組分J 1經(jīng) HPLC制備，以50% MEOH洗脫，得到化合物I (13mg) ;J 2經(jīng)HPLC制備，以54% MEOH洗脫， 得到化合物II (220mg) J 3經(jīng)HPLC制備，以54% MEOH洗脫，得到化合物III (24mg)。C組 分(940mg)進(jìn)行硅膠柱和kphadexLH-20柱分離，得化合物IV (64mg)。以上對(duì)海參皂苷單體的分離純化均從鮮海參或干參中獲得。2006年，中國(guó)海洋大學(xué)以海參廢液為原材料提取制備了水溶性海參皂苷，在《中國(guó) 海洋大學(xué)學(xué)報(bào)》第36卷，發(fā)表了“仿刺參水溶性海參皂苷的分離制備及抗真菌活性的研究”， 其主要特點(diǎn)是海參廢棄液用lmol/L NaOH調(diào)節(jié)pH= 10，離心(8000r/min，30min)收集上 清液，上樣于預(yù)處理的AB-8型大孔吸附樹脂柱，用去離子水沖洗后，分別用20%和70%的 乙醇溶液進(jìn)行洗脫，收集70%乙醇的洗脫組分，減壓濃縮至浸膏狀，加入少量蒸餾水重新溶 解，離心(8000r/min，40min)收集上清液，經(jīng)石油醚萃取脫脂后，將水層再利用水飽和的正 丁醇萃取3次，合并所得正丁醇層，減壓濃縮至浸膏狀后進(jìn)行真空冷凍干燥，即得到水溶性 海參皂苷凍干品。文中從海參廢液中分離制備了海參皂苷，但對(duì)于Holotoxin A1純品的制 備還沒(méi)有報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提出一種利用鮮海參加工廢液制備海參皂苷Holotoxin A1對(duì)照品的工藝 方法。本發(fā)明的技術(shù)方案包括如下內(nèi)容(本發(fā)明所述百分?jǐn)?shù)均為濃度百分比)一種利用鮮海參加工廢液制備海參皂苷Holotoxin A1對(duì)照品的工藝方法，其特征 是它由如下步驟組成(1)將鮮海參加工廢液減壓濃縮后加入乙醇，靜置，待固液分層后， 吸取上清液；( 將所得上清液通過(guò)大孔吸附樹脂柱，吸附飽和后，分別利用水，20%乙醇 溶液沖洗；然后再利用70%乙醇溶液沖洗大孔吸附樹脂柱并收集洗脫液，將洗脫液減壓濃 縮得浸膏；(3)將所得浸膏拌樣硅膠粉，利用由甲醇，二氯甲烷，乙酸乙酯，水組成的溶液體 系進(jìn)行硅膠柱層析；再利用甲醇二氯甲烷乙酸乙酯水=2 2 4 1，取下層為展 開劑進(jìn)行TLC層析；收集硅膠柱層析遷移率為0. 2-0. 3的組分，將該組分減壓濃縮，真空干 燥得白色粉末。(4)將白色粉末利用乙腈水溶液溶解，利用HPLC，203nm紫外光吸收，乙腈水 溶液為流動(dòng)相進(jìn)行純化，收集主峰，真空干燥得海參皂苷Holotoxin A1對(duì)照品。TLC是指硅 膠板層析。本方案的具體特點(diǎn)還有所述鮮海參為新鮮刺參。將新鮮刺參煮制后的加工廢液減 壓濃縮后利用乙醇沉淀得到混合液，使乙醇在混合液中的濃度為15-25%，靜置分層后，取上清液。所述乙腈水溶液為45-55%乙腈水溶液。所述鮮海參加工廢液是指將新鮮刺參放 入沸騰的海水或自來(lái)水中煮10-40min，撈出海參后所得到的溶液。所述硅膠柱層析中的層 析液為甲醇二氯甲烷乙酸乙酯水=2 2 4 1，取下層。海參皂苷Holotoxin A1結(jié)構(gòu)式如下本發(fā)明充分利用新鮮刺參加工煮制過(guò)程中所產(chǎn)生的廢液，利用上述工藝方法，能 夠有效的分離純化出98%以上的海參皂苷Holotoxin A1對(duì)照品。本發(fā)明最顯著的特點(diǎn) 包括如下三個(gè)方面(1)利用新鮮刺參加工廢液，從中提取純度高于98%以上的海參皂苷 Holotoxin A1 ； (2)工藝方法僅采用醇沉取上清液、大孔樹脂層析、硅膠柱層析、HPLC層析 四步先后組合就可獲得98%以上純度的海參皂苷對(duì)照品，工藝簡(jiǎn)單；C3)HPLC層析，采用 203nm紫外光吸收，45-55%乙腈水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行純化，不同于文獻(xiàn)中報(bào)道的分離其它 海參皂苷單體(純品)的方法，如利用60%甲醇溶液為流動(dòng)相。本發(fā)明對(duì)于利用新鮮刺參 加工廢液分離純化制備海參皂苷Holotoxin A1對(duì)照品具有極高的利用價(jià)值。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1(1)收集新鮮刺參加工廢液2000L，65°C第一次減壓濃縮，濃縮至體積200L，固形 物含量為16 %，然后加入95 %的乙醇45L，靜置后取上清液。(2)上清液以2倍柱體積的流速通過(guò)AB-8型大孔吸附樹脂柱，過(guò)柱完畢后，利用 50L的純凈水沖洗，20L20%的乙醇溶液沖洗；再用30L70%的乙醇溶液沖洗大孔吸附樹脂 柱并收集本次沖洗的洗脫液，將洗脫液60°C濃縮得浸膏。(3)浸膏拌樣硅膠粉，采用甲醇二氯甲烷乙酸乙酯水=2 2 4 1，取 下層進(jìn)行硅膠柱層析，再利用甲醇二氯甲烷乙酸乙酯水=2 2 4 1為展開體 系，取下層進(jìn)行TLC層析，收集硅膠柱層析遷移率為0. 2-0. 3的組分，收集組分50°C濃縮，真
空干燥。(4)干燥組分利用乙腈水溶液溶解，利用HPLC，203nm紫外光吸收，45%的乙腈流動(dòng)相層析，收集主峰，真空干燥得海參皂苷Holotoxin A1對(duì)照品。通過(guò)上述步驟所得海參皂苷Holotoxin A1純度達(dá)98%以上。實(shí)施例2 (1)收集新鮮刺參加工廢液2000L，65°C第一次減壓濃縮，濃縮至體積200L，固形 物含量為13 %，然后加入95 %的乙醇70L，靜置后取上清液。(2)上清液以2倍柱體積的流速通過(guò)AB-8型大孔吸附樹脂柱，過(guò)柱完畢后，利用 50L的純凈水沖洗和20L20%的乙醇溶液沖洗；再用30L70%的乙醇溶液沖洗大孔吸附樹脂 柱并收集本次沖洗的洗脫液，將洗脫液50°C濃縮得浸膏。(3)浸膏拌樣硅膠粉，采用甲醇二氯甲烷乙酸乙酯水=2 2 4 1取下 層進(jìn)行硅膠柱層析，再利用甲醇二氯甲烷乙酸乙酯水=2 2 4 1為展開體系， 取下層進(jìn)行TLC層析，收集硅膠柱層析遷移率為0. 2-0. 3的組分，收集組分60°C濃縮，真空干燥。(4)干燥組分利用乙腈水溶液溶解，利用HPLC，203nm紫外光吸收，50%的乙腈流 動(dòng)相層析，收集主峰，真空干燥得海參皂苷對(duì)照品Holotoxin A10通過(guò)上述步驟所得海參皂苷Holotoxin A1純度達(dá)98%以上。
權(quán)利要求
1.一種利用鮮海參加工廢液制備海參皂苷Holotoxin ~對(duì)照品的工藝方法，其特征是 它由如下步驟組成(1)將鮮海參加工廢液減壓濃縮后加入乙醇，靜置，待固液分層后，吸取上清液；(2)將所得上清液通過(guò)大孔吸附樹脂柱，吸附飽和后，分別利用水，20%乙醇溶液沖洗； 然后再利用70%乙醇溶液沖洗大孔吸附樹脂柱并收集洗脫液，將洗脫液減壓濃縮得浸膏；(3)將所得浸膏拌樣硅膠粉，利用由甲醇，二氯甲烷，乙酸乙酯，水組成的溶液體系進(jìn)行 硅膠柱層析；再利用甲醇二氯甲烷乙酸乙酯水=2 2 4 1為展開體系，取下層 進(jìn)行TLC層析，收集硅膠柱層析遷移率為0. 2-0. 3的組分，將該組分減壓濃縮，真空干燥得 白色粉末；(4)將白色粉末利用乙腈水溶液溶解，利用HPLC，203nm紫外光吸收，乙腈水溶液為流 動(dòng)相進(jìn)行純化，收集主峰，真空干燥得海參皂苷Holotoxin A1對(duì)照品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用鮮海參加工廢液提取海參皂苷HolotoxinA1對(duì)照品的 工藝方法，其特征是所述鮮海參為新鮮刺參。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用鮮海參加工廢液制備海參皂苷HolotoxinA1對(duì)照品 的工藝方法，其特征是所述鮮海參加工廢液是指將新鮮刺參放入沸騰的海水或自來(lái)水中煮 10-40min，撈出海參后所得到的溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的利用鮮海參加工廢液制備海參皂苷Holot0XinA1對(duì)照品的工 藝方法，其特征是將新鮮刺參煮制后的得到的鮮海參加工廢液減壓濃縮后利用乙醇沉淀得 到混合液，使乙醇在混合液中的濃度為15-25%，靜置分層后，取上清液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用鮮海參加工廢液制備海參皂苷HolotoxinAJf照品的 工藝方法，其特征是所述乙腈水溶液為45-55%乙腈水溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用鮮海參加工廢液制備海參皂苷HolotoxinA1對(duì)照品 的工藝方法，其特征是所述硅膠柱層析中的層析液為甲醇二氯甲烷乙酸乙酯水= 2:2:4: 1，取下層。
全文摘要
一種利用鮮海參加工廢液制備海參皂苷Holotoxin A1對(duì)照品的工藝方法，其特征是它由如下步驟組成(1)將鮮海參加工廢液減壓濃縮醇沉，吸取上清液；(2)將所得上清液通過(guò)大孔吸附樹脂柱，吸附飽和后沖洗并收集洗脫液，將洗脫液減壓濃縮得浸膏；(3)將所得浸膏拌硅膠粉，利用由甲醇，二氯甲烷，乙酸乙酯，水組成的溶液體系進(jìn)行硅膠柱層析；再利用甲醇∶二氯甲烷∶乙酸乙酯∶水＝2∶2∶4∶1為展開體系，取下層進(jìn)行TLC層析，收集硅膠柱層析遷移率為0.2-0.3的組分，將該組分減壓濃縮，真空干燥得白色粉末。(4)將白色粉末利用乙腈水溶液溶解，利用HPLC，203nm紫外光吸收，乙腈水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行純化，收集主峰，真空干燥得海參皂苷Holotoxin A1對(duì)照品。本發(fā)明主要用于制備海參皂苷Holotoxin A1。
文檔編號(hào)C07J71/00GK102060905SQ20101054129
公開日2011年5月18日 申請(qǐng)日期2010年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月12日
發(fā)明者劉新, 劉昌衡, 夏雪奎, 孟秀梅, 張永剛, 張綿松, 王小軍, 袁文鵬, 賈愛(ài)榮 申請(qǐng)人:山東省科學(xué)院生物研究所