專利名稱：肽的制造方法
肽的制造方法本發(fā)明涉及用于制造Omiganan肽及其中間產(chǎn)物的方法，并且此外涉及在用于制 造Omiganan的方法中的新穎的中間產(chǎn)物。Omiganan 是對(duì)于月太 H-Ile-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-N H2 (SEQ ID NO 1)的常見國(guó)際命名(CID)，它主要是以其五鹽酸化物(5HC1)鹽的形式被使 用。Omiganan是一種陽(yáng)離子的抗微生物的肽。最近的研究還顯示了它可以在炎癥應(yīng)答中 起作用。Omiganan在體外分析中證明了對(duì)抗多種微生物的一種快速殺菌活性，這些微生物 移殖于皮膚中而且可以在炎癥病變的致病中起作用。此外，Omiganan五氯化物目前是在 II-III期用于治療嚴(yán)重的痤瘡，并且在III期臨床試驗(yàn)中用于預(yù)防中心靜脈導(dǎo)管相關(guān)的血 流感染。Omiganan可以經(jīng)由一種線性肽合成而生產(chǎn)，其中對(duì)應(yīng)的氨基酸被順序地添加到一 個(gè)增長(zhǎng)的肽鏈中。至于所希望的Omiganan肽的產(chǎn)率和純度，這些方法是不令人滿意的。本發(fā)明現(xiàn)在使之可得到一種用于該Omiganan肽的改進(jìn)的合成。美國(guó)專利號(hào)5，262，567披露了使用一種化合物(包括一個(gè)胍基團(tuán)以及一種未取代 的四苯基硼酸鹽離子)作為該肽合成中的中間產(chǎn)物。作為一個(gè)實(shí)例，描述了由精氨酸與四 苯基硼酸鹽(TPB)形成的化合物的合成以及它在合成該肽Boc-Leu-Arg-OH中的用途。WO 99/65506A披露了包含陽(yáng)離子肽的藥用組合物，這些陽(yáng)離子肽包括陽(yáng)離子肽 MBI 11B20CN，它包含Omiganan的氨基酸序列。因此本發(fā)明的目標(biāo)是提供用于生產(chǎn)該Omiganan肽的方法，該方法以高產(chǎn)率和高 純度給出Omiganan。根據(jù)本發(fā)明的方法出人意料地允許以有限的步驟(特別是純化步驟) 生產(chǎn)所述肽，因此大大減小了制造成本。因此本發(fā)明在第一方面涉及用于制造具有序列H-Ile-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp -Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-NH2 (SEQ ID NO 1) Omiganan肽或其一種衍生物的一種方法，該方法 包括在溶液中將一種第一肽與一種第二肽進(jìn)行偶聯(lián)的至少一個(gè)步驟，該第一肽具有一個(gè)活 化的羧基以及至少兩個(gè)氨基酸單元、或一種選自下組的氨基酸，該組的組成為具有一個(gè)活 化羧基的Ile、LeU、Arg、以及Trp、Pr0 ；該第二肽具有一個(gè)游離的氨基以及至少兩個(gè)氨基酸 單元，其中該第一與第二肽是不同的并且包含選自下組的多個(gè)氨基酸，該組的組成為Ile、 Leu>Arg>Trp>Pro> ^(,,S. Lysj^T-Iil Omiganan 中白勺序歹[J 11 e-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-P ro-Trp-Arg-Arg-Lys (SEQ ID NO 1)所說明的順序中。為了本發(fā)明的目的，術(shù)語“肽”是指一種聚合物，其中這些單體是通過酰胺鍵共價(jià) 地附接在一起的氨基酸。肽是兩個(gè)或經(jīng)常是更多個(gè)氨基酸單體長(zhǎng)。另外，所有的肽序列由 左邊或右邊取向是處于氨基端到羧基端的常規(guī)方向的那些化學(xué)式代表。為了本發(fā)明的目的，術(shù)語“氨基酸”旨在表示任何包括至少一個(gè)NR1R2基團(tuán)(優(yōu)選 NH2基團(tuán))、以及至少一個(gè)羧基的化合物。本發(fā)明的這些氨基酸可以是天然存在的或是合成 的。這些天然氨基酸除甘氨酸之外，包含一種手性碳原子。除非另外確切指明，優(yōu)選的是包 含具有L構(gòu)型的天然氨基酸的這些化合物。貫穿本申請(qǐng)將氨基酸殘基縮寫為如下異亮氨 酸是Ile ；亮氨酸是Leu ；精氨酸是Arg ；色氨酸是Trp ；脯氨酸是Pro并且賴氨酸是LyS。
為了本發(fā)明的目的，術(shù)語肽的“C-端”是由一個(gè)游離羧基(-C00H)封端的一種氨基 酸序列的末端。另一方面，術(shù)語肽的“N-端”是指由一種具有游離氨基(-NH2)的氨基酸封 端的一種氨基酸序列的末端。為了本發(fā)明的目的，術(shù)語“偶聯(lián)”是指在一種氨基酸的羧基或一種第一肽的C-端 與另一種氨基酸的氨基或一種第二肽的N-端之間的反應(yīng)。換言之，在偶聯(lián)的過程中，兩個(gè) 肽中間產(chǎn)物片段、或一個(gè)肽中間產(chǎn)物片段以及一種反應(yīng)性氨基酸被偶聯(lián)，一般是在一種適 當(dāng)?shù)娜軇┲?、并且通常是在促進(jìn)該偶聯(lián)反應(yīng)的效率以及質(zhì)量的另外試劑的存在下。這些肽 中間產(chǎn)物片段被反應(yīng)性地安排，因而一個(gè)片段的N-端變?yōu)榕悸?lián)至另一個(gè)片段的C-端，或反 之亦然。如在此使用的，術(shù)語“肽衍生物”包括一種類似物，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基已 經(jīng)被對(duì)應(yīng)的D異構(gòu)體或被一個(gè)非天然的氨基酸殘基、或其一種化學(xué)衍生物所取代。一種肽 的化學(xué)衍生物包括但不限于含有多個(gè)另外的化學(xué)部分的一種衍生物，假如該衍生物保持 該肽的抑制活性，則這些另外的化學(xué)部分通常不是該肽的一部分。這類衍生物的實(shí)例是 (a)該氨基端的或另一個(gè)游離氨基的N-酰基衍生物，其中該酰基基團(tuán)可以是一種烷?；?基團(tuán)比如乙酰基、己酰基、辛酰基；一種芳?；?，如苯甲?；?、或生物素基；(b)該羧基端的 或另一個(gè)游離羧基或多個(gè)羥基的酯類；以及(c)該羧基端的或另一個(gè)游離羧基的酰胺，通 過與氨或與一種適當(dāng)?shù)陌贩磻?yīng)而產(chǎn)生。Omiganan的衍生物及其中間產(chǎn)物還是(例如)該 Omiganan序列的受保護(hù)的片段和肽、Omiganan與無機(jī)的或有機(jī)酸的鹽類(優(yōu)選無機(jī)酸、并 且最優(yōu)選鹽酸)的鹽及其中間產(chǎn)物?？赡苁褂玫呐c有機(jī)酸的鹽的實(shí)例是與乙酸、檸檬酸、草 酸、三氟乙酸、四苯基硼酸以及酒石酸的鹽類。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括將Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-NH2 (SEQ ID NO 2)或其一種衍生物與Ile-Leu進(jìn)行偶聯(lián)的步驟，其中Ile的
氨基受一個(gè)氨基保護(hù)基團(tuán)所保護(hù)。此外優(yōu)選的是本發(fā)明的方法包括將Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-NH2 (SEQ ID NO 3)或其一種衍生物與Arg-Trp-Pr0進(jìn)行偶聯(lián)的步驟，其中Arg的氨基受到一個(gè)保護(hù)基團(tuán) 保護(hù)。該方法優(yōu)選地包括將Trp-Arg-Arg-Lys-NH2 (SEQ ID NO 4)或其一種衍生物與 Trp-Trp-Pro進(jìn)行偶聯(lián)的步驟，其中Trp N端的氨基受到一個(gè)保護(hù)基團(tuán)保護(hù)。此外，本發(fā)明根據(jù)一個(gè)第二方面是針對(duì)一種用于制造H-Arg-Lys (Boc)-NH2的方 法，該方法包括以下步驟(a)將 Z-Arg-OH. Cl 與 H-Lys (Boc) -NH2 進(jìn)行偶聯(lián)；并且(b)將步驟(a)中所獲得的Z-Arg-Lys (Boc)-NH2氫解，優(yōu)選是在一種Pd催化劑的 存在下。術(shù)語"Lys(Boc) ”旨在表示氨基側(cè)鏈?zhǔn)艿揭粋€(gè)Boc基團(tuán)保護(hù)的一種賴氨酸。 在第三方面，本發(fā)明是針對(duì)新穎的中間產(chǎn)物Z-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Ar g-Arg-Lys (Boc) -NH2 (SEQ ID NO 2)。在第四個(gè)方面，本發(fā)明是針該新穎的中間產(chǎn)物Z-Arg-Trp-Pro-OH。在第五個(gè)方面，本發(fā)明是針對(duì)一種用于制造Z-Arg-Trp-Pro-OH的方法，該方法包 括使H-Trp-Pro-OH與Z-Arg-OH. HCl進(jìn)行偶聯(lián)的步驟。
在第六個(gè)方面，本發(fā)明是針對(duì)新穎的中間產(chǎn)物Z-Trp-Trp-Pro-OH。在第七個(gè)方面，本發(fā)明是針對(duì)一種用于制造Z-Trp-Trp-Pro-OH的方法，該方法包 括使H-Trp-Pro-OH與Z-Trp-Osu進(jìn)行偶聯(lián)的步驟。在第八個(gè)方面，本發(fā)明是針對(duì)一種用于制造中間產(chǎn)物Boc-IIe-Leu-OH的方法，該 方法包括使Boc-Ile-NCA與H-Leu-OH進(jìn)行偶聯(lián)的步驟。在第九個(gè)方面，本發(fā)明是針對(duì)新穎的中間產(chǎn)物Z-Trp-Arg-Arg-Lys (Boc) -NH2 (SEQ ID NO 4)。在第十個(gè)方面，本發(fā)明是針對(duì)新穎的中間產(chǎn)物Z-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys ( Boc) -NH2 (SEQ ID NO 3)。在本發(fā)明的方法中，保護(hù)基團(tuán)一般用于在所涉及的氨基酸或肽中間產(chǎn)物中的一個(gè) 或多個(gè)氨基。保護(hù)基團(tuán)的用途沒有具體進(jìn)行限制。以說明的方式，在本發(fā)明的這些化合物中可以采用以下保護(hù)基團(tuán)?；捅Ｗo(hù)基團(tuán)，特別是甲酰基、三氟乙?；⑧彵蕉柞；?、4_甲苯磺酰基、苯磺 ?；约?-硝基苯基次磺酸基；芳香族的尿烷型保護(hù)基團(tuán)，例如尤其是取代的或未取代的芐氧基羰基、對(duì)_溴代 芐氧基羰基、對(duì)-甲氧基芐氧基羰基、二苯甲基氧基羰基、2-(4_聯(lián)苯基)丙基(2)氧基羰 基、2-(3，5_ 二甲基氧苯基)、丙基(2)氧基羰基、以及三苯基膦?；一趸驶恢咀宓哪蛲樾捅Ｗo(hù)基團(tuán)，特別是叔丁氧羰基、二異丙基甲氧羰基、異丙氧羰基、 乙氧羰基、烯丙氧羰基、9-芴甲氧羰基、2-甲基磺?；已豸驶约?，2，3-三氯乙基氧基 羰基；環(huán)烷基尿烷型保護(hù)基團(tuán)，例如尤其是環(huán)戊氧羰基、金剛烷氧基羰基、環(huán)己氧基羰 基、叔戊氧基羰基以及異冰片基氧基羰基；硫尿烷型保護(hù)基團(tuán)，特別是苯基硫代羰基、烷基型保護(hù)基團(tuán)，例如尤其是三苯基甲基(三苯甲基)以及芐基；三烷基硅烷基團(tuán)，如三烷基硅烷。上述的保護(hù)基團(tuán)特別適合作為氨基保護(hù)基團(tuán)。在本發(fā)明的一種或多種方法中，優(yōu)選的是在與一個(gè)保護(hù)基團(tuán)進(jìn)行偶聯(lián)的步驟過程 中一種氨基酸基團(tuán)中的至少一個(gè)氨基受到保護(hù)，該保護(hù)基團(tuán)選自一種芳香族的尿烷型保護(hù) 基團(tuán)以及脂肪族的尿烷型保護(hù)基團(tuán)。更優(yōu)選地，所述保護(hù)基團(tuán)是選自一種叔丁氧羰基(Boc) 基團(tuán)與一種芐氧基羰基(Z)基團(tuán)。在本發(fā)明的一種或多種方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該芐氧基羰基(Z)基團(tuán)被用 作一個(gè)氨基酸單元中一個(gè)端氨基的保護(hù)基團(tuán)，其中該氨基酸單元是Arg或Trp。在本發(fā)明的一種或多種方法的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該叔丁氧羰基(Boc)基團(tuán) 被用作Lys中的側(cè)鏈氨基的和/或Ile中的N-端氨基的保護(hù)基團(tuán)。特別適合用于保護(hù)該羧基的其他保護(hù)基團(tuán)包括烷氧基，特別是甲酯、乙酯、叔丁酯 以及芐基酯。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，Lys的羧基是作為酰胺、特別是作為CONH2基團(tuán)被保 護(hù)的。在本發(fā)明的一種或多種方法中，該第一肽具有一個(gè)活化的羧基以及一般至少兩個(gè) 氨基酸單元。在本發(fā)明的方法中可以使用不同的活化基團(tuán)，它們減少了副反應(yīng)和/或增大 了反應(yīng)效率，優(yōu)先選自碳二亞胺類、羰基二咪唑類、酰鹵類、磷鐺鹽類、以及脲鐺或胍鐺鹽類。例如，磷鐺和脲鐺鹽類在一種叔堿(例如二異丙基乙胺(DIPEA)以及三乙胺(TEA))的 存在下可以將被保護(hù)的氨基酸轉(zhuǎn)化成活化的種類(例如BOP、PyBOP, HBTU、以及TBTU全部 產(chǎn)生了 HOBt酯)。幫助防止外消旋作用的其他試劑包括碳二亞胺類(例如N，N-二環(huán)己 基碳二亞胺(DCC)、N-(3- 二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亞胺(EDC)或水溶性碳二亞 胺(WS⑶I))與一種添加的輔助親核體(例如1-羥基-苯并三唑(HOBt)、3，4 二氫-3-羥 基-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪(HOOBT)、1_羥基-氮雜苯并三唑(HOAt)、或HOSu)或其衍 生物?？梢允褂玫牧硪环N試劑是TBTU。例如用N，N- 二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、N-(3- 二 甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亞胺(EDC)、新戊酰氯(PivCl)、異丁基氯甲酸酯(IBCF)、 HBTU (0-(苯并三唑-1-基)-N, N，N，，N，-四甲基脲鐺六氟磷酸鹽)、HATU (0- (7-氮雜苯并 三唑-1-基)-N，N, N，，N，-四甲基銨脲鐺六氟磷酸鹽)、以及EEDQ (2-乙氧基-1-乙氧碳 ?；?1，2-二氫喹啉)獲得了好的結(jié)果。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的活化基團(tuán)是DCC、EDC以及HBTU。當(dāng)使用這類羧酸活化劑時(shí)，該偶聯(lián)反應(yīng)經(jīng)常是在一種堿作為額外試劑的存在下進(jìn) 行的。在本發(fā)明的另一個(gè)具體的方面，該偶聯(lián)反應(yīng)因此是在一種堿的存在下進(jìn)行的。該堿 是優(yōu)先選自叔胺類以及雜芳香族胺類，如N-甲基嗎啉(NMM)、吡啶、三乙胺(TEA)、二異丙基 乙胺(DIPEA)或它們的混合物。更優(yōu)選地，它是選自N-甲基嗎啉以及二異丙基乙胺。除這些活化基團(tuán)之外，有時(shí)候有利地使用添加劑。優(yōu)選的添加劑是N-羥基丁二酰 亞胺(Suc-OH)、N-羥基苯并三唑(HOBt)、或3，4-二氫_3_羥基-4-氧代-1，2，3苯并三嗪 (HOOBt)以及它們的衍生物。通常這些添加劑是基于待活化的羧基的量值按1到2當(dāng)量的 量值使用。在本發(fā)明的另一個(gè)具體的方面，如以上說明的肽的偶聯(lián)是在至少一種極性有機(jī)溶 劑的存在下進(jìn)行的。在一個(gè)具體的優(yōu)選實(shí)施方案中，該極性有機(jī)溶劑允許對(duì)所形成的肽鍵 的外消旋作用、該肽和/或肽片段的溶解度、以及偶聯(lián)反應(yīng)速率進(jìn)行特別有效的控制。該 極性有機(jī)溶劑優(yōu)先選自N，N- 二甲基乙酰胺(DMA)、N, N- 二甲基甲酰胺(DMF)、N-甲基吡 咯烷酮(NMP)、二甲亞砜(DMSO)、乙酸乙酯(AcOEt)、異丙基乙酸酯、二氯甲烷(DCM)、亞甲 基氯、吡啶、氯仿、乙腈、二甲氧基乙烷、二噁烷、四氫呋喃(THF)或它們的混合物。更優(yōu)選 地，它是選自N，N- 二甲基乙酰胺(DMA)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、二氯甲烷(DCM)、以及N， N 二甲基甲酰胺(DMF)或它們的混合物。最優(yōu)選地，該極性有機(jī)溶劑是N，N-二甲基乙酰胺 (DMA)。一種優(yōu)選的混合物包含20%到80% (體積)的DMA以及80%到20% (體積)的 二氯甲烷(CH2Cl2)、更優(yōu)選50%到70% (體積)的DMA以及50%到30% (體積)的二氯 甲烷(CH2Cl2)。如在此使用的術(shù)語“偶聯(lián)”或“偶聯(lián)步驟”具體是指將不同的肽或氨基酸進(jìn)行偶聯(lián) 的步驟。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括使Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-NH2(SEQ ID NO 2)或其一種衍生物與受保護(hù)的Ile-Leu或其一種衍生物進(jìn)行 偶聯(lián)的步驟。在這個(gè)步驟中，優(yōu)選將HOOBt用作一種添加劑。此外，這個(gè)偶聯(lián)步驟優(yōu)選是在 DMA/二氯甲烷(CH2Cl2)的一種混合物中進(jìn)行，該混合物優(yōu)選包含50%到75% (體積)的 DMA以及25%到50% (體積)的二氯甲烷(CH2Cl2)。此外該偶聯(lián)步驟優(yōu)選在EDC的存在下 進(jìn)行。
在根據(jù)本發(fā)明的方法的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，該第二肽具有選自以下的化 學(xué)式NH2-Trp-Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 4) ,NH2-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys (X) -R (SEQ ID NO 5), NH2-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 6), NH2-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Ar g-Lys (X)_R(SEQ ID N07), NH2-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 8), N H2-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 9), NH2-Arg-Trp-Pro-Trp-T rp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 10), NH2-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys (X)-R(SEQ ID NO 11)，其中X是用于該Lys-側(cè)鏈氨基的一個(gè)保護(hù)基團(tuán)、優(yōu)選 是一種Boc基團(tuán)，并且R是用于Lys的羧基的一個(gè)羧基保護(hù)基團(tuán)、優(yōu)選是一種酰胺基團(tuán)。事實(shí)上本發(fā)明允許貫穿該合成對(duì)于在該Ominagan肽的10位置包含Arg的D-對(duì) 映異構(gòu)體的多種產(chǎn)物的存進(jìn)行控制并且將其最小化。在這個(gè)實(shí)施方案中，該第二肽總體上包括從0. 1襯％到、有利地從 0. 2wt % -0. 9wt %、并且經(jīng)常從 0. 2wt % 到 0. 7wt % 的一種肽，該肽選自=NH2-Trp-(D) Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 4), NH2-Pro-Trp-(D)Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 5)、 NH2-Trp-Pro-Trp-(D)Arg-Arg-Lys (X)-R (SEQ ID NO 6)、NH2-Trp-Trp-Pro-Trp-(D) Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 7)、 NH2-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-(D)Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 8)、NH2-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-(D)Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 9)、NH2-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-(D)Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 10)、NH2-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp- (D) Arg-Arg-Lys (X) -R (SEQ ID NO 11) > NH2- (D) Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys (X) -R(SEQ ID NO 11)，其中 X 和 R 是如上所說明的。本發(fā) 明還涉及所述第二肽。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，該第二肽是NH2-Arg-Lys(X)-R,其中X是用 于該Lys-側(cè)鏈氨基的一個(gè)任選的保護(hù)基團(tuán)、優(yōu)選是一種Boc基團(tuán)，并且R是用于Lys的 羧基的一個(gè)羧基保護(hù)基團(tuán)，優(yōu)選是一個(gè)酰胺基團(tuán)，并且該第一肽是選自下組Y-Trp-Arg、 Y-Pro-Trp-Arg> Y-Trp-Pro-Trp-Arg(SEQ ID NO 12)> Y-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg(SEQ ID NO 13) > Y-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg(SEQ ID NO 14) > Y-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg(SEQ ID NO 15) > Y-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg(SEQ ID NO 16) > Y-Leu-Arg-Trp-Pro-T rp-Trp-Pro-Trp-Arg(SEQ ID NO 17)、Y-Ile-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg(SE Q ID NO 18)，并且Y是用于該N-端氨基的一個(gè)氨基保護(hù)基團(tuán)、特別是如上所說明的、優(yōu)選 是一個(gè)Z基團(tuán)。在這個(gè)具體的實(shí)施方案中，該偶聯(lián)有利地在一種芳基環(huán)化的氧代-三嗪活化劑、 優(yōu)選HOOBt的存在下進(jìn)行。在這個(gè)實(shí)施方案中，該偶聯(lián)總體上是在從-10°C到+10°C的溫度下進(jìn)行的。在這個(gè)實(shí)施方案中，該偶聯(lián)經(jīng)常是在一種鹵化的與非鹵化的溶劑的一個(gè)混合物 中、優(yōu)選一種氯化的溶劑與一種酰胺型溶劑的一個(gè)混合物進(jìn)行的。適當(dāng)?shù)穆然娜軇┌?例如氯仿、1，2_ 二氯乙烷以及優(yōu)選地二氯甲烷。適當(dāng)?shù)孽０沸腿軇┌ɡ鏝-甲基吡咯 烷酮、N，N-二甲基甲酰胺以及優(yōu)選地N，N-二甲基乙酰胺。亞甲基氯與N，N-二甲基乙酰胺 的一種混合物已經(jīng)給出了良好的結(jié)果。特別有利的是使Z-Trp-Arg-OH 與 HCl. H-Arg-Lys (Boc) -NH2 偶聯(lián)。在本實(shí)施方案的最優(yōu)選的方面，使Z-Trp-Arg-OH與HCl. H-Arg-Lys (Boc) -NH2偶聯(lián)，該活化劑是HOOBt，該溶劑是DMA與亞甲基氯的一種混合物，并且該偶聯(lián)在第一時(shí)間段 中在-5°C 士5°C的溫度下進(jìn)行了 3到5小時(shí)、并且在第二時(shí)間段中在+5°C 士5°C的溫度下 進(jìn)行了 6到10小時(shí)。根據(jù)本發(fā)明特別優(yōu)選的方法是依照

圖1的方案。在該方案中X與Y可以是相同的 或不同的。它們優(yōu)選地是不同的。當(dāng)X是一種叔丁氧羰基(Boc)基團(tuán)并且Y是一種芐氧基 羰基(Z)基團(tuán)時(shí)，獲得了良好的結(jié)果。本發(fā)明還涉及用于制造具有序列H-Ile-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg -Arg-Lys-NH2 (SEQ ID NO 1)的Omiganan肽的一種脫保護(hù)方法，該方法包括在基本上無水 的條件下使具有化學(xué)式 Yl-Ile-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys (Y2) -NH 2(SEQ ID NO 1)的一種前體肽與一種酸進(jìn)行反應(yīng)，其中Yl與Y2指代相同或不同的氨基保 護(hù)基團(tuán)或H，并且Yl或Y2的至少一個(gè)是一種對(duì)酸敏感的氨基保護(hù)基團(tuán)。保護(hù)基團(tuán)Yl和Y2可以是例如包括在以上概括說明中的氨基保護(hù)基團(tuán)。優(yōu)選的是 Yl與Y2 二者都是氨基保護(hù)基團(tuán)。更優(yōu)選地，Yl與Y2 二者都是Boc。在根據(jù)本發(fā)明的脫保護(hù)方法中，該酸經(jīng)常是選自HCl、HF、HBr、HI、三氟乙酸、以及 三氟甲磺酸。更優(yōu)選地，該酸是HC1。特別是在此情況下，對(duì)每摩爾肽使優(yōu)選用6到32摩 爾、更優(yōu)選12到24摩爾的酸。根據(jù)本發(fā)明的脫保護(hù)方法的反應(yīng)總體上是在一種有機(jī)溶劑中進(jìn)行，優(yōu)選是在一種 脂肪族的醇、特別是一種仲醇中，更優(yōu)選是在異丙醇中。在根據(jù)本發(fā)明的脫保護(hù)方法中，基本上無水的條件是例如通過在包含從10mg/kg 到1. 5wt%、優(yōu)選從50mg/kg到1襯％的水的一種液體反應(yīng)介質(zhì)中進(jìn)行該反應(yīng)而實(shí)現(xiàn)的。更 優(yōu)選地，該反應(yīng)介質(zhì)的含水量是從100mg/kg到0. 5wt%。尤其在Yl與Y2中的至少一個(gè)是Boc時(shí)，該反應(yīng)有利地在對(duì)于碳陽(yáng)離子、特別是該 叔丁基陽(yáng)離子的一種清除劑(例如苯甲硫醚、以及優(yōu)選地4-(甲硫基)苯酚)的存在下進(jìn) 行。根據(jù)本發(fā)明的脫保護(hù)方法的反應(yīng)總體上是在從0°C到80°C、優(yōu)選從25°C到45°C的 溫度下進(jìn)行的。在根據(jù)本發(fā)明的脫保護(hù)方法中，該Omiganan肽有利地是以其五鹽酸化物鹽的形 式被回收。在根據(jù)本發(fā)明的脫保護(hù)方法中，該前體肽優(yōu)選地是通過根據(jù)本發(fā)明的方法獲得 的。在該脫保護(hù)方法的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，使Boc-IIe-Leu-Arg-Trp-Pr0-Tr p-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys (Boc) -NH2 (SEQ ID NO 1)脫保護(hù)從而產(chǎn)生 5HC1. H-Ile-Leu-A rg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-NH2(SEQ ID NO 1)是在 HCl 與一種仲醇的一 個(gè)混合物中、優(yōu)選在用于叔丁基碳陽(yáng)離子的一種清除劑(例如4-(甲硫基)苯酚)的存在 下進(jìn)行的。最優(yōu)選地是使用HCl與異丙醇的一種混合物。以這種方式所獲得的脫保護(hù)的產(chǎn)物 可以按一種特別經(jīng)濟(jì)有效的方式進(jìn)行純化，并且比其他可能的脫保護(hù)方法(除其他之外包 括用乙酸、三氟乙酸、甲烷磺酸、HF、以及HBr進(jìn)行分裂)更有效。本申請(qǐng)人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，例如與 用三氟乙酸(TFA)(對(duì)于富含色氨酸的肽像Omiganan而言是更多副產(chǎn)物的來源)進(jìn)行的一個(gè)程序相比，一種HCl/異丙醇混合物優(yōu)選在一種用于叔丁基碳陽(yáng)離子的清除劑的存在下 給出了更好的結(jié)果。而且，在此具體情況下，脫保護(hù)優(yōu)選是在一種如上所說明的基本上不含 水的反應(yīng)介質(zhì)中進(jìn)行。而且，在此具體情況下，所述脫保護(hù)反應(yīng)有利地是在從20°C到80°C、 優(yōu)選從25°C到45°C、并且更優(yōu)選從30°C到40°C的溫度下進(jìn)行。在本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方案中，在一種催化劑的存在下進(jìn)行一種氫解作用。優(yōu)選地， 使用一種可以結(jié)合不同載體(例如碳、SiO2, Si-Al化合物等等)采用的Pd催化劑。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法包括形成一種含Arg的肽的四苯基硼 酸鹽。典型地，所述含Arg的肽的四苯基硼酸鹽是通過使一種偶聯(lián)步驟反應(yīng)介質(zhì)與四苯基 硼酸鹽陰離子的一種來源相接觸而形成的，該介質(zhì)包含經(jīng)常通過根據(jù)本發(fā)明的方法的一個(gè) 偶聯(lián)步驟所獲得的一種含Arg的肽。四苯基硼酸鹽類適合作為四苯基硼酸鹽陰離子的來 源。因此，優(yōu)選的是在一種四苯基硼酸鹽(TPB)的存在下進(jìn)行至少一個(gè)步驟，該鹽優(yōu) 選地是在至少一個(gè)偶聯(lián)步驟完成以后加入。在該四苯基硼酸鹽(TPB)的鹽中的陽(yáng)離子可以是有機(jī)的或無機(jī)的。有機(jī)離子的實(shí) 例是四乙基銨、二異丙基乙基銨、N-乙基哌啶鐺、N-甲基嗎啉鐺、N-乙基嗎啉鐺。適當(dāng)?shù)臒o 機(jī)離子是例如鈉(Na+)或鋰(Li+)。最優(yōu)選地，使用一種能夠形成水溶液的四苯基硼酸鹽。 優(yōu)選的是LiTPB與NaTPB。最優(yōu)選使用的四苯基硼酸鹽是NaTPB。該TPB陰離子可以在其苯環(huán)上被取代或者它可以無任何取代而被使用。優(yōu)選地， 該TPB陰離子沒有被取代。適當(dāng)?shù)娜〈腡PB陰離子的實(shí)例包括例如四(3，5_雙三氟甲
苯基)硼酸鹽。所采用的四苯基硼酸鹽的量值可以在寬的界限中變化。優(yōu)選地，在該含Arg的肽 中對(duì)每個(gè)Arg單元采用從1到10當(dāng)量、優(yōu)選1到1. 5當(dāng)量的四苯基硼酸鹽。該四苯基硼酸鹽在本發(fā)明的方法中優(yōu)選是在完成至少一個(gè)偶聯(lián)步驟之后的處理 (work-up)過程中、在一種溶劑或多種溶劑的混合物的存在下采用。適當(dāng)?shù)娜軇┯绕涫羌?醇、甲氧乙醇、二氯甲烷、正丁醇、異丁醇、仲丁醇、以及叔丁醇。使用甲氧乙醇獲得了良好的 結(jié)果。在這個(gè)實(shí)施方案中，可以有利地使所述含Arg的肽的四苯基硼酸鹽不經(jīng)分離而經(jīng) 受至少一個(gè)另外的合成步驟。經(jīng)常地，使所述含Arg的肽的四苯基硼酸鹽經(jīng)受至少一個(gè)脫 保護(hù)步驟接著經(jīng)受一個(gè)偶聯(lián)步驟。在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明是針對(duì)一種用于制造Omiganan肽的方法，該 方法包括以下步驟(a)至(d)(a)使Arg-Lys-NH2或其一種衍生物、特別是使Arg-Lys (Boc) -NH2與N-保護(hù)的 Trp-Arg-OH或其一種衍生物、特別是與Z-Trp-Arg-OH進(jìn)行偶聯(lián)。(b)使 Trp-Arg-Arg-Lys-NH2 (SEQ ID NO 4)或其一種衍生物、特別是使 Trp-Arg-Arg-Lys (Boc) -NH2 (SEQ ID NO 4)與 N-保護(hù)的 Trp-Trp-Pro 或其一種衍生物、特 別是與Z-Trp-Trp-Pro-OH進(jìn)行偶聯(lián)。(c) Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-NH2 (SEQ ID NO 3)或其一種衍生物、特別 是使 Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys (Boc)-NH2 (SEQ ID NO 3)與 N-保護(hù)的 Arg-Trp-Pro 或 其一種衍生物、特別是與Z-Arg-Trp-Pro-ΟΗ進(jìn)行偶聯(lián)。
(d)使 Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-NH2 (SEQ ID NO 2)或其一種 衍生物、特別是使 Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys (Boc)-NH2 (SEQ ID NO 2) 與N-保護(hù)的Ile-Leu或其一種衍生物、特別是與Boc-Ile-Leu-OH進(jìn)行偶聯(lián)。圖1的方案展示了該包括步驟(a)、(b)、(c)、以及(d)的方法的最優(yōu)選的實(shí)施方案。在根據(jù)本發(fā)明的這些方法中所采用的這些操作條件總體上對(duì)于本發(fā)明不是關(guān)鍵 的。因此，進(jìn)行該方法的壓力總體上是為了將該反應(yīng)介質(zhì)維持在一種液態(tài)，有利的是在0. 1 與10巴之間。在大氣壓下已經(jīng)獲得了良好的結(jié)果。進(jìn)行該方法的該溫度通常是在-50°C 與100°C之間、并且可以依賴于一個(gè)具體步驟中的這些反應(yīng)物以及旨在最終制備的化合物 的性質(zhì)而改變。優(yōu)選地，該溫度是大于或等于_45°C，更優(yōu)選地它是大于或等于_25°C。另 一方面，該溫度優(yōu)選是低于或等于60°C，更優(yōu)選地它是大于或等于50°C。在特殊的偶聯(lián)步驟中，可以應(yīng)用優(yōu)選的更受限制的溫度范圍。例如在將Arg-T rp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-NH2(SEQ ID NO 2)或其一種衍生物與受保護(hù)的 Ile-Leu或其一種衍生物進(jìn)行偶聯(lián)的步驟中，優(yōu)選的將該偶聯(lián)反應(yīng)在一個(gè)第一時(shí)間段中在 O0C 士5°C的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行優(yōu)選大約3到5小時(shí)、并且在一個(gè)第二時(shí)間段中在20°C 士5°C 的溫度范圍內(nèi)優(yōu)選進(jìn)行大約6到10小時(shí)。在本發(fā)明的方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用了中間產(chǎn)物Z-Trp-Arg-Arg-Lys (Bo c) -NH2. 2TPB (SEQ ID NO 4)。優(yōu)選地，通過將 Z-Trp-Arg-OH 與 HCl. H-Arg-Lys (Boc) -NH2 進(jìn) 行偶聯(lián)而獲得Z-Trp-Arg-Arg-Lys (Boc)-NH2. 2TPB (SEQ ID NO 4)。優(yōu)選地，該偶聯(lián)步驟是 在HOOBt的存在下進(jìn)行的。在這個(gè)偶聯(lián)步驟中，優(yōu)選將溫度在一個(gè)第一時(shí)間段中在_5°C 士5°C的范圍內(nèi)維持 大約2到5小時(shí)、并且在一個(gè)第二時(shí)間段中在5°C 士 5°C的溫度范圍內(nèi)維持大約6到10小 時(shí)。將Z-Trp-Arg-OH與HCl. H-Arg-Lys (Boc) -NH2進(jìn)行偶聯(lián)之后優(yōu)選跟隨一個(gè)步驟 (還將被稱作處理步驟)，該步驟包括向該偶聯(lián)步驟的反應(yīng)介質(zhì)中加入一種NaTPB鹽，優(yōu)選 是在水溶液中，更優(yōu)選是在Na2CO3的存在下。在本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)偶聯(lián)步驟中，一種肽優(yōu)選地是按0. 8到1. 2摩爾的肽/每 摩爾其他肽、更優(yōu)選0. 9到1. 1、并且最優(yōu)選0. 95到1. 05摩爾的肽/每摩爾其他肽的量值使用。例如，具有一個(gè)活化的羧基以及一般至少兩個(gè)氨基酸單元的第一肽優(yōu)選地是與具 有一個(gè)游離氨基以及至少兩個(gè)氨基酸單元的第二肽進(jìn)行偶聯(lián)，使用0. 8到1. 2、更優(yōu)選0. 9 到1. 1摩爾第一肽/每摩爾第二肽的一個(gè)量值。本發(fā)明的該第一方面的方法具有眾多的優(yōu)點(diǎn)_它是一種具有較少反應(yīng)步驟的非常收斂的路徑。在使用四苯基硼酸鹽(TPB)鹽 類的多個(gè)實(shí)施方案中，在用TPB鹽類進(jìn)行選擇性提取之后有可能使那些鹽沉淀或者不經(jīng)分 離而繼續(xù)進(jìn)行合成。這提供了合成過程中的增大的靈活性。沒有必要用在側(cè)鏈上受保護(hù)的 Arg進(jìn)行操作。-在色氨酸單元的吲哚環(huán)上進(jìn)行合成的過程中不需要保護(hù)。已知色氨酸對(duì)強(qiáng)酸性 介質(zhì)是非常敏感的(這些吲哚核的烷化、有色副產(chǎn)物的形成)。考慮到事實(shí)上這種保護(hù)是昂貴的并且之后是難以消除的，這是一個(gè)重要的優(yōu)點(diǎn)。因此，在一種具體的優(yōu)選實(shí)施方案中， 在此前所披露的這些方法以及片段中，至少一個(gè)色氨基酸單元并且優(yōu)選全部色氨基酸單元 是未被保護(hù)的。-本發(fā)明的方法還允許減少Arg10以及Leu 2上的外消旋作用的量，這允許了更 容易的最終純化。_最后，本發(fā)明的方法允許相當(dāng)平穩(wěn)的條件用于最終的脫保護(hù)，特別是(若適當(dāng) 時(shí))Boc基團(tuán)的消除。-本發(fā)明的方法此外還允許(特別是在使用具有一種C-端Pro的第一肽的某些優(yōu) 選實(shí)施方案中)進(jìn)一步減小外消旋作用的風(fēng)險(xiǎn)，從而允許了一種更加容易的最終純化。具體地說，本發(fā)明的該第一方面的方法允許獲得Omiganan而伴隨有顯著 減小的量的這三種主要副產(chǎn)物，即H-Ile-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-(D) Arg-Arg-Lys-NH2 (SEQ ID NO 1) > H-Ile-(D)Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg -Lys-NH2 (SEQ ID NO 1)(是通過在偶聯(lián)步驟過程中對(duì)該外消旋作用的更好控制)以及H-I Ie-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-OH (SEQ ID NO 1)(是通過避免在一 種強(qiáng)酸性水介質(zhì)中工作)。一個(gè)將根據(jù)本發(fā)明的方法所生產(chǎn)的Omiganan在一個(gè)另外的純化步驟、特別是一 個(gè)單一純化步驟中進(jìn)行純化。本發(fā)明還涉及用于純化該Omiganan肽的一種方法，該方法包括使一種不純的 Omiganan肽經(jīng)受一種液相色譜法、特別是HPLC色譜法，其中流動(dòng)性包括水以及一種有機(jī)溶 劑。在HPLC色譜法技術(shù)之中，反相以及離子交換相色譜法是優(yōu)選的。使用反相獲得了優(yōu)異 的結(jié)果?？梢允褂貌煌姆聪嘀?，特別是基于C4、C8、C18硅石的反相柱。在這個(gè)方法中，該流動(dòng)相優(yōu)選地包括乙腈。在這個(gè)方法中，該流動(dòng)相有利地包括一 種緩沖劑。使用一種乙酸鹽緩沖劑獲得了良好的結(jié)果。包括乙腈與一種乙酸鹽緩沖劑、PH 5的一種體系作為流動(dòng)相是特別優(yōu)選的。根據(jù)本發(fā)明的純化方法經(jīng)常進(jìn)一步包括一個(gè)反離子交換步驟。例如，可以將純化 過的肽進(jìn)行洗滌，優(yōu)選是在一種色譜柱上用一種氯化物鹽水溶液(特別是NaCl水溶液)與 一種有機(jī)溶劑(特別是乙腈)的一個(gè)混合物。若適當(dāng)時(shí)，在離子交換之后可以用乙腈與水 的一種混合物將該純化過的肽從該柱中洗脫，由此可以獲得純化的omiganan的一種濃縮 溶液。根據(jù)本發(fā)明的純化方法還可以包括一個(gè)結(jié)晶步驟。根據(jù)本發(fā)明的純化方法因此可以進(jìn)一步包括一個(gè)濃縮步驟以及任選地一個(gè)冷凍 干燥步驟。實(shí)例以下實(shí)例說明了本發(fā)明的方法，但不應(yīng)被解釋為對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制。若沒有另外 指明，則該化合物的純度是大于按重量計(jì)98 %并且指出的比率是指體積比。1. Z-Arg-Lys (Boc) NH2. TPB 的合成將1. 02 當(dāng)量的 Z-Arg-OH. HCl (Mw = 344. 8)在室溫下加入 DMA 與 CH2Cl2 (6/4)的 一種混合物中。此后，加入1. 03當(dāng)量的HOBt (N-羥基苯并三唑，Mw = 135. 12)以及1. 00 當(dāng)量的H-Lys (Boc)-NH2 (Mw = 245. 3 ；純度99% )。在將該溶液冷卻到O士5°C之后，加入1. 03 當(dāng)量的 EDC. HCl (Mwl91. 7)。在0士5°C下繼續(xù)攪拌另外30分鐘，然后在室溫下攪拌至少2小時(shí)。在通過HPLC 檢驗(yàn)該反應(yīng)的完成以后，將用一種CH2Cl2/異-BuOH(6/4)混合物稀釋該反應(yīng)混合物并且用 0.5當(dāng)量的HCl溶液進(jìn)行萃取。用CH2Cl2/異-BuOH(6/4)的一種混合物第二次萃取該酸 性水相。首先用含有1. 05當(dāng)量的四苯基硼酸鈉(TPBNa) (Mw = 342g)的一種Na2CO3的5% (重量)水溶液洗滌組合的有機(jī)相，然后用一種5% (重量)NaCl水溶液洗滌4次。在已經(jīng)將該有機(jī)相在真空中濃縮以后，將甲氧乙醇以若干個(gè)部分加入該濃縮物中 以除去痕量的異丁醇接著將它進(jìn)一步蒸發(fā)。然后將該濃縮物最后用甲氧乙醇稀釋并且將其 緩慢地加入一種冷的(0到5°C)5% (重量)NaCl水溶液之中。該肽沉淀出并且將其在低 溫下保持至少30分鐘然后過濾。用冷(0士5°C )脫礦質(zhì)水將該固體洗滌3次。其后，使該固體再溶解于MeOH中并 且進(jìn)行攪拌直到獲得一種輕微混濁的溶液為止。將該溶液部分地濃縮并然后將該甲醇溶液 緩慢地加入到一種冷卻的水性NaCl 5% (重量)溶液中。在將該沉淀物在被過濾掉之前 在低溫下保存至少30分鐘。最后用冷的脫礦質(zhì)水(0士5°C )將該固體洗滌3次并且在真 空(45°C)下進(jìn)行干燥。最終獲得一種灰白色的固體?；趯?duì)含量進(jìn)行的NMR測(cè)量，產(chǎn)率是 89%。2. HCl. H-Arg-Lys (Boc) -NH2 的合成使1. 00 當(dāng)量的 TPB. Z-Arg-Lys (Boc) -NH2 (Mw = 535. 6 ；純度=62. 0% )的一種甲 醇溶液若干次穿過一個(gè)柱，該柱含有一種甲醇洗滌過的樹脂IRA 958 (Mw = 1000 ；3. 00當(dāng) 量)。在通過HPLC檢驗(yàn)這種交換以后，將該樹脂過濾并且用甲醇洗滌三次。使這些組合的 有機(jī)相在真空中部分濃縮。將濃縮的溶液用水稀釋。加入Pd催化劑(Mw= 106.4;2%重量)并且然后將該懸浮液在35°C 士5°C下氫 化至少5小時(shí)。將該催化劑過濾掉、用一種甲醇/水混合物洗滌兩次。將該濾液在真空中 蒸發(fā)，該殘余物懸浮在DMA中并且使之在真空中部分蒸發(fā)以清除痕量的水。在檢驗(yàn)水的含 量以后，用HCl (0. 1N)滴定最終溶液并且不經(jīng)任何純化而進(jìn)一步使用。產(chǎn)率(基于滴定)90%。3. Z-Trp-Arg-OH 的合成將2. 00當(dāng)量的水和1當(dāng)量的Arg(Mw = 174. 2)與DMF混合并且在室溫下進(jìn)行攪 拌直到獲得一種溶液為止。將1. 03當(dāng)量的Z-Trp-OSu (Mw = 435. 45 ；純度=98% )溶解在 DMF中并且傾倒在該精氨酸溶液中。然后在室溫下繼續(xù)攪拌至少5小時(shí)。在通過HPLC檢驗(yàn) 該反應(yīng)的終止以后，通過緩慢地加入冷的乙腈(0士5°C )而使該反應(yīng)混合物沉淀并且在過 濾之前在此溫度下保持至少30分鐘。用CH3CN/IPE(異丙醚)(1/1)的一種混合物將該沉 淀物洗滌3次然后用IPE洗滌2次。然后在真空中在45°C下將該固體干燥。最終獲得一種 白色固體。產(chǎn)率(基于NMR含量)86%。4. Z-Trp-Arg-Arg-Lys (Boc) -NH2. 2TPB (SEQ ID NO 4)的合成將1.00 當(dāng)量Z-Trp-Arg-OH(Mw = 494. 5 ；純度=85. 0%)以及 1. 10 當(dāng)量HOOBt (Mw =163. 13)加入 1. 15 當(dāng)量 HCl. H-Arg-Lys (Boc) -NH2 (Mw = 437. 5 ；純度=20. 0% )的 DMA 溶液中，該溶液之前已經(jīng)用012(12稀釋了。將該溶液冷卻到_5°C 士5°C后，緩慢倒入1.00當(dāng)量HCl/二噁烷4N并然后加入1.10當(dāng)量EDC (Mw= 191.7)。將該反應(yīng)混合物在_5 士 5°C 下攪拌至少3小時(shí)并然后在5°C 士5°C下攪拌至少8小時(shí)。在通過HPLC檢驗(yàn)該反應(yīng)的完成 以后，用一種CH2Cl2/仲丁醇混合物(6/4)將該反應(yīng)混合物稀釋，首先用含有HCl (0. 5當(dāng)量) 的NaCl的5% (重量)水溶液洗滌該反應(yīng)混合物、然后用1900ml的含有2. 2當(dāng)量NaTPB (Mw =342)的一種5% (重量)Na2CO3水溶液洗滌，并且最終用5% (重量)的NaCl水溶液洗 滌5次。在該有機(jī)層濃縮以后，將殘余物溶解在甲醇中然后在真空中濃縮以便清除大部分 的剩余CH2Cl2。通過NMR滴定最終溶液并且不經(jīng)任何純化而進(jìn)一步使用。產(chǎn)率(基于滴定含量)83 %。5. 2HC1. H-Trp-Arg-Arg-Lys (Boc) -NH2 (SEQ ID NO 4)的合成使1. 00 當(dāng)量 2TPB. Z-Trp-Arg-Arg-Lys (Boc) -NH2 (Mw = 878. 11)的甲醇溶液若干 次穿過一個(gè)柱，該柱含有6. 00當(dāng)量的一種甲醇洗滌過的樹脂IRA 958 (Mw = 1000)。在通過 HPLC檢驗(yàn)這種交換以后，將該樹脂過濾并且用甲醇洗滌三次。使這些組合的有機(jī)相在真空 中部分地濃縮。用水將該濃縮溶液稀釋并且加入Pd催化劑。然后在35°C 士5°C下將該懸 浮液氫化至少3小時(shí)。將該催化劑過濾掉并且用甲醇洗滌兩次。將該濾液在真空中蒸發(fā)， 該殘余物溶解在DMA中并且將其進(jìn)一步濃縮以消除剩余的水。在檢驗(yàn)水的含量以后，將沉 淀物溶解在DMA中并且在真空中部分地蒸發(fā)以便適配該溶液的重量。用0. INHCl滴定最終 溶液并且不經(jīng)任何純化而進(jìn)一步使用。產(chǎn)率(基于該滴定)95%。6. Z-Trp-Trp-Pro-OH 的合成將DMA、1. 05 當(dāng)量的 DIPEA(Mw = 129. 2)以及 1. 05 當(dāng)量的 H-Trp-Pro-OH(Mw = 301. 3;純度=91.0%)在室溫下混合至少30分鐘直到形成一種溶液為止。然后用乙酸 乙酯稀釋該反應(yīng)混合物并且將其冷卻到5°C 士5°C。一旦達(dá)到這個(gè)溫度，就加入1.00當(dāng)量 的Z-Trp-Osu(Mw = 435. 45 ；純度=98.0% ),并且在將該溶液留置來再次升溫到室溫之 前繼續(xù)攪拌至少30分鐘。在通過HPLC證實(shí)該反應(yīng)的完成以后，加入0.2當(dāng)量的DMAPA(N， N’ -二甲基氨基丙胺，Mw = 102. 2g/mol)。將該反應(yīng)混合物用乙酸乙酯稀釋并且用含有2 當(dāng)量KHSO4的5% (重量)的NaCl水溶液進(jìn)行洗滌。進(jìn)一步地首先用一種5% (重量)的 NaCl水溶液洗滌該有機(jī)相并且最后用水。將該有機(jī)相在真空中部分地濃縮，該殘余物被懸 浮在乙酸乙酯中并將其進(jìn)一步濃縮以便消除剩余的水。將濃縮的肽溶液以多個(gè)小部分加入 MTBE/石油醚(45-55) (1/1)的一種冷的(0士5°C )混合物中，并且將沉淀物在過濾之前在 0士5°C保持至少30分鐘。過濾后，然后將其用石油醚(45-55)洗滌并且在真空中在45°C下 進(jìn)行干燥。最終獲得一種白色固體。產(chǎn)率(基于NMR含量)=82%。7. Z-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys (Boc) -NH2. 2TPB (SEQ ID NO 3)的合成將1. 00 當(dāng)量的 Z-Trp-Trp-Pro-OH(Mw = 621. 7 ；純度=94. 0 % )加入之前用 CH2Cl2 稀釋過的 1. 05 當(dāng)量 2HC1. HTrp-Arg-Arg-Lys (Boc) -NH2 (Mw = 816. 9 ；純度=15. 0% ) 的DMA溶液之中。然后，加入1.20當(dāng)量N，N’ - 二異丙基乙胺(DIPEA) (Mw = 129.2)以 及1.05當(dāng)量的2-(1Η-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3_四甲基脲六氟磷酸酯)(HBTU) (Mw = 379. 24)。將該反應(yīng)混合物在室溫下攪拌至少1小時(shí)。在通過HPLC檢驗(yàn)該反應(yīng)的完成以后， 用一種CH2Cl2/異丁醇混合物(8/2)將該反應(yīng)混合物稀釋、首先用NaCl與HCl (1. 5當(dāng)量)的一種5% (重量)水溶液進(jìn)行洗滌、然后用Na2CO3與2. 2當(dāng)量NaTPB (Mw = 342g/摩爾)的 一種5% (重量)水溶液洗滌、并且最終用5% (重量)的NaCl水溶液洗滌三次。在該有 機(jī)層濃縮以后，將殘留的油在甲氧乙醇中溶解若干次、然后在真空中濃縮以便消除大部分 的剩余異丁醇。在GC控制之后，將該濃縮物通過緩慢倒入冷的(0士5°C)5% (重量)NaCl 水溶液而使它沉淀。在攪拌至少1小時(shí)以后，將該懸浮液過濾并且用冷水洗滌兩次。將該 沉淀物在真空中在45°C下進(jìn)行干燥。最終獲得一種白色固體。產(chǎn)率(基于NMR含量)=98%。8. 2HC1. H-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys (Boc) -NH2 (SEQ ID NO 3)的合成使 1. 00 當(dāng)量 2TPB. Z-TrpTrp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys (Boc) -NH2 (Mw = 1347. 5 ；純 度=64.0% )的一種甲醇溶液若干次穿過一個(gè)柱，該柱含有一種甲醇洗滌過的樹脂IRA 958(或Amberjet Cl 1000 ;6. 00當(dāng)量)。在通過HPLC檢驗(yàn)這種交換以后，將該樹脂過濾、洗 滌三次。使這些組合的有機(jī)相在真空中部分地濃縮、并然后用水稀釋。最后，加入2% (重 量)的Pd催化劑，并且將該懸浮液在40°C下氫化至少3小時(shí)。將該催化劑過濾掉、用甲醇 /水的一種混合物洗滌三次。將組合的濾液在真空中蒸發(fā)、殘余物懸浮在DMA中并且將其進(jìn) 一步濃縮以消除剩余的水。在檢驗(yàn)水的含量以后，用HCl (0. IN)、AgNO3 (0. 1N)、或NMR滴定 該溶液并且不經(jīng)任何純化而進(jìn)一步使用。產(chǎn)率(基于滴定)=82 %。9. Z-Arg-Trp-Pro-OH 的合成將DMA、1. 00 當(dāng)量的 DIPEA 以及 1. 00 當(dāng)量的 H-Trp-Pro-OH (Mw = 301. 3 ；純 度=94. 0% )在室溫下混合至少30分鐘直到獲得一種溶液為止，然后將該溶液冷卻到 10士5° (1號(hào)溶液)。將1. 00當(dāng)量的Z-Arg-OH. HCl (Mw = 344. 8)在室溫下加入DMA中直 到獲得一種澄清溶液為止(2號(hào)溶液)。在將2號(hào)溶液冷卻到_15°C 士5°C期間，加入1. 05 當(dāng)量吡啶(Mw = 79. 1 ；純度=99. 0% )以及1. 00當(dāng)量的DIPEA。一旦達(dá)到這個(gè)溫度，就將 1. 00當(dāng)量的新戊酰氯(PivCl) (Mw = 120. 58)倒入該反應(yīng)混合物(2號(hào)溶液)中，將其進(jìn)一 步活化大約5分鐘。最后，將1號(hào)溶液加入活化的2號(hào)溶液中，并且將該反應(yīng)混合物進(jìn)一步 攪拌至少1小時(shí)同時(shí)停止冷卻，并且允許該反應(yīng)混合物升溫至室溫。在已經(jīng)通過HPLC證實(shí)該反應(yīng)的完成以后，將該肽溶液在真空中進(jìn)行濃縮。用乙腈 和水稀釋殘余物并且用2N K2COJfpH調(diào)節(jié)到8.0士0.2。然后將該溶液在真空中部分地濃 縮并且將殘余物冷卻到5°C 士5°C以進(jìn)行沉淀。在過濾之前維持?jǐn)嚢柚辽?0分鐘、并且然 后用水洗滌沉淀物。最終獲得一種白色固體。產(chǎn)率(基于NMR含量):90 %。10. Z-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys (Boc)-NH2. 3TPB (SEQ ID NO 2)的合成將1. 00 當(dāng)量的 Z-Arg-Trp-Pro-OH(Mw = 591. 65 ；純度=96. 0 % )、1. 00 當(dāng)量的 HCl/二噁燒(4N)以及 1. 05 當(dāng)量HOBt (Mw = 135. 12 ；純度=98. 0% )加入 1. 00 當(dāng)量 2HC1. H-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys (Boc) -NH2 (Mw = 1213. 4 ；純度=85. 0% )在用 CH2Cl2 稀 釋過的DMA中的溶液中。在已經(jīng)將該溶液冷卻到10°C 士5°C以后，加入1. 02當(dāng)量EDC(Mw = 191. 7)。將該反應(yīng)混合物在10°C 士5°C攪拌30分鐘、并且然后在室溫下攪拌至少4小時(shí)。 在通過HPLC證實(shí)該反應(yīng)的完成以后，用一種CH2Cl2/異丁醇混合物(8/3)將該反應(yīng)混合物稀釋、首先用具有HCl (0.5當(dāng)量)的一種5% (重量)NaCl水溶液進(jìn)行洗滌、然后用含有3 當(dāng)量NaTPB(Mw = 342)的一種5% (重量)Na2CO3水溶液洗滌、并且最終用5% (重量)的 NaCl水溶液洗滌兩次。在該有機(jī)層濃縮以后，將殘余的油在甲氧乙醇中溶解若干次、然后在 真空中進(jìn)行濃縮以便消除大部分的異丁醇。在GC控制之后，將該濃縮物通過緩慢地倒入冷 的5% (重量)NaCl水溶液中而使它沉淀。在攪拌至少1小時(shí)以后，將該懸浮液過濾并且用 冷水洗滌兩次。在將該沉淀物40°C 士5°C下進(jìn)行干燥。最終獲得一種灰白色的固體。產(chǎn)率(基于NMR含量)=87%。11. 3HC1. H-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(Boc)-NH2 (SEQ ID NO 2)的合成使 1. 00 當(dāng)量 3TPB. Z-Arg-Trp-Pro-TrpTrp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(Boc)-NH2 (Mw =1787. 1 ；純度=57.0% )的一種甲醇溶液若干次穿過一個(gè)柱，該柱含有一種甲醇洗滌過 的樹脂IRA 958 (Mw = 1000,9. 00當(dāng)量)。在已經(jīng)通過HPLC檢驗(yàn)這種交換以后，將該樹脂過 濾并且用甲醇洗滌三次。使這些組合的有機(jī)相在真空中部分地濃縮。然后用水將該濃縮的 溶液稀釋并且加入Pd催化劑。然后將該懸浮液在35°C 士5°C下氫化至少6小時(shí)。將該催 化劑過濾掉、用一種甲醇/水混合物洗滌三次。將該組合的濾液在真空中蒸發(fā)，殘余物懸浮 在DMA中并且將其進(jìn)一步濃縮以消除剩余的水。在檢驗(yàn)該水的含量以后，用HCl (0.1N)或 NMR滴定該溶液并且不經(jīng)任何純化而進(jìn)一步使用。產(chǎn)率(基于NMR含量測(cè)量)93%。12. Boc-Ile-Leu-OH 的合成根據(jù)兩個(gè)路徑進(jìn)行Boc-I Ie-Leu-OH 二肽的合成-經(jīng)由Boc-Ile-OH的活化的酯OSu(路徑A)-通過使用Boc-Ile-OH的UNCA(尿烷N-保護(hù)的羧酸酐)(路徑B)路徑A =Boc-Ile-OSu的合成(對(duì)比)在攪拌下，將1.00 當(dāng)量的 Boc-Ile-OH. l/2H20(Mw = 240. 3)以及 1.05 當(dāng)量的 Suc-OH(Mw = 115)加入乙酸乙酯中。將該溶液冷卻到O士5°C并且然后將稀釋在乙酸乙酯 中的1. 10當(dāng)量DCC(Mw = 206. 3)倒入該溶液中。將該懸浮液在0°C下攪拌至少30分鐘、 并且在室溫下攪拌至少5小時(shí)。在已經(jīng)通過加入2. 42g乙酸(0. 20當(dāng)量)使該反應(yīng)混合物 猝滅以后，將D⑶過濾并且用乙酸乙酯洗滌兩次。用以下物質(zhì)洗滌這些有機(jī)層含0. 5當(dāng)量 KHSO4的5% (重量)NaCl水溶液、5% (重量)NaCl水溶液；含0. 5當(dāng)量Na2CO3的5% (重 量)NaCl水溶液、并且最后是5% (重量)NaCl水溶液。將該溶劑在真空下進(jìn)行濃縮。在乙 酸乙酯中吸收該濃縮溶液兩次、并且進(jìn)一步在真空中蒸發(fā)以便消除剩余的水。用環(huán)己烷或 庚烷稀釋該濃縮的有機(jī)層。將該沉淀的懸浮液在室溫下攪拌至少30分鐘、過濾并最終在真 空下(45°C)干燥。干燥過的沉淀物產(chǎn)出了 89% (基于NMR含量)的Boc-Ile-Osu，為白色 固體。路徑A =Boc-Ile-Leu-OH 的合成將1. 01 當(dāng)量的 H-Leu-OH(Mw = 131. 2)在大約 50°C下首先用 2. 10 當(dāng)量 TMA (Mw = 145.12)甲硅烷基化直到獲得一種澄清溶液為止。將該溶液冷卻到室溫，并且用乙酸異丙 酯進(jìn)行稀釋。然后將1. 00當(dāng)量的Boc-Ile-OSu固體(Mw = 328. 26 ； 100. 0% )加入甲硅烷 基化的H-Leu-OH溶液中。將該反應(yīng)混合物在室溫下進(jìn)一步攪拌至少8小時(shí)。在通過HPLC證實(shí)該反應(yīng)的完成以后，通過加入DMAPA和水使該溶液猝滅、用以下物質(zhì)進(jìn)行洗滌500ml 5% (重量)NaCl水溶液中的KHSO4(1.00當(dāng)量)；500ml 5% (重量)NaCl水溶液、以及水。 在將該乙酸異丙酯在真空中蒸發(fā)以后，通過用乙酸異丙酯進(jìn)行共沸蒸餾而去除過量的水。 在濃縮過程中該肽沉淀出。然后將該濃縮的懸浮液稀釋在環(huán)己烷中。將沉淀物在室溫下攪 拌至少10分鐘、過濾并最終在真空中在45°C下進(jìn)行干燥。干燥過的沉淀物產(chǎn)出了(基于 NMR含量)80%的Boc-I le-Leu-OH，為白色固體。路徑B =Boc-Ile-Leu-OH 的合成將1. 00 當(dāng)量的 Boc-IIe-NCA (Mw = 257. 3)加入 1. 10 當(dāng)量 H-Leu-OH (Mw = 131. 2) 在DMSO中的懸浮液中。然后將該懸浮液在60°C 士5°C下加熱至少2小時(shí)。在通過HPLC檢 驗(yàn)轉(zhuǎn)化率以后，用乙酸異丙酯稀釋該反應(yīng)混合物、用以下物質(zhì)進(jìn)行洗滌在5% (重量)NaCl 水溶液中的KHSO4 (Mw= 136 ； 1.00當(dāng)量)、5% (重量)NaCl水溶液、以及水。在將乙酸異丙酯 在真空中蒸發(fā)以后，通過用乙酸異丙酯進(jìn)行共沸蒸餾而消除過量的水。在濃縮過程中該肽 沉淀出。然后將該濃縮的懸浮液在環(huán)己烷中稀釋。將該沉淀物在室溫下攪拌至少10分鐘、 過濾并最終在真空中在45 °C下進(jìn)行干燥。干燥的沉淀物產(chǎn)出了 89%的Boc-Ile-Leu-OH，為 白色固體(基于NMR含量)。13. 3HC1. Boc-11e-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(Boc)-NH2 ( SEQ ID NO 1)的合成將1· 05 當(dāng)量的 Boc-Ile-Leu-OH (Mw = 344. 4)以及 1. 10 當(dāng)量的 HOOBt (Mw = 163. 13)加入 1. 00 當(dāng)量 3HC1. H-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys (Boc) -NH2 (M W= 1652. 9 ；純度=89. 0%)在DMA與CH2Cl2中的一種冷的(O 士 5°C)溶液中。然后將1.20 當(dāng)量的EDC(N-(3-二甲基氨基丙基)-N-乙基碳二亞胺；Mw= 191. 7 ；純度=100.0% )加 入該反應(yīng)混合物，將它在O士5°C下進(jìn)一步攪拌大約4小時(shí)、然后在室溫下攪拌至少8小時(shí)。 在已經(jīng)通過HPLC檢驗(yàn)該反應(yīng)的完成以后，用一種CH2Cl2/異丁醇混合物(8/2)將該反應(yīng)混 合物稀釋、并且用一種5% (重量)NaCl的水溶液+HCl (0. 3當(dāng)量)進(jìn)行洗滌。在該有機(jī)層 濃縮以后，將殘余的油通過緩慢地倒入冷的(O士5°C)乙腈中而使它沉淀。在O士5°C下攪拌 至少30分鐘以后，將該懸浮液過濾并且用冷的MTBE洗滌兩次。將該沉淀物在40°C 士5°C 下進(jìn)行干燥。最終獲得一種灰白色的固體。產(chǎn)率(基于NMR含量)=88%。14. 5HC1. H-Ile-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-NH2 (SEQ ID NO 1)的合成將 1. 00 當(dāng)量的 Boc-Ile-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys (Boc) -NH2 (SEQ ID NO 1) (Mw = 1980 ；純度=89. 0% )緩慢地加入相對(duì)于該肽含有24當(dāng)量HCl 以及6當(dāng)量4-(甲硫基)苯酚(Mw =124. 2)的異丙醇中。在完成加入以后，用異丙醇稀釋 該反應(yīng)混合物。將該反應(yīng)混合物在35°C 士5°C下攪拌至少2小時(shí)。在通過HPLC檢驗(yàn)該反 應(yīng)的完成以后，將該反應(yīng)混合物緩慢倒入冷的異丙醚中。將該沉淀物在O士5°C下攪拌至少 15分鐘、然后過濾、用異丙醚洗滌三次、并且最后在真空下干燥從而獲得5HC1. H-Ile-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-LyS-NH2 (SEQ ID NO 1)。15. 5HC1. H-Ile-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-NH2 (SEQ ID NO 1)的純化
將實(shí)例14中所獲得的產(chǎn)物溶解在一種乙酸鹽緩沖劑中并且在0. 5 μ m膜上過濾。 使用以下參數(shù)通過HPLC將生成的溶液進(jìn)行純化-柱2·0*25cm(ID*L)-固定相C18硅石；ΙΟμπι-ΙΟΟΑ-流動(dòng)相=A=乙酸鹽緩沖劑，ρΗ 5. 0 (0. 15Μ)B=乙月青-流速19mL/min-波長(zhǎng)254nm-梯度(min； % B) (0 ；10) (5 ； 10) (6 ； 18) (36 ；33) (36. 1 ；60) (43 ；60) (43. 1 ； 10) (52 ； 10)所獲得的Omiganan肽(SEQ ID NO 1)具有超過98%的純度。將所生成的高純度部分用水稀釋并且使用以下流動(dòng)相將同一個(gè)柱用來將乙酸根 離子轉(zhuǎn)化為Cl—離子-水/乙腈95/5v/v，用于該柱的平衡-0. 5M NaCl/MeCN 95/5v/v，用于離子交換-水/MeCN60/40v/v，用于洗脫然后將生成的產(chǎn)物進(jìn)行濃縮并且冷凍干燥。
權(quán)利要求
1.一禾中用于制造具有序列 H-Ile-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-NH2(SEQ ID NO 1)的Omiganan肽或其衍生物的方法，該方法包括在溶液中將第一肽與第二 肽偶聯(lián)的至少一個(gè)步驟，該第一肽具有活化的羧基以及至少兩個(gè)氨基酸單元、或選自以下 的氨基酸具有活化羧基的lie、Leu、Arg以及Trp、Pro ；該第二肽具有游離氨基以及至少 兩個(gè)氨基酸單元，其中該第一肽與第二肽不同，并且它們包含選自以下的氨基酸Ile、Leu、 Arg>Trp>Pro 以及 Lys,其順序如 Omiganan 中序列 11 e-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Tr p-Arg-Arg-Lys (SEQ ID NO 1)所指定的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1 所述的方法，包括將 Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-NH2(SEQ ID NO 2)或其衍生物與Ile-Leu偶聯(lián)的步驟，其中Ile的氨基受到氨基保護(hù)基團(tuán) 的保護(hù)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，包括將Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-NH2(SEQ ID NO 3)或其衍生物與Arg-Trp-Pr0偶聯(lián)的步驟，其中Arg的氨基受到保護(hù)基團(tuán)的保護(hù)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的方法，包括將Trp-Arg-Arg-Lys-NH2(SEQ ID NO4)或其衍生物與Trp-Trp-Pro偶聯(lián)的步驟，其中該N端Trp的氨基受到保護(hù)基團(tuán)的保護(hù)。
5.根據(jù)權(quán)利要求2至4中任一項(xiàng)所述的方法，其中該保護(hù)基團(tuán)選自叔丁氧羰基(Boc) 基團(tuán)以及芐氧基羰基( 基團(tuán)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中Arg或Trp的氨基受到芐氧基羰基(Z)基團(tuán)的保護(hù)。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中Lys中的側(cè)鏈氨基和/或Ile中的N端氨基受到 叔丁氧羰基(Boc)的保護(hù)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的方法，其包括形成含Arg的肽的四苯基硼酸鹽。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述含Arg的肽的四苯基硼酸鹽是通過使偶聯(lián)步 驟反應(yīng)介質(zhì)與四苯基硼酸鹽陰離子的來源相接觸而形成的，該反應(yīng)介質(zhì)包含由權(quán)利要求1 至7中任一項(xiàng)所述的偶聯(lián)步驟所獲得的含Arg的肽。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述四苯基硼酸鹽陰離子的來源包括四苯基硼 酸鈉。
11.根據(jù)權(quán)利要求8至10中任一項(xiàng)所述的方法，其中使所述含Arg的肽的四苯基硼酸 鹽不經(jīng)分離而經(jīng)歷至少一個(gè)另外的合成步驟。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中使所述含Arg的肽的四苯基硼酸鹽至少經(jīng)歷脫 保護(hù)步驟然后是偶聯(lián)步驟。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的方法，其中該第二肽具有選自以下的式 NH2-Trp-Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 4), NH2-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO5)>NH2-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(X)-R (SEQ ID NO 6)> NH2-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-L ys (X)-R(SEQ ID NO 7), NH2-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 8)、NH2 -Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 9)、NH2-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp -Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 10) >NH2-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Ar g-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 11)，其中X是用于該Lys側(cè)鏈氨基的任選的保護(hù)基團(tuán)，并且R 是用于Lys的羧基的羧基保護(hù)基團(tuán)，優(yōu)選是酰胺基。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中該第二肽包含0.至的其⑶Arg-Arg-Lys (X) -R 類似物。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中該第二肽包含0.2wt%至0.9wt%的⑶ Arg-Arg-Lys (X) -R 類似物。
16.根據(jù)權(quán)利要求1到12中任一項(xiàng)所述的方法，其中該第二肽是NH2-Arg-Lys⑴-R，其 中X是用于該Lys側(cè)鏈氨基的任選的保護(hù)基團(tuán)，并且R是用于Lys的羧基的羧基保護(hù)基團(tuán)， 優(yōu)選是酰胺基團(tuán)，并且該第一肽選自Y-Trp-Arg、Y-Pro-Trp-Arg, Y-Trp-Pro-Trp-Arg (SEQ ID NO 12)^Y-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg(SEQ ID NO 13)>Y-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg(SEQ ID N014) > Y-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg(SEQ ID NO 15) > Y-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-T rp-Arg(SEQ ID NO 16) > Y-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg(SEQ ID NO 17)、Y-Il e-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg(SEQ ID NO ⑶，其中 Y 是氨基保護(hù)基團(tuán)，優(yōu)選 Z基團(tuán)。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中該偶聯(lián)是在芳基環(huán)化的氧代三嗪活化劑、優(yōu)選 HOOBt的存在下進(jìn)行的。
18.根據(jù)權(quán)利要求16或17所述的方法，其中該偶聯(lián)在-10°C到+10°C的溫度下進(jìn)行。
19.根據(jù)權(quán)利要求16至18中任一項(xiàng)所述的方法，其中該偶聯(lián)在鹵化溶劑與非鹵化溶劑 的混合物、優(yōu)選氯化溶劑與酰胺型溶劑的混合物中進(jìn)行。
20.根據(jù)權(quán)利要求16至19中任一項(xiàng)所述的方法，其中使Z-Trp-Arg-OH與HCl. H-Arg-Lys (Boc) -NH2偶聯(lián)，該活化劑是HOOBt，該溶劑是DMA與亞甲基氯的混合物，并且該 偶聯(lián)在第一個(gè)時(shí)間段中在_5°C 士5°C的溫度下進(jìn)行3到5小時(shí)，并且在第二時(shí)間段中在 +50C 士5°C的溫度下進(jìn)行6到10小時(shí)。
21.根據(jù)權(quán)利要求13至15中任一項(xiàng)所述的方法，其中該第二肽是通過權(quán)利要求16至 20中任一項(xiàng)所述的方法獲得的。
22.根據(jù)權(quán)利要求1至21中任一項(xiàng)所述的方法，該方法依照?qǐng)D1的方案。
23.一種用于制造具有序列 H-Ile-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys -NH2 (SEQ ID NO 1)的Omiganan肽的脫保護(hù)方法，該方法包括在基本上無水的條件下使式 Y I-Ile-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys (Y2) -NH2 (SEQ ID NO 1)的前體 肽與酸進(jìn)行反應(yīng)，其中Yl與Y2指相同或不同的氨基保護(hù)基團(tuán)或H，并且Yl或Y2中的至少 一個(gè)是對(duì)酸敏感的氨基保護(hù)基團(tuán)。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中Yl和Y2是Boc。
25.根據(jù)權(quán)利要求23或24所述的方法，其中該酸選自HC1、HF、三氟乙酸、以及三氟甲磺酸。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中該酸是HC1，并且其中針對(duì)每摩爾的肽優(yōu)選使用 6到32摩爾、更優(yōu)選12到M摩爾的HCl。
27.根據(jù)權(quán)利要求23至沈中任一項(xiàng)所述的方法，其中該反應(yīng)在有機(jī)溶劑中、優(yōu)選在脂 肪醇中、更優(yōu)選在異丙醇中進(jìn)行。
28.根據(jù)權(quán)利要求23至27中任一項(xiàng)所述的方法，其中基本上無水的條件是通過在含有 10mg/kg到1. 5wt%、優(yōu)選50mg/kg到Iwt%的水的液體反應(yīng)介質(zhì)中進(jìn)行該反應(yīng)而實(shí)現(xiàn)的。
29.根據(jù)權(quán)利要求23至觀中任一項(xiàng)所述的方法，其中該反應(yīng)是在碳陽(yáng)離子清除劑、特 別是叔丁基陽(yáng)離子清除劑的存在下進(jìn)行的。
30.根據(jù)權(quán)利要求23至四中任一項(xiàng)所述的方法，其中該反應(yīng)是在0°C到80°C、優(yōu)選 30°C到45°C的溫度下進(jìn)行的。
31.根據(jù)權(quán)利要求23至30中任一項(xiàng)所述的方法，其中該Omiganan肽是以其五鹽酸鹽 的形式被回收的。
32.根據(jù)權(quán)利要求23至31中任一項(xiàng)所述的方法，其中該前體肽是由權(quán)利要求1至22 中任一項(xiàng)所述的方法獲得的。
33.一種用于純化Omiganan肽的方法，其包括使不純的Omiganan肽經(jīng)歷反向液相色譜 法，其中流動(dòng)相包含水以及有機(jī)溶劑。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中該流動(dòng)相包含乙腈。
35.根據(jù)權(quán)利要求33或34所述的方法，其中該流動(dòng)相包含乙酸鹽緩沖劑。
36.根據(jù)權(quán)利要求33至35中任一項(xiàng)所述的方法，還包括反離子交換步驟。
37.根據(jù)權(quán)利要求33至36中任一項(xiàng)所述的方法，還包括濃縮和冷凍干燥步驟。
38.根據(jù)權(quán)利要求33至37中任一項(xiàng)所述的方法，其中該omiganan肽是由權(quán)利要求1 至32中任一項(xiàng)所述的方法獲得的。
39.Trp-Trp-Pro-OH0
40.Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-NH2 (SEQ ID NO 2)。
41.Arg-Trp-Pro-OH0
42.Trp-Arg-Arg-Lys-NH2 (SEQ ID NO 4)。
43.Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-NH2(SEQ ID NO 6)。
44.根據(jù)權(quán)利要求40至43中任一項(xiàng)所述的化合物，其中該N端氨基受到保護(hù)基團(tuán)、優(yōu) 選Z基團(tuán)的保護(hù)。
45.根據(jù)權(quán)利要求40以及42至44中任一項(xiàng)所述的化合物，其中Lys的側(cè)鏈氨基受到 保護(hù)基團(tuán)、優(yōu)選Boc基團(tuán)的保護(hù)。
46.根據(jù)權(quán)利要求40至44中任一項(xiàng)所述的化合物的四苯基硼酸鹽。
47.包括在圖1中的含Arg的肽中的任何一種的四苯基硼酸鹽。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于在溶液相中制造Omiganan肽的一種方法。本發(fā)明還涉及在用于制造Omiganan的方法中新穎的中間產(chǎn)物并且涉及用于制造這些中間產(chǎn)物的方法。
文檔編號(hào)C07K7/08GK102124021SQ200880130757
公開日2011年7月13日 申請(qǐng)日期2008年6月17日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月17日
發(fā)明者喬治斯·布隆迪爾, 洛朗·讓尼, 羅蘭·卡倫斯 申請(qǐng)人:索爾維公司