專利名稱：含咪唑嗡鹽和大環(huán)多胺的陽離子脂質(zhì)、轉(zhuǎn)基因載體及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及陽離子脂質(zhì)、含陽離子脂質(zhì)的轉(zhuǎn)基因載體及其制備方法。 隨著生物化學與分子生物學的不斷發(fā)展，人們對核酸(DNA， RNA)功能的認識不斷 加深，同時也對各種疾病的分子機理有了進一步的認識。在已知的人類疾病中有數(shù)千種疾 病是與基因相關(guān)的，其中包括與單基因相關(guān)的先天性遺傳疾病和與多基因相關(guān)的后天性疾 病。大部分后天性疾病是各種內(nèi)外因素作用于人體的遺傳物質(zhì)使其功能發(fā)生紊亂而造成 的。導(dǎo)致疾病的原因主要是基因缺陷和基因缺失，把適當?shù)耐庠椿蛞肴梭w細胞內(nèi)，以彌 補缺陷或缺失的基因，表達出相應(yīng)的蛋白質(zhì)，從根本上消除產(chǎn)生疾病癥狀的內(nèi)在因素，由此 產(chǎn)生了一種新的治療方法_基因治療。 基因治療的成功，關(guān)鍵是要把用于治療的基因高效的地導(dǎo)入細胞內(nèi)，然而裸基因 進入血清或細胞內(nèi)會被血清內(nèi)的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)所吞噬或被細胞內(nèi)的內(nèi)涵體內(nèi)的核酸酶降 解。另外單獨用裸基因進行轉(zhuǎn)染，基因難于被細胞吸收。因此，開發(fā)安全有效的基因轉(zhuǎn)染載 體是基因治療成功的前提條件。轉(zhuǎn)基因載體包括病毒載體和非病毒載體，病毒載體盡管轉(zhuǎn) 染效率高，但是存在免疫原性、致癌性、宿主基因插入整合等弊端，從而限制了它們的應(yīng)用。 非病毒載體無免疫原性，便于大規(guī)模生產(chǎn)，但轉(zhuǎn)染效率低于病毒載體。然而由于非病毒載體 所具有的優(yōu)點使其成為一類非常具有開發(fā)潛力的轉(zhuǎn)基因載體。 現(xiàn)在研究的非病毒載體中，陽離子脂質(zhì)體是其中一種最具開發(fā)前景的載體之
一。本專禾U申請發(fā)明人的前其月石開究(A novel macrocyclic polyamine cationic lipid containing animidazolium salt group :Synthesis， characterization and its transfection activity as a genedelivery vector. Chem. Biol. Drug Des. ，2008，71(3):
224-229.)發(fā)現(xiàn)，含有咪唑嗡鹽和大環(huán)多胺的化合物在一定的氮磷比(N/P)時對基因具有 很強的包裹濃縮能力，且有一定的轉(zhuǎn)染能力，但細胞毒性較大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供細胞毒性低、基因轉(zhuǎn)染效率高的轉(zhuǎn)基因載體，制備轉(zhuǎn)基因 載體的陽離子脂質(zhì)及其合成方法，以促進基因治療的發(fā)展。 本發(fā)明所述陽離子脂質(zhì)為含咪唑嗡鹽和大環(huán)多胺的陽離子脂質(zhì)，其結(jié)構(gòu)式如下
背景技術(shù)：
<formula>formula see original document page 4</formula>

上述結(jié)構(gòu)式中，R為膽固醇基或皂素基，膽固醇基的結(jié)構(gòu)式如下 皂素基的結(jié)構(gòu)式如下
本發(fā)明所述轉(zhuǎn)基因載體，為上述含咪唑嗡鹽和大環(huán)多胺的陽離子脂質(zhì)、膽固醇和 去離子水形成的溶液，所述溶液中，含咪唑嗡鹽和大環(huán)多胺的陽離子脂質(zhì)濃度為lmmo1/ L 4mmol/L，含咪唑嗡鹽和大環(huán)多胺的陽離子脂質(zhì)與膽固醇的摩爾比為1 2 : 1。
本發(fā)明所述含咪唑嗡鹽和大環(huán)多胺的陽離子脂質(zhì)的合成方法，按照下面的反應(yīng)路
線合成
Boc、 /~\ ,N N
,O一R
N、H
Kl, DMSO, CHCI3
.O一R
、N N; Boc' V_7 Boc
O
CHCI3 or CH3CN
Boc、 /~\
、N
.O—R
TFA, CH2CI2
O一R
上述反應(yīng)式中，R為膽固醇基或皂素基，膽固醇基的結(jié)構(gòu)式如下 皂素基的結(jié)構(gòu)式如下
說明化合物1為合成的目標化合物——含咪唑嗡鹽和大環(huán)多胺的陽離子 脂質(zhì)；化合物2為已知化合物，包括2a和2b， 2a為膽固醇氯乙酸酯(Cholesteryl chloroacetate) ， 2b為阜素氯乙酸酉旨(Diosgenin chloroacetata)，根據(jù)文獻"Steroidal lariat ethers :a new class ofmacrocycles and the crystal structure of N_ (cholesteryloxycarbonyl) aza_15_crown_5. J. Org. Chem. 1987. 52 :2963-2968，， 合成； 化合物3由化合物2、咪唑、碘化鉀合成，合成方法下面將進行描述；化合物4為l-對溴 甲基苯甲基-4，7，10-三(叔丁氧羰基)_1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷(1-bromomethyl benzoyl-4， 7，10_tri (tert-butyloxycarbonyl)_1， 4， 7，10-tetraazacyclododecan)， 根據(jù)文獻"Selective and efficient recognition of thymidylylthymidine(TpT)by bis(ZnII_cyclen)andthymidylylthymidylyl-thymidine(Tp Tp T)by tris(ZnII_cyclen) at neutral pH in aqueous solution. Chem. Eur. J. ， 1999， 11 :3113-3123，，合成；化合物5 由化合物3和化合物4合成，合成方法下面將進行描述。
(1)化合物3的合成 原料包括膽固醇氯乙酸酯或皂素氯乙酸酯、咪唑、碘化鉀和溶劑，膽固醇氯乙酸酯
或皂素氯乙酸酯咪唑碘化鉀=i : io 20 : o. os，所述比例為摩爾比，溶劑由二甲基 亞砜和無水氯仿組成，二甲基亞砜與無水氯仿的體積比為i : 4 6，溶劑的量以膽固醇氯
乙酸酯或皂素氯乙酸酯、咪唑和碘化鉀三種物質(zhì)能完全溶解為限；在室溫、常壓下將溶劑、
膽固醇氯乙酸酯或皂素氯乙酸酯、咪唑和碘化鉀加入反應(yīng)容器中并進行攪拌混合，待固體
物質(zhì)完全溶解后加熱至回流溫度，維持此溫度進行回流反應(yīng)，反應(yīng)時間4小時 6小時，反 應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，然后加入無水碳酸鉀對反應(yīng)液進行中和，無水碳酸鉀的加入量以反 應(yīng)液的pH = 7 8為限，繼后收集反應(yīng)液中的反應(yīng)產(chǎn)物，即得到化合物3 ;
(2)化合物5的合成 原料包括步驟(1)得到的化合物3、l-對溴甲基苯甲基-4，7，10-三(叔丁氧羰 基)-1 ， 4， 7， 10-四氮雜環(huán)十二烷和溶劑，所述化合物3與1-對溴甲基苯甲基-4， 7， 10-三 (叔丁氧羰基)-l，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷的摩爾比為l : 1 2，溶劑為無水氯仿或無水 乙腈，所述化合物3和l-對溴甲基苯甲基-4，7，10-三(叔丁氧羰基)-l，4，7，10-四氮雜環(huán)
十二烷兩種物質(zhì)的總量與溶劑的配比為兩種物質(zhì)的總質(zhì)量溶劑體積=i : 10 16，所
述兩種物質(zhì)的質(zhì)量單位為克、溶劑的體積單位為毫升；在室溫、常壓下將溶劑、化合物3和 1-對溴甲基苯甲基-4， 7， 10-三(叔丁氧羰基)-1 ， 4， 7， 10-四氮雜環(huán)十二烷加入反應(yīng)容器 中并進行攪拌混合，待固體物質(zhì)完全溶解后加熱至回流溫度，維持此溫度進行回流反應(yīng)，反 應(yīng)時間6小時 24小時，反應(yīng)結(jié)束后旋干溶劑，通過柱層析分離、旋干洗脫劑、干燥即得到 化合物5 ; (3)含咪唑嗡鹽和大環(huán)多胺的陽離子脂質(zhì)的合成 原料包括步驟(2)得到的化合物5、無水二氯甲烷和三氟醋酸，化合物5質(zhì)量無
6水二氯甲烷體積=1 : 2 5，所述化合物5的質(zhì)量單位為克、無水二氯甲烷的體積單位為 毫升，三氟醋酸與無水二氯甲烷的體積比為1 : 1 ;在室溫、常壓下將化合物5、無水二氯甲
烷加入反應(yīng)容器中，當化合物5完全溶解后將反應(yīng)容器置于ot:環(huán)境中，然后向反應(yīng)液內(nèi)滴
加三氟醋酸，三氟醋酸滴加完后，在攪拌下于室溫、常壓反應(yīng)至少2小時，反應(yīng)結(jié)束后蒸干 無水二氯甲烷和過量三氟醋酸，然后加甲醇溶解形成溶液，繼后在攪拌下向所述甲醇溶液 中滴加無水乙醚使反應(yīng)產(chǎn)物完全沉淀，經(jīng)過濾、干燥即得到含咪唑嗡鹽和大環(huán)多胺的陽離 子脂質(zhì)。 上述方法中，所述化合物3的合成時，收集反應(yīng)液中的反應(yīng)產(chǎn)物采用以下方式將 反應(yīng)液過濾，將濾餅用氯仿洗滌至少1次，然后合并濾液和濾餅洗滌液，并對濾液和濾餅洗 滌液的混合液用自來水洗滌至少3次，繼后分出有機相氯仿并將其用無水硫酸鎂干燥，再 經(jīng)過濾除去無水硫酸鎂并將所獲濾液通過蒸餾除去氯仿后干燥。 上述方法中，所述化合物5的合成時，柱層析分離所用洗脫劑由乙醇和二氯甲烷 組成，乙醇與二氯甲烷的體積比為1 : 12。 本發(fā)明所述轉(zhuǎn)基因載體的制備方法，其原料包括上述含咪唑嗡鹽和大環(huán)多胺的 陽離子脂質(zhì)、膽固醇和無水氯仿，含咪唑嗡鹽和大環(huán)多胺的陽離子脂質(zhì)與膽固醇摩爾比為 1 : l，含咪唑嗡鹽和大環(huán)多胺的陽離子脂質(zhì)與膽固醇兩種物質(zhì)的總量與無水氯仿的配比
為兩種物質(zhì)的總質(zhì)量無水氯仿體積=i : 40 100，所述兩種物質(zhì)的質(zhì)量單位為克、無
水氯仿的體積單位為毫升；在室溫、常壓下將含咪唑嗡鹽和大環(huán)多胺的陽離子脂質(zhì)、膽固醇
和無水氯仿加入反應(yīng)容器中，當含咪唑嗡鹽和大環(huán)多胺的陽離子脂質(zhì)、膽固醇完全溶解后， 旋干無水氯仿得到脂質(zhì)體膜，將所述脂質(zhì)體膜真空干燥去除殘留的氯仿得到干燥的脂質(zhì)體
膜，然后加入去離子水并攪拌至少3小時形成溶液，去離子水的加入量以溶液中權(quán)利要求1 所述含咪唑嗡鹽和大環(huán)多胺的陽離子脂質(zhì)的濃度為lmmol/L 4mmol/L為限，將所述溶液 在4t:環(huán)境中放置8小時 12小時，再經(jīng)-15°C -2(TC冷凍、4(rC 6(TC解凍至少4次后 于40°C 5(TC超聲0. 5 1. 5小時即得到轉(zhuǎn)基因載體，于4t:保存待用。
本發(fā)明具有以下有益效果 MTT法測試表明，本發(fā)明所述轉(zhuǎn)基因載體具有非常低的細胞毒性。電泳實驗表 明，本發(fā)明所述轉(zhuǎn)基因載體與pEGFP-Nl質(zhì)粒的復(fù)合物，當轉(zhuǎn)基因載體中的陽離子脂質(zhì)與 pEGFP-Nl質(zhì)粒的質(zhì)量比大于4 : l時，就能有效阻滯包裹pEGFP-Nl質(zhì)粒，包裹能力較強，且 本發(fā)明所述轉(zhuǎn)基因載體與pEGFP-Nl質(zhì)粒的復(fù)合物平均粒徑在80nm 120nm之間，Zeta電 位在10mv 40mv之間，非常適合于基因轉(zhuǎn)染。進一步的體外轉(zhuǎn)染實驗表明，用本發(fā)明所述 轉(zhuǎn)基因載體與pEGFP-Nl質(zhì)粒形成的復(fù)合物轉(zhuǎn)染A549細胞，在最佳轉(zhuǎn)染條件下，其中一個轉(zhuǎn) 基因載體T-lb的轉(zhuǎn)染效率超過了市售轉(zhuǎn)基因載體Lipofectamine2000。


圖1是本發(fā)明所述轉(zhuǎn)基因載體T-la、T-lb在A549細胞中的細胞毒性曲線。
圖2是本發(fā)明所述轉(zhuǎn)基因載體T-la與pEGFP-Nl質(zhì)粒的復(fù)合物的電泳阻滯圖片。
圖3是本發(fā)明所述轉(zhuǎn)基因載體T-lb與pEGFP-Nl質(zhì)粒的復(fù)合物的電泳阻滯圖片。
圖4是本發(fā)明所述轉(zhuǎn)基因載體T-la、 T_lb與pEGFP-Nl質(zhì)粒的不同質(zhì)量比復(fù)合物 的粒徑曲線。
7
圖5是本發(fā)明所述轉(zhuǎn)基因載體T-la、 T_lb與pEGFP-Nl質(zhì)粒的不同質(zhì)量比復(fù)合物的Zeta電位曲線。 圖6 (1)是本發(fā)明所述轉(zhuǎn)基因載體T-la中陽離子脂質(zhì)la與pEGFP-Nl質(zhì)粒質(zhì)量比
為8 : 1的復(fù)合物在A549細胞中的轉(zhuǎn)染圖片，圖6(2)是圖6(1)的明場圖片。 圖7(1)是本發(fā)明所述轉(zhuǎn)基因載體T-lb中陽離子脂質(zhì)lb與pEGFP-Nl質(zhì)粒質(zhì)量比
為8 : 1的復(fù)合物在A549細胞中的轉(zhuǎn)染圖片，圖7(2)是圖7(1)的明場圖片。 圖8(1)是轉(zhuǎn)基因載體Lipofectamine 2000與pEGFP-Nl質(zhì)粒質(zhì)量比為8 : 1的
復(fù)合物在A549細胞中的轉(zhuǎn)染圖片，圖8(2)是圖S(l)的明場圖片。
具體實施例方式
以下通過實施例對本發(fā)明作進一步的詳細描述，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下實施例，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容的技術(shù)方案均屬于本發(fā)明的保護范圍。 實施例1 :化合物3a的合成 化合物3a由化合物2a——膽固醇氯乙酸酯、咪唑、碘化鉀合成，化合物3a結(jié)構(gòu)式
如下
原料包括膽固醇氯乙酸酯、咪唑、碘化鉀和溶齊U，膽固醇氯乙酸酯0. Olmol (4. 74g)，咪唑0. 2mo1 (13. 62g)，碘化鉀0. 0005mol (0. 08g)，溶劑由二甲亞砜和無水氯仿組成，二甲亞砜10ml，無水氯仿60ml。在室溫(25°C )、常壓下將上述溶劑、膽固醇氯乙酸酯、咪唑和碘化鉀加入反應(yīng)容器中并進行攪拌混合，待固體物質(zhì)完全溶解后加熱至回流溫度，維持此溫度進行回流反應(yīng)，反應(yīng)時間4小時，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，然后加入無水碳酸鉀2. 80g對反應(yīng)液進行中和，調(diào)節(jié)反應(yīng)液的pH = 7 8 ;繼后將反應(yīng)液過濾，將濾餅用氯仿10ml洗滌1次，合并濾液和濾餅洗滌液，并對濾液和濾餅洗滌液的混合液用自來水洗滌3次(每次洗水用量為50mL)，再后分出有機相氯仿并將其用無水硫酸鎂干燥，再經(jīng)過濾除去無水硫酸鎂，將所獲濾液通過蒸餾除去氯仿后放入烘箱中干燥(溫度6(TC、時間3小時)即得到化合物3a 4. 4g，收率89X。 IR(KBr， cm—1) :1746， 1509， 1464， 1377， 1291，1216， 1078， 1003,662.力NMR(400MHz， CDC13， TMS) :S = 0. 67 (s， 3H， CH3in cholesterol),0. 85-2. 02 (m， 39H， cholesterol) ， 2. 34 (d， 2H， CH2) ， 4. 66 (m， 3H， C0CH2and OCH) ， 5. 37 (t， 1H，C = CH)， 6. 95(d，1H， imidazole-H)， 7. 10(d，1H， imidazole-H)， 7. 50(s，1H， imidazole-H)。HR-MS(ESI) :Calcd for :C32H5。N202 : 49 5 . 39 54[M+H]+ ;Found :495. 3951[M+H] + 。
實施例2 :化合物3b的合成 化合物3b由化合物2b——皂素氯乙酸酯、咪唑、碘化鉀合成，化合物3b其結(jié)構(gòu)式如下
原料包括皂素氯乙酸酯、咪唑、碘化鉀和溶劑，皂素氯乙酸酯0.013mo1(6. 30g)，咪唑O. 13mol(9. lOg)，碘化鉀0. 00065mol(0. 10g)，溶劑二甲亞砜和無水氯仿組成，二甲亞砜10ml，無水氯仿40ml。在室溫(25°C )、常壓下將上述溶劑、皂素氯乙酸酯、咪唑和碘化鉀加入反應(yīng)容器中并進行攪拌混合，待固體物質(zhì)完全溶解后，加熱至回流溫度，維持此溫度進行回流反應(yīng)，反應(yīng)時間6小時，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，然后加入無水碳酸鉀3. OOg對反應(yīng)液進行中和，調(diào)節(jié)反應(yīng)液的pH = 7 8 ;繼后將反應(yīng)液過濾，將濾餅用氯仿10ml洗滌1次，合并濾液和濾餅洗滌液，并對濾液和濾餅洗滌液的混合液用自來水洗滌4次(每次洗水用量為50mL)，再后分出有機相氯仿并將其用無水硫酸鎂干燥，再經(jīng)過濾除去無水硫酸鎂，將所獲濾液通過蒸餾除去氯仿后放入烘箱中干燥(溫度6(TC、時間3小時)即得到化合物3b 5.44g，收率80X。 IR(KBr， cm—1) :1746， 1509， 1464， 1377， 1291， 1216， 1078， 1003，662。 NMR(400MHz， CDC13， TMS) : S = 0.80， (s，6H， CH3) ， 0. 97-2. 00 (m， 28H， s即onin)，2. 34 (d， 2H， CH = C_CH2) ， 3. 35 (d， 1H， OCH2) ， 3. 45 (d， 1H， OCH2) ， 4. 41 (m， 1H， OCH) ， 4. 67 (m， 3H，COCH2and OCH)， 5. 37(t，1H， C = CH)， 6. 95(d，1H， imidazole-H)， 7. 10(d，1H， imidazole-H)，7.50(s，lH， imidazole-H) 。 HR-MS(ESI) :Calcd for :C32H46N204 :523. 3536[M+H] + ;Found :523. 3552[M+H]+。 實施例3 :化合物5a的合成 化合物5a由化合物3a和l-對溴甲基苯甲基-4，7，10-三(叔丁氧羰基)_1， 4， 7，
10-四氮雜環(huán)十二烷合成，化合物5a的結(jié)構(gòu)式如下
Boc"" / 、Boc 原料包括實施例l制備的化合物3a、l-對溴甲基苯甲基-4，7，10-三(叔丁氧羰基)-1，4，7， 10-四氮雜環(huán)十二烷和溶劑無水乙腈，化合物3a 2. 00,1 (1. 04g) ， 1-對溴甲基苯甲基-4， 7， 10-三(叔丁氧羰基)-1， 4， 7， 10-四氮雜環(huán)十二烷3. 30,1 (2. 16g)，無水乙腈40mL。在室溫(25tO、常壓下將上述無水乙腈、化合物3a和l-對溴甲基苯甲基-4，7， 10-三(叔丁氧羰基)-1， 4， 7， 10-四氮雜環(huán)十二烷加入反應(yīng)容器中并進行攪拌混合，待固體物質(zhì)完全溶解后，加熱至回流溫度，維持此溫度進行回流反應(yīng)，反應(yīng)時間8小時，反應(yīng)結(jié)束后旋干溶劑，用乙醇、二氯甲烷組成的洗脫劑(乙醇與二氯甲烷的體積比為l : 12)進
9行柱層析分離，然后旋干洗脫劑、放入烘箱中干燥(溫度6(TC、時間3小時)即得到泡沫狀固體化合物5a 1.6g，收率70X。 IR(KBr， cm—1) :3424， 2940， 1748， 1690， 1564， 1461， 1415，1365， 12481164， 1106， 1027，978，859，772，625.力NMR(400MHz， CDC13， TMS) :S =o.67(s，3H， CH3 in cholesterol) ， 0. 85—2. 02 (m， 65H， cholesterol and 30C0C (CH3) 3) ， 2. 34 (d， 2H，CH2) ， 2. 37-2. 64 (m， 4H， CH2NCH2) ， 3. 30-3. 70 (m， 12H， NCH2CH2NCH2CH2NCH2CH2) ， 3. 73 (m， 2H，ArCH2) ， 4. 70 (m， 1H， 0CH) ， 5. 36-5. 38 (t， 3H， C = CH and ArCH2) ， 5. 48 (s， 2H， C0CH2) ， 7. 12 (d，1H， imidazole-H)，7. 32-7. 35(m，5H， imidazole-H and Ar)，10.85 (s，1H， imidazole-H) HR-MS(ESI) :Calcd for :C63H101BrN608 :1069. 7681 [M_Br]+ ;Found :1069. 7616[M_Br] + 。
實施例4 :化合物5b的合成 化合物5b由化合物3b和l-對溴甲基苯甲基-4，7，10-三(叔丁氧羰基)_1， 4， 7，
10-四氮雜環(huán)十二烷合成，化合物5b的結(jié)構(gòu)式如下
<formula>formula see original document page 10</formula> 原料包括實施例2制備的化合物3b、l_對溴甲基苯甲基-4， 7， 10-三(叔丁氧羰基)-1， 4， 7， 10-四氮雜環(huán)十二烷和溶劑無水氯仿，化合物3b 2. OOmmol (1. 00g) ， 1-對溴甲基苯甲基-4， 7， 10-三(叔丁氧羰基)-1， 4， 7， 10-四氮雜環(huán)十二烷2. 30,1 (1. 50g)，無水氯仿40mL。在室溫(25°C )、常壓下將上述無水氯仿、化合物3b和1-對溴甲基苯甲基-4，7， 10-三(叔丁氧羰基)-1， 4， 7， 10-四氮雜環(huán)十二烷加入反應(yīng)容器中并進行攪拌混合，待固體物質(zhì)完全溶解后，加熱至回流溫度，維持此溫度進行回流反應(yīng)，反應(yīng)時間20小時，反應(yīng)結(jié)束后旋干溶劑，用乙醇、二氯甲烷組成的洗脫劑(乙醇與二氯甲烷的體積比為1 : 12)進行柱層析分離，然后旋干洗脫劑、放入烘箱中干燥(溫度6(TC、時間3小時)即得到泡沫狀固體化合物5b 1.7g，收率85X。 IR(KBr， cm—0 :3424， 2940， 1748， 1690， 1564， 1461，1415，1365，12481164，1106，1027，978，859，772，625.力NMR(400MHz， CDC13， TMS) :S =0. 78 (s， 6H， CH3) ， 0. 96—2. 00 (m， 57H， s即onin and30C0C (CH3) 3) ， 2. 37 (d， 2H， CH = C_CH2)，2. 51-2. 70 (m， 4H， CH2NCH2) ， 3. 30-3. 70 (m， 12H， NCH2CH2NCH2CH2NCH2CH2 and 0CH2) ， 3. 73 (m，2H， ArCH2) ， 4. 41 (m， 1H， 0CH) ， 4. 70 (m， 1H. 0CH) ， 5. 34-545 (t， 3H， C = CH and ArCH2) ， 5. 50 (s，2H， C0CH2) ，7. 12(d， 1H， imidazole—H) ， 7. 32—7. 35 (m， 5H， imidazole—H and Ar)，10.85(s，1H， imidazole-H). HR-MS (ESI) :Calcd for :C63H97BrN6010 :1097. 7266 [M-Br] + ;Found :1097.7002[M-Br]+。 實施例5 :陽離子脂質(zhì)la的合成 陽離子脂質(zhì)la由化合物5a、無水二氯甲烷和三氟醋酸合成，陽離子脂質(zhì)la的結(jié)構(gòu)
式如下
原料包括實施例3制備的化合物5a、無水二氯甲烷和三氟醋酸，化合物5a 1. 00g， (0.85mmol)，無水二氯甲烷2mL，三氟醋酸2mL。在室溫(25°C )、常壓下將化合物5a、無 水二氯甲烷加入反應(yīng)容器中，當化合物5a完全溶解后將反應(yīng)容器置于冰水浴中，然后向 反應(yīng)液內(nèi)滴加三氟醋酸，三氟醋酸滴加完后，在室溫、常壓下攪拌反應(yīng)2. 5小時，反應(yīng)結(jié) 束后蒸干無水二氯甲烷和過量三氟醋酸，然后加甲醇lmL溶解形成溶液，繼后在攪拌下 向所述甲醇溶液中滴加無水乙醚使反應(yīng)產(chǎn)物完全沉淀，經(jīng)離心過濾、真空干燥(真空度 0. 095Mpa，干燥時間12小時，溫度25°C )即得到含咪唑嗡鹽和大環(huán)多胺的陽離子脂質(zhì)la 0.80g，收率80 %。 IR(KBr， cm—1) :3436， 2950， 2866， 1745， 1680， 1564， 1514， 1456， 1413， 1375， 1202， 1174， 1130， 831， 800， 721， 518.'H NMR(400MHz， CDC13， TMS) :S = 0.86(s，3H， CH3in cholesterol) ， 0. 89—2. 00 (m， 47H， cholesterol) ， 2. 34 (d， 2H， CH2) ， 2. 86—3. 15 (m， 14H， CH2NCH2CH2NCH2CH2NCH2CH2) ， 3. 73 (m， 2H， ArCH2) ， 4. 70 (m， 1H， 0CH) ， 5. 10 (m， 2H， ArCH2)， 5. 29-5. 34 (m， 3H， C = CH and C0CH2) ， 7. 33 (m， 4H， Ar) ， 7. 46 (d， 1H， imidazole—H) ， 7. 61 (d， 1H， imidazole-H) ，9. 48 (s， 1H， imidazole-H). HR-MS (ESI) :Calcdfor :C54H80BrF9N608 : 769. 6108[M-Br-3CF3C00H]+ ;Found :769. 4712 [M_Br-3CF3C00H] + 。
實施例6 :陽離子脂質(zhì)lb的合成 陽離子脂質(zhì)lb由化合物5b、無水二氯甲烷和三氟醋酸合成，陽離子脂質(zhì)lb的結(jié)構(gòu)
式如下
原料包括實施例4制備的化合物5b、無水二氯甲烷和三氟醋酸，化合物5b l.OOg， (0. 87mmol)，無水二氯甲烷3mL，三氟醋酸3mL。在室溫(25°C )、常壓下將化合物5b、無水 二氯甲烷加入反應(yīng)容器中，當化合物5b完全溶解后將反應(yīng)容器置于冰水浴中，然后向反應(yīng) 液內(nèi)滴加三氟醋酸，三氟醋酸滴加完后，在室溫、常壓下攪拌反應(yīng)2小時，反應(yīng)結(jié)束后蒸干 無水二氯甲烷和過量三氟醋酸，然后加甲醇lmL溶解形成溶液，繼后在攪拌下向所述甲醇 溶液中滴加無水乙醚使反應(yīng)產(chǎn)物完全沉淀，經(jīng)離心過濾、真空干燥(真空度0. 095Mpa，干 燥時間12小時，溫度25tO即得到含咪唑嗡鹽和大環(huán)多胺的陽離子脂質(zhì)lb 0.89g，收率85%。 IR(KBr，cm—0 :3424,2940， 1748， 1690， 1564， 1461， 1415， 1365， 12481164， 1106， 1027， 978， 859， 772， 625.'H NMR (400MHz ， CDC13， TMS) :S =0.78(s，6H， CH3) ， 0. 96—2. 00 (m， 32H， saponin) ， 2. 37 (d， 2H， CH = C_CH2) ， 2. 89-3. 17 (m， 16H， CH2NCH2CH2NCH2CH2NCH2CH2and 0CH2)， 3. 50 (t， 2H， NCH2) ， 3. 64 (m， 2H， Ar) ， 4. 39 (m， 1H， 0CH) ， 4. 60 (m， 1H， OCH) ， 5. 15 (m， 2H， ArCH2)， 5. 30-5. 35 (m， 3H， C = CH andC0CH2) ， 7. 35 (m， 4H， Ar) ， 7. 47 (d， 1H， imidazole—H) ， 7. 65 (d， 1H， imidazole-H) ，9. 54(s， 1H， imidazole-H) HR-MS (ESI) :Calcd for :C53H74BrF9N6010 : 797. 5693[M-Br-3CF3C00H]+ ;Found :797. 3882[M_Br-3CF3C00H] + 。
實施例7 :含陽離子脂質(zhì)la的轉(zhuǎn)基因載體(簡稱T-la)的制備
原料包括實施例5制備的含咪唑嗡鹽和大環(huán)多胺的陽離子脂質(zhì)la、膽固醇和無水 氯仿，陽離子脂質(zhì)la 0. Olmmol (0. 0077g)，膽固醇0. Olmmol (0. 0039g)，無水氯仿0. 5mL。在 室溫(25°C )、常壓下將所述陽離子脂質(zhì)la、膽固醇和無水氯仿加入反應(yīng)容器中，當陽離子 脂質(zhì)la、膽固醇完全溶解后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(轉(zhuǎn)速為60r/min)旋干得到脂質(zhì)體膜，再經(jīng)真空 干燥(真空度0. 095Mpa，干燥時間12小時，溫度25°C )去除殘留氯仿得到干燥脂質(zhì)體膜， 以上述陽離子脂質(zhì)la的摩爾量(0. Olmmol)計算，向此干燥脂質(zhì)體膜加入去離子水2. 5mL 配成含咪唑嗡鹽和大環(huán)多胺的陽離子脂質(zhì)4mmol/L的溶液，攪拌3小時，繼后將所配制的溶 液在4t:冰箱內(nèi)放置12小時，再經(jīng)冰鹽浴冷凍固化、水浴6(TC解凍液化5次，最后在功率為 100兆、水浴溫度為50°C的超聲波水浴中超聲0. 5小時即得到含陽離子脂質(zhì)la的轉(zhuǎn)基因載 體T-la，放置于4t:冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?實施例8 :含陽離子脂質(zhì)lb的轉(zhuǎn)基因載體(簡稱T-lb)的制備 原料包括實施例6制備的含咪唑嗡鹽和大環(huán)多胺的陽離子脂質(zhì)lb、膽固醇和無水
氯仿，陽離子脂質(zhì)lb 0. Olmmol (0. 0079g)，膽固醇0. Olmmol (0. 0039g)，無水氯仿lmL。在室
溫(25°C )、常壓下將所述陽離子脂質(zhì)lb、膽固醇和無水氯仿加入反應(yīng)容器中，當陽離子脂
質(zhì)lb、膽固醇完全溶解后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(轉(zhuǎn)速為60r/min)旋干得到脂質(zhì)體膜，再經(jīng)真空
干燥(真空度0. 095Mpa，干燥時間12小時，溫度25°C )去除殘留氯仿得到干燥脂質(zhì)體膜，
以上述陽離子脂質(zhì)lb的摩爾量(0. Olmmol)計算，向此干燥脂質(zhì)體膜加入去離子水2. 5mL
配成含咪唑嗡鹽和大環(huán)多胺的陽離子脂質(zhì)4mmol/L的溶液，攪拌3小時，繼后將所配制的溶
液在4t:冰箱內(nèi)放置8小時，再經(jīng)冰鹽浴冷凍固化、水浴4(TC解凍液化6次，最后在功率為
100兆、水浴溫度為4(TC的超聲波水浴中超聲1. 5小時即得到含陽離子脂質(zhì)lb的轉(zhuǎn)基因載
體T-lb，放置于4t:冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?實施例9 :轉(zhuǎn)基因載體的細胞毒性實驗 1材料和方法 1. 1材料和儀器 轉(zhuǎn)基因載體T-la、 T-lb :由上述實施例7、實施例8制備。 MTT :購于美國Sigma公司，使用時用PBS配制成5mg/mL溶液，pH值7. 4，經(jīng) 0. 22iim濾膜過濾。 A549和293細胞株來源于美國ATCC。 Bio RAD model 550酶標儀美國Bio-RAD公司生產(chǎn)。 1640培養(yǎng)基美國Gibico公司生產(chǎn) DMEM培養(yǎng)基美國Gibico公司生產(chǎn)
12
C02培養(yǎng)箱法國JOUAN公司生產(chǎn)。 細胞培養(yǎng)板美國Corning公司生產(chǎn)。 溶劑DMSO :美國Sigma公司生產(chǎn)。 胰酶美國Amresco公司生產(chǎn)。 PBS緩沖由國產(chǎn)分析純試劑配制為HI值7. 4 1. 2方法 將上述實施例7制備的轉(zhuǎn)基因載體T-la用含抗生素1640完全培養(yǎng)基(青霉素 100IU/mL+鏈霉素lOOmg/mL)稀釋為含咪唑嗡鹽和大環(huán)多胺的陽離子脂質(zhì)la25 y g/mL、 50 u g/mL、75u g/mL、100u g/mL、125u g/mL、150u g/mL、175u g/mL、200u g/mL的不同濃度 的溶液； 將上述實施例8制備的轉(zhuǎn)基因載體T-lb用含抗生素1640完全培養(yǎng)基(青霉素 100IU/mL+鏈霉素lOOmg/mL)稀釋為含咪唑嗡鹽和大環(huán)多胺的陽離子脂質(zhì)lb25 y g/mL、 50 u g/mL、75u g/mL、100u g/mL、125u g/mL、150u g/mL、175u g/mL、200u g/mL的不同濃度 的溶液。 用胰酶消化收取對數(shù)生長期A549細胞株，調(diào)整細胞數(shù)量約為每孔1. 5X 104個在 96孔細胞培養(yǎng)板上培養(yǎng)。37°C、5% C02條件下培養(yǎng)約24h，使細胞生長至70% _80%匯合 度，棄孔內(nèi)原有培養(yǎng)基，用緩沖液PBS (PH值7. 4)洗1 2次，在每孔中分別加入含不同濃度 咪唑嗡鹽和大環(huán)多胺的陽離子脂質(zhì)la、lb的轉(zhuǎn)基因載體溶液T-la、T-lb 100yL，每個濃度 梯度設(shè)置四個平行孔；采用不含轉(zhuǎn)基因載體T-la、 T-lb的含抗生素1640培養(yǎng)基100 y L作 為對照，考察其在上述實驗條件下的細胞毒性。在37°C、5% C02條件下繼續(xù)培養(yǎng)24h后用 緩沖液PBS(ra值7. 4)洗滌1 2次，再向每孔加入100 ii L無血清無抗生素1640培養(yǎng)基 [含20iiL MTT溶液(5ng/mL in PBS，pH 7. 4)]，孵育4h，移除培養(yǎng)基。生成的藍紫色結(jié)晶 用150iiL匿SO溶解。在吸收波長490nm處用酶標儀測定溶液吸光值。轉(zhuǎn)基因載體T-la、 T-lb組細胞與對照組細胞的相對存活率按下式計算
[A]test/[A]control X100 上式中，[A] test為測試孔的吸光值，[A]control為對照孔的吸光值。
2實驗結(jié)果和討論 實驗結(jié)果見圖1，由圖1可見，當本發(fā)明所述轉(zhuǎn)基因載體T-la、T-lb中含咪唑嗡鹽
和大環(huán)多胺的陽離子脂質(zhì)la、 lb的濃度接近200 g/mL時，細胞存活率可達40%以上，因此
本發(fā)明所述轉(zhuǎn)基因載體的細胞毒性非常低，具有潛在開發(fā)價值。 實施例10 :轉(zhuǎn)基因載體與pEGFP-Nl質(zhì)粒復(fù)合物的凝膠電泳實驗 l材料和方法 1. 1材料和儀器 轉(zhuǎn)基因載體T-la、 T-lb :由上述實施例7、實施例8制備。 pEGFP-Nl質(zhì)粒購于美國Clontech公司 瓊脂糖美國Amor公司生產(chǎn)。 TAE緩沖液由分析純化學試劑配制。 電泳儀美國Bio-RAD公司生產(chǎn)。 凝膠成像系統(tǒng)(GelDoc 2000):美國BIO-RAD公司生產(chǎn)。
染料Goldview :上海賽百盛基因技術(shù)有限公司生產(chǎn)。
葡萄糖溶液太極集團西南藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)。
1.2方法 1. 2. 1轉(zhuǎn)基因載體T-la、 T-lb與pEGFP-Nl質(zhì)粒復(fù)合物的制備
取IO個EP管標記為1號 IO號，在標記為1號 5號的EP管中分別加入轉(zhuǎn)基因 載體T-la中陽離子脂質(zhì)la與pEGFP-Nl質(zhì)粒的質(zhì)量比為1 : 1、2 : 1、4 : 1、6 : 1、8 : 1 的轉(zhuǎn)基因載體T-la并用葡萄糖溶液(0. 36mM/L)定容至50ul。在標記為6號 10號的EP 管中分別加入轉(zhuǎn)基因載體T-lb中陽離子脂質(zhì)lb與pEGFP-Nl質(zhì)粒的質(zhì)量比為l : 1、2 : 1、 4 : 1、6 : 1、8 : l的轉(zhuǎn)基因載體T-lb并用葡萄糖溶液(O. 36mM/L)定容至50ul。另取一 個EP管標記為11號，加入含有100 iig pEGFP-Nl質(zhì)粒的溶液，并用葡萄糖定容至500ul， 輕柔吹打混勻，然后從11號管分別取50ul pEGFP-Nl質(zhì)粒的溶液依次加入上述10個EP管 中，于液面處輕柔吹打3次混勻，所得到的100ul脂質(zhì)體與pEGFP-Nl質(zhì)粒的復(fù)合物溶液4°C 孵育過夜。 1. 2. 2瓊脂糖凝膠的制備 將0. 40g瓊脂糖加入到100mL錐形瓶中，再加入40mLTAE緩沖液，加熱使瓊脂糖 顆粒完全溶解，得無色透明液體。冷卻至5(TC-e(TC，按照染料Goldview : TAE緩沖液二 1 : 20(體積比)的用量加入染料Goldview，混勻后緩慢倒入帶有梳子并事先調(diào)節(jié)為水平 的制膠槽中。室溫靜置，待凝膠完全凝固后小心拔出梳子，并將帶有凝膠的制膠槽放入電泳 槽中，加入TEA緩沖液，TEA緩沖液的量以沒過膠面lmm為宜，令樣品孔自然充滿TEA緩沖 液。 1. 2. 3陽離子脂質(zhì)轉(zhuǎn)基因載體與pEGFP-Nl質(zhì)粒復(fù)合物的電泳實驗 分別取上述制備的轉(zhuǎn)基因載體T-la、 T-lb與pEGFP-Nl質(zhì)粒的復(fù)合物(裝于標記
為1號 10號的EP管)和pEGFP-Nl質(zhì)?？瞻讓φ?0ul與1. 67ul 6xloading buffer混
勻加入凝膠上的加樣孔內(nèi)。蓋上電泳槽，室溫(25°C )下100V電壓電泳約30min后停止，取
出凝膠在凝膠成像系統(tǒng)中曝光后采圖。 2實驗結(jié)果和討論 實驗結(jié)果見圖2和圖3。由圖2可見，當轉(zhuǎn)基因載體T-la中陽離子脂質(zhì)la與 pEGFP-Nl質(zhì)粒的質(zhì)量比為4 : 1時，部分pEGFP-Nl質(zhì)粒滯留在加樣孔，部分pEGFP-Nl質(zhì)粒 由負極向陽極移動，表明陽離子脂質(zhì)轉(zhuǎn)基因載體T-la能部分包裹pEGFP-Nl質(zhì)粒，當轉(zhuǎn)基因 載體T-la中陽離子脂質(zhì)la與pEGFP-Nl質(zhì)粒的質(zhì)量比為6 : 1時，pEGFP-Nl質(zhì)粒全部被 滯留，表明轉(zhuǎn)基因載體T-la能全部包裹pEGFP-Nl質(zhì)粒。 由圖3可見，當轉(zhuǎn)基因載體T-lb中陽離子脂質(zhì)lb與pEGFP-Nl質(zhì)粒的質(zhì)量比為 4 : 1時，部分pEGFP-Nl質(zhì)粒滯留在加樣孔，部分pEGFP-Nl質(zhì)粒由負極向陽極移動，表明 陽離子脂質(zhì)轉(zhuǎn)基因載體T-lb能部分包裹pEGFP-Nl質(zhì)粒，當轉(zhuǎn)基因載體T-lb中陽離子脂質(zhì) lb與pEGFP-Nl質(zhì)粒的質(zhì)量比為6 : 1時，pEGFP-Nl質(zhì)粒全部被滯留，表明轉(zhuǎn)基因載體T-Ib 能全部包裹pEGFP-Nl質(zhì)粒。 實施例11 :轉(zhuǎn)基因載體與pEGFP-Nl質(zhì)粒復(fù)合物的的粒徑和Zeta電位實驗
l材料和方法
1. l材料和儀器
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轉(zhuǎn)基因載體T-la、 T-lb :由上述實施例7、實施例8制備。 pEGFP-Nl質(zhì)粒購于美國Clontech公司。 葡萄糖溶液太極集團西南藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)。 納米粒度及電位分析儀(ZEN 3600) :Malvern Inc公司生產(chǎn)。 1.2方法 1. 2. 1轉(zhuǎn)基因載體T-la、T-lb與pEGFP-Nl質(zhì)粒復(fù)合物的制備
取IO個EP管標記為1號 IO號，在標記為1號 5號的EP管中分別加入轉(zhuǎn)基因 載體T-la中陽離子脂質(zhì)la與pEGFP-Nl質(zhì)粒的質(zhì)量比為1 : 1、2 : 1、4 : 1、6 : 1、8 : 1 的轉(zhuǎn)基因載體T-la并用葡萄糖溶液(0. 36mM/L)定容至50ul。在標記為6號 10號的EP 管中分別加入轉(zhuǎn)基因載體T-lb中陽離子脂質(zhì)lb與pEGFP-Nl質(zhì)粒的質(zhì)量比為l : 1、2 : 1、 4 : 1、6 : 1、8 : l的轉(zhuǎn)基因載體T-lb并用葡萄糖溶液(O. 36mM/L)定容至50ul。另取一 個EP管標記為11號，加入含有100 ii gpEGFP-Nl質(zhì)粒的溶液，并用葡萄糖定容至500ul，輕 柔吹打混勻，然后從11號管分別取50ulpEGFP-Nl質(zhì)粒的溶液依次加入上述10個EP管中， 于液面處輕柔吹打3次混勻，所得到的100ul脂質(zhì)體與pEGFP-Nl質(zhì)粒的復(fù)合物溶液4t:孵 育過夜。 1. 2. 2轉(zhuǎn)基因載體與pEGFP-Nl質(zhì)粒復(fù)合物的粒徑和電位實驗 將上述轉(zhuǎn)基因載體T-la、 T-lb與pEGFP-Nl質(zhì)粒的復(fù)合物分別用葡萄糖溶液
(0. 36mM/L)定溶至lmL。用納米粒度及電位分析儀測其粒徑和Zeta電位。 2實驗結(jié)果和討論 實驗結(jié)果見圖4和圖5。由圖4可見，轉(zhuǎn)基因載體T-la與pEGFP-Nl質(zhì)粒的復(fù)合 物在轉(zhuǎn)基因載體T-la陽離子脂質(zhì)la與pEGFP-Nl質(zhì)粒的質(zhì)量比為l : l時，粒徑較大，約 320nm，當T-la陽離子脂質(zhì)la與pEGFP-Nl質(zhì)粒的質(zhì)量比為8 : 1和10 : 1時，粒徑較小， 約為100nm ;而轉(zhuǎn)基因載體T-lb與pEGFP-Nl質(zhì)粒的復(fù)合物在轉(zhuǎn)基因載體T-lb陽離子脂質(zhì) lb與pEGFP-Nl質(zhì)粒的質(zhì)量比為4 : l時，粒徑最大，約570nm，當陽離子脂質(zhì)lb與pEGFP-Nl 質(zhì)粒的質(zhì)量比為10 : 1時粒徑較小，約為200nm ;需要說明的是，因為納米粒度分析儀測定 粒徑受干擾因素影響很大，因此不能用來衡量復(fù)合物粒徑的絕對大小。
由圖5可見，轉(zhuǎn)基因載體T-la、T-lb與pEGFP-Nl質(zhì)粒的復(fù)合物在陽離子脂質(zhì)轉(zhuǎn)基 因載體T-la、T-lb中陽離子脂質(zhì)la、lb與pEGFP-Nl質(zhì)粒的質(zhì)量比為l : 1時，電位為負值， 而當陽離子脂質(zhì)la、lb與pEGFP-Nl質(zhì)粒的質(zhì)量比為4 : 1以上時，電位都在20mV 30mV 之間，此時因為復(fù)合物帶正電荷，有利于轉(zhuǎn)染過程中復(fù)合物與細胞壁的靜電結(jié)合靠近，增加 復(fù)合物進入細胞的幾率。 實施例12 :轉(zhuǎn)基因載體的體外基因轉(zhuǎn)染實驗
l材料和方法
1. l材料和儀器 轉(zhuǎn)基因載體T-la、 T-lb :由上述實施例7、實施例8制備。 pEGFP-Nl質(zhì)粒購于美國Clontech公司 A549細胞株來源于ATCC。 PBS緩沖由國產(chǎn)分析純試劑配制。 1640培養(yǎng)基GIBICO公司生產(chǎn)。
DMEM培養(yǎng)基GIBIC0公司生產(chǎn)
胰酶美國Amresco公司生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因載體Lipofectamine 2000 :美國invitrogen公司生產(chǎn) 細胞培養(yǎng)板美國Corning公司生產(chǎn)。 倒置熒光顯微鏡日本Olympus公司生產(chǎn)。 EndoFree Plasmid Kit :TIANGEN公司生產(chǎn)。 C02培養(yǎng)箱法國J0UAN公司生產(chǎn)。 生物安全柜法國JOUAN公司生產(chǎn)。 1.2方法 1. 2. 1轉(zhuǎn)基因載體與pEGFP-Nl質(zhì)粒復(fù)合物的制備 取4個EP管標記為1號 4號，在標記為1號 2號的EP管中分別加入轉(zhuǎn)基因 載體T-la中陽離子脂質(zhì)la與pEGFP-Nl質(zhì)粒的質(zhì)量比為6 : 1、8 : 1的轉(zhuǎn)基因載體T_la 并用無血清無抗生素的新鮮1640培養(yǎng)基定容至100ul。在標記為3號 4號的EP管中分 別加入轉(zhuǎn)基因載體T-lb中陽離子脂質(zhì)lb與pEGFP-Nl質(zhì)粒的質(zhì)量比為6 : 1、8 : 1的轉(zhuǎn) 基因載體T-lb并用無血清無抗生素的新鮮1640培養(yǎng)基定容至100ul。另取一個EP管標 記為5號，加入含有32ugpEGFP-Nl質(zhì)粒的溶液，并用無血清無抗生素的新鮮1640培養(yǎng)基定 容至400ul，輕柔吹打混勻，然后從5號管分別取100ulpEGFP-Nl質(zhì)粒的溶液依次加入上述 4個EP管中，于液面處輕柔吹打3次混勻，所得到的200ul脂質(zhì)體與pEGFP-Nl質(zhì)粒的復(fù)合 物溶液室溫孵育20分鐘備用。 1. 2. 2轉(zhuǎn)基因載體與pEGFP-Nl質(zhì)粒復(fù)合物的體外轉(zhuǎn)染實驗 用胰酶消化收取對數(shù)生長期A549細胞株，調(diào)整細胞數(shù)量約為每孔7. OX 104 8. OX 104個在24孔細胞培養(yǎng)板上培養(yǎng)。37°C、5 % C02條件下培養(yǎng)約24h，使細胞生長至 70% _80%匯合度，棄孔內(nèi)原有培養(yǎng)基，用PBS洗1 2次，分別加入上述4管中復(fù)合物溶 液lOOul，使每種材料與pEGFP-Nl質(zhì)粒同質(zhì)量比的處理組均有兩個復(fù)孔，再補充不含血清 及抗生素的新鮮1640培養(yǎng)基使每孔內(nèi)的總體系為250ul。 37°C、5% C02條件下繼續(xù)孵育4h 后棄轉(zhuǎn)染用培養(yǎng)基，用PBS洗滌1 2次重新加入含有10%血清的新鮮1640培養(yǎng)基在相同 條件下培養(yǎng)24h，其后取出細胞板在倒置熒光顯微鏡下觀察EGFP蛋白的表達情況，并采圖。
按照上述實施例12中1. 2. 1的方法制備轉(zhuǎn)基因載體Lipofectamine2000 與pEGFP-Nl質(zhì)粒的復(fù)合物，按照上述實施例12中1. 2. 2的方法將轉(zhuǎn)基因載體 Lipofectamine2000與pEGFP-Nl質(zhì)粒的復(fù)合物在A549細胞中進行體外轉(zhuǎn)染實驗。
2實驗結(jié)果和討論 實驗結(jié)果見圖6、圖7和圖8。由圖6和圖8可見，轉(zhuǎn)基因載體T-la與pEGFP-Nl 質(zhì)粒的復(fù)合物在陽離子脂質(zhì)la與pEGFP-Nl質(zhì)粒的質(zhì)量比為8 : 1時，在A549細胞中有明 顯轉(zhuǎn)染效果，但轉(zhuǎn)染效率低于Lipofectamine2000 ;而由圖7和圖8可見，轉(zhuǎn)基因載體T-lb 與pEGFP-Nl質(zhì)粒的復(fù)合物在陽離子脂質(zhì)lb與pEGFP-Nl質(zhì)粒的質(zhì)量比為8 : 1時，在A549 細胞中轉(zhuǎn)染非常明顯，轉(zhuǎn)染效率高于Lipofectamine2000，并且如實施例9所述，轉(zhuǎn)基因載 體T-lb細胞毒性很低，因此本發(fā)明提供了一種高效低毒的轉(zhuǎn)基因載體。
權(quán)利要求
含咪唑嗡鹽和大環(huán)多胺的陽離子脂質(zhì)，其特征在于所述陽離子脂質(zhì)的結(jié)構(gòu)式如下上述結(jié)構(gòu)式中，R為膽固醇基或皂素基，膽固醇基的結(jié)構(gòu)式如下皂素基的結(jié)構(gòu)式如下F2009102164626C0000011.tif,F2009102164626C0000012.tif,F2009102164626C0000013.tif
2. 轉(zhuǎn)基因載體，其特征在于該轉(zhuǎn)基因載體為由權(quán)利要求1所述含咪唑嗡鹽和大環(huán)多胺 的陽離子脂質(zhì)、膽固醇和去離子水形成的溶液，所述溶液中，權(quán)利要求1所述含咪唑嗡鹽和大環(huán)多胺的陽離子脂質(zhì)摩爾濃度為lmmol/L 4mmol/L，權(quán)利要求1所述含咪唑嗡鹽和大環(huán) 多胺的陽離子脂質(zhì)與膽固醇的摩爾比為1 2 : 1。
3. 權(quán)利要求1所述含咪唑嗡鹽和大環(huán)多胺的陽離子脂質(zhì)的合成方法，其特征在于合成 步驟如下(1) 化合物3的合成原料包括膽固醇氯乙酸酯或皂素氯乙酸酯、咪唑、碘化鉀和溶劑，膽固醇氯乙酸酯或皂素氯乙酸酯咪唑碘化鉀=i : io 20 : o. os，所述比例為摩爾比，溶劑由二甲亞砜和 無水氯仿組成，二甲亞砜與無水氯仿的體積比為i : 4 6，溶劑的量以膽固醇氯乙酸酯或 皂素氯乙酸酯、咪唑和碘化鉀三種物質(zhì)能完全溶解為限；在室溫、常壓下將溶劑、膽固醇氯乙酸酯或皂素氯乙酸酯、咪唑和碘化鉀加入反應(yīng)容器 中并進行攪拌混合，待固體物質(zhì)完全溶解后加熱至回流溫度，維持此溫度進行回流反應(yīng)，反應(yīng)時間4小時 6小時，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，然后加入無水碳酸鉀對反應(yīng)液進行中和， 無水碳酸鉀的加入量以反應(yīng)液的pH = 7 8為限，繼后收集反應(yīng)液中的反應(yīng)產(chǎn)物，即得到 化合物3 ;(2) 化合物5的合成原料包括步驟(1)得到的化合物3、l-對溴甲基苯甲基-4，7，10-三(叔丁氧羰基)-l， 4， 7， 10-四氮雜環(huán)十二烷和溶劑，所述化合物3與1-對溴甲基苯甲基-4， 7， 10-三(叔丁氧 羰基)-l，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷的摩爾比為1 : 1 2，溶劑為無水氯仿或無水乙腈，所述化合物3和1-對溴甲基苯甲基-4， 7， 10-三(叔丁氧羰基)-1 ， 4， 7， 10-四氮雜環(huán)十二烷兩種物質(zhì)的總量與溶劑的配比為兩種物質(zhì)的總質(zhì)量溶劑體積=i : 10 16，所述兩種物質(zhì)的質(zhì)量單位為克、溶劑的體積單位為毫升；在室溫、常壓下將溶劑、化合物3和1-對溴甲基苯甲基-4， 7， 10-三(叔丁氧羰基)-1 ， 4， 7， 10-四氮雜環(huán)十二烷加入反應(yīng)容器中并進行攪拌混合，待固體物質(zhì)完全溶解后加熱至 回流溫度，維持此溫度進行回流反應(yīng)，反應(yīng)時間6小時 24小時，反應(yīng)結(jié)束后旋干溶劑，通 過柱層析分離、旋干洗脫劑、干燥即得到化合物5 ;(3)含咪唑嗡鹽和大環(huán)多胺的陽離子脂質(zhì)的合成原料包括步驟(2)得到的化合物5、無水二氯甲烷和三氟醋酸，化合物5質(zhì)量無水二 氯甲烷體積=1 : 2 5，所述化合物5的質(zhì)量單位為克、無水二氯甲烷的體積單位為毫升， 三氟醋酸與無水二氯甲烷的體積比為1:1;在室溫、常壓下將化合物5、無水二氯甲烷加入反應(yīng)容器中，當化合物5完全溶解后將反應(yīng)容器置于ot:環(huán)境中，然后向反應(yīng)液內(nèi)滴加三氟醋酸，三氟醋酸滴加完后，在攪拌下于室溫、常壓反應(yīng)至少2小時，反應(yīng)結(jié)束后蒸干無水二氯甲烷和過量三氟醋酸，然后加甲醇溶 解形成溶液，繼后在攪拌下向所述甲醇溶液中滴加無水乙醚使反應(yīng)產(chǎn)物完全沉淀，經(jīng)過濾、 干燥即得到含咪唑嗡鹽和大環(huán)多胺的陽離子脂質(zhì)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的含咪唑嗡鹽和大環(huán)多胺的陽離子脂質(zhì)的合成方法，其特征在 于化合物3的合成時，收集反應(yīng)液中的反應(yīng)產(chǎn)物采用以下方式將反應(yīng)液過濾，將濾餅用氯 仿洗滌至少1次，然后合并濾液和濾餅洗滌液，并對濾液和濾餅洗滌液的混合液用自來水 洗滌至少3次，繼后分出有機相氯仿并將其用無水硫酸鎂干燥，再經(jīng)過濾除去無水硫酸鎂 并將所獲濾液通過蒸餾除去氯仿后干燥。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的含咪唑嗡鹽和大環(huán)多胺的陽離子脂質(zhì)的合成方法，其特 征在于化合物5的合成時，柱層析分離所用洗脫劑由乙醇和二氯甲烷組成，乙醇與二氯甲 烷的體積比為1 : 12。
6. 權(quán)利要求2所述轉(zhuǎn)基因載體的制備方法，其特征在于原料包括權(quán)利要求1所述含咪 唑嗡鹽和大環(huán)多胺的陽離子脂質(zhì)、膽固醇和無水氯仿，權(quán)利要求1所述含咪唑嗡鹽和大環(huán) 多胺的陽離子脂質(zhì)與膽固醇摩爾比為l : l，權(quán)利要求l所述含咪唑嗡鹽和大環(huán)多胺的陽離子脂質(zhì)與膽固醇兩種物質(zhì)的總量與無水氯仿的配比為兩種物質(zhì)的總質(zhì)量無水氯仿體積=1 : 40 100，所述兩種物質(zhì)的質(zhì)量單位為克、無水氯仿的體積單位為毫升；在室溫、常壓下將權(quán)利要求i所述含咪唑嗡鹽和大環(huán)多胺的陽離子脂質(zhì)、膽固醇和無 水氯仿加入反應(yīng)容器中，當權(quán)利要求i所述含咪唑嗡鹽和大環(huán)多胺的陽離子脂質(zhì)、膽固醇 完全溶解后，旋干無水氯仿得到脂質(zhì)體膜，將所述脂質(zhì)體膜真空干燥去除殘留的氯仿得到干燥的脂質(zhì)體膜，然后加入去離子水并攪拌至少3小時形成溶液，去離子水的加入量以溶 液中權(quán)利要求1所述含咪唑嗡鹽和大環(huán)多胺的陽離子脂質(zhì)的濃度為lmmol/L 4mmol/L為 限，將所述溶液在4。C環(huán)境中放置8小時 12小時，再經(jīng)-15°C -20"冷凍、40" 60°C 解凍至少4次后于40°C 5(TC超聲0. 5 1. 5小時即得到權(quán)利要求2所述轉(zhuǎn)基因載體。
全文摘要
本發(fā)明提供的含咪唑嗡鹽和大環(huán)多胺的陽離子脂質(zhì)，其結(jié)構(gòu)式如下上述結(jié)構(gòu)式中，R為膽固醇基或皂素基。以含咪唑嗡鹽和大環(huán)多胺的陽離子脂質(zhì)、膽固醇和去離子水制備轉(zhuǎn)基因載體，所述轉(zhuǎn)基因載體中，含咪唑嗡鹽和大環(huán)多胺的陽離子脂質(zhì)摩爾濃度為1mmol/L～4mmol/L，所述含咪唑嗡鹽和大環(huán)多胺的陽離子脂質(zhì)與膽固醇的摩爾比為1～2∶1。
文檔編號C07J71/00GK101732730SQ20091021646
公開日2010年6月16日 申請日期2009年12月1日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月1日
發(fā)明者余孝其, 朱文, 黃清東 申請人:四川大學