漆酶在蛋白凝膠脫色中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及漆酶在蛋白凝膠脫色中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]漆酶(laccase，EC 1.10.3.2)是一種含銅的多酚氧化酶，廣泛存在于高等植物、真菌和昆蟲(chóng)中，其中白腐真菌被認(rèn)為是目前最高效的漆酶生產(chǎn)者。漆酶是一種綠色環(huán)保酶，漆酶通過(guò)氧化反應(yīng)，使底物失去電子形成自由基，而失去的電子又傳遞給分子氧形成水。漆酶的底物范圍很廣，可以催化多種芳香族化合物的氧化，但是漆酶對(duì)不同染料的作用效果不同，取決于漆酶的性質(zhì)和染料的結(jié)構(gòu)。小分子漆酶介體，如ABTS (2，2-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)、HBT (l-hydroxybenzotriazole)、丁香酉簽(syringaldehyde, SYD)、乙酰丁香酮(acetosyringone, ACE)和丁香酸(syringic acid,SYA)等可以拓寬漆酶的底物范圍或提高催化速度。漆酶的低底物特異性使其在廢水處理、紙漿漂白、生物能源、食品加工、生物修復(fù)等領(lǐng)域中有著廣泛而重要的應(yīng)用前景。
[0003]蛋白質(zhì)的聚丙稀酰胺凝電泳(polyacrylamide gel electrophoresis)是當(dāng)代實(shí)驗(yàn)室蛋白質(zhì)分析和檢測(cè)最常用技術(shù)之一。電泳結(jié)束后將凝膠浸泡在染料中，隨后通過(guò)溶劑洗去多余染料(“脫色”)，使蛋白條帶直接顯示。常采用考馬斯亮藍(lán)(Coomassie BrilliantBlue, CBB)R-250或G-250進(jìn)行染色。常用的染色液和脫色液中含有甲醇、冰醋酸等有機(jī)溶劑。要獲得較好的脫色效果，需要較長(zhǎng)脫色時(shí)間(過(guò)夜)，并更換多次脫色液，會(huì)產(chǎn)生大量的(有機(jī))染料廢液，若直接排放會(huì)造成污染。到目前為止，漆酶對(duì)染料廢水脫色的研宄局限于水溶液環(huán)境。本發(fā)明嘗試將漆酶用于蛋白凝膠(固體)的脫色，使蛋白條帶在清晰背景上顯示，便于觀察。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明提供了一種漆酶在蛋白凝膠脫色中的應(yīng)用，利用漆酶進(jìn)行染色蛋白凝膠的脫色，環(huán)保、快速、簡(jiǎn)便，不需要有機(jī)溶劑，節(jié)約能源，降低染料廢水的污染。
[0005]本發(fā)明的漆酶在蛋白凝膠脫色中的應(yīng)用，將漆酶應(yīng)用于蛋白凝膠電泳中常規(guī)染色后的脫色，并在脫色的同時(shí)實(shí)現(xiàn)染料的降解。
[0006]漆酶的應(yīng)用方式包括漆酶或漆酶/介體系統(tǒng)。
[0007]所述蛋白凝膠電泳包括，但不局限于十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE) ο
[0008]所述蛋白染料包括，但不局限于考馬斯亮藍(lán)R250和G250。
[0009]所述漆酶包括，但不局限于真菌、細(xì)菌來(lái)源漆酶。
[0010]所述介體包括，但不局限于ABTS、HBT、ACE、SYA、SYD。
[0011]本發(fā)明的技術(shù)方案詳述如下:
本發(fā)明涉及高產(chǎn)漆酶的白腐真菌齒毛菌(Cferrma sp.) HYBO7菌株(參考文獻(xiàn):YangJj Lin Qj Ng T B，Ye X，Lin J.Purificat1n and characterizat1n of a novellaccase from Cerrena sp.HYBO7 with dye decolorizing ability.PLoS ONE, 2014，9: ell0834)o
[0012]本發(fā)明涉及利用齒毛菌HYB07菌株發(fā)酵生產(chǎn)漆酶。
[0013]本發(fā)明還涉及利用齒毛菌HYB07菌株的發(fā)酵液對(duì)蛋白凝膠進(jìn)行脫色。將發(fā)酵液稀釋后直接用于蛋白凝膠的脫色，在不使用有機(jī)溶劑、不更換脫色液、較低溫度的條件下獲得滿意的脫色效果，并在脫色同時(shí)實(shí)現(xiàn)染料降解。
[0014]本發(fā)明的脫色條件為:在溫度25 0C -45 °C、漆酶酶活12 -18 U/mL、介體濃度IμΜ-3 μ Μ、脫色時(shí)間 I h-2 h。
[0015]更優(yōu)選的脫色條件為:在溫度40 °C、漆酶酶活15 U/mL、介體濃度2 μΜ、脫色時(shí)間2 h0
[0016]本發(fā)明利用漆酶進(jìn)行蛋白凝膠脫色，脫色快速(2小時(shí)可獲得低背景的清晰蛋白條帶)，操作簡(jiǎn)便(不需要沸騰或更換脫色液)且環(huán)保(不使用傳統(tǒng)脫色液所需的有機(jī)溶劑如甲醇、乙酸，在脫色的同時(shí)實(shí)現(xiàn)染料降解，無(wú)廢液處理問(wèn)題及費(fèi)用)。通過(guò)優(yōu)化漆酶濃度、介體種類(lèi)和濃度、脫色時(shí)間等因素，在較短時(shí)間內(nèi)獲得了良好的脫色效果，操作簡(jiǎn)便且綠色環(huán)保。
【附圖說(shuō)明】
[0017]圖1為漆酶對(duì)不同種類(lèi)染料脫色效果的影響。從1~12依次是:考馬斯亮藍(lán)R250、甲基橙、甲基紅、堿性品紅、溴百里香酚藍(lán)、中性紅、結(jié)晶紫、酸性品紅、剛果紅、溴甲酚綠、亞甲基藍(lán)、玫瑰紅B)。
[0018]圖2為考馬斯亮藍(lán)R250經(jīng)漆酶脫色處理前后的UV-visible全波長(zhǎng)掃描。
[0019]圖3為不同介體對(duì)蛋白凝膠脫色效果的影響。從1~5依次是:ACE (20 μM),SYA(20 μΜ)、ΗΒΤ (20 μ Μ), ABTS (2 μ Μ), SYD (20 μΜ)。
[0020]圖4為漆酶/ABTS系統(tǒng)中不同溫度對(duì)蛋白凝膠脫色效果的影響。從1~6依次是:20 °C、25 °C、30 °C、35 °C、40°C、45°C。
[0021]圖5為漆酶/ABTS系統(tǒng)中漆酶酶活對(duì)蛋白凝膠脫色效果的影響。從1~6依次是:酶濃度 3 U/mL、6 U/mL、9 U/mL,12 U/mL,15 U/mL,18 U/mL。
[0022]圖6為介體ABTS濃度對(duì)蛋白凝膠脫色效果的影響。從1~6依次是:ABTS濃度0.5μΜ、1 μΜ、1.5 μΜ、2 μΜ、3 μΜ、4 μΜ。
[0023]圖7為漆酶/ABTS系統(tǒng)中漆酶脫色時(shí)間對(duì)蛋白凝膠脫色效果的影響。從1~4依次是:0.5 h、l h、l.5 h、2 h。
[0024]圖8為漆酶/ABTS脫色系統(tǒng)的檢測(cè)靈敏性。從1~9依次是:1000 ng、500 ng、250ng、100 ng、80 ng、60 ng、40 ng、20 ng、10 ng。
[0025]圖9為漆酶/ABTS脫色系統(tǒng)與不同脫色體系試驗(yàn)對(duì)比。從1~5依次是:檸檬酸-Na2HPOjf 沖液(pH 7.0),40 °C、漆酶酶活 15 U/mL,ABTS 2 μ M、脫色 2h ;dH20、溫度 40°C、漆酶酶活15 U/mL、ABTS 2 μM、脫色2h ;Dong et al.(2011)中描述的試驗(yàn)方案(蛋白凝膠染色后置于dH20中煮沸30~60s，更換dH20后再次煮沸，并重復(fù)多次);在dH20、40 V條件下脫色2 h ;在檸檬酸-Na2HPO4緩沖液(pH 7.0),40 °C條件下脫色2 h。
[0026]圖10為漆酶/ABTS對(duì)大腸桿菌裂解液總蛋白電泳的脫色。1，蛋白marker ;2，IPTG 誘導(dǎo)前BL21大腸桿菌裂解液總蛋白；3，IPTG誘導(dǎo)后BL21大腸桿菌裂解液總蛋白。
【具體實(shí)施方式】
[0027]以下根據(jù)具體的實(shí)施例充分說(shuō)明本發(fā)明，但是本發(fā)明不僅限于此。
[0028]1.菌株
菌株來(lái)源于白腐真菌齒毛菌(HYB07菌株(參考文獻(xiàn):Yang J, LinQj Ng T B， Ye X， Lin J.Purificat1n and characterizat1n of a novel laccasefrom Cerrena sp.HYB07 with dye decolorizing ability.PLoS ONE, 2014，9:ell0834)o大腸桿菌BL21購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。
[0029]2.試劑
蛋白marker購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，ABTS購(gòu)自Sigma-Aldrich公司，考馬斯亮藍(lán)R250購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司，BSA購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。
[0030]3.培養(yǎng)基
種子培養(yǎng)基:PDA液體培養(yǎng)基。
[0031]液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基(g/L):麥芽糊精60，蛋白胨15，酒石酸銨2，KH2PO4 6，MgS04.7Η204.14，CaCl2 0.3，NaCl 0.18，CuSO4.5Η20 0.0625，ZnSO4.7Η20 0.018，and vitamin BI
0.015ο
[0032]4.本發(fā)明中所用到的生物