相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用

本申請(qǐng)主張2009年10月16日提交的臨時(shí)申請(qǐng)第61/279279號(hào)和2010年4月9日提交的臨時(shí)申請(qǐng)第61/322722號(hào)的權(quán)益，兩者均以引用方式全部并入本文。

關(guān)于序列表的聲明

與本申請(qǐng)相關(guān)聯(lián)的序列表以文本格式代替紙印本提供，并且在此以引用方式并入本說(shuō)明書(shū)。包含該序列表的文本文件的名稱(chēng)為35668_Seq_Final.txt。該文本文件為109KB；創(chuàng)建于2010年10月15日；并且正隨著本說(shuō)明書(shū)的提交經(jīng)由EFS-Web提交。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及免疫領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及MBL相關(guān)的絲氨酸蛋白酶抑制劑在治療或預(yù)防補(bǔ)體介導(dǎo)的凝血障礙中的用途。

背景技術(shù)：

補(bǔ)體系統(tǒng)為啟動(dòng)并增強(qiáng)對(duì)微生物感染和其它急性損傷的炎癥反應(yīng)提供了早期的作用機(jī)制(M.K.Liszewski和J.P.Atkinson，1993，載于Fundamental Immunology，第三版，W.E.Paul編輯，Raven Press，Ltd.，New York)。盡管補(bǔ)體活化提供了重要的針對(duì)潛在病原體的第一線防御，但是促進(jìn)保護(hù)性炎癥反應(yīng)的補(bǔ)體活性也可以表現(xiàn)出對(duì)宿主的潛在威脅(K.R.Kalli等，Springer Semin.Immunopathol.15:417-431,1994；B.P.Morgan,Eur.J.Clinical Investig.24:219-228,1994)。例如，C3和C5蛋白水解產(chǎn)物募集并活化嗜中性粒細(xì)胞。這些活化細(xì)胞不加選擇地釋放破壞性酶，可能造成器官損傷。此外，補(bǔ)體活化可能導(dǎo)致溶胞的補(bǔ)體成分沉積在附近的宿主細(xì)胞以及微生物靶上，導(dǎo)致宿主細(xì)胞裂解。

已經(jīng)表明補(bǔ)體系統(tǒng)促成許多急性和慢性疾病狀況的發(fā)病機(jī)制，所述疾病包括：心肌梗塞、中風(fēng)之后的血管重建、ARDS、再灌注損傷、敗血癥性休克、熱燒傷之后的毛細(xì)血管滲漏、心肺分流術(shù)后炎癥、移植排斥、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、重癥肌無(wú)力和阿爾茨海默病。在幾乎所有的這些疾病中，補(bǔ)體都不是病因，而是發(fā)病機(jī)制所涉及的若干因素之一。盡管如此，補(bǔ)體活化可能是重要的病理機(jī)制，并在許多這類(lèi)疾病狀況的臨床控制中表現(xiàn)出有效之處。對(duì)各種疾病狀況中補(bǔ)體介導(dǎo)的組織損傷的重要性的增加的認(rèn)識(shí)增強(qiáng)了對(duì)有效補(bǔ)體抑制藥物的需求。還沒(méi)有藥物獲準(zhǔn)用于特異性靶向并抑制補(bǔ)體活化的人體用途。

目前，普遍認(rèn)為補(bǔ)體系統(tǒng)可通過(guò)三種截然不同的途徑被活化：經(jīng)典途徑、凝集素途徑和替代途徑。經(jīng)典途徑通常是由抗體與外源顆粒(即抗原)相結(jié)合而觸發(fā)的，因此需要預(yù)先暴露于該抗原來(lái)產(chǎn)生特異性抗體。因?yàn)榻?jīng)典途徑的活化與免疫應(yīng)答的發(fā)生有關(guān)，所以經(jīng)典途徑是獲得性免疫系統(tǒng)的一部分。相反，凝集素途徑和替代途徑兩者不依賴(lài)于克隆性免疫(clonal immunity)，是先天性免疫系統(tǒng)的一部分。

經(jīng)典途徑活化的第一步是特異性識(shí)別分子C1q與結(jié)合了抗原的IgG和IgM結(jié)合。補(bǔ)體系統(tǒng)的活化導(dǎo)致了絲氨酸蛋白酶酶原的序貫活化。C1q與C1r和C1s絲氨酸蛋白酶酶原結(jié)合成稱(chēng)為C1的復(fù)合物，當(dāng)C1q與免疫復(fù)合物結(jié)合時(shí)，C1r的Arg-Ile位點(diǎn)進(jìn)行自我蛋白酶解，接著是C1r激活C1s，從而獲得裂解C4和C2的能力。C4裂解成兩個(gè)片段，稱(chēng)為C4a和C4b，這使得C4b片段能夠與鄰近的羥基或氨基形成共價(jià)鍵，隨后與活化C2的C2b片段進(jìn)行非共價(jià)相互作用而產(chǎn)生C3轉(zhuǎn)化酶(C4b2b)。C3轉(zhuǎn)化酶(C4b2b)激活C3，導(dǎo)致C5轉(zhuǎn)化酶(C4b2b3b)的產(chǎn)生以及能夠引起微生物裂解的膜攻擊復(fù)合物(C5b-9)的形成。C3和C4的活化形式(C3b和C4b)共價(jià)沉積在外源靶表面上，其被多種吞噬細(xì)胞上的補(bǔ)體受體所識(shí)別。

獨(dú)立地，補(bǔ)體系統(tǒng)通過(guò)凝集素途徑活化的第一步也是特異性識(shí)別分子的結(jié)合，接著是所結(jié)合的絲氨酸蛋白酶的活化。然而，凝集素途徑中的識(shí)別分子是糖結(jié)合蛋白(甘露聚糖結(jié)合凝集素(MBL)、H-纖維膠凝蛋白(H-ficolin)、M-纖維膠凝蛋白和L-纖維膠凝蛋白)，而不是通過(guò)C1q來(lái)結(jié)合免疫復(fù)合物(J.Lu等，Biochim.Biophys.Acta1572:387-400，2002；Holmskov等，Annu.Rev.Immunol.21:547-578(2003)；Teh等，Immunology 101:225-232(2000))。Ikeda等人首先證明，與C1q類(lèi)似，MBL在與酵母甘露聚糖包被的紅細(xì)胞結(jié)合時(shí)能夠以依賴(lài)C4的方式使補(bǔ)體系統(tǒng)活化(K.Ikeda等，J.Biol.Chem.262:7451-7454，1987)。MBL是膠原凝集素蛋白家族的成員，是鈣依賴(lài)性凝集素，與具有定位于吡喃糖環(huán)赤道面上的3-羥基和4-羥基的糖類(lèi)結(jié)合。因此MBL的重要配體是D-甘露糖和N-乙酰-D-葡糖胺，而不符合這種空間要求的糖類(lèi)則對(duì)MBL沒(méi)有可檢出的親和性(Weis,W.I.等，Nature 360:127-134，1992)。MBL和單價(jià)糖之間的相互作用是相當(dāng)微弱的，解離常數(shù)通常在2mM的范圍內(nèi)。MBL通過(guò)同時(shí)與多個(gè)單糖殘基相互作用來(lái)達(dá)到對(duì)聚糖配體特異性地緊密結(jié)合(Lee,R.T.等，Archiv.Biochem.Biophys.299:129-136，1992)。MBL識(shí)別通常修飾微生物如細(xì)菌、酵母、寄生蟲(chóng)和某些病毒的糖模式。相反，MBL不識(shí)別D-半乳糖和唾液酸，即倒數(shù)第二位的糖和倒數(shù)第一位的糖，它們一般修飾哺乳動(dòng)物血漿和細(xì)胞表面糖蛋白上存在的“成熟”糖綴合物。一般認(rèn)為這種結(jié)合特異性有助于保護(hù)免于自身活化。然而，MBL確實(shí)以高親和力結(jié)合高甘露糖“前體”聚糖簇，這些簇位于被隔離在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體內(nèi)的N-連接的糖蛋白和糖脂上(Maynard,Y.等，J.Biol.Chem.257:3788-3794，1982)。因此，受損細(xì)胞是通過(guò)MBL結(jié)合的凝集素途徑活化的潛在目標(biāo)。

纖維膠凝蛋白(ficolin)具有不同類(lèi)型的不是MBL的凝集素結(jié)構(gòu)域，稱(chēng)為血纖蛋白原樣結(jié)構(gòu)域。纖維膠凝蛋白以不依賴(lài)Ca⁺⁺的方式來(lái)結(jié)合糖殘基。在人體中，已經(jīng)鑒定出纖維膠凝蛋白的三種類(lèi)型，即L-纖維膠凝蛋白、M-纖維膠凝蛋白和H-纖維膠凝蛋白。L-纖維膠凝蛋白和H-纖維膠凝蛋白這兩種血清纖維膠凝蛋白共同對(duì)N-乙酰-D-葡糖胺具有特異性；然而，H-纖維膠凝蛋白還結(jié)合N-乙酰-D-半乳糖胺。L-纖維膠凝蛋白、H-纖維膠凝蛋白和MBL的糖特異性的差異意味著不同的凝集素可能是互補(bǔ)的，盡管有重疊，但是可能靶向不同的糖綴合物。這個(gè)觀點(diǎn)得到了最新報(bào)道的支持，即在凝集素途徑的已知凝集素中，只有L-纖維膠凝蛋白與脂磷壁酸特異性結(jié)合，脂磷壁酸是一種存在于所有革蘭氏陽(yáng)性菌上的細(xì)胞壁糖綴合物(Lynch，N.J.等，J.Immunol.172:1198-1202，2004)。膠原凝集素(即MBL)和纖維膠凝蛋白在氨基酸序列上沒(méi)有顯著的相似性。然而，兩組蛋白質(zhì)具有類(lèi)似的結(jié)構(gòu)域組構(gòu)，與C1q類(lèi)似，裝配成寡聚結(jié)構(gòu)，這樣就使得多位點(diǎn)結(jié)合的可能性最大化。MBL的血清濃度在健康人群中是高度可變的，這在遺傳上是由MBL基因的啟動(dòng)子和編碼區(qū)二者的多態(tài)性/突變所控制的。作為急性期蛋白，MBL的表達(dá)在炎癥期間進(jìn)一步上調(diào)。L-纖維膠凝蛋白在血清中存在的濃度與MBL類(lèi)似。因此，凝集素途徑的L-纖維膠凝蛋白分途徑在力量上可能與MBL分途徑不相上下。MBL和纖維膠凝蛋白也可能作為調(diào)理素起作用，這需要這些蛋白質(zhì)與吞噬細(xì)胞受體相互作用(Kuhlman，M.等，J.Exp.Med.169:1733，1989；Matsushita，M.等，J.Biol.Chem.271:2448-54，1996)。然而，吞噬細(xì)胞上受體的身份還未得到確定。

人MBL通過(guò)其膠原樣結(jié)構(gòu)域與獨(dú)特的C1r/C1s樣絲氨酸蛋白酶形成特異性、高親和性的相互作用，稱(chēng)為MBL相關(guān)的絲氨酸蛋白酶(MBL-associated serine proteases，MASP)。迄今為止已經(jīng)描述了三種MASP。首先，鑒定出單一的酶“MASP”，其特征是負(fù)責(zé)啟動(dòng)補(bǔ)體級(jí)聯(lián)(即切割C2和C4)的酶(Ji,Y.H.等，J.Immunol.150:571-578，1993)。隨后，發(fā)現(xiàn)MASP實(shí)際上是兩種蛋白酶MASP-1和MASP-2的混合物(Thiel,S.等，Nature 386:506-510，1997)。然而，有研究表明僅MBL-MASP-2復(fù)合物就足以使補(bǔ)體活化(Vorup-Jensen,T.等，J.Immunol.165:2093-2100，2000)。此外，只有MASP-2快速切割C2和C4(Ambrus,G.等，J.Immunol.170:1374-1382，2003)。因此，MASP-2是負(fù)責(zé)激活C4和C2以產(chǎn)生C3轉(zhuǎn)化酶C4b2b的蛋白酶。這是不同于C1復(fù)合物的顯著差異，C1復(fù)合物中兩種特異性絲氨酸蛋白酶(C1r和C1s)協(xié)同作用導(dǎo)致了補(bǔ)體系統(tǒng)的活化。最近，已經(jīng)分離出第三種新的蛋白酶MASP-3(Dahl,M.R.等，Immunity 15:127-35，2001)。MASP-1和MASP-3是同一基因的可變剪接產(chǎn)物。MASP-1和MASP-3的生物學(xué)功能仍有待闡明。

MASP與C1復(fù)合物的酶成分C1r和C1s共享相同的結(jié)構(gòu)域組構(gòu)(Sim,R.B.等，Biochem.Soc.Trans.28:545，2000)。這些結(jié)構(gòu)域包括N末端C1r/C1s/海膽Vegf/骨形成蛋白(CUB)結(jié)構(gòu)域、表皮生長(zhǎng)因子樣結(jié)構(gòu)域、第二CUB結(jié)構(gòu)域、串聯(lián)的補(bǔ)體調(diào)控蛋白結(jié)構(gòu)域和絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域。與在C1蛋白酶中一樣，MASP-2的活化通過(guò)絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域附近的Arg-Ile鍵裂解而產(chǎn)生，這將酶分成二硫鍵連接的A鏈和B鏈，后者由絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。最近，描述了MASP-2的遺傳上決定的缺陷(Stengaard-Pedersen,K.等，New Eng.J.Med.349:554-560，2003)。單個(gè)核苷酸的突變導(dǎo)致CUB 1結(jié)構(gòu)域的Asp-Gly交換，并使得MASP-2不能與MBL結(jié)合。

MBL還與稱(chēng)為19kDa MBL相關(guān)蛋白(MAp19)(Stover,C.M.，J.Immunol.162:3481-90，1999)或者小MBL相關(guān)蛋白(sMAP)(Takahashi，M.等，Int.Immunol.11:859-863，1999)的非酶蛋白締合。MAp19通過(guò)MASP 2基因產(chǎn)物的可變剪接而產(chǎn)生，包括MASP-2的頭兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，其后接著是4個(gè)獨(dú)特氨基酸的額外序列。MASP 1和MASP 2基因分別位于3號(hào)染色體和1號(hào)染色體上(Schwaeble，W.等，Immunobiology 205:455-466，2002)。

若干證據(jù)表明存在不同的MBL-MASP復(fù)合物，且血清中的總MASP的大部分不與MBL結(jié)合(Thiel，S.等，J.Immunol.165:878-887，2000)。H-纖維膠凝蛋白和L-纖維膠凝蛋白都與MASP結(jié)合，并且激活凝集素補(bǔ)體途徑，同MBL一樣(Dahl,M.R.等，Immunity15:127-35，2001；Matsushita,M.等，J.Immunol.168:3502-3506，2002)。凝集素途徑和經(jīng)典途徑都形成共同的C3轉(zhuǎn)化酶(C4b2b)，這兩條途徑在這一步會(huì)合。

普遍認(rèn)為凝集素途徑在宿主抵抗感染的防御中具有重要作用。MBL參與宿主防御的強(qiáng)有力證據(jù)來(lái)自于對(duì)功能性MBL血清水平降低的患者的分析(Kilpatrick，D.C.，Biochim.Biophys.Acta 1572:401-413，2002)。這些患者表現(xiàn)出復(fù)發(fā)性細(xì)菌和真菌感染的易感性。這些癥狀通常在生命早期在易損表觀窗期間是明顯的，因?yàn)閺哪阁w獲得的抗體效價(jià)降低，但處于全部抗體應(yīng)答發(fā)展之前。這種癥狀經(jīng)常是由于MBL膠原部分的數(shù)個(gè)位點(diǎn)突變引起的，其妨礙了MBL寡聚體的正確形成。然而，由于MBL可以作為不依賴(lài)于補(bǔ)體的調(diào)理素起作用，所以還不知道對(duì)感染的易感性增加在多大程度上是由于受損的補(bǔ)體活化所致。

盡管大量證據(jù)表明在非感染性人類(lèi)疾病的發(fā)病機(jī)制中，經(jīng)典補(bǔ)體途徑和替代補(bǔ)體途徑兩者都存在，但是對(duì)凝集素途徑作用的評(píng)價(jià)才剛剛開(kāi)始。最新研究提供的證據(jù)表明，凝集素途徑的活化可能是造成缺血/再灌注損傷中補(bǔ)體活化和相關(guān)炎癥的原因。Collard等人(2000)報(bào)告受到氧化應(yīng)激的培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合MBL，且在暴露于人血清時(shí)顯示出C3沉積(Collard,C.D.等，Am.J.Pathol.156:1549-1556，2000)。此外，用封閉性抗MBL單克隆抗體處理人血清抑制了MBL結(jié)合和補(bǔ)體活化。將這些發(fā)現(xiàn)擴(kuò)展到心肌缺血-再灌注大鼠模型上，其中比起用對(duì)照抗體處理的大鼠，用針對(duì)大鼠MBL的封閉性抗體處理的大鼠在冠狀動(dòng)脈閉塞時(shí)顯示心肌損傷顯著較輕(Jordan,J.E.等，Circulation 104:1413-1418，2001)。尚不清楚氧化應(yīng)激后MBL與血管內(nèi)皮結(jié)合的分子機(jī)制；最近的研究表明，氧化應(yīng)激后凝集素途徑的活化可能是由MBL與血管內(nèi)皮細(xì)胞角蛋白結(jié)合而介導(dǎo)的，而不是與糖綴合物結(jié)合(Collard,C.D.等，Am.J.Pathol.159:1045-1054，2001)。其它研究已顯示出缺血/再灌注損傷發(fā)病機(jī)制中的經(jīng)典途徑和替代途徑以及凝集素途徑在這種疾病中的作用仍然存在爭(zhēng)議(Riedermann,N.C.等，Am.J.Pathol.162:363-367，2003)。

與經(jīng)典途徑和凝集素途徑相反，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)替代途徑中完成識(shí)別功能的起始因子(initiator)，而在其它兩種途徑中是C1q和凝集素來(lái)完成識(shí)別功能的。目前普遍接受的是，替代途徑是由外來(lái)表面或其它異常表面(細(xì)菌、酵母、病毒感染細(xì)胞或者受損組織)自發(fā)觸發(fā)的。有四種血漿蛋白直接參與了替代途徑：C3、B因子、D因子和備解素。對(duì)于替代途徑，需要由天然C3蛋白水解形成的C3b發(fā)揮作用。由于替代途徑C3轉(zhuǎn)化酶(C3bBb)含有C3b作為必需亞基，關(guān)于通過(guò)替代途徑的第一個(gè)C3b來(lái)源的問(wèn)題代表了令人困擾的問(wèn)題，且促使了相當(dāng)多的研究工作。

C3屬于含有極少的被稱(chēng)為硫酯鍵的翻譯后修飾的蛋白質(zhì)家族(還有C4和α-2巨球蛋白)。硫酯基團(tuán)由谷氨酰胺的末端羰基與三個(gè)氨基酸距離的半胱氨酸的巰基相結(jié)合所形成。該鍵不穩(wěn)定，且谷氨酰胺的親電子羰基可與其它分子通過(guò)羥基或氨基形成共價(jià)鍵。當(dāng)被隔離在完整C3的疏水口袋內(nèi)部時(shí)，硫酯鍵是相當(dāng)穩(wěn)定的。然而，C3被蛋白酶切割成C3a和C3b，導(dǎo)致C3b上高反應(yīng)性的硫酯鍵暴露出來(lái)，通過(guò)該機(jī)制C3b與靶共價(jià)結(jié)合。除了有大量文件證明C3b與補(bǔ)體靶共價(jià)結(jié)合的作用外，還有研究認(rèn)為C3硫酯具有觸發(fā)替代途徑的關(guān)鍵作用。根據(jù)普遍接受的“慢轉(zhuǎn)理論(tick-over theory)”，替代途徑是由液相轉(zhuǎn)化酶iC3Bb的形成所啟動(dòng)的，iC3Bb是由C3與水解硫酯(iC3；C3(H₂O))和B因子形成的(Lachmann，P.J.等，Springer Semin.Immunopathol.7:143-162，1984)。C3b樣iC3由天然C3經(jīng)蛋白質(zhì)中內(nèi)部硫酯的緩慢自發(fā)水解而產(chǎn)生(Pangburn,M.K.等，J.Exp.Med.154:856-867，1981)。通過(guò)iC3Bb轉(zhuǎn)化酶的活性，C3b分子沉積在靶表面，從而啟動(dòng)替代途徑。

對(duì)替代途徑活化的起始因子的了解甚少。認(rèn)為激活因子包括酵母細(xì)胞壁(酵母聚糖)、許多純的多糖、兔紅細(xì)胞、某些免疫球蛋白、病毒、真菌、細(xì)菌、動(dòng)物腫瘤細(xì)胞、寄生蟲(chóng)和受損細(xì)胞。這些激活因子所共有的唯一特征是糖類(lèi)的存在，但是糖類(lèi)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和多樣性使得難以確定共享的分子決定子，這是公認(rèn)的。

對(duì)于凝集素/經(jīng)典途徑C3轉(zhuǎn)化酶(C4b2b)，替代途徑也可以提供強(qiáng)大的放大環(huán)路(amplification loop)，因?yàn)樗a(chǎn)生的任何C3b都能與B因子一起參與形成額外的替代途徑C3轉(zhuǎn)化酶(C3bBb)。替代途徑C3轉(zhuǎn)化酶通過(guò)備解素的結(jié)合而穩(wěn)定。備解素延長(zhǎng)了替代途徑C3轉(zhuǎn)化酶的半衰期6-10倍。向C3轉(zhuǎn)化酶中添加C3b導(dǎo)致替代途徑C5轉(zhuǎn)化酶的形成。

一直以來(lái)認(rèn)為所有三種途徑(即經(jīng)典、凝集素和替代途徑)會(huì)合于C5，它被裂解形成具有多種促炎作用的產(chǎn)物。會(huì)合后的途徑被稱(chēng)為末端補(bǔ)體途徑。C5a是最有效的過(guò)敏毒素，引起平滑肌和血管緊張度以及血管通透性的改變。它也是嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞兩者的強(qiáng)有力的趨化因子和激活因子。C5a介導(dǎo)的細(xì)胞活化能夠通過(guò)誘導(dǎo)釋放多種另外的炎癥介質(zhì)來(lái)顯著放大炎癥反應(yīng)，另外的炎癥介質(zhì)包括細(xì)胞因子、水解酶、花生四烯酸代謝物和活性氧類(lèi)別。C5裂解導(dǎo)致了C5b-9的形成，它也被稱(chēng)為膜攻擊復(fù)合物(MAC)。目前強(qiáng)有力的證據(jù)表明，亞裂解的MAC沉積除了起裂解成孔復(fù)合物的作用外，還可能還在炎癥中發(fā)揮重要作用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

提供本概述，從而以簡(jiǎn)化形式引入概念的選擇，其在以下發(fā)明詳述中進(jìn)一步描述。本概述既不欲鑒定請(qǐng)求保護(hù)的主題的關(guān)鍵特征，也不欲用于協(xié)助確定請(qǐng)求保護(hù)的主題的范圍。

一方面，本發(fā)明提供抑制有生命的受試者中MASP-2依賴(lài)性補(bǔ)體活化的不利作用的方法。該方法包括將有效抑制MASP-2依賴(lài)性補(bǔ)體活化的量的MASP-2抑制劑給予有需要的受試者的步驟。在本上下文中，短語(yǔ)“MASP-2依賴(lài)性補(bǔ)體活化”是指通過(guò)凝集素依賴(lài)性MASP-2系統(tǒng)而發(fā)生的替代途徑補(bǔ)體活化。在本發(fā)明的另一方面，MASP-2抑制劑通過(guò)凝集素依賴(lài)性MASP-2系統(tǒng)抑制補(bǔ)體活化，但基本上不抑制通過(guò)經(jīng)典或C1q依賴(lài)性系統(tǒng)的補(bǔ)體活化，從而C1q依賴(lài)性系統(tǒng)仍然具有功能。

在本發(fā)明這些方面的一些實(shí)施方案中，MASP-2抑制劑是抗MASP-2抗體或其片段。在其它實(shí)施方案中，抗MASP-2抗體具有降低的效應(yīng)子功能。在一些實(shí)施方案中，MASP-2抑制劑是MASP-2抑制肽或非肽MASP-2抑制劑。

另一方面，本發(fā)明提供用于抑制MASP-2依賴(lài)性補(bǔ)體活化的不利作用的組合物，該組合物包含治療有效量的MASP-2抑制劑和藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明還提供制備用于抑制有需要的有生命的受試者中MASP-2依賴(lài)性補(bǔ)體活化的不利作用的藥物的方法，其包括藥物載體中的治療有效量的MASP-2抑制劑。本發(fā)明還提供制備用于抑制MASP-2依賴(lài)性補(bǔ)體活化以治療下文所述病癥、疾病和障礙中每一種的藥物的方法。

本發(fā)明的方法、組合物和藥物用于在患有如本文將進(jìn)一步描述的急性或慢性病理病癥或損傷的哺乳動(dòng)物受試者、包括人中體內(nèi)抑制MASP-2依賴(lài)性補(bǔ)體活化的不利作用。這些疾病和損傷包括但不限于與自身免疫性疾病和/或炎性疾病相關(guān)的MASP-2介導(dǎo)的補(bǔ)體活化。

在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供用于抑制受試者中MASP-2依賴(lài)性補(bǔ)體活化的方法，所述受試者患有凝血障礙如補(bǔ)體介導(dǎo)的凝血障礙或凝血病、或處于發(fā)生凝血障礙如補(bǔ)體介導(dǎo)的凝血障礙或凝血病的風(fēng)險(xiǎn)中，所述方法通過(guò)向該受試者給予藥物載體中的治療有效量的MASP-2抑制劑來(lái)實(shí)施。接受根據(jù)本發(fā)明的治療的病癥包括(借助于非限制性實(shí)例)彌散性血管內(nèi)凝血("DIC")，也被稱(chēng)作消耗性凝血病。

在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供用于抑制受試者中MASP-2依賴(lài)性補(bǔ)體活化的方法，所述受試者患有凝血障礙或處于發(fā)生凝血障礙的風(fēng)險(xiǎn)中，所述方法包括：給予該受試者有效抑制MASP-2依賴(lài)性補(bǔ)體活化的量的MASP-2抑制劑。

在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供用于抑制受試者中MASP-2依賴(lài)性補(bǔ)體活化的方法，所述受試者患有凝血障礙或處于發(fā)生凝血障礙的風(fēng)險(xiǎn)中，所述方法包括：給予該受試者有效選擇性抑制MASP-2依賴(lài)性補(bǔ)體活化而基本上不抑制C1q依賴(lài)性補(bǔ)體活化的量的MASP-2抑制劑。

在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供制備用于抑制患有補(bǔ)體介導(dǎo)的凝血障礙的有生命的受試者中MASP-2依賴(lài)性補(bǔ)體活化的作用的藥物的方法，所述方法包括：將治療有效量的MASP-2抑制劑組合在藥物載體中。

在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供用于在有需要的受試者中治療彌散性血管內(nèi)凝血、預(yù)防彌散性血管內(nèi)凝血或降低彌散性血管內(nèi)凝血的嚴(yán)重程度的方法，所述方法包括：給予該受試者包含有效抑制MASP-2依賴(lài)性補(bǔ)體活化的量的MASP-2抑制劑的組合物。

附圖說(shuō)明

通過(guò)參考下面的詳細(xì)描述連同附圖，本發(fā)明前述的方面以及許多附帶的優(yōu)點(diǎn)將更容易領(lǐng)會(huì)，同樣也更好理解，其中：

圖1是圖解替代補(bǔ)體途徑的補(bǔ)體活化需要凝集素途徑依賴(lài)的MASP-2活化這一新發(fā)現(xiàn)的流程圖；

圖2是圖解人MASP-2基因組結(jié)構(gòu)的圖；

圖3A是圖解人MASP-2蛋白的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)的示意圖；

圖3B是圖解人MAp19蛋白的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)的示意圖；

圖4是圖解鼠MASP-2敲除策略的圖；

圖5是圖解人MASP-2微基因構(gòu)建體的圖；

圖6A提供了證明MASP-2缺乏導(dǎo)致凝集素途徑介導(dǎo)的C4活化喪失的結(jié)果，如通過(guò)甘露聚糖上C4b沉積缺乏所測(cè)定的；

圖6B提供了證明MASP-2缺乏導(dǎo)致凝集素途徑介導(dǎo)的C4活化喪失的結(jié)果，如通過(guò)酵母聚糖上C4b沉積缺乏所測(cè)定的；

圖6C提供了證明獲自MASP-2+/-、MASP-2-/-和野生型品系的血清樣品的相對(duì)C4活化水平的結(jié)果，如通過(guò)甘露聚糖和酵母聚糖上的C4b沉積所測(cè)定的；

圖7A提供了證明MASP-2缺乏導(dǎo)致凝集素途徑介導(dǎo)的以及替代途徑介導(dǎo)的C3活化喪失的結(jié)果，如通過(guò)甘露聚糖上C3b沉積缺乏所測(cè)定的；

圖7B提供了證明MASP-2缺乏導(dǎo)致凝集素途徑介導(dǎo)的以及替代途徑介導(dǎo)的C3活化喪失的結(jié)果，如通過(guò)酵母聚糖上C3b沉積缺乏所測(cè)定的；

圖8提供了證明加入鼠重組MASP-2到MASP-2-/-血清樣品中以蛋白濃度依賴(lài)的方式恢復(fù)了凝集素途徑介導(dǎo)的C4活化的結(jié)果，如通過(guò)甘露聚糖上的C4b沉積所測(cè)定的；

圖9提供了證明MASP-2-/-品系中經(jīng)典途徑有功能的結(jié)果；

圖10提供了證明MASP-2依賴(lài)的補(bǔ)體活化系統(tǒng)在腹主動(dòng)脈瘤修復(fù)之后在缺血/再灌注階段中活化的結(jié)果；

圖11A提供了證明抗MASP-2Fab2抗體#11抑制C3轉(zhuǎn)化酶形成的結(jié)果，如實(shí)施例24所述；

圖11B提供了證明抗MASP-2Fab2抗體#11與天然大鼠MASP-2結(jié)合的結(jié)果，如實(shí)施例24所述；

圖11C提供了證明抗MASP-2Fab2抗體#41抑制C4裂解的結(jié)果，如實(shí)施例24所述；

圖12提供了證明經(jīng)測(cè)試抑制C3轉(zhuǎn)化酶形成的所有抗MASP-2Fab2抗體還被發(fā)現(xiàn)抑制C4裂解的結(jié)果，如實(shí)施例24所述；

圖13是表示從用于抗MASP-2封閉性Fab2抗體表位作圖的大鼠MASP-2衍生的重組多肽的示意圖，如實(shí)施例25所述；

圖14提供了證明抗MASP-2Fab2#40和#60與大鼠MASP-2多肽結(jié)合的結(jié)果，如實(shí)施例25所述；

圖15提供了證明腎缺血/再灌注損傷模型中再灌注后24小時(shí)和48小時(shí)野生型(+/+)和MASP-2(-/-)小鼠的血尿素氮清除率的結(jié)果，如實(shí)施例26所述；

圖16A提供了證明冠狀動(dòng)脈閉塞和再灌注模型中損傷后野生型(+/+)的梗塞大小及MASP-2(-/-)小鼠中梗塞大小減小的結(jié)果，如實(shí)施例27所述；

圖16B提供了顯示冠狀動(dòng)脈閉塞和再灌注模型中各受試動(dòng)物的分布的結(jié)果，如實(shí)施例27所述；

圖17A提供了顯示從野生型(+/+)和MASP-2(-/-)小鼠中分離的RPE-脈絡(luò)膜復(fù)合體中的基線VEGF蛋白水平的結(jié)果，如實(shí)施例28所述；

圖17B提供了顯示黃斑變性模型中激光誘發(fā)的損傷之后第三天野生型(+/+)和MASP-2(-/-)小鼠的RPE-脈絡(luò)膜復(fù)合體中VEGF蛋白水平的結(jié)果，如實(shí)施例28所述；

圖18提供了顯示野生型(+/+)和MASP-2(-/-)小鼠中激光誘發(fā)損傷后第七天平均脈絡(luò)膜新血管形成(CNV)體積的結(jié)果，如實(shí)施例28所述；

圖19提供了顯示野生型(+/+)和MASP-2(-/-)小鼠在Col2mAb誘發(fā)類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎后隨時(shí)間變化的平均臨床關(guān)節(jié)炎評(píng)分的結(jié)果，如實(shí)施例29所述；

圖20A是顯示sMAP(Map 19)基因定向破壞的示意圖，如實(shí)施例30所述；

圖20B提供了從得自雄性sMAP(-/-)嵌合小鼠與雌性C57Bl/6小鼠交配的子代分離的基因組DNA的DNA印跡分析，如實(shí)施例30所述；

圖20C提供了野生型(+/+)和sMAP(-/-)小鼠的PCR基因型分型分析，如實(shí)施例30所述；

圖21A提供了sMAP(-/-)小鼠中sMAP和MASP-2mRNA的RNA印跡分析，如實(shí)施例30所述；

圖21B提供了野生型(+/+)和sMAP(-/-)小鼠中編碼MASP-2H鏈、MASP-2L鏈和sMAP的cDNA的定量RT-PCR分析，如實(shí)施例30所述；

圖22A提供了sMAP(-/-)即MAp 19(-/-)的免疫印跡，證實(shí)小鼠血清中缺乏MASP-2和sMAP，如實(shí)施例30所述；

圖22B提供了證明在MBL-MASP-sMAP復(fù)合物中檢出MASP-2和sMAP的結(jié)果，如實(shí)施例30所述；

圖23A提供了顯示野生型(+/+)和sMAP(-/-)小鼠血清中C4沉積在甘露聚糖包被的孔中的結(jié)果，如實(shí)施例30所述；

圖23B提供了顯示野生型(+/+)和sMAP(-/-)小鼠血清中C3沉積在甘露聚糖包被的孔中的結(jié)果，如實(shí)施例30所述；

圖24A提供了顯示sMAP(-/-)血清中的MBL-MASP-sMAP復(fù)合物的重構(gòu)的結(jié)果，如實(shí)施例30所述；

圖24B-D提供了顯示rsMAP和MASP-2i競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合MBL的結(jié)果，如實(shí)施例30所述；

圖25A-B提供了顯示通過(guò)加入rMASP-2而不是rsMAP使C4沉積活性恢復(fù)的結(jié)果，如實(shí)施例30所述；

圖26A-B提供了顯示通過(guò)加入rsMAP來(lái)降低C4沉積活性的結(jié)果，如實(shí)施例30所述；

圖27A-C提供了顯示MASP-2是造成C3的C4旁路活化的原因的結(jié)果，如實(shí)施例31所述；

圖28A和圖28B提供了在正常大鼠血清中給予MASP-2Fab2抗體之后C4b沉積的抑制(圖28A)和凝血酶活化的抑制的劑量響應(yīng)曲線，如實(shí)施例32中所述；

圖29A和圖29B提供了在彌散性血管內(nèi)凝血的局部Schwartzman反應(yīng)模型中，與未處理的野生型小鼠和其中補(bǔ)體途徑被放血?jiǎng)┭坨R蛇毒因子(cobra venom factor，CVF)和終末途徑抑制劑(C5aR拮抗劑)抑制的野生型小鼠中的血小板凝集(圖29A)相比，MASP-2(-/-)小鼠中測(cè)定的血小板凝集(表示為凝集面積)(圖29B)，如實(shí)施例33中所述；

圖30A-30C圖示在特異于經(jīng)典或凝集素途徑激活路線的試驗(yàn)中，C4-/-血漿中的C3周轉(zhuǎn)的研究結(jié)果；

圖31A將平均危險(xiǎn)區(qū)(area-at-risk，AAR)和梗塞體積(INF)圖示為在經(jīng)歷冠狀動(dòng)脈左前降支閉塞和再灌注之后WT(+/+)和MASP-2(-/-)小鼠中的總心肌體積的百分比，如實(shí)施例34中所述；

圖31B將梗塞體積(INF)與平均危險(xiǎn)區(qū)(AAR)之間的關(guān)聯(lián)圖示為在經(jīng)歷動(dòng)脈閉塞和再灌注之后WT(+/+)和MASP-2(-/-)小鼠中的左心室心肌體積的百分比，如實(shí)施例34中所述；

圖31C圖示根據(jù)Langendorff分離-灌注小鼠心臟模型制備的WT(+/+)和MASP-2(-/-)小鼠的緩沖液灌注心臟中的梗塞體積(INF)，其中全心缺血和再灌注在無(wú)血清的情況下進(jìn)行，如實(shí)施例34中所述；

圖31D圖示根據(jù)Langendorff分離-灌注小鼠心臟模型制備的WT(+/+)和MASP-2(-/-)小鼠的緩沖液灌注心臟中的梗塞體積(INF)與風(fēng)險(xiǎn)區(qū)帶之間的關(guān)聯(lián)，如實(shí)施例34中所述；

圖32圖示在WT(+/+)供體腎的WT(+/+)(B6)或MASP-2(-/-)移植受體小鼠中測(cè)定的血尿素氮(BUN)水平，如實(shí)施例35中所述；

圖33將WT(+/+)和MASP-2(-/-)小鼠的存活者百分比圖示為盲腸結(jié)扎和穿刺(CLP)模型中微生物感染后的天數(shù)的函數(shù)，如實(shí)施例36中所述；

圖34圖示盲腸結(jié)扎和穿刺(CLP)模型中微生物感染后在WT(+/+)和MASP-2(-/-)中測(cè)定的細(xì)菌數(shù)，如實(shí)施例36中所述；

圖35為Kaplan-Mayer曲線，該曲線圖示在用綠膿假單胞菌的鼻內(nèi)給藥激發(fā)后6天WT(+/+)、MASP-2(-/-)和C3(-/-)小鼠的存活百分比，如實(shí)施例37中所述；

圖36圖示在WT小鼠內(nèi)小鼠抗MASP-2單克隆抗體的0.3mg/kg或1.0mg/kg皮下給藥之后，在不同時(shí)間點(diǎn)取樣的樣品中C4b沉積的水平，測(cè)定為對(duì)照的％，如實(shí)施例38中所述；

圖37圖示在WT小鼠內(nèi)小鼠抗MASP-2單克隆抗體的0.6mg/kg腹膜內(nèi)給藥之后，在不同時(shí)間點(diǎn)取樣的樣品中C4b沉積的水平，測(cè)定為對(duì)照的％，如實(shí)施例38中所述；

圖38圖示在用0.3mg/kg或1.0mg/kg小鼠抗MASP-2單克隆抗體的單次腹膜內(nèi)注射預(yù)處理的WT(+/+)小鼠中激光誘發(fā)損傷后第7天的平均脈絡(luò)膜新生血管形成(CNV)體積，如實(shí)施例39中所述；

圖39A圖示在用5×10⁸/100μl腦膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)感染后MASP-2(-/-)和WT(+/+)小鼠的存活百分比，如實(shí)施例40中所述；

圖39B圖示采自用5×10⁸cfu/100μl腦膜炎奈瑟氏菌感染的MASP-2KO(-/-)和WT(+/+)小鼠的血樣中在不同時(shí)間點(diǎn)重新獲得的腦膜炎奈瑟氏菌的log cfu/ml，如實(shí)施例40中所述；

圖40A圖示在用2×10⁸cfu/100μl腦膜炎奈瑟氏菌感染后MASP-2KO(-/-)和WT(+/+)小鼠的存活百分比，如實(shí)施例40中所述；

圖40B圖示采自用2×10⁸cfu/100μl腦膜炎奈瑟氏菌感染的WT(+/+)小鼠的血樣中在不同時(shí)間點(diǎn)重新獲得的腦膜炎奈瑟氏菌的log cfu/ml，如實(shí)施例40中所述；以及

圖40C圖示采自用2×108cfu/100μl腦膜炎奈瑟氏菌感染的MASP-2(-/-)小鼠的血樣中在不同時(shí)間點(diǎn)重新獲得的腦膜炎奈瑟氏菌的log cfu/ml，如實(shí)施例40中所述。

序列表描述

SEQ ID NO:1人MAp 19cDNA

SEQ ID NO:2人MAp 19蛋白(帶前導(dǎo)序列)

SEQ ID NO:3人MAp 19蛋白(成熟)

SEQ ID NO:4人MASP-2cDNA

SEQ ID NO:5人MASP-2蛋白(帶前導(dǎo)序列)

SEQ ID NO:6人MASP-2蛋白(成熟)

SEQ ID NO:7人MASP-2gDNA(外顯子1-6)

抗原：(關(guān)于MASP-2成熟蛋白)

SEQ ID NO:8CUBI序列(氨基酸1-121)

SEQ ID NO:9CUBEGF序列(氨基酸1-166)

SEQ ID NO:10CUBEGFCUBII(氨基酸1-293)

SEQ ID NO:11EGF區(qū)(氨基酸122-166)

SEQ ID NO:12絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域(氨基酸429-671)

SEQ ID NO:13無(wú)活性的絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域(氨基酸610-625，具有Ser618至Ala的突變)

SEQ ID NO:14TPLGPKWPEPVFGRL(CUB1肽)

SEQ ID NO:15TAPPGYRLRLYFTHFDLELSHLCEYDFVKLSS GAKVLATLCGQ(CUBI肽)

SEQ ID NO:16TFRSDYSN(MBL結(jié)合區(qū)核心)

SEQ ID NO:17FYSLGSSLDITFRSDYSNEKPFTGF(MBL結(jié)合區(qū))

SEQ ID NO:18IDECQVAPG(EGF肽)

SEQ ID NO:19ANMLCAGLESGGKDSCRGDSGGALV(絲氨酸蛋白酶結(jié)合核心)詳述

肽抑制劑：

SEQ ID NO:20MBL全長(zhǎng)cDNA

SEQ ID NO:21MBL全長(zhǎng)蛋白

SEQ ID NO:22OGK-X-GP(共有結(jié)合序列)

SEQ ID NO:23OGKLG

SEQ ID NO:24GLR GLQ GPO GKL GPO G

SEQ ID NO:25GPO GPO GLR GLQ GPO GKL GPO GPO GPO

SEQ ID NO:26GKDGRDGTKGEKGEPGQGLRGLQGPOGKL GPOG

SEQ ID NO:27GAOGSOGEKGAOGPQGPOGPOGKMGPKGEO GDO(人h-纖維膠凝蛋白)

SEQ ID NO:28GCOGLOGAOGDKGEAGTNGKRGERGPOGPO GKAGPOGPNGAOGEO(人纖維膠凝蛋白p35)

SEQ ID NO:29LQRALEILPNRVTIKANRPFLVFI(C4裂解位點(diǎn))

表達(dá)抑制劑：

SEQ ID NO:30CUBI-EGF結(jié)構(gòu)域的cDNA(SEQ ID NO:4的核苷酸22-680)

SEQ ID NO:31

5'CGGGCACACCATGAGGCTGCTGACCCTCC TGGGC 3'SEQ ID NO:4的核苷酸12-45，包括MASP-2翻譯起始位點(diǎn)(有義鏈)

SEQ ID NO:32

5'GACATTACCTTCCGCTCCGACTCCAACGAG AAG 3'，編碼含有MASP-2MBL結(jié)合位點(diǎn)區(qū)域的SEQ ID NO:4的核苷酸361-396(有義鏈)

SEQID NO:33

5'AGCAGCCCTGAATACCCACGGCCGTATCCC AAA 3'，編碼含有CUBII結(jié)構(gòu)域區(qū)域的SEQ ID NO:4的核苷酸610-642

克隆引物：

SEQ ID NO:34CGGGATCCATGAGGCTGCTGACCCTC(用于CUB的5'PCR)

SEQ ID NO:35GGAATTCCTAGGCTGCATA(用于CUB的3'PCR)

SEQ ID NO:36GGAATTCCTACAGGGCGCT(用于CUBIEGF的3'PCR)

SEQ ID NO:37GGAATTCCTAGTAGTGGAT(用于CUBIEGFCUBII的3'PCR)

SEQ ID NO:38-47是人源化抗體的克隆引物

SEQ ID NO:48是9個(gè)氨基酸的肽鍵

表達(dá)載體：

SEQ ID NO:49是MASP-2小基因插入序列

SEQ ID NO:50是鼠MASP-2cDNA

SEQ ID NO:51是鼠MASP-2蛋白(w/前導(dǎo)序列)

SEQ ID NO:52是成熟鼠MASP-2蛋白

SEQ ID NO:53是大鼠MASP-2cDNA

SEQ ID NO:54是大鼠MASP-2蛋白(w/前導(dǎo)序列)

SEQ ID NO:55是成熟大鼠MASP-2蛋白

SEQ ID NO:56-59是用于人MASP-2的定點(diǎn)誘變的寡核苷酸，所述人MASP-2用來(lái)產(chǎn)生人MASP-2A

SEQ ID NO:60-63是用于鼠MASP-2的定點(diǎn)誘變的寡核苷酸，所述鼠MASP-2用來(lái)產(chǎn)生鼠MASP-2A

SEQ ID NO:64-65是用于大鼠MASP-2的定點(diǎn)誘變的寡核苷酸，所述大鼠MASP-2用來(lái)產(chǎn)生大鼠MASP-2A。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明基于本發(fā)明的發(fā)明人預(yù)料不到的發(fā)現(xiàn)，即需要MASP-2來(lái)啟動(dòng)替代補(bǔ)體途徑的活化。通過(guò)使用敲除小鼠模型MASP-2-/-，本發(fā)明的發(fā)明人已顯示，通過(guò)凝集素介導(dǎo)的MASP-2途徑抑制替代補(bǔ)體途徑活化而同時(shí)保持經(jīng)典途徑的完整是可能的，從而確定了凝集素依賴(lài)性MASP-2活化是缺少經(jīng)典途徑的替代補(bǔ)體活化所需要的。本發(fā)明也描述了MASP-2作為治療靶的用途，用于抑制與凝集素介導(dǎo)的替代補(bǔ)體途徑活化有關(guān)的細(xì)胞損傷而同時(shí)保持免疫系統(tǒng)經(jīng)典(C1q依賴(lài)性的)途徑成分的完整。

I.定義

除非本文明確規(guī)定，否則本文使用的所有術(shù)語(yǔ)都具有如本發(fā)明領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所理解的相同含義。為了明確用于本說(shuō)明書(shū)和所附權(quán)利要求書(shū)中描述本發(fā)明的有關(guān)術(shù)語(yǔ)，提供下列定義。

本文所用術(shù)語(yǔ)“MASP-2依賴(lài)性補(bǔ)體活化”是指經(jīng)凝集素依賴(lài)性MASP-2活化而發(fā)生的替代途徑補(bǔ)體活化。

本文所用術(shù)語(yǔ)“替代途徑”是指例如由酵母聚糖觸發(fā)的補(bǔ)體活化，所述酵母聚糖來(lái)自真菌和酵母細(xì)胞壁、革蘭氏陰性外膜的脂多糖(LPS)和兔紅細(xì)胞以及來(lái)自多種純的多糖、兔紅細(xì)胞、病毒、細(xì)菌、動(dòng)物腫瘤細(xì)胞、寄生蟲(chóng)和受損細(xì)胞，在傳統(tǒng)上一直認(rèn)為是由來(lái)自補(bǔ)體因子C3自發(fā)水解產(chǎn)生的C3b而引起的。

本文所用術(shù)語(yǔ)“凝集素途徑”是指通過(guò)血清和非血清糖結(jié)合蛋白(包括甘露聚糖結(jié)合凝集素(MBL)和纖維膠凝蛋白)的特異性結(jié)合而發(fā)生的補(bǔ)體活化。

本文所用術(shù)語(yǔ)“經(jīng)典途徑”是指由抗體與外源顆粒結(jié)合而觸發(fā)的并且需要結(jié)合識(shí)別分子C1q的補(bǔ)體活化。

本文所用術(shù)語(yǔ)“MASP-2抑制劑”是指與MASP-2結(jié)合或直接與MASP-2相互作用并有效抑制MASP-2依賴(lài)性補(bǔ)體活化的任何試劑，包括抗MASP-2抗體及其MASP-2結(jié)合片段、天然和合成肽、小分子、可溶性MASP-2受體、表達(dá)抑制劑和分離的天然抑制劑，還包括在凝集素途徑中為結(jié)合其它識(shí)別分子(例如MBL、H-纖維膠凝蛋白、M-纖維膠凝蛋白或L-纖維膠凝蛋白)而與MASP-2競(jìng)爭(zhēng)的肽，但是不包括與這些其它的識(shí)別分子結(jié)合的抗體。用于本發(fā)明方法的MASP-2抑制劑可降低MASP-2依賴(lài)性補(bǔ)體活化大于20％，例如大于50％，例如大于90％。在一個(gè)實(shí)施方案中，MASP-2抑制劑降低MASP-2依賴(lài)性補(bǔ)體活化大于90％(即導(dǎo)致僅僅10％或更低的MASP-2補(bǔ)體活化)。

本文所用術(shù)語(yǔ)“抗體”包括得自產(chǎn)生抗體的任何哺乳動(dòng)物(如小鼠、大鼠、兔和包括人在內(nèi)的靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物)并與MASP-2多肽或其部分特異性結(jié)合的抗體及其抗體片段。示例性的抗體包括多克隆抗體、單克隆抗體和重組抗體；多特異性抗體(如雙特異性抗體)；人源化抗體；鼠抗體；嵌合的小鼠-人、小鼠-靈長(zhǎng)類(lèi)、靈長(zhǎng)類(lèi)-人單克隆抗體；和抗獨(dú)特型抗體，且可以是任何完整的分子或其片段。

本文所用術(shù)語(yǔ)“抗體片段”是指得自或涉及全長(zhǎng)抗MASP-2抗體的一部分，一般包括抗原結(jié)合區(qū)或其可變區(qū)?？贵w片段的說(shuō)明性實(shí)例包括Fab、Fab'、F(ab)₂、F(ab')₂和Fv片段、scFv片段、雙抗體、線性抗體、單鏈抗體分子和由抗體片段形成的多特異性抗體。

本文所用的“單鏈Fv”或“scFv”抗體片段包括抗體的V_H和V_L結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)域存在于單一多肽鏈上。Fv多肽一般還包括V_H與V_L結(jié)構(gòu)域之間的多肽接頭，這使得scFv能夠形成所需的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)。

本文所用術(shù)語(yǔ)“嵌合抗體”是含有得自非人物種(如嚙齒動(dòng)物)抗體的可變結(jié)構(gòu)域和互補(bǔ)決定區(qū)的重組蛋白，而抗體分子的其余部分來(lái)源于人抗體。

本文所用術(shù)語(yǔ)“人源化抗體”是包含符合源自非人免疫球蛋白的特異性互補(bǔ)決定區(qū)的最小序列的嵌合抗體，該特異性互補(bǔ)決定區(qū)被植入人抗體構(gòu)架中。人源化抗體通常是其中只有抗體互補(bǔ)決定區(qū)是非人來(lái)源的重組蛋白。

本文所用術(shù)語(yǔ)“甘露聚糖結(jié)合凝集素”(“MBL”)等同于甘露聚糖結(jié)合蛋白(“MBP”)。

本文所用的“膜攻擊復(fù)合物”(“MAC”)是指插入并破壞膜的5種末端補(bǔ)體成分(C5-C9)的復(fù)合物。亦稱(chēng)C5b-9。

本文所用的“受試者”包括所有哺乳動(dòng)物，包括但不限于人、非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物、狗、貓、馬、綿羊、山羊、牛、兔、豬和嚙齒動(dòng)物。

本文所用的氨基酸殘基的縮寫(xiě)如下：丙氨酸(Ala；A)、天冬酰胺(Asn；N)、天冬氨酸(Asp；D)、精氨酸(Arg；R)、半胱氨酸(Cys；C)、谷氨酸(Glu；E)、谷胺酰胺(Gln；Q)、甘氨酸(Gly；G)、組氨酸(His；H)、異亮氨酸(Ile；I)、亮氨酸(Leu；L)、賴(lài)氨酸(Lys；K)、甲硫氨酸(Met；M)、苯丙氨酸(Phe；F)、脯氨酸(Pro；P)、絲氨酸(Ser；S)、蘇氨酸(Thr；T)、色氨酸(Trp；W)、酪氨酸(Tyr；Y)和丙氨酸(Val；V)。

從最廣意義上看，天然存在的氨基酸可根據(jù)各個(gè)氨基酸側(cè)鏈的化學(xué)特性來(lái)分組。“疏水”氨基酸是指Ile、Leu、Met、Phe、Trp、Tyr、Val、Ala、Cys或Pro?！坝H水”氨基酸是指Gly、Asn、Gln、Ser、Thr、Asp、Glu、Lys、Arg或His。氨基酸的這種組別可進(jìn)一步細(xì)分如下。“不帶電荷的親水”氨基酸是指Ser、Thr、Asn或者Gln?！八嵝浴卑被崾侵窯lu或Asp?！皦A性”氨基酸是指Lys、Arg或者His。

本文所用術(shù)語(yǔ)“保守的氨基酸取代”通過(guò)下面每組中氨基酸之間的取代來(lái)說(shuō)明：(1)甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；(2)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；(3)絲氨酸和蘇氨酸；(4)天冬氨酸和谷氨酸；(5)谷胺酰胺和天冬酰胺；(6)賴(lài)氨酸、精氨酸和組氨酸。

本文所用術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸”是指核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸(DNA)或其模擬物的寡聚體或多聚體。該術(shù)語(yǔ)還涵蓋由天然存在的核苷酸、糖和核苷間(骨架)共價(jià)鍵以及具有非天然存在的修飾的寡核苷酸所組成的寡核苷酸堿基。

II.替代途徑：新見(jiàn)解

補(bǔ)體的替代途徑首先是由Louis Pillemer和他的同事在1950年代初期根據(jù)由酵母細(xì)胞壁制備的酵母聚糖用來(lái)激活補(bǔ)體的研究提出的(Pillemer,L.等，J.Exp.Med.103:1-13，1956；Lepow，I.H.，J.Immunol.125:471-478，1980)。從那時(shí)起直到現(xiàn)在，酵母聚糖被認(rèn)為是人和嚙齒動(dòng)物血清中替代途徑的特異性激活因子的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)例(Lachmann,P.J.等，Springer Semin.Immunopathol.7:143-162，1984；Van Dijk，H.等，J.Immunol.Methods 85:233-243，1985；Pangburn,M.K.，Methods in Enzymol.162:639-653，1988)。用于替代途徑活化的簡(jiǎn)便而廣泛使用的測(cè)定法是將血清與包被在塑料孔中的酵母聚糖一起溫育，以測(cè)定溫育后固相上C3b沉積的量。正如所料，與正常小鼠血清溫育之后，在酵母聚糖包被孔中有大量C3b沉積(圖7B)。然而，與正常血清相比，得自純合MASP-2缺陷型小鼠的血清與酵母聚糖包被孔一起溫育導(dǎo)致C3b沉積大為減少。此外，在該實(shí)驗(yàn)中使用MASP 2基因缺陷型雜合小鼠的血清產(chǎn)生的C3b沉積水平，介于純合MASP-2缺陷型小鼠血清與正常小鼠血清所得到的C3b沉積水平的中間。使用已知激活替代途徑的另一種多糖甘露聚糖包被的孔也獲得了類(lèi)似結(jié)果(圖7A)。由于除了MASP 2基因之外，正常小鼠和MASP-2缺陷型小鼠共享相同的遺傳背景，因此這些預(yù)料不到的結(jié)果表明，MASP-2在替代途徑活化方面起著重要作用。

這些結(jié)果提供了強(qiáng)有力的證據(jù)，證明替代途徑并非象基本上所有現(xiàn)有的有關(guān)補(bǔ)體的醫(yī)學(xué)教科書(shū)和最新的綜述文章中所描述的那樣是不受限制的獨(dú)立的補(bǔ)體活化途徑。現(xiàn)行普遍持有的科學(xué)觀點(diǎn)是，替代途徑是在某些微粒靶(微生物、酵母聚糖、兔紅細(xì)胞)的表面上被自發(fā)的“慢轉(zhuǎn)”C3活化的擴(kuò)大所激活的。然而，在MASP-2敲除小鼠血清中，通過(guò)兩種眾所周知的替代途徑“激活因子”都沒(méi)有產(chǎn)生顯著的替代途徑活化，這使得無(wú)法通過(guò)“慢轉(zhuǎn)理論”來(lái)解釋補(bǔ)體活化的重要生理機(jī)制。

由于已知MASP-2蛋白酶具有明確的特異性酶作用，負(fù)責(zé)凝集素補(bǔ)體級(jí)聯(lián)的啟動(dòng)，因此這些結(jié)果提示由酵母聚糖和甘露聚糖導(dǎo)致的凝集素途徑的活化是隨后替代途徑活化的關(guān)鍵性的第一步。C4b是由凝集素途徑產(chǎn)生而不是由替代途徑產(chǎn)生的活化產(chǎn)物。與這個(gè)觀點(diǎn)相一致，正常小鼠血清與酵母聚糖或甘露聚糖包被的孔進(jìn)行溫育時(shí)導(dǎo)致了C4b沉積在孔上，當(dāng)包被孔與得自MASP-2缺陷型小鼠的血清溫育時(shí)，這種C4b沉積大大減少(圖6A、圖6B和圖6C)。

替代途徑除了作為補(bǔ)體活化的獨(dú)立途徑這一被普遍接受的作用之外，還能為最初被經(jīng)典途徑和凝集素途徑引發(fā)的補(bǔ)體活化提供放大環(huán)路(Liszewski，M.K.和J.P.Atkinson,1993，載于Fundamental Immunology，第三版，由W.E.Paul編輯，Raven Press，Ltd.，New York；Schweinie，J.E.等，J.Clin.Invest.84:1821-1829，1989)。在這種替代途徑介導(dǎo)的放大機(jī)制中，通過(guò)經(jīng)典或凝集素補(bǔ)體級(jí)聯(lián)活化而產(chǎn)生的C3轉(zhuǎn)化酶(C4b2b)將C3切割成C3a和C3b，從而提供了能夠參與形成C3bBb的C3b，C3bBb是替代途徑C3轉(zhuǎn)化酶。在MASP-2敲除血清中缺乏替代途徑活化可能的解釋是，由酵母聚糖、甘露聚糖以及其它推定的替代途徑“激活因子”產(chǎn)生的初始的補(bǔ)體活化需要凝集素途徑，而替代途徑起著放大補(bǔ)體活化的關(guān)鍵作用。換句話說(shuō)，替代途徑是依賴(lài)凝集素和經(jīng)典補(bǔ)體途徑用于活化的前饋放大環(huán)路，而不是獨(dú)立的線性級(jí)聯(lián)。

補(bǔ)體級(jí)聯(lián)并不是如以前設(shè)想的那樣通過(guò)三條截然不同的途徑(經(jīng)典途徑、替代途徑和凝集素途徑)被激活，我們的結(jié)果表明，將補(bǔ)體看成由兩個(gè)主要系統(tǒng)組成更為準(zhǔn)確，大致上相當(dāng)于補(bǔ)體免疫防御系統(tǒng)的先天性(凝集素)和獲得性(經(jīng)典)的兩翼。凝集素(MBP、M-纖維膠凝蛋白、H-纖維膠凝蛋白和L-纖維膠凝蛋白)是引發(fā)先天性補(bǔ)體系統(tǒng)的特異性識(shí)別分子，該系統(tǒng)包括凝集素途徑和相關(guān)的替代途徑放大環(huán)路。C1q是引發(fā)獲得性補(bǔ)體系統(tǒng)的特異性識(shí)別分子，該系統(tǒng)包括經(jīng)典途徑和相關(guān)的替代途徑放大環(huán)路。我們將這兩個(gè)主要的補(bǔ)體活化系統(tǒng)分別稱(chēng)為凝集素依賴(lài)性補(bǔ)體系統(tǒng)和C1q依賴(lài)性補(bǔ)體系統(tǒng)。

除了在免疫防御中的基本作用外，補(bǔ)體系統(tǒng)是造成許多臨床疾病的組織損傷的原因。因此，迫切需要開(kāi)發(fā)治療上有效的補(bǔ)體抑制劑以抑制這些不利作用。如果認(rèn)識(shí)到補(bǔ)體是由兩個(gè)主要的補(bǔ)體活化系統(tǒng)組成的，則就能夠理解我們非常需要的是僅僅特異性抑制引起特定病理的補(bǔ)體活化系統(tǒng)而又不完全停止補(bǔ)體的免疫防御能力。例如，在其中補(bǔ)體活化主要由凝集素依賴(lài)性補(bǔ)體系統(tǒng)介導(dǎo)的疾病中，僅特異性抑制該系統(tǒng)將是有利的。這將保持C1q依賴(lài)性補(bǔ)體活化系統(tǒng)的完整性以處理免疫復(fù)合物加工以及幫助宿主防御感染。

在特異性抑制凝集素依賴(lài)性補(bǔ)體系統(tǒng)的治療藥物的研發(fā)中，優(yōu)選的作為靶標(biāo)的蛋白成分是MASP-2。在凝集素依賴(lài)性補(bǔ)體系統(tǒng)的所有蛋白成分(MBL、H-纖維膠凝蛋白、M-纖維膠凝蛋白、L-纖維膠凝蛋白、MASP-2、C2-C9、B因子、D因子和備解素)中，只有MASP-2是凝集素依賴(lài)性補(bǔ)體系統(tǒng)所獨(dú)有并且是這個(gè)系統(tǒng)起作用所必需的。凝集素(MBL、H-纖維膠凝蛋白、M-纖維膠凝蛋白和L-纖維膠凝蛋白)也是凝集素依賴(lài)性補(bǔ)體系統(tǒng)中獨(dú)有的成分。然而，這些凝集素成分任一種的喪失并不一定抑制系統(tǒng)活化，這是由于凝集素冗余所致。為了保證抑制凝集素依賴(lài)性補(bǔ)體活化系統(tǒng)，抑制所有4種凝集素可能是必要的。此外，由于還已知MBL和纖維膠凝蛋白具有不依賴(lài)于補(bǔ)體的調(diào)理活性，因此抑制凝集素功能將導(dǎo)致喪失這種有利的抗感染的宿主防御機(jī)制。相反，如果MASP-2是抑制靶標(biāo)的話，這種不依賴(lài)于補(bǔ)體的凝集素調(diào)理活性會(huì)保持完整。MASP-2作為抑制凝集素依賴(lài)性補(bǔ)體活化系統(tǒng)的治療靶的額外好處是，MASP-2的血漿濃度是所有補(bǔ)體蛋白中最低的(約500ng/ml)；因此，為得到完全抑制可能只需要相對(duì)低濃度的高親和性MASP-2抑制劑(Moller-Kristensen,M.等，J.Immunol Methods 282:159-167，2003)。

III.MASP-2在各種疾病和病癥中的作用以及使用MASP-2抑制劑的治療方法

缺血再灌注損傷

當(dāng)血流在長(zhǎng)期缺血后恢復(fù)時(shí)會(huì)發(fā)生缺血再灌注損傷(I/R)。它是許多疾病的發(fā)病和死亡的共同原因。外科手術(shù)患者在主動(dòng)脈瘤修復(fù)術(shù)、心肺分流術(shù)、與例如器官移植(如心、肺、肝、腎)和/或四肢/指趾再植相關(guān)的血管吻合術(shù)、中風(fēng)、心肌梗塞、休克和/或外科手術(shù)后的血液動(dòng)力復(fù)蘇之后易受其影響?；加袆?dòng)脈粥樣硬化疾病的患者易發(fā)生心肌梗塞、中風(fēng)以及血栓誘發(fā)的腸和下肢缺血。創(chuàng)傷患者常常遭受四肢一過(guò)性缺血。此外，任何原因的大量血液損失都導(dǎo)致全身I/R反應(yīng)。

I/R損傷的病理生理學(xué)是復(fù)雜的，至少兩個(gè)主要因素是造成這個(gè)過(guò)程的原因：補(bǔ)體活化和嗜中性粒細(xì)胞刺激和與之相伴的氧自由基介導(dǎo)的損傷。在I/R損傷中，補(bǔ)體活化最早記載于30多年前的心肌梗塞期間，并引起了關(guān)于補(bǔ)體系統(tǒng)對(duì)I/R組織損傷的影響的大量研究(Hill，J.H.等，J.Exp.Med.133:885-900，1971)。目前，不斷積累的證據(jù)表明，補(bǔ)體是I/R損傷中的關(guān)鍵介質(zhì)。在幾種I/R動(dòng)物模型中，補(bǔ)體抑制已經(jīng)在限制損傷方面獲得了成功。在早期的研究中，輸注眼鏡蛇毒因子之后使得C3耗盡，據(jù)報(bào)道該C3耗盡在腎臟和心臟的I/R期間是有利的(Maroko，P.R.等，1978，J.Clin Invest.61:661-670，1978；Stein,S.H.等，Miner Electrolyte Metab.11:256-61，1985)。然而，可溶形式的補(bǔ)體受體1(sCR1)是用來(lái)預(yù)防心肌I/R損傷的第一種補(bǔ)體特異性抑制劑(Weisman,H.F.等，Science 249:146-51，1990)。心肌I/R期間的sCR1治療減少了梗塞形成，所述梗塞形成與沿冠狀內(nèi)皮沉積的C5b-9復(fù)合物的減少和再灌注后的白細(xì)胞浸潤(rùn)減少有關(guān)。

在實(shí)驗(yàn)性心肌I/R中，在再灌注之前給予C1酯酶抑制劑(C1INH)防止了C1q的沉積并顯著減少了心肌壞死面積(Buerke，M.等，1995，Circulation 91:393-402，1995)。遺傳上缺失C3的動(dòng)物在骨骼肌或腸缺血之后，其局部組織壞死較少(Weiser,M.R.等，J.Exp.Med.183:2343-48，1996)。

膜攻擊復(fù)合物是補(bǔ)體導(dǎo)向的損傷的最后媒介物，C5缺陷型動(dòng)物的研究表明，I/R損傷模型中局部損傷和較遠(yuǎn)部位損傷減少(Austen,W.G.Jr.等，Surgery 126:343-48，1999)。已經(jīng)證實(shí)在鼠腸再灌注開(kāi)始前后分別給予補(bǔ)體活化抑制劑即可溶性Crry(補(bǔ)體受體相關(guān)基因Y)時(shí)對(duì)于抗損傷是有效的(Rehrig,S.等，J.Immunol.167:5921-27，2001)。在骨骼肌缺血模型中，在再灌注開(kāi)始之后給予時(shí)，用可溶性補(bǔ)體受體1(sCR1)同樣減少肌肉損傷(Kyriakides,C.等，Am.J.Physiol Cell Physiol.281:C244-30，2001)。在心肌I/R的豬模型中，在再灌注之前用針對(duì)過(guò)敏毒素C5a的單克隆抗體(“MoAb”)處理的動(dòng)物顯示，梗塞形成減少(Amsterdam,E.A.等，Am.J.Physiol.Heart Circ.Physiol.268:H448-57，1995)。用C5MoAb處理的大鼠證實(shí)，心肌中梗塞大小、嗜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和凋亡減少(Vakeva,A.等，Circulation 97:2259-67，1998)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果使I/R損傷發(fā)病機(jī)制中補(bǔ)體活化的重要性得到突出。

尚不清楚主要是哪條補(bǔ)體途徑(經(jīng)典、凝集素或替代途徑)參與了I/R損傷中的補(bǔ)體活化。Weiser等人根據(jù)血管通透性顯著降低表明C3和C4敲除小鼠受到保護(hù)而免受I/R損傷，從而證實(shí)了凝集素途徑和/或經(jīng)典途徑在骨骼I/R期間的重要作用(Weiser,M.R.等，J.Exp.Med.183:2343-48，1996)。相反，用C4敲除小鼠進(jìn)行的腎I/R實(shí)驗(yàn)表明沒(méi)有顯著的組織保護(hù)作用，而C3、C5和C6敲除小鼠則受到保護(hù)而免受損傷，這表明腎I/R損傷期間的補(bǔ)體活化是通過(guò)替代途徑而發(fā)生的(Zhou,W.等，J.Clin.Invest.105:1363-71，2000)。Stahl等人最近采用D因子缺陷型小鼠，提供了關(guān)于替代途徑在小鼠腸I/R中的重要作用的證據(jù)(Stahl,G.等，Am.J.Pathol.162:449-55，2003)。相反，Williams等人表明C4和IgM(Rag1-/-)缺陷型小鼠中C3的器官染色減少并保護(hù)器官免受損傷，從而提出小鼠腸I/R損傷開(kāi)始時(shí)經(jīng)典途徑的重要作用(Williams,J.P.等，J.Appl.Physiol.86:938-42，1999)。

在心肌I/R模型中，用抗大鼠甘露聚糖結(jié)合凝集素(MBL)的單克隆抗體處理大鼠導(dǎo)致缺血后再灌注損傷減輕(Jordan,J.E.等，Circulation 104:1413-18，2001)。MBL抗體還在氧化應(yīng)激之后，體外減少補(bǔ)體沉積在內(nèi)皮細(xì)胞上，這表明了凝集素途徑在心肌I/R損傷中的作用(Collard,C.D.等，Am.J.Pathol.156:1549-56，2000)。也有證據(jù)表明在一些器官中，I/R損傷可能由稱(chēng)為天然抗體的特定類(lèi)別的IgM以及經(jīng)典途徑的活化所介導(dǎo)(Fleming,S.D.等，J.Immunol.169:2126-33，2002；Reid,R.R.等，J.Immunol.169:5433-40，2002)。

已經(jīng)開(kāi)發(fā)出幾種補(bǔ)體活化抑制劑作為潛在治療藥物，來(lái)預(yù)防由心肌I/R并發(fā)癥導(dǎo)致的發(fā)病率和死亡率。這些抑制劑中有兩種即sCR1(TP10)和人源化抗C5scFv(培克珠單抗(Pexelizumab))已經(jīng)完成了II期臨床試驗(yàn)。培克珠單抗還完成了III期臨床試驗(yàn)。盡管TP10在早期的I/II期試驗(yàn)中具有良好的耐受性，并且對(duì)患者有益，但是2002年2月結(jié)束的II期試驗(yàn)結(jié)果并沒(méi)有達(dá)到初步終點(diǎn)。然而，來(lái)自正在進(jìn)行心內(nèi)直視手術(shù)的高危人群男性患者的數(shù)據(jù)的亞組分析證實(shí)，死亡率和梗塞大小顯著降低。在COMA和COMPLY II期試驗(yàn)中，給予人源化抗C5scFv降低了與急性心肌梗塞有關(guān)的總體患者死亡率，但是未能達(dá)到初步終點(diǎn)(Mahaffey,K.W.等，Circulation 108:1176-83，2003)。最近發(fā)表了來(lái)自最新的抗C5scFv III期臨床試驗(yàn)(PRIMO-CABG)的結(jié)果，其用于改進(jìn)冠狀動(dòng)脈分流術(shù)后由手術(shù)產(chǎn)生的結(jié)果。盡管沒(méi)有達(dá)到此項(xiàng)研究的初步終點(diǎn)，但是此研究證實(shí)，術(shù)后患者的發(fā)病率和死亡率整體下降。

Walsh博士及其同事證實(shí)，缺乏MBL、從而缺乏MBL依賴(lài)性凝集素途徑活化但經(jīng)典補(bǔ)體途徑卻充分活化的小鼠受到保護(hù)而不受心臟再灌注損傷，結(jié)果保護(hù)了心臟功能(Walsh等，J.Immunol.175:541-46，2005)。值得注意的是，缺乏經(jīng)典補(bǔ)體途徑識(shí)別成分C1q、但是具有完整MBL補(bǔ)體途徑的小鼠，無(wú)法受到保護(hù)而不受損傷。這些結(jié)果表明凝集素途徑在心肌缺血再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制中具有主要作用。

已知補(bǔ)體活化在胃腸缺血再灌注(I/R)有關(guān)的組織損傷中起著重要作用。Hart及其同事采用GI/R鼠模型的最新研究指出，遺傳上缺失MBL的小鼠在胃腸I/R后受到保護(hù)而不受腸損傷(Hart等，J.Immunol.174:6373-80，2005)。在胃腸I/R后，與未處理MBL缺陷型小鼠相比，在MBL缺陷型小鼠中加入重組MBL顯著增加損傷。相比之下，遺傳上缺失經(jīng)典途徑識(shí)別成分C1q的小鼠，在胃腸I/R之后未受到組織損傷的保護(hù)。

腎I/R是急性腎衰竭的重要原因。補(bǔ)體系統(tǒng)似乎基本上參與了腎I/R損傷。在最近的一項(xiàng)研究中，de Vries及其同事報(bào)道了在實(shí)驗(yàn)性腎I/R損傷以及臨床腎I/R損傷進(jìn)程中凝集素途徑被激活(de Vries等，Am.J.Path.165:1677-88，2004)。此外，在腎I/R進(jìn)程中，凝集素途徑發(fā)生在補(bǔ)體C3、C6和C9沉積之前，并且與補(bǔ)體C3、C6和C9沉積共定位。這些結(jié)果表明凝集素途徑的補(bǔ)體活化參與了腎I/R損傷。

因此，本發(fā)明的一個(gè)方面涉及通過(guò)應(yīng)用藥物載體中的治療有效量的MASP-2抑制劑來(lái)治療經(jīng)歷缺血再灌注的受試者從而治療缺血再灌注損傷?？赏ㄟ^(guò)動(dòng)脈內(nèi)、靜脈內(nèi)、顱內(nèi)、肌內(nèi)、皮下或其它胃腸外給藥，給予受試者M(jìn)ASP-2抑制劑，對(duì)于非肽能抑制劑可口服給予，最適合經(jīng)動(dòng)脈內(nèi)或靜脈內(nèi)給藥。本發(fā)明的MASP-2抑制劑組合物適于在缺血再灌注事件后立即或盡快開(kāi)始給予。在受控環(huán)境下發(fā)生再灌注的情況下(例如在主動(dòng)脈瘤修復(fù)術(shù)、器官移植或斷肢或斷指趾或者受傷四肢或指趾的復(fù)置術(shù)后)，可以在再灌注之前和/或期間和/或之后給予MASP-2抑制劑。為達(dá)到最佳治療效果，可按照醫(yī)師規(guī)定定期重復(fù)給藥。

動(dòng)脈粥樣硬化

有相當(dāng)多的證據(jù)表明，補(bǔ)體活化參與人體動(dòng)脈粥樣化的形成。多項(xiàng)研究令人信服地表明，盡管在正常動(dòng)脈中沒(méi)有發(fā)生顯著的補(bǔ)體活化，但是補(bǔ)體在動(dòng)脈粥樣硬化病變中被大量活化，在易受損和破裂的斑塊中尤其突出。在人動(dòng)脈粥樣化中，經(jīng)常發(fā)現(xiàn)末端補(bǔ)體途徑的成分(Niculescu,F.等，Mol.Immunol.36:949-55.10-12，1999；Rus,H.G.等，Immunol.Lett.20:305-310，1989；Torzewski,M.等，Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.18:369-378，1998)。還發(fā)現(xiàn)在動(dòng)脈病變中有C3和C4沉積(Hansson,G.K.等，Acta Pathol.Microbiol.Immunol.Scand.(A)92:429-35，1984)。C5b-9沉積的程度與損傷的嚴(yán)重性有關(guān)(Vlaicu,R.等，Atherosclerosis57:163-77，1985)。補(bǔ)體iC3b、而不是C5b-9沉積在破裂和易損斑塊上的情況特別嚴(yán)重，這表明補(bǔ)體活化可能是急性冠狀動(dòng)脈綜合征的一個(gè)因素(Taskinen S.等，Biochem.J.367:403-12，2002)。在兔實(shí)驗(yàn)性動(dòng)脈粥樣化中發(fā)現(xiàn)了補(bǔ)體活化先于病變發(fā)生前(Seifer,P.S.等，Lab Invest.60:747-54，1989)。

在動(dòng)脈粥樣硬化病變中，補(bǔ)體通過(guò)經(jīng)典途徑和替代途徑被激活，但是至今還幾乎沒(méi)有補(bǔ)體活化是通過(guò)凝集素途徑的證據(jù)。動(dòng)脈壁的幾個(gè)成分可能引發(fā)補(bǔ)體活化?？赡芡ㄟ^(guò)與酶降解LDL結(jié)合的C反應(yīng)蛋白(CRP)來(lái)激活補(bǔ)體的經(jīng)典途徑(Bhakdi,S.等，Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.19:2348-54，1999)。與此觀點(diǎn)一致的發(fā)現(xiàn)是，末端補(bǔ)體蛋白與早期人病變內(nèi)膜中的CRP共定位(Torzewski,J.等，Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.18:1386-92，1998)。同樣地，對(duì)病變內(nèi)的氧化LDL特異性的免疫球蛋白IgM或IgG抗體可能激活經(jīng)典途徑(Witztum,J.L.，Lancet 344:793-95，1994)。從人動(dòng)脈粥樣硬化病變中分離的脂質(zhì)具有高含量的未酯化的膽固醇，并且能夠激活替代途徑(Seifert P.S.等，J.Exp.Med.172:547-57，1990)。常常與動(dòng)脈粥樣硬化病變相關(guān)的革蘭氏陰性菌肺炎衣原體(Chlamydia pneumoniae)也可激活補(bǔ)體替代途徑(Campbell L.A.等，J.Infect.Dis.172:585-8，1995)。動(dòng)脈粥樣硬化病變中存在的其它潛在的補(bǔ)體活化因子包括膽固醇結(jié)晶和細(xì)胞碎片，這兩者都可激活替代途徑(Seifert,P.S.等，Mol.Immunol.24:1303-08，1987)。

已知補(bǔ)體活化的副產(chǎn)物具有許多能夠影響動(dòng)脈粥樣硬化病變發(fā)展的生物學(xué)性質(zhì)。局部補(bǔ)體活化可能誘導(dǎo)細(xì)胞裂解并且產(chǎn)生至少一些在晚期病變壞死核心中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞碎片(Niculescu,F.等，Mol.Immunol.36:949-55.10-12，1999)。亞裂解補(bǔ)體活化可能是造成平滑肌細(xì)胞增殖以及動(dòng)脈粥樣化形成期間單核細(xì)胞浸潤(rùn)到動(dòng)脈內(nèi)膜上的重要因素(Torzewski J.等，Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.18:673-77，1996)。補(bǔ)體的持續(xù)活化可能是有害的，因?yàn)樗赡芤l(fā)炎癥并使炎癥持續(xù)。除了血漿補(bǔ)體成分的浸潤(rùn)外，動(dòng)脈細(xì)胞表達(dá)了補(bǔ)體蛋白信使RNA，各種補(bǔ)體成分的表達(dá)在動(dòng)脈粥樣硬化病變中被上調(diào)(Yasojima,K.等，Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.21:1214-19，2001)。

已經(jīng)報(bào)道的關(guān)于補(bǔ)體蛋白缺乏對(duì)動(dòng)脈粥樣化形成的影響的研究數(shù)量有限。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中的結(jié)果也不一致。在大鼠中，通過(guò)有毒劑量的維生素D誘發(fā)的動(dòng)脈粥樣硬化樣病變的形成在缺乏補(bǔ)體的動(dòng)物體內(nèi)減少(Geertinger P.等，Acta.Pathol.Microbiol.Scand.(A)78:284-88，1970)。此外，在膽固醇喂養(yǎng)兔中，通過(guò)遺傳性C6缺乏癥(Geertinger,P.等，Artery 1:177-84，1977；Schmiedt,W.等，Arterioscl.Thromb.Vasc.Biol.18:1790-1795，1998)或者通過(guò)抗補(bǔ)體藥物K-76COONa(Saito,E.等，J.Drug Dev.3:147-54，1990)引起的補(bǔ)體抑制，抑制了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展而又不影響血清膽固醇水平。相反，最近的研究報(bào)道了脫脂載脂蛋白E(ApoE)缺陷型小鼠中，C5缺乏不減緩動(dòng)脈粥樣硬化病變的發(fā)展(Patel,S.等，Biochem.Biophys.Res.Commun.286:164-70，2001)。然而在另一項(xiàng)研究中，在存在或不存在下C3缺乏的情況下，對(duì)LDLR缺陷型(ldlr-)小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化病變的發(fā)展進(jìn)行了評(píng)價(jià)(Buono,C.等，Circulation 105:3025-31，2002)。他們發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈粥樣化到動(dòng)脈粥樣硬化樣病變的成熟部分取決于完整補(bǔ)體系統(tǒng)的存在。

因此，本發(fā)明的一個(gè)方面涉及通過(guò)應(yīng)用藥物載體中的治療有效量的MASP-2抑制劑來(lái)治療患有或易患動(dòng)脈粥樣硬化的受試者從而治療或預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化。可以通過(guò)動(dòng)脈內(nèi)、靜脈內(nèi)、鞘內(nèi)、顱內(nèi)、肌內(nèi)、皮下或其它胃腸外給藥而給予受試者M(jìn)ASP-2抑制劑，對(duì)于非肽能抑制劑可口服給予。可以在受試者診斷出動(dòng)脈粥樣硬化后開(kāi)始給予或者在發(fā)生該病的高危受試者中預(yù)防性地給予MASP-2抑制劑組合物。為達(dá)到最佳治療效果，可按照醫(yī)師規(guī)定定期重復(fù)給藥。

其它血管疾病和病癥

內(nèi)皮很大程度上暴露于免疫系統(tǒng)，特別容易受到存在于血漿中的補(bǔ)體蛋白的攻擊。研究表明補(bǔ)體介導(dǎo)的血管損傷是心血管系統(tǒng)中若干疾病的病理生理學(xué)原因，所述疾病包括動(dòng)脈粥樣硬化(Seifert,P.S.等，Atherosclerosis 73:91-104，1988)、缺血再灌注損傷(Weisman,H.F.，Science249:146-51，1990)和心肌梗塞(Tada,T.等，Virchows Arch 430:327-332，1997)。有證據(jù)表明，補(bǔ)體活化可能擴(kuò)展到其它血管病中。

例如，有證據(jù)表明，補(bǔ)體活化是多種形式的血管炎的發(fā)病機(jī)制的原因之一，包括亨諾赫–舍恩萊因紫癜腎炎、與系統(tǒng)性紅斑狼瘡相關(guān)的血管炎、與類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)的血管炎(亦稱(chēng)惡性類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)、免疫復(fù)合物型血管炎和無(wú)脈癥。亨諾赫–舍恩萊因紫癜腎炎是具有免疫發(fā)病機(jī)制的小血管系統(tǒng)性血管炎的一種形式，其中補(bǔ)體通過(guò)凝集素途徑活化導(dǎo)致C5b-9誘導(dǎo)的內(nèi)皮損傷被認(rèn)為是一個(gè)重要的機(jī)制(Kawana,S.等，Arch.Dermatol.Res.282:183-7，1990；Endo,M.等，Am J.Kidney Dis.35:401-7，2000)。系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是影響多種器官的全身性自身免疫性疾病的實(shí)例，包括皮膚、腎、關(guān)節(jié)、漿膜表面和中樞神經(jīng)系統(tǒng)，常常與嚴(yán)重血管炎有關(guān)。在患有活動(dòng)性SLE患者的血清中存在IgG抗內(nèi)皮抗體和能夠結(jié)合內(nèi)皮細(xì)胞的IgG復(fù)合物，并且在患有SLE血管炎患者的血管壁上發(fā)現(xiàn)了IgG免疫復(fù)合物和補(bǔ)體的沉積(Cines,D.B.等，J.Clin.Invest.73:611-25，1984)。與血管炎有關(guān)的類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(亦稱(chēng)惡性類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)(Tomooka,K.，F(xiàn)ukuoka Igaku Zasshi 80:456-66，1989)、免疫復(fù)合物型血管炎、與甲型肝炎有關(guān)的血管炎、破白細(xì)胞性血管炎以及被稱(chēng)為無(wú)脈癥的動(dòng)脈炎，構(gòu)成了另一多型組別的人類(lèi)疾病，其中針對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞和其它細(xì)胞類(lèi)型的補(bǔ)體依賴(lài)的細(xì)胞毒性起著已證實(shí)的作用(Tripathy,N.K.等，J.Rheumatol.28:805-8，2001)。

還有證據(jù)表明了補(bǔ)體活化在擴(kuò)張型心肌病中起作用。擴(kuò)張型心肌病是以心臟肥大和心臟收縮功能受損為特征的綜合征。最新數(shù)據(jù)表明，心肌中正在發(fā)生的炎癥可能是疾病發(fā)生的原因。已知補(bǔ)體的末端膜攻擊復(fù)合物C5b-9與免疫球蛋白沉積和TNF-α的心肌表達(dá)顯著相關(guān)。在28名患有擴(kuò)張型心肌病患者的心肌活檢樣品中，證實(shí)了C5b-9的心肌積累，這就表明心肌中慢性免疫球蛋白介導(dǎo)的補(bǔ)體活化可能是部分促成擴(kuò)張型心肌病進(jìn)程的原因(Zwaka,T.P.等，Am.J.Pathol.161(2):449-57，2002)。

因此，本發(fā)明的一個(gè)方面涉及通過(guò)給予包含治療有效量的MASP-2抑制劑在藥物載體中的組合物來(lái)治療血管病，所述血管病包括心血管病、腦血管病、外周(如肌肉骨骼)血管病、腎血管病和腸系膜/腸血管病。認(rèn)為本發(fā)明適用的疾病包括但不限于：血管炎，包括亨諾赫－舍恩萊因紫癜腎炎、與系統(tǒng)性紅斑狼瘡相關(guān)的血管炎、與類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)的血管炎(亦稱(chēng)惡性類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)、免疫復(fù)合物型血管炎和無(wú)脈癥；擴(kuò)張型心肌??；糖尿病性血管??；川崎病(動(dòng)脈炎)和靜脈氣體栓塞(VGE)。同樣，如果補(bǔ)體活化的發(fā)生是作為與心血管介入手術(shù)相關(guān)的內(nèi)腔創(chuàng)傷和異物炎癥反應(yīng)的結(jié)果，則認(rèn)為本發(fā)明的MASP-2抑制劑組合物還可以單獨(dú)或與其它再狹窄抑制劑組合，用于抑制支架放置后再狹窄、動(dòng)脈粥樣硬化斑旋切術(shù)后再狹窄和/或經(jīng)皮經(jīng)腔冠狀動(dòng)脈成形術(shù)(PTCA)后再狹窄，所述其它再狹窄抑制劑公開(kāi)于Demopulos的美國(guó)專(zhuān)利第6,492,332號(hào)。

可以通過(guò)動(dòng)脈內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、鞘內(nèi)、顱內(nèi)、皮下或其它胃腸外給藥給予受試者M(jìn)ASP-2，對(duì)于非肽能抑制劑可口服給予。為達(dá)到最佳治療效果，可按照醫(yī)師規(guī)定定期重復(fù)給藥。對(duì)于抑制再狹窄，可以在安置支架或者動(dòng)脈粥樣硬化斑切除術(shù)或者血管成形手術(shù)之前和/或期間和/或之后給予MASP-2抑制劑組合物。或者，可將MASP-2抑制劑組合物涂敷在支架上或摻入支架中。

胃腸疾病

潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病是炎性腸病(IBD)類(lèi)別下的慢性腸炎疾病。IBD的特征是未知起因自發(fā)發(fā)生的慢性復(fù)發(fā)性炎癥。盡管在人體和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物兩者中對(duì)該病都進(jìn)行了廣泛深入研究，但是確切的病理學(xué)機(jī)制仍有待闡明。然而，有研究認(rèn)為補(bǔ)體系統(tǒng)在IBD患者中被激活，而且認(rèn)為補(bǔ)體系統(tǒng)在疾病發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用(Kolios,G.等，Hepato-Gastroenterology 45:1601-9，1998；Elmgreen,J.，Dan.Med.Bull.33:222，1986)。

研究表明，在IBD患者的表層上皮細(xì)胞內(nèi)腔面(luminal face)以及粘膜肌層和粘膜下層血管中發(fā)現(xiàn)了C3b和其它活化的補(bǔ)體產(chǎn)物(Halstensen,T.S.等，Immunol.Res.10:485-92，1991；Halstensen,T.S.等，Gastroenterology 98:1264，1990)。此外，在炎性腸病中發(fā)現(xiàn)了特有的多形核細(xì)胞浸潤(rùn)，這通常是C5a產(chǎn)生的結(jié)果(Kohl,J.，Mol.Immunol.38:175，2001)。還有報(bào)道指出在小型臨床研究中(Kitano,A.等，Dis.Colon Rectum 35:560，1992)以及在角叉菜聚糖誘發(fā)的結(jié)腸炎兔模型中(Kitano,A.等，Clin.Exp.Immunol.94:348-53，1993)，多功能補(bǔ)體抑制劑K-76使?jié)冃越Y(jié)腸炎的癥狀得到改善。

已表明，一種新的人C5a受體拮抗劑保護(hù)大鼠IBD模型免于疾病病理(Woodruff，T.M.等，J.Immunol.171:5514-20，2003)。將遺傳上缺失衰變加速因子(DAF，一種膜補(bǔ)體調(diào)控蛋白)的小鼠用于IBD模型中，表明DAF缺乏導(dǎo)致明顯更多的組織損傷，而且促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生增加(Lin,F.等，J.Immunol.172:3836-41，2004)。因此，補(bǔ)體調(diào)控在腸穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)中十分重要，可能是參與IBD發(fā)生的主要發(fā)病機(jī)制。

因此，本發(fā)明提供用于抑制患有炎性胃腸疾病的受試者的MASP-2依賴(lài)性補(bǔ)體活化的方法，該方法通過(guò)給予患有這些疾病的患者包含治療有效量的MASP-2抑制劑在藥物載體中的組合物實(shí)施，所述胃腸疾病包括但不限于胰腺炎、憩室炎和腸病，包括克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎和過(guò)敏性腸綜合征?？赏ㄟ^(guò)動(dòng)脈內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、鞘內(nèi)、顱內(nèi)或其它胃腸外給藥來(lái)給予受試者M(jìn)ASP-2抑制劑，對(duì)于非肽能抑制劑可口服給予?？砂凑蔗t(yī)師的規(guī)定適當(dāng)?shù)囟ㄆ谥貜?fù)給藥以控制待治療疾病的癥狀。

肺部疾病

許多肺部炎性疾病的發(fā)病機(jī)制中涉及補(bǔ)體，所述疾病包括急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)(Ware，I.等，N.Engl.J.Med.342:1334-49，2000)；輸血相關(guān)性急性肺損傷(TRALI)(Seeger,W.等，Blood 76:1438-44，1990)；缺血/再灌注急性肺損傷(Xiao,F.等，J.Appl.Physiol.82:1459-65，1997)；慢性阻塞性肺病(COPD)(Marc,M.M.等，Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.(印刷前的電子出版物)，2004年3月23日)；哮喘(Krug,N.等，Am.J.Respir.Crit.Care Med.164:1841-43，2001)；韋格納肉芽腫病(Kalluri,R.等，J.Am.Soc.Nephrol.8:1795-800，1997)；和抗腎小球基底膜病(古德帕斯徹病)(Kondo,C.等，Clin.Exp.Immunol.124:323-9，2001)。

目前普遍接受的是，許多ARDS的病理生理學(xué)涉及炎癥級(jí)聯(lián)失調(diào)，這種炎癥級(jí)聯(lián)開(kāi)始是作為對(duì)感染或其它刺激性事件的正常反應(yīng)，但是最終引起了宿主顯著的自體損傷(Stanley,T.P.，Emerging Therapeutic Targets 2:1-16，1998)。ARDS患者幾乎全都顯示大范圍補(bǔ)體活化的證據(jù)(補(bǔ)體成分C3a和C5a的血漿水平升高)，補(bǔ)體活化的程度與ARDS的發(fā)生和結(jié)果有關(guān)(Hammerschmidt,D.F.等，Lancet 1:947-49，1980；Solomkin,J.S.等，J.Surgery97:668-78，1985)。

各種實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)表明補(bǔ)體活化在ARDS病理生理學(xué)中的作用。在動(dòng)物模型中，補(bǔ)體的系統(tǒng)活化導(dǎo)致急性肺損傷，其組織病理學(xué)與在人ARDS中發(fā)現(xiàn)的類(lèi)似(Till,G.O.等，Am.J.Pathol.129:44-53，1987；Ward,P.A.，Am.J.Pathol.149:1081-86，1996)。通過(guò)一般性補(bǔ)體耗竭或者通過(guò)特異性抑制C5a從而抑制補(bǔ)體級(jí)聯(lián)，為急性肺損傷動(dòng)物模型提供了保護(hù)作用(Mulligan,M.S.等，J.Clin.Invest.98:503-512，1996)。在大鼠模型中，sCR1在補(bǔ)體介導(dǎo)的肺損傷和嗜中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的肺損傷中具有保護(hù)作用(Mulligan,M.S.、Yeh等，J.Immunol.148:1479-85，1992)。此外，所有補(bǔ)體成分實(shí)際上都可通過(guò)II型肺泡細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞和肺成纖維細(xì)胞在肺中局部產(chǎn)生(Hetland,G.等，Scand.J.Immunol.24:603-8，1986；Rothman,B.I.等，J.Immunol.145:592-98，1990)。因此，補(bǔ)體級(jí)聯(lián)定位準(zhǔn)確從而顯著引起肺部炎癥，因此在ARDS中導(dǎo)致肺損傷。

哮喘本質(zhì)上是炎性疾病。變應(yīng)性哮喘最重要的特征包括對(duì)各種特異性和非特異性刺激的氣道高反應(yīng)性、氣道粘液過(guò)度產(chǎn)生、肺部嗜酸粒細(xì)胞增多以及血清IgE濃度升高。盡管哮喘的起因是多因子的，不過(guò)一般認(rèn)為，它是在遺傳易感個(gè)體中作為對(duì)普通環(huán)境抗原不當(dāng)免疫應(yīng)答的結(jié)果而產(chǎn)生的。文獻(xiàn)中大量記載了人哮喘性肺中補(bǔ)體系統(tǒng)被高度激活這一事實(shí)(Humbles,A.A.等，Nature 406:998-01，2002；van de Graf,E.A.等，J.Immunol.Methods147:241-50，1992)。此外，得自動(dòng)物模型和人體的最新的數(shù)據(jù)為補(bǔ)體活化是導(dǎo)致疾病發(fā)病機(jī)制的重要機(jī)制提供了證據(jù)(Karp,C.L.等，Nat.Immunol.1:221-26，2000；Bautsch,W.等，J.Immunol.165:5401-5，2000；Drouin,S.M.等，J.Immunol.169:5926-33，2 002；Walters,D.M.等，Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.27:413-18，2002)。使用慢性真菌性哮喘鼠模型的研究支持凝集素途徑在哮喘中的作用。在該哮喘模型中，甘露聚糖結(jié)合凝集素的遺傳缺陷型小鼠與正常動(dòng)物相比，氣道高反應(yīng)性發(fā)生改變(Hogaboam,C.M.等，J.Leukoc.Biol.75:805-14，2004)。

在哮喘中，可通過(guò)幾種途徑激活補(bǔ)體，包括：(a)作為變應(yīng)原-抗體復(fù)合物形成的結(jié)果通過(guò)經(jīng)典途徑而被活化；(b)變應(yīng)原表面上的替代途徑活化；(c)凝集素途徑通過(guò)變應(yīng)原上結(jié)合糖類(lèi)結(jié)構(gòu)而被活化；以及(d)通過(guò)從炎性細(xì)胞釋放出的蛋白酶切割C3和C5。盡管在哮喘中，還有很多有關(guān)由補(bǔ)體所起的復(fù)合物作用的方面尚待研究，但是鑒定變應(yīng)性哮喘發(fā)生中所涉及的補(bǔ)體活化途徑，可以為開(kāi)發(fā)這種日趨重要的疾病的新治療策略提供方向。

使用動(dòng)物模型的多項(xiàng)研究證實(shí)，C3及其裂解產(chǎn)物C3a在變應(yīng)型表型發(fā)生中的關(guān)鍵作用。Drouin及其同事在卵清蛋白(OVA)/煙曲霉(Aspergillus fumigatus)哮喘模型中使用了C3缺陷型小鼠(Drouin等，J.Immunol.167:4141-45，2001)。他們發(fā)現(xiàn)，C3缺陷型小鼠當(dāng)用變應(yīng)原攻擊時(shí)，與匹配的野生型對(duì)照小鼠相比，AHR和肺嗜酸粒細(xì)胞增多的減少。此外，這些C3缺陷型小鼠顯著地減少產(chǎn)生IL-4的細(xì)胞的數(shù)目，并且削弱Ag特異型IgE和IgG1應(yīng)答。Taube及其同事在OVA哮喘模型中，通過(guò)使用可溶性重組形式的小鼠補(bǔ)體受體Crry，在C3和C4水平阻斷補(bǔ)體活化方面，得到了類(lèi)似的結(jié)果(Taube等，Am.J.Respir.Crit.Care Med.168:1333-41，2003)。Humbles及其同事在小鼠中剔除了C3aR以檢查C3a在嗜酸性粒細(xì)胞功能中的作用(Humbles等，Nature406:998-1001，2000)。他們使用OVA哮喘模型，觀察到對(duì)于氣溶膠化乙酰甲基膽堿幾乎得到完全保護(hù)而不發(fā)生AHR。Drouin及其同事(2002)曾在OVA/煙曲霉哮喘模型中使用C3aR缺陷型小鼠，并且證實(shí)變應(yīng)性反應(yīng)的減弱與肺中AHR減輕、嗜酸性粒細(xì)胞募集、TH2細(xì)胞因子產(chǎn)生和粘液分泌減少以及Ag特異型IgE和IgG1應(yīng)答減弱的C3缺陷型動(dòng)物非常相似(Drouin等，J.Immunol.169:5926-33，2002)。Bautsch及其同事使用天然缺失C3aR的豚鼠品系進(jìn)行了研究(Bautsch等，J.Immunol.165:5401-05，2000)。他們使用OVA變應(yīng)性哮喘模型，觀察到在抗原攻擊后受到顯著保護(hù)而免于氣道支氣管收縮。

近來(lái)多項(xiàng)使用動(dòng)物模型的研究證實(shí)了C5及其裂解產(chǎn)物C5a在變應(yīng)型表型發(fā)生中的關(guān)鍵作用。Abe及其同事報(bào)道了C5aR活化與氣道炎癥、細(xì)胞因子產(chǎn)生和氣道反應(yīng)性相關(guān)的證據(jù)(Abe等，J.Immunol.167:4651-60，2001)。在他們的研究中，通過(guò)可溶性CR1、(補(bǔ)體活化抑制劑)futhan或合成的六肽C5a拮抗劑來(lái)抑制補(bǔ)體活化，阻斷了炎癥反應(yīng)和對(duì)乙酰甲基膽堿的氣道反應(yīng)性。在采用阻斷抗C5單克隆抗體的研究中，Peng及其同事發(fā)現(xiàn)在OVA哮喘模型中，C5活化基本上是造成氣道炎癥和AHR的原因(Peng等，J.Clin.Invest.115:1590-1600，2005)。Baelder及其同事同樣也報(bào)道了C5aR的阻斷基本上減輕了煙曲霉哮喘模型的AHR(Baelder等，J.Immunol.174:783-89，2005)。此外，C3aR和C5aR兩者的阻斷顯著減輕了氣道炎癥，如BAL中嗜中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)目減少所證實(shí)的一樣。

盡管以上羅列的研究突出了補(bǔ)體因子C3和C5及其裂解產(chǎn)物在實(shí)驗(yàn)性變應(yīng)性哮喘發(fā)病機(jī)制中的重要性，但是這些研究沒(méi)有提供有關(guān)三條補(bǔ)體活化途徑中每一條所起作用的資料，因?yàn)镃3和C5是所有三條活化途徑共有的。然而，Hogaboam及其同事的最新研究表明，凝集素途徑可能在哮喘發(fā)病機(jī)制中具有主要作用(Hogaboam等，J.Leukocytye Biol.75:805-814，2004)。這些研究使用甘露聚糖結(jié)合凝集素-A(MBL-A，一種起著凝集素補(bǔ)體途徑活化識(shí)別成分的作用的糖結(jié)合蛋白)遺傳缺陷型小鼠。在慢性真菌性哮喘模型中，在用煙曲霉分生孢子i.t.攻擊后的第4天和第48天，檢查MBL-A(+/+)和MBL-A(-/-)煙曲霉敏化小鼠。與敏化MBL-A(+/+)組相比，敏化MBL-A(-/-)小鼠在分生孢子攻擊后的兩個(gè)時(shí)間段上，AHR都顯著減緩。他們發(fā)現(xiàn)與野生型動(dòng)物組相比，煙曲霉敏化MBL-A(-/-)小鼠肺中的TH2細(xì)胞因子水平(IL-4、IL-5和IL-13)在分生孢子攻擊后第4天顯著降低。他們的結(jié)果表明，在慢性真菌性哮喘期間MBL-A和凝集素途徑在AHR的發(fā)生和持續(xù)中具有主要作用。

最新的特異性MBL多態(tài)性與哮喘發(fā)生之間相關(guān)性的臨床研究的結(jié)果進(jìn)一步為凝集素途徑可能在該病中起著重要病理作用提供了證據(jù)(Kaur等，Clin.Experimental Immunol.143:414-19，2006)。個(gè)體間MBL的血漿濃度變化很大，這主要?dú)w結(jié)于MBL基因內(nèi)的遺傳多態(tài)性。他們發(fā)現(xiàn)攜帶至少一個(gè)拷貝的使MBL表達(dá)上調(diào)2-4倍的特異性MBL多態(tài)性的個(gè)體，發(fā)生支氣管哮喘的風(fēng)險(xiǎn)增加了幾乎5倍。在攜帶該MBL多態(tài)性的支氣管哮喘患者中，這也是疾病嚴(yán)重性增強(qiáng)的標(biāo)志。

因此，本發(fā)明的一方面提供用于治療肺部疾病的方法，該方法通過(guò)將包含治療有效量的MASP-2抑制劑在藥物載體中的組合物給予患有肺部疾病的受試者實(shí)施，所述疾病包括但不限于急性呼吸窘迫綜合征、輸血相關(guān)性急性肺損傷、缺血/再灌注急性肺損傷、慢性阻塞性肺病、哮喘、韋格納肉芽腫病、抗腎小球基底膜病(古德帕斯徹病)、胎糞吸入綜合征、閉塞性細(xì)支氣管炎綜合征、特發(fā)性肺纖維化、燒傷繼發(fā)性急性肺損傷、非心源性肺水腫、輸血相關(guān)的呼吸抑制和肺氣腫?？梢匀硇越o予受試者M(jìn)ASP-2抑制劑，例如通過(guò)動(dòng)脈內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、吸入、經(jīng)鼻、皮下或者其它胃腸外給藥，或者對(duì)于非肽能藥物可通過(guò)口服給藥。MASP-2抑制劑組合物可以與一種或多種另外的治療藥物組合，另外的治療藥物包括抗炎藥、抗組胺藥、皮質(zhì)類(lèi)固醇或者抗微生物藥?？砂凑蔗t(yī)師規(guī)定重復(fù)給藥直到疾病消退。

體外循環(huán)

有許多醫(yī)學(xué)手術(shù)在其實(shí)施期間要從患者循環(huán)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移血液(體外循環(huán)系統(tǒng)或ECC)。這些手術(shù)包括血液透析法、血漿除去法、白細(xì)胞除去法、體外膜式氧合(ECMO)、肝素誘導(dǎo)的體外膜式氧合LDL沉淀(HELP)和心肺分流術(shù)(CPB)。這些手術(shù)將血液或血液產(chǎn)物暴露給可能改變正常細(xì)胞功能和止血的外源表面。在最早的研究中，Craddock等人鑒定出補(bǔ)體活化是血液透析期間粒細(xì)胞減少的可能原因(Craddock,P.R.等，N.Engl.J.Med.296:769-74，1977)。從1977年到現(xiàn)在，無(wú)數(shù)研究結(jié)果表明，進(jìn)行血液透析或CPB的患者所經(jīng)受的許多不良事件是由補(bǔ)體系統(tǒng)活化引起的(Chenoweth,D.E.，Ann.N.Y.Acad.Sci.516:306-313，1987；Hugli,TE，Complement 3:111-127，1986；Cheung,A.K.，J.Am.Soc.Nephrol.1:150-161，1990；Johnson,R.J.，Nephrol.Dial.Transplant 9:36-45 1994)。例如，已經(jīng)表明補(bǔ)體活化潛力是確定血液透析器與腎功能恢復(fù)、易感染性、肺功能障礙、腎衰竭患者的發(fā)病率和存活率方面的生物相容性的重要標(biāo)準(zhǔn)(Hakim,R.M.，Kidney Int.44:484-4946，1993)。

在很大程度上認(rèn)為，通過(guò)血液透析膜的補(bǔ)體活化是通過(guò)替代途徑機(jī)制而發(fā)生的，這是由于C4a產(chǎn)生很少(Kirklin,J.K.等，J.Thorac.Cardiovasc.Surg.86:845-57，1983；Vallhonrat,H.等，ASAIO J.45:113-4，1999)，但是最新研究提出可能還包括經(jīng)典途徑(Wachtfogel,Y.T.等，Blood 73:468-471，1989)。然而，對(duì)啟動(dòng)和控制人工表面(包括生物醫(yī)藥用聚合物)上補(bǔ)體活化的因素了解得仍然不夠。例如，已將用于血液透析中的銅仿膜(Cuprophan membrane)歸類(lèi)為非常有效的補(bǔ)體活化因子。盡管不希望受理論束縛，但是本發(fā)明的發(fā)明人還是推測(cè)這也許可部分通過(guò)其多糖性質(zhì)來(lái)解釋。在本專(zhuān)利中所鑒定的MASP-2依賴(lài)性補(bǔ)體活化系統(tǒng)提供了一種機(jī)制，由此凝集素途徑的活化便引發(fā)了替代途徑活化。

在CPB期間進(jìn)行ECC的患者遭受全身性炎癥反應(yīng)，這部分是由血液暴露于體外環(huán)路的人工表面而引起的，但也是由不依賴(lài)于表面的因素象外科創(chuàng)傷和缺血再灌注損傷引起的(Butler,J.等，Ann.Thorac.Surg.55:552-9，1993；Edmunds,L.H.，Ann.Thorac.Surg.66(增刊):S12-6，1998；Asimakopoulos,G.，Perfusion 14:269-77，1999)。CPB引發(fā)的炎癥反應(yīng)可能導(dǎo)致術(shù)后并發(fā)癥，一般稱(chēng)為“灌注后綜合征”。在這些術(shù)后事件中有認(rèn)知缺陷(Fitch,J.等，Circulation 100(25):2499-2506，1999)、呼吸衰竭、出血性疾病、腎功能障礙，最嚴(yán)重的情況下為多器官衰竭(Wan,S.等，Chest 112:676-692，1997)。與沒(méi)有CPB但是有相應(yīng)程度外科創(chuàng)傷的手術(shù)相比，有CPB的冠狀旁路手術(shù)導(dǎo)致了更多的補(bǔ)體活化(E.Fosse，1987)。因此，這些CPB相關(guān)問(wèn)題主要的疑似因素是旁路手術(shù)期間的補(bǔ)體活化不當(dāng)(Chenoweth,K.等，N.Engl.J.Med.304:497-503，1981；Haslam.P等，Anaesthesia 25:22-26，1980；J.K.Kirklin等，J.Thorac.Cardiovasc.Surg.86:845-857，1983；Moore,F.D.等，Ann.Surg 208:95-103，1988；Steinberg.J等，J.Thorac.Cardiovasc.Surg 106:1901-1918，1993)。在CPB環(huán)路中，替代補(bǔ)體途徑在補(bǔ)體活化中發(fā)揮了主要作用，這是血液與CPB環(huán)路人工表面之間相互作用的結(jié)果(Kirklin,J.K.等，J.Thorac.Cardiovasc.Surg.，86:845-57，1983；Kirklin,J.K.等，Ann.Thorac.Surg.41:193-199，1986；Vallhonrat H.等，ASAIO J.45:113-4，1999)。然而，也有證據(jù)表明CPB期間經(jīng)典補(bǔ)體途徑被激活(Wachtfogel,Y.T.等，Blood 73:468-471，1989)。

主要的炎癥物質(zhì)是在補(bǔ)體系統(tǒng)活化后產(chǎn)生的，包括過(guò)敏毒素C3a和C5a、調(diào)理素C3b和膜攻擊復(fù)合物C5b-9。C3a和C5a是嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和血小板的有效刺激物(Haeffner-Cavaillon,N.等，J.Immunol.,139:794-9，1987；Fletcher,M.P.等，Am.J.Physiol.265:H1750-61，1993；Rinder,C.S.等，J.Clin.Invest.96:1564-72，1995；Rinder,C.S.等，Circulation 100:553-8，1999)。這些細(xì)胞的活化導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子(IL-1、IL-6、IL-8、TNFα)、氧自由基和蛋白酶的釋放(Schindler,R.等，Blood 76:1631-8，1990；Cruickshank,A.M.等，Clin Sci.(Lond)79:161-5，1990；Kawamura,T.等，Can.J.Anaesth.40:1016-21，1993；Steinberg,J.B.等，J.Thorac.Cardiovasc.Surg.106:1008-1，1993；Finn,A.等，J.Thorac.Cardiovasc.Surg.105:234-41，1993；Ashraf,S.S.等，J.Cardiothorac.Vasc.Anesth.11:718-22，1997)。已經(jīng)表明C5a使多形核細(xì)胞(PMN)中Mac-1的粘著分子CD11b和CD18上調(diào)，并誘導(dǎo)PMN脫粒以釋放促炎酶(Rinder,C.等，Cardiovasc Pharmacol.27(增刊1):S6-12，1996；Evangelista,V.等，Blood 93:876-85，1999；Kinkade，J.M.，Jr.等，Biochem.Biophys.Res.Commun.114:296-303，1983；Lamb，N.J.等，Crit.Care Med.27:1738-44，1999；Fujie,K.等，Eur.J.Pharmacol.374:117-25，1999)。C5b-9誘導(dǎo)血小板上的粘著分子P選擇蛋白(CD62P)的表達(dá)(Rinde,C.S.等，J.Thorac.Cardiovasc.Surg.118:460-6，1999)，而C5a和C5b-9兩者都誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞上P選擇蛋白的表面表達(dá)(Foreman,K.E.等，J.Clin.Invest.94:1147-55，1994)。這些粘著分子參與白細(xì)胞、血小板和內(nèi)皮細(xì)胞之間的相互作用。粘著分子在活化內(nèi)皮細(xì)胞上的表達(dá)是活化白細(xì)胞匯集的原因，然后介導(dǎo)組織炎癥和損傷(Evangelista,V.，Blood 1999；Foreman,K.E.，J.Clin.Invest.1994；Lentsch,A.B.等，J.Pathol.190:343-8，2000)。正是這些補(bǔ)體活化產(chǎn)物對(duì)嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、血小板和其它循環(huán)細(xì)胞的作用才可能導(dǎo)致在CPB后出現(xiàn)各種問(wèn)題。

正在研究若干補(bǔ)體抑制劑在CPB中的潛在應(yīng)用。它們包括可溶性重組補(bǔ)體受體1(sCR1)(Chai,P.J.等，Circulation 101:541-6，2000)、人源化單鏈抗C5抗體(h5G1.1-scFv或培克珠單抗)(Fitch,J.C.K.等，Circulation 100:3499-506，1999)、人膜輔因子蛋白和人衰變加速因子的重組融合雜合體(CAB-2)(Rinde,C.S.等，Circulation 100:553-8，1999)、13個(gè)殘基的C3結(jié)合環(huán)肽(Compstatin)(Nilsson,B.等，Blood 92:1661-7，1998)和抗D因子MoAb(Fung,M.等，J.Thoracic Cardiovasc.Surg.122:113-22，2001)。SCR1和CAB-2在C3和C5活化步驟抑制經(jīng)典和替代補(bǔ)體途徑。Compstatin在C3活化步驟抑制兩條補(bǔ)體途徑，而h5G1.1-scFv僅在C5活化步驟抑制兩條補(bǔ)體途徑?？笵因子MoAb在C3和C5活化步驟抑制替代途徑。然而，這些補(bǔ)體抑制劑都不會(huì)特異性抑制本專(zhuān)利所鑒定的MASP-2依賴(lài)性補(bǔ)體活化系統(tǒng)。

已經(jīng)報(bào)道了大有希望的III期臨床研究的結(jié)果，研究人源化單鏈抗C5抗體(h5G1.1-scFv，培克珠單抗(pexelizu mab))在降低圍手術(shù)期MI和冠狀動(dòng)脈旁路移植(CABG)手術(shù)死亡率中的功效和安全性(Verrie,E.D.等，JAMA 291:2319-27，2004)。與安慰劑相比，培克珠單抗(pexelizu mab)與已實(shí)施CABG手術(shù)的2746名患者中的最終死亡或MI混合風(fēng)險(xiǎn)的顯著降低沒(méi)有關(guān)聯(lián)。然而，在進(jìn)行包括或不包括瓣膜手術(shù)的CABG手術(shù)的所有3099名患者中，術(shù)后30天有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著降低。由于培克珠單抗(pexelizu mab)在C5活化步驟抑制C5a和sC5b-9的產(chǎn)生，但是對(duì)其它兩種有效的補(bǔ)體炎性物質(zhì)C3a和調(diào)理素C3b的產(chǎn)生沒(méi)有影響，亦知C3a和C3b是CPB引發(fā)的炎癥反應(yīng)的原因。

因此，本發(fā)明的一個(gè)方面涉及通過(guò)應(yīng)用包含治療有效量的MASP-2抑制劑在藥物載體中的組合物來(lái)治療進(jìn)行體外循環(huán)手術(shù)的受試者，從而預(yù)防或治療體外暴露所引發(fā)的炎癥反應(yīng)，所述受試者包括進(jìn)行血液透析、血漿除去法、白細(xì)胞除去法、體外膜式氧合(ECMO)、肝素誘導(dǎo)的體外膜式氧合LDL沉淀(HELP)和心肺分流術(shù)(CPB)的患者。認(rèn)為按照本發(fā)明方法的MASP-2抑制劑治療可用于降低或預(yù)防有時(shí)由CPB手術(shù)引起的認(rèn)知功能障礙?？稍谑中g(shù)之前和/或手術(shù)之中和/或手術(shù)之后，通過(guò)例如動(dòng)脈內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下或其它胃腸外給藥給予受試者M(jìn)ASP-2抑制劑?；蛘?，可在體外循環(huán)期間將MASP-2抑制劑引入受試者血流中，例如通過(guò)將MASP-2抑制劑注射到血液通過(guò)或流過(guò)其進(jìn)行循環(huán)的管或膜中，或者通過(guò)使血液與涂敷有MASP-2抑制劑的表面例如管、膜的內(nèi)壁或其它表面如CPB裝置相接觸。

炎性關(guān)節(jié)炎和非炎性關(guān)節(jié)炎以及其它肌肉骨骼疾病

各種各樣的風(fēng)濕性疾病的發(fā)病機(jī)制中涉及補(bǔ)體系統(tǒng)的活化；包括類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Linton,S.M.等，Molec.Immunol.36:905-14，1999)、青少年類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Mollnes,T.E.等，Arthritis Rheum.29:1359-64，1986)、骨關(guān)節(jié)炎(Kemp,P.A.等，J.Clin.Lab.Immunol.37:147-62，1992)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)(Molina,H.，Current Opinion in Rheumatol.14:492-497，2002)、貝赫切特綜合征(Behcet's syndrome)(Rumfeld,W.R.等，Br.J.Rheumatol.25:266-70，1986)和斯耶格倫綜合征(Sjogren's syndrome)(Sanders,M.E.等，J.Immunol.138:2095-9，1987)。

很有說(shuō)服力的證據(jù)表明，免疫復(fù)合物引發(fā)的補(bǔ)體活化是造成類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)組織損傷的主要病理機(jī)制。許多出版物記載了RA患者血漿中補(bǔ)體活化產(chǎn)物增加(Morgan,B.P.等，Clin.Exp.Immunol,73:473-478，1988；Auda,G.等，Rheumatol.Int.10:185-189，1990；Rumfeld,W.R.等，Br.J.Rheumatol.25:266-270，1986)。還在發(fā)炎的風(fēng)濕性關(guān)節(jié)中發(fā)現(xiàn)了如C3a、C5a和sC5b-9的補(bǔ)體活化產(chǎn)物，并且已經(jīng)確定補(bǔ)體活化程度和RA嚴(yán)重性之間正相關(guān)(Makinde，V.A.等，Ann.Rheum.Dis.48:302-306，1989；Brodeu,J.P.等，Arthritis Rheumatism34:1531-1537，1991)。在成人和青少年類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中，替代途徑補(bǔ)體活化產(chǎn)物Bb的血清和滑液水平比C4d(經(jīng)典途徑活化的標(biāo)記)的高，表明補(bǔ)體活化主要是由替代途徑介導(dǎo)的(El-Ghobarey,A.F.等，J.Rheumatology 7:453-460，1980；Agarwal,A.等，Rheumatology39:189-192，2000)。補(bǔ)體活化產(chǎn)物可直接損傷組織(通過(guò)C5b-9)或者經(jīng)過(guò)敏毒素C3a和C5a募集炎性細(xì)胞而間接介導(dǎo)炎癥。

實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎的動(dòng)物模型已被廣泛用來(lái)研究補(bǔ)體在RA發(fā)病機(jī)制中的作用。在RA動(dòng)物模型中，通過(guò)眼鏡蛇毒因子耗盡補(bǔ)體防止了關(guān)節(jié)炎的發(fā)生(Morgan,K.等，Arthritis Rheumat.24:1356-1362，1981；Van Lent,P.L.等，Am.J.Pathol.140:1451-1461，1992)。將可溶形式的補(bǔ)體受體1(sCR1，一種補(bǔ)體抑制劑)注射到關(guān)節(jié)內(nèi)，抑制了RA大鼠模型中的炎癥(Goodfellow，R.M.等，Clin.Exp.Immunol.110:45-52，1997)。此外，sCR1抑制大鼠膠原誘發(fā)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和進(jìn)程(Goodfellow，R.M.等，Clin Exp.Immunol.119:210-216，2000)?？扇苄訡R1在替代途徑和經(jīng)典途徑的C3和C5活化步驟抑制經(jīng)典和替代補(bǔ)體途徑，從而抑制C3a、C5a和sC5b-9的產(chǎn)生。

1970年代后期，認(rèn)識(shí)到用異種II型膠原(CII；人關(guān)節(jié)軟骨的主要膠原成分)免疫嚙齒動(dòng)物導(dǎo)致十分類(lèi)似于人RA的自身免疫性關(guān)節(jié)炎(膠原誘發(fā)性關(guān)節(jié)炎，或者CIA)的發(fā)生(Courtenay,J.S.等，Nature 283:666-68，1980；Banda等，J.of Immunol.171:2109-2115(2003))。在易感動(dòng)物中，自身免疫應(yīng)答涉及各因素的復(fù)雜組合，包括特定的主要組織相容性復(fù)合物(MHC)分子、細(xì)胞因子和CII特異性的B細(xì)胞和T細(xì)胞應(yīng)答(有關(guān)綜述見(jiàn)Myers,L.K.等，Life Sciences 61:1861-78，1997)。幾乎40％的近交系小鼠的補(bǔ)體成分C5完全缺乏的觀察結(jié)果(Cinade,B.等，J.Exp.Med.120:897-902，1964)，為通過(guò)對(duì)C5缺陷型與C5充足型品系之間進(jìn)行CIA比較從而研究補(bǔ)體在該關(guān)節(jié)炎模型中的作用提供了間接的機(jī)會(huì)。這些研究結(jié)果表明，足夠的C5絕對(duì)是CIA發(fā)生所必需的(Watson等，1987；Wang,Y.等，J.Immunol.164:4340-4347，2000)。通過(guò)使用抗C5單克隆抗體(MoAb)還為C5和補(bǔ)體在RA中的重要性提供了進(jìn)一步的證據(jù)。在鼠CIA模型中經(jīng)腹膜內(nèi)預(yù)防性給予抗C5MoAb幾乎完全防止了疾病的發(fā)生，而在活動(dòng)性關(guān)節(jié)炎期間的治療則產(chǎn)生顯著的臨床益處和更輕微的組織學(xué)疾病(Wang,Y.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:8955-59，1995)。

通過(guò)使用最近開(kāi)發(fā)出的一種炎性關(guān)節(jié)炎模型K/BxN T細(xì)胞受體轉(zhuǎn)基因小鼠的研究，提供了關(guān)于補(bǔ)體活化在疾病發(fā)病機(jī)制中的潛在作用的更深入的認(rèn)識(shí)(Korganow，A.S.等，Immunity 10:451-461，1999)。所有K/BxN動(dòng)物都自發(fā)產(chǎn)生自身免疫性疾病，該病具有人RA的大多數(shù)(盡管不是全部)臨床、組織學(xué)和免疫學(xué)特征。此外，將患關(guān)節(jié)炎的K/BxN小鼠的血清轉(zhuǎn)移到健康動(dòng)物中，通過(guò)關(guān)節(jié)炎形成免疫球蛋白(arthritogenic immunoglobulin)的轉(zhuǎn)移在幾天之內(nèi)便引起關(guān)節(jié)炎。為了鑒定疾病發(fā)生所需要的特定補(bǔ)體活化步驟，將關(guān)節(jié)炎K/BxN小鼠的血清轉(zhuǎn)移到各種遺傳上缺失特定補(bǔ)體途徑產(chǎn)物的小鼠中(Ji,H.等，Immunity 16:157-68，2002)。有趣的是，研究結(jié)果證明替代途徑活化是至關(guān)重要，而經(jīng)典途徑活化則可有可無(wú)。此外，C5a的形成至關(guān)重要，因?yàn)镃5缺陷型小鼠和C5aR缺陷型小鼠均受到保護(hù)免于發(fā)病。與這些結(jié)果相一致的是，以前的研究曾報(bào)道了C5a受體表達(dá)的遺傳缺失保護(hù)小鼠不患關(guān)節(jié)炎(Grant,E.P.等，J.Exp.Med.196:1461-1471，2002)。

美國(guó)康涅狄格州紐黑文市的Alexion Pharmaceuticals公司正在開(kāi)發(fā)防止人補(bǔ)體成分C5裂解成其促炎成分的人源化抗C5MoAb(5G1.1)，作為RA的潛在治療方法。

兩個(gè)研究小組獨(dú)立地提出，凝集素途徑通過(guò)MBL與特異性IgG糖形(glycoform)的相互作用促進(jìn)RA患者的炎癥(Malhotra等，Nat.Med.1:237-243，1995；Cuchacovich等，J.Rheumatol.23:44-51，1996)。RA與分子的Fc區(qū)缺乏半乳糖的IgG糖形(稱(chēng)作IgG0糖形)的顯著增加有關(guān)(Rudd等，Trends Biotechnology 22:524-30，2004)。IgG0糖形的百分比隨疾病進(jìn)程而增加，并且當(dāng)患者進(jìn)入緩解期時(shí)回復(fù)到正常。在患RA的個(gè)體中，IgG0體內(nèi)沉積在滑膜組織上，MBL則以高水平存在于滑液中。聚集在與RA有關(guān)的成簇IgG上的無(wú)半乳糖IgG(IgG0)，可以與甘露糖結(jié)合凝集素(MBL)結(jié)合并激活補(bǔ)體的凝集素途徑。此外，著眼于RA患者中的MBL等位變體的最新臨床研究的結(jié)果表明，MBL在該病中可具有促炎作用(Garred等，J.Rheumatol.27:26-34，2000)。因此，凝集素途徑在RA發(fā)病機(jī)制中可具有重要作用。

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是一種病因不明的自身免疫性疾病，它導(dǎo)致產(chǎn)生自身抗體、形成循環(huán)免疫復(fù)合物以及暫時(shí)不受控制地激活補(bǔ)體系統(tǒng)。盡管SLE中自身免疫性的起因仍然令人困惑，但是現(xiàn)在有相當(dāng)多的資料表明補(bǔ)體活化是造成該病血管損傷的重要機(jī)制(Abramson,S.B.等，Hospital Practice 33:107-122，1998)。該病中涉及補(bǔ)體的經(jīng)典途徑和替代途徑兩者的活化，C4d和Bb都是中度至嚴(yán)重狼瘡疾病活性的敏感標(biāo)志(Manzi,S.等，Arthrit.Rheumat.39:1178-1188，1996)。妊娠期間替代補(bǔ)體途徑的活化伴有系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病突發(fā)(Buyon,J.P.等，Arthritis Rheum.35:55-61，1992)。此外，凝集素途徑可能也是引起疾病發(fā)生的原因，因?yàn)樽罱赟LE患者的血清中鑒定出針對(duì)MBL的自身抗體(Seelen,M.A.等，Clin Exp.Immunol.134:335-343，2003)。

認(rèn)為通過(guò)經(jīng)典途徑的免疫復(fù)合物介導(dǎo)的補(bǔ)體活化是SLE患者中發(fā)生組織損傷的一種機(jī)制。然而，經(jīng)典途徑補(bǔ)體成分在遺傳上的缺乏增加了狼瘡和狼瘡樣疾病的風(fēng)險(xiǎn)(Pickering,M.C.等，Adv.Immunol.76:227-324，2000)。80％以上發(fā)生SLE或相關(guān)綜合征的人完全缺乏C1q、C1r/C1s、C4或C3。這表示狼瘡中協(xié)調(diào)補(bǔ)體有害效應(yīng)與保護(hù)性效應(yīng)時(shí)存在明顯的相互矛盾。

經(jīng)典途徑的重要活性似乎是促進(jìn)免疫復(fù)合物通過(guò)單核吞噬系統(tǒng)而從循環(huán)和組織中去除(Kohler,P.F.等，Am.J.Med.56:406-11，1974)。此外，最近發(fā)現(xiàn)在凋亡小體的去除和處理中具有重要作用的補(bǔ)體(Mevorarch,D.等，J.Exp.Med.188:2313-2320，1998)。經(jīng)典途徑功能的缺乏可能使得形成一種循環(huán)使得受試者容易發(fā)生SLE，在這種循環(huán)中，免疫復(fù)合物或凋亡細(xì)胞在組織中累積，引起炎癥并釋放自身抗原，繼而又刺激自身抗體和更多免疫復(fù)合物的產(chǎn)生，從而引起自身免疫應(yīng)答(Botto,M.等，Nat.Genet.19:56-59，1998；Botto,M.，ArthritisRes.3:201-10，2001)。然而，經(jīng)典途徑成分的這種“完全”缺乏狀態(tài)只存在于大約百分之一的SLE患者中。因此，在絕大多數(shù)SLE患者中，經(jīng)典途徑成分的完全缺乏并不對(duì)疾病病因產(chǎn)生影響，補(bǔ)體活化可能是導(dǎo)致SLE發(fā)病機(jī)制的重要機(jī)制。很少有遺傳上永久缺失經(jīng)典途徑成分的個(gè)體經(jīng)常在他們生命中的某個(gè)時(shí)間發(fā)生SLE，這一事實(shí)證明冗余機(jī)制能夠引起疾病。

SLE動(dòng)物模型的結(jié)果支持補(bǔ)體活化在疾病發(fā)病機(jī)制中的重要作用。使用阻斷抗C5MoAb來(lái)抑制C5活化，減輕了SLE小鼠模型NZB/NZW F1小鼠的蛋白尿和腎病(Wang Y.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:8563-8，1996)。此外，與未治療對(duì)照相比，用抗C5MoAb治療植入抗DNA抗體分泌細(xì)胞的患有嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷病的小鼠，導(dǎo)致了蛋白尿和腎組織學(xué)圖像的改善，并伴有存活率相關(guān)益處(Ravirajan,C.T.等，Rheumatology 43:442-7，2004)。替代途徑也在SLE的自身免疫性疾病表現(xiàn)上具有重要作用，因?yàn)閷因子缺陷型小鼠與SLE的MRL/lpr模型回交時(shí)，顯示缺乏B因子減輕了血管炎、腎小球病，降低了常見(jiàn)于這種模型的C3消耗和IgG3RF水平，而不改變其它自身抗體水平(Watanabe，H.等，J.Immunol.164:786-794，2000)。作為SLE潛在治療手段的人源化抗C5MoAb正在研究之中。這種抗體防止將C5裂解成C5a和C5b。在I期臨床試驗(yàn)中，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重不利作用，為了確定其在SLE中的功效，更多的人體試驗(yàn)正在進(jìn)行之中(Strand,V.，Lupus 10:216-221，2001)。

人和動(dòng)物研究的結(jié)果都支持補(bǔ)體系統(tǒng)是直接引起肌營(yíng)養(yǎng)不良發(fā)病機(jī)制的原因的可能性。人營(yíng)養(yǎng)不良肌活檢樣品(dystrophic biopsies)的研究表明，C3和C9沉積在營(yíng)養(yǎng)不良肌肉壞死和未壞死的纖維上(Cornelio和Dones，Ann.Neurol.16:694-701，1984；Spuler和Engel,A.G.，Neurology50:41-46，1998)。Porter及其同事采用DNA微陣列方法，觀察到在符合營(yíng)養(yǎng)不良疾病發(fā)生的肌養(yǎng)蛋白缺陷型(mdx)小鼠中，多數(shù)補(bǔ)體相關(guān)的mRNA的基因表達(dá)顯著增加(Porter等，Hum.Mol.Genet.77:263-72，2002)。

人dysferlin(一種跨膜肌肉蛋白)編碼基因的突變，已被鑒定為兩種形式的骨骼肌肉疾病，即肢帶肌營(yíng)養(yǎng)不良(LGMD)和Miyoshi肌病的主要風(fēng)險(xiǎn)因素(Liu等，Nat.Genet.20:31-6，1998)。已經(jīng)研發(fā)出幾個(gè)具有dysferlin突變的小鼠模型，并且它們還發(fā)生進(jìn)行性肌營(yíng)養(yǎng)不良。已經(jīng)在一些LGMD患者的未壞死肌肉纖維表面上鑒定出補(bǔ)體級(jí)聯(lián)的活化(Spuler和Engel.，Neurology50:41-46，1998)。在近期的研究中，Wenzel及其同事證實(shí)，鼠和人缺乏dysferlin的肌肉纖維均缺乏補(bǔ)體抑制因子CD33/DAF，該抑制因子是一種特異性C5b-9MAC(膜攻擊復(fù)合物)抑制劑(Wenzel等，J.Immunol.175:6219-25，2005)。因而，缺乏dysferlin的未壞死肌肉細(xì)胞更易受補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞裂解的影響。Wenzel及其同事提出，骨骼肌肉細(xì)胞的補(bǔ)體介導(dǎo)的裂解可能是參與在患者中發(fā)生LGMD和Miyoshi肌病的主要病理機(jī)制。Connolly及其同事研究了補(bǔ)體C3在嚴(yán)重先天性營(yíng)養(yǎng)不良模型dy-l-小鼠的發(fā)病機(jī)制中的作用，該小鼠缺乏層粘連蛋白α2(Connolly等，J.Neuroimmunol.127:80-7，2002)。他們開(kāi)發(fā)出遺傳上缺乏C3和層粘連蛋白α2兩者的動(dòng)物，并且發(fā)現(xiàn)缺乏C3延長(zhǎng)了肌營(yíng)養(yǎng)不良的dy-l-模型的存活。此外，雙敲除(C3-l-，dy-l-)小鼠比dy-l-小鼠表現(xiàn)出更強(qiáng)的肌肉力量。該項(xiàng)研究表明，補(bǔ)體系統(tǒng)可能直接促成先天性營(yíng)養(yǎng)不良這種形式的發(fā)病機(jī)制。

因此，本發(fā)明的一個(gè)方面涉及通過(guò)將包含治療有效量的MASP-2抑制劑在藥物載體中的組合物給予患有炎性和非炎性關(guān)節(jié)炎以及其它肌肉骨骼疾病的受試者來(lái)預(yù)防或治療這些疾病，所述疾病包括但不限于骨關(guān)節(jié)炎、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、青少年類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)、神經(jīng)病性關(guān)節(jié)病、銀屑病性關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)強(qiáng)硬性脊椎炎或其它脊椎關(guān)節(jié)病以及結(jié)晶性關(guān)節(jié)病、肌營(yíng)養(yǎng)不良或系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)?？梢匀硇越o予受試者M(jìn)ASP-2抑制劑，例如通過(guò)動(dòng)脈內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下或其它胃腸外給藥，或者對(duì)于非肽能藥物可通過(guò)口服給藥?；蛘?，可通過(guò)局部遞藥，例如通過(guò)關(guān)節(jié)內(nèi)注射。可以在一段長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)定期給予MASP-2抑制劑，以治療或控制慢性病，或者可以在包括進(jìn)行關(guān)節(jié)外科手術(shù)在內(nèi)的急性創(chuàng)傷或損傷之前、期間和/或之后的一段時(shí)間單次或重復(fù)給藥。

腎疾病

各種各樣的腎疾病的發(fā)病機(jī)制中涉及補(bǔ)體系統(tǒng)的活化，包括腎小球系膜增生性腎小球腎炎(IgA腎病、貝惹病(Berger's disease))(Endo,M.等，Clin.Nephrology55:185-191，2001)、膜性腎小球腎炎(Kerjashki,D.，Arch B Cell Pathol.58:253-71，1990；Brenchley,P.E.等，Kidney Int.，41:933-7，1992；Salant,D.J.等，Kidney Int.35:976-84，1989)、膜增生性腎小球腎炎(腎小球系膜毛細(xì)血管性腎小球腎炎)(Bartlow，B.G.等，Kidney Int.15:294-300，1979；Meri,S.等，J.Exp.Med.175:939-50，1992)、急性感染后腎小球腎炎(鏈球菌感染后腎小球腎炎)、冷球蛋白血癥性腎小球腎炎(Ohsawa,I.等，Clin Immunol.101:59-66，2001)、狼瘡腎炎(Gatenby,P.A.，Autoimmunity 11:61-6，1991)和亨諾赫–舍恩萊因紫癜腎炎(Endo,M.等，Am.J.Kidney Dis.35:401-407，2000)。對(duì)腎疾病中所涉及的補(bǔ)體的認(rèn)識(shí)已有幾十年，但是有關(guān)它在腎疾病的發(fā)作、進(jìn)展和消退期的確切作用仍存在較多爭(zhēng)議。在正常條件下，補(bǔ)體的影響對(duì)宿主是有利的，但是補(bǔ)體的不當(dāng)活化和沉積可能引起組織損傷。

有充分的證據(jù)表明，腎小球炎癥即腎小球腎炎常常是由于免疫復(fù)合物沉積在腎小球或腎小管結(jié)構(gòu)上引發(fā)的，繼而又引發(fā)了補(bǔ)體活化、炎癥和組織損傷。Kahn和Sinniah證實(shí)，取自各種形式腎小球腎炎患者的活檢組織的腎小管基底膜上，C5b-9的沉積增加(Kahn,T.N.等，Histopath.26:351-6，1995)。在IgA腎病患者的研究中(Alexopoulos,A.等，Nephrol.Dial.Transplant 10:1166-1172，1995)，C5b-9在腎小管上皮/基底膜結(jié)構(gòu)上的沉積與血漿肌酸酐水平相關(guān)。另一項(xiàng)膜性腎病的研究證實(shí)了臨床結(jié)果與尿sC5b-9水平之間的關(guān)系(Kon,S.P.等，Kidney Int.48:1953-58，1995)。sC5b-9水平升高與預(yù)后不良呈正相關(guān)。Lehto等人測(cè)得膜性腎小球腎炎患者尿中CD59以及C5b-9水平升高(Lehto,T.等，Kidney Int.47:1403-11，1995)，CD59是一種抑制質(zhì)膜中膜攻擊復(fù)合物的補(bǔ)體調(diào)節(jié)因子。取自這些相同患者的活檢組織樣品的組織病理學(xué)分析證實(shí)，C3和C9蛋白在腎小球中沉積，而C59在這些組織中的表達(dá)比正常腎組織的表達(dá)減少。這些不同的研究表明，正在發(fā)生補(bǔ)體介導(dǎo)的腎小球腎炎導(dǎo)致尿中排泄出補(bǔ)體蛋白，這與組織損傷程度和疾病預(yù)后的程度相互關(guān)聯(lián)。

抑制各種腎小球腎炎動(dòng)物模型的補(bǔ)體活化也證實(shí)了該病病因中補(bǔ)體活化的重要性。在膜增生性腎小球腎炎(MPGN)模型中，C6缺陷型大鼠(不能形成C5b-9)中輸注抗Thy1抗血清導(dǎo)致腎小球細(xì)胞增殖減少90％，血小板和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)降低80％，IV型膠原合成減少(腎小球基質(zhì)擴(kuò)展的標(biāo)志)以及蛋白尿比C6+正常大鼠的少50％(Brandt,J.等，Kidney Int.49:335-343，1996)。這些結(jié)果表明在這種大鼠抗胸腺細(xì)胞血清模型中，C5b-9是補(bǔ)體導(dǎo)致的組織損傷的主要介質(zhì)。在另一種腎小球腎炎模型中，輸注分級(jí)劑量的兔抗大鼠腎小球基底膜，產(chǎn)生了多形核白細(xì)胞(PMN)劑量依賴(lài)性地流入，這種多形核白細(xì)胞流入通過(guò)預(yù)先用眼鏡蛇毒因子處理(消耗補(bǔ)體)而被減弱(Scandrett,A.L.等，Am.J.Physiol.268:F256-F265，1995)。眼鏡蛇毒因子處理的大鼠也顯示出組織病理減輕、長(zhǎng)期蛋白尿減少以及肌酸酐水平比對(duì)照大鼠的降低。Couser等人采用三種GN大鼠模型(抗胸腺細(xì)胞血清、Con A抗Con A和被動(dòng)性海曼腎炎(passive Heymann nephritis))，證實(shí)使用重組sCR1蛋白抑制補(bǔ)體這類(lèi)方法的潛在治療功效(Couse,W.G.等，J.Am.Soc.Nephrol.5:1888-94，1995)。比起對(duì)照大鼠，用sCR1處理的大鼠則出現(xiàn)PMN、血小板和巨噬細(xì)胞流入顯著減少、腎小球系膜裂解(mesangiolysis)和蛋白尿減少。通過(guò)在NZB/W F1小鼠模型中使用抗C5MoAb，為補(bǔ)體活化在腎小球腎炎中的重要性提供了進(jìn)一步的證據(jù)?？笴5MoAb抑制C5的裂解，從而阻斷C5a和C5b-9的產(chǎn)生。用抗C5MoAb連續(xù)治療6個(gè)月，導(dǎo)致腎小球腎炎進(jìn)程顯著改善。美國(guó)康涅狄格州紐黑文市的Alexion Pharmaceuticals公司正在開(kāi)發(fā)一種防止人補(bǔ)體成分C5裂解成其促炎成分的人源化抗C5MoAb單克隆抗體(5G1.1)，作為腎小球腎炎潛在的治療方法。

通過(guò)對(duì)遺傳上缺失特定補(bǔ)體成分的患者的研究，為補(bǔ)體在腎臟損傷中的病理學(xué)作用提供了直接證據(jù)。許多報(bào)道證明了腎疾病與補(bǔ)體調(diào)節(jié)因子H缺乏有關(guān)(Ault,B.H.，Nephrol.14:1045-1053，2000；Levy,M.等，Kidney Int.30:949-56，1986；Pickering,M.C.等，Nat.Genet.31:424-8，2002)。H因子的缺乏導(dǎo)致B因子和C3的低血漿水平以及C5b-9的消耗。非典型性膜增生性腎小球腎炎(MPGN)和特發(fā)性溶血性尿毒癥綜合征(HUS)都與H因子的缺乏有關(guān)。H因子缺陷型豬(Jansen,J.H.等，Kidney Int.53:331-49，1998)和H因子敲除小鼠(Pickering,M.C.，2002)都表現(xiàn)出MPGN樣癥狀，這就證實(shí)了H因子在補(bǔ)體調(diào)節(jié)中的重要性。其它補(bǔ)體成分的缺乏與系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)發(fā)生后的繼發(fā)性腎病有關(guān)(Walport,M.J.，Davies等，Ann.N.Y.Acad.Sci.815:267-81，1997)。C1q、C4和C2的缺乏使得非常容易通過(guò)與缺乏清除免疫復(fù)合物和凋亡物質(zhì)有關(guān)的機(jī)制而發(fā)生SLE。在這些SLE患者中許多發(fā)生了狼瘡腎炎，其特征在于免疫復(fù)合物沉積在整個(gè)腎小球中。

通過(guò)鑒定患者體內(nèi)針對(duì)補(bǔ)體成分的自身抗體(其中一些與腎疾病直接相關(guān))，為補(bǔ)體活化與腎疾病關(guān)聯(lián)提供了進(jìn)一步的證據(jù)(Trouw，L.A.等，Mol.Immunol.38:199-206，2001)。這些自身抗體的許多種與腎疾病的關(guān)聯(lián)性如此高，以致于引入了術(shù)語(yǔ)腎炎因子(NeF)來(lái)表示這種活性。在臨床研究中，腎炎因子陽(yáng)性患者中大約有50％發(fā)生MPGN(Spitze,R.E.等，Clin.Immunol.Immunopathol.64:177-83，1992)。C3NeF是針對(duì)替代途徑C3轉(zhuǎn)化酶(C3bBb)的自身抗體，它使這種轉(zhuǎn)化酶穩(wěn)定，從而促進(jìn)替代途徑活化(Daha,M.R.等，J.Immunol.116:1-7，1976)。同樣地，對(duì)經(jīng)典途徑C3轉(zhuǎn)化酶(C4b2a)具有特異性的自身抗體(稱(chēng)為C4NeF)使該轉(zhuǎn)化酶穩(wěn)定，從而促進(jìn)經(jīng)典途徑活化(Daha,M.R.等，J.Immunol.125:2051-2054，1980；Halbwachs,L.等，J.Clin.Invest.65:1249-56，1980)。已表明，抗C1q自身抗體與SLE患者的腎炎有關(guān)(Hovath,L.等，Clin.Exp.Rheumatol.19:667-72，2001；Siegert,C.等，J.Rheumatol.18:230-34，1991；Siegert,C.等，Clin.Exp.Rheumatol.10:19-23，1992)，還有報(bào)道指出這些抗C1q自身抗體的效價(jià)升高被用來(lái)預(yù)測(cè)腎炎的突發(fā)(Coremans,I.E.等，Am.J.Kidney Dis.26:595-601，1995)。從SLE患者尸檢腎洗脫出的免疫沉積物揭示這些抗C1q自身抗體的累積(Mannick,M.等，Arthritis Rheumatol.40:1504-11，1997)。所有這些事實(shí)都指向這些自身抗體的病理學(xué)作用。然而，并不是所有具有抗C1q自身抗體的患者都發(fā)生腎病，一些健康個(gè)體中也有低效價(jià)的抗C1q自身抗體(Siegert,C.E.等，Clin.Immunol.Immunopathol.67:204-9，1993)。

除了補(bǔ)體活化的替代途徑和經(jīng)典途徑以外，凝集素途徑在腎疾病中也有重要的病理學(xué)作用。通過(guò)免疫組織化學(xué)技術(shù)，從獲自診斷為患有幾種不同腎病的患者的腎活檢材料中，檢測(cè)出高水平的MBL、MBL相關(guān)的絲氨酸蛋白酶及補(bǔ)體活化產(chǎn)物，這些腎病包括亨諾赫–舍恩萊因紫癜腎炎(Endo,M.等，Am.J.Kidney Dis.35:401-407，2000)、冷球蛋白血癥性腎小球腎炎(Ohsawa,I.等，Clin.Immunol.101:59-66，2001)以及IgA腎病(Endo,M.等，Clin.Nephrology 55:185-191，2001)。因此，盡管已經(jīng)清楚補(bǔ)體與腎病之間的相關(guān)性這一事實(shí)幾十年，但是關(guān)于補(bǔ)體如何確切影響這些腎病的數(shù)據(jù)仍遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠完整。

因此，本發(fā)明的一個(gè)方面涉及通過(guò)將包含治療有效量的MASP-2抑制劑在藥物載體中的組合物，給予患有腎病的受試者以治療這類(lèi)疾病，所述疾病包括但不限于腎小球系膜增生性腎小球腎炎、膜性腎小球腎炎、膜增生性腎小球腎炎(腎小球系膜毛細(xì)血管性腎小球腎炎)、急性感染后腎小球腎炎(鏈球菌感染后腎小球腎炎)、冷球蛋白血癥性腎小球腎炎、狼瘡腎炎、亨諾赫–舍恩萊因紫癜腎炎或者IgA腎病。可以全身性給予受試者M(jìn)ASP-2抑制劑，例如通過(guò)動(dòng)脈內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下或其它胃腸外給藥，或者對(duì)于非肽能藥物可通過(guò)口服給藥。可以在一段長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)定期給予MASP-2抑制劑，以治療或控制慢性病，或者可以在急性創(chuàng)傷或損傷之前、期間或之后的一段時(shí)間單次或重復(fù)給藥。

皮膚疾病

銀屑病是慢性虛弱性皮膚病，累及數(shù)百萬(wàn)人，是遺傳和環(huán)境因素兩者的結(jié)果。一般認(rèn)為局部用藥以及UVB和PUVA光線療法是銀屑病的一線治療方法。然而，對(duì)于遍及全身的或更大范圍的疾病來(lái)說(shuō)，全身性治療指示為初步治療，或者在一些情況下用以增強(qiáng)UVB和PUVA治療。

各種皮膚疾病(例如銀屑病)的潛在病因支持免疫和促炎過(guò)程(包括補(bǔ)體系統(tǒng)的參與)的作用。此外，已經(jīng)確定了補(bǔ)體系統(tǒng)作為重要的非特異性皮膚防御機(jī)制的作用。它的活化導(dǎo)致不僅有助于維持正常的宿主防御、而且還介導(dǎo)炎癥和組織損傷的產(chǎn)物的產(chǎn)生。補(bǔ)體的促炎產(chǎn)物包括具有調(diào)理活性和細(xì)胞刺激活性的C3大片段(C3b和C3bi)、低分子量的過(guò)敏毒素(C3a、C4a和C5a)和膜攻擊復(fù)合物。其中，C5a或其降解產(chǎn)物脫Arg的C5a似乎是最重要的介質(zhì)，因?yàn)樗l(fā)揮對(duì)炎性細(xì)胞的有效趨化效應(yīng)。真皮內(nèi)給予C5a過(guò)敏毒素誘導(dǎo)的皮膚變化與通過(guò)免疫復(fù)合物介導(dǎo)的補(bǔ)體活化而發(fā)生的皮膚超敏血管炎中所觀察到的變化十分相似。補(bǔ)體活化參與了自身免疫性大皰性皮膚病中炎癥變化的發(fā)病機(jī)制。由表皮天皰瘡抗體引起的補(bǔ)體活化似乎是稱(chēng)為嗜酸細(xì)胞性海綿樣水腫這一特征性炎癥變化發(fā)生的原因。在大皰性類(lèi)天皰瘡(BP)中，基底膜區(qū)抗原與BP抗體之間的相互作用導(dǎo)致了補(bǔ)體活化，似乎與嵌入真皮表皮接界的白細(xì)胞有關(guān)。所產(chǎn)生的過(guò)敏毒素不僅激活浸潤(rùn)性白細(xì)胞，而且還誘導(dǎo)肥大細(xì)胞脫粒，這就促使真皮表皮分離和嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。同樣地，補(bǔ)體活化似乎在獲得性大皰性表皮松解和妊娠皰疹中所觀察到的真皮表皮分離中發(fā)揮更直接的作用。

補(bǔ)體參與銀屑病的證據(jù)來(lái)自于文獻(xiàn)中記載的涉及銀屑病和相關(guān)疾病的炎癥變化的病理生理學(xué)機(jī)制的最新實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)。越來(lái)越多的證據(jù)表明，T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫力在銀屑病病變的引發(fā)和維持中起著重要作用。有研究顯示，銀屑病病變中由活化T細(xì)胞產(chǎn)生的淋巴因子對(duì)表皮增殖具有強(qiáng)大的影響力。在銀屑病病變的嚴(yán)重發(fā)炎部位能夠觀察到角質(zhì)層下的特征性嗜中性粒細(xì)胞累積。通過(guò)由受刺激的角質(zhì)形成細(xì)胞釋放的趨化因子、IL-8和Gro-α的協(xié)同作用，特別是通過(guò)替代補(bǔ)體途徑活化所產(chǎn)生的C5a/脫arg的C5a，化學(xué)趨化性地吸引并激活嗜中性粒細(xì)胞(Terui,T.，TahokuJ.Exp.Med.190:239-248，2000；Terui,T.，Exp.Dermatol.9:1-10，2000)。

銀屑病鱗屑提取物含有獨(dú)特的趨化肽部分，它可能參與誘導(dǎo)節(jié)律性經(jīng)表皮的白細(xì)胞趨化反應(yīng)。最新研究鑒定出該部分中存在兩種不相關(guān)的趨化肽，即C5a/脫Arg的C5a和白介素8(IL-8)及其相關(guān)細(xì)胞因子。為研究它們對(duì)經(jīng)表皮白細(xì)胞遷移的相對(duì)影響以及它們?cè)阢y屑病病變中的相互關(guān)系，對(duì)銀屑病病變鱗屑提取物和相關(guān)的無(wú)菌膿皰皮膚病提取物中的免疫反應(yīng)性C5a/脫Arg的C5a和IL-8濃度進(jìn)行了定量。發(fā)現(xiàn)病變皮膚角質(zhì)組織提取物中的C5a/脫Arg的C5a和IL-8的濃度比非炎性正常角質(zhì)皮膚(orthokeratotic skin)的濃度顯著增加。C5a/脫Arg的C5a濃度的增加是病變鱗屑提取物特有的。根據(jù)這些結(jié)果，似乎C5a/脫Arg的C5a僅在優(yōu)先利于補(bǔ)體活化的特定情況下在炎性病變皮膚中產(chǎn)生。這就為使用補(bǔ)體活化抑制劑改善銀屑病病變提供了理論基礎(chǔ)。

雖然有研究顯示補(bǔ)體系統(tǒng)的經(jīng)典途徑在銀屑病中被激活，但是仍有少量關(guān)于替代途徑參與銀屑病炎癥反應(yīng)的報(bào)道。在補(bǔ)體活化途徑的傳統(tǒng)觀點(diǎn)范圍內(nèi)，補(bǔ)體片段C4d和Bb分別在經(jīng)典途徑和替代途徑活化時(shí)被釋放。因此，C4d或Bb片段的存在表示通過(guò)經(jīng)典途徑和/或替代途徑進(jìn)行的補(bǔ)體活化。一項(xiàng)研究使用酶免疫測(cè)定技術(shù)測(cè)定了銀屑病鱗屑提取物中C4d和Bb的水平。這些皮膚病鱗屑含有的用酶免疫測(cè)定法可檢測(cè)到的C4d和Bb水平比非炎性皮膚角質(zhì)層中的高(Takematsu,H.等，Dermatologica 181:289-292，1990)。這些結(jié)果表明在銀屑病的病變皮膚中除補(bǔ)體的經(jīng)典途徑之外，替代途徑也被激活。

通過(guò)對(duì)患有特應(yīng)性皮炎(AD)的35名患者和患有輕微至中度銀屑病的24名患者的外周血中的正常補(bǔ)體成分和活化產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)定，獲得補(bǔ)體參與銀屑病和特應(yīng)性皮炎的額外證據(jù)。血清中C3、C4和C1鈍化物(C1INA)的水平用放射免疫擴(kuò)散測(cè)定，而C3a和C5a水平則用放射免疫測(cè)定法測(cè)定。觀察到與健康的非特應(yīng)性對(duì)照相比，兩種疾病中的C3、C4和C1INA的水平都顯著增加。在AD中，C3a水平趨于升高，而在銀屑病中，C3a水平則顯著提高。這些結(jié)果表明，在AD和銀屑病中，補(bǔ)體系統(tǒng)都參與了炎癥過(guò)程(Ohkonohchi,K.等，Dermatologica 179:30-34，1989)。

銀屑病的病變皮膚中補(bǔ)體活化還導(dǎo)致末端補(bǔ)體復(fù)合物在表皮內(nèi)沉積，如通過(guò)測(cè)定銀屑病患者的血漿和角質(zhì)組織中的SC5b-9水平所顯示的一樣。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)銀屑病血漿中的SC5b-9水平顯著高于對(duì)照或者特應(yīng)性皮炎患者的水平。得自病變皮膚的總蛋白提取物的研究顯示，盡管在非炎性角質(zhì)組織中無(wú)法檢測(cè)到SC5b-9，但在銀屑病的病變角質(zhì)組織中有高水平的SC5b-9。通過(guò)使用抗C5b-9新抗原的單克隆抗體的免疫熒光法，僅在銀屑病皮膚的角質(zhì)層中觀察到C5b-9的沉積?？偟膩?lái)說(shuō)，在銀屑病的病變皮膚中，補(bǔ)體系統(tǒng)被激活，補(bǔ)體活化一直進(jìn)行到終端步驟，產(chǎn)生了膜攻擊復(fù)合物。

近來(lái)，新的選擇性靶向免疫系統(tǒng)的生物藥物已經(jīng)可用來(lái)治療銀屑病。目前已被美國(guó)FDA批準(zhǔn)或者處于III期研究的四種生物藥物是：阿來(lái)西普(alefacept)(艾默)和efalizuMoAb(依法珠單抗)(它們是T細(xì)胞調(diào)節(jié)劑)；依那西普(etanercept)(恩利)(它是可溶性TNF受體)；以及inflixiMoAb(它是抗TNF單克隆抗體)。依法珠單抗(Raptiva)是免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)劑，其中作用的靶向機(jī)制是阻斷淋巴細(xì)胞上的LFA-1與抗原呈遞細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞上的ICAM-1之間的相互作用。通過(guò)依法珠單抗(Raptiva)結(jié)合CD11a使淋巴細(xì)胞上可用的CD11a結(jié)合位點(diǎn)飽和，使淋巴細(xì)胞上細(xì)胞表面CD11a的表達(dá)下調(diào)。這種作用機(jī)制抑制了T細(xì)胞活化、細(xì)胞至真皮和表皮的遷移以及T細(xì)胞再活化。因此，大量科學(xué)證據(jù)表明了補(bǔ)體在皮膚的炎性疾病狀態(tài)中的作用，最新制藥方法現(xiàn)已針對(duì)免疫系統(tǒng)或特定的炎癥過(guò)程。然而，還沒(méi)有研究將MASP-2視作靶向目標(biāo)。根據(jù)本發(fā)明的發(fā)明人對(duì)MASP-2在補(bǔ)體活化中的作用的新認(rèn)識(shí)，本發(fā)明的發(fā)明人認(rèn)為MASP-2是治療銀屑病和其它皮膚病的有效靶標(biāo)。

因此，本發(fā)明的一個(gè)方面涉及治療銀屑病、自身免疫性大皰性皮膚病、嗜酸細(xì)胞性海綿樣水腫、大皰性類(lèi)天皰瘡、獲得性大皰性表皮松解、特應(yīng)性皮炎、妊娠皰疹和其它皮膚病，以及用于治療熱燒傷和化學(xué)燒傷，包括由此引起的毛細(xì)血管滲漏，即通過(guò)將包含治療有效量的MASP-2抑制劑在藥物載體中的組合物給予患有所述皮膚病的受試者進(jìn)行治療。MASP-2抑制劑可以通過(guò)應(yīng)用含有MASP-2抑制劑的噴霧劑、洗劑、凝膠劑、糊劑、軟膏劑或灌洗溶液劑，局部給予受試者，或者例如通過(guò)動(dòng)脈內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下或其它胃腸外給藥等全身性給予，或者對(duì)于非肽能藥物可通過(guò)口服給藥。對(duì)于急性病，治療可包括單次給藥或重復(fù)用藥或給藥，或者對(duì)于控制慢性病，則包括定期用藥或給藥。

移植

補(bǔ)體系統(tǒng)的活化顯著地促進(jìn)了實(shí)體器官移植后的炎癥反應(yīng)。在同種異體移植中，補(bǔ)體系統(tǒng)可被缺血/再灌注激活，并且可能被針對(duì)移植物的抗體激活(Baldwin,W.M.等，Springer Seminol Immunopathol.25:181-197，2003)。從非靈長(zhǎng)類(lèi)至靈長(zhǎng)類(lèi)的異種移植中，補(bǔ)體的主要激活因子是預(yù)先存在的抗體。動(dòng)物模型中的研究表明使用補(bǔ)體抑制劑可顯著延長(zhǎng)移植物的存活(參見(jiàn)下文)。因此，補(bǔ)體系統(tǒng)在器官移植后的器官損傷中有著明確的作用，從而本發(fā)明的發(fā)明人認(rèn)為使用針對(duì)MASP-2的補(bǔ)體抑制劑可預(yù)防同種異體移植或異種移植后對(duì)移植物的損傷。

先天免疫機(jī)制、特別是補(bǔ)體在針對(duì)移植物的炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答中所起的作用比以前所認(rèn)識(shí)的作用要大。例如，替代補(bǔ)體途徑活化似乎介導(dǎo)了腎缺血/再灌注損傷，近端小管細(xì)胞可能是這種環(huán)境中補(bǔ)體成分的來(lái)源兼攻擊部位。腎臟內(nèi)局部產(chǎn)生的補(bǔ)體也在針對(duì)移植物的細(xì)胞和抗體介導(dǎo)的免疫應(yīng)答兩者的發(fā)生中都發(fā)揮著作用。

C4d是活化補(bǔ)體因子C4的降解產(chǎn)物，C4是經(jīng)典途徑和凝集素依賴(lài)途徑的成分。C4d染色已經(jīng)成為急性病和慢性病環(huán)境中體液排斥的有用標(biāo)記，重新引起對(duì)抗供體抗體形成的重要性的關(guān)注。C4d和急性細(xì)胞排斥的形態(tài)學(xué)標(biāo)志之間的關(guān)聯(lián)性具有統(tǒng)計(jì)顯著性。在24-43％的I型發(fā)作、45％的II型排斥和50％的III型排斥中觀察到C4d(Nickeleit,V.等，J.Am.Soc.Nephrol.13:242-251，2002；Nickeleit,V.等，Nephrol.Dial.Transplant 18:2232-2239，2003)。正在開(kāi)發(fā)抑制補(bǔ)體或降低局部合成作為移植后達(dá)到改善臨床結(jié)果的手段的多種治療方法。

補(bǔ)體級(jí)聯(lián)活化是由于移植期間的許多過(guò)程而發(fā)生的。目前的療法盡管在限制細(xì)胞排斥方面是有效的，但是并不能完全應(yīng)付所面臨的所有障礙。這些障礙包括體液排斥和慢性同種異體移植腎病或功能障礙。盡管對(duì)移植器官的總體反應(yīng)是宿主方許多效應(yīng)機(jī)制的結(jié)果，不過(guò)補(bǔ)體可能在其中一些方面起著關(guān)鍵作用。在腎移植環(huán)境下，近端小管細(xì)胞的局部補(bǔ)體合成似乎特別重要。

補(bǔ)體特異性抑制劑的可獲得性可能為改善器官移植后的臨床結(jié)果提供了機(jī)會(huì)。通過(guò)阻滯補(bǔ)體攻擊的機(jī)制起作用的抑制劑可能是特別有用的，因?yàn)樗鼈冇型岣吖πВ⑶冶苊鉄o(wú)免疫應(yīng)答接受者的系統(tǒng)性補(bǔ)體耗盡。

補(bǔ)體在異種移植排斥中也起著關(guān)鍵作用。因此，有效的補(bǔ)體抑制劑作為潛在的治療藥是非常令人關(guān)注的。在豬－靈長(zhǎng)類(lèi)器官移植中，超急性排斥(HAR)是由抗體沉積和補(bǔ)體活化引起的。已經(jīng)對(duì)預(yù)防豬－靈長(zhǎng)類(lèi)組合中超急性異種移植物排斥的多項(xiàng)策略和目標(biāo)進(jìn)行了試驗(yàn)。這些方法通過(guò)去除天然抗體、用眼鏡蛇毒因子耗盡補(bǔ)體、或者用可溶性補(bǔ)體抑制劑sCR1防止C3活化得以實(shí)現(xiàn)。此外，補(bǔ)體活化阻斷劑(CAB-2)，一種源自人衰變加速因子(DAF)和膜輔因子蛋白的重組可溶性嵌合蛋白，抑制經(jīng)典途徑和替代途徑兩者的C3和C5轉(zhuǎn)化酶。CAB-2減少用人血離體灌注豬心的補(bǔ)體介導(dǎo)的組織損傷。將豬心異位移植到未接受任何免疫抑制的獼猴中時(shí)對(duì)CAB-2功效的研究表明，在接受CAB-2的猴中，移植物存活期顯著延長(zhǎng)(Salerno,C.T.等，Xenotransplantation 9:125-134，2002)。CAB-2顯著抑制補(bǔ)體活化，體現(xiàn)在C3a和SC5b-9的產(chǎn)生急劇減少。在移植排斥時(shí)，iC3b、C4和C9的組織沉積與對(duì)照的沉積類(lèi)似或者略微有減少，IgG、IgM、C1q和纖維蛋白沉積沒(méi)有變化。因此，這種補(bǔ)體抑制方法消除了移植到獼猴體內(nèi)的豬心的超急性排斥。這些研究證實(shí)了補(bǔ)體抑制對(duì)存活的有益效果，本發(fā)明的發(fā)明人認(rèn)為MASP-2抑制劑還可用于異種移植。

另一種方法集中在確定抗補(bǔ)體5(C5)單克隆抗體能否在大鼠－預(yù)敏化小鼠心臟移植模型中防止超急性排斥(HAR)，以及這些MoAb與環(huán)孢菌素(cyclosporine)和環(huán)磷酰胺聯(lián)用能否實(shí)現(xiàn)移植物的長(zhǎng)期存活。研究表明抗C5MoAb預(yù)防HAR(Wang,H.等，Transplantation68:1643-1651，1999)。因此本發(fā)明的發(fā)明人認(rèn)為，補(bǔ)體級(jí)聯(lián)中的其它靶(例如MASP-2)對(duì)于在未來(lái)的臨床異種移植中防止HAR和急性血管排斥也可能是有價(jià)值的。

雖然補(bǔ)體在見(jiàn)于異種移植的超急性排斥中的關(guān)鍵作用已經(jīng)非常確定，但是在同種異體移植中的不太明顯的作用開(kāi)始顯現(xiàn)。早已清楚補(bǔ)體和獲得性免疫應(yīng)答之間的聯(lián)系，其中發(fā)現(xiàn)缺乏補(bǔ)體的動(dòng)物在抗原刺激后產(chǎn)生低于正常的抗體應(yīng)答。研究表明抗原用補(bǔ)體裂解產(chǎn)物C3d的調(diào)理作用極大地增加了抗原呈遞到B細(xì)胞的有效性，并且表明是通過(guò)2型補(bǔ)體受體連接到某些B細(xì)胞上而起作用的。這項(xiàng)工作已經(jīng)延伸到小鼠皮膚移植模型中的移植環(huán)境，其中C3和C4缺陷型小鼠在同種抗體的產(chǎn)生方面具有明顯的缺點(diǎn)，這是由于類(lèi)別轉(zhuǎn)換成高親和性IgG失敗所致。由于抗供體抗體和體液排斥的重要性，因此這些機(jī)制在腎移植中的重要性隨之增加。

以前的工作已證實(shí)，在腎臟移植之后的同種異體移植物排斥期間，近端小管細(xì)胞的C3合成上調(diào)。在小鼠腎臟移植模型中，已對(duì)局部合成補(bǔ)體的作用進(jìn)行了研究。與C3陽(yáng)性供體的對(duì)照移植物相比，將C3陰性供體的移植物移植到C3充足的受體中，顯示其存活期延長(zhǎng)(>100天)，而對(duì)照移植物14天內(nèi)就被排斥。此外，與對(duì)照的相比，C3陰性移植物的接受者體內(nèi)抗供體T細(xì)胞增值應(yīng)答顯著降低，這表明局部合成的C3對(duì)T細(xì)胞初敏的作用。

這些觀察結(jié)果表明這樣的可能性，即供體抗原暴露于T細(xì)胞首先是在移植物中發(fā)生的，而且局部合成的補(bǔ)體通過(guò)供體抗原的調(diào)理作用或者通過(guò)向抗原呈遞細(xì)胞或T細(xì)胞提供另外的信號(hào)而增強(qiáng)了抗原呈遞。在腎臟移植環(huán)境下，產(chǎn)生補(bǔ)體的腎小管細(xì)胞也表明補(bǔ)體沉積在它們的細(xì)胞表面上。

因此，本發(fā)明的一個(gè)方面涉及通過(guò)將包含治療有效量的MASP-2抑制劑在藥物載體中的組合物給予移植受體，來(lái)預(yù)防或治療由組織或?qū)嶓w器官移植引起的炎癥反應(yīng)，所述移植受體包括已接受完整器官(例如腎、心、肝、胰腺、肺、角膜等)或移植物(如瓣膜、腱、骨髓等)的同種異體移植或異種移植的受試者?？梢酝ㄟ^(guò)動(dòng)脈內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下或其它胃腸外給藥給予受試者M(jìn)ASP-2抑制劑，或者對(duì)于非肽能抑制劑可口服給予。給藥可發(fā)生在移植后的急性期和/或作為長(zhǎng)期移植后療法。附加于移植后給藥或者代替移植后給藥，可在移植之前和/或移植手術(shù)期間用MASP-2抑制劑治療受試者，和/或用MASP-2抑制劑預(yù)處理待移植的器官或組織。器官或組織的預(yù)處理可能需要將含有MASP-2抑制劑的溶液劑、凝膠劑或糊劑經(jīng)噴霧或沖洗表面而應(yīng)用到器官或組織表面，或者可將器官或組織浸泡在含有MASP-2抑制劑的溶液中。

中樞與外周神經(jīng)系統(tǒng)疾病和損傷

各種中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)或外周神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)疾病或損傷的發(fā)病機(jī)制涉及補(bǔ)體系統(tǒng)的活化，所述疾病或損傷包括但不限于多發(fā)性硬化(MS)、重癥肌無(wú)力(MG)、亨廷頓病(HD)、肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)、急性熱病性多神經(jīng)炎、中風(fēng)后再灌注、椎間盤(pán)退行性疾病、腦外傷、帕金森病(PD)和阿爾茨海默病(AD)。補(bǔ)體蛋白在包括神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞在內(nèi)的CNS細(xì)胞中合成的初步測(cè)定，以及對(duì)補(bǔ)體活化之后在CNS中產(chǎn)生的過(guò)敏毒素能改變神經(jīng)元功能的認(rèn)識(shí)，揭示了補(bǔ)體在CNS疾病中的潛在作用(Morgan,B.P.等，Immunology Today17:10:461-466，1996)?，F(xiàn)已表明，C3a受體和C5a受體存在于神經(jīng)元上，并廣泛分布在感覺(jué)、運(yùn)動(dòng)和邊緣腦系統(tǒng)的各個(gè)不同部分上(Barum,S.R.，Immunologic Research 26:7-13，2002)。而且，已表明，過(guò)敏毒素C5a和C3a改變嚙齒動(dòng)物的飲食習(xí)慣，并能誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。這些發(fā)現(xiàn)增加了有關(guān)在各種CNS炎性疾病中抑制補(bǔ)體活化的治療效用的可能性，所述疾病包括腦外傷、脫髓鞘、腦膜炎、中風(fēng)和阿爾茨海默病。

腦外傷或腦出血是常見(jiàn)的臨床問(wèn)題，補(bǔ)體活化可能產(chǎn)生并加重所形成的炎癥和水腫。已在大鼠腦外傷模型中對(duì)補(bǔ)體抑制作用進(jìn)行了研究(Kaczorowski等，J.Cereb.Blood Flow Metab.15:860-864，1995)。在臨腦損傷之前給予sCR1顯著抑制嗜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)到受傷區(qū)域，這表明了補(bǔ)體對(duì)于吞噬細(xì)胞募集的重要性。同樣地，血漿和腦脊液(CSF)中高水平的多種補(bǔ)體活化產(chǎn)物的存在清楚表明了腦出血之后患者中的補(bǔ)體活化。補(bǔ)體活化和C5b-9復(fù)合物染色增加在隔離的腰椎間盤(pán)組織中得到證實(shí)，可能表明了在椎間盤(pán)突出組織誘發(fā)的坐骨神經(jīng)痛中的作用(Gronblad,M.等，Spine 28(2):114-118，2003)。

MS(多發(fā)性硬化)的特征在于CNS內(nèi)將軸突包鞘并絕緣的髓磷脂逐漸喪失。盡管尚不清楚最初的原因，不過(guò)有大量證據(jù)表明涉及到免疫系統(tǒng)(Prineas,J.W.等，Lab Invest.38:409-421，1978；Ryberg,B.，J.Neurol.Sci.54:239-261，1982)。還有明確的證據(jù)表明，補(bǔ)體在CNS或PNS脫髓鞘疾病的病理生理學(xué)中起著突出作用，這些疾病包括MS、急性熱病性多神經(jīng)炎和米勒－費(fèi)希爾綜合征(Gasque,P.等，Immunopharmacology 49:171-186，2000；Barnum,S.R.in Bondy S.等(主編)Inflammatory events in neurodegeneration,Prominent Press,pp.139-156，2001)。補(bǔ)體是引起組織破壞、發(fā)炎、髓磷脂碎片的清除甚至是軸突髓鞘再形成的原因。盡管補(bǔ)體參與證據(jù)確鑿，但是補(bǔ)體治療性靶的鑒定目前仍只是在實(shí)驗(yàn)性變應(yīng)性腦脊髓炎(EAE)(一種多發(fā)性硬化的動(dòng)物模型)中進(jìn)行評(píng)價(jià)。研究表明，與EAE對(duì)照小鼠相比，缺乏C3或B因子的EAE小鼠脫髓鞘作用減弱(Barnum,Immunologic Research 26:7-13，2002)。使用稱(chēng)為“sCrry”的可溶形式的補(bǔ)體抑制劑和C3-/-以及B因子-/-的EAE小鼠研究證實(shí)補(bǔ)體是疾病模型在若干水平上發(fā)生和發(fā)展的原因。此外，B因子-/-小鼠中的EAE嚴(yán)重性的顯著降低，這為補(bǔ)體替代途徑在EAE中的作用提供了進(jìn)一步的證據(jù)(Nataf等，J.Immunology165:5867-5873，2000)。

MG(重癥肌無(wú)力)是乙酰膽堿受體喪失和運(yùn)動(dòng)終板破壞的神經(jīng)肌肉接頭疾病。sCR1在MG動(dòng)物模型中非常有效，這進(jìn)一步表明了補(bǔ)體在該疾病中的作用(Piddelesden等，J.Neuroimmunol.1997)。

神經(jīng)退行性疾病AD(阿爾茨海默病)的組織學(xué)標(biāo)志是老年斑和神經(jīng)纖維原纏結(jié)(McGeer等，Res.Immunol.143:621-630，1992)。這些病理學(xué)標(biāo)記對(duì)于補(bǔ)體系統(tǒng)成分也是強(qiáng)染色的。證據(jù)指向?qū)е律窠?jīng)元死亡和認(rèn)知功能障礙的局部神經(jīng)炎癥狀態(tài)。老年斑含有異常的淀粉樣β肽(Aβ，這是一種源自淀粉樣前體蛋白的肽。研究表明Aβ結(jié)合C1并能引發(fā)補(bǔ)體活化(Rogers等，Res.Immunol.143:624-630，1992)。此外，AD的顯著特征是與經(jīng)典補(bǔ)體途徑從C1q到C5b-9的活化蛋白相關(guān)，觀察到它們高度定位于神經(jīng)炎斑中(Shen,Y.等，Brain Research 769:391-395，1997；Shen,Y.等，Neurosci.Letters305(3):165-168，2001)。因此，Aβ不但啟動(dòng)了經(jīng)典途徑，而且所產(chǎn)生的連續(xù)炎癥狀態(tài)可能是神經(jīng)元細(xì)胞死亡的原因。而且，AD中補(bǔ)體活化已經(jīng)進(jìn)行到末端C5b-9階段的這一事實(shí)表明，補(bǔ)體系統(tǒng)的調(diào)節(jié)機(jī)制仍不能終止補(bǔ)體活化過(guò)程。

有研究提出了幾種補(bǔ)體途徑抑制劑作為潛在的AD治療手段，包括作為C1Q結(jié)合抑制劑的蛋白聚糖、作為C3轉(zhuǎn)化酶抑制劑和C5活化阻斷劑或C5a受體抑制劑的萘莫司他(Nafamstat)(Shen,Y.等，Progress in Neurobiology,70:463-472，2003)。MASP-2作為先天補(bǔ)體途徑起始步驟以及用于替代途徑活化的作用，提供了可能的新的治療手段，這得到了表明補(bǔ)體途徑參與AD的大量數(shù)據(jù)的支持。

同其它CNS退行性疾病一樣，在PD(帕金森病)患者腦的受損區(qū)域存在炎癥的證據(jù)，所述炎癥的特征在于神經(jīng)膠質(zhì)反應(yīng)(特別是小膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng))，以及HLA-DR抗原、細(xì)胞因子和補(bǔ)體成分的表達(dá)增加。這些觀察結(jié)果表明，免疫系統(tǒng)機(jī)制參與了PD中神經(jīng)元損傷的發(fā)病機(jī)制。然而，還沒(méi)有闡明PD中的原發(fā)性損傷的細(xì)胞機(jī)制，但是，有可能是線粒體突變、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡在起作用。此外，PD中由紋狀體和黑質(zhì)的神經(jīng)元損傷引起的炎癥可能加重病程。這些觀察結(jié)果表明，用補(bǔ)體抑制藥治療可能起著減緩PD進(jìn)程的作用(Czlonkowska,A.等，Med.Sci.Monit.8:165-177，2002)。

因此，本發(fā)明的一個(gè)方面涉及通過(guò)應(yīng)用包含治療有效量的MASP-2抑制劑在藥物載體中的組合物來(lái)治療患有外周神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)疾病或損傷和/或中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)疾病或損傷的受試者，來(lái)治療這些疾病或損傷。認(rèn)為可根據(jù)本發(fā)明治療的CNS和PNS疾病和損傷包括但不限于多發(fā)性硬化(MS)、重癥肌無(wú)力(MG)、亨廷頓病(HD)、肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)、急性熱病性多神經(jīng)炎、中風(fēng)后再灌注、椎間盤(pán)退行性疾病、腦外傷、帕金森病(PD)、阿爾茨海默病(AD)、米勒－費(fèi)希爾綜合征、腦外傷和/或出血、脫髓鞘，還可為腦膜炎。

對(duì)于治療CNS疾病和腦外傷來(lái)說(shuō)，可以通過(guò)鞘內(nèi)、顱內(nèi)、腦室內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下或其它胃腸外給藥給予受試者M(jìn)ASP-2抑制劑，對(duì)于非肽能抑制劑可口服給予?？赏ㄟ^(guò)全身給藥途徑或者通過(guò)局部給予功能障礙或創(chuàng)傷部位來(lái)治療PNS疾病和腦外傷?？砂凑蔗t(yī)師的規(guī)定定期重復(fù)給予本發(fā)明的MASP-2抑制劑組合物，直到癥狀得到有效緩解或控制。

血液病

膿毒癥是由于患者對(duì)侵入微生物的過(guò)度反應(yīng)而引起的。補(bǔ)體系統(tǒng)的主要功能是配合對(duì)侵入細(xì)菌和其它病原體的炎癥反應(yīng)。與這種生理作用相一致，許多研究顯示補(bǔ)體活化在膿毒癥的發(fā)病機(jī)制中具有主要作用(Bone,R.C.，Annals.Internal.Med.115:457-469，1991)。膿毒癥臨床表現(xiàn)的定義在不斷發(fā)展中。通常將膿毒癥定義為對(duì)感染的系統(tǒng)性宿主應(yīng)答。然而，在許多情況下，有膿毒癥癥狀的患者中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)感染的臨床證據(jù)(如血液培養(yǎng)細(xì)菌陽(yáng)性)。這種矛盾之處最早是在1992年的共識(shí)會(huì)議上確定術(shù)語(yǔ)“全身炎癥反應(yīng)綜合征”(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)時(shí)被注意到的，SIRS不需要確定的細(xì)菌感染的存在(Bone,R.C.等，Crit.Care Med.20:724-726，1992)。目前普遍認(rèn)為，伴隨膿毒癥和SIRS的是不能調(diào)控炎癥反應(yīng)。出于該簡(jiǎn)述的目的，我們會(huì)考慮膿毒癥的臨床定義還包括嚴(yán)重膿毒癥、敗血癥性休克和SIRS。

在1980年代末期之前，膿毒癥患者的主要感染源是革蘭氏陰性菌。已知革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分脂多糖(LPS)刺激炎癥介質(zhì)從各種細(xì)胞類(lèi)型中釋放出來(lái)，并且當(dāng)注射到動(dòng)物體內(nèi)時(shí)誘導(dǎo)急性感染癥狀(Haeney,M.R.等，Antimicrobial Chemotherapy 41(增刊A):41-6，1998)。有趣的是，引起感染的微生物的范圍似乎從1970年代末期和1980年代主要是革蘭氏陰性菌變成了現(xiàn)今的主要是革蘭氏陽(yáng)性菌，其原因目前不清楚(Martin,G.S.等，N.Eng.J.Med.348:1546-54，2003)。

許多研究表明補(bǔ)體活化在介導(dǎo)炎癥和引起休克、特別是敗血癥性休克和出血性休克特征中的重要性。革蘭氏陰性和革蘭氏陽(yáng)性生物一般都促使敗血癥性休克。LPS是主要經(jīng)由替代途徑的有效的補(bǔ)體活化因子，盡管抗體介導(dǎo)的經(jīng)典途徑活化也有發(fā)生(Fearon,D.T.等，N.Engl.J.Med.292:937-400，1975)。革蘭氏陽(yáng)性細(xì)胞壁的主要成分是肽聚糖和脂磷壁酸，兩種成分都是替代補(bǔ)體途徑的有效激活因子，盡管在特異性抗體存在時(shí)，它們也能激活經(jīng)典補(bǔ)體途徑(Joine,K.A.等，Ann.Rev.Immunol.2:461-2，1984)。

膿毒癥發(fā)病機(jī)制中最初涉及補(bǔ)體系統(tǒng)是當(dāng)研究人員注意到過(guò)敏毒素C3a和C5a介導(dǎo)各種也可能發(fā)生在膿毒癥期間的炎癥反應(yīng)時(shí)發(fā)現(xiàn)的。這些過(guò)敏毒素引起血管擴(kuò)張和微血管通透性增加，這是在敗血癥性休克中起著重要作用的事件(Schumache,W.A.等，Agents Actions34:345-349，1991)。此外，過(guò)敏毒素誘導(dǎo)支氣管痙攣、組胺從肥大細(xì)胞中釋放以及血小板聚集。而且，它們對(duì)粒細(xì)胞發(fā)揮了許多作用，例如趨化、聚集、粘附、溶酶體酶的釋放、毒性超氧陰離子的產(chǎn)生和白三烯的形成(Shin,H.S.等，Science 162:361-363，1968；Vogt,W.，Complement 3:177-86，1986)。認(rèn)為這些生物學(xué)作用在膿毒癥并發(fā)癥例如休克或急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)的發(fā)生中起著作用(Hammerschmidt,D.E.等，Lancet 1:947-949，1980；Slotman,G.T.等，Surgery 99:744-50，1986)。此外，過(guò)敏毒素C3a水平的升高與膿毒癥的致命結(jié)果有關(guān)(Hack,C.E.等，Am.J.Med.86:20-26，1989)。在一些休克動(dòng)物模型中，某些補(bǔ)體缺陷型品系(如C5缺陷型品系)對(duì)LPS的輸注效應(yīng)具有更高的抗性(Hseuh,W.等，Immunol.70:309-14，1990)。

研究顯示，在嚙齒動(dòng)物膿毒癥發(fā)作期間，用抗體阻斷C5a產(chǎn)生極大地提高了存活率(Czermak,B.J.等，Nat.Med.5:788-792，1999)。當(dāng)用抗體或小分子抑制劑阻斷C5a受體(C5aR)時(shí)，得到了類(lèi)似的結(jié)果(Huber-Lang,M.S.等，F(xiàn)ASEB J.16:1567-74，2002；Riedemann,N.C.等，J.Clin.Invest.110:101-8，2002)。較早期對(duì)猴子的實(shí)驗(yàn)研究表明，C5a的抗體阻斷減少了大腸桿菌(E.coli)誘發(fā)的敗血癥性休克和成人呼吸窘迫綜合征(Hangen,D.H.等，J.Surg.Res.46:195-9，1989；Stevens,J.H.等，J.Clin.Invest.77:1812-16，1986)。與膿毒癥不太嚴(yán)重的患者和幸存者相比，C5a在膿毒癥病人體內(nèi)升高，并且與顯著降低存活率和多器官衰竭有關(guān)(Nakae,H.等，Res.Commun.Chem.Pathol.Pharmacol.84:189-95，1994；Nakae等，Surg.Today 26:225-29，1996；Bengtson,A.等，Arch.Surg.123:645-649，1988)。C5a在膿毒癥期間發(fā)揮其有害作用的機(jī)制還有待更詳細(xì)的研究，但是最近的數(shù)據(jù)表明，膿毒癥期間C5a的產(chǎn)生顯著損害血液嗜中性粒細(xì)胞的先天免疫功能(Huber-Lang,M.S.等，J.Immunol.169:3223-31，2002)、它們引起呼吸爆發(fā)的能力及其產(chǎn)生細(xì)胞因子的能力(Riedemann,N.C.等，Immunity19:193-202，2003)。此外，膿毒癥期間的C5a產(chǎn)生似乎具有促凝血效應(yīng)(Laudes,I.J.等，Am.J.Pathol.160:1867-75，2002)。在膿毒癥和ARDS動(dòng)物模型中，補(bǔ)體調(diào)控蛋白CI INH也顯示出功效(Dickneite,G.，Behring Ins.Mitt.93:299-305，1993)。

凝集素途徑在膿毒癥的發(fā)病機(jī)制中也可能有作用。已顯示MBL結(jié)合臨床上重要的各種微生物，包括革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌，并激活凝集素途徑(Neth,O.等，Infect.Immun.68:688，2000)。脂磷壁酸(LTA)越來(lái)越被視作LPS的革蘭氏陽(yáng)性對(duì)應(yīng)物(Gram-positive counterpart)。它是誘導(dǎo)細(xì)胞因子從單核吞噬細(xì)胞和全血中釋放的有效免疫刺激劑(Morath,S.等，J.Exp.Med.195:1635，2002；Morath,S.等，Infect.Immun.70:938，2002)。最近證實(shí)，L-纖維膠凝蛋白與從許多革蘭氏陽(yáng)性菌(包括金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus))分離的LTA特異性結(jié)合，并且激活凝集素途徑(Lynch,N.J.等，J.Immunol.172:1198-02，2004)。還顯示，MBL能結(jié)合得自腸球菌(Enterococcus spp)的LTA，其中多聚甘油磷酸鏈被糖基取代，但是不結(jié)合來(lái)自其它9種菌種(包括金黃色葡萄球菌)的LTA(Polotsky,V.Y.等，Infect.Immun.64:380，1996)。

因此，本發(fā)明一方面提供用于治療膿毒癥或由膿毒癥引起的疾病的方法，該方法通過(guò)將包含治療有效量的MASP-2抑制劑在藥物載體中的組合物給予患有膿毒癥或由膿毒癥引起的疾病的受試者實(shí)施，所述疾病包括但不限于嚴(yán)重膿毒癥、敗血癥性休克、膿毒癥引起的急性呼吸窘迫綜合征和全身性炎癥反應(yīng)綜合征。本發(fā)明提供治療其它血液病的有關(guān)方法，該方法通過(guò)將包含治療有效量的MASP-2抑制劑在藥物載體中的組合物給予患其它血液病的受試者實(shí)施，所述其它血液病包括出血性休克、溶血性貧血、自身免疫性血栓形成性血小板減少性紫癜(TTP)、溶血性尿毒癥綜合征(HUS)或其它骨髓/血液破壞性疾病。可以全身性給予受試者M(jìn)ASP-2抑制劑，例如通過(guò)動(dòng)脈內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、吸入(特別是在ARDS的情況下)、皮下或其它胃腸外給藥，或者對(duì)于非肽能抑制劑可口服給予。MASP-2抑制劑組合物可與一種或多種另外的治療藥聯(lián)用以對(duì)抗膿毒癥和/或休克的后遺癥。對(duì)于晚期膿毒癥或休克或者由此引起的疾病狀況來(lái)說(shuō)，MASP-2抑制劑組合物可適于以速效劑型給藥，例如通過(guò)靜脈內(nèi)或動(dòng)脈內(nèi)推注含有MASP-2抑制劑組合物的溶液劑來(lái)給藥?？砂凑蔗t(yī)師規(guī)定重復(fù)給藥，直到疾病消退。

泌尿生殖系統(tǒng)疾病

研究表明補(bǔ)體系統(tǒng)參與了幾種截然不同的泌尿生殖系統(tǒng)疾病，包括疼痛性膀胱病、感覺(jué)性膀胱病、慢性非細(xì)菌性膀胱炎和間質(zhì)性膀胱炎(Holm-Bentzen,M.等，J.Urol.138:503-507，1987)、不育(Cruz等，Biol.Reprod.54:1217-1228，1996)、妊娠(Xu,C.等，Science 287:498-507，2000)、胎兒母體耐受(Xu,C.等，Science 287:498-507，2000)和先兆子癇(Haege,M.，Int.J.Gynecol.Obstet.43:113-127，1993)。

疼痛性膀胱病、感覺(jué)性膀胱病、慢性非細(xì)菌性膀胱炎和間質(zhì)性膀胱炎是未知病因和發(fā)病機(jī)制所知甚少的疾病，因此沒(méi)有任何合理的治療方法。有關(guān)膀胱的上皮和/或粘膜表層膜缺陷的致病理論，以及有關(guān)免疫紊亂的理論成為主流(Holm-Bentzen,M.等，J.Urol.138:503-507，1987)。據(jù)報(bào)道已經(jīng)測(cè)試了間質(zhì)性膀胱炎患者的免疫球蛋白(IgA、IgG、IgM)、補(bǔ)體成分(C1q、C3、C4)和C1酯酶抑制劑。補(bǔ)體成分C4的血清水平有非常顯著的降低(p<0.001)，免疫球蛋白G顯著增加(p<0.001)。該研究表明補(bǔ)體系統(tǒng)經(jīng)典途徑活化，并且支持慢性局部免疫過(guò)程參與該病發(fā)病機(jī)制的可能性(Mattila,J.等，Eur.Urol.9:350-352，1983)。而且，在自身抗體與膀胱粘膜中的抗原結(jié)合之后，補(bǔ)體活化可能參與組織損傷的產(chǎn)生，并參與該病典型的慢性自身延續(xù)性炎癥(self-perpetuating inflammation)(Helin,H.等，Clin.Immunol.Immunopathol.43:88-96，1987)。

除了補(bǔ)體在泌尿生殖器炎性疾病中的作用之外，生殖功能也可能受到補(bǔ)體途徑局部調(diào)節(jié)的影響。天然存在的補(bǔ)體抑制劑已經(jīng)發(fā)展到了為宿主細(xì)胞提供所需的保護(hù)以控制體內(nèi)的補(bǔ)體系統(tǒng)。為了揭示胚胎發(fā)育中的補(bǔ)體調(diào)控，對(duì)Crry進(jìn)行了研究，Crry是天然存在的嚙齒動(dòng)物補(bǔ)體抑制劑，在結(jié)構(gòu)上類(lèi)似于人補(bǔ)體抑制劑MCP和DAF。有趣的是，產(chǎn)生Crry-/-小鼠的努力沒(méi)有成功。相反，發(fā)現(xiàn)純合的Crry-/-小鼠死于子宮內(nèi)。Crry-/-胚胎在交配后存活到大約10天，存活隨著由發(fā)育停滯所導(dǎo)致的死亡而迅速下降。炎性細(xì)胞也明顯侵入Crry-/-胚胎的胎盤(pán)組織中。相比之下，Crry+/+胚胎似乎具有沉積在胎盤(pán)上的C3。這表明在胎盤(pán)水平上發(fā)生了補(bǔ)體活化，在缺少補(bǔ)體調(diào)節(jié)時(shí)，胚胎死亡。驗(yàn)證性研究在C3缺陷型背景下進(jìn)行了引入Crry突變的試驗(yàn)。該補(bǔ)救性策略是成功的?？偟恼f(shuō)來(lái)，這些數(shù)據(jù)表示必須調(diào)節(jié)胎兒母體的補(bǔ)體界面。胎盤(pán)中補(bǔ)體調(diào)節(jié)的細(xì)微變化可能是胎盤(pán)功能障礙和流產(chǎn)的原因(Xu,C.等，Science 287:498-507，2000)。

先兆子癇是妊娠誘發(fā)的高血壓癥，其中涉及補(bǔ)體系統(tǒng)活化，不過(guò)仍然存在著爭(zhēng)議(Haege,M.，Int.J.Gynecol.Obstet.43:113-127，1993)。體循環(huán)中的補(bǔ)體活化與先兆子癇中已確立的疾病密切相關(guān)，但是在臨床癥狀出現(xiàn)之前沒(méi)有發(fā)現(xiàn)補(bǔ)體活化增加，因此不能將補(bǔ)體成分用作先兆子癇的預(yù)測(cè)因子(Haeger等，Obstet.Gynecol.78:46，1991)。然而，在胎盤(pán)床局部環(huán)境中增加的補(bǔ)體活化可能勝于局部控制機(jī)制，導(dǎo)致過(guò)敏毒素和C5b-9水平升高(Haeger等，Obstet.Gynecol.73:551，1989)。

與抗精子抗體(ASA)相關(guān)的不育的一種假定機(jī)制是通過(guò)生殖道中補(bǔ)體活化的作用。C3b和iC3b調(diào)理素可通過(guò)其補(bǔ)體受體以及精子表面末端C5b-9復(fù)合物的形成來(lái)增強(qiáng)吞噬細(xì)胞與精子的結(jié)合，進(jìn)而降低精子的活動(dòng)性，故C3b和iC3b調(diào)理素的產(chǎn)生是與生殖力降低有關(guān)的可能原因。在不孕婦女的卵巢卵泡液中也證實(shí)了C5b-9水平升高(D'Cruz,O.J.等，J.Immunol.144:3841-3848，1990)。其它研究表明精子游動(dòng)減緩，精子/卵子相互作用減弱，這些都可能與補(bǔ)體有關(guān)(D'Cruz,O.J.等，J.Immunol.146:611-620，1991；Alexander,N.J.，F(xiàn)ertil.Steril.41:433-439，1984)。最后，用sCR1進(jìn)行的研究證實(shí)了針對(duì)ASA介導(dǎo)和補(bǔ)體介導(dǎo)的人精子損傷的保護(hù)作用(D'Cruz,O.J.等，Biol.Reprod.54:1217-1228，1996)。這些數(shù)據(jù)為補(bǔ)體抑制劑用于治療泌尿生殖系統(tǒng)疾病和障礙提供了若干證據(jù)。

因此，本發(fā)明一方面提供用于抑制患有泌尿生殖系統(tǒng)疾病的患者的MASP-2依賴(lài)性補(bǔ)體活化的方法，該方法通過(guò)將包含治療有效量的MASP-2抑制劑在藥物載體中的組合物給予患有泌尿生殖系統(tǒng)疾病的受試者實(shí)施。我們認(rèn)為用本發(fā)明方法和組合物進(jìn)行治療性治療的泌尿生殖系統(tǒng)疾病以非限制性實(shí)例方式包括：疼痛性膀胱病、感覺(jué)性膀胱病、慢性非細(xì)菌性膀胱炎和間質(zhì)性膀胱炎、男女不育、胎盤(pán)功能障礙以及流產(chǎn)和先兆子癇?？梢匀硇越o予受試者M(jìn)ASP-2抑制劑，例如通過(guò)動(dòng)脈內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、吸入、皮下或其它胃腸外給藥，或者對(duì)于非肽能抑制劑可口服給予?；蛘撸琈ASP-2抑制劑組合物可局部遞送到泌尿生殖道，例如通過(guò)用液體溶液或凝膠組合物進(jìn)行膀胱內(nèi)沖洗或灌輸?？砂凑蔗t(yī)師規(guī)定重復(fù)給藥以控制或消除疾病。

糖尿病和糖尿病性疾病

糖尿病性視網(wǎng)膜微血管病的特征是通透性增加、白細(xì)胞淤滯、微血栓形成和毛細(xì)血管細(xì)胞凋亡，所有這些都可能是由補(bǔ)體活化所引起或促進(jìn)的。糖尿病患者的腎小球結(jié)構(gòu)和神經(jīng)內(nèi)微血管都表現(xiàn)出補(bǔ)體活化的跡象。高含量葡萄糖體外選擇性地降低CD55和CD59在內(nèi)皮細(xì)胞表面上表達(dá)和CD59進(jìn)行阻礙其補(bǔ)體抑制功能的非酶糖化作用的發(fā)現(xiàn)表明，糖尿病中補(bǔ)體抑制劑的利用度或有效性降低，CD55和CD59是糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定膜蛋白的兩種抑制劑。

Zhang等人的研究(Diabetes51:3499–3504，2002)探索了作為人非增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病特征的補(bǔ)體活化及其與抑制分子變化的關(guān)聯(lián)性。發(fā)現(xiàn)補(bǔ)體活化末端產(chǎn)物C5b-9的沉積發(fā)生在2型糖尿病病人眼供體的視網(wǎng)膜血管壁上，但在年齡匹配的非糖尿病供體血管則沒(méi)有發(fā)生。在糖尿病性視網(wǎng)膜中未檢測(cè)到經(jīng)典途徑特有的補(bǔ)體成分C1q和C4，這表明C5b-9是經(jīng)替代途徑產(chǎn)生的。糖尿病供體顯示，由GPI錨連接到質(zhì)膜上的兩種補(bǔ)體抑制劑CD55和CD59的視網(wǎng)膜水平顯著降低。在用10周鏈脲佐菌素誘發(fā)的糖尿病大鼠中觀察到視網(wǎng)膜血管中類(lèi)似的補(bǔ)體活化及視網(wǎng)膜CD55和CD59水平選擇性降低。因此，糖尿病似乎引起補(bǔ)體抑制劑和補(bǔ)體活化的缺損性調(diào)節(jié)，其在糖尿病性視網(wǎng)膜微血管病大多數(shù)其它表現(xiàn)之前。

Gerl等人(Investigative Ophthalmology and Visual Science 43:1104-08，2000)測(cè)定了受累于糖尿病性視網(wǎng)膜病眼內(nèi)的活化補(bǔ)體成分的存在。免疫組織化學(xué)研究表明，在所有50個(gè)糖尿病性視網(wǎng)膜病樣本中，在緊鄰玻璃膜(Bruch membrane)之下以及緊包住毛細(xì)血管的脈絡(luò)膜毛細(xì)血管層中都檢測(cè)到了補(bǔ)體C5b-9復(fù)合物大量沉積。C3d染色與C5b-9染色正相關(guān)，表示補(bǔ)體活化在原位發(fā)生的事實(shí)。此外，發(fā)現(xiàn)了玻連蛋白的陽(yáng)性染色，它與胞外C5b-9形成了穩(wěn)定的復(fù)合物。相反，沒(méi)有C反應(yīng)蛋白(CRP)、甘露聚糖結(jié)合凝集素(MBL)、C1q或C4的陽(yáng)性染色，表明補(bǔ)體活化不是通過(guò)C4依賴(lài)性途徑發(fā)生的。因此，C3d、C5b-9和玻連蛋白的存在表明，補(bǔ)體活化可能是通過(guò)糖尿病性視網(wǎng)膜病受累眼中脈絡(luò)膜毛細(xì)血管層中的替代途徑而完成的。補(bǔ)體活化可能是可造成眼組織疾病和視覺(jué)缺陷的病理性后遺癥的病因。因此，使用補(bǔ)體抑制劑可能是減少或阻斷糖尿病中發(fā)生的微血管損傷的有效治療方法。

胰島素依賴(lài)型糖尿病(IDDM，亦稱(chēng)I型糖尿病)是與不同類(lèi)型自身抗體的存在有關(guān)的自身免疫性疾病(Nicoloff等，Clin.Dev.Immunol.11:61-66，2004)。這些抗體和相應(yīng)抗原在循環(huán)中的存在導(dǎo)致形成循環(huán)免疫復(fù)合物(CIC)，已知CIC長(zhǎng)期保留在血液中。CIC在小血管中的沉積有可能導(dǎo)致伴有衰弱性臨床結(jié)果的微血管病。糖尿病兒童中，CIC與微血管并發(fā)癥的發(fā)生之間存在關(guān)聯(lián)性。這些發(fā)現(xiàn)表明CIC IgG的水平升高與早期糖尿病性視網(wǎng)膜病的發(fā)生有關(guān)，且補(bǔ)體途徑抑制劑對(duì)于阻斷糖尿病性視網(wǎng)膜病可能是有效的(Kotnik等，Croat.Med.J.44:707-11，2003)。此外，下游補(bǔ)體蛋白的形成和替代途徑的參與可能是IDDM中胰島細(xì)胞總體功能的影響因素，期望使用補(bǔ)體抑制劑來(lái)減少可能的損傷或限制細(xì)胞死亡(Caraher等，J.Endocrinol.162:143-53，1999)。

與健康對(duì)照相比，循環(huán)MBL濃度在1型糖尿病患者中顯著升高，并且這些MBL濃度與尿白蛋白排泄正相關(guān)(Hansen等，J.Clin.Endocrinol.Metab.88:4857-61，2003)。最近的臨床研究發(fā)現(xiàn)，MBL基因型高表達(dá)和低表達(dá)的頻率在1型糖尿病患者和健康對(duì)照之間是相似的(Hansen等，Diabetes53:1570-76，2004)。然而，如果糖尿病患者的MBL基因型高，則他們患腎病的風(fēng)險(xiǎn)顯著提高。這就表明MBL高水平和凝集素途徑補(bǔ)體活化可能是引起糖尿病性腎病發(fā)生的原因。該結(jié)論得到最新前瞻性研究的支持，在該研究中，對(duì)MBL水平與新近診斷為 1型糖尿病患者組群中蛋白尿發(fā)生之間的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行了分析(Hovind等，Diabetes54:1523-21，2005)。他們發(fā)現(xiàn)在1型糖尿病病程早期，高水平的MBL與稍后持續(xù)性蛋白尿的發(fā)生顯著相關(guān)。這些結(jié)果表明，MBL和凝集素途徑可能參與糖尿病血管并發(fā)癥的特定發(fā)病機(jī)制，而不僅僅是引起現(xiàn)有病變的速度加快。在最近的臨床研究(Hansen等，Arch.Intern.Med.166:2007-13，2006)中，在接受隨訪調(diào)查15年以上，已進(jìn)行基線充分鑒定的一組2型糖尿病患者中，對(duì)MBL水平進(jìn)行了測(cè)定。他們發(fā)現(xiàn)即使在對(duì)已知的混淆變量進(jìn)行調(diào)整后，MBL血漿水平高(>1000μg/L)的患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)比低水平MBL(<1000μg/L)患者明顯較高。

本發(fā)明另一方面，提供抑制患有非肥胖性糖尿病(IDDM)或IDDM的血管病、神經(jīng)病或視網(wǎng)膜病并發(fā)癥或者成人發(fā)病的(2型)糖尿病的受試者的MASP-2依賴(lài)性補(bǔ)體活化的方法，該方法通過(guò)將包含治療有效量的MASP-2抑制劑在藥物載體中的組合物給予受試者實(shí)施。可以全身性給予受試者M(jìn)ASP-2抑制劑，例如通過(guò)動(dòng)脈內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下或其它胃腸外給藥，或者對(duì)于非肽能抑制劑可口服給予。或者，可通過(guò)局部送遞到血管病、神經(jīng)病或視網(wǎng)膜病癥狀的部位來(lái)給藥。可在一段長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)定期給予MASP-2抑制劑以治療或控制慢性病，或者通過(guò)單次或連續(xù)給藥來(lái)治療急性病。

圍化療期的給藥和惡性腫瘤的治療

補(bǔ)體系統(tǒng)的活化還可能參與惡性腫瘤的發(fā)病機(jī)制。最近，使用多克隆抗體或單克隆抗體以及鏈霉抗生物素－生物素－過(guò)氧化物酶技術(shù)，對(duì)17個(gè)乳腺癌樣品和6個(gè)良性乳腺腫瘤樣品中的C5b-9補(bǔ)體復(fù)合物新抗原、IgG、C3、C4、S蛋白/玻連蛋白、纖連蛋白和巨噬細(xì)胞進(jìn)行了定位。所有的癌組織樣品在每個(gè)TNM階段，都有C5b-9沉積在腫瘤細(xì)胞膜上，有細(xì)顆粒沉積在細(xì)胞殘留物上，并且壞死區(qū)域中出現(xiàn)彌散性沉積物(Niculescu,F.等，Am.J.Pathol.140:1039-1043，1992)。

此外，補(bǔ)體活化可能是化學(xué)療法或放射治療的結(jié)果，因此抑制補(bǔ)體活化可能用作惡性腫瘤治療的輔助治療以減少醫(yī)源性炎癥。手術(shù)之前進(jìn)行化學(xué)治療和放射治療時(shí)，C5b-9的沉積更多更久。在所有良性病變樣品中都不存在C5b-9沉積物。S蛋白/玻連蛋白呈原纖維狀沉積物存在于結(jié)締組織基質(zhì)中，呈彌散性沉積物存在于腫瘤細(xì)胞周?chē)?，不如纖連蛋白沉積得多而持久。IgG、C3和C4沉積物只存在于癌樣品中。乳腺癌中C5b-9沉積物的存在表示補(bǔ)體活化及其隨后的致病效應(yīng)(Niculescu,F.等，Am.J.Pathol.140:1039-1043，1992)。

脈沖式可調(diào)諧染料激光(577nm)(PTDL)治療誘導(dǎo)了血紅蛋白凝固和組織壞死，這主要限于血管中。在經(jīng)PTDL照射的正常皮膚的研究中，主要發(fā)現(xiàn)如下：1)C3片段、C8、C9和MAC沉積在血管壁上；2)這些沉積物不是由于蛋白變性，因?yàn)樗鼈儍H僅在照射后7分鐘就很明顯了，與運(yùn)鐵蛋白立即沉積在紅細(xì)胞凝固部位上不同；3)顯示C3沉積物通過(guò)替代途徑放大了補(bǔ)體活化，這是特異性的反應(yīng)，因?yàn)榻M織壞死本身并不導(dǎo)致這種放大作用；和4)這些反應(yīng)是在多形核白細(xì)胞局部累積之前發(fā)生的。在血管瘤中組織壞死更明顯。壞死中心的較大血管瘤血管并不顯著地固定補(bǔ)體。相反，位于外周血管中的補(bǔ)體沉積類(lèi)似于正常皮膚中所觀察到的沉積，除了一個(gè)例外：在激光治療后立即在一些血管中檢測(cè)到C8、C9和MAC，這個(gè)發(fā)現(xiàn)與沒(méi)有C5轉(zhuǎn)化酶形成而直接發(fā)生MAC裝配相一致。這些結(jié)果表明，補(bǔ)體在PTDL誘導(dǎo)的血管壞死中被激活，并可能是隨后的炎癥反應(yīng)的原因。

腫瘤的光動(dòng)力學(xué)療法(PDT)引起了強(qiáng)烈的宿主免疫應(yīng)答，其表現(xiàn)之一是顯著的嗜中性粒細(xì)胞增多。除了由于PDT誘導(dǎo)的補(bǔ)體活化而釋放的補(bǔ)體片段(直接介質(zhì))以外，還有至少12種由于補(bǔ)體活性而引起的間接介質(zhì)。后者包括細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6、L-10、G-CSF和KC、血栓烷、前列腺素、白三烯、組胺和凝血因子(Cecic,I.等，Cancer Lett.183:43-51，2002)。

最后，可以展望MASP-2依賴(lài)性補(bǔ)體活化的抑制劑與標(biāo)準(zhǔn)治療方案聯(lián)用以治療癌癥。例如，用利妥昔單抗(rituximab)，即一種嵌合抗CD20單克隆抗體進(jìn)行治療可能與中度至嚴(yán)重的首劑不利作用相關(guān)，特別是在具有大量循環(huán)腫瘤細(xì)胞的患者中。在最近的首次輸注利妥昔單抗的研究中，在5位復(fù)發(fā)的輕度非霍奇金淋巴瘤(NHL)患者中，測(cè)得補(bǔ)體活化產(chǎn)物(C3b/c和C4b/c)和細(xì)胞因子(腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素6(IL-6)和IL-8)。輸注利妥昔單抗誘導(dǎo)快速的補(bǔ)體活化，其先于TNF-α、IL-6和IL-8的釋放。盡管研究組小，但是補(bǔ)體活化水平似乎是與輸注前的循環(huán)B細(xì)胞數(shù)量有關(guān)(r＝0.85；P＝0.07)，并與副作用的嚴(yán)重性有關(guān)。這些結(jié)果表明，補(bǔ)體在利妥昔單抗治療副作用的發(fā)生機(jī)制中起著關(guān)鍵作用。因?yàn)椴荒苡闷べ|(zhì)類(lèi)固醇防止補(bǔ)體活化，所以研究補(bǔ)體抑制劑在利妥昔單抗首次用藥期間的可能作用中具有重大意義(van der Kolk,L.E.等，Br.J.Haematol.115:807-811，2001)。

在本發(fā)明另一個(gè)方面，提供用于抑制待接受化學(xué)療法和/或放射療法治療的受試者的MASP-2依賴(lài)性補(bǔ)體活化的方法，所述療法包括但不限于癌癥狀況治療。該方法包括將包含治療有效量的MASP-2抑制劑在藥物載體中的組合物在圍化療期，即在實(shí)施化學(xué)療法和/或放射療法之前和/或期間和/或之后給予患者。例如，可以在實(shí)施化學(xué)療法或放射療法之前或者實(shí)施化學(xué)療法或放射療法同時(shí)給予本發(fā)明的MASP-2抑制劑組合物，并在整個(gè)治療過(guò)程中持續(xù)，以減輕化學(xué)療法和/或放射療法在非目標(biāo)健康組織中的有害影響。此外，可以在化學(xué)療法和/或放射療法之后給予MASP-2抑制劑組合物。要理解的是，化學(xué)療法和放射療法方案經(jīng)常需要重復(fù)治療，因此MASP-2抑制劑組合物的給藥也可重復(fù)，并與化學(xué)療法和放射療法相對(duì)一致。還認(rèn)為MASP-2抑制劑可用作化療藥物，單用或與其它化療藥物和/或放射療法聯(lián)用，以治療患有惡性腫瘤的患者?？梢赃m當(dāng)通過(guò)口服(用于非肽能藥物)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或其它非腸道途徑給藥。

內(nèi)分泌疾病

最近還發(fā)現(xiàn)與少數(shù)幾種內(nèi)分泌疾病或失調(diào)有關(guān)的補(bǔ)體系統(tǒng)，包括橋本甲狀腺炎(Hashimoto's thyroiditis)(Blanchin,S.等，Exp.Eye Res.73(6):887-96，2001)、應(yīng)激、焦慮癥以及其它涉及自垂體調(diào)節(jié)性釋放的催乳素、生長(zhǎng)因子或胰島素樣生長(zhǎng)因子和促腎上腺皮質(zhì)激素的潛在的激素失調(diào)(Francis,K.等，F(xiàn)ASEB J.17:2266-2268，2003；Hansen,T.K.，Endocrinology144(12):5422-9，2003)。

使用例如激素和細(xì)胞因子這類(lèi)分子，在內(nèi)分泌系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)之間形成了雙向溝通。最近，闡明了一條新途徑，通過(guò)該途徑，補(bǔ)體衍生的細(xì)胞因子C3a刺激垂體前葉激素釋放并激活對(duì)應(yīng)激反應(yīng)和炎癥控制的反射中樞下丘腦－垂體－腎上腺軸。C3a受體在分泌垂體激素的細(xì)胞和不分泌垂體激素的(濾泡星形(folliculostellate))細(xì)胞中表達(dá)。C3a和脫Arg的C3a(非炎性代謝物)刺激垂體細(xì)胞培養(yǎng)物釋放催乳素、生長(zhǎng)激素和促腎上腺皮質(zhì)激素。體內(nèi)給予重組C3a和脫Arg的C3a時(shí)，這些激素以及腎上腺皮質(zhì)酮的血清水平以劑量依賴(lài)性方式增加。這就表明補(bǔ)體途徑通過(guò)與內(nèi)分泌垂體腺的溝通來(lái)調(diào)節(jié)組織特異性和全身性炎癥反應(yīng)(Francis,K.等，F(xiàn)ASEB J.17:2266-2268，2003)。

越來(lái)越多的動(dòng)物和人體研究表明，生長(zhǎng)激素(GH)和胰島素樣生長(zhǎng)因子I(IGF-I)調(diào)節(jié)免疫功能。GH療法增加垂?；颊叩乃劳雎省＿^(guò)量的死亡幾乎完全是由敗血癥性休克或多器官衰竭所致，這表明可能涉及GH誘導(dǎo)的免疫和補(bǔ)體功能的調(diào)節(jié)。甘露聚糖結(jié)合凝集素(MBL)是在先天免疫中通過(guò)結(jié)合糖結(jié)構(gòu)之后激活補(bǔ)體級(jí)聯(lián)和炎癥而起重要作用的血漿蛋白。有證據(jù)支持，生長(zhǎng)激素對(duì)MBL水平有重要影響，因此可能對(duì)凝集素依賴(lài)性補(bǔ)體活化有重要影響(Hansen,T.K.，Endocrinology 144(12):5422-9，2003)。

甲狀腺過(guò)氧化物酶(TPO)是參與自身免疫性甲狀腺疾病的一種主要的自身抗原。TPO由大的N末端髓過(guò)氧化物酶樣模塊(module)、其后是補(bǔ)體調(diào)控蛋白(CCP)樣模塊和表皮生長(zhǎng)因子樣模塊組成。CCP模塊是參與C4補(bǔ)體成分活化的分子組分，在自身免疫性疾病中研究C4能否結(jié)合TPO并激活補(bǔ)體途徑。TPO通過(guò)其CCP模塊直接激活補(bǔ)體，而無(wú)需Ig的任何介導(dǎo)。而且，在橋本甲狀腺炎患者中，甲狀腺細(xì)胞過(guò)量表達(dá)C4和該補(bǔ)體途徑的所有下游成分。這些結(jié)果表明，TPO連同與補(bǔ)體途徑活化有關(guān)的其它機(jī)制一起，可能是橋本甲狀腺炎中觀察到的大量細(xì)胞遭破壞的原因(Blanchin,S.等，2001)。

因此，本發(fā)明一方面提供用于抑制MASP-2依賴(lài)性補(bǔ)體活化以治療內(nèi)分泌疾病的方法，該方法通過(guò)將包含治療有效量的MASP-2抑制劑在藥物載體中的組合物給予患有內(nèi)分泌疾病的受試者實(shí)施。根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行治療的疾病以非限制性實(shí)例方式包括：橋本甲狀腺炎、應(yīng)激、焦慮癥以及其它涉及自垂體調(diào)節(jié)性釋放的催乳素、生長(zhǎng)因子或胰島素樣生長(zhǎng)因子和促腎上腺皮質(zhì)激素的潛在的激素失調(diào)。可全身性給予受試者M(jìn)ASP-2抑制劑，例如通過(guò)動(dòng)脈內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、吸入、經(jīng)鼻、皮下或其它胃腸外給藥，或者對(duì)于非肽能抑制劑可口服給予。MASP-2抑制劑組合物可以與一種或多種另外的治療藥物聯(lián)用。可按照醫(yī)師規(guī)定重復(fù)給藥直到疾病消退。

眼科疾病

年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)是累及數(shù)百萬(wàn)成人的致盲疾病，然而對(duì)導(dǎo)致AMD發(fā)生的生物化學(xué)、細(xì)胞和/或分子事件的后遺癥了解甚少。AMD導(dǎo)致黃斑的漸進(jìn)性破壞，這與位于黃斑內(nèi)及其周?chē)?、視網(wǎng)膜后以及視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)與脈絡(luò)膜之間的稱(chēng)為脈絡(luò)膜小疣(drusen)的胞外沉積物的形成有關(guān)。最近的研究揭示，與炎癥和免疫介導(dǎo)過(guò)程相關(guān)的蛋白質(zhì)在脈絡(luò)膜小疣相關(guān)成分中是普遍的。已經(jīng)在視網(wǎng)膜、RPE和脈絡(luò)膜細(xì)胞檢測(cè)到編碼許多這類(lèi)分子的轉(zhuǎn)錄物。這些數(shù)據(jù)還證實(shí)，作為有效抗原呈遞細(xì)胞的樹(shù)突細(xì)胞與脈絡(luò)膜小疣的發(fā)生密切相關(guān)，補(bǔ)體活化是脈絡(luò)膜小疣內(nèi)部以及沿著RPE–脈絡(luò)膜界面的關(guān)鍵途徑(Hageman,G.S.等，Prog.Retin.Eye Res.，20:705-732，2001)。

若干項(xiàng)獨(dú)立研究表明，AMD與補(bǔ)體H因子(CFH)基因的遺傳多態(tài)性之間有強(qiáng)關(guān)聯(lián)性，其中在危險(xiǎn)性等位基因純合的個(gè)體中AMD的可能性增加了7.4倍(Klein,R.J.等，Science,308:362-364，2005；Haines等，Science 308:362-364，2005；Edwards等，Science308:263-264，2005)。CFH基因已經(jīng)被定位在染色體1q31，這是一個(gè)在AMD中涉及6個(gè)獨(dú)立連鎖掃描(linkage scan)的區(qū)域(參見(jiàn)例如Schultz,D.W.等，Hum.Mol.Genet.12:3315，2003)。已知CFH是補(bǔ)體系統(tǒng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。研究顯示，細(xì)胞上和循環(huán)中的CFH通過(guò)抑制將C3激活成為C3a和C3b以及通過(guò)鈍化現(xiàn)有的C3b來(lái)調(diào)節(jié)補(bǔ)體活性。已經(jīng)在AMD患者的玻璃膜(Brusch's membrane)、毛細(xì)血管間支柱(intercapillary pillar)中以及脈絡(luò)膜小疣內(nèi)部觀察到C5b-9的沉積(Klein等)。免疫熒光實(shí)驗(yàn)表明，在AMD中CFH的多態(tài)性可能引起補(bǔ)體沉積在脈絡(luò)膜毛細(xì)血管和脈絡(luò)膜血管中(Klein等)。

膜結(jié)合補(bǔ)體抑制劑補(bǔ)體受體1也定位在脈絡(luò)膜小疣中，但是在RPE細(xì)胞中用免疫組織化學(xué)法無(wú)法檢測(cè)出。相比之下，第二膜結(jié)合補(bǔ)體抑制劑膜膜輔因子蛋白存在于脈絡(luò)膜小疣結(jié)合的RPE細(xì)胞中以及脈絡(luò)膜小疣內(nèi)部的小的球形亞結(jié)構(gòu)組分中。這些以前未鑒定出的組分對(duì)特征性沉積在補(bǔ)體活化部位的補(bǔ)體成分C3的蛋白水解片段也具有強(qiáng)的免疫反應(yīng)性。有研究認(rèn)為這些結(jié)構(gòu)代表來(lái)自作為補(bǔ)體攻擊目標(biāo)的退行性RPE細(xì)胞的殘余碎片(Johnson,L.V.等，Exp.Eye Res.73:887-896，2001)。

這些多補(bǔ)體調(diào)節(jié)劑以及補(bǔ)體活化產(chǎn)物(C3a、C5a、C3b、C5b-9)的鑒定和定位使研究者斷定，慢性補(bǔ)體活化在脈絡(luò)膜小疣生物發(fā)生過(guò)程和AMD病因中起著重要作用(Hageman等，Progress Retinal Eye Res.20:705-32，2001)。在脈絡(luò)膜小疣中鑒定出C3和C5活化產(chǎn)物，并不會(huì)讓人認(rèn)了解補(bǔ)體是通過(guò)經(jīng)典途徑還是通過(guò)凝集素途徑或替代放大環(huán)路活化，正如本發(fā)明所了解的一樣，因?yàn)镃3和C5兩者是所有三條途徑共有的。然而，兩項(xiàng)研究使用對(duì)經(jīng)典途徑活化必不可少的識(shí)別成分C1q特異性的抗體，對(duì)脈絡(luò)膜小疣免疫標(biāo)記進(jìn)行了探索(Mullins等，F(xiàn)ASEB J.14:835-846，2000；Johnson等，Exp.Eye Res.70:441-449，2000)。兩項(xiàng)研究都得出結(jié)論，認(rèn)為在脈絡(luò)膜小疣中一般觀察不到C1q免疫標(biāo)記。這些有關(guān)C1q的否定結(jié)果表明，脈絡(luò)膜小疣中的補(bǔ)體活化不是通過(guò)經(jīng)典途徑產(chǎn)生的。另外，Mullins等人的研究(2000)報(bào)道了脈絡(luò)膜小疣的免疫復(fù)合物組分(IgG輕鏈、IgM)的免疫標(biāo)記是微弱可變的，這進(jìn)一步表明經(jīng)典途徑在該疾病過(guò)程期間發(fā)生的補(bǔ)體活化中起著次要作用。

最近，兩篇已發(fā)表的研究報(bào)告對(duì)小鼠(一種人CNV模型)中補(bǔ)體在激光誘導(dǎo)的脈絡(luò)膜新血管形成(CNV)的發(fā)展中的作用進(jìn)行了評(píng)價(jià)。Bora及其同事(2005)采用免疫組織學(xué)方法發(fā)現(xiàn)，在激光處理后，補(bǔ)體活化產(chǎn)物C3b和C5b-9(MAC)在新血管復(fù)合體上的顯著沉積(Bora等，J.Immunol.174:491-7，2005)。重要的是，在C3遺傳缺陷型小鼠(C3-/-小鼠)中不發(fā)生CNV，C3是所有補(bǔ)體活化途徑所需的必不可少的成分。在激光誘導(dǎo)的CNV后，對(duì)小鼠眼組織中的3種涉及CNV的血管生成因子VEGF、TGF-β₂和β-FGF的RNA信息水平進(jìn)行了評(píng)價(jià)。值得注意的是，補(bǔ)體缺失導(dǎo)致這些血管生成因子的RNA水平明顯降低。

Nozaki及其同事采用ELISA方法，證實(shí)了在激光誘導(dǎo)的CNV進(jìn)程的早期產(chǎn)生了有效的過(guò)敏毒素C3a和C5a(Nozaki等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.103:2328-33，2006)。此外，在野生型小鼠中，將C3和C5的這兩種生物活性片段注射到玻璃體腔之后誘導(dǎo)VEGF表達(dá)。與這些結(jié)果一致，Nozaki及其同事還表明遺傳上去除C3a和C5a的受體減少激光損傷后的VEGF表達(dá)和CNV形成，抗體介導(dǎo)的C3a或C5a中和或其受體的藥理阻斷也減少CNV。之前的研究證實(shí)，白細(xì)胞募集，特別是巨噬細(xì)胞募集在激光誘導(dǎo)的CNV中起著關(guān)鍵作用(Sakurai等，Invest.Opthomol.Vis.Sci.44:3578-85，2003；Espinosa-Heidmann等，Invest.Opthomol.Vis.Sci.44:3586-92，2003)。在Nozaki及其同事的論文(2006)中報(bào)道了在激光損傷后，C3aR(-/-)和C5aR(-/-)小鼠的白細(xì)胞募集顯著減少。

因此，本發(fā)明的一方面提供用于抑制MASP-2依賴(lài)性補(bǔ)體活化以治療年齡相關(guān)性黃斑變性或其它補(bǔ)體介導(dǎo)的眼科疾病的方法，該方法通過(guò)將包含治療有效量的MASP-2抑制劑在藥物載體中的組合物給予患有這些疾病或其它補(bǔ)體介導(dǎo)的眼科疾病的受試者實(shí)施?？赏ㄟ^(guò)例如凝膠劑、軟膏劑或滴劑形式的組合物經(jīng)沖洗或敷用而局部給予眼部MASP-2抑制劑組合物。或者，可全身性給予受試者M(jìn)ASP-2抑制劑，例如通過(guò)動(dòng)脈內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、吸入、經(jīng)鼻、皮下或其它胃腸外給藥，或者對(duì)于非肽能抑制劑可口服給予。MASP-2抑制劑組合物可與一種或多種另外治療藥物聯(lián)用，另外的治療藥物公開(kāi)于例如美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2004-0072809-A1。可按照醫(yī)師規(guī)定重復(fù)給藥直到疾病消退或得到控制。

凝血病

已形成補(bǔ)體系統(tǒng)在彌散性血管內(nèi)凝血("DIC")如顯著身體外傷繼發(fā)的DIC中的作用的證據(jù)。

前述研究已顯示，C4-/-小鼠不受免于腎再灌注損傷的保護(hù)(Zhou,W.等人，"Predominant role for C5b-9in renal ischemia/reperfusion injury,"J Clin Invest 105:1363-1371(2000))。為了研究C4-/-小鼠是否仍然能夠經(jīng)由經(jīng)典或凝集素途徑激活補(bǔ)體，在特異性針對(duì)經(jīng)典或凝集素途徑激活路線的試驗(yàn)中測(cè)定C4-/-血漿中的C3周轉(zhuǎn)。盡管在經(jīng)由經(jīng)典途徑觸發(fā)激活時(shí)未能觀察到C3裂解，但觀察到C4缺陷血清中的C3的高效凝集素途徑依賴(lài)性激活(圖30)。能夠看出，在MASP-2-/-小鼠體內(nèi)，甘露聚糖和酵母聚糖上的C3b沉積嚴(yán)重受損，即使在根據(jù)許多先前發(fā)表的關(guān)于替代途徑激活的論文，應(yīng)該對(duì)于所有三條途徑而言是允許的實(shí)驗(yàn)條件下。當(dāng)使用由免疫球蛋白復(fù)合體包被而不是甘露聚糖或酵母聚糖包被的孔中的相同血清時(shí)，在MASP-2+/+小鼠血清和MASP-2-/-血清中看到C3b沉積和因子B裂解，而在C1q耗盡的血清中看不到。這表明，當(dāng)經(jīng)由經(jīng)典活性提供初始的C3b時(shí)，在MASP-2-/-血清中促進(jìn)了替代途徑激活。圖30C圖示以下令人驚訝的發(fā)現(xiàn)：C3能夠在C4缺陷血漿中以凝集素途徑依賴(lài)的形式被有效激活。

這個(gè)“C4旁路”通過(guò)經(jīng)由用可溶性甘露聚糖或甘露糖預(yù)溫育血漿的凝集素途徑激活的抑制而廢止。

異常、非免疫性的補(bǔ)體系統(tǒng)的激活對(duì)人是具有潛在危險(xiǎn)性的，并且可能還在血液途徑激活中起重要作用，尤其是在其中炎性途徑和血液途徑均被激活的嚴(yán)重外傷的情況下。在正常的健康者體內(nèi)，C3轉(zhuǎn)化率是總血漿C3蛋白的<5％。在猛烈的感染(包括敗血癥和免疫復(fù)合物病)中，C3轉(zhuǎn)化率在補(bǔ)體水平常常低于正常水平的情況下以約30％重建自身，這歸因于增加的利用和池(pool)分布的改變。大于30％的即時(shí)C3途徑激活通常產(chǎn)生血管舒張和組織體液?jiǎn)适У拿黠@的臨床證據(jù)。在30％C3轉(zhuǎn)化率以上，引發(fā)機(jī)制主要是非免疫性的，并且導(dǎo)致的臨床表現(xiàn)對(duì)患者有害。健康者體內(nèi)和對(duì)照患病者體內(nèi)的補(bǔ)體C5水平似乎遠(yuǎn)比C3更穩(wěn)定。C5水平的顯著降低和/或轉(zhuǎn)化與患者對(duì)非正常多發(fā)傷(例如，道路交通事故)和可能形成休克肺綜合癥的反應(yīng)相關(guān)聯(lián)。因此，超過(guò)30％的血管池的補(bǔ)體C3激活的任何證據(jù)、或任何C5介入的任何證據(jù)、或兩者可被認(rèn)為可能是患者中有害病理變化的前兆。

C3和C5兩者均放出作用于釋放血管舒張化合物的肥大細(xì)胞和嗜堿細(xì)胞的過(guò)敏毒素(C3a和C5a)。它們建立趨化性梯度以將多形核細(xì)胞(PMN)導(dǎo)向免疫干擾(一種有益的應(yīng)答)的中心，但在這里它們不一樣，因?yàn)镃5a對(duì)這些吞噬細(xì)胞具有特異性凝塊(凝集)作用，防止它們遠(yuǎn)離反應(yīng)位點(diǎn)的隨機(jī)移動(dòng)。在感染的正常對(duì)照中，C3激活C5。然而，在多發(fā)傷中，C5似乎被廣泛激活，系統(tǒng)地生成C5a過(guò)敏毒素。此不受控制的活性引起多形白細(xì)胞在血管系統(tǒng)內(nèi)部凝塊，并且然后這些凝塊被掃入肺的毛細(xì)血管，它們由于過(guò)氧化物的放出而在其中滯留并且產(chǎn)生局部損傷作用。盡管不愿被理論限制，但該機(jī)制在急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)的發(fā)病機(jī)理中或許是重要的，不過(guò)此見(jiàn)解最近受到了質(zhì)疑。在體外，C3a過(guò)敏毒素能夠顯示為強(qiáng)有力的血小板凝聚體，但它們的體內(nèi)介入較少被定義，并且傷口修復(fù)中的血小板物質(zhì)和纖溶酶的釋放可僅次要地包含補(bǔ)體C3?？赡艿氖?，C3激活的延時(shí)上升為生成DIC所必需。

除以上概述的能夠解釋外傷與DIC之間的聯(lián)系的被激活補(bǔ)體成分的細(xì)胞和血管效應(yīng)之外，出現(xiàn)的科學(xué)發(fā)現(xiàn)識(shí)別了補(bǔ)體與凝血系統(tǒng)之間的直接分子連接和功能性交互。支持?jǐn)?shù)據(jù)已從對(duì)C3缺陷小鼠的研究中獲得。由于C3是各補(bǔ)體途徑的共享成分，所以預(yù)測(cè)C3缺陷小鼠缺乏全部補(bǔ)體功能。然而，意外地，C3缺陷小鼠能夠完美激活終端補(bǔ)體成分(Huber-Lang,M.等人，"Generation of C5a in the absence of C3:a new complement activation pathway,"Nat.Med 12:682-687(2006))。研究深入揭示，終端補(bǔ)體成分的C3依賴(lài)性激活是通過(guò)凝血酶(凝血級(jí)聯(lián)的限速酶)介導(dǎo)的(Huber等人，2006)。初始補(bǔ)體活化之后介導(dǎo)凝血酶激活的分子成分仍然是難以捉摸的。

本發(fā)明人闡明了什么被認(rèn)為是補(bǔ)體與凝血級(jí)聯(lián)之間的交互的分子基礎(chǔ)，并且將MASP-2識(shí)別為連接該兩個(gè)系統(tǒng)的中心控制點(diǎn)。除眾所周知的C2和C4補(bǔ)體蛋白之外，對(duì)MASP-2的底物特異性的生化研究已將凝血酶原鑒定為可能的底物。MASP-2在功能相關(guān)的位點(diǎn)特異性裂解凝血酶原，生成凝血酶，即凝血級(jí)聯(lián)的限速酶(Krarup,A.等人，"Simultaneous Activation of Complement and Coagulation by MBL-Associated Serine Protease 2,"PLoS.ONE.2:e623(2007))。由MASP-2生成的凝血酶能夠促進(jìn)纖維蛋白在限定的重建的體外系統(tǒng)中的沉積，證明MASP-2裂解的功能相關(guān)性(Krarup等人，2007)。如以下本文實(shí)例中所論述，發(fā)明人通過(guò)證明凝集素途徑激活之后正常嚙齒動(dòng)物血清內(nèi)的凝血酶激活，進(jìn)一步印證了這個(gè)發(fā)現(xiàn)的生理學(xué)意義，并且證明了這個(gè)過(guò)程通過(guò)中和MASP-2單克隆抗體而被阻斷。

MASP-2可在凝集素途徑中代表中心分支點(diǎn)，能夠促進(jìn)補(bǔ)體系統(tǒng)和凝血系統(tǒng)兩者的激活。由于凝集素途徑激活是對(duì)許多類(lèi)型的外傷性損傷的生理應(yīng)答，所以本發(fā)明人認(rèn)為，并發(fā)的(由補(bǔ)體成分介導(dǎo)的)系統(tǒng)性炎癥和(經(jīng)由凝血途徑介導(dǎo)的)彌散性凝血能夠通過(guò)MASP-2激活兩個(gè)途徑的能力來(lái)解釋。這些發(fā)現(xiàn)清楚地表明MASP-2在DIC產(chǎn)生中的作用和MASP-2抑制在治療或預(yù)防DIC中的治療學(xué)益處。MASP-2可提供補(bǔ)體系統(tǒng)與凝血系統(tǒng)之間的分子連接，并且凝集素途徑的激活在其發(fā)生在外傷的背景下時(shí)能夠經(jīng)由MASP-2凝血酶軸直接引發(fā)凝血系統(tǒng)的激活，提供外傷和DIC之間的機(jī)制聯(lián)系。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，MASP-2的抑制會(huì)抑制凝集素途徑激活并且減少過(guò)敏毒素C3a和C5a兩者的生成。據(jù)信，C3激活的延時(shí)上升為生成DIC所必需。

所以，本發(fā)明的一個(gè)方面因而提供用于抑制MASP-2依賴(lài)性補(bǔ)體活化以治療彌散性血管內(nèi)凝血或其他補(bǔ)體介導(dǎo)的凝血障礙的方法，該方法通過(guò)向患有此類(lèi)病癥或處于發(fā)生此類(lèi)病癥風(fēng)險(xiǎn)中的受試者給予組合物來(lái)進(jìn)行，該組合物包含藥物載體中的治療有效量的MASP-2抑制劑(例如，抗MASP-2抗體或其片段、肽抑制劑或小分子抑制劑)。在一些實(shí)施方案中，MASP-2抑制劑能夠阻斷已被激活的MASP-2。將MASP-2抑制組合物適當(dāng)給予受試者全身，諸如通過(guò)動(dòng)脈內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、吸入、鼻、皮下或其他腸胃外給藥，或?qū)τ诜请哪軇┒钥赡芡ㄟ^(guò)口服給藥。給藥可按照醫(yī)師決定而重復(fù)，直到已消除或控制病癥為止。本發(fā)明的這個(gè)方面的方法可用于治療DIC，其繼發(fā)于敗血癥、包括神經(jīng)性創(chuàng)傷(例如，急性顱腦損傷，見(jiàn)Kumura,E.等人，Acta Neurochirurgica85:23-28(1987))的嚴(yán)重外傷、感染(細(xì)菌、病毒、真菌、寄生蟲(chóng))、癌癥、產(chǎn)科并發(fā)癥、肝病、嚴(yán)重中毒反應(yīng)(例如，蛇咬傷、昆蟲(chóng)咬傷、輸血反應(yīng))、休克、中暑、移植排異反應(yīng)、血管動(dòng)脈瘤、肝功能衰竭、通過(guò)化學(xué)治療或放射治療的癌癥療法、燒傷、意外輻射暴露及其他病因。見(jiàn)(例如)Becker J.U.和Wira C.R."Disseminated Intravascular Coagulation"emedicine.medscape.com/9/10/2009。對(duì)于外傷或其他急性事件繼發(fā)的DIC而言，MASP-2抑制組合物可在外傷性損傷之后立即給藥，或在外傷誘發(fā)損傷或狀況(諸如對(duì)被認(rèn)為處于DIC風(fēng)險(xiǎn)中的患者的手術(shù))之前、期間、緊接著或之后一至七天或更長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)(諸如在24小時(shí)至72小時(shí)內(nèi))給藥。在一些實(shí)施方案中，MASP-2抑制組合物可以速效劑型適當(dāng)給藥，諸如通過(guò)包含MASP-2抑制劑組合物的溶液滴注劑的靜脈內(nèi)或動(dòng)脈內(nèi)輸送。

IV.MASP-2抑制劑

一方面，本發(fā)明提供抑制MASP-2依賴(lài)性補(bǔ)體活化的不利作用的方法。MASP-2抑制劑是以有效抑制有生命的受試者的MASP-2依賴(lài)性補(bǔ)體活化的量給予的。在本發(fā)明這個(gè)方面的實(shí)施中，代表性的MASP-2抑制劑包括：抑制MASP-2生物活性的分子(例如小分子抑制劑、抗MASP-2抗體或者與MASP-2相互作用或妨礙蛋白間相互作用的封閉性肽)，以及減少M(fèi)ASP-2表達(dá)的分子(例如MASP-2反義核酸分子、MASP-2特異性RNAi分子和MASP-2核酶)，從而阻止MASP-2激活替代補(bǔ)體途徑。MASP-2抑制劑可單獨(dú)使用作為主要療法，或者與其它治療藥物聯(lián)用作為輔助療法以增強(qiáng)其它藥物治療的治療益處。

MASP-2依賴(lài)性補(bǔ)體活化抑制以補(bǔ)體系統(tǒng)成分的至少一種以下的變化為特征，所述變化是由于根據(jù)本發(fā)明的方法給予MASP-2抑制劑所致：MASP-2依賴(lài)性補(bǔ)體活化系統(tǒng)產(chǎn)物C4b、C3a、C5a和/或C5b-9(MAC)形成或產(chǎn)生的抑制(測(cè)定法參見(jiàn)例如實(shí)施例2)、使用未致敏兔或豚鼠紅細(xì)胞在溶血分析中評(píng)價(jià)的替代補(bǔ)體活化的減少、C4裂解和C4b沉積的減少(測(cè)定法參見(jiàn)例如實(shí)施例2)，或者C3裂解和C3b沉積的減少(測(cè)定法參見(jiàn)例如實(shí)施例2)。

根據(jù)本發(fā)明，使用有效抑制MASP-2依賴(lài)性補(bǔ)體活化系統(tǒng)的MASP-2抑制劑。用于實(shí)施本發(fā)明這個(gè)方面的MASP-2抑制劑包括例如抗MASP-2抗體及其片段、MASP-2抑制肽、小分子、MASP-2可溶性受體和表達(dá)抑制劑。MASP-2抑制劑可通過(guò)阻斷MASP-2的生物學(xué)功能而抑制MASP-2依賴(lài)性補(bǔ)體活化系統(tǒng)。例如，抑制劑可有效阻斷MASP-2蛋白間的相互作用，阻礙MASP-2二聚化或裝配，阻斷Ca²⁺結(jié)合，阻礙MASP-2絲氨酸蛋白酶活性位點(diǎn)，或者可減少M(fèi)ASP-2蛋白表達(dá)。

在一些實(shí)施方案中，MASP-2抑制劑選擇性抑制MASP-2補(bǔ)體活化，保持了C1q依賴(lài)性補(bǔ)體活化系統(tǒng)功能上的完整性。

在一個(gè)實(shí)施方案中，用于本發(fā)明方法的MASP-2抑制劑是特異性的MASP-2抑制劑，其與包含SEQ ID NO:6的多肽特異性結(jié)合的親和力是與補(bǔ)體系統(tǒng)中的其它抗原結(jié)合的親和力的至少10倍高。在另一個(gè)實(shí)施方案中，MASP-2抑制劑與包含SEQ ID NO:6的多肽特異性結(jié)合的結(jié)合親和力是與補(bǔ)體系統(tǒng)中的其它抗原結(jié)合的結(jié)合親和力的至少100倍高。MASP-2抑制劑的結(jié)合親和力可使用合適的結(jié)合測(cè)定法進(jìn)行測(cè)定。

MASP-2多肽具有類(lèi)似于C1補(bǔ)體系統(tǒng)的蛋白酶MASP-1、MASP-3以及C1r和C1s的分子結(jié)構(gòu)。SEQ ID NO:4所示的cDNA分子編碼MASP-2的代表性實(shí)例(由SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列組成)，提供帶有前導(dǎo)序列(氨基酸1-15)的人MASP-2多肽，分泌后被切割，產(chǎn)生成熟形式的人MASP-2(SEQ ID NO:6)。如圖2中所示，人MASP 2基因包括十二個(gè)外顯子。人MASP-2cDNA由外顯子B、C、D、F、G、H、I、J、K和L編碼?？勺兗艚赢a(chǎn)生了20kDa蛋白，稱(chēng)為MBL相關(guān)的蛋白19(“MAp19”，亦稱(chēng)“sMAP”)(SEQ ID NO:2)，由圖2所示外顯子B、C、D和E產(chǎn)生的(SEQ ID NO:1)編碼。SEQ ID NO:50所示的cDNA分子編碼鼠MASP-2(由SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列組成)，提供帶有前導(dǎo)序列的鼠MASP-2多肽，分泌后被切割，產(chǎn)生成熟形式的鼠MASP-2(SEQ ID NO:52)。SEQ ID NO:53所示的cDNA分子編碼大鼠MASP-2(由SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列組成)，提供帶有前導(dǎo)序列的大鼠MASP-2多肽，分泌后被切割，產(chǎn)生成熟形式的大鼠MASP-2(SEQ ID NO:55)。

本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解的是，SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:53中公開(kāi)的序列分別代表人、小鼠和大鼠MASP-2的單個(gè)等位基因，發(fā)生等位基因變異和可變剪接是預(yù)料之中的。SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:53所示核苷酸序列的等位基因變體，包括含有沉默突變的變體以及其中導(dǎo)致氨基酸序列改變的突變的變體，都屬本發(fā)明的范圍。可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)探測(cè)cDNA或基因組文庫(kù)而從不同個(gè)體中克隆MASP-2序列的等位基因變體。

人MASP-2蛋白(SEQ ID NO:6)的結(jié)構(gòu)域見(jiàn)圖3A，包括N端C1r/C1s/海膽Vegf/骨形成蛋白(CUBI)結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:6的氨基酸1-121)、表皮生長(zhǎng)因子樣結(jié)構(gòu)域(氨基酸122-166)、第二CUBI結(jié)構(gòu)域(氨基酸167-293)以及串聯(lián)的補(bǔ)體調(diào)控蛋白結(jié)構(gòu)域和絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域。MASP 2基因的可變剪接產(chǎn)生圖3B中所示的MAp19。MAp19是含有MASP-2的N端CUB1-EGF區(qū)的非酶蛋白，具有得自圖2所示外顯子E的4個(gè)額外殘基(EQSL)。

研究表明，一些蛋白質(zhì)通過(guò)蛋白間的相互作用與MASP-2結(jié)合或者與MASP-2相互作用。例如，已知MASP-2結(jié)合凝集素蛋白MBL、H-纖維膠凝蛋白和L-纖維膠凝蛋白，并與之形成Ca²⁺依賴(lài)性復(fù)合物。研究表明，每種MASP-2/凝集素復(fù)合物通過(guò)蛋白質(zhì)C4和C2的MASP-2依賴(lài)性裂解來(lái)激活補(bǔ)體(Ikeda,K.等，J.Biol.Chem.262:7451-7454，1987；Matsushita,M.等，J.Exp.Med.176:1497-2284，2000；Matsushita,M.等，J.Immunol.168:3502-3506，2002)。研究表明，MASP-2的CUB1-EGF結(jié)構(gòu)域?qū)τ贛ASP-2與MBL的締合是必不可少的(Thielens,N.M.等，J.Immunol.166:5068，2001)。研究還表明，CUB1EGFCUBII結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)MASP-2的二聚化，這是形成活性MBL復(fù)合物所需要的(Wallis,R.等，J.Biol.Chem.275:30962-30969，2000)。因此，可對(duì)結(jié)合已知對(duì)MASP-2依賴(lài)性補(bǔ)體活化重要的MASP-2靶區(qū)或者阻礙該區(qū)域的MASP-2抑制劑進(jìn)行鑒定。

抗MASP-2抗體

在本發(fā)明這個(gè)方面的一些實(shí)施方案中，MASP-2抑制劑包括抑制MASP-2依賴(lài)性補(bǔ)體活化系統(tǒng)的抗MASP-2抗體。用于本發(fā)明這個(gè)方面的抗MASP-2抗體包括得自任何產(chǎn)生抗體的哺乳動(dòng)物的多克隆抗體、單克隆抗體或重組抗體，并且可以是多特異性的、嵌合的、人源化的、抗獨(dú)特型抗體以及抗體片段?？贵w片段包括Fab、Fab'、F(ab)₂、F(ab')₂、Fv片段、scFv片段和單鏈抗體，見(jiàn)本文的進(jìn)一步描述。

文獻(xiàn)中記載了幾種抗MASP-2抗體，其中的一些列于下表1?？墒褂帽疚乃鰷y(cè)定法篩選前述抗MASP-2抗體抑制MASP-2依賴(lài)性補(bǔ)體活化系統(tǒng)的能力。例如，已經(jīng)鑒定出阻斷MASP-2依賴(lài)性補(bǔ)體活化的抗大鼠MASP-2Fab2抗體，詳情見(jiàn)本文實(shí)施例24和25。一旦鑒定出發(fā)揮MASP-2抑制劑作用的抗MASP-2抗體，就可將它用于產(chǎn)生抗獨(dú)特型抗體，并用于鑒定其它MASP-2結(jié)合分子，如見(jiàn)下文進(jìn)一步描述的。

表1：來(lái)自文獻(xiàn)的MASP-2特異性抗體

效應(yīng)子功能降低的抗MASP-2抗體

在本發(fā)明這個(gè)方面的一些實(shí)施方案中，抗MASP-2抗體降低了效應(yīng)子功能，來(lái)減輕可能由經(jīng)典補(bǔ)體途徑活化產(chǎn)生的炎癥。研究表明IgG分子引發(fā)經(jīng)典補(bǔ)體途徑的能力存在于分子的Fc部分(Duncan,A.R.等，Nature 332:738-740 1988)。其中通過(guò)酶切割除去分子Fc部分的IgG分子缺少這種效應(yīng)子功能(參見(jiàn)Harlow，Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York,1988)。因此，可通過(guò)具有使效應(yīng)子功能減到最低的基因工程Fc序列，或者成為人IgG2或IgG4同種型，由此去掉分子的Fc部分，從而產(chǎn)生效應(yīng)子功能降低的抗體。

可對(duì)IgG重鏈的Fc部分進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)操作來(lái)產(chǎn)生效應(yīng)子功能降低的抗體，如本文實(shí)施例9所述，也描述于Jolliffe等，Int’l Rev.Immunol.10:241-250，1993和Rodrigues等，J.Immunol.151:6954-6961，1998。效應(yīng)子功能降低的抗體還包括激活補(bǔ)體和/或與Fc受體相互作用的能力降低的人IgG2和IgG4同種型(Ravetch,J.V.等，Annu.Rev.Immunol.9:457-492，1991；Isaacs,J.D.等，J.Immunol.148:3062-3071，1992；van de Winkel,J.G.等，Immunol.Today 14:215-221，1993)?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的若干方法之一，來(lái)產(chǎn)生對(duì)包括IgG2或IgG4同種型在內(nèi)的人MASP-2特異性的人源化抗體或完全人抗體，如Vaughan,T.J.等，Nature Biotechnical 16:535-539，1998所述。

抗MASP-2抗體的產(chǎn)生

可使用MASP-2多肽(例如全長(zhǎng)MASP-2)或使用帶有抗原性MASP-2表位的肽(如MASP-2多肽部分)來(lái)產(chǎn)生抗MASP-2抗體。免疫原性肽可以少至五個(gè)氨基酸殘基。例如，可以使用包括SEQ ID NO:6全部氨基酸序列的MASP-2多肽來(lái)誘導(dǎo)用于本發(fā)明方法的抗MASP-2多肽?？梢詫⒁阎獏⑴c蛋白間相互作用的特定MASP-2結(jié)構(gòu)域(例如CUBI)和CUBIEGF結(jié)構(gòu)域以及包括絲氨酸蛋白酶活性部位的區(qū)域表達(dá)為實(shí)施例5中所述的重組多肽并用作抗原。此外，包含MASP-2多肽(SEQ ID NO:6)至少6個(gè)氨基酸的部分的肽也可用來(lái)誘導(dǎo)MASP-2抗體。下表2中提供了用于誘導(dǎo)MASP-2抗體的MASP-2衍生抗原的其它實(shí)例。用于產(chǎn)生抗體的MASP-2肽和多肽可作為天然多肽、或者重組肽或合成肽以及無(wú)催化活性的重組多肽(例如MASP-2A)而被分離出來(lái)，如實(shí)施例5-7進(jìn)一步描述的。在本發(fā)明這個(gè)方面的一些實(shí)施方案中，使用實(shí)施例8和實(shí)施例9中所述轉(zhuǎn)基因小鼠品系獲得抗MASP-2抗體，如下文進(jìn)一步描述的。

用于產(chǎn)生抗MASP-2抗體的抗原還包括融合多肽，例如MASP-2或其部分與免疫球蛋白多肽或者與麥芽糖結(jié)合蛋白的融合物。多肽免疫原可以是全長(zhǎng)分子或其部分。如果多肽部分是半抗原樣的，則最好可將這部分結(jié)合或連接到大分子載體(例如匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或破傷風(fēng)類(lèi)毒素)上用于免疫。

表2：MASP-2衍生的抗原

多克隆抗體

可通過(guò)使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的方法，用MASP-2多肽或其免疫原性部分免疫動(dòng)物來(lái)制備抗MASP-2的多克隆抗體。參見(jiàn)例如Green等，"Production of Polyclonal Antisera,"，載于Immunochemical Protocols(Manson主編)，第105頁(yè)，另詳見(jiàn)實(shí)施例6?？赏ㄟ^(guò)使用佐劑來(lái)增加MASP-2多肽的免疫原性，所述佐劑包括無(wú)機(jī)凝膠(例如氫氧化鋁)或弗氏佐劑(完全或不完全)、表面活性劑(例如溶血卵磷脂)、普流羅尼克多元醇(pluronic polyol)、聚陰離子、油乳液、匙孔血藍(lán)蛋白和二硝基苯酚。多克隆抗體一般由馬、牛、狗、雞、大鼠、小鼠、兔、豚鼠、山羊或綿羊等動(dòng)物產(chǎn)生。或者，用于本發(fā)明的抗MASP-2抗體也可得自近似人類(lèi)的靈長(zhǎng)類(lèi)。在狒狒中產(chǎn)生診斷用和治療用抗體的通用技術(shù)可參見(jiàn)例如Goldenberg等人的國(guó)際專(zhuān)利公布號(hào)WO 91/11465和Losman,M.J.等，Int.J.Cancer 46:310，1990。然后采用本領(lǐng)域眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)方法，從這些被免疫過(guò)的動(dòng)物的血液中獲得含有免疫活性抗體的血清。

單克隆抗體

在一些實(shí)施方案中，MASP-2抑制劑是抗MASP-2單克隆抗體?？筂ASP-2單克隆抗體是高度特異性的，針對(duì)單一MASP-2表位。本文所用的修飾語(yǔ)“單克隆”是指獲自基本同源的抗體群的抗體性質(zhì)，不得理解為需要通過(guò)任何特定方法來(lái)產(chǎn)生的抗體。可采用通過(guò)培養(yǎng)物中的連續(xù)細(xì)胞系以提供抗體分子產(chǎn)生的任何技術(shù)來(lái)獲得單克隆抗體，例如Kohler,G.等，Nature256:495，1975中所述的雜交瘤方法，或者可以通過(guò)重組DNA方法制備單克隆抗體(參見(jiàn)例如Cabilly的美國(guó)專(zhuān)利第4,816,567號(hào))。也可以采用有關(guān)技術(shù)從噬菌體抗體文庫(kù)中分離單克隆抗體(參見(jiàn)Clackson,T.等，Nature 352:624-628，1991和Marks,J.D.等，J.Mol.Biol.222:581-597，1991)。這些抗體可以是任何免疫球蛋白類(lèi)別，包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD及其任何亞類(lèi)。

例如，可通過(guò)將包含MASP-2多肽或其部分的組合物注射給合適的哺乳動(dòng)物(例如BALB/c小鼠)而獲得單克隆抗體。在預(yù)定時(shí)間之后，從小鼠中取出脾細(xì)胞，使之懸浮于細(xì)胞培養(yǎng)基中。然后將脾細(xì)胞與無(wú)限增殖細(xì)胞系融合形成雜交瘤。將形成的雜交瘤在細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，對(duì)它們產(chǎn)生抗MASP-2單克隆抗體的能力進(jìn)行篩選。進(jìn)一步描述抗MASP-2單克隆抗體產(chǎn)生的實(shí)例詳見(jiàn)實(shí)施例7。(也可參見(jiàn)Current Protocols in Immunology,第1卷，John Wiley&Sons,第2.5.1-2.6.7頁(yè)，1991)。

可通過(guò)使用轉(zhuǎn)基因小鼠來(lái)獲得人單克隆抗體，所述轉(zhuǎn)基因小鼠已被工程改造以在響應(yīng)抗原攻擊時(shí)產(chǎn)生特異性人抗體。在這種技術(shù)中，將人免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因座元件引入得自胚胎干細(xì)胞系的小鼠品系中，所述胚胎干細(xì)胞系含有被定向破壞的內(nèi)源免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因座。該轉(zhuǎn)基因小鼠可合成對(duì)人抗原(例如本文所述MASP-2抗原)特異性的人抗體，可使用該小鼠來(lái)產(chǎn)生分泌人MASP-2抗體的雜交瘤，其通過(guò)采用常規(guī)Kohler-Milstein技術(shù)，將來(lái)自這些動(dòng)物的B細(xì)胞與合適的骨髓瘤細(xì)胞系融合(詳見(jiàn)實(shí)施例7)。具有人免疫球蛋白基因組的轉(zhuǎn)基因小鼠是市售的(例如購(gòu)自Abgenix,Inc.,Fremont CA和Medarex,Inc.,Annandale,N.J.)。用于從轉(zhuǎn)基因小鼠中獲得人抗體的方法描述于例如Green,L.L.等，Nature Genet.7:13，1994；Lonberg,N.等，Nature 368:856，1994和Taylor,L.D.等，Int.Immun.6:579，1994。

可通過(guò)各種已確立的技術(shù)從雜交瘤培養(yǎng)物中分離和純化單克隆抗體。這些分離技術(shù)包括用A蛋白瓊脂糖凝膠親和層析、大小排阻層析和離子交換層析(參見(jiàn)例如Coligan，第2.7.1-2.7.12頁(yè)和第2.9.1-2.9.3頁(yè)、Baines等，"Purification of Immunoglobulin G(IgG)(免疫球蛋白G(IgG)的純化)",載于Methods in Molecular Biology,The Humana Press,Inc.，第10卷，第79-104頁(yè)，1992)。

多克隆抗體、單克隆抗體或得自噬菌體的抗體一旦產(chǎn)生，首先便要測(cè)定其對(duì)MASP-2結(jié)合的特異性。可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種測(cè)定法來(lái)檢測(cè)特異性結(jié)合MASP-2的抗體。示例性的測(cè)定法包括通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行的蛋白質(zhì)印跡法或免疫沉淀分析法(描述于例如Ausubel等)、免疫電泳、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定、斑點(diǎn)印跡法、抑制或競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定法以及夾心測(cè)定法(描述于Harlow和Land,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1988)。一旦鑒定出特異性結(jié)合MASP-2的抗體，便通過(guò)以下幾種測(cè)定法之一，測(cè)定抗MASP-2抗體作為MASP-2抑制劑發(fā)揮作用的能力：例如凝集素特異性C4裂解測(cè)定法(描述于實(shí)施例2)、C3b沉積測(cè)定法(描述于實(shí)施例2)或者C4b沉積測(cè)定法(描述于實(shí)施例2)。

本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以容易地測(cè)定抗MASP-2單克隆抗體的親和力(參見(jiàn)例如Scatchard,A.，NY Acad.Sci.51:660-672，1949)。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于本發(fā)明方法的抗MASP-2單克隆抗體能結(jié)合MASP-2，其結(jié)合親和力<100nM，優(yōu)選<10nM，最優(yōu)選<2nM。

嵌合/人源化抗體

用于本發(fā)明方法的單克隆抗體包括嵌合抗體以及這些抗體的片段，其中重鏈和/或輕鏈部分與得自特定物種的抗體的相應(yīng)序列相同或同源，或者屬于特定抗體類(lèi)別或亞類(lèi)，而鏈的其余部分與得自另一物種的抗體的相應(yīng)序列相同或同源，或者屬于另一抗體類(lèi)別或亞類(lèi)(Cabilly的美國(guó)專(zhuān)利第4,816,567號(hào)和Morrison,S.L.等，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 81:6851-6855，1984)。

用于本發(fā)明的一種嵌合抗體的形式是人源化單克隆抗MASP-2抗體。非人(例如鼠)抗體的人源化形式是嵌合抗體，含有得自非人免疫球蛋白的最小序列。通過(guò)將非人(例如小鼠)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)從小鼠免疫球蛋白的可變重鏈和可變輕鏈轉(zhuǎn)移到人可變區(qū)，從而產(chǎn)生人源化單克隆抗體。然后，典型的做法是將人抗體的其余部分代入非人對(duì)應(yīng)部分的構(gòu)架區(qū)。此外，人源化抗體可包括受體抗體或供體抗體中不存在的殘基。這些修飾被用來(lái)進(jìn)一步改進(jìn)抗體性能。一般而言，人源化抗體將包含基本上全部的至少一種、通常兩種可變區(qū)，其中所有或基本上所有的超變環(huán)都對(duì)應(yīng)于非人免疫球蛋白的超變環(huán)，所有或基本上所有的Fv構(gòu)架區(qū)都是人免疫球蛋白序列的Fv構(gòu)架區(qū)。人源化抗體任選可包含至少一部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)，通常為人免疫球蛋白的恒定區(qū)。更多詳情可參見(jiàn)Jones,P.T.等，Nature 321:522-525，1986；Reichmann,L.等，Nature 332:323-329，1988；以及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596，1992。

用于本發(fā)明的人源化抗體包括至少含有MASP-2結(jié)合CDR3的人單克隆抗體。此外，可以替換Fc部分以便產(chǎn)生IgA或IgM以及人IgG抗體。這些人源化抗體將具有特殊的臨床效用，因?yàn)樗鼈兲禺愋缘刈R(shí)別人MASP-2，但是卻不會(huì)引起人體對(duì)抗體本身的免疫應(yīng)答。因此它們更適用于人體的體內(nèi)給藥，尤其是必須重復(fù)或長(zhǎng)期給藥的時(shí)候。

由鼠抗MASP-2單克隆抗體獲得人源化抗MASP-2抗體的實(shí)例見(jiàn)本文實(shí)施例10。人源化單克隆抗體的生產(chǎn)技術(shù)還記載于例如Jones,P.T.等，Nature 321:522，1986；Carter,P.等，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 89:4285，1992；Sandhu,J.S.，Crit.Rev.Biotech.12:437，1992；Singer,I.I.等，J.Immun.150:2844，1993；Sudhir(主編)，Antibody Engineering Protocols,Humana Press,Inc.，1995；Kelley,"Engineering Therapeutic Antibodies,"載于Protein Engineering:Principles and Practice,Cleland等(主編)，John Wiley&Sons,Inc.，第399-434頁(yè)，1996；以及Queen的美國(guó)專(zhuān)利第5,693,762號(hào)(1997)。此外，還有從特定鼠抗體區(qū)合成人源化抗體的商業(yè)實(shí)體，例如Protein Design Labs(Mountain View，CA)。

重組抗體

也可使用重組方法制備抗MASP-2抗體。例如，可使用人免疫球蛋白表達(dá)文庫(kù)(可獲自例如Stratagene,Corp.，La Jolla,CA)產(chǎn)生人抗體片段(V_H、V_L、Fv、Fd、Fab或F(ab')₂)來(lái)制備人抗體。然后使用類(lèi)似于產(chǎn)生嵌合抗體的技術(shù)，將這些片段用以構(gòu)建完整的人抗體。

抗獨(dú)特型抗體

一旦鑒定出具有所需抑制活性的抗MASP-2抗體，便可采用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)將這些抗體用來(lái)產(chǎn)生類(lèi)似部分MASP-2的抗獨(dú)特型抗體，參見(jiàn)例如Greenspan,N.S.等，F(xiàn)ASEB J.7:437，1993。例如，結(jié)合MASP-2并競(jìng)爭(zhēng)性抑制補(bǔ)體活化所需的MASP-2蛋白的相互作用的抗體可用來(lái)產(chǎn)生類(lèi)似MASP-2蛋白上的MBL結(jié)合位點(diǎn)的抗獨(dú)特型抗體，從而結(jié)合并中和MASP-2的結(jié)合配體，例如MBL。

免疫球蛋白片段

用于本發(fā)明方法的MASP-2抑制劑不僅包括完整的免疫球蛋白分子，而且還包括眾所周知的片段，這些片段包括Fab、Fab'、F(ab)₂、F(ab')₂和Fv片段、scFv片段、雙抗體、線性抗體、單鏈抗體分子以及由抗體片段形成的多特異性抗體。

本領(lǐng)域眾所周知的是，只有小部分的抗體分子即互補(bǔ)位參與抗體與其表位的結(jié)合(參見(jiàn)例如Clark,W.R.，The Experimental Foundations of Modern Immunology,Wiley&Sons,Inc.，NY，1986)?？贵w的pFc'區(qū)和Fc區(qū)是經(jīng)典補(bǔ)體途徑的效應(yīng)子，但是不參與抗原結(jié)合。其中pFc'區(qū)已被酶切割的抗體，或者所產(chǎn)生的沒(méi)有pFc'區(qū)的抗體被稱(chēng)為F(ab')₂片段，它保留了完整抗體的抗原結(jié)合部位。分離的F(ab')₂片段由于有兩個(gè)抗原結(jié)合部位而被稱(chēng)為二價(jià)單克隆抗體。類(lèi)似地，其中Fc區(qū)已被酶切割的抗體，或者所產(chǎn)生的沒(méi)有Fc區(qū)的抗體被稱(chēng)為Fab片段，它保留了完整抗體分子的一個(gè)抗原結(jié)合部位。

抗體片段可通過(guò)蛋白水解而獲得，例如通過(guò)常規(guī)方法經(jīng)胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化完整抗體。例如，可通過(guò)用胃蛋白酶進(jìn)行抗體酶切割來(lái)產(chǎn)生抗體片段，從而提供稱(chēng)為F(ab')₂的5S片段。該片段可再使用硫醇還原試劑切割，得到3.5S Fab'單價(jià)片段。任選可使用二硫鍵裂解產(chǎn)生的巰基的封端基團(tuán)來(lái)進(jìn)行裂解反應(yīng)。作為替代方法，使用胃蛋白酶的酶切割直接產(chǎn)生兩個(gè)單價(jià)Fab片段和一個(gè)Fc片段。這些方法記載于例如Goldenberg的美國(guó)專(zhuān)利第4,331,647號(hào)；Nisonoff,A.等，Arch.Biochem.Biophys.89:230，1960；Porter,R.R.，Biochem.J.73:119，1959；Edelman等，載于Methods in Enzymology,1:422，Academic Press,1967；以及Coligan的第2.8.1-2.8.10頁(yè)和第2.10.-2.10.4頁(yè)。

在一些實(shí)施方案中，優(yōu)選使用缺乏Fc區(qū)的抗體片段以避免Fc結(jié)合Fcγ受體時(shí)激活經(jīng)典補(bǔ)體途徑。有幾種方法可產(chǎn)生避免與Fcγ受體相互作用的MoAb。例如，單克隆抗體的Fc區(qū)可通過(guò)使用蛋白水解酶部分消化(例如無(wú)花果蛋白酶消化)，從而用化學(xué)法去除，因此產(chǎn)生例如結(jié)合抗原的抗體片段，例如Fab或F(ab)₂片段(Mariani,M.等，Mol.Immunol.28:69-71，1991)。或者，可以在構(gòu)建本文所述的人源化抗體期間使用不結(jié)合Fcγ受體的人γ4IgG同種型。也可使用本文所述重組技術(shù)來(lái)改造缺少Fc結(jié)構(gòu)域的抗體、單鏈抗體和結(jié)合抗原的結(jié)構(gòu)域。

單鏈抗體片段

或者，可以制備對(duì)MASP-2特異性的單一肽鏈結(jié)合分子，其中重鏈和輕鏈Fv區(qū)相連接。Fv片段可通過(guò)肽接頭相連，形成單鏈抗原結(jié)合蛋白(scFv)。通過(guò)構(gòu)建包含編碼V_H和V_L結(jié)構(gòu)域的DNA序列的結(jié)構(gòu)基因來(lái)制備這些單鏈抗原結(jié)合蛋白，各結(jié)構(gòu)域之間通過(guò)寡核苷酸連接。將結(jié)構(gòu)基因插入表達(dá)載體中，隨后將其引入宿主細(xì)胞(例如大腸桿菌)中。重組宿主細(xì)胞合成了由接頭肽橋接兩個(gè)V結(jié)構(gòu)域的單一多肽鏈。scFv的制備方法記載于例如Whitlow等，"Methods:A Companion to Methods in Enzymology"2:97，1991；Bird等，Science 242:423，1988；Ladner的美國(guó)專(zhuān)利第4,946,778號(hào)；Pack,P.等，Bio/Technology 11:1271，1993。

舉例來(lái)說(shuō)，可通過(guò)將淋巴細(xì)胞體外暴露于MASP-2多肽，并在噬菌體或類(lèi)似載體中選擇抗體展示文庫(kù)(例如通過(guò)使用固定化的或標(biāo)記的MASP-2蛋白或肽)，獲得MASP-2特異性scFv。可通過(guò)對(duì)噬菌體或細(xì)菌(如大腸桿菌)上展示的隨機(jī)肽文庫(kù)進(jìn)行篩選而獲得編碼具有可能的MASP-2多肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽的基因。這些隨機(jī)肽展示文庫(kù)可用于篩選與MASP-2相互作用的肽。構(gòu)建和篩選這些隨機(jī)肽展示文庫(kù)的技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的(Lardner的美國(guó)專(zhuān)利第5,223,409號(hào)；Lardner的美國(guó)專(zhuān)利第4,946,778號(hào)；Lardner的美國(guó)專(zhuān)利第5,403,484號(hào)；Lardner的美國(guó)專(zhuān)利第5,571,698號(hào)；以及Kay等，Phage Display of Peptides and Proteins,Academic Press,Inc.，1996)，且隨機(jī)肽展示文庫(kù)和用于篩選這些文庫(kù)的試劑盒是市售的，例如購(gòu)自CLONTECH Laboratories,Inc.(Palo Alto,Calif.)、Invitrogen Inc.(San Diego,Calif.)、New England Biolabs,Inc.(Beverly,Mass.)以及Pharmacia LKB Biotechnology Inc.(Piscataway,N.J.)。

用于本發(fā)明這個(gè)方面的抗MASP-2抗體片段的另一種形式是編碼單一互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的肽，其結(jié)合MASP-2抗原的表位并抑制MASP-2依賴(lài)性補(bǔ)體活化。可通過(guò)構(gòu)建編碼目標(biāo)抗體CDR的基因而獲得CDR肽(“最小識(shí)別單元”)。例如可通過(guò)使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)從抗體生成細(xì)胞的RNA合成可變區(qū)，從而制備這些基因(參見(jiàn)例如Larrick等，Methods:A Companion to Methods in Enzymology2:106，1991；Courtenay-Luck,"Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies(單克隆抗體的遺傳操作)"，載于Monoclonal Antibodies:Production,Engineering and Clinical Application,Ritter等(主編)，第166頁(yè)，Cambridge University Press,1995；以及Ward等，"Genetic Manipulation and Expression of Antibodies(抗體的遺傳操作和表達(dá))"，載于Monoclonal Antibodies:Principles and Applications,Birch等(主編)，第137頁(yè)，Wiley-Liss,Inc.，1995)。

將本文所述MASP-2抗體給予有需要的受試者以抑制MASP-2依賴(lài)性補(bǔ)體活化。在一些實(shí)施方案中，MASP-2抑制劑是效應(yīng)子功能降低的高親和性人或人源化單克隆抗MASP-2抗體。

肽抑制劑

在本發(fā)明這個(gè)方面的一些實(shí)施方案中，MASP-2抑制劑包括分離的MASP-2肽抑制劑，其包括抑制MASP-2依賴(lài)性補(bǔ)體活化系統(tǒng)的分離的天然肽抑制劑和合成肽抑制劑。本文所用術(shù)語(yǔ)“分離的MASP-2肽抑制劑”是指通過(guò)結(jié)合MASP-2、與MASP-2競(jìng)爭(zhēng)以結(jié)合凝集素途徑中的其它識(shí)別分子(例如MBL、H-纖維膠凝蛋白、M-纖維膠凝蛋白或L-纖維膠凝蛋白)從而抑制MASP-2依賴(lài)性補(bǔ)體活化的肽，和/或直接與MASP-2相互作用以抑制MASP-2依賴(lài)性補(bǔ)體活化的肽，所述肽是基本純化的，其基本上沒(méi)有其它與之一起存在于自然界以達(dá)到實(shí)用和適于其既定用途程度的物質(zhì)。

已經(jīng)使用肽抑制劑成功地在體內(nèi)阻礙了蛋白間的相互作用和催化位點(diǎn)。例如，最近，結(jié)構(gòu)上與LFA-1有關(guān)的粘著分子的肽抑制劑已獲準(zhǔn)臨床用于凝血病(Ohman,E.M.等，European Heart J.16:50-55，1995)。研究揭示短的線性肽(<30個(gè)氨基酸)防止或阻礙整聯(lián)蛋白依賴(lài)性粘附(Murayama,O.等，J.Biochem.120:445-51，1996)。還使用長(zhǎng)度范圍為25-200個(gè)氨基酸殘基的較長(zhǎng)肽，成功阻斷了整聯(lián)蛋白依賴(lài)性粘附(Zhang,L.等，J.Biol.Chem.271(47):29953-57，1996)。一般而言，較長(zhǎng)的肽抑制劑具有比短肽高的親和性和/或較慢的解離速度，因此是更有效的抑制劑。研究還表明，環(huán)肽抑制劑是有效的整聯(lián)蛋白體內(nèi)抑制劑，用于治療人炎性疾病(Jackson,D.Y.等，J.Med.Chem.40:3359-68，1997)。產(chǎn)生環(huán)肽的一種方法包括其中肽的末端氨基酸是半胱氨酸的肽的合成，從而使得肽能夠通過(guò)末端氨基酸之間的二硫鍵以環(huán)狀形式存在，已經(jīng)證實(shí)用于治療造血系統(tǒng)腫瘤時(shí)，改善了親和性和體內(nèi)半衰期(例如Larson的美國(guó)專(zhuān)利第6,649,592號(hào))。

合成的MASP-2肽抑制劑

通過(guò)模擬對(duì)于MASP-2功能是重要的靶區(qū)的氨基酸序列，來(lái)示例性說(shuō)明用于本發(fā)明這個(gè)方面方法中的MASP-2抑制肽。用于實(shí)施本發(fā)明方法的抑制肽的大小范圍為約5個(gè)氨基酸至約300個(gè)氨基酸。表3提供用于實(shí)施本發(fā)明這個(gè)方面的示例性抑制肽的一覽表。可通過(guò)幾種測(cè)定法中的一種對(duì)候選MASP-2抑制肽作為MASP-2抑制劑起作用的能力進(jìn)行測(cè)定，這些測(cè)定法包括例如凝集素特異性的C4裂解測(cè)定法(參見(jiàn)實(shí)施例2)以及C3b沉積測(cè)定法(參見(jiàn)實(shí)施例2)。

在一些實(shí)施方案中，MASP-2抑制肽得自MASP-2多肽并選自全長(zhǎng)的成熟MASP-2蛋白(SEQ ID NO:6)，或者得自MASP-2蛋白的特定結(jié)構(gòu)域，例如CUBI結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:8)、CUBIEGF結(jié)構(gòu)域(SEQ ID N O:9)、EGF結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:11)以及絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:12)。如前所述，研究表明CUBEGFCUBII區(qū)是二聚化和與MBL結(jié)合所需要的(Thielens等，同上)。特別是在鑒定人體帶有Asp105至Gly105純合突變的研究證實(shí)，MASP-2的CUBI結(jié)構(gòu)域中的肽序列TFRSDYN(SEQ ID NO:16)參與結(jié)合MBL，所述突變導(dǎo)致從MBL復(fù)合物上失去MASP-2(Stengaard-Pedersen,K.等，New England J.Med.349:554-560，2003)。

MASP-2抑制肽還可得自MAp19(SEQ ID NO:3)。如實(shí)施例30所述，MAp19(SEQ ID NO:3)(亦稱(chēng)sMAP)具有下調(diào)被MBL復(fù)合物激活的凝集素途徑的能力(Iwaki等，J.Immunol.177:8626-8632，2006)。雖然不希望受理論的束縛，但是很有可能的是，sMAP能夠占據(jù)MBL中的MASP-2/sMAP結(jié)合部位，阻止MASP-2與MBL的結(jié)合。據(jù)報(bào)道，sMAP在與纖維膠凝蛋白A締合時(shí)與MASP-2競(jìng)爭(zhēng)，抑制通過(guò)纖維膠凝蛋白A/MASP-2復(fù)合物的補(bǔ)體活化(Endo Y.等，Immunogenetics 57:837-844(2005))。

在一些實(shí)施方案中，MASP-2抑制肽得自結(jié)合MASP-2并參與凝集素補(bǔ)體途徑的凝集素蛋白。已經(jīng)鑒定出參與該途徑的幾種不同的凝集素，包括甘露聚糖結(jié)合凝集素(MBL)、L-纖維膠凝蛋白、M-纖維膠凝蛋白和H-纖維膠凝蛋白(Ikeda,K.等，J.Biol.Chem.262:7451-7454，1987；Matsushita,M.等，J.Exp.Med.176:1497-2284，2000；Matsushita,M.等，J.Immunol.168:3502-3506，2002)。這些凝集素作為同源三聚體亞基的寡聚體而存在于血清中，每個(gè)亞基都具有帶有糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域的N端膠原樣纖維。已經(jīng)證實(shí)這些不同的凝集素結(jié)合MASP-2，凝集素/MASP-2復(fù)合物通過(guò)裂解蛋白C4和C2而激活補(bǔ)體。H-纖維膠凝蛋白具有24個(gè)氨基酸的氨基端區(qū)、帶有11個(gè)Gly-Xaa-Yaa重復(fù)的膠原樣結(jié)構(gòu)域、12個(gè)氨基酸的頸部結(jié)構(gòu)域和207個(gè)氨基酸的血纖蛋白原樣結(jié)構(gòu)域(Matsushita,M.等，J.Immunol.168:3502-3506，2002)。H-纖維膠凝蛋白結(jié)合GlcNAc，并使被得自鼠傷寒沙門(mén)氏菌(S.typhimurium)、明尼蘇達(dá)沙門(mén)氏菌(S.minnesota)和大腸桿菌的LPS包被的人紅細(xì)胞凝集。已經(jīng)證實(shí)H-纖維膠凝蛋白結(jié)合MASP-2和MAp19并激活凝集素途徑，出處同上。L-纖維膠凝蛋白/P35也結(jié)合GlcNAc，已被證實(shí)與人血清中的MASP-2和MAp19締合，并且證實(shí)該復(fù)合物激活凝集素途徑(Matsushita,M.等，J.Immunol.164:2281，2000)。因此，用于本發(fā)明的MASP-2抑制肽可包括選自MBL蛋白(SEQ ID NO:21)、H-纖維膠凝蛋白(Genbank檢索號(hào)NM_173452)、M-纖維膠凝蛋白(Genbank檢索號(hào)O00602)以及L-纖維膠凝蛋白(Genbank檢索號(hào)NM_015838)的至少5個(gè)氨基酸的區(qū)域。

更準(zhǔn)確地講，科學(xué)家已經(jīng)鑒定出MBL上的MASP-2結(jié)合部位是在12個(gè)Gly-X-Y三聯(lián)體“GKD GRD GTK GEK GEP GQG LRG LQG POG KLG POG NOG PSG SOG PKG QKG DOG KS”(SEQ ID NO:26)中，該三聯(lián)體位于MBP膠原樣結(jié)構(gòu)域C端部分的鉸鏈和頸之間(Wallis,R.等，J.Biol.Chem.279:14065，2004)。該MASP-2結(jié)合部位區(qū)在人H-纖維膠凝蛋白和人L-纖維膠凝蛋白中也是高度保守的。研究指出，所有三種包括氨基酸序列“OGK-X-GP”(SEQ ID NO:22)的凝集素蛋白中存在共有結(jié)合部位，該氨基酸序列中字母“O”表示羥脯氨酸，字母“X”表示疏水殘基(Wallis等，2004，同上)。因此，在一些實(shí)施方案中，用于本發(fā)明這個(gè)方面的MASP-2抑制肽長(zhǎng)度為至少6個(gè)氨基酸并且包含SEQ ID NO:22。已經(jīng)證實(shí)包括氨基酸序列“GLR GLQ GPO GKL GPO G”(SEQ ID NO:24)并得自MBL的肽體外結(jié)合MASP-2(Wallis等，2004，同上)。為增強(qiáng)與MASP-2的結(jié)合，可合成在每端鄰接兩個(gè)GPO三聯(lián)體的肽(“GPO GPO GLR GLQ GPO GKL GPO GGP OGP O”SEQ ID NO:25)，以增強(qiáng)天然MBL蛋白中所發(fā)現(xiàn)的三股螺旋的形成(詳述見(jiàn)Wallis,R.等，J.Biol.Chem.279:14065，2004)。

MASP-2抑制肽也可得自人H-纖維膠凝蛋白，其包括來(lái)自H-纖維膠凝蛋白的共有MASP-2結(jié)合區(qū)的序列“GAO GSO GEK GAO GPQ GPO GPO GKM GPK GEO GDO”(SEQ ID NO:27)。還包括得自人L-纖維膠凝蛋白的肽，其包括來(lái)自L-纖維膠凝蛋白的共有MASP-2結(jié)合區(qū)的序列“GCO GLO GAO GDK GEA GTN GKR GER GPO GPO GKA GPO GPN GAO GEO”(SEQ ID NO:28)。

MASP-2抑制肽還可得自C4裂解部位，例如連接到抗凝血酶III C端部分的C4裂解部位“LQRALEILPNRVTIKANRPFLVFI”(SEQ ID NO:29)(Glove,G.I.等，Mol.Immunol.25:1261(1988))。

表3：示例性的MASP-2抑制肽

注：字母“O”表示羥脯氨酸。字母“X”為疏水殘基。

可對(duì)得自C4裂解部位的肽以及抑制MASP-2絲氨酸蛋白酶部位的其它肽進(jìn)行化學(xué)修飾，以使其成為不可逆的蛋白酶抑制劑。例如，合適的修飾可包括但是不必限于C端、Asp或Glu、或者添加到功能側(cè)鏈上的鹵甲基酮(Br、Cl、I、F)；在氨基或其它功能側(cè)鏈上的鹵乙酰(或其它α-鹵乙酰)基團(tuán)；在氨基端或羧基端或者功能側(cè)鏈上的環(huán)氧基或含亞胺的基團(tuán)；或者在氨基端或羧基端或者其它功能側(cè)鏈上的亞氨酸酯。這些修飾提供了通過(guò)肽的共價(jià)結(jié)合而永久抑制酶的這一優(yōu)勢(shì)。這可能導(dǎo)致有效劑量較低和/或給予肽抑制劑需要的頻率較低。

除了上述抑制肽以外，用于本發(fā)明方法的MASP-2抑制肽包括含有按本文所述方法獲得的抗MASP-2MoAb的結(jié)合MASP-2的CDR3區(qū)的肽。用于合成肽的CDR區(qū)的序列可以通過(guò)本領(lǐng)域已知方法來(lái)測(cè)定。重鏈可變區(qū)是通常長(zhǎng)度范圍為100-150個(gè)氨基酸的肽。輕鏈可變區(qū)是通常長(zhǎng)度范圍為80-130個(gè)氨基酸的肽。在重鏈和輕鏈可變區(qū)內(nèi)部的CDR序列包括大約僅3-25個(gè)氨基酸序列，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員很容易對(duì)其進(jìn)行測(cè)序。

本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解的是，上述的MASP-2抑制肽的基本同源的變異也可具有MASP-2抑制活性。示例性的變異包括但不必限于在題述肽的羧基端或氨基端有插入、缺失、置換和/或添加的氨基酸的肽及其混合物。因此，我們認(rèn)為這些具有MASP-2抑制活性的同源肽可用于本發(fā)明的方法。所述肽還可包括復(fù)制基序和具有保守取代的其它修飾。本文其它部分所述的保守變體包括一種氨基酸與具有同樣電荷、大小或疏水性等性質(zhì)的另一種氨基酸的交換。

可以對(duì)MASP-2抑制肽進(jìn)行修飾以增加溶解度和/或使正或負(fù)電荷最大化，以便使之更類(lèi)似于完整蛋白的區(qū)段。衍生物可以具有或沒(méi)有本文所公開(kāi)肽的精確的一級(jí)氨基酸結(jié)構(gòu)，只要衍生物在功能上仍保留所需要的MASP-2抑制特性。所述修飾可包括氨基酸取代，即被通常已知的20種氨基酸之一或另一種氨基酸取代、被附加有所需特征(例如酶降解抗性)的衍生化氨基酸或取代氨基酸取代或者被D氨基酸取代，或者被另外的模擬一種或多種氨基酸或肽的天然構(gòu)象和功能的分子或化合物(例如糖)取代；氨基酸缺失；氨基酸插入，即插入通常已知的20種氨基酸之一或另一種氨基酸、插入附加有所需特征(例如酶降解抗性)的衍生化氨基酸或取代氨基酸或者插入D氨基酸，或者插入另外的模擬一種或多種氨基酸或肽的天然構(gòu)象和功能的分子或化合物(例如糖)；或者被另外的模擬母體肽的天然構(gòu)象、電荷分布和功能的分子或化合物(例如糖或核酸單體)取代。肽也可通過(guò)乙?；蝓０坊M(jìn)行修飾。

可根據(jù)肽生物合成、糖生物合成等已知技術(shù)合成衍生的抑制肽。開(kāi)始時(shí)，技術(shù)人員可根據(jù)合適的計(jì)算機(jī)程序來(lái)確定目標(biāo)肽的構(gòu)象。一旦知道本文所公開(kāi)的肽的構(gòu)象，技術(shù)人員便能以合理設(shè)計(jì)方式來(lái)確定能夠在一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行什么類(lèi)別的取代，以便形成的衍生物保留了母體肽的基本構(gòu)象和電荷分布，但卻可以擁有母體肽中不存在的特征或者其特征優(yōu)于母體肽存在的特征。一旦鑒定出候選衍生分子，就可使用本文所述測(cè)定法來(lái)測(cè)定衍生物，以確定它們是否發(fā)揮MASP-2抑制劑的作用。

MASP-2抑制肽的篩選

還可使用分子建模和合理分子設(shè)計(jì)來(lái)產(chǎn)生和篩選模擬MASP-2關(guān)鍵結(jié)合區(qū)的分子結(jié)構(gòu)并抑制MASP-2的補(bǔ)體活性的肽。用于建模的分子結(jié)構(gòu)包括抗MASP-2單克隆抗體的CDR區(qū)，以及已知對(duì)MASP-2功能十分重要的目標(biāo)區(qū)域，這些區(qū)域包括如前所述的二聚化所需要的區(qū)域、涉及結(jié)合MBL的區(qū)域以及絲氨酸蛋白酶活性部位。用于鑒定結(jié)合特定靶的肽的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。例如，分子印記可用于從頭構(gòu)建大分子結(jié)構(gòu)，例如結(jié)合特定分子的肽。參見(jiàn)例如Shea,K.J.，"Molecular Imprinting of Synthetic Network Polymers:The De Novo synthesis of Macromolecular Binding and Catalytic Sites(合成網(wǎng)狀聚合物的分子印記：大分子結(jié)合部位和催化部位的合成)"TRIP2(5)，1994。

舉例來(lái)說(shuō)，制備MASP-2結(jié)合肽模擬物的一種方法如下。使已知MASP-2結(jié)合肽或具有MASP-2抑制作用的抗MASP-2抗體的結(jié)合區(qū)的功能性單體(模板)聚合。然后去除模板，接著在模板留下的空隙中使第二類(lèi)單體聚合，得到具有類(lèi)似于模板的一種或多種所需性質(zhì)的新分子。除了以這種方式制備肽外，還可制備作為MASP-2抑制劑的其它MASP-2結(jié)合分子，例如多糖、核苷、藥物、核蛋白、脂蛋白、糖類(lèi)、糖蛋白、類(lèi)固醇、脂質(zhì)和其它生物活性材料。該方法適用于設(shè)計(jì)各種各樣比其天然對(duì)應(yīng)物更穩(wěn)定的生物學(xué)模擬物，因?yàn)樗鼈兺ǔＪ峭ㄟ^(guò)功能單體的自由基聚合而成的，產(chǎn)生了具有生物不能降解骨架的化合物。

肽合成

可采用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)制備MASP-2抑制肽，例如最初由Merrifield提出的固相合成技術(shù)(Merrifield，J.Amer.Chem.Soc.85:2149-2154，1963)。例如，可根據(jù)生產(chǎn)商提供的說(shuō)明書(shū)，使用Applied Biosystems 431A肽合成儀(Foster City,Calif.)實(shí)現(xiàn)自動(dòng)合成。其它技術(shù)參見(jiàn)例如Bodanszky,M.等，Peptide Synthesis,第二版，John Wiley&Sons,1976，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它參考文獻(xiàn)。

還可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)遺傳工程技術(shù)來(lái)制備肽。例如，可通過(guò)酶的方法將編碼肽的核酸插入表達(dá)載體中，進(jìn)行DNA表達(dá)，在所需要的氨基酸存在下將DNA翻譯成肽，從而來(lái)制備肽。然后，使用層析技術(shù)或電泳技術(shù)將肽純化，或者通過(guò)將編碼肽的序列與編碼載體蛋白的核酸序列同步插入表達(dá)載體中的載體蛋白方法，所述載體蛋白可以與肽融合，隨后再?gòu)碾纳锨邢聛?lái)?？刹捎脤游黾夹g(shù)、電泳技術(shù)或免疫學(xué)技術(shù)(例如經(jīng)載體蛋白的抗體而結(jié)合到樹(shù)脂上)分離蛋白－肽融合物?？墒褂没瘜W(xué)方法或酶方法(例如通過(guò)水解酶)來(lái)裂解肽。

也可按照常規(guī)技術(shù)，用重組宿主細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)用于本發(fā)明方法的MASP-2抑制肽。為了表達(dá)MASP-2抑制肽編碼序列，必須將編碼肽的核酸分子與控制表達(dá)載體轉(zhuǎn)錄表達(dá)的調(diào)節(jié)序列有效連接，然后引入宿主細(xì)胞中。除了轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列(例如啟動(dòng)子和增強(qiáng)子)之外，表達(dá)載體可包括翻譯調(diào)節(jié)序列和標(biāo)記基因，標(biāo)記基因適合于選擇攜帶表達(dá)載體的細(xì)胞。

可用“基因儀”并用亞磷酰胺法等方法來(lái)合成編碼MASP-2抑制肽的核酸分子。如果例如基因或基因片段合成的應(yīng)用中需要化學(xué)合成的雙鏈DNA，則分別制備每條互補(bǔ)鏈。短基因(60-80個(gè)堿基對(duì))的生產(chǎn)在技術(shù)上簡(jiǎn)單易行，可通過(guò)合成互補(bǔ)鏈，然后將它們退火來(lái)實(shí)現(xiàn)。對(duì)于較長(zhǎng)基因的生產(chǎn)來(lái)說(shuō)，要由長(zhǎng)度為20-100個(gè)核苷酸的單鏈片段按模塊形式裝配成合成基因(雙鏈)。有關(guān)多核苷酸合成的綜述參見(jiàn)例如Glick和Pasternak,"Molecular Biotechnology,Principles and Applications of Recombinant DNA"，ASM Press,1994；Itakura,K.等，Annu.Rev.Biochem.53:323，1984；以及Climie,S.等，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA87:633，1990。

小分子抑制劑

在一些實(shí)施方案中，MASP-2抑制劑是小分子抑制劑，包括具有低分子量的天然和合成物質(zhì)，例如肽、肽模擬物和非肽抑制劑(包括寡核苷酸和有機(jī)化合物)。MASP-2的小分子抑制劑可根據(jù)抗MASP-2抗體的可變區(qū)的分子結(jié)構(gòu)而產(chǎn)生。

小分子抑制劑也可根據(jù)MASP-2的晶體結(jié)構(gòu)采用計(jì)算機(jī)藥物設(shè)計(jì)來(lái)進(jìn)行設(shè)計(jì)和產(chǎn)生(Kuntz I.D.等，Science 257:1078，1992)。已經(jīng)證實(shí)大鼠MASP-2的晶體結(jié)構(gòu)(Feinberg,H.等，EMBO J.22:2348-2359，2003)。應(yīng)用Kuntz等描述的方法，將MASP-2晶體結(jié)構(gòu)坐標(biāo)輸入計(jì)算機(jī)程序(如DOCK)，計(jì)算機(jī)將輸出預(yù)期結(jié)合MASP-2的小分子結(jié)構(gòu)的清單。這些計(jì)算機(jī)程序的使用為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。例如，使用HIV-1蛋白酶抑制劑的晶體結(jié)構(gòu)，通過(guò)運(yùn)用程序DOCK，評(píng)價(jià)從劍橋晶體學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)(Cambridge Crystallographic database)中查找到的化合物與酶結(jié)合部位的匹配性，來(lái)鑒定作為HIV-1蛋白酶抑制劑的獨(dú)特的非肽配體(Kuntz,I.D.等，J.Mol.Biol.161:269-288，1982；DesJarlais,R.L.等，PNAS 87:6644-6648，1990)。

應(yīng)用例如實(shí)施例7所述的MASP-2結(jié)合測(cè)定法來(lái)篩選用計(jì)算機(jī)方法鑒定為潛在的MASP-2抑制劑的一系列小分子結(jié)構(gòu)。然后在例如實(shí)施例2所述的功能測(cè)定法中對(duì)被確定為結(jié)合MASP-2的小分子進(jìn)行分析，以確定它們是否抑制MASP-2依賴(lài)性補(bǔ)體活化。

MASP-2可溶性受體

一般認(rèn)為其它合適的MASP-2抑制劑包括MASP-2可溶性受體，可以采用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知技術(shù)進(jìn)行生產(chǎn)。

MASP-2的表達(dá)抑制劑

在本發(fā)明這個(gè)方面的另一實(shí)施方案中，MASP-2抑制劑是能夠抑制MASP-2依賴(lài)性補(bǔ)體活化的MASP-2表達(dá)抑制劑。在本發(fā)明這個(gè)方面的實(shí)施中，代表性的MASP-2表達(dá)抑制劑包括MASP-2反義核酸分子(例如反義mRNA、反義DNA或反義寡核苷酸)、MASP-2核酶以及MASP-2RNAi分子。

反義RNA和反義DNA分子通過(guò)與MASP-2mRNA雜交并阻止MASP-2蛋白的翻譯而起到直接阻斷MASP-2mRNA翻譯的作用。反義核酸分子能以許多不同的方式來(lái)構(gòu)建，只要它能夠阻礙MASP-2的表達(dá)。例如，可通過(guò)使MASP-2cDNA(SEQ ID NO:4)的編碼區(qū)(或其部分)相對(duì)于其正常轉(zhuǎn)錄方向進(jìn)行反轉(zhuǎn)以供其互補(bǔ)序列轉(zhuǎn)錄，從而構(gòu)建反義核酸分子。

反義核酸分子通常與一個(gè)或多個(gè)靶基因的至少一部分基本相同。然而，核酸并不需要完全相同以抑制表達(dá)。較高的同源性一般可用來(lái)對(duì)較短反義核酸分子的使用予以補(bǔ)償。最小的百分比同一性通常約65％以上，但是較高的百分比同一性可對(duì)內(nèi)源序列的表達(dá)發(fā)揮更有效的阻抑作用。通常優(yōu)選基本為大約80％以上的較大的百分比同一性，盡管通常最優(yōu)選約95％至完全相同。

反義核酸分子不需要具有與靶基因相同的內(nèi)含子或外顯子模式，靶基因的非編碼區(qū)段可能在獲得靶基因表達(dá)的反義抑制方面與編碼區(qū)段是等效的。至少大約8個(gè)左右核苷酸的DNA序列可用作反義核酸分子，盡管優(yōu)選較長(zhǎng)的序列。在本發(fā)明中，有用的MASP-2抑制劑的代表性實(shí)例是反義MASP-2核酸分子，該分子與由SEQ ID NO:4所示核酸序列組成的MASP-2cDNA的互補(bǔ)序列有至少90％同一性。SEQ ID NO:4所示核酸序列編碼由SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列組成的MASP-2蛋白。

反義寡核苷酸靶向結(jié)合MASP-2mRNA是可用于降低MASP-2蛋白合成水平的另一種機(jī)制。例如，多聚半乳糖醛酸酶和蠅蕈堿2型乙酰膽堿受體的合成被針對(duì)它們相應(yīng)mRNA序列的反義寡核苷酸所抑制(Cheng的美國(guó)專(zhuān)利第5,739,119號(hào)和Shewmaker的美國(guó)專(zhuān)利第5,759,829號(hào))。此外，用核蛋白細(xì)胞周期蛋白、多藥抗藥性基因(MDG1)、ICAM-1、E-選擇蛋白、STK-1、紋狀體GABA_A受體和人EGF證實(shí)了反義抑制的實(shí)例(參見(jiàn)例如Baracchini的美國(guó)專(zhuān)利第5,801,154號(hào)；Baker的美國(guó)專(zhuān)利第5,789,573號(hào)；Considine的美國(guó)專(zhuān)利第5,718,709號(hào)；以及Reubenstein的美國(guó)專(zhuān)利第5,610,288號(hào))。

文獻(xiàn)記載了使得普通技術(shù)人員能夠確定哪些寡核苷酸可用于本發(fā)明的系統(tǒng)，包括使用RNA酶H切割作為轉(zhuǎn)錄物中序列可及性的標(biāo)志來(lái)探測(cè)靶mRNA的合適部位(Scherr,M.等，Nucleic Acids Res.26:5079-5085，1998；Lloyd等，Nucleic Acids Res.29:3665-3673，2001)。將與MASP-2轉(zhuǎn)錄物某些區(qū)域互補(bǔ)的反義寡核苷酸混合物加到表達(dá)MASP-2的細(xì)胞提取物(例如肝細(xì)胞)中，進(jìn)行雜交以產(chǎn)生易受RNA酶H攻擊的部位。該方法可以與計(jì)算機(jī)輔助序列選擇相結(jié)合，所述計(jì)算機(jī)輔助的序列選擇能夠根據(jù)序列形成二聚體、發(fā)夾結(jié)構(gòu)或其它二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)能力來(lái)預(yù)測(cè)用于反義組成的最佳序列選擇，所述結(jié)構(gòu)可降低或抑制對(duì)宿主細(xì)胞靶向mRNA的特異性結(jié)合?？墒褂肙LIGO引物分析軟件(Rychlik,I.，1997)和BLASTN2.0.5算法軟件(Altschul,S.F.等，Nucl.Acids Res.25:3389-3402，1997)來(lái)進(jìn)行這些二級(jí)結(jié)構(gòu)分析和靶部位選擇考量。針對(duì)靶序列的反義化合物的長(zhǎng)度優(yōu)選包括約8個(gè)至約50個(gè)核苷酸。特別優(yōu)選包括約9個(gè)至約35個(gè)左右核苷酸的反義寡核苷酸。本發(fā)明的發(fā)明人認(rèn)為，實(shí)施本發(fā)明基于反義寡核苷酸的方法極優(yōu)選范圍為9個(gè)至35個(gè)核苷酸(即9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35個(gè)堿基長(zhǎng)度左右的核苷酸)的寡核苷酸組成。極優(yōu)選的MASP-2 mRNA靶區(qū)域是位于或鄰近AUG翻譯起始密碼子的區(qū)域，以及與mRNA的5’區(qū)基本互補(bǔ)的序列，例如MASP 2基因核苷酸序列(SEQ ID NO:4)的-10和+10區(qū)域之間的序列。示例性的MASP-2表達(dá)抑制劑見(jiàn)表4。

表4：MASP-2的示例性表達(dá)抑制劑

如上所述，本文所用術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸”是指核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸(DNA)或其模擬物的寡聚體或多聚體。該術(shù)語(yǔ)也包括由天然存在的核苷酸、糖和核苷間(骨架)共價(jià)鍵所組成的那些寡聚核酸堿基(oligonucleobase)以及具有非天然存在的修飾的寡核苷酸。這些修飾使得能夠引入某些無(wú)法通過(guò)天然存在的寡核苷酸提供的所需性質(zhì)，例如毒性降低、抗核酸酶降解的穩(wěn)定性提高以及細(xì)胞攝取增強(qiáng)。在示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明的反義化合物由于磷酸二酯骨架的修飾延長(zhǎng)了反義寡核苷酸的壽命而不同于天然DNA，其中磷酸取代基被硫代磷酸酯置換。同樣地，寡核苷酸的一端或兩端可被一個(gè)或多個(gè)間插在核酸鏈內(nèi)相鄰堿基對(duì)之間的吖啶衍生物取代。

反義方案的另一替代是使用“RNA干涉”(RNAi)。雙鏈RNA(dsRNA)可在哺乳動(dòng)物體內(nèi)引起基因沉默。RNAi的天然功能和共抑制似乎保護(hù)基因組不受可移動(dòng)遺傳元件(例如反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子)以及當(dāng)其活化時(shí)在宿主細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生異常RNA或dsRNA的病毒侵襲(參見(jiàn)例如Jensen,J.等，Nat.Genet.21:209-12，1999)。可通過(guò)合成兩條能夠形成雙鏈RNA分子的RNA鏈來(lái)制備雙鏈RNA分子，每條鏈的長(zhǎng)度約為19-25(例如19-23)個(gè)核苷酸。例如，用于本發(fā)明方法的dsRNA分子可包括相當(dāng)于表4所列序列及其互補(bǔ)序列的RNA。優(yōu)選至少一條RNA鏈具有1-5個(gè)核苷酸的3’突出端。合成的RNA鏈?zhǔn)窃谛纬呻p鏈分子的條件下進(jìn)行組合的。RNA序列可包含SEQ ID NO:4的至少8個(gè)核苷酸的部分，總長(zhǎng)度為25個(gè)核苷酸以下。特定靶的siRNA序列的設(shè)計(jì)為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所掌握?？色@得設(shè)計(jì)siRNA序列并保證表達(dá)有至少70％敲低的商業(yè)服務(wù)(Qiagen,Valencia,Calif)。

dsRNA可作為藥物組合物給予并按已知方法進(jìn)行，其中核酸被引入所需的靶細(xì)胞中。通常使用的基因轉(zhuǎn)移方法包括磷酸鈣、DEAE-葡聚糖、電穿孔、顯微注射和病毒方法。這些方法在Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.，1993中教導(dǎo)。

也可利用核酶來(lái)降低MASP-2的量和/或生物活性，例如靶向MASP-2mRNA的核酶。核酶是催化性RNA分子，能夠切割具有與核酶序列完全或部分同源的序列的核酸分子。可以設(shè)計(jì)核酶轉(zhuǎn)基因，該核酶轉(zhuǎn)基因編碼與靶RNA特異性配對(duì)并在特定位置切割磷酸二酯骨架的RNA核酶，從而使靶RNA功能性失活。在進(jìn)行這種切割時(shí)，核酶本身并無(wú)改變，因此能夠再循環(huán)并切割其它分子。在反義RNA中包括核酶序列賦予了反義RNA切割RNA的活性，從而增加了反義構(gòu)建體的活性。

用于實(shí)施本發(fā)明的核酶通常包括雜交區(qū)和催化區(qū)，雜交區(qū)至少約9個(gè)核苷酸，與至少部分靶MASP-2mRNA的核苷酸序列互補(bǔ)，催化區(qū)適于切割靶MASP-2mRNA(一般參見(jiàn)EPA 0 321 201號(hào)；WO88/04300；Haseloff,J.等，Nature 334:585-591，1988；Fedor,M.J.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:1668-1672，1990；Cech,T.R.等，Ann.Rev.Biochem.55:599-629，1986)。

核酶可以摻入核酶序列的RNA寡核苷酸的形式直接靶向細(xì)胞，或者作為編碼所需要的核酶RNA的表達(dá)載體而被引入細(xì)胞?？膳c所述用于反義多核苷酸的大致相同的方式使用核酶。

可通過(guò)本領(lǐng)域已知的用于DNA和RNA分子合成的任何方法來(lái)制備用于本發(fā)明方法的反義RNA和DNA、核酶和RNAi分子。這些方法包括本領(lǐng)域眾所周知的用于寡脫氧核糖核苷酸和寡核糖核苷酸的化學(xué)合成技術(shù)，例如固相亞磷酰胺化學(xué)合成?；蛘撸赏ㄟ^(guò)編碼反義RNA分子的DNA序列的體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)錄來(lái)產(chǎn)生RNA分子。這種DNA序列可被摻入各種各樣的載體中，載體中插入了合適的RNA聚合酶啟動(dòng)子(例如T7或SP6聚合酶啟動(dòng)子)。或者，可將取決于所用啟動(dòng)子而組成型或誘導(dǎo)型合成反義RNA的反義cDNA構(gòu)建體穩(wěn)定地引入細(xì)胞系中。

可引入各種眾所周知的DNA分子修飾，從而增加穩(wěn)定性和半衰期。有益的修飾包括但不限于將核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸側(cè)翼序列加到分子的5’端和/或3’端，或者在寡脫氧核糖核苷酸骨架內(nèi)使用硫代磷酸酯或2’O-甲基而不是磷酸二酯酶鍵。

V.藥物組合物和遞藥方法

劑量

另一方面，本發(fā)明提供用于抑制MASP-2依賴(lài)性補(bǔ)體活化的不利作用的組合物，所述組合物包含治療有效量的MASP-2抑制劑和藥學(xué)上可接受的載體?？梢灾委熁蚋纳芃ASP-2依賴(lài)性補(bǔ)體活化相關(guān)疾病的治療有效劑量，給予有需要的受試者M(jìn)ASP-2抑制劑。治療有效劑量是指MASP-2抑制劑足以導(dǎo)致改善疾病癥狀的量。

可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)方法，使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型(例如實(shí)施例3中所述的表達(dá)人MASP-2轉(zhuǎn)基因的鼠MASP-2-/-小鼠模型)，來(lái)測(cè)定MASP-2抑制劑的毒性和治療功效。使用這些動(dòng)物模型，可使用標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)確定NOAEL(無(wú)明顯不利作用水平)和MED(最小有效劑量)。NOAEL/MED效應(yīng)之間的劑量比是治療比率，用NOAEL/MED之比表示。最優(yōu)選的是治療比率或指數(shù)高的MASP-2抑制劑。從細(xì)胞培養(yǎng)物分析和動(dòng)物研究中獲得的數(shù)據(jù)可用來(lái)制定用于人體的劑量范圍。MASP-2抑制劑的劑量?jī)?yōu)選在循環(huán)濃度的范圍之內(nèi)，包括幾乎無(wú)毒性或沒(méi)有毒性的最小有效劑量。劑量可在這個(gè)范圍內(nèi)變化，這取決于所采用的劑型和所使用的給藥途徑。

對(duì)于任何化合物劑型來(lái)說(shuō)，可使用動(dòng)物模型來(lái)評(píng)價(jià)治療有效劑量。例如，可在動(dòng)物模型中配制達(dá)得包括MED在內(nèi)的循環(huán)血漿濃度范圍的劑量。也可通過(guò)例如高效液相層析法來(lái)定量測(cè)定血漿中MASP-2抑制劑的水平。

除了毒性研究之外，也可根據(jù)有生命的受試者中存在的MASP-2蛋白的量以及MASP-2抑制劑的結(jié)合親和性來(lái)估計(jì)有效劑量。已經(jīng)證實(shí)正常受試人體血清中存在的MASP-2水平在500ng/ml低水平范圍內(nèi)，可使用MASP-2定量測(cè)定法來(lái)測(cè)定具體受試者的MASP-2水平(描述于Moller-Kristensen M.等，J.Immunol.Methods282:159-167，2003)。

包含MASP-2抑制劑的組合物的給藥劑量一般根據(jù)受試者年齡、體重、身高、性別、一般疾病狀況和病史而變化。舉例來(lái)說(shuō)，可在大約0.010-10.0mg/kg、優(yōu)選0.010-1.0mg/kg、更優(yōu)選0.010-0.1mg/kg受試者體重的劑量范圍內(nèi)給予MASP-2抑制劑，例如抗MASP-2抗體。在某些實(shí)施方案中，所述組合物包含抗MASP-2抗體和MASP-2抑制肽的組合。

可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的補(bǔ)體測(cè)定法來(lái)測(cè)定特定受試者的本發(fā)明MASP-2抑制劑組合物和方法的治療功效以及合適的劑量。補(bǔ)體產(chǎn)生多種特定的產(chǎn)物。在最近的十年間，已經(jīng)研發(fā)出靈敏精確的測(cè)定法，而且大多數(shù)的這類(lèi)活化產(chǎn)物都是市售的，包括小的活化片段C3a、C4a和C5a和大的活化片段iC3b、C4d、Bb和sC5b-9。大多數(shù)的這類(lèi)測(cè)定法都利用了與暴露在片段而不是暴露在其所形成的天然蛋白上的新抗原(new antigen/neoantigen)起反應(yīng)的單克隆抗體，這使得這些測(cè)定法非常簡(jiǎn)單而專(zhuān)一。大多數(shù)都依賴(lài)于ELISA技術(shù)，盡管有時(shí)放射免疫測(cè)定法仍用于C3a和C5a。放射免疫測(cè)定法測(cè)定未經(jīng)加工的片段及其“脫Arg”片段，這些片段是存在于循環(huán)中的主要形式。未經(jīng)加工的片段和C5a_脫Arg通過(guò)結(jié)合細(xì)胞表面受體而被迅速清除掉，因而以極低濃度存在，而C3a_脫Arg則不結(jié)合細(xì)胞，只在血漿中蓄積。測(cè)定C3a提供了補(bǔ)體活化靈敏的、不依賴(lài)途徑的標(biāo)志。可通過(guò)測(cè)定Bb片段來(lái)評(píng)價(jià)替代途徑活化。檢測(cè)膜攻擊途徑活化的液相產(chǎn)物sC5b-9，提供了補(bǔ)體被完全激活的證據(jù)。因?yàn)槟赝緩胶徒?jīng)典途徑都產(chǎn)生同樣的活化產(chǎn)物C4a和C4d，所以測(cè)定這兩種片段并不提供有關(guān)這兩條途徑中哪一條途徑產(chǎn)生了活化產(chǎn)物的任何信息。

另外的藥物

包含MASP-2抑制劑的組合物和方法可任選包括一種或多種另外的治療藥物，它們可增強(qiáng)MASP-2抑制劑的活性，或者以相加或協(xié)同的方式提供相關(guān)治療功能。例如，一種或多種MASP-2抑制劑可與一種或多種消炎和/或鎮(zhèn)痛藥物聯(lián)用?？蓪?duì)另外藥物的含量和選擇加以確定以獲得所需的治療結(jié)果。合適的消炎和/或鎮(zhèn)痛藥物包括：5-羥色胺受體拮抗劑；5-羥色胺受體激動(dòng)劑；組胺受體拮抗劑；緩激肽受體拮抗劑；激肽釋放酶抑制劑；速激肽受體拮抗劑，包括神經(jīng)激肽1和神經(jīng)激肽2受體亞型拮抗劑；降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)受體拮抗劑；白介素受體拮抗劑；花生四烯酸代謝物合成途徑中有活性的酶的抑制劑，包括磷脂酶抑制劑，包括PLA₂同工型抑制劑和PLCγ同工型抑制劑、環(huán)加氧酶(COX)抑制劑(它可以是COX-1、COX-2的抑制劑或非選擇性COX-1和COX-2的抑制劑)、脂加氧酶抑制劑；前列腺素類(lèi)受體拮抗劑，包括類(lèi)二十烷酸EP-1和EP-4受體亞型拮抗劑以及血栓烷受體亞型拮抗劑；白三烯受體拮抗劑，包括白三烯B₄受體亞型拮抗劑和白三烯D₄受體亞型拮抗劑；阿片樣物質(zhì)受體激動(dòng)劑，包括μ-阿片樣物質(zhì)、δ-阿片樣物質(zhì)和κ-阿片樣物質(zhì)受體亞型激動(dòng)劑；嘌呤受體激動(dòng)劑和拮抗劑，包括P_2X受體拮抗劑和P_2Y受體激動(dòng)劑；腺苷三磷酸(ATP)敏感性鉀通道開(kāi)放劑；MAP激酶抑制劑；煙酸乙酰膽堿抑制劑；以及α腎上腺素能受體激動(dòng)劑(包括α-1、α-2和非選擇性的α-1和α-2激動(dòng)劑)。

當(dāng)用于抑制或治療再狹窄時(shí)，本發(fā)明的MASP-2抑制劑可與一種或多種抗再狹窄藥物組合進(jìn)行同時(shí)給藥。合適的抗再狹窄藥物包括：抗血小板藥，包括凝血酶抑制劑和受體拮抗劑、腺苷二磷酸(ADP)受體拮抗劑(亦稱(chēng)嘌呤受體1受體拮抗劑)、血栓烷抑制劑和受體拮抗劑以及血小板膜糖蛋白受體拮抗劑；細(xì)胞粘附分子的抑制劑，包括選擇蛋白抑制劑和整聯(lián)蛋白自由基；抗趨化藥；白介素受體拮抗劑；以及胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑，包括蛋白激酶C(PKC)抑制劑和蛋白酪氨酸磷酸酶、胞內(nèi)蛋白酪氨酸激酶抑制劑的調(diào)節(jié)劑、src同源2(SH2)結(jié)構(gòu)域的抑制劑和鈣通道拮抗劑。

本發(fā)明的MASP-2抑制劑也可與一種或多種其它的補(bǔ)體抑制劑聯(lián)用。目前還沒(méi)有補(bǔ)體抑制劑獲準(zhǔn)用于人體，然而已經(jīng)證明一些藥物體內(nèi)阻斷補(bǔ)體。這類(lèi)藥物中的許多也是有毒的，或者只是部分抑制劑(Asghar,S.S.，Pharmacol.Rev.36:223-44，1984)，這些藥物的使用限于用作研究工具。K76COOH和萘莫司他甲磺酸鹽是兩種在移植動(dòng)物模型中具有一定療效的藥物(Miyagawa,S.等，Transplant Proc.24:483-484，1992)。研究表明低分子量肝素也有效調(diào)節(jié)補(bǔ)體活性(Edens,R.E.等，Complement Today第96-120頁(yè)，Basel:Karger,1993)。我們認(rèn)為這些小分子抑制劑可用作與本發(fā)明MASP-2抑制劑聯(lián)用的藥物。

其它天然存在的補(bǔ)體抑制劑可用于與本發(fā)明的MASP-2抑制劑聯(lián)用。補(bǔ)體的生物學(xué)抑制劑包括可溶性補(bǔ)體因子1(sCR1)。這是一種可在人細(xì)胞的外膜上找到的天然存在的抑制劑。其它膜抑制劑包括DAF、MCP和CD59。已經(jīng)對(duì)重組形式的體外和體內(nèi)抗補(bǔ)體活性進(jìn)行了測(cè)定。sCR1表明在異種移植中是有效的，異種移植中補(bǔ)體系統(tǒng)(替代和經(jīng)典兩者)在新移植器官灌注血液幾分鐘內(nèi)就引起過(guò)度反應(yīng)排斥綜合征(hyperactive rejection syndrome)(Platt J.L.等，Immunol.Today 11:450-6，1990；Marino I.R.等，Transplant Proc.1071-6，1990；Johnstone,P.S.等，Transplantation 54:573-6，1992)。sCR1的使用保護(hù)并延長(zhǎng)了移植器官的存活時(shí)間，表明器官存活機(jī)制中的補(bǔ)體途徑(Leventhal,J.R.等，Transplantation 55:857-66，1993；Pruitt,S.K.等，Transplantation 57:363-70，1994)。

適于與本發(fā)明的組合物聯(lián)用的其它補(bǔ)體抑制劑還包括例如由Alexion Pharmaceuticals,Inc.New Haven Connecticut正在開(kāi)發(fā)的MoAb，以及抗備解素MoAb。

當(dāng)用于治療關(guān)節(jié)炎(例如骨關(guān)節(jié)炎和類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)時(shí)，本發(fā)明的MASP-2抑制劑可與一種或多種軟骨保護(hù)藥聯(lián)用，軟骨保護(hù)藥可包括一種或多種軟骨合成代謝的促進(jìn)劑和/或一種或多種軟骨分解代謝的抑制劑，適當(dāng)包括同時(shí)給藥的合成代謝劑(anabolic agent)和分解代謝抑制劑(catabolic inhibitory agent)兩者。合適的促合成代謝的軟骨保護(hù)藥包括白介素(IL)受體激動(dòng)劑，包括IL-4、IL-10、IL-13、rhIL-4、rhIL-10和rhIL-13以及嵌合IL-4、IL-10或IL-13；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β超家族激動(dòng)劑(包括TGF-β、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3)，骨形成蛋白包括BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7(OP-1)和OP-2/BMP-8，生長(zhǎng)分化因子包括GDF-5、GDF-6和GDF-7，重組TGF-β和BMP，以及嵌合TGF-β和BMP；胰島素樣生長(zhǎng)因子，包括IGF-1；以及成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，包括bFGF。合適的抑制分解代謝的軟骨保護(hù)藥包括白介素-1(IL-1)受體拮抗劑(IL-1ra)，包括可溶性人IL-1受體(shuIL-1R)、rshuIL-1R、rhIL-1ra、抗IL1抗體、AF11567和AF12198；腫瘤壞死因子(TNF)受體拮抗劑(TNF-α)，包括sTNFR1和sTNFRII在內(nèi)的可溶性受體、重組TNF可溶性受體和嵌合TNF可溶性受體，包括嵌合rhTNFR:Fc、Fc融合可溶性受體和抗TNF抗體；環(huán)加氧酶-2(COX-2特異性)抑制劑；包括DuP 697、SC-58451、塞來(lái)考昔(celecoxib)、羅非考昔(rofecoxib)、尼美舒利(nimesulide)、雙氯芬酸(diclofenac)、美洛昔康(meloxicam)、吡羅昔康(piroxicam)、NS-398、RS-57067、SC-57666、SC-58125、氟舒胺(flosulide)、依托度酸(etodolac)、L-745,337和DFU-T-614；促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)抑制劑，包括ERK1、ERK2、SAPK1、SAPK2a、SAPK2b、SAPK2d、SAPK3的抑制劑，包括SB 203580、SB 203580碘、SB202190、SB 242235、SB 220025、RWJ 67657、RWJ 68354、FR 133605、L-167307、PD 98059、PD 169316；核因子κB(NFκB)抑制劑，包括咖啡酸苯乙酯(CAPE)、DM-CAPE、SN-50肽、hymenialdisine和吡咯烷酮二硫代氨基甲酸酯；一氧化氮合酶(NOS)抑制劑，包括N^G-一甲基-L-精氨酸、1400W、二苯撐碘、S-甲基異硫脲、S-(氨乙基)異硫脲、L-N⁶-(1-亞氨基乙基)賴(lài)氨酸、1,3-PBITU、2-乙基-2-硫代假脲、氨基胍、N^ω-硝基-L-精氨酸、N^ω-硝基-L-精氨酸甲酯，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)的抑制劑，包括MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14和MMP-15的抑制劑，包括U-24522、米諾環(huán)素(minocycline)、4-Abz-Gly-Pro-D-Leu-D-Ala-NHOH、Ac-Arg-Cys-Gly-Val-Pro-Asp-NH₂、重組人TIMP1、重組人TIMP2以及磷阿米酮(phosphoramidon)；細(xì)胞粘附分子，包括整聯(lián)蛋白激動(dòng)劑和拮抗劑，包括αVβ3MoAb LM609和鋸鱗蝰素(echistatin)；抗趨化劑，包括F-Met-Leu-Phe受體、IL-8受體、MCP-1受體和MIP1-I/RANTES受體；胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑，包括(a)蛋白激酶抑制劑，包括(i)蛋白激酶C(PKC)抑制劑(同工酶)包括抑激酶素C(calphostin C)、G-6203和GF 109203X以及(ii)蛋白酪氨酸激酶抑制劑；(b)胞內(nèi)蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP酶)調(diào)節(jié)劑；和(c)SH2結(jié)構(gòu)域抑制劑(src同源2結(jié)構(gòu)域)。

對(duì)于一些應(yīng)用來(lái)說(shuō)，將本發(fā)明的MASP-2抑制劑與痙攣抑制劑聯(lián)用可能是有利的。例如，對(duì)泌尿生殖系統(tǒng)應(yīng)用來(lái)說(shuō)，包括至少一種平滑肌痙攣抑制劑和/或至少一種抗炎藥可能是有利的，對(duì)血管手術(shù)來(lái)說(shuō)，包括至少一種血管痙攣抑制劑和/或至少一種抗炎藥和/或至少一種抗再狹窄藥可能是有益的。痙攣抑制劑的合適實(shí)例包括：5-羥色胺2受體亞型拮抗劑；速激肽受體拮抗劑；一氧化氮供體；ATP敏感性鉀通道開(kāi)放劑；鈣通道拮抗劑；以及內(nèi)皮縮血管肽受體拮抗劑。

藥物載體和遞藥載體

一般而言，本發(fā)明的MASP-2抑制劑組合物當(dāng)與任何其它所選的治療藥物聯(lián)用時(shí)，適合于包含在藥學(xué)上可接受的載體中。載體是無(wú)毒的、生物相容的，其選擇不得對(duì)MASP-2抑制劑(以及與其聯(lián)用的任何其它治療藥物)的生物活性產(chǎn)生不利的影響。肽的示例性藥學(xué)上可接受的載體描述于Yamada的美國(guó)專(zhuān)利第5,211,657號(hào)。用于本發(fā)明的抗MASP-2抗體和抑制肽可以配制成固體、半固體、凝膠、液體或氣體形式制劑，例如片劑、膠囊劑、粉劑、顆粒劑、軟膏劑、溶液劑、栓劑(depositories)、吸入劑和注射劑，供口服、胃腸外或外科手術(shù)給藥。本發(fā)明還包括通過(guò)將組合物涂敷在醫(yī)療裝置上進(jìn)行局部給藥等等。

用于通過(guò)注射、輸注或沖洗和局部遞藥的胃腸外遞藥的合適載體包括蒸餾水、磷酸緩沖生理鹽水、標(biāo)準(zhǔn)林格氏液或乳酸鹽林格氏液、葡萄糖溶液、Hank氏溶液或丙二醇。此外，無(wú)菌不揮發(fā)油可用作溶劑或懸浮介質(zhì)。對(duì)于此目的，可采用生物相容性油，包括合成的甘油單酯或甘油二酯。此外，脂肪酸(例如油酸)用于注射劑的制備中?？蓪⑤d體和藥物成分配制成為液體制劑、混懸劑、可聚合或不可聚合的凝膠劑、糊劑或藥膏。

載體也可包括遞藥載體以使遞藥持續(xù)(即延長(zhǎng)、延緩或調(diào)節(jié))，或者增強(qiáng)治療藥物的遞送、吸收、穩(wěn)定性或藥代動(dòng)力學(xué)特征。這種遞藥載體可包括但不限于以下實(shí)例：由蛋白質(zhì)、脂質(zhì)體、糖類(lèi)、合成有機(jī)化合物、無(wú)機(jī)化合物、聚合水凝膠、共聚水凝膠和聚合物膠束組成的微粒、微球、納米球、納米粒。合適的水凝膠和膠束遞送系統(tǒng)包括WO 2004/009664A2中公開(kāi)的PEO:PHB:PEO共聚物和共聚物/環(huán)糊精復(fù)合物以及美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2002/0019369A1中公開(kāi)的PEO和PEO/環(huán)糊精復(fù)合物。這些水凝膠可局部注射到既定起效部位，或者皮下或肌內(nèi)注射以形成緩釋貯庫(kù)。

對(duì)于關(guān)節(jié)內(nèi)遞藥，MASP-2抑制劑可被裝載于上述可注射的液體或凝膠載體、上述可注射的緩釋遞藥載體、或者透明質(zhì)酸或透明質(zhì)酸衍生物中。

對(duì)于非肽能藥物的口服給藥，MASP-2抑制劑可裝載于惰性填充劑或稀釋劑中，例如蔗糖、玉米淀粉或纖維素。

對(duì)于局部給藥，MASP-2抑制劑可裝載于軟膏劑、洗劑、乳膏劑、凝膠劑、滴劑、栓劑、噴霧劑、液體制劑或粉劑中或者透皮貼劑的凝膠或微膠囊遞送系統(tǒng)中。

各種經(jīng)鼻和經(jīng)肺的遞送系統(tǒng)正在研發(fā)中，包括氣霧吸入器、定量吸入器、干粉吸入器和霧化吸入器，可分別適于遞送氣霧劑、吸入劑或霧化遞藥載體中的本發(fā)明藥物。

對(duì)鞘內(nèi)(IT)或腦室內(nèi)(ICV)遞藥，合適的無(wú)菌遞送系統(tǒng)(例如液體制劑；凝膠劑、混懸劑等)可用來(lái)給予本發(fā)明的藥物。

本發(fā)明的組合物還可包括生物相容性賦形劑，例如分散劑或潤(rùn)濕劑、懸浮劑、稀釋劑、緩沖劑、滲透促進(jìn)劑、乳化劑、粘合劑、增稠劑、矯味劑(用于口服給藥)。

抗體和肽的藥物載體

至于抗MASP-2抗體和抑制肽，更準(zhǔn)確地講，可以按注射劑量的所述化合物的溶液劑或混懸劑經(jīng)胃腸外給予示例性劑型，所述化合物包含在生理上可接受的稀釋劑與藥物載體內(nèi)，藥物載體可以是無(wú)菌液體，例如水、油、鹽水、甘油或乙醇。此外，包含抗MASP-2抗體和抑制肽的組合物中可存在例如潤(rùn)濕劑或乳化劑、表面活性劑、pH緩沖物質(zhì)等輔助物質(zhì)。藥物組合物的其外組分包括油脂(例如動(dòng)物、植物或合成來(lái)源的油脂)，例如大豆油和礦物油。一般而言，二元醇例如丙二醇或聚乙二醇是優(yōu)選的注射溶液劑的液體載體。

還能以長(zhǎng)效注射劑或植入制劑的形式給予抗MASP-2抗體和抑制肽，這些制劑可按允許活性劑緩釋或脈沖釋放的方式來(lái)配制。

表達(dá)抑制劑的藥學(xué)上可接受的載體

至于用于本發(fā)明方法的表達(dá)抑制劑，更準(zhǔn)確地講是提供包含上述表達(dá)抑制劑和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑的組合物。組合物還可包含膠體分散體系。

包括表達(dá)抑制劑的藥物組合物可包括但不限于溶液劑、乳劑和含有脂質(zhì)體的制劑。這些組合物可由各種組分制備，包括但不限于預(yù)制液體、自乳化固體和自乳化半固體。這些組合物的制備通常包括將表達(dá)抑制劑與一種或多種以下的成分相混合：緩沖劑、抗氧化劑、低分子量多肽、蛋白質(zhì)、氨基酸、糖類(lèi)(包括葡萄糖、蔗糖或糊精)、螯合劑(例如EDTA)、谷胱甘肽以及其它穩(wěn)定劑和賦形劑。中性緩沖鹽水或者與非特異性血清白蛋白混合的鹽水是合適稀釋劑的實(shí)例。

在一些實(shí)施方案中，組合物可被制備和配制成乳劑，乳劑通常是一種液體以液滴形式分散在另一種液體中的非均相系統(tǒng)(參見(jiàn)Idson，載于Pharmaceutical Dosage Forms,第1卷，Rieger和Banker(主編)，Marcek Dekke,Inc.，N.Y.，1988)。用于乳劑的天然存在的乳化劑的實(shí)例包括阿拉伯樹(shù)膠、蜂蠟、羊毛脂、卵磷脂和磷脂。

在一個(gè)實(shí)施方案中，包括核酸的組合物可配制成微乳劑。本文所用的微乳劑是指水、油和兩親物的系統(tǒng)，它是單一的光學(xué)各向同性和熱力學(xué)穩(wěn)定的液體溶液(參見(jiàn)Rosoff，載于Pharmaceutical Dosage Forms,第1卷)。本發(fā)明的方法也可使用脂質(zhì)體來(lái)將反義寡核苷酸轉(zhuǎn)移和遞送到所需要的部位。

用于局部給藥的表達(dá)抑制劑的藥物組合物和制劑可包括透皮貼劑、軟膏劑、洗劑、乳膏劑、凝膠劑、滴劑、栓劑、噴霧劑、液體制劑和粉劑?？梢允褂贸Ｒ?guī)藥物載體以及水性基質(zhì)、粉末基質(zhì)或油性基質(zhì)和增稠劑等等。

給藥方式

可以多種方式給予包含MASP-2抑制劑的藥物組合物，這取決于是局部還是全身性給藥方式最適于待治療的疾病。此外，本文所述的關(guān)于體外再灌注方法，可通過(guò)將本發(fā)明的組合物引入再循環(huán)血液或血漿來(lái)給予MASP-2抑制劑。而且，本發(fā)明的組合物可通過(guò)將組合物涂布或摻入可植入的醫(yī)療裝置上面或里面而遞送。

全身性遞藥

本文所用術(shù)語(yǔ)“全身性遞藥”和“全身性給藥”是指包括但不限于口服和胃腸外途徑，包括肌內(nèi)(IM)、皮下、靜脈內(nèi)(IV)、動(dòng)脈內(nèi)、吸入、舌下、口腔、局部、經(jīng)皮、經(jīng)鼻、直腸、陰道和其它給藥途徑，它們將所遞送的藥物有效地分散到預(yù)期治療作用的一個(gè)或多個(gè)部位。用于本發(fā)明的全身性遞送的優(yōu)選途徑包括靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下和吸入。應(yīng)當(dāng)理解的是，對(duì)于用于本發(fā)明具體組合物中所選用的藥物，確切的全身性給藥途徑將部分地考慮藥物對(duì)與特定給藥途徑相關(guān)的代謝轉(zhuǎn)化途徑的敏感性加以確定。例如，肽能藥物可能最適于通過(guò)口服以外的途徑給藥。

可通過(guò)任何合適的方法將MASP-2抑制抗體和多肽遞送到有需要的受試者中。遞送MASP-2抗體和多肽的方法包括經(jīng)口服、肺部、胃腸外(例如肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)(IV)或皮下注射)、吸入(例如經(jīng)由微細(xì)粉劑型)、經(jīng)皮、經(jīng)鼻、陰道、直腸或者舌下給藥途徑，可將其配制成適于各自給藥途徑的劑型。

舉例來(lái)說(shuō)，可以通過(guò)將MASP-2抑制抗體和肽應(yīng)用到能夠吸收多肽的身體膜上，例如鼻膜、胃腸膜和直腸膜，而將其引入活體內(nèi)。通常將多肽和滲透促進(jìn)劑一起應(yīng)用到可吸收膜上(參見(jiàn)例如Lee,V.H.L.，Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Sys.5:69，1988；Lee,V.H.L.，J.Controlled Release 13:213，1990；Lee,V.H.L.主編，Peptide and Protein Drug Delivery,Marcel Dekke,New York(1991)；DeBoer,A.G.等，J.Controlled Release,13:241，1990)。例如，STDHF是梭鏈孢酸的合成衍生物，是結(jié)構(gòu)上類(lèi)似于膽鹽的甾類(lèi)表面活性劑，已被用作經(jīng)鼻遞藥的滲透促進(jìn)劑(Lee,W.A.，Biopharm.22，1990年11/12月)。

可以引入與其它分子(例如脂質(zhì))締合的MASP-2抑制抗體和多肽，以保護(hù)多肽不被酶降解。例如，共價(jià)結(jié)合的聚合物、尤其是聚乙二醇(PEG)已被用來(lái)保護(hù)某些蛋白質(zhì)不被體內(nèi)的酶水解，從而延長(zhǎng)半衰期(Fuertges,F.等，J.Controlled Release 11:139，1990)。已經(jīng)報(bào)道了許多用于蛋白質(zhì)遞送的聚合物系統(tǒng)(Bae,Y.H.等，J.Controlled Release 9:271，1989；Hori,R.等，Pharm.Res.6:813，1989；Yamakawa,I.等，J.Pharm.Sci.79:505，1990；Yoshihiro,I.等，J.Controlled Release 10:195，1989；Asano,M.等，J.Controlled Release 9:111，1989；Rosenblatt,J.等，J.Controlled Release 9:195，1989；Makino,K.，J.Controlled Release12:235，1990；Takakura,Y.等，J.Pharm.Sci.78:117，1989；Takakura,Y.等，J.Pharm.Sci.78:219，1989)。

最近，開(kāi)發(fā)出血清穩(wěn)定性和循環(huán)半衰期得到改進(jìn)的脂質(zhì)體(參見(jiàn)例如Webb的美國(guó)專(zhuān)利第5,741,516號(hào))。而且，對(duì)脂質(zhì)體和脂質(zhì)體樣制備物作為可能的藥物載體的各種方法進(jìn)行了綜述(參見(jiàn)例如Szoka的美國(guó)專(zhuān)利第5,567,434號(hào)；Yagi的美國(guó)專(zhuān)利第5,552,157號(hào)；Nakamori的美國(guó)專(zhuān)利第5,565,213號(hào)；Shinkarenko的美國(guó)專(zhuān)利第5,738,868號(hào)以及Gao的美國(guó)專(zhuān)利第5,795,587號(hào))。

對(duì)于經(jīng)皮應(yīng)用，可將MASP-2抑制抗體和多肽與其它合適的成分(例如載體和/或佐劑)混勻。對(duì)這些其它成分的性質(zhì)沒(méi)有限制，只是對(duì)于其既定給藥來(lái)說(shuō)必須是藥學(xué)上可接受的，并且不能降低組合物中活性成分的活性。合適載體的實(shí)例包括含或不含純化膠原的軟膏、乳膏、凝膠或混懸液。MASP-2抑制抗體和多肽也可被浸漬到透皮貼劑、膏藥和繃帶中，優(yōu)選液體或半液體形式。

可以在為維持治療效果所需水平而確定的間隔的周期性基礎(chǔ)上，全身性給予本發(fā)明的組合物。例如，可按每2-4周或者以更低頻率的間隔給予組合物(例如經(jīng)皮下注射)。給藥方案將由醫(yī)師考慮可能影響藥物聯(lián)用的作用的各種因素來(lái)確定。這些因素可包括待治療疾病的進(jìn)展程度、患者年齡、性別和體重和其它臨床因素。各獨(dú)立藥物成分的劑量將隨組合物中所包含的MASP-2抑制劑以及任何遞藥載體(例如緩釋遞藥載體)的存在和性質(zhì)而變化。此外，可在考慮給藥頻率和所遞送藥物的藥代動(dòng)力學(xué)特征的變化后對(duì)劑量進(jìn)行調(diào)整。

局部遞藥

本文所用術(shù)語(yǔ)“局部”包括藥物在預(yù)定的局限性作用部位上或其周?chē)膽?yīng)用，可包括例如局部遞送到皮膚或其它受累組織；眼遞藥；鞘內(nèi)(IT)、腦室內(nèi)(ICV)、關(guān)節(jié)內(nèi)、腔內(nèi)、顱內(nèi)或肺泡內(nèi)給藥、安置或沖洗。可優(yōu)選能夠給予低劑量的局部給藥以避免全身性不利作用，以及更精確地控制遞藥時(shí)間和局部遞藥部位的活性劑濃度。不論患者之間在新陳代謝、血流等方面的變化，局部給藥都在目標(biāo)部位獲得已知濃度。通過(guò)直接遞藥方式還使劑量控制得到改進(jìn)。

MASP-2抑制劑的局部遞送可在用手術(shù)方法治療疾病或病癥的外科手術(shù)的過(guò)程中實(shí)現(xiàn)，例如在動(dòng)脈旁路術(shù)、動(dòng)脈粥樣硬化斑切除術(shù)、激光手術(shù)、超聲波手術(shù)、球囊血管成形術(shù)以及支架安置等手術(shù)期間。例如，可將MASP-2抑制劑與球囊血管成形手術(shù)結(jié)合起來(lái)給予受試者。球囊血管成形手術(shù)包括將連有已排氣球囊的導(dǎo)管插入動(dòng)脈內(nèi)。將已排氣球囊置于動(dòng)脈粥樣硬化斑塊附近，給氣囊充氣使得斑塊向血管壁擠壓。結(jié)果，球囊表面與血管表面的血管內(nèi)皮細(xì)胞層接觸?？梢园丛试S藥物在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊部位釋放的方式，將MASP-2抑制劑附著到球囊血管成形術(shù)導(dǎo)管上?？砂凑毡绢I(lǐng)域已知標(biāo)準(zhǔn)方法將藥物附著在球囊導(dǎo)管上。例如，可將藥物保存在球囊導(dǎo)管的隔室中直到球囊充氣，此時(shí)藥物被釋放到局部環(huán)境中?；蛘?，可將藥物浸漬在球囊表面，從而當(dāng)球囊充氣時(shí)，藥物就接觸到動(dòng)脈壁的細(xì)胞。也可在多孔球囊導(dǎo)管中遞送藥物，參見(jiàn)例如Flugelman,M.Y.等，Circulation 85:1110-1117，1992。另參見(jiàn)已公開(kāi)的PCT申請(qǐng)WO 95/23161中對(duì)于將治療蛋白附著到球囊血管成形術(shù)導(dǎo)管上的示例性方法。同樣地，也可將MASP-2抑制劑包入應(yīng)用于支架上的凝膠或聚合涂層材料中，或者可將MASP-2抑制劑摻入支架材料中，從而支架在血管安置之后便將MASP-2抑制劑洗脫出來(lái)。

用于治療關(guān)節(jié)炎和其它肌肉骨骼疾病的MASP-2抑制劑組合物可通過(guò)關(guān)節(jié)內(nèi)注射來(lái)局部遞送。這些組合物可適當(dāng)?shù)匕ň忈屵f藥載體。作為其中可能需要局部遞藥的另一個(gè)實(shí)例，用于治療泌尿生殖系統(tǒng)疾病的MASP-2抑制劑組合物可適當(dāng)?shù)氐稳氚螂變?nèi)或者其它泌尿生殖結(jié)構(gòu)中。

醫(yī)療裝置上的涂層材料

可將MASP-2抑制劑(例如抗體和抑制肽)固定在可植入或可連接的醫(yī)療裝置表面(或醫(yī)療裝置內(nèi)部)。經(jīng)修飾的表面通?？稍谥踩雱?dòng)物體后與活組織接觸。所謂“可植入或可連接的醫(yī)療裝置”是指在正常操作該裝置(例如支架和可植入遞藥裝置)時(shí)，被植入或連接到動(dòng)物體組織的任何裝置。這些可植入或可連接的醫(yī)療裝置可由諸如以下的材料制成：硝酸纖維素、重氮纖維素、玻璃、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、瓊脂糖凝膠(Sepharose)、瓊脂、淀粉、尼龍、不銹鋼、鈦以及生物可降解的和/或生物相容性聚合物?？赏ㄟ^(guò)相連接的蛋白質(zhì)的生物活性不被破壞的任何技術(shù)，來(lái)使蛋白質(zhì)與裝置連接，例如通過(guò)將蛋白質(zhì)N端和C端殘基的一個(gè)或兩個(gè)連接到裝置上。也可在蛋白質(zhì)內(nèi)一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)上進(jìn)行連接。還可以使用多重連接(既在蛋白質(zhì)內(nèi)部也在蛋白質(zhì)兩端)?？蓪?duì)可植入或可連接的醫(yī)療裝置的表面進(jìn)行修飾以包括用于供蛋白質(zhì)固定的官能團(tuán)(例如羧基、酰胺、氨基、醚、羥基、氰基、次氮基、氨磺?；?sulfanamido)、乙炔基(acetylinic)、環(huán)氧基、硅烷、酐、琥珀酰亞胺基、疊氮基)。偶合化學(xué)法包括但不限于與MASP-2抗體或抑制肽上可利用的官能團(tuán)形成酯、醚、酰胺、疊氮化物和氨磺酰衍生物、氰酸酯和其它鍵。也可通過(guò)將親和標(biāo)記物序列加到蛋白質(zhì)上，從而使MASP-2抗體或抑制片段非共價(jià)連接，這些標(biāo)記物例如GST(D.B.Smith和K.S.Johnson,Gene67:31，1988)、多聚組氨酸(E.Hochuli等，J.Chromatog.411:77，1987)或生物素。這些親和標(biāo)記物也可用于蛋白質(zhì)與裝置的可逆連接。

還可將蛋白質(zhì)共價(jià)連接到裝置體表面上，例如通過(guò)醫(yī)療裝置表面的共價(jià)活化。舉例來(lái)說(shuō)，可通過(guò)以下任一對(duì)反應(yīng)基團(tuán)將基質(zhì)細(xì)胞蛋白質(zhì)(matricellular protein)連接到裝置體上(配對(duì)基團(tuán)的一個(gè)成員存在于裝置體表面，另一個(gè)成員則存在于基質(zhì)細(xì)胞蛋白質(zhì)上)：羥基/羧酸，產(chǎn)生酯鍵；羥基/酸酐，產(chǎn)生酯鍵；羥基/異氰酸酯，產(chǎn)生氨基甲酸乙酯鍵?？捎蒙漕l放電等離子體(RFGD)蝕刻，對(duì)不具備有用反應(yīng)基團(tuán)的裝置體表面進(jìn)行處理來(lái)產(chǎn)生反應(yīng)基團(tuán)，以便供基質(zhì)細(xì)胞蛋白質(zhì)沉積(例如，用氧等離子體處理引入含氧基團(tuán)；用丙基氨基等離子體處理引入氨基)。

可將包括核酸分子(例如反義核酸)的MASP-2抑制劑、編碼肽抑制劑的RNAi或DNA植入連接有裝置體的多孔基質(zhì)中?？捎糜谥圃毂砻鎸拥拇硇远嗫谆|(zhì)是由腱或皮膚膠原制備的多孔基質(zhì)，例如可從各種商業(yè)來(lái)源獲得(例如Sigma和Collagen Corporation)的膠原基質(zhì)，或者膠原基質(zhì)按照參考文獻(xiàn)所述方法制備(Jefferies的美國(guó)專(zhuān)利第4,394,370號(hào)和Koezuka的美國(guó)專(zhuān)利第4,975,527號(hào))。一種膠原材料稱(chēng)為UltraFiber^TM，可從Norian Corp.(Mountain View，California)獲得。

如果需要，也可采用某些聚合基質(zhì)，包括丙烯酸酯聚合物和乳酸聚合物，例如參見(jiàn)Urist的美國(guó)專(zhuān)利第4,526,909號(hào)和Urist的美國(guó)專(zhuān)利第4,563,489號(hào)。有用聚合物的具體實(shí)例為原酸酯、酸酐、丙烯-共延胡索酸酯的聚合物，或者一種或多種α-羥基羧酸單體的聚合物(例如α-羥基乙酸(乙醇酸)和/或α-羥基丙酸(乳酸))。

治療方案

在預(yù)防性應(yīng)用中，將藥物組合物給予易患MASP-2依賴(lài)性補(bǔ)體活化相關(guān)疾病或有患MASP-2依賴(lài)性補(bǔ)體活化相關(guān)疾病風(fēng)險(xiǎn)的受試者，給藥量足以消除或降低疾病癥狀發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)。在治療性應(yīng)用中，以足以緩解或至少部分減少疾病癥狀的治療有效量，將藥物組合物給予疑似患有或已經(jīng)患有MASP-2依賴(lài)性補(bǔ)體活化相關(guān)疾病的受試者。在預(yù)防兼治療方案中，可以給予包含MASP-2抑制劑的組合物若干劑，直到在受試者中獲得充分的治療結(jié)果?？赏ㄟ^(guò)組合物的單次給予或有限的連續(xù)給予，來(lái)應(yīng)用本發(fā)明的MASP-2抑制劑組合物以治療急性疾病，例如再灌注損傷或其它外傷?；蛘?，可在較長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)按定期間隔給予組合物，用于治療慢性病，例如關(guān)節(jié)炎或銀屑病。

本發(fā)明的方法和組合物可用來(lái)抑制通常由診斷性和治療性?xún)?nèi)科和外科手術(shù)引起的炎癥和相關(guān)過(guò)程。為了抑制這些過(guò)程，可以在圍手術(shù)期應(yīng)用本發(fā)明的MASP-2抑制劑組合物。本文所用“圍手術(shù)期”是指在手術(shù)前和/或手術(shù)中和/或手術(shù)后給予本發(fā)明抑制劑組合物，即手術(shù)前，手術(shù)前和手術(shù)中，手術(shù)前和手術(shù)后，手術(shù)前、手術(shù)中和手術(shù)后，手術(shù)中，手術(shù)中和手術(shù)后，或者手術(shù)后。圍手術(shù)期應(yīng)用可通過(guò)將組合物局部給予手術(shù)部位來(lái)進(jìn)行，例如通過(guò)注射或者連續(xù)或間歇沖洗手術(shù)部位，或者通過(guò)全身性給藥。用于圍手術(shù)期局部遞送MASP-2抑制劑溶液劑的合適方法參見(jiàn)Demopulos的美國(guó)專(zhuān)利第6,420,432號(hào)和Demopulos的美國(guó)專(zhuān)利第6,645,168號(hào)。用于局部遞送包括MASP-2抑制劑的軟骨保護(hù)組合物的合適方法參見(jiàn)國(guó)際PCT專(zhuān)利申請(qǐng)WO 01/07067 A2。用于定向全身性遞送包括MASP-2抑制劑的軟骨保護(hù)組合物的合適方法參見(jiàn)國(guó)際PCT專(zhuān)利申請(qǐng)WO 03/063799 A2。

VI.實(shí)施例

下面的實(shí)施例僅舉例說(shuō)明目前預(yù)期的用于實(shí)施本發(fā)明的最佳方式，但是不得解釋為限制本發(fā)明。本文所引用的所有文獻(xiàn)都通過(guò)引用特別結(jié)合到本文中。

實(shí)施例1

本實(shí)施例描述了缺乏MASP-2(MASP-2-/-)但MAp19充足(MAp19+/+)的小鼠品系的產(chǎn)生。

材料與方法：設(shè)計(jì)打靶載體pKO-NTKV 1901來(lái)破壞編碼鼠MASP-2C端的三個(gè)外顯子，包括編碼絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域的外顯子，見(jiàn)圖4。使用PKO-NTKV 1901轉(zhuǎn)染鼠ES細(xì)胞系E14.1a(SV129Ola)。選出新霉素抗性和胸苷激酶敏感的克隆。篩選出600個(gè)ES克隆，在其中鑒定出4個(gè)不同克隆，通過(guò)DNA印跡證實(shí)含有預(yù)期選擇的打靶事件(targeting event)和重組事件，見(jiàn)圖4。通過(guò)胚胎轉(zhuǎn)移由這4個(gè)陽(yáng)性克隆產(chǎn)生嵌合體。然后將嵌合體在遺傳背景C57/BL6下回交以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因雄性鼠。將轉(zhuǎn)基因雄性鼠與雌性鼠雜交產(chǎn)生F1，50％的后代顯示出MASP 2基因被破壞的雜合性。將雜合小鼠互交以產(chǎn)生純合的MASP-2缺陷型后代，按1:2:1的比例分別產(chǎn)生雜合小鼠和野生型小鼠。

結(jié)果和表型：發(fā)現(xiàn)所產(chǎn)生的純合MASP-2-/-缺陷型小鼠是可存活和能育的，通過(guò)DNA印跡證實(shí)缺乏MASP-2，從而確認(rèn)了正確的打靶事件，經(jīng)RNA印跡證實(shí)缺乏MASP-2mRNA，經(jīng)蛋白質(zhì)印跡證實(shí)缺乏MASP-2蛋白(數(shù)據(jù)未顯示)。使用時(shí)間分辨RT-PCR在LightCycler機(jī)上進(jìn)一步證實(shí)了存在MAp19mRNA，缺乏MASP-2mRNA。MASP-2-/-小鼠確實(shí)如預(yù)期那樣繼續(xù)表達(dá)MAp19、MASP-1和MASP-3mRNA及蛋白質(zhì)(數(shù)據(jù)未顯示)。通過(guò)LightCycler分析對(duì)MASP-2-/-小鼠中備解素、B因子、D因子、C4、C2和C3的mRNA的存在和豐度進(jìn)行了評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)這些成分與野生型同窩對(duì)照中的相同(數(shù)據(jù)未顯示)。來(lái)自純合MASP-2-/-小鼠的血漿完全缺乏凝集素途徑介導(dǎo)的補(bǔ)體活化和替代途徑補(bǔ)體活化，如實(shí)施例2進(jìn)一步描述的。

在純的C57BL6背景下產(chǎn)生MASP-2-/-品系：將MASP-2-/-小鼠與純C57BL6品系回交9代后，將MASP-2-/-品系用作實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。

實(shí)施例2

本實(shí)施例證實(shí)MASP-2是通過(guò)替代途徑和凝集素途徑進(jìn)行補(bǔ)體活化所必需的。

方法與材料：

凝集素途徑特異性C4裂解測(cè)定法：C4裂解測(cè)定法記載于Petersen等，J.Immunol.Methods257:107(2001)，該測(cè)定法測(cè)定了由來(lái)自金黃色葡萄球菌、結(jié)合L-纖維膠凝蛋白的脂磷壁酸(LTA)所產(chǎn)生的凝集素途徑活化。對(duì)實(shí)施例11中所述測(cè)定法進(jìn)行了改進(jìn)，通過(guò)用LPS和甘露聚糖或酵母聚糖包被板后，加入得自MASP-2-/-小鼠的血清，來(lái)測(cè)定由MBL引起的凝集素途徑活化，如下文所述。還對(duì)該測(cè)定法進(jìn)行了改進(jìn)以消除由經(jīng)典途徑所致的C4裂解的可能性。這通過(guò)使用含有1M NaCl的樣品稀釋緩沖液來(lái)實(shí)現(xiàn)，這使得凝集素途徑識(shí)別組分以高親和力結(jié)合它們的配體，卻又阻止了內(nèi)源C4的活化，從而通過(guò)使C1復(fù)合物解離而排除了經(jīng)典途徑的參與。簡(jiǎn)單地說(shuō)，在改進(jìn)的測(cè)定法中，將血清樣品(稀釋于高鹽(1M NaCl)緩沖液中)加入到配體包被板上，接著加入緩沖液(具有生理濃度的鹽)中的恒量純C4。含有MASP-2的結(jié)合識(shí)別復(fù)合物裂解C4而引起C4b沉積。

測(cè)定方法：

1)用稀釋于包被緩沖液(15mM Na₂CO₃，35mM NaHCO₃，pH 9.6)的1μg/ml甘露聚糖(M7504Sigma)或任何其它配體(例如下列配體)，來(lái)包被Nunc Maxisorb微量滴定板(Maxisorb，Nunc,目錄號(hào)442404，F(xiàn)isher Scientific)。

下列試劑用于本測(cè)定法中：

a.甘露聚糖(1μg/孔甘露聚糖(M7504Sigma)，于100μl包被緩沖液中)；

b.酵母聚糖(1μg/孔酵母聚糖(Sigma)，于100μl包被緩沖液中)；

c.LTA(1μg/孔，于100μl包被緩沖液中，或者2μg/孔，于20μl甲醇中)；

d.1μg H-纖維膠凝蛋白特異性Mab 4H5，于包被緩沖液中；

e.來(lái)自淺綠氣球菌(Aerococcus viridans)的PSA(2μg/孔，于100μl包被緩沖液)；

f.100μl/孔福爾馬林固定的金黃色葡萄球菌DSM20233(OD₅₅₀＝0.5)，于包被緩沖液中。

2)將板在4℃下溫育過(guò)夜。

3)過(guò)夜溫育后，通過(guò)將板與0.1％HSA-TBS封閉緩沖液(0.1％(重量/體積)HSA的10mM Tris-HCl、140mM NaCl、1.5mM NaN₃溶液(pH 7.4))溫育1-3小時(shí)后，用TBS/吐溫(tween)/Ca²⁺(含0.05％吐溫20和5mM CaCl₂、1mM MgCl₂的TBS(pH 7.4))洗板3次，從而使剩余蛋白結(jié)合位點(diǎn)飽和。

4)將待測(cè)試的血清樣品稀釋于MBL結(jié)合緩沖液(1M NaCl)中，將稀釋的樣品加到板上，4℃下溫育過(guò)夜。只加緩沖液的孔用作陰性對(duì)照。

5)在4℃下溫育過(guò)夜之后，將該板用TBS/吐溫/Ca²⁺洗滌3次。然后將人C4(100μl/孔，1μg/ml稀釋于BBS(4mM巴比妥，145mM NaCl，2mM CaCl₂，1mM MgCl₂，pH 7.4)中)加到板上，在37℃下溫育90分鐘。該板用TBS/吐溫/Ca²⁺再洗滌3次。

6)用堿性磷酸酶綴合的雞抗人C4c(以1:1000稀釋于TBS/吐溫/Ca²⁺中)來(lái)檢測(cè)C4b沉積，將其加到板上，在室溫下溫育90分鐘。然后該板用TBS/吐溫/Ca²⁺洗滌3次。

7)通過(guò)加入100μl磷酸對(duì)硝基苯酯底物溶液來(lái)檢測(cè)堿性磷酸酶，在室溫下溫育20分鐘，在微量滴定板讀板儀上讀取OD₄₀₅。

結(jié)果：圖6A-B顯示來(lái)自MASP-2+/+(交叉線)、MASP-2+/-(實(shí)心圓)和MASP-2-/-(實(shí)心三角)的血清稀釋液中在甘露聚糖(圖6A)和酵母聚糖(圖6B)上C4b沉積的量。圖6C顯示來(lái)自MASP-2-/+小鼠(n＝5)和MASP-2-/-小鼠(n＝4)的酵母聚糖(白色條形柱)或甘露聚糖(陰影條形柱)包被板上相對(duì)于野生型小鼠(n＝5)的C4轉(zhuǎn)化酶相對(duì)活性，所根據(jù)的是測(cè)定針對(duì)野生型血清標(biāo)準(zhǔn)化的C4b沉積的量。誤差棒代表標(biāo)準(zhǔn)差。如圖6A-C所示，來(lái)自MASP-2-/-小鼠的血漿在甘露聚糖和酵母聚糖包被板上完全缺乏凝集素途徑介導(dǎo)的補(bǔ)體活化。這些結(jié)果清楚地表明，MASP-2而不是MASP-1或MASP-3為凝集素途徑的效應(yīng)子成分。

C3b沉積測(cè)定法：

1)Nunc Maxisorb微量滴定板(Maxisorb，Nunc,目錄號(hào)442404，F(xiàn)isher Scientific)用稀釋于包被緩沖液(15mM Na₂CO₃，35mM NaHCO₃，H 9.6)的1μg/ml甘露聚糖(M7504 Sigma)或任何其它配體包被，在4℃下溫育過(guò)夜。

2)該板與0.1％HSA-TBS封閉緩沖液(0.1％(重量/體積)HSA的10mM Tris-HCl，140mM NaCl，1.5mM NaN₃溶液，pH 7.4)一起溫育1-3小時(shí)，從而使剩余的蛋白結(jié)合位點(diǎn)飽和。

3)將該板在TBS/吐溫/Ca⁺⁺(含有0.05％吐溫20和5mM CaCl₂的TBS)中洗滌，將稀釋的BBS加到血清樣品(4mM巴比妥，145mM NaCl，2mM CaCl₂，1mM MgCl₂，pH 7.4)中。將只加緩沖液的孔用作陰性對(duì)照。在該項(xiàng)測(cè)定中，獲自野生型或MASP-2-/-小鼠的一組對(duì)照血清樣品在使用前耗盡C1q。根據(jù)供應(yīng)商的使用說(shuō)明書(shū)，使用兔抗人C1q IgG(Dako,Glostrup,Denmark)包被的偶聯(lián)蛋白A的Dynabeads(Dynal Biotech,Oslo,Norway)來(lái)制備C1q耗盡的小鼠血清。

4)在4℃下溫育過(guò)夜后，用TBS/吐溫/Ca⁺⁺再洗滌一次，用以1:1000稀釋于TBS/吐溫/Ca⁺⁺的多克隆抗人C3c抗體(Dako A 062)來(lái)檢測(cè)被轉(zhuǎn)化和結(jié)合的C3。二次抗體是與堿性磷酸酶綴合的山羊抗兔IgG(完整分子)(Sigma Immunochemicals A-3812)，按1:10000稀釋于TBS/吐溫/Ca⁺⁺。通過(guò)加入100μl底物溶液(Sigma快速磷酸對(duì)硝基苯酯片套裝，Sigma)并在室溫下溫育，來(lái)測(cè)定替代補(bǔ)體途徑(AP)的存在。通過(guò)在微量滴定板讀板儀中測(cè)定405nm的吸收，來(lái)定量監(jiān)測(cè)水解情況。采用血漿/血清樣品的連續(xù)稀釋液來(lái)繪制用于各項(xiàng)分析的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

結(jié)果：圖7A和圖7B所示結(jié)果來(lái)自若干小鼠的合并血清。交叉線表示MASP-2+/+血清，實(shí)心圓表示C1q耗盡的MASP-2+/+血清，空心方塊表示MASP-2-/-血清，空心三角表示C1q耗盡的MASP-2-/-血清。如圖7A-B所示，在C3b沉積測(cè)定中所測(cè)得的MASP-2-/-小鼠的血清在甘露聚糖(圖7A)和酵母聚糖(圖7B)包被板上產(chǎn)生水平非常低的C3活化。這個(gè)結(jié)果清楚地表明，為了啟動(dòng)替代補(bǔ)體途徑，需要MASP-2以助于從C3產(chǎn)生最初的C3b。這是預(yù)料不到的結(jié)果，因?yàn)槠毡榻邮艿挠^點(diǎn)認(rèn)為，補(bǔ)體因子C3、B因子、D因子和備解素形成獨(dú)立的功能性替代途徑，其中C3能夠經(jīng)歷自發(fā)構(gòu)象變化成為“C3b樣”形式，進(jìn)而產(chǎn)生液相轉(zhuǎn)化酶iC3Bb，并使C3b分子沉積在活化表面(例如酵母聚糖)上。

重組MASP-2重構(gòu)MASP-2-/-小鼠血清中的凝集素途徑依賴(lài)性C4活化

為了證實(shí)MASP-2缺乏是MASP-2-/-小鼠凝集素途徑依賴(lài)性C4活化喪失的直接原因，在上述C4裂解測(cè)定中測(cè)試了將重組MASP-2蛋白加到血清樣品中的作用。按照以下實(shí)施例5中所述方法，制備了有功能活性的鼠MASP-2和無(wú)催化活性的鼠MASP-2A(其中絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域活性部位上的絲氨酸殘基被丙氨酸殘基取代)重組蛋白并進(jìn)行了純化。將得自4只MASP-2-/-小鼠的合并血清與蛋白質(zhì)濃度遞增的重組鼠MASP-2或無(wú)活性的重組鼠MASP-2A一起預(yù)溫育，按上述方法測(cè)定C4轉(zhuǎn)化酶活性。

結(jié)果：如圖8所示，將有功能活性鼠重組MASP-2蛋白(用空心三角表示)加到獲自MASP-2-/-小鼠的血清中，以蛋白質(zhì)濃度依賴(lài)方式恢復(fù)了凝集素途徑依賴(lài)性C4活化，而無(wú)催化活性的鼠MASP-2A蛋白(用星號(hào)表示)沒(méi)有恢復(fù)C4活化。將圖8所示結(jié)果針對(duì)用合并的野生型小鼠血清所觀察到的C4活化結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化(用點(diǎn)線表示)。

實(shí)施例3

本實(shí)施例描述了鼠MASP-2-/-、MAp19+/+且表達(dá)人MASP-2轉(zhuǎn)基因(鼠MASP-2敲除，人MASP-2敲入)的轉(zhuǎn)基因小鼠品系的產(chǎn)生。

材料與方法：構(gòu)建包括人MASP 2基因啟動(dòng)子區(qū)并編碼人MASP-2的小基因(SEQ ID NO:49)，稱(chēng)為“mini hMASP-2”，見(jiàn)圖5，它包括頭3個(gè)外顯子(外顯子1至外顯子3)，接著是代表隨后8個(gè)外顯子的編碼序列的cDNA序列，從而編碼由其內(nèi)源啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的全長(zhǎng)MASP-2蛋白。將mini hMASP-2構(gòu)建體注射到MASP-2-/-的受精卵中，以便通過(guò)轉(zhuǎn)基因表達(dá)人MASP-2來(lái)代替缺失的鼠MASP 2基因。

實(shí)施例4

本實(shí)施例描述了從人血清中分離酶原形式的人MASP-2蛋白。

人MASP-2的分離方法：從人血清分離MASP-2的方法記載于Matsushita等，J.Immunol.165:2637-2642，2000。簡(jiǎn)單來(lái)講，使用10mM咪唑緩沖液(pH 6.0)，使人血清通過(guò)酵母甘露聚糖－瓊脂糖凝膠柱，所述緩沖液含有0.2M NaCl、20mM CaCl₂、0.2mM NPGB、20μM p-APMSF和2％甘露醇。使MASP-1和MASP-2酶原與MBL結(jié)合成復(fù)合物后，用含有0.3M甘露糖的上述緩沖液洗脫。為了從MBL上分離出酶原MASP-1和MASP-2，將含有所述復(fù)合物的制備物加到抗MBL-瓊脂糖凝膠中，然后用含有20mM EDTA和1M NaCl的咪唑緩沖液洗脫出MASP。最后，通過(guò)抗MASP-1-瓊脂糖凝膠而使酶原MASP-1和MASP-2相互分離開(kāi)來(lái)，緩沖液與抗MBL-瓊脂糖凝膠所用緩沖液相同。從洗脫液中回收MASP-2，而MASP-1則用0.1M甘氨酸緩沖液(pH 2.2)洗脫。

實(shí)施例5

本實(shí)施例描述了重組全長(zhǎng)人、大鼠和小鼠MASP-2、MASP-2衍生多肽以及無(wú)催化活性的MASP-2突變形式的重組表達(dá)和蛋白質(zhì)生產(chǎn)。

全長(zhǎng)人、小鼠和大鼠MASP-2的表達(dá)：

將人MASP-2全長(zhǎng)cDNA序列(SEQ ID NO:4)同樣亞克隆到哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pCI-Neo(Promega)中，在CMV增強(qiáng)子/啟動(dòng)子區(qū)控制下驅(qū)動(dòng)真核表達(dá)(描述于Kaufman R.J.等，Nucleic Acids Research 19:4485-90，1991；Kaufman,Methods in Enzymology,185:537-66(1991))。將全長(zhǎng)小鼠cDNA(SEQ ID NO:50)和大鼠MASP-2cDNA(SEQ ID NO:53)分別亞克隆到pED表達(dá)載體中。然后應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)磷酸鈣轉(zhuǎn)染方法(描述于Maniatis等，1989)，將MASP-2表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到貼壁的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞系DXB1中。用這些構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞生長(zhǎng)得非常緩慢，表明所編碼的蛋白酶有細(xì)胞毒性。

在另一種方法中，將含有由其內(nèi)源啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的人MASP-2cDNA的小基因構(gòu)建體(SEQ ID NO:49)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)中。人MASP-2蛋白被分泌到培養(yǎng)基中，如下述進(jìn)行分離。

全長(zhǎng)無(wú)催化活性的MASP-2的表達(dá)：

基本原理：在識(shí)別亞成分MBL或纖維膠凝蛋白(L-纖維膠凝蛋白、H-纖維膠凝蛋白或M-纖維膠凝蛋白)結(jié)合它們各自的糖類(lèi)模式之后，MASP-2通過(guò)自催化裂解激活。導(dǎo)致MASP-2活化的自催化裂解經(jīng)常發(fā)生在從血清分離MASP-2的過(guò)程中，或者在重組表達(dá)后的純化期間。為獲得更穩(wěn)定的蛋白質(zhì)制備物用作抗原，通過(guò)用丙氨酸殘基置換蛋白酶結(jié)構(gòu)域催化三聯(lián)體中存在的絲氨酸殘基，產(chǎn)生無(wú)催化活性形式的MASP-2，稱(chēng)為MASP-2A，在大鼠中(SEQ ID NO:55Ser617變成Ala617)；在小鼠中(SEQ ID NO:52Ser617變成Ala617)；或在人中(SEQ ID NO:3Ser618變成Ala618)。

為產(chǎn)生無(wú)催化活性的人和鼠MASP-2A蛋白，使用表5所示寡核苷酸進(jìn)行定點(diǎn)誘變。為了將絲氨酸密碼子變成丙氨酸密碼子，設(shè)計(jì)了表5中的寡核苷酸使編碼有酶活性絲氨酸的人和鼠cDNA區(qū)退火，寡核苷酸含有錯(cuò)配。例如，采用PCR寡核苷酸SEQ ID NO:56-59結(jié)合人MASP-2cDNA(SEQ ID NO:4)，以便擴(kuò)增自起始密碼子到有酶活性絲氨酸的區(qū)域及自絲氨酸到終止密碼子的區(qū)域，從而產(chǎn)生完整開(kāi)放可讀形式的含有Ser618到Ala618突變的突變型MASP-2A。PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳和條帶制備后被純化，使用標(biāo)準(zhǔn)加尾方法產(chǎn)生單腺苷重疊。然后將加腺苷尾的MASP-2A克隆到pGEM-T easy載體中，再轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中。

通過(guò)將SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:65兩種寡核苷酸以等摩爾量結(jié)合，在100℃下加熱2分鐘后，緩慢冷卻到室溫，通過(guò)對(duì)這兩種寡核苷酸的激酶化(kinasing)和退火，來(lái)產(chǎn)生無(wú)催化活性的大鼠MASP-2A蛋白。所得到的退火片段具有Pst1和Xba1匹配末端，將該片段插入以替換野生型大鼠MASP-2cDNA(SEQ ID NO:53)的Pst1-Xba1片段從而產(chǎn)生大鼠MASP-2A。

5'GAGGTGACGCAGGAGGGGCATTAGTGTTT 3'(SEQ ID NO:64)

5'CTAGAAACACTAATGCCCCTCCTGCGTCACCTCTGCA 3'(SEQ ID NO:65)。

按下述方法，進(jìn)一步將人、小鼠和大鼠MASP-2A分別亞克隆到哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pED或pCI-Neo并轉(zhuǎn)染到中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞系DXB1中。

在另一種方法中，應(yīng)用Chen等人所述方法構(gòu)建無(wú)催化活性形式的MASP-2(Chen等，J.Biol.Chem.，276(28):25894-25902，2001)。簡(jiǎn)單來(lái)講，將含有全長(zhǎng)人MASP-2cDNA的質(zhì)粒(描述于Thiel等，Nature 386:506，1997)用Xho1和EcoR1消化，將MASP-2cDNA(參見(jiàn)本文的SEQ ID NO:4)克隆到pFastBac1桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體(Life Technologies,NY)相應(yīng)的限制位點(diǎn)中。然后通過(guò)用天然區(qū)域氨基酸610-625取代編碼肽區(qū)域氨基酸610-625(SEQ ID NO:13)的雙鏈寡核苷酸，將MASP-2絲氨酸蛋白酶活性位點(diǎn)Ser618變成Ala618，從而產(chǎn)生帶有無(wú)活性蛋白酶結(jié)構(gòu)域的MASP-2全長(zhǎng)多肽。

含有得自人MASP-2的多肽區(qū)的表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

采用MASP-2信號(hào)肽(SEQ ID NO:5的殘基1-15)來(lái)產(chǎn)生下面的構(gòu)建體以分泌不同的MASP-2結(jié)構(gòu)域。通過(guò)PCR擴(kuò)增編碼MASP-2(SEQ ID NO:6)殘基1-121的區(qū)域(相當(dāng)于N端CUB1結(jié)構(gòu)域)來(lái)制備表達(dá)人MASP-2CUBI結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:8)的構(gòu)建體。通過(guò)PCR擴(kuò)增編碼MASP-2(SEQ ID NO:6)殘基1-166的區(qū)域(相當(dāng)于N端CUBIEGF結(jié)構(gòu)域)來(lái)制備表達(dá)人MASP-2CUBIEGF結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:9)的構(gòu)建體。通過(guò)PCR擴(kuò)增編碼MASP-2(SEQ ID NO:6)殘基1-293的區(qū)域(相當(dāng)于N端CUBIEGFCUBII結(jié)構(gòu)域)來(lái)制備表達(dá)人MASP-2CUBIEGFCUBII結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:10)的構(gòu)建體。采用Vent_R聚合酶，pBS-MASP-2作為模板，根據(jù)已確立的PCR方法，經(jīng)PCR擴(kuò)增上述結(jié)構(gòu)域。有義引物(5'-CGGGATCCATGAGGCTGCTGACCCTC-3'SEQ ID NO:34)的5’引物序列在PCR產(chǎn)物的5’端引入BamHI限制位點(diǎn)(下劃線)。下表5中所示的各MASP-2結(jié)構(gòu)域的反義引物被設(shè)計(jì)用來(lái)在各種PCR產(chǎn)物末端的EcoRI位點(diǎn)(下劃線)后引入終止密碼子(粗體)。DNA片段一旦被擴(kuò)增，便用BamHI和EcoRI消化，并克隆到pFastBac1載體相應(yīng)的位點(diǎn)中。所得構(gòu)建體用限制酶切作圖表征，并通過(guò)dsDNA測(cè)序來(lái)證實(shí)。

表5：MASP-2PCR引物

MASP-2的重組真核表達(dá)與無(wú)酶活性的小鼠、大鼠和人MASP-2A的蛋白質(zhì)生產(chǎn)應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)磷酸鈣轉(zhuǎn)染方法(Maniatis等，1989)，將上述MASP-2和MASP-2A表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到DXB1細(xì)胞中。在無(wú)血清培養(yǎng)基中產(chǎn)生MASP-2A，以確保制備物不被其它血清蛋白污染。每隔一天從匯合細(xì)胞中收獲培養(yǎng)基(共四次)。所有三個(gè)物種的重組MASP-2A水平平均約為1.5mg/升培養(yǎng)基。

MASP-2A蛋白純化：通過(guò)親和層析法在MBP-A瓊脂糖柱上使MASP-2A(上述Ser-Ala突變體)純化。這種方法能夠快速純化而無(wú)需使用外部標(biāo)記。將MASP-2A(100-200ml培養(yǎng)基用等體積的加樣緩沖液(50mM Tris-Cl，pH 7.5，含有150mM NaCl和25mM CaCl₂)稀釋)加到MBP-瓊脂糖親和柱(4ml)上，柱用10ml加樣緩沖液預(yù)平衡。另用10ml加樣緩沖液洗滌后，在含有1.25M NaCl和10mM EDTA的50mM Tris-Cl(pH 7.5)的1ml組分中洗脫蛋白質(zhì)。用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳來(lái)鑒定含有MASP-2A的餾分。必要時(shí)，MASP-2A通過(guò)離子交換層析在MonoQ柱(HR 5/5)上進(jìn)一步純化。蛋白質(zhì)用含有50mM NaCl的50mM Tris-Cl(pH 7.5)透析，加到用同一緩沖液平衡的柱上。洗滌后，另用10ml的0.05-1M NaCl梯度洗脫出結(jié)合的MASP-2A。

結(jié)果：從200ml培養(yǎng)基中獲得產(chǎn)量為0.25-0.5mg的MASP-2A蛋白。由于糖基化作用，所以經(jīng)MALDI-MS測(cè)得77.5kDa的分子量比未修飾多肽的計(jì)算值(73.5kDa)大。在每個(gè)N-糖基化位點(diǎn)連接有聚糖是所測(cè)分子量的原因。MASP-2A作為單一條帶在SDS-聚丙烯酰胺凝膠上遷移，證明在生物合成期間沒(méi)有被蛋白水解加工。通過(guò)平衡超速離心法測(cè)得的加權(quán)平均分子量與糖基化多肽同型二聚體的計(jì)算值一致。

重組人MASP-2多肽的生產(chǎn)

生產(chǎn)重組MASP-2和MASP-2A衍生多肽的另一種方法描述于Thielens,N.M.等，J.Immunol.166:5068-5077，2001。簡(jiǎn)單來(lái)講，使草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)昆蟲(chóng)細(xì)胞(獲自Novagen,Madison,WI的Ready-Plaque Sf9細(xì)胞)在Sf900II無(wú)血清培養(yǎng)基(Life Technologies)中生長(zhǎng)并維持，該培養(yǎng)基補(bǔ)充了50IU/ml青霉素和50mg/ml鏈霉素(Life Technologies)。使粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)(High Five)昆蟲(chóng)細(xì)胞(由Jadwiga Chroboczek,Institut de Biologie Structurale,Grenoble,France提供)在TC100培養(yǎng)基(Life Technologies)中維持，該培養(yǎng)基含有補(bǔ)充了50IU/ml青霉素和50mg/ml鏈霉素的10％FCS(Dominique Dutscher,Brumath,France)。采用Bac-to-Bac系統(tǒng)(Life Technologies)來(lái)產(chǎn)生重組桿狀病毒。桿粒(bacmid)DNA采用Qiagen中量制備純化系統(tǒng)(Qiagen)純化，并用來(lái)按照生產(chǎn)商所述方案，在cellfectin的Sf900II SFM培養(yǎng)基(Life Technologies)中轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞。4天后收集重組病毒顆粒，經(jīng)病毒噬斑測(cè)定滴定，按照King和Possee所述方法(King和Possee,載于The Baculovirus Expression System:A Laboratory Guide,Chapman and Hall Ltd.，London,第111-114頁(yè)，1992)進(jìn)行擴(kuò)增。

在Sf900II SFM培養(yǎng)基中，用含有MASP-2多肽的重組病毒在28℃下感染粉紋夜蛾(High Five)細(xì)胞(1.75x10⁷個(gè)細(xì)胞/175cm²組織培養(yǎng)瓶)96小時(shí)，感染復(fù)數(shù)為2。經(jīng)離心收集上清液，加入二異丙基氟磷酸至終濃度1mM。

MASP-2多肽被分泌到培養(yǎng)基中。將培養(yǎng)物上清液對(duì)50mM NaCl、1mM CaCl₂、50mM鹽酸三乙醇胺(pH 8.1)透析，以1.5ml/分鐘的速度加到同一緩沖液平衡的Q-瓊脂糖凝膠快流速柱(Amersham Pharmacia Biotech)(2.8x12cm)上。在同一緩沖液中，用1.2升的線性梯度(至350mM NaCl)進(jìn)行洗脫。通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析法鑒定出含有重組MASP-2多肽的餾分，加入(NH₄)₂SO₄至60％(重量/體積)進(jìn)行沉淀，4℃靜置過(guò)夜。將沉淀重懸浮于145mM NaCl、1mM CaCl₂、50mM鹽酸三乙醇胺(pH 7.4)中，加到同一緩沖液平衡的TSK G3000SWG柱(7.5x 600mm)(Tosohaas,Montgomeryville,PA)上。然后將已純化的多肽在Microsep微量濃縮器(截留分子量＝10,000)(Filtron,Karlstein,Germany)中通過(guò)超濾濃縮至0.3mg/ml。

實(shí)施例6

本實(shí)施例描述了抗MASP-2多肽的多克隆抗體的生產(chǎn)方法。

材料與方法：

MASP-2抗原：用以下分離的MASP-2多肽免疫兔子，以生產(chǎn)多克隆抗人MASP-2抗血清：分離自血清的人MASP-2(SEQ ID NO:6)，描述于實(shí)施例4；重組人MASP-2(SEQ ID NO:6)，含有無(wú)活性的蛋白酶結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:13)的MASP-2A，見(jiàn)實(shí)施例4-5；表達(dá)的重組CUBI(SEQ ID NO:8)、CUBEGFI(SEQ ID NO:9)和CUBEGFCUBII(SEQ ID NO:10)，如上文實(shí)施例5所述。

多克隆抗體：已用BCG(卡介苗(bacillus Calmette-Guerin vaccine))免疫的六周齡兔，經(jīng)注射100μg MASP-2多肽進(jìn)行免疫，MASP-2多肽按100μg/ml溶于無(wú)菌鹽溶液。每4周進(jìn)行注射，通過(guò)ELISA測(cè)定法監(jiān)測(cè)抗體效價(jià)，描述于實(shí)施例7。收集培養(yǎng)物上清液，用于通過(guò)A蛋白親和層析法進(jìn)行抗體純化。

實(shí)施例7

本實(shí)施例描述了抗大鼠或人MASP-2多肽的鼠單克隆抗體的生產(chǎn)方法。

材料與方法：

將100μg人或大鼠rMASP-2或rMASP-2A多肽(按實(shí)施例4或?qū)嵤├?中所述制備)皮下注射到8-12周齡的雄性A/J小鼠(Harlan,Houston,Tex.)，所述多肽溶于200μl磷酸緩沖鹽溶液(PBS)(pH 7.4)中的完全弗氏佐劑(Difco Laboratories,Detroit,Mich.)。在兩周的時(shí)間間隔下，將50μg溶于不完全弗氏佐劑的人或大鼠rMASP-2或rMASP-2A多肽兩次皮下注射到小鼠。在第四周，給小鼠注射溶于PBS的50μg人或大鼠rMASP-2或rMASP-2A多肽，4天后進(jìn)行融合。

對(duì)于每次融合，從經(jīng)過(guò)免疫的小鼠脾臟制備單細(xì)胞懸液，用于與Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞融合。將5x10⁸個(gè)Sp2/0和5x10⁸個(gè)脾細(xì)胞在含有50％聚乙二醇(分子量1450)(Kodak,Rochester,N.Y.)和5％二甲亞砜(Sigma Chemical Co.，St.Louis,Mo.)的培養(yǎng)基中進(jìn)行融合。然后將細(xì)胞調(diào)節(jié)到每200μl的Iscove培養(yǎng)基(Gibco,Grand Island,N.Y.)懸液1.5x10⁵脾細(xì)胞的濃度，培養(yǎng)基中補(bǔ)充10％胎牛血清、100單位/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素、0.1mM次黃嘌呤、0.4μM氨基蝶呤和16μM胸苷。將200微升細(xì)胞懸液加到大約二十個(gè)96孔微量培養(yǎng)板的各孔中。大約10天后，取出培養(yǎng)物上清液，用于在ELISA測(cè)定法中篩選純化因子MASP-2的反應(yīng)性。

ELISA測(cè)定法：通過(guò)加入50μl經(jīng)純化的50ng/ml hMASP-2或大鼠rMASP-2(或rMASP-2A)在室溫下過(guò)夜，包被Immulon 2(Dynatech Laboratories,Chantilly,Va.)微量試驗(yàn)板的各孔。用于包被的低濃度MASP-2使得能夠選擇高親和性抗體。在輕輕拍打培養(yǎng)板除去包被溶液后，將200μl的BLOTTO(脫脂奶粉)的PBS溶液加到每個(gè)孔中達(dá)1小時(shí)以封閉非特異性位點(diǎn)。一小時(shí)之后，各孔用緩沖液PBST(含有0.05％吐溫20的PBS)洗滌。從各融合孔中收集50微升的培養(yǎng)物上清液，并與50μl的BLOTTO混合，然后加到微量試驗(yàn)板的各孔中。溫育1小時(shí)之后，各孔用PBST洗滌。然后通過(guò)與辣根過(guò)氧化物酶(HRP)綴合的山羊抗小鼠IgG(對(duì)Fc特異性)(Jackson ImmunoResearch Laboratories,West Grove,Pa.)反應(yīng)來(lái)檢測(cè)結(jié)合的鼠抗體，并以1:2,000稀釋于BLOTTO中。將含有0.1％3,3,5,5-四甲基聯(lián)苯胺(Sigma,St.Louis,Mo.)和0.0003％過(guò)氧化氫(Sigma)的過(guò)氧化物酶底物溶液加到各孔中，顯色30分鐘。每孔加入50μl 2M H₂SO₄終止反應(yīng)。用BioTek ELISA讀板儀(BioTek Instruments,Winooski,Vt.)讀取反應(yīng)混合物在450nm的光密度(OD)。

MASP-2結(jié)合測(cè)定：

在上述MASP-2ELISA測(cè)定法中測(cè)試為陽(yáng)性的培養(yǎng)物上清液可在結(jié)合測(cè)定中進(jìn)行測(cè)定，以測(cè)定MASP-2抑制劑對(duì)MASP-2的結(jié)合親和性。也可使用類(lèi)似測(cè)定法來(lái)確定抑制劑是否結(jié)合補(bǔ)體系統(tǒng)中的其它抗原。

通過(guò)用MASP-2的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)(pH 7.4)(20ng/100μl/孔，Advanced Research Technology,San Diego,CA)在4℃下過(guò)夜，來(lái)包被聚苯乙烯微量滴定板的各孔(96孔培養(yǎng)基結(jié)合板，Corning Costar,Cambridge,MA)。吸出MASP-2溶液后，各孔用含有1％牛血清白蛋白(BSA；Sigma Chemical)的PBS在室溫下封閉2小時(shí)。無(wú)MASP-2包被的孔用作背景對(duì)照。將在封閉溶液中不同濃度的雜交瘤上清液或已純化的抗MASP-2MoAb等分溶液加到各孔中。在室溫下溫育2小時(shí)之后，各孔用PBS充分漂洗。通過(guò)在封閉溶液中加入過(guò)氧化物酶綴合的山羊抗小鼠IgG(Sigma Chemical)在室溫下溫育1小時(shí)，來(lái)檢測(cè)結(jié)合MASP-2的抗MASP-2MoAb。該板用PBS再次充分漂洗后，加入100μl 3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物(Kirkegaard and Perry Laboratories,Gaithersburg,MD)。加入100μl的1M磷酸來(lái)猝滅TMB反應(yīng)，將板在微量板讀板儀(SPECTRA MAX 250，Molecular Devices,Sunnyvale,CA)中在450nm下讀數(shù)。

然后測(cè)定來(lái)自陽(yáng)性孔的培養(yǎng)物上清液在功能測(cè)定法(例如實(shí)施例2所述C4裂解測(cè)定法)中抑制補(bǔ)體活化的能力。然后經(jīng)有限稀釋克隆陽(yáng)性孔中的細(xì)胞。再在上述ELISA測(cè)定法中測(cè)定MoAb與hMASP-2的反應(yīng)性。使選出的雜交瘤在轉(zhuǎn)瓶中生長(zhǎng)，收集耗盡培養(yǎng)物的上清液，通過(guò)A蛋白親和層析法純化抗體。

實(shí)施例8

本實(shí)施例描述了用作篩選MASP-2抑制劑模型的表達(dá)人MASP-2的MASP-2-/-敲除小鼠的產(chǎn)生。

材料與方法：

將實(shí)施例1所述的MASP-2-/-小鼠與實(shí)施例3所述的表達(dá)人MASP-2轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體(人MASP-2敲入)的MASP-2-/-小鼠進(jìn)行雜交，為鼠MASP-2-/-、鼠MAp19+、人MASP-2+的后代用來(lái)鑒定人MASP-2抑制劑。

這些動(dòng)物模型可用作鑒定MASP-2抑制劑功效的試驗(yàn)底物，MASP-2抑制劑例如人抗MASP-2抗體、MASP-2抑制肽和非肽以及包含MASP-2抑制劑的組合物。例如，將動(dòng)物模型暴露于已知觸發(fā)MASP-2依賴(lài)性補(bǔ)體活化的化合物或試劑中，以足以引起所暴露動(dòng)物的疾病癥狀減輕的時(shí)間和濃度給予動(dòng)物模型MASP-2抑制劑。

此外，鼠MASP-2-/-、MAp19+、人MASP-2+小鼠可用來(lái)產(chǎn)生含有一種或多種涉及MASP-2有關(guān)疾病的細(xì)胞類(lèi)型的細(xì)胞系，它可用作該疾病的細(xì)胞培養(yǎng)模型。由轉(zhuǎn)基因動(dòng)物產(chǎn)生連續(xù)細(xì)胞系是本領(lǐng)域眾所周知的，例如參見(jiàn)Small,J.A.等，Mol.Cell Biol.，5:642-48，1985。

實(shí)施例9

本實(shí)施例描述了在表達(dá)人MASP-2和人免疫球蛋白的MASP-2敲除小鼠中生產(chǎn)抗人MASP-2人抗體的方法。

材料與方法：

按照實(shí)施例1所述方法產(chǎn)生MASP-2-/-小鼠。然后按照實(shí)施例3中所述方法構(gòu)建表達(dá)人MASP-2的小鼠。將純合MASP-2-/-和表達(dá)人MASP-2的MASP-2-/-小鼠各自與得自胚胎干細(xì)胞系的小鼠雜交，該胚胎干細(xì)胞系被改造成包括定向破壞內(nèi)源免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因座，并且表達(dá)至少一個(gè)區(qū)段的人免疫球蛋白基因座。優(yōu)選該人免疫球蛋白基因座的區(qū)段包括重鏈和輕鏈組分的未重排序列。內(nèi)源免疫球蛋白基因的失活和外源免疫球蛋白基因的引入都可通過(guò)定向同源重組來(lái)實(shí)現(xiàn)。由這種方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物能夠使免疫球蛋白組分序列進(jìn)行功能性重排，并表達(dá)由人免疫球蛋白基因編碼的各種同種型的抗體庫(kù)，而不表達(dá)內(nèi)源免疫球蛋白基因。具有這些性質(zhì)的哺乳動(dòng)物的產(chǎn)生和性質(zhì)描述于例如Thomson,A.D.，Nature148:1547-1553，1994和Sloane,B.F.，Nature Biotechnology14:826，1996。其中小鼠抗體基因失活并在功能上被人抗體基因置換的小鼠的遺傳工程改造品系是市售的(例如可獲自Abgenix，F(xiàn)remont CA的)。所得到的子代小鼠能夠產(chǎn)生適用于人體療法的抗人MASP-2人MoAb。

實(shí)施例10

本實(shí)施例描述了人源化鼠抗MASP-2抗體和抗體片段的產(chǎn)生和生產(chǎn)。

按照實(shí)施例7所述方法，在雄性A/J小鼠中產(chǎn)生鼠抗MASP-2單克隆抗體。然后按照下述方法，將鼠恒定區(qū)用其人對(duì)應(yīng)物置換來(lái)產(chǎn)生IgG與抗體Fab片段的嵌合體，使鼠抗體人源化以降低它的免疫原性，所述嵌合體用于抑制本發(fā)明的人受試者體內(nèi)的MASP-2依賴(lài)性補(bǔ)體活化的不利作用。

1.由鼠雜交瘤細(xì)胞克隆抗MASP-2可變區(qū)基因

按照生產(chǎn)商的方案(Biotech,Houston,Tex.)，使用RNAzol由分泌抗MASP-2MoAb的雜交瘤細(xì)胞(按照實(shí)施例7中所述方法獲得)中分離出總RNA。采用寡聚dT作為引物，由總RNA合成第一cDNA鏈。使用免疫球蛋白恒定C區(qū)衍生的3’引物和得自前導(dǎo)肽或鼠V_H或V_K基因的第一構(gòu)架區(qū)的簡(jiǎn)并引物組作為5’引物對(duì)來(lái)進(jìn)行PCR。按Chen和Platsucas所述方法(Chen，P.F.，Scand.J.Immunol.35:539-549，1992)進(jìn)行錨定PCR。對(duì)于克隆V_K基因，用Not1-MAK1引物(5'-TGCGGCCGCTGTAGGTGCTGTCTTT-3'SEQ ID NO:38)來(lái)制備雙鏈cDNA。將退火銜接子AD1(5'-GGAATTCACTCGTTATTCTCG GA-3'SEQ ID NO:39)和AD2(5'-TCCGAGAATAACGAGTG-3'SEQ ID NO:40)連接到雙鏈cDNA的5’端和3’端。經(jīng)Notl消化除去3’端銜接子。然后將消化產(chǎn)物用作PCR模板，以AD1寡核苷酸作為5’引物，MAK2(5'-CATTGAAAGCTTTGGGGTAGAAGTTGTTC-3'SEQ ID NO:41)作為3’引物。將大約500bp的DNA片段克隆到pUC19中。選出若干克隆進(jìn)行序列分析以證實(shí)克隆序列包括預(yù)期的鼠免疫球蛋白恒定區(qū)。Not1-MAK1和MAK2寡核苷酸得自V_K區(qū)，分別為Cκ基因第一堿基對(duì)下游的182bp和84bp。選擇包括完整V_K和前導(dǎo)肽的克隆。

對(duì)于克隆V_H基因，使用Not1-MAG1引物(5'-CGCGGCCGCAGCTGCTCAGAGTGTAGA-3'SEQ ID NO:42)來(lái)制備雙鏈cDNA。將退火銜接子AD1和AD2連接到雙鏈cDNA的5’端和3’端。經(jīng)Notl消化除去3’端銜接子。將消化產(chǎn)物用作PCR模板，以AD1寡核苷酸和MAG2(5'-CGGTAAGCTTCACTGGCTCAGGGAAATA-3'SEQ ID NO:43)作為引物。將長(zhǎng)度為500-600bp的DNA片段克隆到pUC19中。Not1-MAG1和MAG2寡核苷酸得自鼠Cγ.7.1區(qū)，分別為鼠Cγ.7.1基因第一堿基對(duì)下游的180bp和93bp。選擇包括完整V_H和前導(dǎo)肽的克隆。

2.嵌合MASP-2IgG與Fab的表達(dá)載體的構(gòu)建

將上述克隆的V_H和V_K基因用作PCR反應(yīng)的模板，以便將Kozak共有序列加到5’端，將剪接供體加到核苷酸序列的3’端。對(duì)該序列進(jìn)行分析確定沒(méi)有PCR誤差后，將V_H和V_K基因分別插入到含有人C.γ1和C.κ的表達(dá)載體盒中，得到pSV2neoV_H-huCγ1和pSV2neoV-huCγ。使用CsCl梯度純化的重鏈和輕鏈載體的質(zhì)粒DNA通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞。48小時(shí)后，通過(guò)ELISA測(cè)定培養(yǎng)物上清液，證實(shí)存在大約200ng/ml的嵌合IgG。收獲細(xì)胞，制備總RNA。使用寡聚dT作為引物從總RNA合成第一cDNA鏈。將該cDNA用作PCR模板以產(chǎn)生Fd和κDNA片段。對(duì)于Fd基因，使用5'-AAGAAGCTTGCCGCCACCA TGGATTGGCTGTGGAACT-3'(SEQ ID NO:44)作為5’引物以及得自CH1的3’引物(5'-CGGGATCCTCAAACTTTCTTGTCCACCTTGG-3'SEQ ID NO:45)進(jìn)行PCR。證實(shí)DNA序列含有完整的人IgG1的V_H和CH1結(jié)構(gòu)域。在用合適的酶消化后，將Fd DNA片段插入表達(dá)載體盒pSV2dhfr-TUS的HindIII和BamHI限制位點(diǎn)，得到pSV2dhfrFd。pSV2質(zhì)粒是市售的，由不同來(lái)源的DNA區(qū)段組成：pBR322DNA(細(xì)線)含有pBR322DNA復(fù)制起點(diǎn)(pBR ori)以及內(nèi)酰胺酶氨芐青霉素抗性基因(Amp)；SV40DNA，由較粗影線表示并標(biāo)記，含有SV40DNA復(fù)制起點(diǎn)(SV40ori)、早期啟動(dòng)子(dhfr和neo基因的5’)以及聚腺苷酸化信號(hào)(dhfr和neo基因的3’端)。得自SV40的聚腺苷酸化信號(hào)(pA)也位于Fd基因的3’端。

對(duì)于κ基因，使用5'-AAGAAAGCTTGCCGCCACCATGTTCTCA CTAGCTCT-3'(SEQ ID NO:46)作為5’引物和得自C_K衍生的3’引物(5'-CGGGATCCTTCTCCCTCTAACACTCT-3'SEQ ID NO:47)進(jìn)行PCR。驗(yàn)證DNA序列含有完整的V_K和人C_K區(qū)域。在用合適的限制酶消化后，將κDNA片段插入表達(dá)載體盒pSV2neo-TUS的HindIII和BamHI限制位點(diǎn)，得到pSV2neoK。Fd和κ基因的表達(dá)均由HCMV衍生的增強(qiáng)子和啟動(dòng)子元件驅(qū)動(dòng)。因?yàn)镕d基因不包括涉及到鏈間二硫鍵的半胱氨酸氨基酸殘基，所以該重組的嵌合Fab就含有非共價(jià)連接的重鏈和輕鏈。該嵌合Fab被命名為cFab。

為獲得帶有重鏈和輕鏈間二硫鍵的重組Fab，可以將上述Fd基因延長(zhǎng)以包括得自人IgG1鉸鏈區(qū)的額外9個(gè)氨基酸(EPKSCDKTH SEQ ID NO:48)的編碼序列。編碼Fd基因3’端的30個(gè)氨基酸的BstEII-BamHI DNA區(qū)段可被編碼延長(zhǎng)的Fd的DNA區(qū)段置換，產(chǎn)生pSV2dhfrFd/9aa。

3.嵌合的抗MASP-2IgG的表達(dá)和純化

為產(chǎn)生分泌嵌合的抗MASP-2IgG的細(xì)胞系，用經(jīng)純化的pSV2neoV_H-huC.γ1和pSV2neoV-huCκ的質(zhì)粒DNA通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)染NSO細(xì)胞。在0.7mg/ml G418存在下選出被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。將細(xì)胞在250ml轉(zhuǎn)瓶中用含血清的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

將100ml旋動(dòng)培養(yǎng)物的培養(yǎng)物上清液加到10ml PROSEP-A柱(Bioprocessing,Inc.，Princeton,N.J.)上。柱用10個(gè)柱床體積的PBS洗滌。結(jié)合的抗體用50mM檸檬酸緩沖液(pH3.0)洗脫。將等體積的1M Hepes(pH 8.0)加到含有純化抗體的餾分中，調(diào)節(jié)pH到7.0。通過(guò)Millipore膜超濾(截留分子量：3,000)，用PBS進(jìn)行緩沖液交換來(lái)去除殘留的鹽。通過(guò)BCA方法(Pierce)測(cè)得經(jīng)純化抗體的蛋白質(zhì)濃度。

4.嵌合的抗MASP-2Fab的表達(dá)和純化

為產(chǎn)生分泌嵌合的抗MASP-2Fab的細(xì)胞系，用經(jīng)純化的pSV2dhfrFd(或pSV2dhfrFd/9aa)和pSV2neoκ的質(zhì)粒DNA通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞。在G418和甲氨蝶呤存在下選出被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。在濃度遞增的甲氨蝶呤中對(duì)所選細(xì)胞系進(jìn)行擴(kuò)增。經(jīng)有限稀釋對(duì)細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞亞克隆。然后將高產(chǎn)單細(xì)胞亞克隆細(xì)胞系在100ml轉(zhuǎn)瓶中用無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

采用抗MASP-2MoAb的小鼠抗獨(dú)特型MoAb，通過(guò)親和層析法對(duì)嵌合的抗MASP-2Fab進(jìn)行純化。可用與匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)綴合的鼠抗MASP-2MoAb給小鼠免疫，篩選出能夠與人MASP-2競(jìng)爭(zhēng)的特異性MoAb結(jié)合，從而來(lái)制備抗獨(dú)特型MASP-2MoAb。至于純化，將來(lái)自產(chǎn)生cFab或cFab/9aa的旋動(dòng)培養(yǎng)的CHO細(xì)胞的100ml上清液加到與抗獨(dú)特型MASP-2MoAb偶聯(lián)的親和柱上。然后該柱用PBS充分洗滌后，結(jié)合的Fab用50mM二乙胺(pH 11.5)洗脫出來(lái)。按照上述方法通過(guò)緩沖液交換除去殘留的鹽。通過(guò)BCA方法(Pierce)測(cè)定經(jīng)純化的Fab的蛋白質(zhì)濃度。

可應(yīng)用實(shí)施例2中所述的抑制測(cè)定法來(lái)測(cè)定嵌合MASP-2IgG、cFab和cFAb/9aa抑制MASP-2依賴(lài)性補(bǔ)體途徑的能力。

實(shí)施例11

本實(shí)施例描述了用作功能性篩選的體外C4裂解測(cè)定法，從而鑒定能夠阻斷經(jīng)由L-纖維膠凝蛋白/P35、H-纖維膠凝蛋白、M-纖維膠凝蛋白或甘露聚糖的MASP-2依賴(lài)性補(bǔ)體活化的MASP-2抑制劑。

C4裂解測(cè)定法：Petersen,S.V.等人描述了C4裂解測(cè)定法(Petersen,S.V.等,J.Immunol.Methods 257:107，200)，測(cè)定了由結(jié)合L-纖維膠凝蛋白的金黃色葡萄球菌的脂磷壁酸(LTA)導(dǎo)致的凝集素途徑活化。

試劑：福爾馬林固定的金黃色葡萄球菌(DSM20233)如下制備：將細(xì)菌在胰胨豆胨血液培養(yǎng)基(tryptic soy blood medium)中于37℃培養(yǎng)過(guò)夜，用PBS洗滌三次，然后在室溫下于PBS/0.5％福爾馬林中固定1小時(shí)，再用PBS洗滌三次后，重懸浮于包被緩沖液(15mM Na₂CO₃、35mM NaHCO₃，pH 9.6)中。

測(cè)定法：Nunc MaxiSorb微量滴定板(Nalgene Nunc International,Rochester,NY)的各孔用以下的成分包被：100μl福爾馬林固定的金黃色葡萄球菌DSM20233(OD₅₅₀＝0.5)的包被緩沖液與1μg L-纖維膠凝蛋白的包被緩沖液。溫育過(guò)夜之后，各孔用0.1％人血清白蛋白(HSA)的TBS溶液(10mM Tris-HCl，140mM NaCl，pH 7.4)封閉，然后用含有0.05％吐溫20和5mM CaCl₂的TBS溶液(洗滌緩沖液)洗滌。將人血清樣品稀釋于20mM Tris-HCl、1M NaCl、10mM CaCl₂、0.05％Triton X-100、0.1％HSA(pH 7.4)中，這就防止了內(nèi)源C4的活化，并使C1復(fù)合物(由C1q、C1r和C1s組成)解離。將不同濃度的MASP-2抑制劑(包括抗MASP-2MoAb和抑制肽)加到血清樣品中。將稀釋的樣品加到板中，在4℃下溫育過(guò)夜。24小時(shí)后，各板用洗滌緩沖液充分洗滌，然后向每個(gè)孔中加入0.1μg溶于100μl 4mM巴比妥、145mM NaCl、2mM CaCl₂、1mM MgCl₂(pH 7.4)的經(jīng)純化的人C4(按照Dodds,A.W.，Methods Enzymol.223:46，1993所述方法獲得)。37℃1.5小時(shí)后，各板再次經(jīng)洗滌，使用堿性磷酸酶綴合的雞抗人C4c(獲自Immunsystem,Uppsala,Sweden)，檢測(cè)C4b沉積，并使用比色底物磷酸對(duì)硝基苯酯進(jìn)行測(cè)定。

關(guān)于甘露聚糖的C4測(cè)定：修改上述測(cè)定法以測(cè)定經(jīng)由MBL的凝集素途徑活化，在加入與各種MASP-2抑制劑混合的血清之前，用LSP和甘露聚糖包被測(cè)定板。

關(guān)于H-纖維膠凝蛋白(Hakata Ag)的C4測(cè)定：修改上述測(cè)定法以測(cè)定經(jīng)由H-纖維膠凝蛋白的凝集素途徑活化，在加入與各種MASP-2抑制劑混合的血清之前，用LSP和H-纖維膠凝蛋白包被測(cè)定板。

實(shí)施例12

下面的測(cè)定法證明了野生型和MASP-2-/-小鼠中存在經(jīng)典途徑活化。

方法：微量滴定板(Maxisorb，Nunc，目錄號(hào)442404，F(xiàn)isher Scientific)用0.1％人血清白蛋白與10mM Tris、140mM NaCl(pH 7.4)在室溫下包被1小時(shí)，然后用按1:1000稀釋于TBS/吐溫/Ca²⁺中的綿羊抗全血清的抗血清(Scottish Antibody Production Unit,Carluke,Scotland)在4℃下溫育過(guò)夜，從而原位產(chǎn)生免疫復(fù)合物。從野生型和MASP-2-/-小鼠中獲得血清樣品，加到包被板中。制備對(duì)照樣品，其中從野生型和MASP-2-/-血清樣品中耗盡C1q。按照供應(yīng)商的使用說(shuō)明書(shū)，使用包被了兔抗人C1q IgG(Dako,Glostrup,Denmark)的A蛋白偶聯(lián)的Dynabead(Dynal Biotech,Oslo,Norway)來(lái)制備C1q耗盡的小鼠血清。將各板在37℃下溫育90分鐘。用按1:1000稀釋于TBS/吐溫/Ca⁺⁺中的多克隆抗人C3c抗體(Dako A 062)來(lái)檢測(cè)結(jié)合的C3b。二次抗體是山羊抗兔IgG。

結(jié)果：圖9表示用IgG與野生型血清、MASP-2-/-血清、耗盡C1q的野生型和耗盡C1q的MASP-2-/-血清包被板上C3b的相對(duì)沉積水平。這些結(jié)果證明，經(jīng)典途徑在MASP-2-/-小鼠品系中完整無(wú)缺。

實(shí)施例13

下面的測(cè)定法用來(lái)通過(guò)在經(jīng)典途徑被免疫復(fù)合物啟動(dòng)的情況下分析MASP-2抑制劑的作用，從而檢測(cè)MASP-2抑制劑是否阻斷了經(jīng)典途徑。

方法：為了檢測(cè)MASP-2抑制劑對(duì)其中經(jīng)典途徑被免疫復(fù)合物啟動(dòng)的補(bǔ)體活化情況的影響，在37℃下，將含有90％NHS的50μl樣品一式三份在10μg/ml免疫復(fù)合物(IC)或PBS存在下溫育，在37℃溫育的還有含有200nM抗備解素單克隆抗體的平行樣品(+/-IC)一式三份。37℃溫育兩小時(shí)后，將13mM EDTA加到所有樣品中終止進(jìn)一步的補(bǔ)體活化，立即將樣品冷卻到5℃。在按照生產(chǎn)商使用說(shuō)明書(shū)，使用ELISA試劑盒(Quidel,目錄號(hào)A015和A009)進(jìn)行補(bǔ)體活化產(chǎn)物(C3a和sC5b-9)分析之前，將樣品保存于-70℃。

實(shí)施例14

本實(shí)施例證實(shí)，凝集素依賴(lài)性MASP-2補(bǔ)體活化系統(tǒng)在腹主動(dòng)脈瘤修復(fù)術(shù)后的缺血/再灌注階段中被激活。

實(shí)驗(yàn)基本原理和設(shè)計(jì)：進(jìn)行腹主動(dòng)脈瘤(AAA)修復(fù)的患者受到缺血/再灌注損傷，這主要是由補(bǔ)體活化介導(dǎo)的。我們研究了MASP-2依賴(lài)性凝集素途徑的補(bǔ)體活化在患者進(jìn)行AAA修復(fù)的缺血/再灌注損傷中的作用。血清中的甘露聚糖結(jié)合凝集素(MBL)的消耗被用來(lái)測(cè)定再灌注期間發(fā)生的MASP-2依賴(lài)性凝集素途徑活化的量。

患者血清樣品的分離：在本研究中共包括23名進(jìn)行選擇性腎下AAA修復(fù)的患者和8名進(jìn)行腹部大手術(shù)的對(duì)照患者。

對(duì)于正進(jìn)行AAA修復(fù)的患者，在手術(shù)期間四個(gè)規(guī)定的時(shí)間點(diǎn)從每名患者的橈動(dòng)脈(經(jīng)動(dòng)脈管路)抽取身體血樣：時(shí)間點(diǎn)1：麻醉誘導(dǎo)；時(shí)間點(diǎn)2：剛好在主動(dòng)脈被鉗住之前；時(shí)間點(diǎn)3：剛好在取出主動(dòng)脈鉗前；時(shí)間點(diǎn)4：再灌注期間。

對(duì)于進(jìn)行腹部大手術(shù)的對(duì)照患者，在麻醉誘導(dǎo)時(shí)以及手術(shù)開(kāi)始之后兩小時(shí)取身體血樣。

MBL水平的測(cè)定：應(yīng)用ELISA技術(shù)，測(cè)定每名患者血漿樣品的甘露聚糖結(jié)合凝集素(MBL)水平。

結(jié)果：該項(xiàng)研究的結(jié)果見(jiàn)圖10，該圖是表示MBL水平(y軸)在各個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)(x軸)的平均百分比變化的曲線圖。MBL的起始值為100％，此后相應(yīng)地下降。如圖10所示，AAA患者(n＝23)顯示血漿MBL水平顯著降低，在AAA之后的缺血/再灌注時(shí)，平均降低了大約41％。相反，在進(jìn)行腹部大手術(shù)的對(duì)照患者(n＝8)的血漿樣品中只觀察到較小的MBL消耗。

給出數(shù)據(jù)呈現(xiàn)的明確跡象表明，補(bǔ)體系統(tǒng)的MASP-2依賴(lài)性凝集素途徑在AAA修復(fù)之后的缺血/再灌注階段被激活。MBL水平的降低似乎與缺血/再灌注損傷有關(guān)，因?yàn)樵谑中g(shù)結(jié)束之后被鉗住的大血管再灌注時(shí)，MBL水平快速顯著地下降。相反，進(jìn)行腹部大手術(shù)而無(wú)重大缺血/再灌注損傷的患者的對(duì)照血清只顯示MBL血漿水平略微下降。鑒于補(bǔ)體活化在再灌注損傷中所起的明確作用，我們得出的結(jié)論是，缺血內(nèi)皮細(xì)胞中MASP-2依賴(lài)性凝集素途徑的活化是缺血/再灌注損傷病理的主要因素。因此，可預(yù)期特異性瞬時(shí)阻斷或降低MASP-2依賴(lài)性凝集素途徑的補(bǔ)體活化對(duì)改善臨床手術(shù)和疾病的結(jié)果具有顯著有益的治療作用，所述臨床手術(shù)和疾病包括一過(guò)性缺血損傷，例如心肌梗塞、腸梗塞、燒傷、移植和中風(fēng)。

實(shí)施例15

本實(shí)施例描述了MASP-2-/-品系用作動(dòng)物模型以檢測(cè)可用于治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的MASP-2抑制劑。

背景與基本原理：鼠關(guān)節(jié)炎模型：K/BxN T細(xì)胞受體(TCR)轉(zhuǎn)基因(tg)小鼠是最近開(kāi)發(fā)出來(lái)的炎性關(guān)節(jié)炎模型(Kouskoff,V.等，Cell87:811-822，1996；Korganow，A.S.等，Immunity 10:451-461，1999；Matsumoto,I.等，Science 286:1732-1735，1999；Maccioni M.等，J.Exp.Med.195(8):1071-1077，2002)。K/BxN小鼠自發(fā)產(chǎn)生自身免疫性疾病，具有人RA的大多數(shù)臨床、組織學(xué)和免疫學(xué)特征(Ji,H.等，Immunity 16:157-168，2002)。該鼠病是關(guān)節(jié)特異性的，但是被T細(xì)胞然后被B細(xì)胞對(duì)泛表達(dá)抗原葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶("GPI")的自反應(yīng)性啟動(dòng)然后保持。此外，將關(guān)節(jié)炎K/BxN小鼠的血清(或者經(jīng)純化的抗GPI Ig)轉(zhuǎn)移到健康動(dòng)物中，在幾天之內(nèi)就引起關(guān)節(jié)炎。研究還表明，當(dāng)多克隆抗GPI抗體或IgG1同種型的抗GPI單克隆抗體的混合物注射到健康受體中時(shí)誘發(fā)了關(guān)節(jié)炎(Maccioni等，2002)。該鼠模型與人RA有關(guān)，因?yàn)檠芯窟€發(fā)現(xiàn)RA患者的血清含有抗GPI抗體，而這在正常個(gè)體中并不存在。在這個(gè)系統(tǒng)中對(duì)C5缺陷型小鼠進(jìn)行了測(cè)試，發(fā)現(xiàn)它阻斷了關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)生(Ji,H.等，2002，同上)。在C3失效小鼠(C3null mice)中也存在對(duì)關(guān)節(jié)炎的強(qiáng)烈抑制，這就意味著替代途徑，然而MBP-A失效小鼠的確發(fā)展成關(guān)節(jié)炎。然而在小鼠中，MBP-C的存在可能彌補(bǔ)了MBP-A的損失。

根據(jù)本文所述觀察結(jié)果，MASP-2在凝集素途徑和替代途徑兩者的啟動(dòng)中起著必不可少的作用，K/BxN關(guān)節(jié)炎模型用來(lái)篩選用作治療RA的治療藥物的MASP-2抑制劑。

方法：在60日齡時(shí)，從關(guān)節(jié)炎K/BxN小鼠中獲得血清，合并，并給MASP-2-/-小鼠(按照實(shí)施例1所述方法獲得)注射(150-200μl，腹膜內(nèi))；并在第0天和第2天給用或不用MASP-2抑制劑(本文所述MoAb、抑制肽等等)的同窩對(duì)照注射。一組正常小鼠在接受血清注射之前還用MASP-2抑制劑預(yù)處理兩天。另一組小鼠在第0天接受血清注射，接著在第6天接受MASP-2抑制劑注射。評(píng)價(jià)隨時(shí)間變化的臨床指數(shù)，將每只染病爪評(píng)為1分，將只有輕微腫脹的爪評(píng)為1/2分。還通過(guò)測(cè)徑器測(cè)定踝厚度(厚度定義為與第0天測(cè)定值之差)。

實(shí)施例16

本實(shí)施例描述了在人血漿灌注的兔心臟離體模型中抑制補(bǔ)體介導(dǎo)的組織損傷實(shí)驗(yàn)。

背景與基本原理：補(bǔ)體系統(tǒng)的活化是異種移植物超急性排斥的原因。以前的研究表明，超急性排斥可能在抗供體抗體不存在時(shí)通過(guò)替代途徑的活化而發(fā)生(Johnston,P.S.等，Transplant Proc.23:877-879，1991)。

方法：為測(cè)定分離的抗MASP-2抑制劑(例如按實(shí)施例7所述方法制備的抗MASP-2抗體)是否能夠抑制組織損傷中的補(bǔ)體途徑，可以使用離體模型來(lái)測(cè)試抗MASP-2MoAb和抗體片段，該模型中單獨(dú)摘出的兔心臟用稀釋的人血漿灌注。這個(gè)模型以前顯示出由于替代補(bǔ)體途徑活化而對(duì)兔心肌造成損傷(Gralinski,M.R.等，Immunopharmacology 34:79-88，1996)。

實(shí)施例17

本實(shí)施例描述了測(cè)定嗜中性粒細(xì)胞活化的實(shí)驗(yàn)方法，該方法用來(lái)測(cè)定根據(jù)本發(fā)明方法來(lái)治療凝集素依賴(lài)性途徑相關(guān)疾病的MASP-2抑制劑的有效劑量。

方法：用于嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶的測(cè)定方法描述于Gupta-Bansal,R.等，MolecularImmunol.37:191-201，2000。簡(jiǎn)單來(lái)講，用雙位點(diǎn)夾心測(cè)定法(two-site sandwich assay)測(cè)定彈性蛋白酶與血清α₁-抗胰蛋白酶的復(fù)合物，該法利用抗彈性蛋白酶和α₁-抗胰蛋白酶的抗體。用抗人彈性蛋白酶抗體(The Binding Site,Birmingham,UK)在PBS中的1:500稀釋液在4℃下過(guò)夜來(lái)包被聚苯乙烯微量滴定板。在吸出抗體溶液后，各孔用含有0.4％HSA的PBS室溫封閉2小時(shí)。將使用或未用MASP-2抑制劑處理的等分(100μl)的血漿樣品加到各孔中。在室溫下溫育2小時(shí)之后，各孔用PBS充分漂洗。通過(guò)加入1:500稀釋的封閉溶液中的過(guò)氧化物酶綴合的α₁抗胰蛋白酶抗體，使之在室溫下溫育1小時(shí)，來(lái)檢測(cè)結(jié)合的彈性蛋白酶－α₁抗胰蛋白酶復(fù)合物。板用PBS洗滌后，加入100μl等分的TMB底物試樣。通過(guò)加入100μl磷酸，猝滅TMB反應(yīng)物，將板在微量板讀板儀中于450nm下讀數(shù)。

實(shí)施例18

本實(shí)施例描述了用來(lái)測(cè)定用于治療心肌缺血/再灌注的MASP-2抑制劑的動(dòng)物模型。

方法：心肌缺血/再灌注模型記載于Vakeva等，Circulation 97:2259-2267，1998和Jordan等，Circulation 104(12):1413-1418，2001?？蓪?duì)所述模型加以如下改進(jìn)用于MASP-2-/-和MASP-2+/+小鼠中。簡(jiǎn)單來(lái)講，將成年雄性小鼠麻醉。將導(dǎo)管插入頸靜脈和氣管中，調(diào)節(jié)嚙齒動(dòng)物呼吸機(jī)，保持100％氧氣通氣量，使呼出的CO₂保持在3.5％和5％之間。進(jìn)行左胸廓切開(kāi)術(shù)，在左冠狀動(dòng)脈起點(diǎn)的3-4mm處進(jìn)行縫合。缺血前5分鐘，給予動(dòng)物MASP-2抑制劑，例如抗MASP-2抗體(例如劑量范圍為0.01-10mg/kg)。然后拉緊冠狀動(dòng)脈附近的縫合線，使之開(kāi)始缺血，保持30分鐘，接著進(jìn)行4小時(shí)再灌注。同法制備假手術(shù)動(dòng)物，但不拉緊縫合線。

補(bǔ)體C3沉積的分析：再灌注之后，從左心室中心區(qū)獲取免疫組織化學(xué)樣品，固定，在-80℃下冷凍備用。將組織切片與HRP綴合的山羊抗大鼠C3抗體一起溫育。在抗MASP-2抑制劑存在下，對(duì)組織切片存在的C3染色進(jìn)行分析，與假手術(shù)的對(duì)照動(dòng)物和MASP-2-/-動(dòng)物相比較，鑒定出減少體內(nèi)C3沉積的MASP-2抑制劑。

實(shí)施例19

本實(shí)施例描述了MASP-2-/-品系用作動(dòng)物模型以測(cè)定MASP-2抑制劑保護(hù)移植組織不受缺血/再灌注損傷的能力。

背景/基本原理：已知缺血/再灌注損傷發(fā)生在移植期間的供體器官中。組織損傷的程度與缺血時(shí)間長(zhǎng)短有關(guān)，是由補(bǔ)體介導(dǎo)的，正如在缺血和通過(guò)使用補(bǔ)體抑制劑(例如可溶性受體1型(CR1))的各種模型中所證實(shí)的一樣(Weisman等，Science 249:146-151，1990；Mulligan等，J.Immunol.148:1479-1486，1992；Pratt等，Am.J.Path.163(4):1457-1465，2003)。用于移植的動(dòng)物模型記載于Pratt等，Am.J.Path.163(4):1457-1465，可加以改進(jìn)用于MASP-2-/-小鼠模型和/或用作MASP-2+/+模型系統(tǒng)，其中對(duì)MASP-2抑制劑保護(hù)移植組織不受缺血/再灌注損傷的能力進(jìn)行篩選。在移植之前用灌注液沖洗供體腎，這為將抗MASP-2抑制劑引入供體腎中提供了機(jī)會(huì)。

方法：將MASP-2-/-和/或MASP-2+/+小鼠麻醉。剖開(kāi)供體左腎，將主動(dòng)脈在腎動(dòng)脈的向頭側(cè)和向尾側(cè)結(jié)扎。將portex管狀導(dǎo)管(Portex Ltd,Hythe,UK)插在結(jié)扎部位之間，用含有MASP-2抑制劑(例如抗MASP-2單克隆抗體)(劑量范圍為0.01-10mg/kg)的5ml Soltran腎灌注液(Baxter Health Care,UK)灌注腎臟至少5分鐘的時(shí)間。然后進(jìn)行腎移植，監(jiān)測(cè)小鼠隨時(shí)間變化的情況。

移植受體分析：按不同時(shí)間間隔收獲腎移植物，采用抗C3對(duì)組織切片進(jìn)行分析以確定C3沉積的程度。

實(shí)施例20

本實(shí)施例描述了膠原誘發(fā)的關(guān)節(jié)炎(CIA)動(dòng)物模型的用途，該模型用于測(cè)定用來(lái)治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的MASP-2抑制劑。

背景與基本原理：膠原誘發(fā)的關(guān)節(jié)炎(CIA)代表用天然II型膠原免疫之后，在嚙齒動(dòng)物和靈長(zhǎng)類(lèi)易感品系中可誘發(fā)的自身免疫性多關(guān)節(jié)炎，被認(rèn)為是人類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的相關(guān)模型(參見(jiàn)Courtney等，Nature 283:666(1980)；Trenthan等，J.Exp.Med.146:857(1977))。RA和CIA的特征都是關(guān)節(jié)發(fā)炎、血管翳形成以及軟骨和骨侵蝕。CIA易感鼠品系DBA/1LacJ是已開(kāi)發(fā)出來(lái)的CIA模型，其中小鼠在用牛II型膠原免疫后，產(chǎn)生了臨床上的嚴(yán)重關(guān)節(jié)炎(Wang等，J.Immunol.164:4340-4347(2000))。將C5缺陷型小鼠品系與DBA/1LacJ雜交，發(fā)現(xiàn)所得品系對(duì)CIA關(guān)節(jié)炎的發(fā)生具有抗性(Wang等，2000，同上)。

根據(jù)本文所述觀察結(jié)果，MASP-2在凝集素途徑和替代途徑的啟動(dòng)中都起著必不可少的作用，CIA關(guān)節(jié)炎模型可用來(lái)篩選對(duì)用作治療RA的治療藥物是有效的MASP-2抑制劑。

方法：按照實(shí)施例1所述方法產(chǎn)生MASP-2-/-小鼠。然后將MASP-2-/-小鼠與得自DBA/1LacJ品系(The Jackson Laboratory)的小鼠雜交。將F1與其后代互交以產(chǎn)生DBA/lLacJ系中的純合MASP-2-/-。

膠原免疫按上述方法(Wang等，2000)進(jìn)行。簡(jiǎn)單來(lái)講，用溶于0.01M乙酸(濃度為4mg/ml)的牛II型膠原(BCII)或小鼠II型膠原(MCII)(獲自Elastin Products,Owensville,MO)免疫野生型DBA/1LacJ小鼠和MASP-2-/-DBA/1LacJ小鼠。將200μg CII和100μg分枝桿菌注射到每只小鼠尾基端部真皮內(nèi)。在21天后再次免疫小鼠，每天檢查關(guān)節(jié)炎的外觀。評(píng)價(jià)每只染病爪有關(guān)關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度隨時(shí)間變化的關(guān)節(jié)炎指數(shù)。

在膠原免疫時(shí)，全身性或者在一個(gè)或多個(gè)關(guān)節(jié)處局部注射MASP-2抑制劑(例如抗MASP-2單克隆抗體)(劑量范圍為0.01mg/kg-10mg/kg)，從而在野生型DBA/1LacJ CIA小鼠中對(duì)MASP-2抑制劑進(jìn)行篩選，并按照上述方法評(píng)價(jià)隨時(shí)間變化的關(guān)節(jié)炎指數(shù)?？扇菀椎卦贛ASP-2-/-、hMASP-+/+敲入DBA/1LacJ CIA小鼠模型中對(duì)抗hMASP-2單克隆抗體作為治療藥物作出評(píng)價(jià)。

實(shí)施例21

本實(shí)施例描述了(NZB/W)F₁動(dòng)物模型的用途，該模型用于測(cè)定用來(lái)治療免疫復(fù)合物介導(dǎo)的腎小球性腎炎的MASP-2抑制劑。

背景與基本原理：新西蘭黑×新西蘭白(NZB/W)的F1小鼠自發(fā)地出現(xiàn)自身免疫綜合征，與人免疫復(fù)合物介導(dǎo)的腎小球性腎炎有顯著的相似性。NZB/W F1小鼠總是在12月齡左右時(shí)死于腎小球性腎炎。如前所述，已經(jīng)證實(shí)補(bǔ)體活化在免疫復(fù)合物介導(dǎo)的腎小球性腎炎的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。研究進(jìn)一步證實(shí)，在NZB/W F1小鼠模型中給予抗C5MoAb導(dǎo)致腎小球性腎炎病程顯著改善(Wang等，Proc.Natl.Acad.Sci.93:8563-8568(1996))。根據(jù)本文所述觀察結(jié)果，MASP-2在凝集素途徑和替代途徑的啟動(dòng)中都起著必不可少的作用，NZB/W F₁動(dòng)物模型可用來(lái)篩選對(duì)用作治療腎小球性腎炎的治療藥物是有效的MASP-2抑制劑。

方法：按照實(shí)施例1所述方法產(chǎn)生MASP-2-/-小鼠。然后將MASP-2-/-小鼠分別與得自NZB和NZW品系(The Jackson Laboratory)的小鼠雜交。將F1與其后代互交以在NZB和NZW遺傳背景下產(chǎn)生純合的MASP-2-/-。為了確定MASP-2在該模型腎小球性腎炎發(fā)病機(jī)制中的作用，對(duì)野生型NZB×NZW小鼠或MASP-2-/-NZB×MASP-2-/-NZW小鼠雜交所產(chǎn)生的F1個(gè)體中該病的發(fā)生進(jìn)行了比較?？擅扛粢恢軓腗ASP-2+/+和MASP-2-/-F1小鼠中收集尿樣，監(jiān)測(cè)尿蛋白水平中抗DNA抗體的存在(描述于Wang等，1996，同上)。還進(jìn)行了腎臟組織病理學(xué)分析以監(jiān)測(cè)腎小球系膜基質(zhì)沉積的量和腎小球性腎炎的發(fā)生。

NZB/W F1動(dòng)物模型還用于篩選對(duì)于用作治療腎小球性腎炎的治療藥物是有效的MASP-2抑制劑。在18周齡時(shí)，用抗MASP-2抑制劑(例如抗MASP-2單克隆抗體)(劑量范圍為0.01mg/kg-10mg/kg)按每周一次或兩周一次的頻率腹膜內(nèi)注射到野生型NZB/W F1。使用上述腎小球性腎炎的組織病理學(xué)和生物化學(xué)標(biāo)志來(lái)評(píng)價(jià)小鼠中疾病的發(fā)生并鑒定對(duì)治療該病是有用的MASP-2抑制劑。

實(shí)施例22

本實(shí)施例描述了管狀環(huán)路(tubing loop)作為測(cè)定MASP-2抑制劑模型的用途，所述抑制劑可用于預(yù)防體外循環(huán)(ECC)(例如心肺分流術(shù)(CPB)環(huán)路)所產(chǎn)生的組織損傷。

背景與基本原理：如上所述，在CPB期間經(jīng)歷ECC的患者遭受全身性炎癥反應(yīng)，這部分是由血液暴露在體外環(huán)路的人工表面所引起的，但也是由不依賴(lài)于表面的因素引起的，象外傷和缺血/再灌注損傷(Butle,J.等，Ann.Thorac.Surg.55:552-9，1993；Edmunds,L.H.，Ann.Thorac.Surg.66(增刊):S12-6，1998；Asimakopoulos,G.，Perfusion 14:269-77，1999)。研究進(jìn)一步證實(shí)，替代補(bǔ)體途徑在CPB環(huán)路的補(bǔ)體活化中起著主要作用，CPB環(huán)路引起血液與CPB環(huán)路的人工表面發(fā)生相互作用(參見(jiàn)Kirklin等，1983，1986，討論同上)。因此，根據(jù)本文所述觀察結(jié)果，MASP-2在凝集素和替代途徑的啟動(dòng)中都起著必不可少的作用，管狀環(huán)路模型可用來(lái)篩選對(duì)于用作預(yù)防或治療體外暴露所引起的炎癥反應(yīng)的治療藥物是有效的MASP-2抑制劑。

方法：利用上述用于心肺分流術(shù)環(huán)路(參見(jiàn)Gong等，J.Clinical Immunol.16(4):222-229(1996))的經(jīng)修改的管狀環(huán)路模型，描述于Gupta-Bansal等，MolecularImmunol.37:191-201(2000)。簡(jiǎn)單來(lái)講，從健康受試者中收集新鮮血液到7ml真空管(vacutainer tube)(每ml全血含有7單位肝素)中。向類(lèi)似于CPB手術(shù)期間所使用(例如內(nèi)徑2.92mm；外徑3.73mm,長(zhǎng)度：45cm)的聚乙烯管中加入1ml血液，用短硅管片封閉成環(huán)。在研究中包括將裝有肝素化血液與10mM EDTA的對(duì)照管作為背景對(duì)照。將樣品和對(duì)照管在水浴中于37℃下垂直旋轉(zhuǎn)1小時(shí)。溫育之后，將血液樣品轉(zhuǎn)移到裝有EDTA的1.7ml微量離心管中，使EDTA終濃度為20mM。將樣品離心，收集血漿。臨旋轉(zhuǎn)前，將MASP-2抑制劑(例如抗MASP-2抗體)加到肝素化血液中。然后對(duì)血漿樣品進(jìn)行分析以測(cè)定C3a和可溶性C5b-9濃度，如Gupta-Bansal等，2000所述。

實(shí)施例23

本實(shí)施例描述了嚙齒動(dòng)物盲腸結(jié)扎和穿刺(CLP)模型系統(tǒng)的用途，該模型用于測(cè)定用來(lái)治療膿毒癥或由膿毒癥引起的疾病的MASP-2抑制劑，所述疾病包括嚴(yán)重膿毒癥、敗血癥性休克、膿毒癥引起的急性呼吸窘迫綜合征和全身性炎癥反應(yīng)綜合征。

背景與基本原理：如上所述，許多研究已經(jīng)證實(shí)補(bǔ)體活化在膿毒癥發(fā)病機(jī)制中具有重要作用(參見(jiàn)Bone,R.C.，Annals.Internal.Med.115:457-469，1991)。CLP嚙齒動(dòng)物模型是模擬人體中膿毒癥臨床病程的公認(rèn)模型，被認(rèn)為是用于人體膿毒癥合理的替代模型(參見(jiàn)Ward,P.，Nature Review Immunology第4卷:133-142(2004))。最近的研究表明，用抗C5a抗體治療CLP動(dòng)物導(dǎo)致菌血癥減少，存活率大為改善(Huber-Lang等，J.of Immunol.169:3223-3231(2002))。因此，根據(jù)本文所述觀察結(jié)果，MASP-2在凝集素和替代途徑的啟動(dòng)中都起著必不可少的作用，CLP嚙齒動(dòng)物模型用于篩選對(duì)于用作預(yù)防或治療膿毒癥或由膿毒癥引起的疾病的治療藥物是有效的MASP-2抑制劑。

方法：對(duì)上述CLP模型(Huber-Lang等，2004，同上)進(jìn)行如下修改。將MASP-2-/-和MASP-2+/+動(dòng)物麻醉。沿腹中線切開(kāi)2cm，將盲腸在回盲瓣的下面牢牢地扎住，避免腸梗阻。然后用21號(hào)針?lè)磸?fù)刺穿盲腸。用絲線和皮膚鉗將腹部切口一層層縫合(Ethicon,Summerville,NJ)。緊隨CLP后，給動(dòng)物注射MASP-2抑制劑(例如抗MASP-2單克隆抗體)(劑量范圍0.01mg/kg-10mg/kg)。在MASP-2-/-、hMASP-+/+敲入CLP小鼠模型中，可容易地對(duì)抗hMASP-2單克隆抗體作為治療藥物作出評(píng)價(jià)。然后使用上述測(cè)定法(Huber-Lang等，2004，同上)，對(duì)小鼠血漿中得自補(bǔ)體的過(guò)敏毒素和呼吸爆發(fā)的水平進(jìn)行分析。

實(shí)施例24

本實(shí)施例描述了阻斷MASP-2活性的高親和性抗MASP-2Fab2抗體片段的鑒定。

背景與基本原理：MASP-2是具有許多獨(dú)立功能結(jié)構(gòu)域的復(fù)雜蛋白質(zhì)，包括：MBL和纖維膠凝蛋白的結(jié)合部位、絲氨酸蛋白酶催化部位、蛋白水解底物C2的結(jié)合部位、蛋白水解底物C4的結(jié)合部位、MASP-2酶原自身活化的MASP-2裂解部位和兩個(gè)Ca⁺⁺結(jié)合部位。鑒定出與高親和性MASP-2結(jié)合的Fab2抗體片段，在功能測(cè)定法中測(cè)定所鑒定出的Fab2片段，以確定它們是否能夠阻斷MASP-2功能活性。

為了阻斷MASP-2功能活性，抗體或Fab2抗體片段必須結(jié)合并阻礙MASP-2功能活性所需要的MASP-2上的結(jié)構(gòu)表位。因此，許多或所有的高親和性結(jié)合抗MASP-2Fab2不能抑制MASP-2功能活性，除非它們能結(jié)合直接參與MASP-2功能活性的MASP-2的結(jié)構(gòu)表位。

測(cè)定抑制凝集素途徑C3轉(zhuǎn)化酶形成的功能測(cè)定法被用來(lái)評(píng)價(jià)抗MASP-2Fab2的“阻斷活性”。已知MASP-2在凝集素途徑中的主要生理作用是產(chǎn)生凝集素介導(dǎo)的補(bǔ)體途徑的下一個(gè)功能成分，即凝集素途徑C3轉(zhuǎn)化酶。凝集素途徑C3轉(zhuǎn)化酶是蛋白酶切割C3成為C3a和C3b的關(guān)鍵酶復(fù)合物(C4bC2a)。MASP-2不是凝集素途徑C3轉(zhuǎn)化酶(C4bC2a)的結(jié)構(gòu)成分；然而，需要MASP-2功能活性以產(chǎn)生組成凝集素途徑C3轉(zhuǎn)化酶的兩個(gè)蛋白質(zhì)成分(C4b、C2a)。此外，為了使MASP-2產(chǎn)生凝集素途徑C3轉(zhuǎn)化酶，似乎需要所有上述MASP-2的獨(dú)立功能活性。出于這些原因，認(rèn)為用于評(píng)價(jià)抗MASP-2Fab2的“阻斷活性”優(yōu)選的測(cè)定法是測(cè)定抑制凝集素途徑C3轉(zhuǎn)化酶形成的功能測(cè)定法。

高親和性Fab2的產(chǎn)生：應(yīng)用人可變輕鏈和重鏈抗體序列的噬菌體展示文庫(kù)以及用于鑒定與所選出的目標(biāo)配體反應(yīng)的Fab2的自動(dòng)抗體篩選技術(shù)，來(lái)產(chǎn)生抗大鼠MASP-2蛋白(SEQ ID NO:55)的高親和性Fab2。利用已知量的大鼠MASP-2(～1mg，純度>85％)蛋白進(jìn)行抗體篩選。利用三輪擴(kuò)增以選出具有最高親和性的抗體。挑選約250個(gè)不同的表達(dá)抗體片段的目標(biāo)(hits)用于ELISA篩選。隨后對(duì)高親和性目標(biāo)進(jìn)行測(cè)序以確定不同抗體的獨(dú)特性。

將50個(gè)獨(dú)特的抗MASP-2抗體純化，將250μg各經(jīng)純化的Fab2抗體用于表征MASP-2結(jié)合親和性和補(bǔ)體途徑功能測(cè)定，詳述如下。

用于評(píng)價(jià)抗MASP-2Fab2抑制(阻斷)活性的測(cè)定法

1.測(cè)定抑制凝集素途徑C3轉(zhuǎn)化酶形成的測(cè)定法：

背景：凝集素途徑C3轉(zhuǎn)化酶是蛋白酶切割C3成為兩個(gè)有效促炎片段過(guò)敏毒素C3a和調(diào)理素C3b的酶復(fù)合物(C4bC2a)。C3轉(zhuǎn)化酶的形成似乎是在介導(dǎo)炎癥方面的凝集素途徑中的關(guān)鍵步驟。MASP-2不是凝集素途徑C3轉(zhuǎn)化酶(C4bC2a)的結(jié)構(gòu)成分；因此，抗MASP-2抗體(或Fab2)不會(huì)直接抑制之前已存在的C3轉(zhuǎn)化酶的活性。然而，為了產(chǎn)生組成凝集素途徑C3轉(zhuǎn)化酶的兩個(gè)蛋白質(zhì)成分(C4b、C2a)，MASP-2絲氨酸蛋白酶活性是必需的。因此，抑制MASP-2功能活性的抗MASP-2Fab2(即阻斷性抗MASP-2Fab2)會(huì)抑制凝集素途徑C3轉(zhuǎn)化酶從頭形成。C3含有獨(dú)特的高反應(yīng)性硫酯基團(tuán)作為其結(jié)構(gòu)部分。在該測(cè)定法中當(dāng)C3轉(zhuǎn)化酶切割C3時(shí)，C3b上的硫酯基團(tuán)可與通過(guò)酯鍵或酰胺鍵固定在塑料孔底部的大分子上的羥基或氨基形成共價(jià)鍵，從而有利于在ELISA測(cè)定法中檢測(cè)出C3b。

酵母甘露聚糖是凝集素途徑的已知激活劑。在測(cè)定C3轉(zhuǎn)化酶形成的下列方法中，將用甘露聚糖包被的塑料孔與稀釋的大鼠血清在37℃下溫育30分鐘以激活凝集素途徑。然后洗滌各孔，并采用標(biāo)準(zhǔn)ELISA方法測(cè)定固定在孔中的C3b。在該測(cè)定法中所產(chǎn)生的C3b的量直接反映了從頭形成的凝集素途徑C3轉(zhuǎn)化酶。在該測(cè)定法中測(cè)定選定濃度的抗MASP-2Fab2抑制C3轉(zhuǎn)化酶形成和隨后C3b產(chǎn)生的能力。

方法：將96孔Costar培養(yǎng)基結(jié)合板與稀釋于50mM碳酸鹽緩沖液(pH 9.5)的甘露聚糖以1μg/50μl/孔在5℃下溫育過(guò)夜。過(guò)夜溫育后，各孔用200μl PBS洗滌三次。然后各孔用100μl/孔的1％牛血清白蛋白的PBS溶液封閉，在室溫下輕輕攪動(dòng)溫育1小時(shí)。然后各孔用200μl PBS洗滌三次。在5℃下，將抗MASP-2Fab2樣品稀釋于含Ca⁺⁺和Mg⁺⁺的GVB緩沖液(4.0mM巴比妥，141mM NaCl，1.0mM MgCl₂，2.0mM CaCl₂，0.1％明膠，pH 7.4)至選定濃度。在5℃下，將0.5％大鼠血清加到上述樣品中，將100μl轉(zhuǎn)移到各孔。將板蓋上，在37℃水浴中溫育30分鐘以便補(bǔ)體活化。將板從37℃水浴轉(zhuǎn)移裝有冰－水混合物的容器中進(jìn)行終止反應(yīng)。各孔依次用200μl PBS-吐溫20(0.05％吐溫20的PBS溶液)洗滌5次，用200μl PBS洗滌2次。加入100μl/孔按1:10,000稀釋的初次抗體(兔抗人C3c，DAKO A0062)，該抗體溶于含有2.0mg/ml牛血清白蛋白的PBS中，在室溫下輕輕攪動(dòng)溫育1小時(shí)。各孔用200μl PBS洗滌5次。加入100μl/孔按1:10,000稀釋的二次抗體(過(guò)氧化物酶綴合的山羊抗兔IgG，American Qualex A102PU)，該抗體溶于含有2.0mg/ml牛血清白蛋白的PBS中，室溫下在振蕩器中輕輕攪動(dòng)溫育1小時(shí)。各孔用200μl PBS洗滌5次。加入100μl/孔過(guò)氧化物酶底物TMB(Kirkegaard&Perry Laboratories)，在室溫下溫育10分鐘。通過(guò)加入100μl/孔1.0M H₃PO₄終止過(guò)氧化物酶反應(yīng)，測(cè)得OD₄₅₀。

2.測(cè)定抑制MASP-2依賴(lài)性C4裂解的測(cè)定法

背景：MASP-2的絲氨酸蛋白酶活性是高度特異性的，僅鑒定出用于MASP-2的兩種蛋白質(zhì)底物：C2和C4。C4裂解產(chǎn)生C4a和C4b?？筂ASP-2Fab2可結(jié)合直接參與C4裂解的MASP-2的結(jié)構(gòu)表位(例如C4的MASP-2結(jié)合部位；MASP-2絲氨酸蛋白酶催化部位)，從而抑制MASP-2的C4裂解功能活性。

酵母甘露聚糖是凝集素途徑的已知激活劑。在測(cè)定MASP-2的C4裂解活性的下列方法中，將用甘露聚糖包被的塑料孔與稀釋的大鼠血清在37℃下溫育30分鐘以激活凝集素途徑。因?yàn)橛糜谠揈LISA測(cè)定法中的初次抗體僅識(shí)別人C4，所以稀釋的大鼠血清還補(bǔ)充了人C4(1.0μg/ml)。然后洗滌各孔，采用標(biāo)準(zhǔn)ELISA方法測(cè)定固定在孔中的人C4b。在該測(cè)定法中，所產(chǎn)生的C4b的量可衡量依賴(lài)MASP-2的C4裂解活性。在該測(cè)定法中，測(cè)定選定濃度的抗MASP-2Fab2抑制C4裂解的能力。

方法：將96孔Costar培養(yǎng)基結(jié)合板與稀釋于50mM碳酸鹽緩沖液(pH 9.5)的甘露聚糖按1μg/50μl/孔在5℃下溫育過(guò)夜。各孔用200μl PBS洗滌3次。然后各孔用100μl/孔1％牛血清白蛋白的PBS溶液封閉，在室溫下輕輕攪動(dòng)溫育1小時(shí)。各孔用200μl PBS洗滌3次。在5℃下，將抗MASP-2Fab2樣品稀釋于含Ca⁺⁺和Mg⁺⁺的GVB緩沖液(4.0mM巴比妥，141mM NaCl，1.0mM MgCl₂，2.0mM CaCl₂，0.1％明膠，pH 7.4)至選定濃度。1.0μg/ml人C4(Quidel)也包括在這些樣品中。在5℃下，將0.5％大鼠血清加到上述樣品中，將100μl轉(zhuǎn)移到各孔。將板蓋上，在37℃水浴中溫育30分鐘以便補(bǔ)體活化。將板從37℃水浴轉(zhuǎn)移裝有冰－水混合物的容器中進(jìn)行終止反應(yīng)。各孔用200μl PBS-吐溫20(0.05％吐溫20的PBS溶液)洗滌5次，然后各孔用200μl PBS洗滌2次。加入100μl/孔以1:700稀釋的生物素綴合的雞抗人C4c(Immunsystem AB,Uppsala,Sweden)的PBS溶液(含有2.0mg/ml牛血清白蛋白(BSA))，在室溫下輕輕攪動(dòng)溫育1小時(shí)。各孔用200μl PBS洗滌5次。加入100μl/孔的0.1μg/ml過(guò)氧化物酶綴合的鏈霉抗生物素(Pierce Chemical#21126)的PBS溶液(含有2.0mg/ml BSA)，在室溫下在振蕩器中輕輕攪動(dòng)溫育1小時(shí)。各孔用200μl PBS洗滌5次。加入100μl/孔過(guò)氧化物酶底物TMB(Kirkegaard&Perry Laboratories)，在室溫下溫育16分鐘。通過(guò)加入100μl/孔1.0M H₃PO₄終止過(guò)氧化物酶反應(yīng)，測(cè)得OD₄₅₀。

3.抗“天然”大鼠MASP-2的抗大鼠MASP-2Fab2的結(jié)合測(cè)定法

背景：MASP-2通常作為還包括特異性凝集素分子(甘露糖結(jié)合蛋白(MBL)和纖維膠凝蛋白)的MASP-2二聚體復(fù)合物存在于血漿中。因此，如果有興趣研究抗MASP-2Fab2與生理相關(guān)形式的MASP-2結(jié)合，則重要的是開(kāi)發(fā)出結(jié)合測(cè)定法，其中利用的是Fab2與血漿“天然”MASP-2之間，而不是與純化的重組MASP-2之間的相互作用。在該結(jié)合測(cè)定法中，先將得自10％大鼠血清的“天然”MASP-2-MBL復(fù)合物固定在甘露聚糖包被的孔內(nèi)。然后采用標(biāo)準(zhǔn)ELISA方法，對(duì)各種抗固定化“天然”MASP-2的抗MASP-2Fab2的結(jié)合親和性進(jìn)行了研究。

方法：將96孔Costar高結(jié)合板與稀釋于50mM碳酸鹽緩沖液(pH 9.5)的甘露聚糖按1μg/50μl/孔在5℃下溫育過(guò)夜。各孔用200μl PBS洗滌3次。各孔用100μl/孔的0.5％脫脂奶粉的PBST溶液(PBS與0.05％吐溫20)封閉，在室溫下輕輕攪動(dòng)溫育1小時(shí)。各孔用200μl TBS/吐溫/Ca⁺⁺洗滌緩沖液(Tris緩沖鹽溶液，0.05％吐溫20，含有5.0mMCaCl₂，pH 7.4)洗滌3次。在冰上制備10％大鼠血清的高鹽結(jié)合緩沖液(20mM Tris，1.0MNaCl，10mM CaCl₂，0.05％Triton-X100，0.1％(重量/體積)牛血清白蛋白，pH 7.4)。每孔加入100μl，在5℃下溫育過(guò)夜。各孔用200μl TBS/吐溫/Ca⁺⁺洗滌緩沖液洗滌3次。然后各孔用200μl PBS洗滌2次。加入100μl/孔稀釋于含有Ca⁺⁺和Mg⁺⁺的GVB緩沖液(4.0mM巴比妥，141mM NaCl，1.0mM MgCl₂，2.0mM CaCl₂，0.1％明膠，pH 7.4)的選定濃度的抗MASP-2Fab2，在室溫下輕輕攪動(dòng)溫育1小時(shí)。各孔用200μl PBS洗滌5次。加入100μl/孔按1:5000稀釋的溶于2.0mg/ml牛血清白蛋白/PBS的HRP綴合的山羊抗Fab2(Biogenesis目錄號(hào)0500-0099)，在室溫下輕輕攪動(dòng)溫育1小時(shí)。各孔用200μl PBS洗滌5次。加入100μl/孔過(guò)氧化物酶底物TMB(Kirkegaard&Perry Laboratories)，在室溫下溫育70分鐘。通過(guò)加入100μl/孔的1.0M H₃PO₄終止過(guò)氧化物酶反應(yīng)，測(cè)得OD₄₅₀。

結(jié)果：

挑選了約250個(gè)不同的與抗大鼠MASP-2蛋白進(jìn)行高親和性反應(yīng)的Fab2用于ELISA篩選。對(duì)這些高親和性Fab2進(jìn)行了測(cè)序以確定不同抗體的獨(dú)特性，對(duì)50個(gè)獨(dú)特的抗MASP-2抗體進(jìn)行純化用于進(jìn)一步分析。250μg各經(jīng)純化的Fab2抗體用來(lái)表征MASP-2結(jié)合親和性及測(cè)定補(bǔ)體途徑功能。該分析的結(jié)果見(jiàn)表6。

表6：阻斷凝集素途徑補(bǔ)體活化的抗MASP-2FAB2

如上表6所示，50個(gè)所測(cè)的抗MASP-2Fab2中，17個(gè)Fab2被鑒定為MASP-2阻斷性Fab2，有效抑制C3轉(zhuǎn)化酶形成，IC₅₀≤10nM Fab2(34％陽(yáng)性選中率)。所鑒定出的17個(gè)Fab2中，有8個(gè)的IC₅₀范圍為納摩爾以下。此外，表6中所示的所有17個(gè)MASP-2阻斷性Fab2在凝集素途徑C3轉(zhuǎn)化酶測(cè)定法中基本上完全抑制了C3轉(zhuǎn)化酶形成。圖11A曲線圖說(shuō)明C3轉(zhuǎn)化酶形成測(cè)定法的Fab2抗體#11的結(jié)果，在其它所測(cè)定的Fab2抗體中具有代表性，其結(jié)果見(jiàn)表6。因?yàn)樯踔廉?dāng)各MASP-2分子被Fab2結(jié)合時(shí)，“阻斷性”Fab2僅可能極微弱地抑制MASP-2功能，這在理論是可能的，因此要慎重考慮。

盡管甘露聚糖是凝集素途徑的已知激活劑，但是在大鼠血清存在的抗甘露聚糖抗體還可能激活經(jīng)典途徑，并且通過(guò)經(jīng)典途徑C3轉(zhuǎn)化酶產(chǎn)生C3b，這在理論上是可能的。然而，在本實(shí)施例所列的17個(gè)阻斷性抗MASP-2Fab2中的每一個(gè)都有效地抑制了C3b產(chǎn)生(>95％)，因此證明了該項(xiàng)測(cè)定法對(duì)于凝集素途徑C3轉(zhuǎn)化酶的特異性。

為了計(jì)算各個(gè)抗體的表觀K_d，對(duì)阻斷性Fab2的所有17個(gè)都進(jìn)行結(jié)合測(cè)定。6個(gè)阻斷性Fab2的抗天然大鼠MASP-2的抗大鼠MASP-2Fab2的結(jié)合測(cè)定的結(jié)果也見(jiàn)表6。圖11B通過(guò)圖示說(shuō)明了用Fab2抗體#11的結(jié)合測(cè)定法的結(jié)果。對(duì)于其它Fab2也進(jìn)行了類(lèi)似的結(jié)合測(cè)定，其結(jié)果見(jiàn)表6。一般而言，對(duì)于6個(gè)Fab2的每一個(gè)結(jié)合“天然”MASP-2所獲得的表觀K_d與在C3轉(zhuǎn)化酶功能測(cè)定中Fab2的IC₅₀的對(duì)應(yīng)性頗為適當(dāng)。有證據(jù)表明，在激活其蛋白酶活性時(shí)，MASP-2經(jīng)歷了從“無(wú)活性”到“活性”形式的構(gòu)象變化(Feinberg等，EMBO J 22:2348-59(2003)；Gal等，J.Biol.Chem.280:33435-44(2005))。在用于C3轉(zhuǎn)化酶形成測(cè)定法的正常大鼠血漿中，MASP-2主要以“無(wú)活性”酶原構(gòu)象存在。相比之下，在結(jié)合測(cè)定法中，MASP-2作為與MBL一起結(jié)合到固定化甘露聚糖的復(fù)合物的組成部分存在；因此，MASP-2可能為“活性”構(gòu)象(Petersen等，J.Immunol Methods 257:107-16，2001)。因此，對(duì)于這兩個(gè)功能測(cè)定法中所測(cè)定的17個(gè)阻斷性Fab2的每一個(gè)，可能不必預(yù)期IC₅₀與K_d之間確切的對(duì)應(yīng)性，因?yàn)樵诟鱾€(gè)測(cè)定法中，F(xiàn)ab2可能結(jié)合不同構(gòu)象形式的MASP-2。盡管如此，除了Fab2#88以外，兩種測(cè)定法中所測(cè)的其它16個(gè)Fab2的每一個(gè)，IC₅₀與表觀K_d之間似乎有相當(dāng)密切的對(duì)應(yīng)性(參見(jiàn)表6)。

對(duì)用于抑制MASP-2介導(dǎo)的C4裂解的若干個(gè)阻斷性Fab2進(jìn)行了評(píng)價(jià)。圖11C通過(guò)圖示說(shuō)明了C4裂解測(cè)定法的結(jié)果，表明用Fab2#41抑制的IC₅₀＝0.81nM(參見(jiàn)表6)。如圖12所示，發(fā)現(xiàn)所有測(cè)試的Fab2都抑制C4裂解，IC₅₀類(lèi)似于C3轉(zhuǎn)化酶測(cè)定法中所獲得的IC₅₀(參見(jiàn)表6)。

盡管甘露聚糖是凝集素途徑的已知激活劑，但是大鼠血清中抗甘露聚糖抗體的存在也可能激活經(jīng)典途徑，從而通過(guò)C1s介導(dǎo)的C4裂解而產(chǎn)生C4b，這在理論上是可能的。然而，已經(jīng)鑒定出有效抑制C4b產(chǎn)生(>95％)的若干種抗MASP-2Fab2，因此證明了該測(cè)定法對(duì)于MASP-2介導(dǎo)的C4裂解的特異性。C4，如同C3一樣，含有獨(dú)特的高反應(yīng)性硫酯基團(tuán)作為其結(jié)構(gòu)部分。在該測(cè)定法中當(dāng)通過(guò)MASP-2裂解C4時(shí)，C4b上的硫酯基團(tuán)可與通過(guò)酯鍵或酰胺鍵固定在塑料孔底部的大分子上羥基或氨基形成共價(jià)鍵，因此有利于在ELISA測(cè)定法中檢測(cè)出C4b。

這些研究清楚表明，對(duì)于大鼠MASP-2蛋白的高親和性FAB2的產(chǎn)生，功能性地阻斷C4和C3轉(zhuǎn)化酶活性，從而防止了凝集素途徑活化。

實(shí)施例25

本實(shí)施例描述了對(duì)若干按照實(shí)施例24所述方法產(chǎn)生的阻斷性抗大鼠MASP-2Fab2抗體進(jìn)行的表位作圖。

方法:

如圖13所示，使用pED4載體，在CHO細(xì)胞中表達(dá)下列都具有N端6個(gè)His標(biāo)記的蛋白質(zhì)：

大鼠MASP-2A，一種全長(zhǎng)MASP-2蛋白，通過(guò)活性中心上的絲氨酸改變?yōu)楸彼?S613A)而失活；

大鼠MASP-2K，經(jīng)改變降低了自身活化的全長(zhǎng)MASP-2蛋白(R424K)；

CUBI-II，一種僅含有CUBI、EGF樣和CUBII結(jié)構(gòu)域的大鼠MASP-2的N端片段；和

CUBI/EGF樣，一種僅含有CUBI和EGF樣結(jié)構(gòu)域的大鼠MASP-2的N端片段。

按照前述方法將這些蛋白質(zhì)通過(guò)鎳親和層析從培養(yǎng)上清液中純化出來(lái)(Chen等，J.Biol.Chem.276:25894-02(2001))。

采用pTrxFus(Invitrogen)，使含有CCPII和大鼠MASP-2絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域的C端多肽(CCPII-SP)，在大腸桿菌中表達(dá)成為硫氧還蛋白融合蛋白。用Thiobond親和樹(shù)脂將蛋白質(zhì)從細(xì)胞裂解物中純化出來(lái)。硫氧還蛋白融合物配偶體由pTrxFus空載體表達(dá)作為陰性對(duì)照。

將所有重組蛋白透析到TBS緩沖液中，通過(guò)測(cè)量OD(280nm)，測(cè)得其濃度。

斑點(diǎn)印跡法分析：

將連續(xù)稀釋的上述和圖13中所示5個(gè)重組MASP-2多肽(以及硫氧還蛋白多肽作為CCPII-絲氨酸蛋白酶多肽的陰性對(duì)照)點(diǎn)在硝酸纖維素膜上。蛋白質(zhì)的點(diǎn)樣量在5重步驟中的范圍為100ng-6.4pg。在稍后的實(shí)驗(yàn)中，蛋白質(zhì)的點(diǎn)樣量再次在5重步驟中的范圍由50ng降至16pg。該膜用5％脫脂奶粉的TBS溶液(封閉緩沖液)封閉，然后與1.0μg/ml抗MASP-2Fab2的封閉緩沖液(含有5.0mM Ca²⁺)一起溫育。用HRP綴合的抗人Fab(AbD/Serotec；1/10,000稀釋)和ECL檢測(cè)試劑盒(Amersham)檢測(cè)結(jié)合的Fab2。一塊膜與作為陽(yáng)性對(duì)照的多克隆兔抗人MASP-2Ab(參見(jiàn)Stover等，J Immunol 163:6848-59(1999))一起溫育。在這種情況下，用HRP綴合的山羊抗兔IgG(Dako；1/2,000稀釋)，檢測(cè)出結(jié)合的Ab。

MASP-2結(jié)合測(cè)定法

ELISA板用1.0μg/孔的重組MASP-2A或CUBI-II多肽的碳酸鹽緩沖液(pH 9.0)在4℃下包被過(guò)夜。孔用1％BSA的TBS溶液封閉，然后加入連續(xù)稀釋的抗MASP-2Fab2的TBS溶液(含有5.0mM Ca²⁺)。將所述板在室溫下溫育1小時(shí)。用TBS/吐溫/Ca²⁺洗滌3次后，加入按1/10,000稀釋于TBS/Ca²⁺的HRP綴合的抗人Fab(AbD/Serotec)，將所述板再次在室溫下溫育1小時(shí)。用TMB過(guò)氧化物酶底物試劑盒(Biorad)檢測(cè)出結(jié)合的抗體。

結(jié)果：

斑點(diǎn)印跡法分析的結(jié)果表明了Fab2與下表7中提供的各種MASP-2多肽的反應(yīng)性。表7提供的數(shù)值表明，所需要的蛋白質(zhì)點(diǎn)樣量提供大約最大信號(hào)強(qiáng)度的一半。如表所示，所有多肽(僅硫氧還蛋白融合物配偶體例外)均被陽(yáng)性對(duì)照Ab(多克隆抗人MASP-2血清，在兔中產(chǎn)生)識(shí)別。

表7：斑點(diǎn)印跡法中與各重組大鼠MASP-2多肽的反應(yīng)性

NR＝無(wú)反應(yīng)。陽(yáng)性對(duì)照抗體是在兔中產(chǎn)生的多克隆抗人MASP-2血清。

所有Fab2均與MASP-2A以及MASP-2K反應(yīng)(數(shù)據(jù)未顯示)。大多數(shù)Fab2識(shí)別CCPII-SP多肽但不識(shí)別N端片段。Fab2#60和Fab2#57是兩個(gè)例外。Fab2#60識(shí)別MASP-2A和CUBI-II片段，但不識(shí)別CUBI/EGF樣多肽或CCPII-SP多肽，這提示它能結(jié)合CUBII的表位或者跨越CUBII和EGF樣結(jié)構(gòu)域。Fab2#57識(shí)別MASP-2A但不識(shí)別任何所測(cè)試的MASP-2片段，這可能表明這種Fab2識(shí)別CCP1的表位。Fab2#40和#49僅結(jié)合完整的MASP-2A。在圖14所示的ELISA結(jié)合測(cè)定法中，F(xiàn)ab2#60還結(jié)合CUBI-II多肽，雖然只具有略微較低的表觀親和性。

這些觀察結(jié)果表明對(duì)于MASP-2蛋白多個(gè)區(qū)域上的獨(dú)特阻斷性Fab2的鑒定。

實(shí)施例26

本實(shí)施例描述了鼠腎缺血/再灌注模型中MASP-2-/-小鼠的分析法。

背景/基本原理：體溫下，腎缺血－再灌注(I/R)損傷與多種臨床病癥有關(guān)，包括低血容量性休克、腎動(dòng)脈閉塞和交叉鉗夾術(shù)。

腎缺血－再灌注(I/R)是急性腎衰竭的重要原因，相關(guān)死亡率高達(dá)50％(Levy等，JAMA 275:1489-94，1996；Thadhani等，N.Engl.J.Med.334:1448-60,1996)。移植后腎衰竭是腎移植常見(jiàn)且危險(xiǎn)的并發(fā)癥(Nicholson等，Kidney Int.58:2585-91，2000)。目前還沒(méi)有腎I/R損傷的有效療法，血液透析是現(xiàn)有唯一的治療法。腎I/R損傷的病理生理學(xué)十分復(fù)雜。最新研究表明，凝集素途徑的補(bǔ)體活化可能對(duì)腎I/R損傷的發(fā)病機(jī)制具有重要作用(deVries等，Am.J.Path.165:1677-88，2004)。

方法：

按照實(shí)施例1所述方法產(chǎn)生MASP-2(-/-)小鼠，并與C57Bl/6回交至少10代。將咪唑安定(Hypnovel)(6.64mg/kg；Roche products Ltd.Welwyn Garden City，UK)注射到稱(chēng)重介于22-25g之間的6只雄性MASP-2(-/-)和6只野生型(+/+)小鼠腹膜內(nèi)，隨后通過(guò)吸入異氟烷(Abbott Laboratories Ltd.，Kent，UK)使之麻醉。之所以選擇異氟烷，是因?yàn)樗菧睾偷奈肼樽韯?，肝毒性最?。粷舛日{(diào)節(jié)準(zhǔn)確，即使在長(zhǎng)時(shí)間麻醉后，動(dòng)物也能迅速恢復(fù)。之所以給予咪唑安定，是因?yàn)樗趧?dòng)物中產(chǎn)生安定麻醉的條件，這意味著只需要給予較少的異氟烷。將保暖墊(warm pad)放置在動(dòng)物身體下面以便保持恒定體溫。接著，沿腹中線切開(kāi)，用一副牽開(kāi)器使腹腔保持打開(kāi)狀態(tài)。徹底清除掉左右腎的腎靜脈和動(dòng)脈的結(jié)締組織，使用微動(dòng)脈瘤夾鉗緊緊夾住腎蒂55分鐘。這種一段時(shí)間的缺血最初是根據(jù)在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行的先期研究來(lái)進(jìn)行的(Zhou等，J.Clin.Invest.105:1363-71(2000))。另外，在缺血滴定后選擇55分鐘的標(biāo)準(zhǔn)缺血時(shí)間，并且發(fā)現(xiàn)55分鐘造成仍可逆轉(zhuǎn)的穩(wěn)定損傷，死亡率低，為5％以下。閉塞后，將0.4ml熱的鹽水(37℃)注入腹腔內(nèi)，然后閉合腹部達(dá)缺血時(shí)間。取出微動(dòng)脈瘤夾鉗后，觀察腎臟直到變色，這是血液回流到腎臟的表示。另將0.4ml熱的鹽水注入腹腔內(nèi)，將切口縫合，之后把動(dòng)物放回其籠中。取出夾鉗后24小時(shí)采集尾部血樣，48小時(shí)時(shí)處死小鼠，再次收集血樣。

腎損傷的評(píng)價(jià)：在6只雄性MASP-2(-/-)和6只野生型(WT)(+/+)小鼠再灌注后24小時(shí)和48小時(shí)，對(duì)腎功能進(jìn)行了評(píng)價(jià)。通過(guò)質(zhì)譜法測(cè)定血液肌酸酐的量，這提供了可再現(xiàn)的腎功能指標(biāo)(靈敏度<1.0μmol/L)。圖15通過(guò)圖示說(shuō)明了在再灌注后24小時(shí)和48小時(shí)，野生型C57Bl/6對(duì)照和MASP-2(-/-)的血尿素氮清除率。如圖15所示，與野生型對(duì)照小鼠相比，MASP-2(-/-)小鼠在24小時(shí)和48小時(shí)時(shí)呈現(xiàn)出血尿素的量顯著降低，這表明在缺血再灌注損傷模型中對(duì)腎損傷的保護(hù)性功能作用。

總的來(lái)說(shuō)，在手術(shù)和缺血損傷后24小時(shí)和48小時(shí)，在WT(+/+)和MASP-2(-/-)小鼠中均觀察到血尿素增加。單獨(dú)測(cè)定了非缺血WT(+/+)手術(shù)動(dòng)物中的血尿素水平為5.8mmol/L。除了圖15所提供的數(shù)據(jù)外，1只MASP-2(-/-)動(dòng)物顯示受到幾乎完全的保護(hù)而未發(fā)生缺血損傷，24小時(shí)和48小時(shí)的值分別為6.8mmol/L和9.6mmol/L。這只動(dòng)物被排除在組別分析之外作為可能的無(wú)關(guān)項(xiàng)，其中可能存在無(wú)缺血損傷。因此，圖15所示最終分析包括5只MASP-2(-/-)小鼠和6只WT(+/+)小鼠，在MASP-2(-/-)小鼠中觀察到在24小時(shí)和48小時(shí)時(shí)，血尿素在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著降低(Student t-檢驗(yàn)p<0.05)。這些觀察結(jié)果表明抑制MASP-2活性可能將對(duì)因缺血損傷所造成的腎損傷產(chǎn)生保護(hù)或治療作用。

實(shí)施例27

本實(shí)施例描述了對(duì)小鼠心肌缺血/再灌注模型中MASP-2(-/-)小鼠的分析。

背景/基本原理：

甘露糖結(jié)合凝集素(MBL)是在響應(yīng)各種各樣的糖結(jié)構(gòu)時(shí)以免疫復(fù)合物依賴(lài)性的方式啟動(dòng)補(bǔ)體活化的循環(huán)分子。這些結(jié)構(gòu)可以是感染因子(infectious agent)的成分或發(fā)生變化的內(nèi)源糖部分，特別是壞死細(xì)胞、腫脹細(xì)胞或凋亡細(xì)胞內(nèi)的糖部分。這些細(xì)胞死亡的形式發(fā)生在再灌注的心肌層內(nèi)，其中補(bǔ)體活化很可能使損傷擴(kuò)大到由再灌注終止缺血的那一時(shí)刻存在的損傷界限以外。盡管引人注目的證據(jù)表明，補(bǔ)體活化使心肌再灌注惡化，但是仍不清楚這種活化的機(jī)制，而且抑制所有的已知途徑很可能具有不堪耐受的不利作用。最新研究表明活化可能包括MBL，而不是經(jīng)典途徑或替代放大環(huán)路(如本文中定義)，因?yàn)槭窃贛BL(A/C)-失效小鼠而不是在C1q-失效小鼠中有梗塞減少(Walsh M.C.等，Jour of Immunol.175:541-546(2005))。然而，這雖然令人鼓舞，但是這些小鼠仍然包括循環(huán)成分(例如纖維膠凝蛋白A)，能夠通過(guò)凝集素途徑激活補(bǔ)體。

該研究對(duì)MASP-2(-/-)小鼠與野生型(+/+)對(duì)照進(jìn)行了研究以確定MASP-2(-/-)是否對(duì)心肌缺血和再灌注損傷不大敏感。使MASP-2(-/-)小鼠遭受局部缺血，將梗塞大小與其野生型同窩小鼠的進(jìn)行比較。

方法：以下方案以前述誘導(dǎo)缺血/再灌注損傷的方法(Marber等，J.Clin Invest.95:1446-1456(1995))為基礎(chǔ)。

按照實(shí)施例1所述方法產(chǎn)生MASP-2(-/-)小鼠，并與C57Bl/6回交至少10代。7只MASP-2(-/-)小鼠和7只野生型(+/+)小鼠用氯胺酮/美托咪定(分別為100mg/kg和0.2mg/kg)麻醉，并使之仰臥在溫控加熱墊上以維持直腸溫度在37±0.3℃。在直視下給小鼠插管，在110次/分鐘的呼吸頻率和225μl/分鐘的潮氣量下使室內(nèi)空氣流通(通風(fēng)器-Hugo Sachs Elektronic MiniVent Type 845,Germany)。

備皮，從左腋窩到劍突前外側(cè)皮膚切開(kāi)。剖開(kāi)胸大肌，從其胸骨邊緣切起，并切到腋窩。胸小肌從其顱骨邊緣切起，并切到尾側(cè)。該肌肉稍后在冠狀動(dòng)脈閉塞期間用作覆蓋心臟的肌瓣。從左肺稍靠中間到邊緣的點(diǎn)用鑷子刺入第5肋間隙和胸膜壁層的肌肉，從而避免了損傷肺或心臟。在刺穿胸膜后，小心地將鑷子指向胸膜以外直指胸骨而不觸及心臟，用電池驅(qū)動(dòng)的烙器(Harvard Apparatus，UK)剖開(kāi)胸膜和肋間肌。操作上要特別留意避免任何出血。用同一技術(shù)，將胸廓切開(kāi)術(shù)延伸到腋窩中線。從其胸骨邊緣切斷第4肋骨后，使肋間隙擴(kuò)寬直到整個(gè)心臟從基底部到頂部暴露出來(lái)。用兩個(gè)小的動(dòng)脈鉗打開(kāi)心包，圍心托架(pericardial cradle)設(shè)置成使心臟稍微前移。使冠狀動(dòng)脈左前降支(LAD)暴露出來(lái)，然后將穿有8-0單絲縫合線的圓針在LAD下穿過(guò)。LAD的結(jié)扎部位正好位于左心房尖的尾部，沿房室嵴(atrioventricular crest)到左心室頂端線路的大約1/4。

所有實(shí)驗(yàn)都以不知情的方式進(jìn)行，研究人員不知道各個(gè)動(dòng)物的基因型。在儀器使用和外科手術(shù)完成后，允許小鼠有15分鐘的平衡期。然后小鼠進(jìn)行30分鐘的冠狀動(dòng)脈閉塞與120分鐘的再灌注時(shí)間。

冠狀動(dòng)脈閉塞和再灌注模型

用前述的懸重系統(tǒng)(hanging weight system)形成冠狀動(dòng)脈閉塞(Eckle等，Am J Physiol Heart Circ Physiol 291:H2533-H2540，2006)。將單絲結(jié)扎線的兩端穿過(guò)一段長(zhǎng)2mm的聚乙烯PE-10管中，并且用氰基丙烯酸酯膠粘到長(zhǎng)度5-0的縫合線上。然后將縫合線牽引在2個(gè)水平安置的可移動(dòng)金屬棒上，縫合線的兩端各附加上1g的小塊。通過(guò)抬升小棒，使小塊懸起，置于控制牽引力下的縫合線隨著規(guī)定且恒定的壓力使LAD閉塞。LAD閉塞通過(guò)處于風(fēng)險(xiǎn)的區(qū)域變蒼白而得到驗(yàn)證，LAD灌注區(qū)的顏色由鮮紅變成紫色，這就表明血流停止。通過(guò)放低小棒直到小塊放到手術(shù)墊上，并且解除了結(jié)扎線的牽引力而獲得再灌注。通過(guò)與用于驗(yàn)證閉塞相同的3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)來(lái)驗(yàn)證再灌注。如果分別在冠狀動(dòng)脈閉塞開(kāi)始時(shí)或者在再灌注15分鐘內(nèi)未達(dá)到所有3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，則小鼠不再用于進(jìn)一步分析。在冠狀動(dòng)脈閉塞期間，通過(guò)用胸大肌瓣覆蓋心臟，并且用0.9％鹽水浸濕的紗布封住胸廓切開(kāi)傷口，來(lái)維持心臟表面的溫度和濕度。

心肌梗塞大小的測(cè)量：

通過(guò)測(cè)面積法(planometry)來(lái)測(cè)定梗塞大小(INF)和風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域(AAR)。在靜脈內(nèi)注射500I.U.肝素后，使LAD再閉塞，將300μl 5％(重量/體積)伊文思藍(lán)(Evans Blue)(Sigma-Aldrich，Poole，UK)慢慢注射到頸靜脈內(nèi)以顯現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域(AAR)的輪廓。這使得染料進(jìn)入左心室的非缺血區(qū)域，而缺血AAR則不染色。小鼠斷頸處安樂(lè)死，快速取出心臟。將心臟在冰上冷卻，并在5％瓊脂糖中固定，然后切成8片厚度為800μm的橫切片。將所有切片與溶于0.1M Na₂HPO₄/NaH₂PO₄緩沖液(調(diào)節(jié)至pH 7.4)的3％2,3,5-三苯基氯化四唑(Sigma Aldrich，Poole，UK)一起在37℃下溫育20分鐘。將切片在10％甲醛中固定過(guò)夜。將切片放在兩塊蓋玻片之間，采用高分辨率光學(xué)掃描儀對(duì)各切片兩側(cè)進(jìn)行數(shù)字成像。然后運(yùn)用SigmaScan軟件(SPSS，US)對(duì)數(shù)字圖像進(jìn)行分析。通過(guò)鑒定其顏色外觀和顏色邊界，在每個(gè)切片上描出梗塞區(qū)域(蒼白色)的大小、左心室(LV)風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域(紅色)和正常灌注的LV帶(藍(lán)色)的輪廓。研究人員對(duì)每個(gè)切片兩側(cè)的面積進(jìn)行定量測(cè)定并平均。計(jì)算每只動(dòng)物的梗塞大小，用％風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域表示。

結(jié)果：通過(guò)鑒定其顏色外觀和顏色邊界，在每個(gè)切片上描出梗塞區(qū)域(蒼白色)的大小、LV風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域(紅色)和正常灌注的LV帶(藍(lán)色)的輪廓。研究人員對(duì)每個(gè)切片兩側(cè)的面積進(jìn)行定量測(cè)定并平均。計(jì)算每只動(dòng)物的梗塞大小，用％風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域表示。圖16A表示對(duì)7只WT(+/+)小鼠和7只MASP-2(-/-)小鼠的評(píng)價(jià)，以在經(jīng)歷上述冠狀動(dòng)脈閉塞和再灌注技術(shù)后，測(cè)出它們的梗塞大小。如圖16A所示，MASP-2(-/-)小鼠比起野生型(+/+)小鼠，梗塞大小在統(tǒng)計(jì)上顯著減少(p<0.05)，這就表明在缺血再灌注損傷模型中具有保護(hù)心肌免受損傷的作用。圖16B顯示所測(cè)試的個(gè)體動(dòng)物的分布，表明了對(duì)MASP-2(-/-)小鼠明顯的保護(hù)作用。

實(shí)施例28

本實(shí)施例描述了MASP-2-/-在鼠黃斑變性模型中的結(jié)果。

背景/基本原理：年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)是工業(yè)化世界55歲以后致盲的主要原因。AMD主要以?xún)煞N形式出現(xiàn)：新血管性(濕性)AMD和萎縮性(干性)AMD。新血管(濕性)形式占AMD相關(guān)的嚴(yán)重視力喪失的90％，即使僅有～20％患有AMD的個(gè)體發(fā)展成濕性形式。AMD的臨床特點(diǎn)包括多發(fā)性脈絡(luò)膜小疣、地區(qū)性萎縮(geographic atrophy)和脈絡(luò)膜新血管形成(CNV)。2004年12月，美國(guó)食品和藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)了Macugen(倍加他尼(pegaptanib))，這是一類(lèi)特異性靶向并阻斷血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的作用新的眼科藥物，用于治療濕性(新血管)形式的AMD(Ng等，Nat Rev.Drug Discov 5:123-32(2006))。盡管Macugen對(duì)于小部分AMD患者代表著有前景的新的治療選擇，但是對(duì)于開(kāi)發(fā)這種復(fù)雜疾病的其它治療方法的迫切需要依然存在。多項(xiàng)獨(dú)立路線的研究表明了補(bǔ)體活化在AMD發(fā)病機(jī)制中的重要作用。脈絡(luò)膜新血管形成(CNV)的發(fā)病機(jī)制，是一種最嚴(yán)重的AMD形式，可能包括補(bǔ)體途徑的活化。

25年前，Ryan描述了動(dòng)物CNV的激光誘導(dǎo)的損傷模型(Ryan,S.J.，Tr.Am.Opth.Soc.LXXVII:707-145，1979)。該模型最初是用獼猴開(kāi)發(fā)的，然而，此后已經(jīng)應(yīng)用同一技術(shù)在各種研究動(dòng)物中開(kāi)發(fā)出了類(lèi)似的CNV模型，包括小鼠(Tobe等，Am.J.Pathol153:1641-46，1998)。在這一模型中，使用激光凝固來(lái)破壞脈胳膜基底層(Bruch's membrane)，這種做法將導(dǎo)致形成CNV樣膜。激光誘導(dǎo)的模型獲取了人的該種疾病的重要特征(有關(guān)最新綜述可參見(jiàn)Ambati等，Survey Ophthalmology 48:257-293，2003)?，F(xiàn)已建立了良好的激光誘導(dǎo)的小鼠模型，并且在大量甚至不斷增加的多個(gè)研究項(xiàng)目中用作實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。一般公認(rèn)的是，激光誘導(dǎo)的模型與人的CNV共有足夠的生物相似性，使用該模型的發(fā)病機(jī)制的臨床前研究和藥物抑制與人的CNV有關(guān)。

方法：按照實(shí)施例1所述方法產(chǎn)生MASP-2-/-小鼠，并與C57Bl/6回交10代。目前的研究對(duì)當(dāng)在激光誘導(dǎo)的CNV的病程中對(duì)MASP-2(-/-)和MASP-2(+/+)雄性小鼠評(píng)價(jià)的結(jié)果進(jìn)行了比較，激光誘導(dǎo)的CNV是一種在激光損傷后，通過(guò)激光掃描共焦顯微鏡來(lái)衡量組織損傷，并且通過(guò)ELISA測(cè)定視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)/脈絡(luò)膜的VEGF(一種涉及CNV的有效血管生成因子)水平，焦點(diǎn)集中在激光誘導(dǎo)的CNV體積的新血管AMD的加速模型。

誘導(dǎo)脈絡(luò)膜新血管形成(CNV)：在第0天，由對(duì)藥物組分配不知情的一個(gè)人，對(duì)每只動(dòng)物的雙眼實(shí)施激光凝固(532nm，200mW，100毫秒，75μm；Oculight GL，Iridex，Mountain View，CA)。使用裂隙燈傳遞系統(tǒng)和蓋玻片作為接觸透鏡，按標(biāo)準(zhǔn)化方式將激光光斑照在視神經(jīng)周?chē)＜す鈸p傷形態(tài)終點(diǎn)是出現(xiàn)空泡，這是一種被視作與脈胳膜基底層破壞有關(guān)的跡象。詳細(xì)方法和終點(diǎn)數(shù)據(jù)評(píng)價(jià)如下。

熒光素血管造影術(shù)：在激光凝固后1周，用照相機(jī)和成像系統(tǒng)(TRC 50 1A照相機(jī)；ImageNet 2.01系統(tǒng)；Topcon，Paramus，NJ)進(jìn)行熒光素血管造影術(shù)。在腹膜內(nèi)注射0.1ml2.5％熒光素鈉后，用與眼底照相機(jī)鏡頭接觸的20-D鏡頭抓拍照片。未參與激光凝固或血管造影術(shù)的視網(wǎng)膜專(zhuān)家以不知情的方式一次性對(duì)熒光素血管造影照片進(jìn)行評(píng)價(jià)。

脈絡(luò)膜新血管形成(CNV)的體積：在激光損傷后一周，摘出雙眼，用4％低聚甲醛在4℃下固定30分鐘。通過(guò)除去前節(jié)(anterior segment)獲得眼杯，在PBS中洗滌3次，隨后通過(guò)甲醇系列脫水和再水化。用緩沖液(含有1％牛血清白蛋白和0.5％Triton X-100的PBS)在室溫下封閉兩次30分鐘后，眼杯與稀釋于含有0.2％BSA和0.1％Triton X-100的PBS中的0.5％FITC-同工凝集素B4(Vector laboratories，Burlingame，CA)一起在4℃下溫育過(guò)夜，F(xiàn)ITC-同工凝集素B4能結(jié)合內(nèi)皮細(xì)胞表面的末端β-D-半乳糖殘基，并選擇性地標(biāo)記鼠血管系統(tǒng)。用含有0.1％Triton X-100的PBS洗滌2次后，輕輕剝離視網(wǎng)膜感覺(jué)神經(jīng)層(neurosensory retina)并切斷視神經(jīng)。切開(kāi)4個(gè)松馳放射狀切口，將剩余的RPE－脈絡(luò)膜－鞏膜復(fù)合體平放在antifade培養(yǎng)基(Immu-Mount Vectashield Mounting Medium；Vector Laboratories)中封固，蓋上蓋玻片。

平放樣本(Flatmount)用激光掃描共焦顯微鏡(TCS SP；Leica，Heidelberg，Germany)觀察。通過(guò)用藍(lán)色氬波長(zhǎng)(488nm)激發(fā)并捕獲515nm和545nm之間的發(fā)射來(lái)觀測(cè)血管。對(duì)于所有成像研究都使用40X油浸物鏡。從RPE－脈絡(luò)膜－鞏膜復(fù)合體表面獲取水平光學(xué)切片(lμm步進(jìn))?？梢澡b定出在與病變相連的圍繞脈絡(luò)膜血管網(wǎng)上的最深焦平面，這被認(rèn)定是病變的基底。在激光定向區(qū)域與這一參照平面表面上的任何血管均被斷定為CNV。各切片的圖像通過(guò)數(shù)字化予以保存。用顯微鏡軟件(TCS SP；Leica)通過(guò)計(jì)算機(jī)進(jìn)行的圖像分析來(lái)測(cè)定與CNV相關(guān)熒光的面積。在各個(gè)水平切片上對(duì)整個(gè)熒光面積進(jìn)行匯總，來(lái)用作CNV體積的指數(shù)。由對(duì)處理組分配不知情的操作人員進(jìn)行成像。

因?yàn)楦鱾€(gè)激光病變發(fā)展成CNV的可能性受它所屬組別的影響(小鼠、眼和激光光斑)，使用具有裂區(qū)重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的線性混合模型對(duì)平均病變體積進(jìn)行比較。主區(qū)(whole plot)因子是動(dòng)物所屬的遺傳組別，而裂區(qū)(split plot)則為眼。測(cè)得統(tǒng)計(jì)上的顯著性水平為0.05。用適于多重比較的Bonferroni調(diào)整(Bonferroni adjustment)構(gòu)建事后比較的方法。

VEGF ELISA。在通過(guò)12束激光光斑損傷后的第3天，將RPE－脈絡(luò)膜復(fù)合體于裂解緩沖液(20mM咪唑HCl，10mM KCl，1mM MgCl₂，10mM EGTA，1％Triton X-100，10mM NaF，1mM鉬酸鈉和1mM EDTA與蛋白酶抑制劑)中在冰上用超聲處理15分鐘。用識(shí)別所有切片變體的ELISA試劑盒(R&D Systems,Minneapolis,MN)，在450-570nm(Emax；Molecular Devices，Sunnyvale，CA)下測(cè)定上清液中的VEGF蛋白水平，并針對(duì)總蛋白標(biāo)準(zhǔn)化。由不參與激光凝固、成像或血管造影術(shù)的操作人員以不知情的方式進(jìn)行重復(fù)測(cè)量。VEGF數(shù)值用至少3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值+/-SEM表示，采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)進(jìn)行比較。在P<0.05時(shí)拒絕零假設(shè)。

結(jié)果：

評(píng)價(jià)VEGF水平：

圖17通過(guò)圖示說(shuō)明了在第0天由C57Bl6野生型和MASP-2(-/-)小鼠中分離出來(lái)的RPE－脈絡(luò)膜復(fù)合體的VEGF蛋白水平。如圖17A所示，對(duì)VEGF水平的評(píng)價(jià)表明，在MASP-2(-/-)小鼠與C57bl野生型對(duì)照小鼠中VEGF的基線水平降低。圖17B通過(guò)圖示說(shuō)明了激光誘導(dǎo)的損傷后第三天所測(cè)VEGF蛋白水平。如圖17B所示，在野生型(+/+)小鼠中，在激光誘導(dǎo)的損傷之后的第三天，VEGF水平顯著提高，這與已發(fā)表的研究(Nozaki等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103:2328-33(2006))一致。然而，預(yù)料不到的是，在MASP-2(-/-)小鼠中觀察到VEGF的水平非常低。

評(píng)價(jià)脈絡(luò)膜新血管形成(CNV)：

除了在激光誘發(fā)的黃斑變性之后VEGF水平降低以外，在激光損傷之前和之后測(cè)定了CNV面積。圖18通過(guò)圖示說(shuō)明了在C57bl野生型小鼠和MASP-2(-/-)小鼠中，在激光誘導(dǎo)的損傷后的第7天測(cè)得的CNV體積。如圖18所示，與野生型對(duì)照小鼠相比，MASP-2(-/-)小鼠的CNV面積在激光誘導(dǎo)的損傷后的第7天呈大約30％的減少。

這些觀察結(jié)果表明在MASP(-/-)小鼠與野生型(+/+)對(duì)照中觀察到的VEGF和CNV減少，用抑制劑阻斷MASP-2可能在黃斑變性的治療中具有保護(hù)或治療作用。

實(shí)施例29

本實(shí)施例描述了MASP-2(-/-)在鼠單克隆抗體誘發(fā)的類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型中的結(jié)果。

背景/基本原理：類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)最常用的動(dòng)物模型是膠原誘發(fā)的關(guān)節(jié)炎(CIA)(有關(guān)最新綜述可參見(jiàn)Linton和Morgan，Mol.Immunol.36:905-14，1999)。膠原II型(CII)是關(guān)節(jié)基質(zhì)蛋白的一種主要組分，用天然CII與佐劑免疫通過(guò)對(duì)關(guān)節(jié)軟骨中與CII有交叉反應(yīng)性自體免疫應(yīng)答而誘發(fā)自身免疫性多關(guān)節(jié)炎。同RA一樣，對(duì)CIA的易感性與某些II類(lèi)MHC等位基因的表達(dá)相關(guān)聯(lián)。小鼠的一些品系，包括C57Bl/6品系，對(duì)經(jīng)典CIA具有抗性，因?yàn)樗鼈內(nèi)狈m當(dāng)?shù)腗HC單元型，因此不會(huì)產(chǎn)生高的抗CII抗體效價(jià)。然而，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)經(jīng)靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)給予小鼠4種抗II型膠原的特異性單克隆抗體合劑，可在小鼠所有品系中誘發(fā)一致的關(guān)節(jié)炎。這些致關(guān)節(jié)炎單克隆抗體(arthridogenic monoclonal antibodies)是市售的(Chondrex，Inc.，Redmond，WA)。這種CIA的被動(dòng)轉(zhuǎn)移模型已成功用在多個(gè)近期發(fā)表的采用C57Bl/6小鼠品系的報(bào)道之中(Kagari等，J.Immunol.169:1459-66，2002；Kato等，J.Rheumatol.30:247-55，2003；Banda等，J.Immunol.177:1904-12，2006)。下面的研究對(duì)使用CIA的被動(dòng)轉(zhuǎn)移模型對(duì)野生型(+/+)(WT)與MASP-2(-/-)小鼠發(fā)生關(guān)節(jié)炎的敏感性進(jìn)行了比較，這兩種小鼠具有共同的C57Bl/6遺傳背景。

方法:

動(dòng)物：按照實(shí)施例1所述方法產(chǎn)生MASP-2(-/-)小鼠，并與C57Bl/6回交10代。在本項(xiàng)研究中，使用的14只雄性和雌性C57BL/6野生型小鼠在抗體注射時(shí)為7-8周齡，10只雄性和雌性MASP-2(-/-)和野生型(+/+)C57Bl/6小鼠在抗體注射時(shí)為7-8周齡。20只小鼠用單克隆抗體合劑注射，得到20只一致應(yīng)答小鼠(兩組各10只)。將動(dòng)物(10/組)按5只動(dòng)物/籠關(guān)養(yǎng)，在開(kāi)始研究前使之適應(yīng)5-7天。

在第0天和第1天，給小鼠靜脈內(nèi)注射單克隆抗體合劑(Chondrex，Redmond WA)(5mg)。試驗(yàn)藥物是得自Chondrex公司的單克隆抗體+LPS。在第2天，經(jīng)腹膜內(nèi)給予小鼠LPS。在第0天、第2天、第4天、第6天、第8天、第10天、第12天和(結(jié)束前)第14天，給小鼠稱(chēng)重。在第14天，小鼠用異氟烷麻醉，最終放血用于血清。收集血液后，小鼠處安樂(lè)死，取下帶膝的前后肢，放入福爾馬林中留待將來(lái)處理。

處理組：

第1組(對(duì)照)：4只小鼠，品系C57/BL/6WT(+/+)；

第2組(試驗(yàn))：10只小鼠，品系C57/BL/6WT(+/+)(接受mAb混合物加上LPS)；和

第3組(試驗(yàn))：10只小鼠，品系C57/BL/MASP-2KO/6Ai(-/-)(接受mAb混合物加上LPS)

用以下評(píng)分系統(tǒng)每日評(píng)價(jià)臨床關(guān)節(jié)炎評(píng)分：

0＝正常；1＝1只后爪或前爪關(guān)節(jié)染?。?＝2只后爪或前爪關(guān)節(jié)染?。?＝3只后爪或前爪關(guān)節(jié)染?。?＝中度(紅斑和中度腫脹或4節(jié)指趾關(guān)節(jié)染病)；5＝嚴(yán)重(彌散性紅斑和整只爪嚴(yán)重腫脹，不能伸縮指趾)。

結(jié)果：

圖19顯示用于在長(zhǎng)達(dá)兩周時(shí)間內(nèi)繪制平均每日臨床關(guān)節(jié)炎評(píng)分曲線圖的分組數(shù)據(jù)。在未接受CoL2MoAb處理的對(duì)照組中未觀察到臨床關(guān)節(jié)炎評(píng)分。從第9天到第14天，MASP(-/-)小鼠的臨床關(guān)節(jié)炎評(píng)分較低?？傮w臨床關(guān)節(jié)炎評(píng)分與曲線下面積(AUC)分析表明MASP-2(-/-)組相對(duì)于WT(+/+)小鼠降低了21％。然而，前述C57Bl6小鼠本底無(wú)法提供完整的總體關(guān)節(jié)炎臨床評(píng)分。由于發(fā)病率低，分組數(shù)少，故雖然是肯定的趨勢(shì)，所提供的數(shù)據(jù)卻只是傾向(p＝0.1)，在統(tǒng)計(jì)上沒(méi)有顯著性p<0.05的水平。可能需要處理組中額外的動(dòng)物來(lái)表示統(tǒng)計(jì)上的顯著性。由于關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率降低，所以評(píng)價(jià)了染病爪評(píng)分用于說(shuō)明嚴(yán)重程度。在任一MASP-2(-/-)小鼠中未觀察到臨床關(guān)節(jié)炎評(píng)分>3的單一發(fā)病情況，而在30％WT(+/+)小鼠中則觀察到，這進(jìn)一步表明(1)關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度可能與補(bǔ)體途徑活化有關(guān)，(2)阻斷MASP-2可能對(duì)關(guān)節(jié)炎具有有益效果。

實(shí)施例30

本實(shí)施例證實(shí)，小的甘露糖結(jié)合凝集素結(jié)合蛋白(MAp19或sMAP)是MASP-2依賴(lài)性補(bǔ)體活化的抑制劑。

背景/基本原理：

摘要：

甘露糖結(jié)合凝集素(MBL)和纖維膠凝蛋白是在先天免疫中起作用的模式識(shí)別蛋白，并且通過(guò)MBL相關(guān)的絲氨酸蛋白酶(MASP)觸發(fā)凝集素補(bǔ)體途徑活化。在凝集素途徑活化時(shí)，MASP-2裂解C4和C2。小的MBL相關(guān)蛋白(sMAP)，一種截短形式的MASP-2，同樣與MBL/纖維膠凝蛋白-MASP復(fù)合物締合。為了闡明sMAP的作用，我們通過(guò)定向破壞sMAP特異性外顯子產(chǎn)生了sMAP缺陷型(sMAP-/-)小鼠。因?yàn)榛蚴艿狡茐?，MASP-2的表達(dá)水平在sMAP-/-小鼠中也降低。在缺陷型血清中重組sMAP(rsMAP)和重組MASP-2(rMASP-2)再構(gòu)成MBL-MASP-sMAP復(fù)合物時(shí)，這些重組體與MBL的結(jié)合是競(jìng)爭(zhēng)性的，MBL-MASP-sMAP復(fù)合物的C4裂解活性通過(guò)加入rMASP-2而得到恢復(fù)，然而加入rsMAP削弱了活性。因此，MASP-2對(duì)于C4活化是必不可少的，sMAP在凝集素途徑活化中起著調(diào)節(jié)作用。

緒論：

補(bǔ)體系統(tǒng)介導(dǎo)蛋白酶解的連鎖反應(yīng)和蛋白質(zhì)復(fù)合物的裝配，作為先天性免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)兩者的一部分在生物防御中起著主要作用。哺乳動(dòng)物補(bǔ)體系統(tǒng)由三條活化途徑組成，即經(jīng)典途徑、替代途徑和凝集素途徑(Fujita，Nat.Rev.Immunol.2:346-353(2002)；Walport，N Engl J Med 344:1058-1066(2001))。凝集素途徑提供針對(duì)入侵病原體的第一線防御。這個(gè)途徑的病原體識(shí)別成分甘露糖結(jié)合凝集素(MBL)和纖維膠凝蛋白，能結(jié)合細(xì)菌、病毒和寄生蟲(chóng)表面的一系列糖，并激活MBL相關(guān)的血清蛋白酶(MASP)，從而觸發(fā)下游反應(yīng)級(jí)聯(lián)。將缺乏MBL與各種感染性疾病(特別是在適應(yīng)性免疫系統(tǒng)建立之前的低齡兒童時(shí)期)易感性增加聯(lián)系在一起的許多臨床研究強(qiáng)調(diào)凝集素途徑對(duì)于先天免疫防御的重要性(Jack等，Immunol Rev180:86-99(2001)；Neth等，Infect Immun68:688-693(2000)；Summerfield等，Lancet 345:886-889(1995)；Super等，Lancet 2:1236-1239(1989))。然而，凝集素途徑也是造成補(bǔ)體不良活化的原因，這種補(bǔ)體的不良活化在包括心臟和腎臟缺血/再灌注損傷等許多病理病癥中參與炎癥和組織損傷(de Vries等，Am J Pathol 165:1677-1688(2004)；Fiane等，Circulation108:849-856(2003)；Jordan等，Circulation 104:1413-1418(2001)；Walsh等，J Immunol175:541-546(2005))。

正如上面提及的一樣，凝集素途徑包括通過(guò)MBL和纖維膠凝蛋白的糖識(shí)別(Fujita等，Immunol Rev 198:185-202(2004)；Holmskov等，Annu Rev Immunol 21:547-578(2003)；Matsushita和Fujita，Immunobiology 205:490-497(2002))，這些凝集素與以下成分形成復(fù)合物：MASP-1(Matsushita和Fujita，J Exp Med 176:1497-1502(1992)；Sato等，Int Immunol6:665-669(1994)；Takada等，Biochem Biophys Res Commun 196:1003-1009(1993))、MASP-2(Thiel等，Nature 386:506-510(1997)，MASP-3(Dahl等，Immunity 15:127-135(2001))和MASP-2的截短蛋白(小MBL相關(guān)蛋白；sMAP或MAp19)(Stover等，J Immunol 162:3481-3490(1999)；Takahashi等，Int Immunol 11:859-863(1999))。MASP家族成員由6個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，2個(gè)C1r/C1s/Uegf/骨形成蛋白(CUB)結(jié)構(gòu)域，1個(gè)表皮生長(zhǎng)因子(EGF)樣結(jié)構(gòu)域，2個(gè)補(bǔ)體調(diào)控蛋白(CCP)或短共有重復(fù)序列(short consensus repeat，SCR)結(jié)構(gòu)域和1個(gè)絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域(Matsushita等，Curr Opin Immunol 10:29-35(1998))。MASP-2和sMAP可由單個(gè)結(jié)構(gòu)基因通過(guò)可變剪接而產(chǎn)生，sMAP由第一CUB(CUB1)結(jié)構(gòu)域、EGF樣結(jié)構(gòu)域和sMAP特異性外顯子編碼的C端上的額外4個(gè)氨基酸組成。MASP-1和MASP-3同樣由單個(gè)基因通過(guò)可變剪接產(chǎn)生(Schwaeble等，Immunobiology 205:455-466(2002)。當(dāng)MBL和纖維膠凝蛋白與微生物表面的糖結(jié)合時(shí)，酶原形式的MASP便在第二CCP和蛋白酶結(jié)構(gòu)域之間進(jìn)行切割，產(chǎn)生由2個(gè)多肽組成的活性形式，稱(chēng)為重(H)鏈和輕(L)鏈，因此獲得針對(duì)補(bǔ)體成分的蛋白水解活性。已積累的證據(jù)表明，MASP-2切割C4和C2(Matsushita等，J.Immunol 165:2637-2642(2000))，這導(dǎo)致形成C3轉(zhuǎn)化酶(C4bC2a)。我們假定，MASP-1直接切割C3，隨后激活放大環(huán)路(Matsushita和Fujita，Immunobiology 194:443-448(1995))，但是這個(gè)功能是有爭(zhēng)議的(Ambrus等，J.Immunol 170:1374-1382(2003))。盡管MASP-3在L鏈同樣含有絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域，并且具有針對(duì)合成底物的酶解活性(Zundel等，J Immunol 172:4342-4350(2004))，但是還沒(méi)有鑒定出它的生理底物。仍不清楚缺乏絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域的sMAP的功能。

在本研究中，為了闡明sMAP在凝集素補(bǔ)體途徑活化中的作用，我們破壞了編碼sMAP的C端4個(gè)氨基酸殘基(EQSL)的sMAP特異性外顯子，產(chǎn)生了sMAP-/-小鼠。我們?cè)诖耸状螆?bào)道了sMAP下調(diào)凝集素途徑活化的能力。

材料與方法

小鼠

構(gòu)建了含有外顯子1-4和129/Sv小鼠MASP-2基因外顯子6部分及新霉素抗性基因表達(dá)盒而不是外顯子5的打靶載體(圖20A)。將DT-A基因插入該載體的3'端，并插入3個(gè)lox p位點(diǎn)以便將來(lái)實(shí)施有條件打靶以定向除去新霉素表達(dá)盒和啟動(dòng)子區(qū)。打靶載體通過(guò)電穿孔進(jìn)入129/Sv ES細(xì)胞。將靶向的ES克隆微注射到C57Bl/6J胚泡內(nèi)，將胚泡植入代孕ICR母鼠的子宮內(nèi)。使雄性嵌合小鼠與雌性C57BL/6J小鼠交配以產(chǎn)生雜合(+/-)小鼠。用圖20A中所示的探針，對(duì)用BamH I消化的尾部DNA進(jìn)行DNA印跡分析，篩選出雜合(+/-)小鼠。DNA印跡分析顯示在得自雜合(+/-)小鼠的DNA中有6.5kbp和11kbp條帶(圖20B)。將雜合(+/-)小鼠與C57BL/6J小鼠回交。為了獲得純合(-/-)小鼠，使雜合(+/-)小鼠互交。通過(guò)基于PCR的尾部DNA的基因分型分析來(lái)鑒定純合(-/-)小鼠(C57BL/6J背景)。用外顯子4特異性和neo基因特異性有義引物與外顯子6特異性反義引物的混合物進(jìn)行PCR分析。得自純合(-/-)小鼠的DNA產(chǎn)生了單一的1.8kbp條帶(圖20C)。在所有實(shí)驗(yàn)中，按照Fukushima Medical University的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)方針，來(lái)使用8-12周齡的小鼠。

RNA印跡分析

通過(guò)電泳從野生型(+/+)和純合(-/-)小鼠肝中分離出Poly(A)+RNA(1μg)，轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，與對(duì)sMAP、MASP-2H鏈、MASP-2L鏈或neo基因特異性的³²P標(biāo)記的cDNA探針雜交。剝離出同一膜，與對(duì)甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)特異性的探針再雜交。

定量RT-PCR

用LightCycler系統(tǒng)(Roche Diagnostics)進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。由得自野生型(+/+)和純合(-/-)小鼠肝的60ng poly(A)+RNA合成的cDNA用作實(shí)時(shí)PCR的模板，對(duì)MASP-2H鏈和L鏈及sMAP的cDNA片段進(jìn)行擴(kuò)增和監(jiān)測(cè)。

免疫印跡法

在還原條件下將樣品在10％或12％SDS-聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。用針對(duì)MASP-1的L鏈產(chǎn)生的抗MASP-1抗血清或用針對(duì)得自MASP-2H鏈的肽產(chǎn)生的抗MASP-2/sMAP抗血清，檢測(cè)膜上的蛋白質(zhì)。

檢測(cè)MBL-MASP-sMAP復(fù)合物中的MASP和sMAP

將小鼠血清(20μl)加到含有0.1％(重量/體積)BSA(TBS-Ca²⁺/BSA)的480μl TBS-Ca²⁺緩沖液(20mM Tris-HCl(pH 7.4)，0.15M NaCl和5mM CaCl₂)中，與TBS-Ca²⁺/BSA緩沖液中的40μl 50％甘露聚糖－瓊脂凝膠漿(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)在4℃下溫育30分鐘。溫育之后，各凝膠用TBS-Ca²⁺緩沖液洗滌，將用于SDS-PAGE的樣品緩沖液加到凝膠中。將凝膠煮沸，對(duì)上清液進(jìn)行SDS-PAGE，隨后用免疫印跡法檢測(cè)MBL復(fù)合物中的MASP-1、MASP-2和sMAP。

C4沉積測(cè)定法

用TBS-Ca²⁺/BSA緩沖液將小鼠血清稀釋至100μl。將稀釋的樣品加到甘露聚糖包被的微量滴定孔中，在室溫下溫育30分鐘。各孔用冰冷的洗滌緩沖液(含有0.05％(體積/體積)吐溫20的TBS-Ca²⁺緩沖液)洗滌。洗滌后，將人C4加到每孔中，在冰上溫育30分鐘。各孔用冰冷的洗滌緩沖液洗滌，將HRP綴合的抗人C4多克隆抗體(Biogenesis,Poole,England)加到各孔中。在37℃下溫育30分鐘后，各孔用洗滌緩沖液洗滌，將3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)溶液加到每孔中。顯色后，加入1M H₃PO₄，在450nm下測(cè)量吸光度。

C3沉積測(cè)定法

將小鼠血清用含有0.1％(重量/體積)HSA的BBS緩沖液(4mM巴比妥，145mM NaCl，2mM CaCl₂和1mM MgCl₂，pH 7.4)稀釋至100μl。將稀釋的樣品加到甘露聚糖包被的微量滴定孔中，在37℃下溫育1小時(shí)。各孔用洗滌緩沖液洗滌。洗滌后，將HRP綴合的抗人C3c多克隆抗體(Dako，Glostrup，Denmark)加到每孔中。在室溫下溫育1小時(shí)后，各孔用洗滌緩沖液洗滌并將TMB溶液加到每孔中。按上述方法測(cè)定顏色。

重組體

按前述方法制備重組小鼠sMAP(rsMAP)、rMASP-2和其在絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域的活性位點(diǎn)絲氨酸殘基被取代為丙氨酸殘基的無(wú)活性小鼠MASP-2突變型(MASP-2i)(Iwaki和Fujita，2005)。

MBL-MASP-sMAP復(fù)合物的重構(gòu)

將純合(-/-)小鼠血清(20μl)和不同量的MASP-2i和/或rsMAP在總體積為40μl的TBS-Ca²⁺緩沖液中在冰上溫育過(guò)夜。將混合物與甘露聚糖-瓊脂凝膠漿一起溫育，按照“檢測(cè)MBL-MASP-sMAP復(fù)合物中的MASPs和sMAP”中所述方法檢測(cè)結(jié)合到凝膠上MBL-MASP復(fù)合物中的MASP-2i和rsMAP。

C4沉積活性的重構(gòu)

將純合(-/-)小鼠血清(0.5μl)和不同量的rMASP-2和/或rsMAP在總體積為20μl的TBS-Ca²⁺中在冰上溫育過(guò)夜?；旌衔镉?0μl TBS-Ca²⁺/BSA緩沖液稀釋?zhuān)⒓拥礁事毒厶前坏目字?。按照“C4沉積實(shí)驗(yàn)”中所述方法進(jìn)行之后的所有步驟。

結(jié)果

圖20：sMAP基因的定向破壞。(A)MASP-2/sMAP基因、打靶載體和靶向等位基因的部分限制圖譜。sMAP特異性外顯子(外顯子5)被neo基因表達(dá)盒置換。(B)從雄性嵌合小鼠與雌性C57BL/6J小鼠交配得到子代的基因組DNA的DNA印跡分析。尾部DNA用BamH I消化，與(A)中所示探針雜交。由野生型等位基因得到11kbp條帶，從靶向等位基因得到6.5kbp條帶。(C)PCR基因分型分析。用外顯子4特異性和neo基因特異性有義引物與外顯子6特異性反義引物的混合物，對(duì)尾部DNA進(jìn)行了分析。從野生型等位基因得到2.5kbp條帶，從靶向等位基因得到1.8kb條帶。

圖21：sMAP和MASP-2mRNA在純合(-/-)小鼠中的表達(dá)。(A)RNA印跡分析。使得自野生型(+/+)和純合(-/-)小鼠肝的Poly(A)+RNA進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，與對(duì)sMAP、MASP-2H鏈、MASP-2L鏈或neo基因特異性的³²P標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交。在純合(-/-)小鼠中觀察到對(duì)neo特異性的條帶(2.2kb)。(B)定量RT-PCR。用LightCycler儀器(Roche Diagnostics)通過(guò)實(shí)時(shí)PCR使MASP-2H鏈和L鏈及sMAP cDNA片段擴(kuò)增。從得自野生型(+/+)和純合(-/-)小鼠肝的poly(A)+RNA合成的cDNA用作模板。所示數(shù)據(jù)是兩次實(shí)驗(yàn)的平均值。

圖22：純合(-/-)小鼠血清中缺乏MASP-2。(A)小鼠血清中的MASP-2和sMAP的免疫印跡法。野生型(+/+)或純合(-/-)小鼠血清(2μl)進(jìn)行了免疫印跡法，并用抗MASP-2/sMAP抗血清進(jìn)行了檢測(cè)。(B)MBL-MASP-sMAP復(fù)合物中MASP和sMAP的檢測(cè)。按照材料與方法中所述，將小鼠血清與甘露聚糖-瓊脂糖凝膠一起溫育，檢測(cè)出結(jié)合到凝膠上的MBL復(fù)合物中的sMAP、MASP-1和MASP-2。

圖23：在純合(-/-)小鼠血清中，C4和C3裂解減少。(A)C4沉積在甘露聚糖包被的孔中。將小鼠血清稀釋2倍，在甘露聚糖包被的孔中在室溫下溫育30分鐘。洗滌各孔后，將人C4加到每孔中，在冰上溫育30分鐘。用HRP綴合的抗人C4多克隆抗體，對(duì)沉積在孔中的人C4的量進(jìn)行了測(cè)定。(B)C3沉積在甘露聚糖包被的孔中。將稀釋的小鼠血清加到甘露聚糖包被的孔中，在37℃下溫育1小時(shí)。用HRP綴合的抗人C3c多克隆抗體檢測(cè)出在孔中的內(nèi)源C3沉積。

圖24：sMAP和MASP-2與MBL的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合。(A)純合(-/-)小鼠血清中MBL-MASP-sMAP復(fù)合物的重構(gòu)。將MASP-2i和/或rsMAP(4μg)與純合(-/-)小鼠血清(20μl)一起溫育。將混合物再與甘露聚糖-瓊脂糖凝膠一起溫育，通過(guò)免疫印跡法，在結(jié)合到凝膠上的級(jí)分中檢測(cè)出rsMAP和MASP-2i。(B)將不同量的MASP-2i(0-5μg)和恒定含量的rsMAP(5μg)與純合(-/-)小鼠血清(20μl)一起溫育，再與甘露聚糖-瓊脂糖凝膠一起溫育。(C)恒定量的MASP-2i(0.5μg)和不同量的rsMAP(0-20μg)與純合(-/-)小鼠血清(20μl)一起溫育。(D)不同量的rsMAP(0-20μg)與野生型(+/+)小鼠血清(20μl)一起溫育。

圖25：通過(guò)加入rMASP-2重新恢復(fù)C4沉積活性。將不同量的rsMAP(0-5μg)(A)或rMASP-2(0-1.5μg)(B)與總體積為20μl的TBS-Ca²⁺緩沖液中的0.5μl純合(-/-)小鼠血清在冰上溫育過(guò)夜。然后混合物用80μl TBS-Ca²⁺/BSA緩沖液稀釋?zhuān)偌拥礁事毒厶前坏目字?，測(cè)得C4沉積在孔中的量。

圖26：通過(guò)加入sMAP降低C4沉積活性。(A)將rMASP-2(1μg)和不同量的rsMAP(0-0.5μg)與0.5μl純合(-/-)小鼠血清一起溫育。將混合物加到甘露聚糖包被的孔中，測(cè)得C4沉積在孔中的量。(B)將rsMAP(0-0.7μg)與野生型血清(0.5μl)一起溫育，測(cè)得C4沉積在甘露聚糖包被的孔中的量。

結(jié)果：

sMAP和MASP-2在純合(-/-)小鼠中的表達(dá)

為了闡明sMAP在體內(nèi)的作用，我們建立了缺乏sMAP的基因靶向小鼠。構(gòu)建了打靶載體以便用新霉素抗性基因表達(dá)盒置換對(duì)sMAP特異性的外顯子(外顯子5)(圖20A)。將陽(yáng)性ES克隆注射到C57BL/6胚泡，使建立者嵌合體(founder chimera)與C57BL/6J雌性交配。得自野灰色幼鼠(agouti-color pup)尾部DNA的DNA印跡分析顯示靶向等位基因的胚遺傳(圖20B)。用圖20A中所示的探針，通過(guò)用BamH I消化的尾部DNA進(jìn)行的DNA印跡分析，篩選出雜合(+/-)小鼠。DNA印跡分析顯示得自雜合(+/-)小鼠的DNA的6.5kbp和11kbp條帶(圖20B)。使雜合(+/-)小鼠與C57BL/6J小鼠回交。為了獲得純合(-/-)小鼠，使雜合(+/-)小鼠互交。通過(guò)對(duì)尾部DNA的基于PCR的基因分型，鑒定出產(chǎn)生單一1.8kbp條帶的純合(-/-)小鼠(C57BL/6J背景)(圖20C)。

純合(-/-)小鼠正常發(fā)育，在體重上與野生型(+/+)小鼠沒(méi)有顯著差異。兩者之間在形態(tài)學(xué)上也沒(méi)有差異。在RNA印跡分析中，在野生型(+/+)小鼠中，sMAP特異性的探針檢測(cè)到單一的0.9kb條帶，而在純合(-/-)小鼠中沒(méi)有檢測(cè)出特異性條帶(圖21A)。使用對(duì)MASP-2H鏈或L鏈特異性的探針時(shí)，在野生型(+/+)小鼠中檢測(cè)出若干條特異性條帶，與之前報(bào)道的一樣(Stover等，1999)，H鏈特異性探針也檢測(cè)出sMAP特異性條帶。然而，在純合(-/-)小鼠中，相應(yīng)的條帶非常弱，并檢測(cè)到幾條額外的條帶。我們還進(jìn)行了定量RT-PCR分析，以檢查sMAP和MASP-2mRNA的表達(dá)水平。在純合(-/-)小鼠中，sMAP mRNA的表達(dá)被完全破壞，MASP-2的表達(dá)也明顯降低：通過(guò)實(shí)時(shí)PCR定量測(cè)定，大約為野生型(+/+)小鼠的H鏈和L鏈兩條鏈表達(dá)的2％(圖21B)。此外，我們還研究了在蛋白質(zhì)水平上的MASP-2表達(dá)。通過(guò)免疫印跡法，在純合(-/-)小鼠血清既未檢出sMAP也未檢出MASP-2(圖22A)。在純合(-/-)小鼠血清與甘露聚糖-瓊脂糖凝膠一起溫育后，在結(jié)合到凝膠上的級(jí)分中未檢出sMAP和MASP-2，盡管在復(fù)合物中檢測(cè)到MASP-1(圖22B)。

在純合(-/-)小鼠血清中通過(guò)凝集素途徑的C4和C3的裂解活性

當(dāng)將純合(-/-)小鼠血清在甘露聚糖包被的孔中溫育，人C4沉積在孔中的量大約是從1/400至1/50稀釋范圍的正常血清的20％(圖23A)。我們還研究了純合(-/-)小鼠血清中凝集素途徑的C3沉積活性。將小鼠血清加到甘露聚糖包被的孔中，測(cè)得內(nèi)源C3沉積在孔中的量。該含量在缺陷型血清中減少，是1/10稀釋的正常血清的21％(圖23B)。

純合(-/-)小鼠血清中MBL-MASP-sMAP復(fù)合物的重構(gòu)

當(dāng)將重組小鼠sMAP(rsMAP)或無(wú)活性小鼠MASP-2突變型(MASP-2i)加到純合(-/-)小鼠血清中，兩個(gè)重組體都能夠結(jié)合MBL(圖24A，泳道3和4)。當(dāng)rsMAP和MASP-2i與血清同時(shí)溫育時(shí)(圖24A，泳道5)，在MBL-MASP-sMAP復(fù)合物檢測(cè)到兩個(gè)重組體。然而，結(jié)合到復(fù)合物上的sMAP的量小于當(dāng)僅rsMAP與血清溫育的量。于是我們進(jìn)一步研究了sMAP和MASP-2與MBL的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合。將恒定量的rsMAP和不同量的MASP-2i加到缺陷型血清中。rsMAP的結(jié)合以劑量依賴(lài)性方式隨著MASP-2i量的增加而減少(圖24B)。相反，結(jié)合到MBL上的MASP-2i的量隨著rsMAP的加入而減少(圖24C)。當(dāng)將rsMAP加到野生型血清中時(shí)，結(jié)合到MBL的內(nèi)源sMAP和MASP-2兩者都以劑量依賴(lài)性方式減少(圖24D)。

純合(-/-)小鼠血清中C4沉積活性的重構(gòu)

我們用重組體進(jìn)行了在甘露聚糖包被孔中C4沉積的重構(gòu)實(shí)驗(yàn)。當(dāng)將rsMAP加到缺陷型血清中時(shí)，C4沉積的量實(shí)際上以劑量依賴(lài)性方式減少至基礎(chǔ)水平(圖25A)。當(dāng)將rMASP-2加到血清中時(shí)，C4的量以劑量依賴(lài)性方式最多恢復(fù)至野生型血清的46％，并達(dá)到平臺(tái)期(圖25B)。接著，我們研究了sMAP對(duì)C4沉積的作用。當(dāng)將恒定量的rMASP-2和不同量的rsMAP加到缺陷型血清中時(shí)，C4的沉積量以劑量依賴(lài)性方式隨著rsMAP的加入而減少(圖26A)，將rsMAP加入到野生型血清中同樣也減少C4沉積量(圖26B)，這就表明sMAP在凝集素途徑活化中起著調(diào)節(jié)作用。

討論

我們通過(guò)定向破壞sMAP特異性外顯子從而產(chǎn)生了sMAP-/-小鼠。MASP-2的表達(dá)水平在這些小鼠的mRNA和蛋白質(zhì)水平上也極大地降低(圖21和圖22)。用MASP-2探針的RNA印跡分析顯示得自sMAP-/-小鼠的poly(A)+RNA中僅有額外條帶，這表明了MASP-2基因的正常剪接被sMAP基因的打靶所改變，因此，MASP-2的表達(dá)水平明顯降低。結(jié)果，與正常血清中的相比，在缺陷型血清中，經(jīng)MBL-MASP復(fù)合物裂解的C4減少大約80％(圖23A)。重構(gòu)實(shí)驗(yàn)中，C4裂解活性通過(guò)加入rMASP-2而不是rsMAP而得到恢復(fù)(圖25)。缺陷型血清中所觀察到的C4沉積的減少可能是由MBL-MASP復(fù)合物中缺乏MASP-2所引起的(圖22B)。因此，顯而易見(jiàn)的是MASP-2對(duì)C4通過(guò)MBL-MASP復(fù)合物的活化是必需的。然而，rMASP-2的加入并不完全恢復(fù)裂解活性，而且C4的沉積達(dá)到了平臺(tái)期。與之前的報(bào)道一樣(Cseh等，J Immunol 169:5735-5743(2002)；Iwaki和Fujita，J Endotoxin Res11:47-50(2005))，大多數(shù)rMASP-2在純化過(guò)程中通過(guò)自身活化而轉(zhuǎn)變成活性形式，一些則喪失了蛋白酶活性。因?yàn)镸ASP-2的活性或無(wú)活性狀態(tài)對(duì)其與MBL的締合沒(méi)有重要影響(Zundel等，J Immunol 172:4342-4350(2004))，很可能喪失其蛋白酶活性的rMASP-2結(jié)合至MBL上，競(jìng)爭(zhēng)性妨礙了活性形式的結(jié)合，從而導(dǎo)致了C4沉積的不完全恢復(fù)。凝集素途徑的C3裂解活性在缺陷型血清中也同樣減弱(圖23B)。C3沉積量的減少大概是由C3轉(zhuǎn)化酶活性水平非常低所致，C3轉(zhuǎn)化酶由通過(guò)MASP-2產(chǎn)生的C4b和C2a片段組成。

MASP和sMAP各自締結(jié)成同型二聚體，所形成的復(fù)合物通過(guò)其N(xiāo)端CUB和EGF樣結(jié)構(gòu)域與MBL或L-纖維膠凝蛋白結(jié)合(Chen和Wallis，J Biol Chem 276:25894-25902(2001)；Cseh等，J Immunol 169:5735-5743(2002)；Thielens等，J Immunol 166:5068-5077(2001)；Zundel等，J Immunol 172:4342-4350(2004))。sMAP和MASP-2的CUB1-EGF-CUB2節(jié)段的晶體結(jié)構(gòu)揭示了其同型二聚體結(jié)構(gòu)(Feinberg等，EMBO J 22:2348-2359(2003)；Gregory等，J Biol Chem 278:32157-32164(2003))。MBL的膠原樣結(jié)構(gòu)域參與了與MASP的締合(Wallis和Cheng，J Immunol 163:4953-4959(1999)；Wallis和Drickamer，J Biol Chem 279:14065-14073(1999))，引入該結(jié)構(gòu)域的一些突變使得MBL與MASP-1和MASP-2的CUB1-EGF-CUB2節(jié)段的結(jié)合減弱(Wallis和Dodd，J Biol Chem 275:30962-30969(2000))。MASP-2的結(jié)合部位與MASP-1/3的結(jié)合部位重疊但不相同(Wallis等，J Biol Chem279:14065-13073(2004))。盡管還沒(méi)有鑒定出MBL的sMAP結(jié)合部位，但是sMAP和MASP-2的結(jié)合部位大概是相同的，因?yàn)镃UB1-EGF區(qū)與sMAP和MASP-2中的相同。因此，有理由認(rèn)為sMAP和MASP-2在MBL-MASP-sMAP復(fù)合物的重構(gòu)中相互競(jìng)爭(zhēng)以結(jié)合MBL(圖24)。sMAP對(duì)于MBL的親和性比MASP-2的低(Cseh等，J Immunol 169:5735-5743(2002)；Thielens等，J Immunol 166:5068-5077(2001))。仍然沒(méi)有測(cè)得小鼠血清中sMAP的濃度。然而，如圖22A所示，野生型血清中sMAP的量比MASP-2中的大得多。因此，sMAP能夠占據(jù)MASP-2/sMAP結(jié)合部位，并妨礙MASP-2與MBL結(jié)合，因此，MBL-MASP復(fù)合物的C4裂解活性降低。sMAP在凝集素途徑中的調(diào)節(jié)機(jī)制有待研究。尚不清楚sMAP是在補(bǔ)體活化之前還是在之后起調(diào)節(jié)作用。sMAP可能防止在微生物感染之前MBL-MASP復(fù)合物隨意活化，或者抑制凝集素途徑一經(jīng)激活后發(fā)生過(guò)度活化。在凝集素途徑中存在另外的潛在調(diào)節(jié)因子。MASP-3也是MASP-2結(jié)合MBL的競(jìng)爭(zhēng)者，并下調(diào)MASP-2的C4裂解活性和C2裂解活性(Dahl等，Immunity 15:127-135(2001))。盡管尚未研究sMAP與MASP-3之間的相互作用，但是很可能它們能夠協(xié)同下調(diào)凝集素途徑的活化。

在本報(bào)告中我們證實(shí)了sMAP和MASP-2競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合到MBL上，且sMAP具有下調(diào)凝集素途徑的能力，該途徑被MBL-MASP復(fù)合物激活。有理由認(rèn)為，sMAP還調(diào)節(jié)由纖維膠凝蛋白-MASP復(fù)合物激活的凝集素途徑的另一條路線。MASP-2和sMAP還競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合小鼠纖維膠凝蛋白A，并下調(diào)纖維膠凝蛋白A-MASP復(fù)合物的C4裂解活性(Y Endo等，準(zhǔn)備中)。最近報(bào)道了對(duì)MBL失效小鼠的研究(Shi等，J Exp Med 199：1379-1390(2004))。MBL失效小鼠在MBL凝集素途徑中不具備C4裂解活性，易受金黃色葡萄球菌感染。在本研究中，同樣缺失MASP-2的sMAP-/-小鼠顯示，除在凝集素途徑中的C4裂解活性以外，C3裂解活性還有降低。因?yàn)閟MAP缺陷型小鼠的調(diào)理活性受損，所以它們易受細(xì)菌感染。對(duì)sMAP缺陷型小鼠的進(jìn)一步研究將闡明凝集素途徑在針對(duì)感染性疾病的保護(hù)中的功能。

另一個(gè)重要的發(fā)現(xiàn)是，將rsMAP加到正常血清中導(dǎo)致C4活化降低(圖26B)。已經(jīng)證實(shí)凝集素途徑在若干器官中調(diào)節(jié)炎癥和組織損傷(de Vries等，Am J Pathol 165:1677-1688(2004)；Fiane等，Circulation 108:849-856(2003)；Jordan等，Circulation 104:1413-1418(2001)；Walsh等，J Immunol 175:541-546(2005))。在進(jìn)行胸腹主動(dòng)脈動(dòng)脈瘤治療的MBL缺陷型患者中，補(bǔ)體沒(méi)有被激活，促炎標(biāo)記的水平在手術(shù)后降低(Fiane等，Circulation108:849-856(2003))。已積累的證據(jù)證實(shí)了在各種血管床的缺血和再灌注等病癥期間MBL可能的病理生理作用。因此，特異性阻斷MBL或抑制凝集素補(bǔ)體途徑可能代表著用于防止缺血/再灌注有關(guān)損傷的治療相關(guān)性策略。因此，sMAP可能是這類(lèi)抑制劑中的一個(gè)侯選者，因?yàn)樗米髂赝緩交罨娜趸?attenuator)。

實(shí)施例31

本實(shí)施例證明MASP-2負(fù)責(zé)C3的C4旁路活化。

背景/基本原理：最近，有研究表明抑制替代途徑保護(hù)腎免于缺血性急性衰竭(Thurman等，J.Immunol 170:1517-1523(2003))。本文所示數(shù)據(jù)意味著凝集素途徑指導(dǎo)替代途徑活化，替代途徑進(jìn)而又協(xié)同放大補(bǔ)體活化。我們假設(shè)，凝集素途徑的瞬時(shí)抑制還可影響替代途徑活化，因此在限制補(bǔ)體介導(dǎo)的移植物損傷和炎癥時(shí)，可改善器官移植的長(zhǎng)期結(jié)果，并且可緩和不必要的針對(duì)移植物的適應(yīng)性免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)，降低通過(guò)適應(yīng)性免疫系統(tǒng)所致的繼發(fā)性移植物排斥的風(fēng)險(xiǎn)。這得到了最新臨床數(shù)據(jù)的支持，這些數(shù)據(jù)表明由于遺傳的MBL缺陷(存在于大約30％的人群中)所導(dǎo)致的部分受損的凝集素途徑，與人的腎同種異體移植物存活率提高有關(guān)(Berge，Am J Transplant5:1361-1366(2005))。

采用基因靶向小鼠品系，在一過(guò)性腸缺血和肌肉缺血模型中，充分證明了補(bǔ)體成分C3和C4參與缺血-再灌注(I/R)損傷(Weiser等，J Exp Med 183:2342-2348(1996)；Williams等J Appl Physiol86:938-42，(1999))。還充分證明了C3在腎I/R損傷和繼發(fā)性移植物排斥中具有顯著作用(Zhou等，J Clin Invest105:1363-1371(2000)；Pratt等，Nat Med 8:582-587(2002)；Farrar等，Am J.Pathol 164:133-141(2004))。然而，預(yù)料不到的是在已公布的小鼠腎同種異體移植物排斥模型中沒(méi)有觀察到C4缺陷型的表型(Lin，2005，待發(fā)表)。然而，隨后對(duì)這些C4缺陷型小鼠的血清和血漿的分析表明，這些小鼠保持殘留的功能活性，表現(xiàn)在C3的LP依賴(lài)性裂解和進(jìn)一步的下游補(bǔ)體活化(參見(jiàn)圖27C)。

功能性C4旁路(和C2旁路)的存在是一些研究人員之前描述過(guò)的現(xiàn)象(但沒(méi)有充分表征)(Miller等，Proc Natl Acad Sci 72:418-22(1975)；Knutzen Steuer等，J Immunol143(7):2256-61(1989)；Wagner等，J Immunol 163:3549-3558(1999)，與在C4(和C2)缺陷型血清中的不依賴(lài)替代途徑的C3更新有關(guān)。

方法：凝集素途徑和經(jīng)典途徑對(duì)C3沉積的作用。將小鼠血漿(用EGTA/Mg²⁺作為抗凝血?jiǎng)?在4.0mM巴比妥、145mM NaCl、2.0mM CaCl₂、1.0mM MgCl₂(pH 7.4)中稀釋并再鈣化，然后加到甘露聚糖(如圖27A和27C所示)或酵母聚糖(如圖27B所示)包被的微量滴定板，在37℃下溫育90分鐘。板用10mM Tris-Cl、140mM NaCl、5.0mM CaCl₂、0.05％吐溫20(pH 7.4)洗滌3次，然后用抗小鼠C3c抗體測(cè)得C3b沉積。

結(jié)果：圖27A-C中所示結(jié)果代表著3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。當(dāng)在用免疫球蛋白復(fù)合物而不是甘露聚糖或酵母聚糖包被的孔中使用同一血清時(shí)，在WT(+/+)小鼠血清和合并的MASP-2(-/-)血清中觀察到C3b沉積和B因子裂解，但在C1q耗盡血清未觀察到(數(shù)據(jù)未顯示)。這就表明了當(dāng)通過(guò)CP活性提供最初的C3b時(shí)，在MASP-2-/-血清中可以恢復(fù)替代途徑活化。圖27C表示預(yù)料不到的觀察結(jié)果，即在C4(-/-)缺陷型血漿中可以凝集素途徑依賴(lài)的方式有效地激活C3。這種“C4旁路”通過(guò)血漿與可溶性甘露聚糖或甘露糖預(yù)溫育抑制凝集素途徑活化而被完全破壞。

可以觀察到，C3b沉積在甘露聚糖和酵母聚糖上嚴(yán)重危及MASP-2(-/-)缺陷型小鼠的安全，即使在按照以前已發(fā)表論文的實(shí)驗(yàn)條件下，所述論文認(rèn)為替代途徑活化應(yīng)為所有三條途徑所容許。如圖27A-C中所示，MASP-2(-/-)缺陷型小鼠血漿不通過(guò)凝集素途徑激活C4，不裂解C3，既不通過(guò)凝集素途徑也不通過(guò)替代途徑。因此我們假設(shè)MASP-2是這條C4旁路所必需的。Teizo Fujita教授最近報(bào)道了在鑒定很可能參與凝集素途徑依賴(lài)性C4旁路的成分的進(jìn)一步進(jìn)展。與Fujita's MASP-1/3缺陷型小鼠品系雜交的C4缺陷型小鼠的血漿喪失了C4缺陷型血漿通過(guò)凝集素途徑裂解C3的殘留能力。這通過(guò)將重組MASP-1加到C4和MASP-1/3缺陷型的組合血漿中而得以恢復(fù)(Takahashi，Mol Immunol 43:153(2006)，這表明MASP-1參與了在C4不存在下裂解C3的凝集素途徑衍生的復(fù)合物的形成(重組MASP-1不裂解C3，但它卻裂解C2；Rossi等，J Biol Chem 276:40880-7(2001)；Chen等，J Biol Chem279:26058-65(2004))。我們觀察到MASP-2是形成該旁路所必需的。

盡管需要更多的功能和定量參數(shù)以及組織學(xué)研究來(lái)鞏固這一初步研究，但是其初步結(jié)果為通過(guò)凝集素途徑的補(bǔ)體活化是造成腎I/R損傷的病理生理學(xué)的重要原因的假設(shè)提供了強(qiáng)有力的支持，正如MASP-2-/-小鼠顯示的腎功能更快恢復(fù)一樣。

實(shí)施例32

本實(shí)施例證明，凝血酶激活能夠在生理?xiàng)l件下在凝集素途徑激活之后發(fā)生，并且證明MASP-2牽涉的程度。在正常大鼠血清中，凝集素途徑的激活導(dǎo)致與補(bǔ)體活化(以C4沉積來(lái)評(píng)定)同時(shí)發(fā)生的凝血酶激活(以凝血酶沉積來(lái)評(píng)定)。如在圖28A和圖28B中可見(jiàn)，這個(gè)系統(tǒng)中的凝血酶激活由MASP-2封閉性抗體(Fab2形式)抑制，顯示出類(lèi)似補(bǔ)體活化的曲線(圖28A)的抑制濃度-應(yīng)答曲線(圖28B)。這些數(shù)據(jù)暗示，在外傷中發(fā)生時(shí)的凝集素途徑的激活將在完全依賴(lài)于MASP-2的過(guò)程中導(dǎo)致補(bǔ)體系統(tǒng)和凝血系統(tǒng)兩者的激活。根據(jù)推理，MASP-2封閉性抗體在過(guò)度系統(tǒng)性凝血例如彌散性血管內(nèi)凝血的減輕病例中可證明有效，過(guò)度系統(tǒng)性凝血是在主要外傷病例中導(dǎo)致死亡率的標(biāo)志之一。

實(shí)施例33

本實(shí)施例提供在MASP-2-/-缺陷小鼠和MASP-2+/+充足小鼠中使用彌散性血管內(nèi)凝血("DIC")的局部Schwartzman反應(yīng)模型以評(píng)估凝集素途徑在DIC中的作用所產(chǎn)生的結(jié)果。

背景/基本原理：

如上文所述，MASP-2的阻斷抑制凝集素途徑激活并且減少過(guò)敏毒素C3a和C5a兩者的生成。在體外，C3a過(guò)敏毒素能夠顯示為強(qiáng)有力的血小板凝聚體，但它們的體內(nèi)牽涉較少被明確定義，并且傷口修復(fù)中的血小板物質(zhì)和纖溶酶的釋放可僅次要地牽涉補(bǔ)體C3。在本實(shí)施例中，在MASP-2(-/-)和WT(+/+)小鼠中分析了凝集素途徑的作用，以便解決C3激活的延時(shí)上升是否為引起彌散性血管內(nèi)凝血所必需。

方法：

如實(shí)施例27中所述產(chǎn)生用于本研究的MASP-2(-/-)小鼠。局部Schwartzman反應(yīng)模型被用于本實(shí)驗(yàn)中。局部Schwartzman反應(yīng)(LSR)是一種脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的應(yīng)答，該應(yīng)答具有來(lái)自先天性免疫系統(tǒng)的細(xì)胞元件和體液元件的充分表征的作用。LSR對(duì)補(bǔ)體的依賴(lài)是非常確定的(Polak,L.等人，Nature 223:738-739(1969)；Fong J.S.等人，J Exp Med 134:642-655(1971))。在LSR模型中，用TNFα(500ng，陰囊內(nèi))預(yù)處理小鼠達(dá)4小時(shí)，然后使小鼠麻醉并且準(zhǔn)備用于提睪肌的活體顯微鏡檢查。選擇具有良好血流(1-4mm/s)的毛細(xì)血管后微靜脈(15-60μm直徑)網(wǎng)用于觀察。用熒光抗體處理動(dòng)物以選擇性標(biāo)記嗜中性粒細(xì)胞或血小板。順序掃描血管網(wǎng)，并且數(shù)字記錄所有血管的圖像用于后面的分析。在記錄微循環(huán)的基本狀況之后，小鼠接受了單一LPS(100μg)的靜脈內(nèi)注射，其單獨(dú)注射或與下列藥劑一同注射。然后每10分鐘掃描同一血管網(wǎng)達(dá)1小時(shí)。熒光團(tuán)的特異性累積通過(guò)本底熒光的扣除來(lái)識(shí)別，并且通過(guò)確定圖像的閾值而增強(qiáng)。反應(yīng)的量級(jí)根據(jù)記錄的圖像測(cè)定。Schwartzman反應(yīng)的初步測(cè)定是凝集數(shù)據(jù)。

所述研究比較了暴露于已知的補(bǔ)體途徑耗竭劑眼鏡蛇毒因子(CVF)或終末途徑抑制劑(C5aR拮抗劑)的MASP-2+/+充足或野生型小鼠。結(jié)果(圖29A)證明，CVF以及C5aR拮抗劑兩者均防止了脈管系統(tǒng)中凝集體的出現(xiàn)。另外，MASP-2-/-缺陷小鼠(圖29B)也證明了局部Schwartzman反應(yīng)的完全抑制，支持凝集素途徑的牽涉。這些結(jié)果清楚地證明MASP-2在DIC發(fā)生中的作用，并且支持利用MASP-2抑制劑治療和預(yù)防DIC。

實(shí)施例34

本實(shí)施例描述鼠心肌缺血/再灌注模型中的MASP-2(-/-)小鼠的分析。

背景/基本原理：

為了評(píng)定MASP-2對(duì)冠狀動(dòng)脈的缺血性損傷之后的炎性再灌注損害的作用，在如Marber等人，J.Clin Invest.95:1446-1456(1995)所述的鼠缺血/再灌注(MIRP)模型中和在Langendorff分離灌注小鼠心臟模型中比較了MASP-2(-/-)和MASP-2(+/+)小鼠。

方法：

如實(shí)施例27中所述產(chǎn)生用于本研究的MASP-2(-/-)小鼠。使用實(shí)施例27中所述的方法在八只WT(MASP-2(+/+))小鼠和十一只MASP-2(-/-)小鼠中實(shí)施左心室的缺血性損傷。如實(shí)施例27中所述，梗塞尺寸(INF)和危險(xiǎn)區(qū)(AAR)由測(cè)面積法確定。

Langendorff分離-灌注小鼠心臟模型：制備來(lái)自小鼠的心臟用于Langendorff分離-灌注小鼠心臟模型的方法按照F.J.Sutherland等人，Pharmacol Res 41:613(2000)中所述實(shí)施。也參見(jiàn)A.M.Kabir等人，Am J Physiol Heart Circ Physiol 291:H1893(2006)；Y.Nishino等人，Circ Res 103:307(2008)和I.G.Webb等人，Cardiovasc Res(2010)。

簡(jiǎn)要描述，用戊巴比妥(300mg/kg)和肝素(150單位)腹膜內(nèi)麻醉六只雄性WT(+/+)小鼠和九只雄性MASP-2(-/-)小鼠。心臟被迅速分離并且放在冰冷的改性Krebs-Henselit緩沖液(KH,118.5mmol/l NaCl、25.0mmol/l NaHCO₃、4.75mmol KCl、KH₂PO₄ 1.18、MgSO₄1.19、D-葡萄糖 11.0以及CaCl₂ 1.41)中。將切除的心臟安裝到具有水套的Langendorff設(shè)備上，并且用95％O₂和5％CO₂平衡的KH緩沖液在80mm Hg的恒壓下逆行灌注。灌注液的溫度維持在37℃。插入左心室的充滿流體的球囊監(jiān)測(cè)了可收縮功能。逐漸使該球囊膨脹，直到舒張末期壓在1mm Hg到7mm Hg。用0.075mm銀絲(Advent)以580bpm進(jìn)行心房起搏。冠脈血流通過(guò)灌注液的定時(shí)收集來(lái)測(cè)定。

體外梗塞評(píng)定

在逆行灌注開(kāi)始之后，使心臟穩(wěn)定達(dá)30分鐘?？偫ǘ?，所有心臟不得不滿足以下標(biāo)準(zhǔn)：冠脈血流量在1.5至4.5mL/min，心率>300bpm(非起搏)，左心室形成壓>55mm Hg，從開(kāi)胸術(shù)到主動(dòng)脈插管的時(shí)間<3min，并且在穩(wěn)定化期間沒(méi)有持續(xù)的節(jié)律障礙。然后在無(wú)血清的情況下實(shí)施全心缺血和再灌注。然后所有心臟通過(guò)夾住主動(dòng)脈流入管經(jīng)受30分鐘的全心缺血，繼之以2小時(shí)的再灌注。

電起搏在缺血期間收縮停止時(shí)終止，并且重新啟動(dòng)30分鐘進(jìn)入再灌注。在2小時(shí)的再灌注之后，用5ml溶于KH的1％氯化三苯基四唑(triphenyl tetrazolium chloride；TTC)灌注心臟達(dá)1分鐘，并且然后在37℃下將心臟放在相同的溶液中達(dá)10分鐘。然后除去心房，并且將心臟吸干、稱(chēng)重，并且-20℃儲(chǔ)存達(dá)至多1周。

然后將心臟解凍，放在2.5％戊二醛中達(dá)1分鐘，并且置入5％瓊脂糖中。然后使用振動(dòng)切片機(jī)(Agar Scientific)以0.7mm切片從頂端向底座切斷瓊脂糖心臟塊。切片后，在4℃下將切片轉(zhuǎn)移至PBS中達(dá)外加的一天以前，在室溫下將切片放在10％甲醛中過(guò)夜。然后切片在Perspex板(相隔0.57mm)之間壓縮并且使用掃描儀(Epson model G850A)成像。放大之后，使用圖像分析軟件(SigmaScan Pro 5.0,SPSS)和整體的表面積進(jìn)行測(cè)面積法，并且TTC陰性的左心室心肌通過(guò)與組織厚度相乘而變換為體積。在每一心臟內(nèi)，在個(gè)體切片的求和之后，將TTC陰性的梗塞體積表示為左心室容積的百分比或?qū)ψ笮氖胰莘e作圖。

結(jié)果：

梗塞區(qū)域的尺寸(蒼白)，危險(xiǎn)左心室(LV)區(qū)(紅色)和正常灌注的LV區(qū)帶(藍(lán)色)通過(guò)它們的顏色外觀和顏色邊界的鑒定而在各個(gè)切片中描出輪廓。區(qū)域在每一切片的兩面上定量并且由研究者進(jìn)行平均。將梗塞體積計(jì)算為各個(gè)動(dòng)物的風(fēng)險(xiǎn)區(qū)帶的％(％RZ)。

圖31A示出八只WT(+/+)小鼠和十一只MASP-2(-/-)小鼠經(jīng)歷上述冠狀動(dòng)脈閉塞和再灌注技術(shù)之后，對(duì)它們的梗塞尺寸的測(cè)定的評(píng)估。圖31A將平均危險(xiǎn)區(qū)(AAR，受缺血影響的區(qū)域的度量)和梗塞體積(INF，對(duì)心肌的損害的度量)圖示為總心肌體積的百分比。如圖31A中所示，盡管兩個(gè)組之間的AAR沒(méi)有差異，但MASP-2(-/-)小鼠中的INF體積與它們的WT同窩相比顯著減少，因而指示在MIRP的這個(gè)模型中沒(méi)有MASP-2的情況下免于心肌損傷的保護(hù)效應(yīng)。

圖31B將INF對(duì)AAR作圖之間的關(guān)系圖示為左心室(LV)心肌體積的％。如圖31B中所示，對(duì)于任何給定的AAR，MASP-2(-/-)動(dòng)物與它們的WT同窩相比顯示它們的梗塞尺寸的高度顯著的減少。

圖31C和31D示出根據(jù)Langendorff分離-灌注小鼠心臟模型制備的WT(+/+)和MASP-2(-/-)小鼠的緩沖液灌注心臟的心肌梗塞的結(jié)果，其中全心缺血和再灌注在無(wú)血清的情況下實(shí)施。如圖31C和圖31D中所示，在MASP-2(-/-)小鼠的心臟與WT(+/+)小鼠的心臟之間沒(méi)有觀察到所得梗塞體積(INF)的差異，暗示圖31A和圖31B中所示的梗塞尺寸的差異是由血漿因子引起，而不是由MASP-2(-/-)小鼠的心肌組織對(duì)缺血性損害的較低易感性引起。

總之，這些結(jié)果證明，MASP-2缺乏在鼠心肌缺血/再灌注模型中缺血心臟的再灌注之后顯著降低心肌損傷，并且支持利用MASP-2抑制劑治療和預(yù)防缺血/再灌注損傷。

實(shí)施例35

本實(shí)施例描述鼠腎移植模型中的MASP-2(-/-)小鼠的分析。

背景/基本原理：

利用小鼠模型評(píng)定MASP-2在腎移植的功能性后果中的作用。

方法：

利用將單腎同基因移植至單側(cè)腎切除后的受體小鼠中評(píng)定腎移植的功能性后果，其中使用六只WT(+/+)移植受體(B6)和六只MASP-2(-/-)移植受體。為了評(píng)定移植腎的功能，在移植后第5天從受體除去殘存的天然腎，并且通過(guò)血尿素氮(BUN)水平的測(cè)定在24小時(shí)之后評(píng)定腎功能。

結(jié)果：

圖32圖示W(wǎng)T(+/+)受體和MASP-2(-/-)受體中腎移植后第6天的腎的血尿素氮(BUN)水平。如圖32中所示，在WT(+/+)(B6)移植受體內(nèi)觀察到大大升高的BUN水平(小鼠中的正常BUN水平<5mM)，指示腎衰竭。相反，MASP-2(-/-)同基因移植受體小鼠顯示顯著較低的BUN水平，暗示改善的腎功能。已注意到，這些結(jié)果是利用來(lái)自WT(+/+)腎供體的移植物而獲得的，暗示僅僅移植受體中的功能性凝集素途徑的缺少就足以實(shí)現(xiàn)治療益處。

總之，這些結(jié)果表明，經(jīng)由MASP-2抑制的凝集素途徑的瞬時(shí)抑制在腎移植中提供降低發(fā)病率和延遲的移植物功能的方法，并且此方法可能適用于其他移植情況。

實(shí)施例36

本實(shí)施例證明，MASP-2(-/-)小鼠在鼠多微生物敗血癥腹膜炎模型中是抗敗血癥休克的。

背景/基本原理：

為了評(píng)估MASP-2(-/-)在感染中的潛在作用，評(píng)估了盲腸結(jié)扎和穿刺(CLP)模型，其為一種多微生物敗血癥腹膜炎的模型。這個(gè)模型被認(rèn)為最精確地模擬人敗血癥腹膜炎的過(guò)程。盲腸結(jié)扎和穿刺(CLP)模型是其中盲腸由針結(jié)扎和穿刺、導(dǎo)致細(xì)菌連續(xù)滲漏進(jìn)入腹腔、細(xì)菌經(jīng)由淋巴引流到達(dá)血液并且然后分布至所有腹器官中、導(dǎo)致多器官衰竭和敗血癥休克的模型(Eskandari等人，J Immunol 148(9):2724-2730(1992))。CLP模型模擬患者中觀察到的敗血癥的過(guò)程，并且誘發(fā)早期高炎性應(yīng)答，繼之以明顯的低炎性階段。在這個(gè)階段期間，動(dòng)物對(duì)細(xì)菌激發(fā)高度敏感(Wichterman等人，J.Surg.Res.29(2):189-201(1980))。

方法：

如實(shí)施例23中所述在WT(+/+)(n＝18)和MASP-2(-/-)(n＝16)小鼠中測(cè)定利用盲腸結(jié)扎和穿刺(CLP)模型的多微生物感染的死亡率。簡(jiǎn)述之，將MASP-2缺陷小鼠和它們的野生型同窩麻醉，并且取出盲腸并且在遠(yuǎn)端上方30％處結(jié)扎。其后，用0.4mm直徑的針穿刺盲腸一次。然后將盲腸放到腹腔中，并且用夾具閉合皮膚。在CLP后14天的時(shí)期內(nèi)監(jiān)測(cè)經(jīng)受了CLP的小鼠的存活。CLP后16小時(shí)在小鼠中收集腹膜灌洗液以測(cè)定細(xì)菌負(fù)載。腹膜灌洗液的連續(xù)稀釋物在PBS中制備并且在Mueller Hinton板中接種，隨后在厭氧條件下37℃溫育達(dá)24小時(shí)，之后測(cè)定細(xì)菌負(fù)載。

在肺和脾中CLP之后16小時(shí)，對(duì)細(xì)菌感染的TNF-α細(xì)胞因子應(yīng)答也在WT(+/+)和MASP-2(-/-)小鼠中經(jīng)由定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)測(cè)定。在WT(+/+)和MASP-2(-/-)小鼠中CLP之后16小時(shí)，TNF-α的血清水平也通過(guò)夾心ELISA定量。

結(jié)果：

圖33將CLP處理的動(dòng)物的存活百分比圖示為CLP操作之后天數(shù)的函數(shù)。如圖33中所示，與WT(+/+)小鼠相比，MASP-2(-/-)小鼠中的凝集素途徑缺乏不增加利用盲腸結(jié)扎和穿刺模型的多微生物感染后的小鼠的死亡率。然而，如圖34中所示，與它們的WT(+/+)同窩相比時(shí)，MASP-2(-/-)小鼠顯示了CLP之后腹膜灌洗液中顯著更高的細(xì)菌負(fù)載(細(xì)菌數(shù)增加大約1000倍)。這些結(jié)果表明，MASP-2(-/-)缺陷小鼠是抗敗血癥休克的。此模型中的MASP-2缺陷小鼠中減少的細(xì)菌清除可能歸因于削弱的C3b介導(dǎo)的吞噬作用，因?yàn)樽C明了C3沉積是MASP-2依賴(lài)性的。

已測(cè)定，與WT(+/+)對(duì)照相比，MASP-2(-/-)小鼠中的對(duì)細(xì)菌感染的TNF-α細(xì)胞因子應(yīng)答沒(méi)有升高(未顯示數(shù)據(jù))。同樣已測(cè)定，與TNF-α的血清水平保持幾乎不變的MASP-2(-/-)小鼠相反，在CLP后的16小時(shí)，WT(+/+)小鼠中存在顯著更高的TNF-α的血清濃度。這些結(jié)果暗示，對(duì)敗血癥狀況的強(qiáng)烈炎性應(yīng)答在MASP-2(-/-)小鼠中得到緩和，并且允許動(dòng)物在更高細(xì)菌計(jì)數(shù)的情況下存活。

總之，這些結(jié)果證明就敗血癥而言凝集素途徑補(bǔ)體活化的潛在有害效應(yīng)和壓倒性敗血癥的患者中增加的死亡率。這些結(jié)果進(jìn)一步證明，MASP-2缺乏調(diào)節(jié)炎性免疫反應(yīng)并且降低敗血癥期間炎性介質(zhì)的表達(dá)水平。因此認(rèn)為，通過(guò)給予對(duì)抗MASP-2的抑制性單克隆抗體抑制MASP-2(-/-)將有效減少患有敗血癥休克的受試者中的炎性應(yīng)答。

實(shí)施例37

本實(shí)施例描述鼠鼻內(nèi)感染性模型中MASP-2(-/-)小鼠的分析。

背景/基本原理：

綠膿假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一種革蘭氏陰性機(jī)會(huì)性人細(xì)菌性病原體，該病原體引起大范圍的感染，特別是在免疫受損的個(gè)體中。它是獲得性醫(yī)院感染的主要來(lái)源，特別是醫(yī)院獲得性肺炎。它也在囊性纖維化(CF)患者中造成顯著的發(fā)病率和死亡率。綠膿假單胞菌肺感染的特征在于強(qiáng)的嗜中性粒細(xì)胞募集和導(dǎo)致廣泛組織損傷的顯著的肺臟炎癥(PalankiM.S.等人，J.Med.Chem 51:1546-1559(2008))。

在本實(shí)施例中，進(jìn)行研究以確定MASP-2(-/-)小鼠中的凝集素途徑的去除是否增加小鼠對(duì)細(xì)菌感染的易感性。

方法：

用綠膿假單胞菌菌株的鼻內(nèi)給藥激發(fā)22只WT(+/+)小鼠、22只MASP-2(-/-)小鼠和11只C3(-/-)小鼠。所述小鼠在感染后受監(jiān)測(cè)超過(guò)六天，并且構(gòu)建Kaplan-Mayer曲線，顯示存活百分比。

結(jié)果：

圖35是感染后六天WT(+/+)、MASP-2(-/-)或C3(-/-)小鼠的存活百分比的Kaplan-Mayer曲線。如圖35中所示，與WT(+/+)小鼠比較，在MASP-2(-/-)小鼠中未觀察到差異。然而，C3(-/-)小鼠中經(jīng)典(C1q)途徑的去除導(dǎo)致對(duì)細(xì)菌感染的嚴(yán)重的易感性。這些結(jié)果證明，MASP-2抑制不增加對(duì)細(xì)菌感染的易感性，表明有可能通過(guò)抑制MASP-2來(lái)減少外傷患者中不希望的炎性并發(fā)癥而不減損患者利用經(jīng)典補(bǔ)體途徑抗感染的能力。

實(shí)施例38

本實(shí)施例描述如實(shí)施例24中所述鑒定的代表性高親和力抗MASP-2Fab2抗體的藥效分析。

背景/基本原理：

如實(shí)施例24中所述，為了識(shí)別封閉大鼠凝集素途徑的高親和力抗體，利用大鼠MASP-2蛋白淘選噬菌體展示文庫(kù)。這個(gè)文庫(kù)經(jīng)設(shè)計(jì)以提供高免疫多樣性并且完全利用人類(lèi)免疫球蛋白基因序列而構(gòu)建。如實(shí)施例24中所示，通過(guò)ELISA篩選識(shí)別了大約250個(gè)獨(dú)立的噬菌體克隆，所述噬菌體克隆以高親和力與大鼠MASP-2蛋白結(jié)合。這些克隆的測(cè)序鑒定了50個(gè)獨(dú)特的MASP-2抗體編碼噬菌體。由這些克隆表達(dá)Fab2蛋白，純化和分析Fab2蛋白的MASP-2結(jié)合親和力和凝集素補(bǔ)體途徑功能性抑制。

如實(shí)施例24的表6中所示，具有功能性封閉活性的17個(gè)抗MASP-2Fab2被鑒定為此分析的結(jié)果(對(duì)于封閉性抗體而言，34％命中率)。凝集素補(bǔ)體途徑通過(guò)Fab2的功能性抑制在C4沉積的水平上是明顯的，C4沉積的水平是由MASP-2進(jìn)行的C4裂解的直接度量。重要地，當(dāng)評(píng)定C3轉(zhuǎn)化酶活性時(shí)，抑制同樣明顯，證明凝集素補(bǔ)體途徑的功能性阻斷。如實(shí)施例24中所述識(shí)別的所述17個(gè)MASP-2封閉性Fab2有力地抑制C3轉(zhuǎn)化酶形成，其IC₅₀值等于或小于10nM。所識(shí)別的17個(gè)Fab2中的八個(gè)具有亞納摩爾范圍內(nèi)的IC₅₀值。此外，所有17個(gè)MASP-2封閉性Fab2在凝集素途徑C3轉(zhuǎn)化酶試驗(yàn)中給出C3轉(zhuǎn)化酶形成的基本完全的抑制，如圖11A至圖11C中所示，并且概括在實(shí)施例24的表6中。此外，表6中所示的17個(gè)封閉性抗MASP-2Fab2中的每一個(gè)有力地抑制C3b生成(>95％)，因而證明本試驗(yàn)針對(duì)凝集素途徑C3轉(zhuǎn)化酶的特異性。

大鼠IgG2c和小鼠IgG2a全長(zhǎng)抗體同種型變體來(lái)源于Fab2#11。本實(shí)施例描述這些同種型對(duì)于藥效參數(shù)的體內(nèi)表征。

方法：

如實(shí)施例24中所述，大鼠MASP-2蛋白用于淘選Fab噬菌體展示文庫(kù)，F(xiàn)ab2#11是從該文庫(kù)中鑒定的。大鼠IgG2c和小鼠IgG2a全長(zhǎng)抗體同種型變體來(lái)源于Fab2#11。大鼠IgG2c和小鼠IgG2a全長(zhǎng)抗體同種型均如下在體內(nèi)對(duì)于藥效參數(shù)進(jìn)行表征。

小鼠中的體內(nèi)研究：

在小鼠中進(jìn)行藥效研究，以研究抗MASP-2抗體給藥對(duì)體內(nèi)血漿凝集素途徑活性的作用。在此研究中，在凝集素途徑試驗(yàn)中，在小鼠抗MASP-2MoAb(來(lái)源于Fab2#11的小鼠IgG2a全長(zhǎng)抗體同種型)的0.3mg/kg或1.0mg/kg的皮下(sc)和腹膜內(nèi)(ip)給藥之后的不同時(shí)間點(diǎn)離體測(cè)定C4沉積。

圖36圖示凝集素途徑特異性C4b沉積，其在取自小鼠(n＝3小鼠/組)的未稀釋的血清樣品中、在小鼠抗MASP-2MoAb的0.3mg/kg或1.0mg/kg皮下給藥之后的不同時(shí)間點(diǎn)離體測(cè)定。在抗體給藥之前收集的來(lái)自小鼠的血清樣品充當(dāng)陰性對(duì)照(100％活性)，而體外補(bǔ)充了100nM的同樣的封閉性抗MASP-2抗體的血清用作陽(yáng)性對(duì)照(0％活性)。

圖36中所示的結(jié)果證明在小鼠抗MASP-2MoAb的1.0mg/kg劑量皮下給藥之后的C4b沉積的快速和完全的抑制。在小鼠抗MASP-2MoAb的0.3mg/kg劑量的皮下給藥之后，觀察到C4b沉積的部分抑制。

小鼠抗MASP-2MoAb在小鼠中以0.6mg/kg單次腹膜內(nèi)給藥之后，跟蹤凝集素途徑恢復(fù)的時(shí)間過(guò)程達(dá)三個(gè)星期。如圖37中所示，凝集素途徑活性的急劇下降發(fā)生在抗體給藥之后，繼之以腹膜內(nèi)給藥后持續(xù)約7天的完全的凝集素途徑抑制。經(jīng)過(guò)第二和第三周，觀察到凝集素途徑活性的緩慢恢復(fù)，小鼠中完全的凝集素途徑恢復(fù)則是在抗MASP-2MoAb給藥后17天。

這些結(jié)果證明，來(lái)源于Fab2#11的小鼠抗MASP-2MoAb在全身輸送時(shí)以劑量響應(yīng)的方式抑制小鼠的凝集素途徑。

實(shí)施例39

本實(shí)施例描述對(duì)來(lái)源于Fab2#11的小鼠抗MASP-2MoAb在年齡相關(guān)黃斑變性小鼠模型中效力的分析。

背景/基本原理：

如實(shí)施例24中所述，大鼠MASP-2蛋白用于淘選Fab噬菌體展示文庫(kù)，F(xiàn)ab2#11從該文庫(kù)中鑒定為功能活性抗體。大鼠IgG2c和小鼠IgG2a同種型的全長(zhǎng)抗體由Fab2#11產(chǎn)生。如實(shí)施例38中所述表征了小鼠IgG2a同種型的全長(zhǎng)抗MASP-2抗體的藥效參數(shù)。在本實(shí)施例中，在年齡相關(guān)黃斑變性(AMD)的小鼠模型中分析了來(lái)源于Fab2#11的小鼠抗MASP-2全長(zhǎng)抗體，該小鼠模型由Bora P.S.等人，J Immunol 174:491-497(2005)描述。

方法：

如中實(shí)施例38所述的來(lái)源于Fab2#11的小鼠IgG2a全長(zhǎng)抗MASP-2抗體同種型在年齡相關(guān)黃斑變性(AMD)的小鼠模型中測(cè)試，如實(shí)施例28中所述并具有以下修改。

小鼠抗MASP-2MoAb的給藥

將兩種不同劑量(0.3mg/kg和1.0mg/kg)的小鼠抗MASP-2MoAb連同同種型對(duì)照MoAb處理一起在CNV誘發(fā)之前16小時(shí)腹膜內(nèi)注射至WT(+/+)小鼠(n＝8小鼠/組)。

脈絡(luò)膜新生血管形成(CNV)的誘發(fā)：

利用如實(shí)施例28中所述的激光凝固進(jìn)行脈絡(luò)膜新生血管形成(CNV)的誘發(fā)和CNV體積的測(cè)定。

結(jié)果：

圖38圖示在用同種型對(duì)照MoAb或小鼠抗MASP-2MoAb(0.3mg/kg和1.0mg/kg)處理的小鼠中激光損傷后7天測(cè)定的CNV面積。如圖38中所示，在用1.0mg/kg抗MASP-2MoAb預(yù)處理的小鼠中，激光處理后七天觀察到CNV的統(tǒng)計(jì)顯著的(p<0.01)大約50％減少。如圖38中進(jìn)一步示出，觀察到0.3mg/kg劑量的抗MASP-2MoAb對(duì)減少CNV并不有效。注意到，0.3mg/kg劑量的抗MASP-2MoAb顯示出在皮下給藥之后具有C4b沉積的部分和瞬時(shí)抑制，如實(shí)施例38中所述和圖36中所示。

本實(shí)施例中所述的結(jié)果證明，利用抑制劑(諸如抗MASP-2MoAb)的MASP-2的阻斷在黃斑變性的治療中具有預(yù)防和/或治療作用。注意到，這些結(jié)果與實(shí)施例28中所述的在MASP-2(-/-)小鼠中進(jìn)行的研究中觀察到的結(jié)果一致，其中，與野生型對(duì)照小鼠相比，在MASP-2(-/-)小鼠中觀察到激光處理后7天的CNV的30％減少。此外，本實(shí)施例中的結(jié)果進(jìn)一步證明，全身輸送的抗MASP-2抗體在眼內(nèi)提供局部的治療益處，從而強(qiáng)調(diào)全身性給藥途徑治療AMD患者的潛力。概括而言，這些結(jié)果提供支持在AMD的治療中利用MASP-2MoAb的證據(jù)。

實(shí)施例40

本實(shí)施例證明，與野生型對(duì)照小鼠相比，MASP-2缺陷小鼠受到保護(hù)而免于腦膜炎奈瑟氏菌感染后的腦膜炎奈瑟氏菌誘發(fā)的死亡率，并且具有增強(qiáng)的菌血癥清除。

基本原理：腦膜炎奈瑟氏菌是異養(yǎng)革蘭氏陰性雙球菌，它在腦膜炎及其他形式的腦膜炎球菌疾病(諸如腦膜炎球菌血癥)中的作用是已知的。腦膜炎奈瑟氏菌是兒童期間的致病率和死亡率的主要誘因。嚴(yán)重的并發(fā)癥包括敗血癥、華-弗綜合征Waterhouse-Friderichsen syndrome)、腎上腺機(jī)能不全和彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)。見(jiàn)例如Rintala E.等人，Critical Care Medicine28(7):2373-2378(2000)。在本實(shí)施例中，在MASP-2(-/-)和WT(+/+)小鼠中分析凝集素途徑的作用，以便解決MASP-2缺陷小鼠是否會(huì)對(duì)腦膜炎奈瑟氏菌誘發(fā)的死亡率敏感。

方法：

如實(shí)施例27中所述產(chǎn)生MASP-2敲除小鼠。10周大的MASP-2KO小鼠(n＝10)和野生型C57/B6小鼠(n＝10)通過(guò)靜脈內(nèi)注射被接種一劑5×10⁸cfu/100μl、2×10⁸cfu/100μl或3×10⁷cfu/100μl的溶于400mg/kg右旋糖酐鐵的腦膜炎奈瑟氏菌血清群A Z2491。監(jiān)測(cè)感染后的小鼠的存活超過(guò)72小時(shí)時(shí)間周期。感染后，以每小時(shí)一次的間隔從小鼠采集血樣，并且分析所述血樣以測(cè)定腦膜炎奈瑟氏菌的血清水平(log cfu/ml)，以便驗(yàn)證感染并且測(cè)定細(xì)菌從血清的清除率。

結(jié)果：

圖39A圖示在5×10⁸/100μl cfu感染劑量的腦膜炎奈瑟氏菌給藥之后，MASP-2KO小鼠和WT小鼠的存活百分比。如圖39A中所示，在用5×10⁸/100μl cfu的最高劑量的腦膜炎奈瑟氏菌感染之后，100％的MASP-2KO小鼠在感染后的72小時(shí)期間自始至終存活。相反，僅20％的WT小鼠在感染后的24小時(shí)仍然活著。這些結(jié)果證明，MASP-2缺陷小鼠受到保護(hù)而免于腦膜炎奈瑟氏菌誘發(fā)的死亡率。

圖39B圖示取自用5×10⁸cfu/100μl腦膜炎奈瑟氏菌感染的MASP-2KO小鼠和WT小鼠的血樣中在不同時(shí)間點(diǎn)回收的腦膜炎奈瑟氏菌的log cfu/ml。如圖39B中所示，在WT小鼠中，血液中的腦膜炎奈瑟氏菌水平在感染后24小時(shí)達(dá)到約6.5log cfu/ml的峰值，并且在感染后48小時(shí)下降到零。相反，在MASP-2KO小鼠中，腦膜炎奈瑟氏菌水平在感染后6小時(shí)達(dá)到約3.5log cfu/ml的峰值，并且在感染后36小時(shí)下降到零。

圖40A圖示MASP-2KO小鼠和WT小鼠在由2×10⁸cfu/100μl腦膜炎奈瑟氏菌感染之后的存活百分比。如圖40A中所示，在用2×10⁸cfu/100μl劑量的腦膜炎奈瑟氏菌感染之后，100％的MASP-2KO小鼠在感染后的72小時(shí)期間自始至終存活。相反，僅80％的WT小鼠在感染后24小時(shí)仍然活著。與圖39A中所示的結(jié)果一致，這些結(jié)果進(jìn)一步證明，MASP-2缺陷小鼠受到保護(hù)而免于腦膜炎奈瑟氏菌誘發(fā)的死亡率。

圖40B圖示取自用2×10⁸cfu/100μl腦膜炎奈瑟氏菌感染的WT小鼠的血樣中在不同時(shí)間點(diǎn)回收的腦膜炎奈瑟氏菌的log cfu/ml。如圖40B中所示，用2×10⁸cfu感染的WT小鼠的血液中的腦膜炎奈瑟氏菌水平在感染后12小時(shí)達(dá)到約4log cfu/ml的峰值，并且在感染后24小時(shí)下降到零。圖40C圖示取自用2×10⁸cfu/100μl腦膜炎奈瑟氏菌感染的MASP-2KO小鼠的血樣中在不同時(shí)間點(diǎn)回收的腦膜炎奈瑟氏菌的log cfu/ml。如圖40C中所示，用2×10⁸cfu感染的MASP-2KO小鼠的血液中的腦膜炎奈瑟氏菌水平在感染后2小時(shí)達(dá)到約3.5log cfu/ml的峰水平，并且在感染后3小時(shí)下降到零。與圖39B中所示的結(jié)果一致，這些結(jié)果證明，盡管用與WT小鼠相同劑量的腦膜炎奈瑟氏菌感染MASP-2KO小鼠，但與WT相比，MASP-2KO小鼠具有增強(qiáng)的菌血癥清除。

在用3×10⁷cfu/100μl的最低劑量的腦膜炎奈瑟氏菌感染之后，MASP-2KO和WT小鼠的存活百分比在72小時(shí)時(shí)期處為100％(未顯示數(shù)據(jù))。

討論

這些結(jié)果顯示，與WT小鼠相比，MASP-2缺陷小鼠受到保護(hù)而免于腦膜炎奈瑟氏菌誘發(fā)的死亡率，并且具有增強(qiáng)的菌血癥清除。因此，鑒于這些結(jié)果預(yù)期，MASP-2抑制劑(諸如MASP-2MoAb)的治療應(yīng)用將被期待以有效治療、預(yù)防或減輕腦膜炎奈瑟氏菌感染的影響(即，敗血癥和DIC)。此外，這些結(jié)果表明，MASP-2抑制劑(諸如MASP-2MoAb)的應(yīng)用不會(huì)將受試者預(yù)置于染上腦膜炎奈瑟氏菌感染的增大的風(fēng)險(xiǎn)中。

雖然描述并說(shuō)明了優(yōu)選的實(shí)施方案，但是應(yīng)當(dāng)理解的是，可以在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的情況下在其中進(jìn)行各種修改。