專(zhuān)利名稱(chēng)：基于豬瘟病毒ns3建立的間接elisa方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于獸醫(yī)生物技術(shù)領(lǐng)域，是基于豬瘟病毒(Classical Swine FeverVirus CSFV)重組蛋白NS3為包被抗原，建立檢測(cè)CSFV抗體的間接ELISA方法。

背景技術(shù)：
豬瘟(Classical Swine Fever CSF)是由CSFV引起的一種急性熱性傳染病，各種年齡階段的豬都可感染發(fā)病，該病被國(guó)際動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)列為A類(lèi)傳染病，我國(guó)將其列為一類(lèi)傳染病。雖然該病在北美洲、大洋洲及部分歐洲國(guó)家已經(jīng)消滅，但在其他養(yǎng)豬國(guó)家仍廣泛存在，并對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重危害。我國(guó)長(zhǎng)期對(duì)豬群免疫接種豬瘟病毒兔化弱毒(Hog Cholera Lapizined Virus HCLV)疫苗，基本控制了豬瘟的大流行，但豬瘟在我國(guó)各地豬群中廣泛存在，并呈現(xiàn)地區(qū)性散發(fā)性特點(diǎn)，在豬群中存在一定隱性感染和持續(xù)性感染現(xiàn)象。
當(dāng)前CSF實(shí)驗(yàn)室診斷方法主要存在的問(wèn)題之一是如何有效地區(qū)分CSFV野毒株和疫苗毒株的感染，雖然有報(bào)道特異性RT-PCR能夠區(qū)分病毒野毒和疫苗毒感染，但其對(duì)技術(shù)性要求過(guò)高，不適合大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)具有操作簡(jiǎn)單、敏感性高、快速、易標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)，適合于大規(guī)模血清學(xué)檢測(cè)。但當(dāng)前研制開(kāi)發(fā)的絕大部分CSFV抗體檢測(cè)試劑盒，包括廣泛用于CSFV-Ab血清學(xué)檢測(cè)的IDEXX公司CSFV-Ab檢測(cè)試劑盒，同樣不能區(qū)分CSFV野毒株和疫苗毒株的感染產(chǎn)生的抗體。隨著基因工程疫苗技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)已研究開(kāi)發(fā)出以CSFV E2作為抗原的基因工程標(biāo)記疫苗，和基于CSFV Erns的鑒別診斷ELISA。雖然CSFV E2基因工程疫苗能夠?qū)σ赘胸i群提供保護(hù)，但在實(shí)際臨床中以Erns為抗原建立的鑒別診斷ELISA在血清學(xué)檢測(cè)方面存在敏感性低的缺陷(75～80％)，導(dǎo)致CSFV基因工程標(biāo)記疫苗在實(shí)際臨床應(yīng)用中受到限制。上述問(wèn)題存在導(dǎo)致開(kāi)展CSFV凈化工作受到嚴(yán)重阻礙，使得我國(guó)豬群中CSFV長(zhǎng)期存在并對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成巨大危害。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種基于豬瘟病毒NS3建立的間接ELISA方法，可用于豬群中CSFV NS3蛋白抗體檢測(cè)，以此判斷豬群中CSFV NS3抗體水平、豬群中CSF自然感染的情況，以及為CSFV E2基因工程標(biāo)記疫苗提供鑒別診斷ELISA。
為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是一種基于豬瘟病毒NS3建立的間接ELISA方法，該方法包括如下步驟 (1)、包被抗原的制備 根據(jù)GenBank中豬瘟病毒全基因序列(登錄號(hào)AF351433)，設(shè)計(jì)兩條引物，上游引物fP5′-GATGAGCTCGGGCCTGCCGTTTGCAAGAAG-3′，下游引物rP5′-TCTCCTCGAGTTATAGA CCAACTACCTGTTTTAGTGC-3′，通過(guò)PCR方法從豬瘟病毒兔化弱毒(HCLV)cDNA中擴(kuò)增到長(zhǎng)度為2049bp NS3基因序列，將其克隆到原核表達(dá)載體pET-32a(+)(購(gòu)自Novagen公司，產(chǎn)品編號(hào)69015-3)中，構(gòu)建重組原核表達(dá)載體pETNS3；將重組原核表達(dá)載體pETNS3轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rosetta(DE3)細(xì)胞，經(jīng)0.1mM IPTG誘導(dǎo)高效表達(dá)了重組蛋白NS3，該蛋白主要以包含體形式表達(dá)，部分為可溶性表達(dá)，采用Ni+親和層析方法(參照Novagen公司High-Affinity Ni-NTA Resin試劑盒說(shuō)明書(shū))純化得到重組蛋白NS3，制得抗原。對(duì)照孔包被的抗原硫氧還蛋白由pET-32a(+)空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rosetta(DE3)細(xì)胞誘導(dǎo)表達(dá)，采用Ni+親和層析方法進(jìn)行純化。
(2)、以純化的重組蛋白NS3作為包被抗原建立間接ELISA ①包被用pH為9.6的0.05M碳酸鹽緩沖液稀釋包被抗原包被96孔ELISA板(美國(guó)Costa公司)，檢測(cè)孔NS3蛋白包被量為200ng/孔，對(duì)照孔包被硫氧還蛋白40ng/孔，4℃條件下包被24小時(shí)后甩干，采用PBST(0.05M PH7.4PBS+0.05％吐溫-20，下同)洗滌2遍； ②封閉封閉采用PBST稀釋5％脫脂奶粉，300μl/孔，37℃條件下封閉2h后甩干，用PBST洗滌3次； ③血清作用條件血清樣品稀釋液為PBST稀釋5％脫脂奶粉，添加5％大腸桿菌裂解液，得100μl/孔，血清做50倍稀釋為2μl/孔；37℃條件下孵育1h后甩干，用PBST洗滌4次； ④酶標(biāo)兔抗豬抗體作用條件酶標(biāo)兔抗豬抗體(購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，產(chǎn)品目錄號(hào)A5670)用PBST做104倍稀釋?zhuān)?00μl/孔，37℃條件下孵育1h后甩干，用PBST洗滌4次； ⑤底物顯色TMB底物(購(gòu)自Sigma公司，產(chǎn)品目錄號(hào)T8768)100μl/孔，37℃條件下作用10min后加2M H2SO4100μl/孔，終止反應(yīng)； ⑥讀數(shù)采用酶標(biāo)儀吸光度450nm下讀取數(shù)據(jù)，計(jì)算結(jié)果。
本發(fā)明中提及的PBST皆為0.05M PH7.4PBS+0.05％吐溫-20。(3)、間接NS3-ELISA結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 參考血清的確定經(jīng)IDEXX公司CSFV-Ab檢測(cè)試劑盒和IFA檢測(cè)為陽(yáng)性的血清，在該NS3-ELISA條件下重復(fù)性檢測(cè)OD值為1.0±0.1確定為參考陽(yáng)性血清；經(jīng)IDEXX公司CSFV-Ab檢測(cè)試劑盒和IFA檢測(cè)為陰性的血清，在該NS3-ELISA條件下重復(fù)性檢測(cè)OD值為0.1±0.05確定為參考陰性血清。
S/P值判定結(jié)果計(jì)算公式如下 樣品OD值＝檢測(cè)孔OD值-對(duì)照孔OD值 臨界OD值＝陰性血清平均OD值(n＞30)+3×標(biāo)準(zhǔn)差 樣品S/P值＝樣品OD值/參考陽(yáng)性血清OD值 臨界S/P值＝臨界OD值/參考陽(yáng)性血清OD值 判定標(biāo)準(zhǔn)當(dāng)參考陽(yáng)性血清OD值≥0.75，參考陰性血清OD值＜0.25，同時(shí)參考陰性血清OD值/參考陽(yáng)性血清OD值＜0.2，表明試驗(yàn)成立；臨界S/P值為0.3，S/P≥0.3判定為陽(yáng)性，S/P＜0.3判定為陰性。
黃病毒科各成員NS3在功能方面相似，在人醫(yī)方面已有報(bào)道用丙型肝炎(HCV)重組蛋白NS3建立ELISA應(yīng)用于感染人群血清學(xué)檢測(cè)。牛病毒性腹瀉病毒(Bovine Virus Diarrhea Virus BVDV)與CSFV同屬于瘟病毒屬，運(yùn)用BVDV NS3建立ELISA檢測(cè)牛群中BVDV的抗體水平在國(guó)外已經(jīng)報(bào)道。利用分子生物學(xué)技術(shù)克隆表達(dá)CSFV NS3基因獲取重組蛋白NS3，運(yùn)用WesternBlotting分析證明能與血清中的CSFV NS3特異性抗體結(jié)合，以重組蛋白NS3為抗原建立間接ELISA，依據(jù)ELISA原理以S/P值作為該方法的結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，使該方法在檢測(cè)血清抗體過(guò)程中標(biāo)準(zhǔn)化，減少在實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中造成的系統(tǒng)誤差，可以作為一種可靠的CSFV抗體血清學(xué)檢測(cè)方法，成為CSFV E2基因工程標(biāo)記疫苗一種候選鑒別ELISA檢測(cè)方法。NS3-ELISA的建立理論上能為我國(guó)利用CSFV E2基因工程標(biāo)記疫苗代替?zhèn)鹘y(tǒng)HCLV提供鑒別診斷自然感染的方法，使得運(yùn)用基因工程標(biāo)記疫苗結(jié)合配套鑒別診斷ELISA凈化我國(guó)豬群中的CSFV感染有可靠的技術(shù)保障。
本發(fā)明方法首次利用分子生物學(xué)基因克隆表達(dá)技術(shù)，獲取CSFV重組蛋白NS3，以重組蛋白NS3為抗原建立起間接ELISA。該NS3-ELISA可用于豬群中CSFV NS3特異性抗體檢測(cè)，以此判斷豬群中CSFV NS3抗體水平、豬群中CSF自然感染的情況，以及為CSFV E2基因工程標(biāo)記疫苗提供鑒別ELISA檢測(cè)方法。



圖1是重組蛋白NS3在大腸桿菌Rosetta中誘導(dǎo)表達(dá)及蛋白純化SDS-PAGE分析圖。
其中第1泳道蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，從上至下分別是97.2KDa、66.4KDa、44.3KDa、29KDa；第2泳道純化后的重組蛋白NS3；第3泳道誘導(dǎo)菌裂解后上清；第4泳道誘導(dǎo)菌裂解后沉淀；第5泳道誘導(dǎo)后全菌；第6泳道未誘導(dǎo)全菌；第7泳道Western Blotting分析誘導(dǎo)菌裂解液；第8泳道WesternBlotting分析未誘導(dǎo)菌裂解液。
圖2是IFA檢測(cè)血清樣品結(jié)果圖。
其中A參考陽(yáng)性血清；B參考陰性血清；C陰性血清；D陽(yáng)性血清。

具體實(shí)施例方式 1、包被抗原的制備 1.1特異性引物設(shè)計(jì)與合成利用Primer 5.0引物分析軟件，根據(jù)GenBank收錄CSFV全基因序列(GenBank登陸號(hào)為AF351433)中NS3編碼區(qū)基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物fP和rP，引物兩端分別設(shè)有Sac I和Xho I酶切位點(diǎn)，預(yù)計(jì)可擴(kuò)增出CSFV基因組中5,142-7,191bp(長(zhǎng)度為2,049bp)的基因片段。
上游引物fP5′-GATGAGCTCGGGCCTGCCGTTTGCAAGAAG-3′；下游引物rP5′-TCTCCTCGAGTTATAGACCAACTACCTGTTTTAGTGC-3′。上、下游引物均由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。
1.2pETNS3原核表達(dá)載體的構(gòu)建采用NS3特異性上下游引物從質(zhì)粒pPOHCLV(包含HCLV全長(zhǎng)cDNA)中擴(kuò)增NS3基因片段，用限制性?xún)?nèi)切酶SacI和Xho I(購(gòu)自大連寶生物公司)分別對(duì)NS3PCR產(chǎn)物和pET-32a(+)載體進(jìn)行酶切，用T4DNA連接酶連接兩者酶切產(chǎn)物(購(gòu)自大連寶生物公司)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，采用PCR方法和酶切鑒定陽(yáng)性克隆，陽(yáng)性克隆送至上海英俊生物技術(shù)公司進(jìn)行測(cè)序。
挑取單個(gè)陽(yáng)性克隆菌落PCR鑒定結(jié)果表明能擴(kuò)增到2,000bp多目的條帶，與預(yù)計(jì)NS3基因片段大小一致。挑取單個(gè)陽(yáng)性克隆菌落增菌培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，用限制性?xún)?nèi)切酶Sac I和Xho I進(jìn)行酶切鑒定，酶切后得到5,300bp和2,000bp大小的片段。陽(yáng)性克隆測(cè)序結(jié)果顯示NS3基因插入位置、插入方向和閱讀框正確，結(jié)果表明重組原核表達(dá)載體pETNS3構(gòu)建成功。
1.3重組蛋白NS3誘導(dǎo)表達(dá)與鑒定將構(gòu)建好的重組原核表達(dá)載體pETNS3質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，挑單個(gè)菌落進(jìn)行增菌培養(yǎng)，LB液體培養(yǎng)基中添加50μg/ml濃度Amp和1％濃度葡萄糖，30℃條件下140rpm培養(yǎng)4h左右至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(620nm吸光度為0.6)，加入IPTG終濃度為1mM，繼續(xù)培養(yǎng)5-6h后收菌。分別取誘導(dǎo)和非誘導(dǎo)菌液2ml，離心后收集細(xì)菌沉淀，用50μl PBS(0.05M PH7.4)懸浮細(xì)菌。樣品加2×SDS凝膠加樣緩沖液50μl混勻，煮沸處理5min后振蕩裂解細(xì)菌，稍離心后取上清進(jìn)行SDS-PAGE，鑒定蛋白是否表達(dá)。取誘導(dǎo)培養(yǎng)菌液離心后棄上清收集細(xì)菌沉淀，用PBS懸浮細(xì)菌后超聲波裂解至清亮，4℃條件下10,000×g/min離心5min，分別取上清和沉淀懸浮液加2×SDS凝膠加樣緩沖液混勻，煮沸處理5min后SDS-PAGE鑒定蛋白表達(dá)方式。
1.4蛋白純化取100ml LB液體培養(yǎng)基，按照1.3中蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行大量誘導(dǎo)培養(yǎng)。取包含體參照Novagen公司High-Affinity Ni-NTA Resin試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行蛋白純化，取回收蛋白質(zhì)樣品加2×SDS凝膠加樣緩沖液煮沸處理5min后，進(jìn)行SDS-PAGE鑒定蛋白純度?；厥盏鞍讟悠凡捎梅止夤舛扔?jì)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，加入50％甘油置-20℃保存?zhèn)溆谩?br> SDS-PAGE分析顯示，重組蛋白NS3在大腸桿菌Rosetta(DE3)細(xì)胞中成功表達(dá)，主要以包含體的形式表達(dá)，部分以可溶性方式表達(dá)，蛋白分子量大小為95kDa，與預(yù)測(cè)的重組蛋白NS3大小基本一致(參見(jiàn)圖1)。回收后蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行SDS-PAGE鑒定純度，結(jié)果表明蛋白純化效果較好，純度在90％以上，測(cè)定蛋白質(zhì)濃度為1.0mg/ml(見(jiàn)圖1)。
1.5Western Blotting分析按照1.3中方法誘導(dǎo)表達(dá)蛋白，分別取誘導(dǎo)和非誘導(dǎo)全菌SDS-PAGE，參照常規(guī)Western Blotting方法進(jìn)行操作，最后采用增強(qiáng)型HRP-DAB底物顯色試劑(購(gòu)自北京天根生化科技公司)進(jìn)行顯色。結(jié)果顯示與SDS-PAGE對(duì)比，pETNS3轉(zhuǎn)化Rosetta(DE3)誘導(dǎo)后在Western Blotting對(duì)應(yīng)位置出現(xiàn)特異性的條帶，而對(duì)照未誘導(dǎo)菌則無(wú)(見(jiàn)圖1)。結(jié)果表明重組蛋白NS3能與陽(yáng)性血清中抗體發(fā)生特異性抗原抗體反應(yīng)。
2、以重組蛋白NS3建立間接ELISA 取純化后重組蛋白NS3做包被抗原建立間接ELISA方法，采用方陣法摸索ELISA最佳蛋白包被濃度和血清稀釋濃度，以及ELISA最佳反應(yīng)條件。最終確定條件如下 ①包被檢測(cè)孔重組蛋白NS3包被量為200ng/孔，對(duì)照孔硫氧還蛋白包被量為40ng/孔，4℃條件下包被24小時(shí)后甩干，采用PBST(0.05M PH7.4PBS+0.05％吐溫-20)洗滌2遍； ②封閉封閉采用PBST稀釋5％脫脂奶粉，300μl/孔，37℃條件下封閉2h后甩干，用PBST洗滌3次； ③血清作用條件血清稀釋液為PBST稀釋5％脫脂奶粉，添加5％的大腸桿菌裂解液，得100μl/孔，血清做50倍稀釋為2μl/孔；37℃條件下孵育1h后甩干，用PBST洗滌4次； ④酶標(biāo)兔抗豬抗體作用條件酶標(biāo)兔抗豬抗體用PBST做104倍稀釋后，100μl/孔，37℃條件下孵育1h后甩干，用PBST洗滌4次； ⑤底物顯色TMB底物100μl/孔，37℃條件下作用10min后加2M H2SO4終止反應(yīng)； ⑥讀數(shù)采用酶標(biāo)儀吸光度450nm下讀取數(shù)據(jù)。
3、結(jié)果判定 檢測(cè)結(jié)果計(jì)算公式 樣品OD值＝檢測(cè)孔OD值-對(duì)照孔OD值 樣品S/P值＝樣品OD值/參考陽(yáng)性血清OD值 判定標(biāo)準(zhǔn)當(dāng)參考陽(yáng)性血清OD值≥0.75，參考陰性血清OD值＜0.25，同時(shí)參考陰性血清OD值/參考陽(yáng)性血清OD值＜0.2，表明試驗(yàn)成立。血清樣品臨界S/P值為0.3，S/P≥0.3判定為陽(yáng)性，S/P＜0.3判定為陰性。
ELISA重復(fù)性試驗(yàn)按照確定好的ELISA條件，用參考陽(yáng)性血清和參考陰性血清進(jìn)行批次間重復(fù)性試驗(yàn)，檢驗(yàn)所建立ELISA的穩(wěn)定性，結(jié)果見(jiàn)下表1。結(jié)果顯示參考陽(yáng)性血清10次重復(fù)性試驗(yàn)后，NS3檢測(cè)孔OD值變異系數(shù)為3.8％，對(duì)照孔OD值變異系數(shù)為10.9％，檢測(cè)OD值變異系數(shù)為4.2％；參考陰性血清NS3檢測(cè)孔OD值變異系數(shù)為21％，對(duì)照孔OD值變異系數(shù)為10.5％，檢測(cè)OD值變異系數(shù)為40.6％。結(jié)果表明參考陽(yáng)性血清重復(fù)性檢測(cè)變異性小，NS3檢測(cè)孔OD值和測(cè)定OD值變異系數(shù)均低于10％，檢測(cè)結(jié)果具有很好的重復(fù)性，所以該NS3-ELISA以S/P值作為判定標(biāo)準(zhǔn)；而參考陰性血清重復(fù)性變異性大，各個(gè)指標(biāo)變異系數(shù)均大于10％，所以以P/N值判定結(jié)果變異性大，不適合作為本方法的判定標(biāo)準(zhǔn)。
表1 批次間重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果
無(wú)交叉反應(yīng)應(yīng)用CSFV重組蛋白NS3建立起的間接NS3-ELISA檢測(cè)豬群中常見(jiàn)傳染性病毒性疾病，如豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(PRRSV)參考陽(yáng)性血清、偽狂犬病毒(PRV)參考陽(yáng)性血清、口蹄疫病毒(FMDV)參考陽(yáng)性血清和豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)參考陽(yáng)性血清，結(jié)果均為陰性。表明運(yùn)用NS3融合蛋白建立的相關(guān)ELISA方法與豬群中常見(jiàn)病原抗體之間無(wú)交叉反應(yīng)。
本發(fā)明的間接NS3-ELISA與IDEXX公司CSFV-Ab檢測(cè)試劑盒比較檢測(cè)不同年齡和種群豬的血清樣品325份，比較間接NS3-ELISA與IDEXX公司CSFV-Ab檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果之間一致性，結(jié)果顯示陽(yáng)性血清符合率為88.42％，陰性血清符合率為85.19％，總符合率為87.08％，表明兩者之間檢測(cè)結(jié)果有較高的一致性，見(jiàn)下表2。
表2 間接NS3-ELISA與IDEXX公司CSFV-Ab檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果對(duì)比表 IFA檢測(cè)42份NS3-ELISA與IDEXX公司CSFV-Ab檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果存在差異的血清樣NS3-ELISA和IDEXX公司CSFV-Ab檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果比較有42份樣品存在差異性，進(jìn)一步采用IFA進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示與IFA結(jié)果比較NS3-ELISA的總符合率為66.67％，而IDEXX公司CSFV-Ab檢測(cè)試劑盒為33.33％。表明這42份血清樣品中NS3-ELISA檢測(cè)結(jié)果與IFA檢測(cè)結(jié)果有較好的一致性，同時(shí)從總的血清檢測(cè)結(jié)果來(lái)看NS3-ELISA在敏感性和特異性方面稍高于IDEXX公司CSFV-Ab檢測(cè)試劑盒。
權(quán)利要求
1.一種基于豬瘟病毒NS3建立的間接ELISA方法，其特征在于該方法根據(jù)間接ELISA的原理建立，包括如下步驟
(1)、包被抗原的制備
根據(jù)GenBank中豬瘟病毒全基因序列(登錄號(hào)AF351433)，設(shè)計(jì)兩條引物，上游引物fP5′-GATGAGCTCGGGCCTGCCGTTTGCAAGAAG-3′，下游引物rP5′-TCTCCTCGAGTTATAGA CCAACTACCTGTTTTAGTGC-3′；通過(guò)PCR方法從豬瘟病毒兔化弱毒cDNA中擴(kuò)增到長(zhǎng)度為2049bp NS3基因序列，將其克隆到原核表達(dá)載體pET-32a(+)中，構(gòu)建重組原核表達(dá)載體pETNS3；將重組原核表達(dá)載體pETNS3轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rosetta(DE3)細(xì)胞，經(jīng)1mM IPTG誘導(dǎo)高效表達(dá)了重組蛋白NS3，該蛋白主要以包含體形式表達(dá)，部分為可溶性表達(dá)，采用Ni+親和層析方法純化得到重組蛋白NS3；
(2)、以純化后的豬瘟病毒重組蛋白NS3做包被抗原建立間接ELISA
①包被用pH為9.6的0.05M碳酸鹽緩沖液稀釋包被抗原包被96孔ELISA板，檢測(cè)孔NS3蛋白包被量為200ng/孔，4℃條件下包被24小時(shí)后甩干，采用PBST洗滌2遍；
②封閉封閉采用PBST稀釋5％脫脂奶粉，300μl/孔，37℃條件下封閉2h后甩干，用PBST洗滌3次；
③血清作用條件血清樣品稀釋液為PBST稀釋5％脫脂奶粉，添加5％大腸桿菌裂解液，得100μl/孔，血清做50倍稀釋為2μl/孔；37℃條件下孵育1h后甩干，用PBST洗滌4次；
④酶標(biāo)兔抗豬抗體作用條件酶標(biāo)兔抗豬抗體用PBST做104倍稀釋后，100μl/孔，37℃條件下孵育1h后甩干，用PBST洗滌4次；
⑤底物顯色TMB底物100μl/孔，37℃條件下作用10min后加2M H2SO4100μl/孔，終止反應(yīng)；
⑥讀數(shù)采用酶標(biāo)儀吸光度450nm下讀取數(shù)據(jù)；
(3)、結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)當(dāng)參考陽(yáng)性血清OD值≥0.75，參考陰性血清OD值＜0.25，同時(shí)參考陰性血清OD值/參考陽(yáng)性血清OD值＜0.2，表明試驗(yàn)成立，樣品臨界S/P值為0.3，S/P≥0.3判定為陽(yáng)性，S/P＜0.3判定為陰性。
全文摘要
一種基于豬瘟病毒(Classical Swine Fever Virus CSFV)NS3建立的間接ELISA方法，通過(guò)基因克隆表達(dá)技術(shù)，獲取豬瘟病毒重組蛋白NS3。以重組蛋白NS3為包被抗原建立起間接ELISA方法，包括抗原重組蛋白NS3的制備、間接ELISA建立、判定標(biāo)準(zhǔn)的建立及臨床血清學(xué)檢測(cè)的應(yīng)用?？捎糜谪i群中CSFV NS3特異性抗體檢測(cè)，以此判斷豬群中CSFV NS3抗體水平、豬群中CSFV自然感染的情況，以及為CSFV E2基因工程標(biāo)記疫苗提供鑒別ELISA檢測(cè)方法。目前該方法是國(guó)際上首次利用CSFV NS3建立檢測(cè)豬群中CSFV抗體的ELISA，其敏感性和特異性明顯高于基于Ems建立的ELISA。
文檔編號(hào)C07K14/18GK101799471SQ20091021556
公開(kāi)日2010年8月11日 申請(qǐng)日期2009年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月23日
發(fā)明者余興龍, 蔣大良, 李潤(rùn)成, 葛猛 申請(qǐng)人:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)