專利名稱：一種多發(fā)性骨髓瘤特異性蛋白及其專用檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種多發(fā)性骨髓瘤特異性糖基化蛋白質(zhì)及其專用檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
多發(fā)性骨髓瘤是血液系統(tǒng)常見的一種惡性腫瘤，表現(xiàn)為單克隆的漿細(xì)胞惡性增生。其發(fā)病率居血液惡性腫瘤發(fā)病率的第2位。多發(fā)性骨髓瘤起病緩慢、隱匿，早期臨床表現(xiàn)不明顯，容易被誤診。就診時大部分已經(jīng)是中晚期。因此需要研究有效、簡單的早期診斷標(biāo)志物及其診斷方法，以實現(xiàn)多發(fā)性骨髓瘤的早期發(fā)現(xiàn)(Oncologist，2007，12 :664 ； Journal of Clinical Oncology,2005, 23 :6345)。人血清/血漿中白蛋白是單鏈球形蛋白質(zhì)，也是血清/血漿中含量最高的蛋白質(zhì)， 通常情況下是非糖基化蛋白。其具有獨特的結(jié)構(gòu)和許多重要的生理功能。包括營養(yǎng)價值； 維持血液膠體滲透壓；清除自由基；還可以結(jié)合和運輸許多內(nèi)源性與外源性物質(zhì)，如血清 Ca2+、未結(jié)合膽紅素、游離脂肪酸以及甲狀腺激素等。人血清/血漿白蛋白本身還是許多內(nèi)源性物質(zhì)和外源性藥物的載體，藥物和白蛋白結(jié)合后，可以降低其生物利用度同時增加在體內(nèi)的半衰期(Clin Perinatol，2004，31 :475 Journal of Infusion Nursing, 2006, 29 260)。白蛋白可以通過改變其氧化狀態(tài)如糖基化、二硫鍵的增加來影響其蛋白構(gòu)象，進而影響和藥物的結(jié)合效率(British Journal of Pharmacology，2007，151 :580)。在多發(fā)性骨髓瘤的臨床檢查和診斷中，糖基化白蛋白水平同疾病進展有很大關(guān)系，是一個重要的預(yù)后指標(biāo)。人血清/血漿白蛋白三維結(jié)構(gòu)包括三個結(jié)構(gòu)上相似的功能域1 (1-195)、 11(196-383)和III (384-585)，每個結(jié)構(gòu)域又分為兩個相似的螺旋結(jié)構(gòu)的亞結(jié)構(gòu)域。亞結(jié)構(gòu)域 ΙΑ-IB、IIA-IIB、IIIA-IIIB 間的連接，則分別是 ltl6K 至119E、292E 至 ”5V、492E 至 511A 的三段伸展肽鏈，每個結(jié)構(gòu)域具有不同的結(jié)合特性。目前公認(rèn)在IIA和IIIA存在兩個芳香族或雜環(huán)類物質(zhì)的結(jié)合位點，在IB和IIIB存在長鏈脂肪酸的結(jié)合位點(Journal of Biological Chemistry, 1999,274 :29303 ；Protein Engineering, 1999，12 :439)。絕大部分藥物都與白蛋白的亞結(jié)構(gòu)域IIA結(jié)合，在此亞結(jié)構(gòu)區(qū)域中存在一個可以與許多藥物結(jié)合的較大的疏水區(qū)，其它亞域也可能對其結(jié)合產(chǎn)生影響。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種多發(fā)性骨髓瘤特異性糖基化蛋白質(zhì)及其專用檢測試劑
品.ο本發(fā)明所提供的多發(fā)性骨髓瘤特異性糖基化蛋白質(zhì)，其氨基酸序列為序列表中序列1，所述序列1的氨基端第342位氨基酸殘基為糖基化位點，該位點連接的糖鏈組成為 [Hex]5[HexNAc]5[Fuc] [NeuNAc]。上述多發(fā)性骨髓瘤特異性糖基化蛋白質(zhì)糖基化位點為mM(N為天冬酰胺)，屬于 N-連接的復(fù)雜型糖鏈，糖鏈組成為[Hex] 5[HexNAC]5[FuC] [NeuNAc]。其中，Hex表示己糖，HexNAc表示N-乙酰氨基己糖，F(xiàn)uc表示巖藻糖，NeuNAc表示唾液酸。342N糖基化位點位于 IIB，與健康人血清白蛋白的差異為自氨基端第344位丙氨酸(344A)突變?yōu)樘K氨酸(344T),該位點的突變所引起的糖基化可能與多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生有關(guān)。本發(fā)明所提供的檢測多發(fā)性骨髓瘤特異性糖基化蛋白質(zhì)的試劑盒，包括刀豆凝集素親和層析試劑盒、SDS-PAGE電泳試劑盒、胰蛋白酶、蛋白酶K、糖肽富集分離試劑盒和質(zhì)譜儀。所述糖肽富集分離試劑盒包括以質(zhì)量比為1 1的石墨碳和活性炭的混合物為填料的層析柱。所述石墨碳的顆粒直徑范圍為5-8 μ m,活性炭顆粒直徑范圍為3-5 μ m。所述刀豆凝集素親和層析試劑盒包括刀豆凝集素親和層析柱、結(jié)合緩沖液和洗脫緩沖液；所述結(jié)合緩沖液為由20mM Tris-HCl，0. 15M NaCl,lmM MnCl2, ImM CaCl2和水組成， pH7. 4的溶液；所述洗脫緩沖液為pH7. 4,0. 5M甲基- α -D-吡喃葡萄糖苷的水溶液。所述糖肽富集分離試劑盒還包括上樣緩沖液、平衡液和洗脫液；所述上樣緩沖液和平衡液均為ρΗ3. 0，體積百分濃度為0. 2%的甲酸溶液；所述洗脫液為含有體積百分濃度為0. 2%的甲酸的體積百分濃度為30%的乙腈溶液。本發(fā)明還提供一種檢測多發(fā)性骨髓瘤特異性糖基化蛋白質(zhì)的方法，包括下述步驟1)用刀豆凝集素親和層析的方法富集疑似多發(fā)性骨髓瘤患者血清中的糖蛋白，以健康人血清為對照；2) 10% SDS-PAGE電泳分離1)中得到多發(fā)性骨髓瘤患者血清中的糖蛋白，切下含有66kDa處與健康人血清中有差異的蛋白條帶的凝膠；3)將含有多發(fā)性骨髓瘤特異性糖基化蛋白質(zhì)的凝膠，進行胰酶膠內(nèi)酶切，之后加入蛋白酶K酶切，獲得雙酶切溶液；4)用層析分離方法富集步驟3)中獲得的雙酶切溶液中的糖肽；所述層析分離方法所用的層析柱的填料為質(zhì)量比為11的石墨碳和活性炭的混合物；5)利用基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜測定糖肽，獲得糖基化位點和糖鏈的信息；若獲得的蛋白的序列如序列1所示，并且自氨基端第342位氨基酸為糖基化位點，則該蛋白為多發(fā)性骨髓瘤特異性糖基化蛋白質(zhì)?？衫帽景l(fā)明的多發(fā)性骨髓瘤特異性糖基化蛋白質(zhì)的糖基化位點和其序列(與健康人血清白蛋白的差異為自氨基端第344位丙氨酸(344A)突變?yōu)樘K氨酸(344T))確診多發(fā)性骨髓瘤患者。利用本發(fā)明的試劑盒，可以通過檢測待測人血清/血漿中是否含有本發(fā)明的特異性糖基化蛋白質(zhì)實現(xiàn)對多發(fā)性骨髓瘤的快速診斷。


圖1為刀豆凝集素富集后健康人(NE)和三例多發(fā)性骨髓瘤患者(M1E、M2E和M3E) 血清中糖蛋白質(zhì)的電泳圖。圖2為刀豆凝集素富集后多發(fā)性骨髓瘤患者(MlE)、肺癌患者(LIE和L2E)和胰腺癌患者(PlE和P2E)的血清糖蛋白的電泳圖。圖3為多發(fā)性骨髓瘤特異性糖基化蛋白質(zhì)的基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜圖。
圖4為多發(fā)性骨髓瘤患者中特異性糖基化蛋白質(zhì)的糖肽質(zhì)譜圖。圖5為多發(fā)性骨髓瘤患者中特異性糖基化蛋白質(zhì)的糖肽結(jié)構(gòu)鑒定質(zhì)譜圖。
具體實施例方式下述實施例中的方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。實施例1、多發(fā)性骨髓瘤特異性糖基化蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn)和結(jié)構(gòu)鑒定一、刀豆凝集素親和層析對血清中糖蛋白的富集和分離方法及其效果鑒定1、刀豆凝集素親和層析柱的制備及層析富集方法刀豆凝集素親和層析柱購自Vector公司。利用刀豆凝集素親和層析柱進行親和層析富集糖蛋白的方法如下所述1)平衡用 10 倍體積的結(jié)合緩沖液(由 20mM Tris_HCl，0. 15M NaCl，ImM MnCl2, ImM CaCl2和水組成，pH7. 4的溶液)平衡刀豆凝集素親和層析柱；2)上樣200 μ L血清與1. 8mL結(jié)和緩沖液及苯甲基磺酰氟(lmM/mL)混合，4°C混勻過夜，然后過步驟1)平衡后的刀豆凝集素親和層析柱；3)沖洗用10倍體積的結(jié)合緩沖液洗去未結(jié)合的非糖蛋白；4)洗脫用5倍體積的洗脫緩沖液(pH7. 4，0. 5M甲基-α -D-吡喃葡萄糖苷的水溶液)洗脫糖蛋白。2、刀豆凝集素親和層析對血清中糖蛋白的富集和分離的效果鑒定本發(fā)明的發(fā)明人通過實驗，鑒定了刀豆凝集素親和層析對多發(fā)性骨髓瘤特異性糖基化蛋白質(zhì)的富集的特異性和敏感性，具體方法如下所述1)多發(fā)性骨髓瘤相關(guān)糖蛋白敏感性驗證為了證明66kDa多發(fā)性骨髓瘤相關(guān)糖蛋白的敏感性，按照步驟1的方法分別富集健康人(NE)、三例多發(fā)性骨髓瘤患者(M1E、M2E和M3E)的血清糖蛋白。將富集得到的糖蛋白進行10% SDS-PAGE電泳分離。結(jié)果如圖1所示。從圖1可知，三例多發(fā)性骨髓瘤患者血清糖蛋白在66kDa處有一明顯差異的蛋白條帶。證明此差異蛋白可作為多發(fā)性骨髓瘤診斷標(biāo)志物。2)多發(fā)性骨髓瘤相關(guān)糖蛋白的特異性驗證為了證明刀豆凝集素對66kDa多發(fā)性骨髓瘤相關(guān)糖蛋白的特異性，按照步驟1的方法分別富集了健康人(NE)、兩例肺癌患者(LIE和L2E)、兩例胰腺癌患者(PlE和P2E)和一例多發(fā)性骨髓瘤患者(MlE)的血清糖蛋白。將富集得到的糖蛋白進行10% SDS-PAGE電泳分離。結(jié)果如圖2所示。從圖2可知，多發(fā)性骨髓瘤患者血清糖蛋白與健康人、肺癌和胰腺癌患者血清糖蛋白相比在66kDa處有一明顯差異蛋白，證明此差異蛋白是在多發(fā)性骨髓瘤患者中特異表達(dá)的。二、多發(fā)性骨髓瘤特異性糖基化蛋白質(zhì)的鑒定1.多發(fā)性骨髓瘤特異性糖蛋白的鑒定在證明了刀豆凝集素試驗過程的重復(fù)性和有效性后，按照步驟一中的步驟1的方法對健康人和多發(fā)性骨髓瘤患者的血清進行了刀豆凝集素糖基化蛋白質(zhì)富集試驗。將健康人血清(NE)和多發(fā)性骨髓瘤患者血清以及刀豆凝集素富集的糖蛋白進行10% SDS-PAGE電泳。
將多發(fā)性骨髓瘤血清電泳獲得的66kDa多發(fā)性骨髓瘤相關(guān)糖蛋白(圖2中箭頭所示處)的條帶切下即得到含有多發(fā)性骨髓瘤特異性蛋白的凝膠，將該含有多發(fā)性骨髓瘤特異性蛋白的凝膠進行胰酶膠內(nèi)酶切。具體步驟為1)將切下的凝膠置于含25mM碳酸氫銨的50% (體積百分濃度)乙腈溶液中脫色后，然后置于純乙腈中脫水，待干。2)將脫水后的凝膠置于50 μ L含IOmM 二硫蘇糖醇的25mM碳酸氫銨溶液，56°C，1 小時；然后置于50 μ L含20mM碘乙酰胺的25mM碳酸氫銨溶液，室溫避光45分鐘。純乙腈脫水，待干。3)根據(jù)膠塊體積加入適量胰蛋白酶(5ng/y L)，4°C 1小時后，37°C酶切過夜；取上清。將上述酶切獲得的上清進行基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜鑒定，其質(zhì)譜圖如圖3所示。利用MASCOT搜索引擎檢索結(jié)果為人血清白蛋白，氨基酸覆蓋率為52%。人血清白蛋白的氨基酸序列及其與多發(fā)性骨髓瘤特異性糖基化蛋白質(zhì)的質(zhì)譜檢測結(jié)果匹配肽段如下所示Match to :ALBU_HUMAN Score :200 Expect :2e_16Serum albumin OS = Homo sapiens GN = ALB PE = 1 SV = 2Nominal mass (Mr) :71317 ；Calculated pi value :5. 92NCBI BLAST search of ALBU HUMAN against nrUnformatted sequence string for pasting into other applicationsTaxonomy :Homo sapiensFixed modifications :Carbamidomethyl(C)Variable modifications :0xidation(M)Cleavage by Trypsin :cuts C-term side of KR unless next residue is PNumber of mass values searched :85Number of mass values matched :31Sequence Coverage :52%Matched peptides shown inBlack
1MKffVTFISLLFLFSSAYSRGVFRRDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIA
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601 AASQAALGL。2.多發(fā)性骨髓瘤特異性糖蛋白雙酶切取胰蛋白酶酶切的上清，加入蛋白酶K，使其終濃度為0.05 μ g/μ L。37°C酶切過夜，即獲得雙酶切產(chǎn)物。3.多發(fā)性骨髓瘤特異性糖蛋白糖肽富集分離將石墨碳粒度(顆粒直徑)范圍為5-8 μ m和活性碳粒度(顆粒直徑)范圍為 3-5μπι按1 1(質(zhì)量比)混合，溶于80% (體積百分濃度)的乙腈溶液中制成等質(zhì)量比例混合的石墨碳與活性碳混合物，裝柱前充分混勻。然后進行如下的糖肽富集分離過程1)裝柱取適量的石墨碳與活性碳混合物溶液，裝入Tip管內(nèi)，制成長度5_8mm的 ZipTip柱，并用80% (體積百分濃度)的乙腈溶液沖洗備用。2)平衡加入30 μ L ρΗ3· 0,0.2% (體積百分濃度)的甲酸溶液，30g離心10分
鐘，重復(fù)3次。3)上樣步驟2雙酶切好的樣品，用甲酸溶液調(diào)樣本溶液pH值為3. 0，然后用 PH3. 0,0. 2% (體積百分濃度)的甲酸溶液稀釋到30μ L，加到平衡好的ZipTip柱內(nèi)，30g 離心10分鐘。4)沖洗20yL去離子水，30g離心10分鐘，重復(fù)2次。5)洗脫10 μ L ρΗ4· 0，含有0· 2% (體積百分濃度)甲酸的30% (體積百分濃度) 乙腈溶液，30g離心5分鐘，重復(fù)3次，并收集，即富集分離得到糖肽洗脫溶液。4.多發(fā)性骨髓瘤特異性糖蛋白糖肽鑒定取0. 5 μ L糖肽洗脫液與0. 5 μ L 20mg/mL對羥基苯甲酸溶液混合后進行基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜鑒定。質(zhì)譜圖如4所示。利用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，對離子m/z 3169. 2進行二級質(zhì)譜分析，如圖5所示。通過 NetNGlyc 1.0 krver預(yù)測和人工結(jié)構(gòu)解析。鑒定結(jié)果為序列1所示蛋白的糖基化位點為342NYT ( “NYT”表示糖基化位點，N為天冬酰胺，Y為酪氨酸，T為蘇氨酸)，屬于N-連接的復(fù)雜型糖鏈，糖鏈組成為[HeX]5[HeXNAC]5[FuC] [NeuNAc]。其中，Hex表示己糖，HexNAc表示N-乙酰氨基己糖，F(xiàn)uc表示巖藻糖，NeuNAc表示唾液酸。342NYT糖基化位點位于IIB，與健康人血清白蛋白的差異為自氨基端第344位丙氨酸(344A)突變?yōu)樘K氨酸(344T),該位點的突變所引起的糖基化可能與多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生有關(guān)。上述結(jié)果表明，本發(fā)明的多發(fā)性骨髓瘤特異性蛋白與人血清白蛋白只在一個位點有差異，即344A突變?yōu)?44T,序列如序列1所示，糖基化位點在序列1的第342位氨基酸為糖基化位點。利用本發(fā)明的多發(fā)性骨髓瘤特異性蛋白的糖基化位點(342NYT)可以快速診斷多發(fā)性骨髓瘤。按照上述方法回收序列為序列表中序列1所示的序列，并進行質(zhì)譜檢測，檢測自氨基端第342位氨基酸是否為糖基化位點。如果342位點是糖基化位點，則提示該人可能患有多發(fā)性骨髓瘤。
權(quán)利要求
1.一種多發(fā)性骨髓瘤特異性糖基化蛋白質(zhì)，其氨基酸序列為表中序列1，所述序列1的氨基端第342位氨基酸殘基為糖基化位點，該位點連接的糖鏈組成為 [Hex] 5 [HexNAc] 5 [Fuc] [NeuNAc]，其中，Hex 表示己糖，HexNAc 表示 N-乙酰氨基己糖，F(xiàn)uc 表示巖藻糖，NeuNAc表示唾液酸。
2.一種檢測多發(fā)性骨髓瘤特異性糖基化蛋白質(zhì)的試劑盒，包括刀豆凝集素親和層析試劑盒、SDS-PAGE電泳試劑盒、胰蛋白酶、蛋白酶K、糖肽富集分離試劑盒和質(zhì)譜儀。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述糖肽富集分離試劑盒包括以質(zhì)量比為11的石墨碳和活性炭的混合物為填料的層析柱。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于所述石墨碳的顆粒直徑范圍為5-8μ m， 活性炭顆粒直徑范圍為3-5 μ m。
5.根據(jù)權(quán)利要求2-4中任意一項所述的試劑盒，其特征在于所述刀豆凝集素親和層析試劑盒包括刀豆凝集素親和層析柱、結(jié)合緩沖液和洗脫緩沖液；所述結(jié)合緩沖液為由 20mM Tris-HCl，0. 15M NaCl，ImM MnCl2, ImM CaCl2 和水組成，pH7. 4 的溶液；所述洗脫緩沖液為PH7. 4，0. 5M甲基-α -D-吡喃葡萄糖苷的水溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求2-4中任意一項所述的試劑盒，其特征在于所述糖肽富集分離試劑盒還包括上樣緩沖液、平衡液和洗脫液；所述上樣緩沖液和平衡液均為ΡΗ3. 0，體積百分濃度為0. 2%的甲酸溶液；所述洗脫液為含有體積百分濃度為0. 2%的甲酸的體積百分濃度為30%的乙腈溶液。
7.—種檢測多發(fā)性骨髓瘤特異性糖基化蛋白質(zhì)的方法，包括下述步驟1)用刀豆凝集素親和層析的方法富集疑似多發(fā)性骨髓瘤患者血清中的糖蛋白，以健康人血清為對照；2)10%SDS-PAGE電泳分離1)中得到多發(fā)性骨髓瘤患者血清中的糖蛋白，切下含有 66kDa處與健康人血清中有差異的蛋白條帶的凝膠；3)將步驟2)切下的凝膠，進行胰酶膠內(nèi)酶切，之后加入蛋白酶K酶切，獲得雙酶切溶液；4)用層析分離方法富集步驟3)中獲得的雙酶切溶液中的糖肽；所述層析分離方法所用的層析柱的填料為質(zhì)量比為11的石墨碳和活性炭的混合物；5)利用基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜測定糖肽，獲得糖基化位點和糖鏈的信息；若獲得的蛋白的序列如序列1所示，第342位氨基酸為糖基化位點，則該蛋白為多發(fā)性骨髓瘤特異性糖基化蛋白質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種多發(fā)性骨髓瘤特異性糖基化蛋白質(zhì)及其專用檢測試劑盒。該蛋白，其氨基酸序列為序列表中序列1，所述序列1的自氨基端第342位氨基酸殘基為糖基化位點，該位點連接的糖鏈組成為[Hex]5[HexNAc]5[Fuc][NeuNAc]。該試劑盒，包括刀豆凝集素親和層析試劑盒、SDS-PAGE電泳試劑盒、胰蛋白酶、蛋白酶K、糖肽富集分離試劑盒和質(zhì)譜儀?？衫帽景l(fā)明的多發(fā)性骨髓瘤特異性糖基化蛋白質(zhì)的糖基化位點和序列診斷多發(fā)性骨髓瘤。利用本發(fā)明的試劑盒，可以通過檢測待測人血清/血漿中是否含有本發(fā)明的特異性糖基化蛋白質(zhì)，快速輔助診斷多發(fā)性骨髓瘤。
文檔編號C07K14/47GK102336828SQ20101023879
公開日2012年2月1日 申請日期2010年7月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月26日
發(fā)明者劉輝, 張海婧, 李智立 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所