專利名稱：：用于預(yù)防和治療補體相關(guān)紊亂的CRlg多肽的制作方法用于預(yù)防和治療補體相關(guān)紊亂的CRIg多肽發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明關(guān)注最近發(fā)現(xiàn)的巨噬細(xì)胞特異受體CRIg(早先稱為STIgMA),及其在預(yù)防和/或治療補體相關(guān)紊亂中的用途，包括補體相關(guān)眼狀況，諸如年齡相關(guān)黃斑變性(AMD)和脈絡(luò)膜新血管形成(CNV)。
背景技術(shù)：
：補體系統(tǒng)是由一系列血清糖蛋白構(gòu)成的復(fù)雜酶級聯(lián)，所述血清糖蛋白通常以無活性的原酶(pro-enzyme)形式存在。三種主要途徑，經(jīng)典途徑和旁^各途徑，可活化補體，它們在C3水平歸并，其中兩種相似的C3轉(zhuǎn)變酶將C3切割成C3a和C3b。另一種途徑，甘露糖結(jié)合凝集素(MBL)途徑也已有記載。經(jīng)典途徑成分以C和數(shù)值標(biāo)注(例如C1、C3)。鑒于它們鑒定的順序，前四種成分的編號為Cl、C4、C2和C3。旁路途徑成分以字母表明(例如B、P、D)。切割片段以該成分名稱后續(xù)的小寫字母命名(例如C3a和C3b是C3的片l殳)。無活性C3b命名為iC3b。補體蛋白的多肽鏈以該成分后的希臘字母命名(例如C3a和C3P是C3的a和卩鏈)。C3的細(xì)胞膜受體縮寫為CR1、CR2、CR3和CR4。補體系統(tǒng)的經(jīng)典途徑是人免疫應(yīng)答體液分支的主要效應(yīng)物。激活經(jīng)典途徑和MBL途徑的拍j幾或是與抗原結(jié)合的IgG或IgM抗體或是耙細(xì)"包上的;疑集素?？贵w對抗原的結(jié)合暴露了抗體上作為第一補體成分Cl的結(jié)合位點的位點。Cl結(jié)合至少兩個與抗原結(jié)合的抗體的暴露區(qū)域，結(jié)果是其Clr和Cls亞基受到活化?；罨蟮腃ls負(fù)責(zé)下面兩種所涉及補體成分C4和C2的切割。C4切割成兩個片段，其中較大的C4b分子附著于附近的靶膜，而較小的C4a分子離去。沉積的C4b上的一個暴露位點可供與下面一種補體成分C2相互作用。正如在前一個步驟中，活化后的Cls將C2分子切割成兩段，其中片段C2a保留，而較小的C2b片段離去。C4b2a，也稱為C3轉(zhuǎn)變酶，保持與膜結(jié)合。此C3轉(zhuǎn)變酶將下一種補體成分C3轉(zhuǎn)變成其活性形式。補體旁路途徑的激活在C3b與細(xì)胞壁和病原體的其它細(xì)胞成分和/或與IgG抗體結(jié)合時開始。然后因子B與結(jié)合細(xì)胞的C3b聯(lián)合，形成C3bB。C3bB然后由因子B分裂成Bb和Ba,以形成旁路途徑C3轉(zhuǎn)變酶C3bBb。然后備解素，一種血清蛋白質(zhì)，結(jié)合C3bBb，形成作為C3轉(zhuǎn)變酶發(fā)揮功能的C3bBbP,它將C3分子酶促分裂成C3a和C3b。此時，補體旁路途徑受到激活。有些C3b結(jié)合C3bBb以形成C3bBb3b，它能夠?qū)5分子分裂成C5a和C5b。旁路途徑是一種自我放大途徑，而且在不存在抗體時在細(xì)菌和其它病原體的清除和識別中是重要的。旁路途徑還可在由凝集素和/或經(jīng)典途徑初始激活補體后放大補體激活。人中旁路途徑激活的限速步驟是因子D對因子B切割成旁路途徑C3轉(zhuǎn)變酶C3bBb的酶促作用(Stahletal.,AmericanJournalofPathology162:449-455(2003))。補體激活和沉積在佐劑誘發(fā)的關(guān)節(jié)炎(AIA)和膠原誘發(fā)的關(guān)節(jié)炎(CIA)中及多種其它疾病和狀況中的角色有強大的證據(jù)。最近，有缺陷的旁路途徑控制牽涉進(jìn)腎病和眼病的形成，包括溶血性尿毒癥綜合征(HUS)和AMD(Zipfeletal.,Mol.Immunol.43:97-106(2006),可在線獲得www.sciencedirect.com)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)C3對于小鼠中CNV的形成是關(guān)鍵的(Boraetal.,J.Immunol.174(1):491-7(2005》。補體系統(tǒng)在炎性狀況和相關(guān)組織損傷、自身免疫病和補體相關(guān)疾病中的角色也是眾所周知的。已經(jīng)提出旁^各途徑在炎癥(Mollnesetal.，TrendsinImmunology23:61-64(2002))、局部的及缺血和再灌注后的遠(yuǎn)端組織損傷(Stahletal"見上文)；成人呼吸窘迫綜合征(ARDS;Scheinetal.,Chest91:850-854(1987));心肺旁路手術(shù)過程中的補體激活(Fungetal，JThoracCardiovascSurg122:113-122(2001));皮肌炎(Kissel，JTetal.，NEJM314:329-334(1986));和天皰瘡(Honguchietal"JInvestDermatol92:588-592(1989))中扮演重要角色。補體旁路途徑還已牽涉進(jìn)自身免疫病，諸如例如狼瘡腎炎及由此發(fā)生的腎小球腎炎和血管炎(參見例如Watanabeetal.，J.Immunol.164:786-794(2000))和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，諸如幼發(fā)型類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Aggarwaletal.,Rheumatology29:189-192(2000);NeumannE.etal.，ArthritisRheum.4:934-45(2002))。補體沉積和活化的局部增加與疾病的嚴(yán)重程度有關(guān)(Atkinson,JClinInvest112:1639-1641(2003))。C5a受體拮抗劑，諸如肽和有才幾小分子，已經(jīng)測試用于治療關(guān)節(jié)炎(Woodrufetal.,Arthritis&Rheumatism46(9):2476-2485(2002))和多種其它免疫炎性疾病(Shortetal.，BrJPharmacol126:551-554(1999);Finchetal.,JMedChem42:1965-1074(1999));而諸如Promics(Australia)等公司已經(jīng)在進(jìn)行人體臨床試驗以測試C5a拮抗劑在類似適應(yīng)癥中的功效。C5a還已牽涉進(jìn)皮肌炎和天皰瘙(Kissel,JTetal.,NEJM314:329-334(1986))?？笴5a單克隆抗體還已顯示出降低心肺轉(zhuǎn)流術(shù)和心臟4f^專誘發(fā)的冠狀動脈內(nèi)皮功能障礙(Toftikujietal.,J.Thorac.Cardiovasc.Surg.116:1060-1069(1998)),預(yù)防膠原誘發(fā)的關(guān)節(jié)炎，和改善已確立的疾病(Wangetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA92(19):8955-8959(1995》。調(diào)理吞噬作用(Opsonophagocytosis)，即補體片段在顆粒表面上沉積和吞噬細(xì)胞隨后攝取的過程，對于循環(huán)顆粒，包括免疫復(fù)合物、凋亡細(xì)胞或細(xì)胞碎片、和病原體的清除是至關(guān)緊要的(Gasque,P.,MolImmunol.41:1089-1098(2004))。駐留組織的巨噬細(xì)胞已知在補體介導(dǎo)的從循環(huán)中清除顆粒中扮演重要角色。Kupffer細(xì)胞，占駐留組織的巨噬細(xì)胞的90%以上，連續(xù)暴露于來自肝門靜脈的血液，且在戰(zhàn)略上位于肝血竇中以/人胃腸道中有效清除調(diào)理后的病毒、腫瘤細(xì)胞、細(xì)菌、真菌、寄生蟲和有害物質(zhì)。此清除過程在纟艮大程度上依賴補體C3作為調(diào)理素的存在(Fujitaetal.,Immunol.Rev.198:185-202(2004))。在經(jīng)由硫酯與細(xì)菌表面結(jié)合時，C3受到切割，并放大補體旁路途徑。此反應(yīng)導(dǎo)致C3片段的進(jìn)一步沉積，它可充當(dāng)巨噬細(xì)胞上補體受體的配體。此途徑的重要性體現(xiàn)在缺乏C3的人對細(xì)菌和病毒感染的高易感性。迄今已表征的補體受體CR1、3和4只在PKC激活或Fc受體刺激后內(nèi)在化C3b和吞噬C3調(diào)理的顆粒(Carpentieretal.,CellRegul2:41-55(1991);Sengelov，Crit.Rev.Immunol.15:107-131(1995);Sengelovetal"J.Immunol.153:804-810(1994))。此外，CR1不在鼠Kupffer細(xì)胞的表面上表達(dá)(Fangetal.,J.Immunol.160:5273-5279(1998))。幫助KC組成性清除循環(huán)顆粒的補體受體迄今尚無記載?？笴3b(i)抗體已有報道增強補體激活、C3b(i)沉積、和rituximab對CD20+細(xì)胞的殺傷(Kennedyetal.，Blood101(3):1071-1079(2003》。鑒于已知補體級聯(lián)牽涉多種疾病，需要鑒定和開發(fā)新的藥品用于預(yù)防和/或治療補體相關(guān)疾病。發(fā)明概述本發(fā)明基于補體受體家族的一個新成員和與補體系統(tǒng)相互作用的第一免疫球蛋白(Ig)超家族成員的鑒定。一方面，本發(fā)明關(guān)注用于預(yù)防或治療補體相關(guān)眼狀況的方法，包括對有需要的受試者施用預(yù)防或治療有效量的補體抑制物，諸如補體旁路途徑的抑制物，例如CRIg多肽或其激動劑。補體相關(guān)眼狀況可以是例如年齡相關(guān)黃斑變性(AMD)、脈絡(luò)膜新血管形成(CNV)、葡萄膜炎、糖尿病性和其它缺血相關(guān)視網(wǎng)膜病變、眼內(nèi)炎、糖尿病性黃斑水肺、病理性近視、馮希-林二氏(vonHippel-Lindau)病、目艮的組織胞漿菌病、視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞(CRVO)、角膜新血管形成和視網(wǎng)膜新血管形成。優(yōu)選的是，所述補體相關(guān)眼狀況是AMD或CNV,包括這些狀況的所有階段。另一方面，本發(fā)明關(guān)注用于預(yù)防AMD形成或發(fā)展的方法，包括對在至少一只眼中有風(fēng)險形成AMD或i貪斷有AMD的受試者施用有效量的補體抑制物，諸如補體旁路途徑的抑制物，例如CRIg多肽或其激動劑。又一方面，本發(fā)明關(guān)注用于治療干性AMD的方法，包括對有需要的受試者施用治療有效量的補體抑制物，諸如旁路途徑的抑制物，例如CRIg多肽或其激動劑。在所有實施方案中，CRIg多肽可以例如選自SEQIDNO:2，4,6和8的CRIg多肽和所述多肽的胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)。CRIg多肽，包括全長多肽及其ECD,可與免疫球蛋白序列，諸如免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)序列，例如Fc區(qū)融合，而所得免疫粘附素可作為CRIg激動劑用于本發(fā)明的預(yù)防和治療方法。免疫球蛋白優(yōu)選是IgG,諸如IgG-l、IgG-2、IgG-3、或lgG-4，更優(yōu)選IgG-l或IgG-3。IgGl重鏈恒定區(qū)序列可至少包含鉸鏈、CH2和CH3區(qū)，或者例如CH1、鉸鏈、CH2和CH3區(qū)。又一方面，本發(fā)明關(guān)注用于預(yù)防或治療補體相關(guān)疾病或狀況的方法，包括用預(yù)防或治療有效量的補體抑制物，諸如旁^各途徑的抑制物，例如CRIg多肽或其激動劑處理有需要的受試者。另一方面，本發(fā)明關(guān)注用于在哺乳動物中抑制C3b補體片段生成的方法，包括對所述哺乳動物施用有效量的補體抑制物，諸如旁路途徑的抑制物，例如CRIg多肽或其激動劑。又一方面，本發(fā)明關(guān)注用于在哺乳動物中選4奪性抑制補體旁路途徑的方法，包括對所述哺乳動物施用有效量的CRIg多肽或其激動劑。在所有方面，CRIg多肽可以例如選自SEQIDNO:2，4,6,8的CRIg多肽和所述多肽的胞外區(qū)。所述激動劑優(yōu)選是上文所述CRIg-Ig融合蛋白(免疫粘附素)。所述免疫球蛋白序列可以是例如免疫球蛋白恒定區(qū)序列，諸如免疫球蛋白重鏈的恒定區(qū)序列。在另一個實施方案中，所述免疫球蛋白重《連恒定區(qū)序列與SEQIDNO:2,4，6或8的CRIg多肽的胞外區(qū)融合。在又一個實施方案中，所述免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)序列是IgG，諸如IgG-1或IgG-3的，其中IgG-1重鏈恒定區(qū)序列可例如至少包含鉸鏈、CH2和CH3區(qū)，或者鉸鏈、CH1、CH2和CH3區(qū)。補體相關(guān)疾病可以是例如炎性疾病或自身免疫病。在一個具體的實施方案中，所述補體相關(guān)疾病選自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)、缺血和再灌注后的遠(yuǎn)端組織損傷(remotetissueinjury)、心肺旁路手術(shù)過程中的補體激活、皮肌炎、天皰瘡、《良疳腎炎及由此發(fā)生的腎小球腎炎和血管炎、心肺轉(zhuǎn)流術(shù)、心臟停搏誘發(fā)的冠狀動脈內(nèi)皮功能障礙(coronaryendothelialdysfunction)、II型膜性增生性腎小球腎炎、IgA腎病、急性腎衰竭、冷球蛋白血癥、抗磷脂綜合征、年齡相關(guān)黃斑變性、葡萄膜炎、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、同種移植、超急性排斥反應(yīng)、血液透析、'l"曼性阻塞性月市應(yīng);敫綜合4i(chronicocclusivepulmonarydistresssyndrome)、哮喘、阿耳茨海默氏(Alzheimer)病、動脈粥樣硬化、遺傳性血管性水腫、陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿和吸入性肺炎。在另一個具體的實施方案，所述補體相關(guān)疾病選自炎性腸病(IBD)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、幼發(fā)型慢性關(guān)節(jié)炎、脊推關(guān)節(jié)病、系統(tǒng)性硬化(硬皮病)、特發(fā)性炎性肌病(皮肌炎、多肌炎)、斯耶格倫氏(Sj6gren)綜合征、系統(tǒng)性血管炎、結(jié)節(jié)病、自身免疫性溶血性貧血(免疫性全血細(xì)胞減少、陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿)、自身免疫性血小板減少(特發(fā)性血小板減少性紫癜、免疫介導(dǎo)的血小板減少)、曱狀腺炎(格雷夫斯氏(Graves)病、橋本氏(Hashimoto)曱狀腺炎、幼發(fā)型淋巴細(xì)胞性曱狀腺炎、萎縮性曱狀腺炎)、糖尿病、免疫介導(dǎo)的腎病(腎小球腎炎、腎小管間質(zhì)性腎炎)、中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的脫髓鞘病諸如多發(fā)性硬化、特發(fā)性多神經(jīng)病、肝膽病諸如傳染性肝炎(曱型、乙型、丙型、丁型、戊型和其它非嗜肝病毒肝炎)、自身免疫性慢性活動性肝炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化、肉芽腫性肝炎、和硬化性膽管炎、炎性和纖維化肺病(例如嚢性纖維化病)、麩膠敏感性腸病、惠普爾氏(Whipple)病、自身免疫或免疫介導(dǎo)的皮膚病包括大皰性皮膚病、多形紅斑和4妄觸性皮炎、銀屑病、肺的變應(yīng)性疾病諸如嗜曙紅細(xì)胞性肺炎、特發(fā)性肺纖維化和超每文感性肺炎、移植相關(guān)疾病包括移植物排斥和移一直物抗宿主病。在又一個具體的實施方案中，所述補體相關(guān)疾病是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、銀屑病或孝喘。在所有實施方案中，所述受試者可以是哺乳動物，諸如人類患者。又一方面，本發(fā)明關(guān)注用于在受試者中預(yù)防或治療年齡相關(guān)黃斑變性(AMD)或脈絡(luò)膜新血管形成(CNV)的方法，包括對受試者施用有效量的補體抑制物，諸如旁路途徑的抑制物，例如CRIg多肽或其激動劑。附圖簡述圖1A-1B顯示了321個氨基酸的人CRIg多肽的核苷酸和氨基酸序列(分別是SEQIDNO:1和2)。圖2A-2B顯示了399個氨基酸的全長長型天然人CRIg(huCRIg或huCRIg-長)的核苷酸和氨基酸序列(分別是SEQIDNO:3和4)。圖3A-3B顯示了305個氨基酸的短型天然人CRIg(huCRIg-短)的核苷酸和氨基酸序列(分別是SEQIDNO:5和6)。圖4A-4C顯示了280個氨基酸的天然鼠CRIg(muCRIg)的核苷酸和氨基酸序列(分別是SEQIDNO:7和8)。圖5顯示了全長huCRIg(SEQIDNO:4)和huCRIg-短(SEQIDNO:6)與muCRIg(SEQIDNO:8)對比的氨基酸序列。顯示了疏水信號序列、IgV、IgC和跨膜區(qū)。muCRIg在第170位具有預(yù)測的單一N-連接糖基4匕位點(NGTG)。標(biāo)示了根據(jù)人CRIg基因的外顯子-內(nèi)含子邊界推導(dǎo)出的Ig結(jié)構(gòu)域邊界。圖6顯示了小鼠肝冷凍切片中CRIg的原位雜交。圖7顯示了人肝冷凍切片中CRIg的原位雜交。圖8顯示了激活的結(jié)腸和腎上腺巨噬細(xì)胞、Kupffer細(xì)胞、和胎盤Hofbauer細(xì)胞中CRIg的原位雜交。圖9顯示了RA滑膜細(xì)胞中CRIgmRNA的原位雜交。圖IO顯示了腦小膠質(zhì)細(xì)胞中CRIgmRNA的原位雜交。圖11顯示了來自人哮喘組織的細(xì)胞中CRIgmRNA的原位雜交。圖12顯示了來自人'l"曼性肝炎組織的細(xì)胞中CRIgmRNA的原位雜交。圖13顯示了腎上腺巨噬細(xì)胞中CRIg的免疫組化分析。圖14顯示了肝Kupffer細(xì)胞中CRIg的免疫組化分析。圖15顯示了腦小膠質(zhì)細(xì)胞中CRIg的免疫組化分析。圖16顯示了胎盤Hofbauer細(xì)胞中CRIg的免疫組化分析。圖17。顯示huCRIg在多種組織中表達(dá)的Northern印跡分析。表達(dá)CRIg的人組織中存在1.5和1.8kb的兩種轉(zhuǎn)錄物。圖18。(A)顯示huCRIg在骨髓單核細(xì)胞系HL60和THP-1中及在已分化巨噬細(xì)胞中的表達(dá)升高的TAQMANPCR分析。在JurkatT纟田月包、MOLT3、MOLT4和RAMOSB細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)了低水平表達(dá)。(B)huCRlgmRNA在體外單核細(xì)胞分化過程中的表達(dá)升高。從人外周血分離的單核細(xì)胞通過粘附于塑料達(dá)7天而分化。在分化過程中的不同時間點提取總RNA。(C)huCRIg蛋白在單核細(xì)胞分化成巨噬細(xì)胞的過程中的表達(dá)升高。單核細(xì)^J口(B)中所述處理，全細(xì)胞裂解物運行凝膠電泳并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，與huCRIg的多克隆抗體(4F7)—起溫育。該多克隆抗體識別可能代表長型和短型huCRIg的48和38kDa條帶。圖19。huCRIg蛋白在細(xì)胞系中的分子表征。(A)huCRIg-gd在293E細(xì)胞中瞬時表達(dá)，用抗gd免疫沉淀，并將印跡與抗gd或CRIg胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)的多克隆抗體一起溫育。(B)在293細(xì)胞中表達(dá)的huCRIg是單體N-糖基化蛋白質(zhì)。CRIg在用過釩酸鈉處理HEK293細(xì)胞時酪氨酸磷酸化，但不征募Syk激酶。磷酸化CRIg與非糖基化CRIg相比以略高的分子量遷移。圖20。huCRIg在人單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞上的選擇性表達(dá)。外周血單核細(xì)胞用對B、T、NK纟田月包、單核細(xì)胞特異的抗體和用ALEXAA488偶聯(lián)的CRIg的單克隆抗體(3C9)染色。在所有外周血白細(xì)胞中以及在單核細(xì)胞衍生的樹突細(xì)胞中不存在表達(dá)，但在體外分化的巨噬細(xì)胞中表達(dá)。圖21。CRIgmRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)受IL-10和地塞米松提高。(A)實時PCR顯示了CRIgmRNA的表達(dá)在用IL-IO、TGFP處理后升高且受地塞米松高度誘導(dǎo)，但受LPS、IFNy和TNFa處理的下調(diào)。(B)Ficoll分離的外周血單核細(xì)胞用多種細(xì)胞因子和地塞米松處理5天，并用抗CD14和抗CRIg雙重染色。流式分析顯示了用地塞米松處理的單核細(xì)胞的表面上及用IL-10和LPS處理后CRIg表達(dá)顯著升高。圖22。CRIg在單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位。單核細(xì)月包在巨噬細(xì)胞分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天，在丙酮中固定，并用多克隆抗CRIg抗體6F1或CD63和二抗山羊抗兔FITC染色。在共聚焦顯微鏡中研究細(xì)胞。在細(xì)胞質(zhì)中找到CRIg,在此它與溶酶體膜蛋白CD63共定位。CRIg還在巨噬細(xì)胞的前緣和后緣處以與F-肌動蛋白相似的模式表達(dá)。比例尺=10(im。圖23。CRIgmRNA在慢性炎性疾病中的定位。原位雜交顯示了從肺炎患者(A,B)或慢性孝喘患者(C，D)的組織獲得的肺泡巨噬細(xì)胞中存在CRIgmRNA。CRIgmRNA還在從慢性肝炎患者(E,F)的肝活組織檢查獲得的組織中的肝Kupffer細(xì)胞中表達(dá)。圖24。CRIgmRNA表達(dá)在發(fā)炎的滑膜中升高。CRIgmRNA在,人無關(guān)節(jié)炎癥的患者(A,C)的膝置換術(shù)獲得的關(guān)節(jié)的滑膜中較低或不存在，但在有骨關(guān)節(jié)炎的患者(B，D)的血管翳中的細(xì)胞，可能是滑膜細(xì)胞或滑膜巨噬細(xì)胞中高度表達(dá)。圖25。用多克隆抗體6F1檢測有變性關(guān)節(jié)病的患者(A,B,C)的滑膜內(nèi)襯細(xì)胞中的CRIg蛋白。在對照滑膜(D)中沒有找到CRIg的免疫組化才企測。圖26。CRIg蛋白在駐留組織的巨噬細(xì)胞亞型中表達(dá)，且其表達(dá)在十曼性炎性疾病中升高。(A)CRIg在穩(wěn)定表達(dá)CRIg的CHO細(xì)胞的膜上表達(dá)。在從慢性哞喘患者獲得的組織中的在肺泡巨噬細(xì)胞(B)中找到CRIg蛋白的高表達(dá)。(C)CRIg在人小腸的組織細(xì)胞中的表達(dá)。切片得自手術(shù)切除的組織且可能包含瘤。(D)CRIg蛋白在人產(chǎn)前胎盤中的Hofbauer細(xì)胞中的表達(dá)。CRIg蛋白在巨噬細(xì)胞中的高表達(dá)存在于腎上腺(E)中和人肝的Kupffer細(xì)胞(F)中。染色在5iLim厚的丙酮固定切片上進(jìn)行，使用DAB作為色原。圖像在20X和40Xi文大倍數(shù)拍照。圖27。從動脈粥樣硬化患者獲得的血管斑上CD68和CRIg的免疫組化染色。將連續(xù)切片固定，并用人CD68的單克隆抗體(A,B)和針對人CRIg制備的多克隆抗體6F1(C,D)染色。根據(jù)連續(xù)切片的染色的判斷，CRIg出現(xiàn)于動脈粥樣硬化斑中存在的一群巨噬細(xì)胞和泡沫細(xì)胞中，且與CD68陽性巨噬細(xì)胞交疊。放大倍數(shù)IOX(A,C)和20X(B,D)。圖28。心間質(zhì)巨噬細(xì)胞上CRIg和CD68的共染色。5)am切片得自人心(尸體解剖)，用CRIg的單克隆抗體(3C9)和二抗抗小鼠FITC標(biāo)記抗體染色。CD68通過使用CD68的PE標(biāo)記單克隆抗體的染色來檢測。放大倍數(shù)20X。圖29。CRIgmRNA水平在從潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩氏(Crohn)病、慢性阻塞性肺病(COPD)和孝喘患者獲得的結(jié)腸組織中顯著升高。對從多種組織提取的總RNA進(jìn)行實時PCR。CRIg的m脂A在從潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩氏(Crohn)病和COPD患者獲得的組織中顯著升高。統(tǒng)計學(xué)分析4吏用Mann-WhitneyU檢驗進(jìn)行。圖30。表達(dá)人CRIg的細(xì)胞顯示出對人內(nèi)皮細(xì)胞的粘附增加。(A)CRIg在人JurkatT細(xì)胞系中穩(wěn)定表達(dá)。(B)細(xì)胞預(yù)先加載熒光染料BCECF(MolecularProbes,Oregon)并加至包被有用或未用10ng/mlTNFa處理的單層人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的96孔板。清洗3次后，熒光在分光熒光計中計數(shù)，它指示保持對HUVEC細(xì)胞粘附的細(xì)胞數(shù)。該圖代表4次獨立實驗。圖31。muCRIgIgG-Fc融合蛋白對膠原誘發(fā)的關(guān)節(jié)炎(CIA)小鼠模型發(fā)展的抑制。一組(CIA)小鼠(n-7)給予100嗎muCRIgIgG-Fc融合蛋白(方)，而CIA小鼠對照組(r^8)接受100嗎鼠IgGl(圓)，每周3次，達(dá)6周。小鼠每天檢驗炎癥的征候并按0-16的標(biāo)準(zhǔn)評分(詳情見實施例25),結(jié)果作圖(平均值士SD，Student氏T檢驗p值=0.0004對照IgGl對測試muCRIg蛋白)。圖32是DNA42257(共有序列)的核苷酸序列(SEQIDNO:9)。圖33顯示了用CRIg-Fc處理的小鼠中關(guān)節(jié)肺脹的降低。圖34顯示了muCRIg抑制關(guān)節(jié)發(fā)炎。圖35顯示了用muCRIg-Fc處理的小鼠的關(guān)節(jié)中皮層骨體積的保持。圖36顯示了CRIg-Fc處理不改變駐留組織的巨噬細(xì)胞的數(shù)目或形態(tài)。圖37顯示了muCRIg處理不影響血清抗膠原抗體滴度。圖38顯示了muCRIg在體內(nèi)不改變不依賴T細(xì)胞的B細(xì)胞應(yīng)答。鈣冷凍關(guān)節(jié)中用F4/80染色產(chǎn)生。圖40顯示了muCRIg-Fc在balb/c小鼠中預(yù)防抗體誘發(fā)的關(guān)節(jié)炎后的關(guān)節(jié)腫脹。圖41顯示了muCRIg抑制抗體誘發(fā)的關(guān)節(jié)炎中的關(guān)節(jié)浸潤。圖42顯示了鼠CRIg-Fc融合蛋白結(jié)合C3調(diào)理的綿羊紅血球(E-IgM)。圖43顯示了人CRIg-Fc對E-IgM的結(jié)合依賴C3。圖44顯示了血清調(diào)理的顆粒對表達(dá)CRIg的CHO細(xì)胞的結(jié)合。圖45顯示了鼠CRIg-Fc結(jié)合補體C3b和iC3b,但不結(jié)合C2、C4、C3c、和C3d。圖46顯示了鼠和人CRIg-Fc結(jié)合補體C3b、C3bi和C3c,但不結(jié)合C1、C2、C4、C3a和C3d。圖47A顯示了鼠和人CRIg-Fc抑制酵母聚糖的C3沉積。圖47B顯示了鼠CRIg-Fc在血清中抑制C3活化。圖48顯示了鼠CRIg抑制旁路途徑誘發(fā)的溶血，但不影響經(jīng)典溶血途徑。圖49顯示了CRIgECD抑制C3和C5旁路途徑轉(zhuǎn)變酶(convertase)。(A)CRIg在Clq缺陷血清中(旁路途徑)抑制兔紅細(xì)胞的溶血，但在fB缺陷血清中(經(jīng)典途徑)不抑制IgM調(diào)理的綿羊紅細(xì)胞的溶血。(B)CRIg抑制液相C3轉(zhuǎn)變酶活性。(C)CRIg不發(fā)揮因子I介導(dǎo)的C3切割的輔因子的功能。(D)CRIg不發(fā)揮C3轉(zhuǎn)變酶衰變的加速劑的功能。(E)CRIg抑制在酵母聚糖顆粒上形成的旁路途徑C5轉(zhuǎn)變酶。圖50。CRIg在駐留組織的巨噬細(xì)胞亞群上選擇性表達(dá)。(A)CRIg是單次跨膜免疫球蛋白超家族成員，由一個(人CRIg短型(huCRIg(S))和鼠CRIg(muCRIg))或兩個(huCRIgL)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域組成。左邊小圖頂部的刻度標(biāo)示以氨基酸計的大小。右邊小圖顯示了hu和muCRIg與關(guān)節(jié)粘附分子-A(JAM-A)和A33抗原有較遠(yuǎn)關(guān)系。右邊小圖頂部的刻度標(biāo)示氨基酸相似性百分比。(B)CRIg在巨噬細(xì)胞中表達(dá)，但在單核細(xì)胞中不表達(dá)。使用抗人CRIgMAb(3C9)通過流式細(xì)胞術(shù)對在10%自體血清和20%胎牛血清中培養(yǎng)7天的人CD14+單核細(xì)胞和CD14+單核細(xì)胞分析huCRIg染色。使用抗muCR]gMAb(14G6)對小鼠CDllb+和F4/80+肝Kupffer細(xì)胞分析muCRIg染色。(C)人和小鼠巨噬細(xì)胞的Western印跡分析。來自培養(yǎng)所示時間的人CD14+單核細(xì)胞或小鼠腹膜巨噬細(xì)胞的裂解物在還原性SDS緩沖液中煮沸，加載到4-10%Tris-苷氨酸凝膠上，并與多克隆抗CRIg抗體(6F1，左邊小圖)或抗muCRIg單克隆抗體(14C6,右邊小圖)一起溫育。使用免疫前IgG(左邊小圖)和大鼠IgG2b(右邊小圖)作為同種型對照。左邊小圖中的箭頭標(biāo)示可能代表huCRIg(L)和(S)的57和50kDa條帶的位置。(D)肝Kupffer細(xì)胞上CRIg與CD68的共定位。使用單克隆抗CRIg(3C9人和14G6小鼠)和單克隆抗CD68抗體對從人和小鼠肝獲得的切片進(jìn)行免疫染色。圖51。外周血白細(xì)胞上CRIg表達(dá)的流式細(xì)胞術(shù)分析和C3片段和C3調(diào)理的顆粒對表達(dá)CRIg的CHO細(xì)胞的結(jié)合的分析。(A)人和小鼠外周血白細(xì)胞上CRIg表達(dá)的流式細(xì)胞術(shù)分析。(B)可溶性C3片段或補體調(diào)理的病原體結(jié)合表達(dá)鼠CRIg的CHO細(xì)胞，但不結(jié)合表達(dá)JAM-2的CHO細(xì)胞。懸浮細(xì)胞與A488標(biāo)記的補體調(diào)理的顆粒一起在連續(xù)旋轉(zhuǎn)下于室溫溫育30分鐘。細(xì)胞清洗3次，并通過流式細(xì)胞術(shù)分析監(jiān)測顆粒的結(jié)合。結(jié)果代表3次獨立實驗。圖52?？扇苄院图?xì)胞表面表達(dá)的CRIg結(jié)合溶液中的或沉積在細(xì)胞表面上的C3片段。(A)CRIg(L)轉(zhuǎn)染的Jurkat細(xì)胞(Jurkat-CRIg)，但非空載體轉(zhuǎn)染的Jurkat細(xì)胞(Jurkat-對照)與C3和IgM調(diào)理的綿羊紅細(xì)胞(E-IgM)形成玫^鬼花結(jié)。直方圖(左邊小圖)顯示了用人CRIg(L)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Jurkat細(xì)胞上的CRIg表達(dá)。用C3缺陷(C3-)或C3充足(C3+)血清調(diào)理的E-IgM與CRIg或用對照載體轉(zhuǎn)染的Jurkat混合1小時。該實驗代表3次獨立實-險。(B)CIg(L)-Fc對IgM調(diào)理的綿羊紅血球(E-IgM)的結(jié)合依賴血清中存在C3。E-IgM用C3消減的人血清調(diào)理，其中加入濃度漸增的純化的人C3。E-IgM隨后與huCRIg(L)-Fc融合蛋白一起溫育，繼而《吏用抗人Fc多克隆抗體通過流式細(xì)胞術(shù)檢測。此實驗代表3次獨立實驗。(C)顯示CRIg(L)-和CRIg(S)-Fc結(jié)合C3b和iC3b的ELISA。濃度漸增的huCRIg(L)-和huCRIg(S)-Fc融合蛋白加至用純化的C3b和iC3b包被的maxisorb板。結(jié)合使用偶聯(lián)有HRPO的抗huFc抗體檢測。所示結(jié)果代表使用不同批次融合蛋白和純化的補體成分的4次獨立實驗。(D)顯示可溶性C3b二聚體結(jié)合huCRIg(L)-Fc的動力學(xué)結(jié)合數(shù)據(jù)。C3b對CRIg融合蛋白的親和力使用表面等離振子共振測定。CRIg蛋白經(jīng)由針對Fc融合標(biāo)簽的抗體的胺偶聯(lián)捕捉到CM5傳感器芯片上。然后注入二聚體C3b足夠時間至飽和。Kd根據(jù)針對濃度繪制的、顯示平衡時響應(yīng)的結(jié)合曲線計算。C3b二聚體結(jié)合huCRIg(S)的計算親和力為44nM,而對huCRIg(L)的親和力為131nM。(E)在細(xì)胞表面上表達(dá)的CRIg結(jié)合A488標(biāo)記的C3b二聚體((C313)2),但不結(jié)合天然C3。左邊小圖顯示了通過流式細(xì)胞術(shù)分析得到的經(jīng)轉(zhuǎn)染THP-1細(xì)胞上huCRIg(L)的表達(dá)水平。(C3b)2顯示出對CRIg轉(zhuǎn)染的THP-1細(xì)胞的可飽和結(jié)合。(C3b)2對THP-1CRIg的結(jié)合可用(C3b)2、C3b和CRIg的胞外結(jié)構(gòu)域(CRIg-ECD)竟?fàn)幍?，但C3不行。所示結(jié)果代表3次獨立實驗。圖53。CRIg敲除型小鼠的生成和表;f正。(A)用于在ES細(xì)胞中同源重組的尋靶載體的生成。(B)嵌合小鼠與野生型小鼠繁殖產(chǎn)生的雜合雌性后代中SRIg等位基因同源重組的Southern印跡一驗i正。(C)野生型和敲除型雄性和雌性小鼠外周血中白細(xì)胞數(shù)的比較。(D)顯示KC中不存在CR1、CR2和CDllc表達(dá)的FACS分析。(E)C3-A488和C3c-A488結(jié)合野生型和敲除型KC的FACS分析。圖54。Kupffer細(xì)胞上的CRIg表達(dá)是C3b和iC3b的結(jié)合所必需的。(A)從CRIg敲除型小鼠獲得的巨噬細(xì)胞上不存在CRIg蛋白。從CRIg野生型、雜合或敲除型小鼠獲得的腹膜巨噬細(xì)胞與抗muCRIgmAb(14G6,左邊小圖)一起溫育。從CRIg野生型和敲除型小鼠獲得的Kupffer細(xì)胞(KC)與抗體14G6一起溫育，并通過流式細(xì)胞術(shù)分析。(B)CDllb和CD18、補體受體3的a和(3鏈、和Crry的表達(dá)水平在/人CRIg野生型小鼠和CRIg敲除型小鼠獲得的Kupffer細(xì)胞上相似。從CRIg野生型或敲除型小鼠分離的Kupffer細(xì)胞與CDllb、CD18和Crry的抗體一起溫育并通過流式細(xì)胞術(shù)分析。(C)從CRIg野生型或敲除型小鼠分離的Kupffer細(xì)胞與活化的小鼠血清(通過于37。C溫育30分鐘而活化)、C3b、(C3b)2和iC3b—起溫育。純化的補體成分對細(xì)胞表面的結(jié)合用識別多種C3衍生片段的多克隆抗體檢測。所示結(jié)果代表4次實驗。(D)從CRIg敲除小鼠分離的KC顯示出與C3充足小鼠血清中調(diào)理的IgM包被的綿羊紅血球(E-IgM)形成玫瑰花結(jié)降低。從CRIg野生型和敲除型小鼠的肝分離的KC與補體C3調(diào)理的E-IgM—起在存在對照IgG或抗CR3阻斷性抗體(Ml/70)時溫育30分鐘。將細(xì)胞固定，對與E-IgM形成玫瑰花結(jié)的KC數(shù)目計數(shù)并表述成KC總數(shù)的百分比。*=p<0.05。所示結(jié)果代表2次獨立實驗。圖55。Kupffer細(xì)月包^盾環(huán)上的CRIg。(A)來自C3野生型(小圖1,3,4和6)或C3敲除型小鼠(小圖2,5)的Kupffer細(xì)胞(KC)與A488標(biāo)記的抗CRIg抗體(14G6)和(C3b)2于4°C一起溫育1小時(小圖l-3)或于37。C一起溫育10分鐘(小圖4-6)。細(xì)胞隨后轉(zhuǎn)移至4。C，并與(紅色直方圖)或不與(黑色直方圖)抗A488抗體一起溫育以區(qū)分細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞表面表達(dá)的抗CRIg或C3b。(B)CRIg和C3b在CRIg野生型KC但非CRIg敲除型KC中的內(nèi)在化和共定位。從CRIg野生型和敲除型小鼠的肝分離的KC在槽載玻片上培養(yǎng)2天，并與A455偶聯(lián)的抗CRIg抗體和A488偶聯(lián)的C3b—起于37°C溫育30分鐘，制作標(biāo)本(mount)并照相。(C)CRIg但非Lampl的抗體循環(huán)至細(xì)胞表面。Kupffer細(xì)胞用A488偶耳關(guān)的抗muCRIg或抗muLampl抗體于37。C加載10分鐘，清洗，隨后在存在抗A488淬滅性抗體時于37。C溫育所示時間。所示結(jié)果代表3次獨立實驗。圖56。CRIg在征募至顆粒攝取部位的循環(huán)內(nèi)體上表達(dá)。(A)細(xì)胞表面表達(dá)的CRIg定位至F-肌動蛋白陽性皺膜(membranemffles)。培養(yǎng)7天的單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞與A488偶聯(lián)的抗CRIgA488mAb3C9(Al和A3中的綠色通道)和Alexa546-鬼筆環(huán)肽(A2和A3中的紅色通道)一起于4。C溫育。箭頭標(biāo)示其中CRIg和肌動蛋白兩種染色都比其余細(xì)胞表面(A3中歸并圖像中的黃色)更強的皺膜。比例尺是20(am。(B)CRIg和C3b與運鐵蛋白在循環(huán)內(nèi)體中共定位。巨噬細(xì)胞與CRIg-A488(B1,B4中的綠色通道)或C30A488(B2,B4中的紅色通道)一起在水上溫育1小時，然后在存在A647-運鐵蛋白(B3，B4中的藍(lán)色通道)時于37°C捕捉10分鐘。比例尺是20)Lim。(C)CRIg征募至吞噬杯(phagocyticcup)和吞噬體膜。巨謹(jǐn)細(xì)胞用C3充足血清調(diào)理的IgM包被的紅細(xì)胞一起在存在A647標(biāo)記的運鐵蛋白時(C2，6和C4,8中的藍(lán)色通道)于37。C溫育10分鐘(Cl-4)或2小時(C5-8)。細(xì)胞隨后固定，透化，并用抗CRIg多克隆抗體(Cl,2和C4,5中的綠色通道)和A555偶聯(lián)的LAMP-1的抗體(C3，7和C4，8中的紅色通道)染色。圖57。人單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞中CRIg的運輸。(A)顯示C3b-A488對第7天MDM上的CRIg的可飽和結(jié)合的FACS圖。(B)MDM用抗CRIg.抗體和C3b-A488在存在10倍摩爾過量的huCRIg(L)-ECD時于37。C脈沖(pulse)10分鐘?？笴RIg抗體的結(jié)合和ii取對CRIg特異，因為它可通過抗體與IO倍摩爾過量的CRIg-ECD(小圖l)的共溫育得到消除，而剩下運鐵蛋白的攝取不受影響(小圖2)。(C)MDM在存在溶酶體蛋白酶抑制劑時于37。C溫育20小時，然后將細(xì)胞清洗，用1%PFA固定，并用Cy3標(biāo)記的抗小鼠IgG檢測所攝取的抗體(C小圖1和小圖3中的紅色通道)。細(xì)胞在10嗎/ml兔抗CRIg6Fl隨后是FITC-抗兔中共染色以檢測總CRIg分布(C小圖2和C小圖3中的綠色通道)。所攝取的抗體與內(nèi)源CRIg信號(C小圖3中歸并圖像中的黃色)幾乎完全交疊，表明抗體纟聶取不影響CRIg運輸。比例尺是20而各通道下方右邊所示有框區(qū)域的4x放大插圖是5pm。C小圖4人巨噬細(xì)胞在C3消減血清中溫育13小時，然后固定，并用兔抗CRIgFl和FITC-抗兔標(biāo)記。CRIg分布與C3充足血清中的基本上相同，二者都與循環(huán)內(nèi)體標(biāo)志物運鐵蛋白(資料未顯示)幾乎完全交疊。比例尺是20pm。(D)將MDM與l嗎/ml抗CRIg-A488(小圖1)、運鐵蛋白-A647(小圖2)—起于37。C溫育10分鐘，在4。/。PFA中固定，用皂苷緩沖液透化，并與小鼠-抗人Lamp-1-A555—起溫育(小圖3)。箭頭標(biāo)示CRIg和運鐵蛋白在再循環(huán)區(qū)室中的共定位。(E)MDM與1fig/ml抗CRIg-A488(小圖1,小圖4中的綠色通道)、運鐵蛋白-A647(小圖2，小圖4中的藍(lán)色通道)一起于37。C溫育30分鐘，清洗，并與PKH染色的、補體C3調(diào)理的綿羊紅血球(SRBC，小圖3,小圖4中的紅色通道)一起以1:10巨噬細(xì)胞:SRBC比率溫育。圖58。缺乏CRIg的小鼠易患單核細(xì)胞增生利斯特氏菌(Z^tehaM。/wqytoge腦)(LM)感染。(A)通過注射到側(cè)面尾靜脈中而感染了所示劑量LM的雌性CRIg野生型和CRIg敲除型小鼠的存活曲線，11=每組5-7只。統(tǒng)計學(xué)分析(Wilcoxon):野生型對敲除型，2x104菌落形成單位(CFU)為p<0.005,5x1()4和2x105CFU為p〈0扁l。(B)LM感染后10分鐘心、肝、血液和脾中的細(xì)菌計數(shù)分析(2x107CFU,n=每組5只)。統(tǒng)計學(xué)分析(成對t檢驗)**p<0.01,*p<0.05。(C)LM感染后1天CRIg敲除型小鼠血清中細(xì)胞因子和趨化因子的濃度升高。統(tǒng)計學(xué)分析(未配對t檢驗)***p<0.001。(D)CRIg敲除型小鼠KC中LM-A488的攝取降低。小鼠用2x107LM-A488感染。1小時后，將肝灌注，與F4/80的抗體一起溫育，并通過流式細(xì)月包術(shù)分析。F4/80陽性KC隨后通過FACS分選，并收集到聚L-賴氨酸包一皮的載玻片上供熒光顯微鏡檢術(shù)的觀察。內(nèi)在化LM-A488數(shù)目在共聚焦顯微鏡中計數(shù)，并計算吞噬細(xì)胞指數(shù)。結(jié)果代表至少兩次實驗。(E)CRIg小鼠具有降低的LM從循環(huán)中清除。CRIg和C3雙重或單一敲除型小鼠靜脈內(nèi)注射2x107CFULM。感染后10分鐘對血液中的CFU計數(shù)。在存在C3時，CRIg敲除型小鼠具有顯著降低的LM從循環(huán)中清除(pO.OOl)。在不存在C3時，CRIg野生型或敲除型小鼠中LM的清除沒有顯著差異。圖59顯示了人CRIg(短)-IgG融合物的核苷酸序列(SEQIDNO:20)。圖60顯示了人CRIg(長)-IgG融合物的核苷酸序列(SEQIDNO:21)。圖61圖示了兩種不同構(gòu)建物中的CRIg(STIgMA)-Fc連接，二者都插入pRK5載體的Clal-Xbal位點。圖62顯示了muCRIg-Fc融合蛋白(但非對照Fc融合蛋白)在野生型但非CRIg敲除型細(xì)胞中抑制LM從循環(huán)中清除。CRIg野生型和敲除型小鼠在靜脈內(nèi)注射2x107CFULM前24小時和16小時用2次注射12mg/kgmuCRIg-Fc或?qū)φ?Fc融合蛋白處理。感染后10分鐘對血液中的CFU計數(shù)。用muCRIg-Fc處理的CRIg野生型小鼠與用對照-Fc處理的野生型小鼠相比LM從循環(huán)中的清除有顯著降低(pO.OOl，非配對Student氏t檢驗)。在CRIg敲除型小鼠中，muCRIg-Fc處理對LM清除沒有影響。圖63。用huCRIg分子抑制補體介導(dǎo)的免疫性溶血。A.使用hCRIg-短和-長融合蛋白抑制獼猴血清RRBC溶血。B.使用hCRIg-長ECD抑制獼猴血清RRBC溶血。圖64。用hCRIg-長在兩種不同實驗中抑制人血清溶血。圖65。用hCRIg-短-Fc和CRIg-長-Fc融合蛋白抑制人血清溶血。圖66。分別用hCRIg-長-ECD和hCRIg-短-ECD抑制人血清溶血。圖67顯示了編碼huCRIg-長-Fc("無莖(stalk)"構(gòu)建物)的核酸序列(SEQIDNO:25)。圖68顯示了編碼在CRIg的^爭膜結(jié)構(gòu)域和Fc部分之間插入了"莖"的huCRIg-長-Fc的核酸序列(SEQIDNO:26)。圖69顯示了編碼huCRIg-短-Fc("無莖"構(gòu)建物)的核酸序列(SEQIDNO:27)。圖70顯示了編碼在CRIg的跨膜結(jié)構(gòu)域和Fc部分之間插入了"莖"的huCRIg-短-Fc的核酸序列(SEQIDNO:28)。圖71A和B顯示了實施例23中所述小鼠CNV研究的結(jié)果。發(fā)明詳述I.定義術(shù)語"PR0362"、"JAM4"、"STIgMA"、和"CRIg，，可互換使用，指天然序列和變異CRIg多肽。"天然序列"CRIg指與衍生自自然界的CRIg多肽具有相同氨基酸序列的多肽，無論其制備模式。因此，天然序列CRIg可以從自然界分離，或者可以通過重組和/或合成手段生成。術(shù)語"天然序列CRIg"明確涵蓋天然存在的截短或分泌形式的CRIg(例如胞外結(jié)構(gòu)域序列)、CRIg的天然存在變異形式(例如可變剪接形式)和天然存在等位變體。天然序列CRIg多肽明確包括321個氨基酸長的SEQIDNO:2的人CRIg多肽(見圖1),含或不含N-末端信號序列，含或不含位于第l位的起始曱硫氨酸，且含或不含位于SEQIDNO:2的大約第277-307位氨基酸的任何或所有跨膜結(jié)構(gòu)域。天然序列CRIg多肽還包括全長399個氨基酸長的SEQIDNO:4的人CRIg多肽(huCRIg或huCRIg-長，見圖2和5)，含或不含N-末端信號序列，含或不含位于第1位的起始曱硫氨酸，且含或不含位于SEQIDNO:4的大約第277-307位氨基酸的任何或所有跨膜結(jié)構(gòu)域。在還有一個實施方案中，天然序列CRIg多肽是305個氨基酸的短型人CRIg(huCRIg-短，SEQIDNO:6，見圖3),含或不含N-末端信號序列，含或不含位于第l位的起始曱硫氨酸，且含或不含位于SEQIDNO:6的大約第183-213位的任何或所有3爭膜結(jié)構(gòu)域。在一個不同的實施方案中，天然序列CRIg多肽是280氨基酸長的SEQIDNO:8的全長鼠CRIg多肽(muCRIg，見圖4和5)，含或不含N-末端信號序列，含或不含位于第1位的起始曱硫氨酸，且含或不含位于SEQIDNO:8的大約第181-211位氨基酸的任何或所有跨膜結(jié)構(gòu)域。其它非人動物，包括高等靈長類動物和哺乳動物的CRIg多肽明確包括在此定義內(nèi)。"CRIg變體"指如下定義的、與天然序列CRIg多肽具有至少約80%氨基酸序列同一性的活性CRIg多肽，包括但不限于C-末端截短的321個氨基酸的huCRIg(SEQIDNO:2)、全長huCRIg(SEQIDNO:4)、huCRIg-短(SEQIDNO:6)、和muCRIg(SEQIDNO:8)，各自含或不含N-末端起始曱硫氨酸，含或不含N-末端信號序列，含或不含整個或部分跨膜結(jié)構(gòu)域，且含或不含胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。在一個具體的實施方案中，CRIg變體與來自序列SEQIDNO:2的序列內(nèi)的成熟、全長多肽具有至少約80%氨基酸序列同源性。在另一個實施方案中，CRIg變體與來自SEQIDNO:4的序列內(nèi)的成熟、全長多肽具有至少約80%氨基酸序列同源性。在又一個實施方案中，CRIg變體與來自SEQIDNO:6的序列內(nèi)的成熟、全長多肽具有至少約80%氨基酸序列同源性。在還有一個實施方案中，CRIg變體與來自SEQIDNO:8的序列內(nèi)的成熟、全長多肽至少約80%氨基酸序列同源性。此類CRIg多肽變體包括例如其中在SEQIDNO:2,4,6或8的序列的N-或C-末端有一個或多個氨基酸殘基插入、替代和/或刪除的CRIg多肽。其它變體在所示多肽序列的跨膜區(qū)內(nèi)有一個或多個氨基酸插入、替代和/或刪除。通常，CRIg變體將與來自SEQIDNO:2,4,6或8內(nèi)的成熟氨基酸序列具有至少約80%氨基酸序列同一性，或至少約85%氨基酸序列同一性，或至少約90%氨基酸序列同一性，或至少約95%氨基酸序列同一性，或至少約98%氨基酸序列同一性，或至少約99%氨基酸序列同一性。優(yōu)選的是，在胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)(SEQIDNO:2或4的氨基酸1或約21至X,其中X是第271-281位的任何氨基酸殘基；或SEQIDNO:6的氨基S吏1或約21至X，其中X是第178-186位的任何氨基酸殘基；或SEQIDNO:8的氨基酸1或約21至X,其中X是第176-184位的任何氨基酸殘基)內(nèi)存在最高程度的序列同一性。CRIg(PR0362)"胞外結(jié)構(gòu)域"或"ECD"指基本上不含各自全長分子的跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的CRIg多肽形式。通常，CRIgECD將具有少于1%的此類跨膜和/或胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，且優(yōu)選的是，將具有少于0.5%的此類結(jié)構(gòu)域。如上所述，任選的是，CRIgECD將包含SEQIDNO:2,4,6或8的氨基酸殘基1或約21至X,其中X是SEQIDNO:2或4中約271至281的任何氨基酸，SEQIDNO:6中約178至186的任何氨基酸，和SEQIDNO:8中約176至184的任何氨基酸。關(guān)于本文中鑒定的CRIg(PR0362)序列的"百分比(。/。)氨基酸序列同一性，，定義為分別在對比序列并在必要時引入缺口以獲取最大百分比序列同一性后，且不將任何保守替代視為序列同一性的一部分時，候選序列中與CRIg序列中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分率。測定百分比氨基酸序列同一性目的的序列對比可以本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的多種方式進(jìn)行，例如使用公眾可得到的計算機軟件，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟件。本領(lǐng)域技術(shù)人員可決定測量對比的適宜參數(shù)，包括對所比較序列全長獲得最大對比所需的任何算法。然后相對于較長序列計算序列同一性，即即使較短序列與較長序列的一部分顯示出100%序列同一性，總體序列同一性仍將小于100%。關(guān)于本文中鑒定的CRIg(PR0362)編碼序列(例如DNA45416)的"百分比(％)核酸序列同一性，，定義為分別在對比序列并在必要時引入缺口以獲取最大百分比序列同一性后，候選序列中與CRIg編碼序列中的核苷酸相同的核苷酸的百分率。測定百分比核酸序列同一性目的的序列對比可以本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的多種方式進(jìn)行，例如使用公眾可得到的計算機軟件，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟件。本領(lǐng)域技術(shù)人員可決定測量對比的適宜參數(shù)，包括對所比較序列全長獲得最大對比所需的任何算法。然后相對于較長序列計算序列同一性，即即使較短序列與較長序列的一部分顯示出100%序列同一性，總體序列同一性仍將小于100%。"分離的"核酸分子指已經(jīng)鑒定且與該核酸的天然來源中通常與之相關(guān)的至少一種污染性核酸分子分開的核酸分子。分離的核酸分子不同于在自然界中發(fā)現(xiàn)它時的形式或背景。分離的核酸分子因此與存在于天然細(xì)胞中的核酸分子有區(qū)別。然而，分離的核酸分子包括通常表達(dá)所編碼多肽的細(xì)胞中所包含的核酸分子，例如當(dāng)所述核酸分子在所述細(xì)胞中的染色體定位不同于它在天然細(xì)月包中的染色體定位時。"分離的"CRIg多肽編碼核酸分子指已經(jīng)鑒定且與CRIg編碼核酸的天然來源中通常與之相關(guān)的至少一種污染性核酸分子分開的核酸分子。分離的CRIg多肽編碼核酸分子不同于在自然界中發(fā)現(xiàn)它時的形式或背景。分離的CRIg多肽編碼核酸分子因此與存在于天然細(xì)胞中的編碼核酸分子有區(qū)別。然而，分離的CRIg編碼核酸分子包括通常表達(dá)CRIg的細(xì)胞中所包含的CRIg編碼核酸分子，例如當(dāng)所述核酸分子在所述細(xì)胞中的染色體定位不同于它在天然細(xì)胞中的染色體定位時。術(shù)語"補體相關(guān)疾病"在本文中以最廣義使用，包括其發(fā)病機制牽涉補體系統(tǒng)激活異常的所有疾病和病理性狀況，-渚如例如補體缺陷。該術(shù)語明確包括受益于C3轉(zhuǎn)變酶抑制的疾病和病理性狀況。該術(shù)語另外包括受益于補體旁路途徑抑制，包括選擇性抑制的疾病和病理性狀況。補體相關(guān)疾病包括但不限于炎性疾病和自身免疫病，諸如例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)、缺血和再灌注后的遠(yuǎn)端組織損傷、心肺旁路手術(shù)過程中的補體激活、皮肌炎、天皰瘡、狼瘡腎炎及由此發(fā)生的腎小球腎炎和血管炎、心肺轉(zhuǎn)流術(shù)、心臟停搏誘發(fā)的冠狀動脈內(nèi)皮功能障礙、II型膜性增生性腎小球腎炎、IgA腎病、急性腎衰竭、冷球蛋白血癥、抗磷脂綜合征、黃斑變性病和其它補體相關(guān)眼狀況，諸如年齡相關(guān)黃斑變性(AMD)、脈絡(luò)膜新血管形成(CNV)、葡萄膜炎、糖尿病性和其它缺血相關(guān)視網(wǎng)膜病變、眼內(nèi)炎、和其它眼內(nèi)新血管疾病，諸如糖尿病性黃斑水腫、病理性近一見、馮希-林二氏(vonHippel-Lindau)病、眼的組織胞漿菌病、視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞(CRVO)、角膜新血管形成、視網(wǎng)膜新血管形成、以及同種移植、超急性排斥反應(yīng)、血液透析、慢性阻塞性肺應(yīng)激綜合征(COPD)、哞喘、和吸入性肺炎。術(shù)語"補體相關(guān)眼狀況"在本文中以最廣義使用，包括其病理學(xué)牽涉補體，包括補體的經(jīng)典和旁路路徑，特別是旁路途徑的所有眼狀況和疾病。此組明確包括其發(fā)生、形成、或發(fā)展可通過抑制旁路途徑來控制的與旁路途徑有關(guān)的所有眼狀況和疾病。補體相關(guān)眼狀況包括^旦不限于黃斑變性病，諸如所有階段的年齡相關(guān)黃斑變性(AMD)，包括干性和濕性(非滲出性和滲出性)形式、脈絡(luò)膜新血管形成(CNV)、葡萄膜炎、糖尿病性和其它缺血相關(guān)視網(wǎng)膜病變、眼內(nèi)炎、和其它眼內(nèi)新血管疾病，諸如糖尿病性黃斑水腫、病理性近視、馮希-林二氏(vonHippel-Lindau)病、眼的組織胞漿菌病、視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞(CRVO)、角膜新血管形成、和視網(wǎng)膜新血管形成。優(yōu)選的一組補體相關(guān)眼狀況包括年齡相關(guān)黃斑變性(AMD)，包括非滲出性(濕性)和滲出性(干性或萎縮性)AMD、脈絡(luò)膜新血管形成(CNV)、糖尿病性碎見網(wǎng)膜病變(DR)、和眼內(nèi)炎。術(shù)語"炎性疾病"和"炎性紊亂"可互換使用，指其中哺乳動物免疫系統(tǒng)的成分引起、介導(dǎo)或以其它方式促成炎性應(yīng)答，促成哺乳動物發(fā)病的疾病或紊亂。還包括其中降4氐免疫應(yīng)答對疾病發(fā)展具有改善作用的疾病。此術(shù)語包括免疫介導(dǎo)的炎性疾病，包括自身免疫病。術(shù)語"T細(xì)胞介導(dǎo)的，，疾病指其中T細(xì)胞直接或間接介導(dǎo)或以其它方式促成哺乳動物發(fā)病的疾病。T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病可能與細(xì)胞介導(dǎo)的效應(yīng)、淋巴因子介導(dǎo)的效應(yīng)等有關(guān)，甚至與B細(xì)胞有關(guān)的效應(yīng)，如果B細(xì)胞得到刺激的話，例如受到由T細(xì)胞分泌的淋巴因子的刺激。免疫相關(guān)和炎性疾病的例子，有些是T細(xì)胞介導(dǎo)的，包括但不限于炎性腸病(IBD)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、幼發(fā)型慢性關(guān)節(jié)炎、脊推關(guān)節(jié)病、系統(tǒng)性硬化(硬皮病)、特發(fā)性炎性肌病(皮肌炎、多肌炎)、斯耶格倫氏(Sj6gren)綜合征、系統(tǒng)性血管炎、結(jié)節(jié)病、自身免疫性溶血性貧血(免疫性全血細(xì)胞減少、陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿)、自身免疫性血小板減少(特發(fā)性血小板減少性紫癜、免疫介導(dǎo)的血小板減少)、曱狀腺炎(格雷夫斯氏(Graves)病、橋本氏(Hashimoto)曱狀腺炎、幼發(fā)型淋巴細(xì)胞性曱狀腺炎、萎縮性曱狀腺炎)、糖尿病、免疫介導(dǎo)的腎病(腎小球腎炎、腎小管間質(zhì)性腎炎)、中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的脫髓鞘病諸如多發(fā)性硬化、特發(fā)性多神經(jīng)病、肝膽病諸如傳染性肝炎(曱型、乙型、丙型、丁型、戊型和其它非嗜肝病毒肝炎)、自身免疫性慢性活動性肝炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化、肉芽腫性肝炎、和硬化性膽管炎、炎性和纖維化肺病(例如嚢性纖維化病)、麩膠敏感性腸病、惠普爾氏(Whipple)病、自身免疫或免疫介導(dǎo)的皮膚病包括大皰性皮膚病、多形紅斑和接觸性皮炎、銀屑病、肺的變應(yīng)性疾病諸如嗜曙紅細(xì)胞性肺炎、特發(fā)性肺纖維化和超敏感性肺炎、移植相關(guān)疾病包括移植物排斥、移植物抗宿主病、阿耳茨海默氏(Alzheimer)病、和動脈粥樣^更化。"腫瘤"在用于本文時指所有腫瘤性細(xì)胞生長和增殖，無論是惡性的還是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)細(xì)胞和組織。術(shù)語"癌癥，，和"癌性"指或描述哺乳動物中特征通常為細(xì)胞生長不受調(diào)節(jié)的生理狀況。癌癥的例子包括但不限于癌、淋巴瘤、母細(xì)胞瘤、肉瘤、和白血病。此類癌癥的更具體例子包括乳癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、鱗狀細(xì)胞癌、小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、胃腸癌、胰腺癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、宮頸癌、卯巢癌、肝癌、膀胱癌、肝細(xì)胞癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜、唾液腺癌、腎癌、肝癌(livercancer)、外陰癌、曱狀腺癌、肝癌(hepaticcarcinoma)及各種類型的頭和頸癌。"治療，，和"處理"指意圖預(yù)防紊亂形成或改變紊亂病理學(xué)而進(jìn)行的干預(yù)。因此，"治療，，和"處理"指治療性處理和防范性或預(yù)防性措施二者。需要治療的受試者包括早就患有紊亂的受試者以及要預(yù)防紊亂的受試者。在免疫相關(guān)疾病的治療中，治療劑可直接改變免疫應(yīng)答成分應(yīng)答的量級，或者使得疾病對其它治療劑例如抗生素、抗真菌劑、抗炎劑、化療劑等的治療更加^:感。在補體相關(guān)疾病的治療中，治療可例如預(yù)防或減緩疾病的發(fā)展。因此，補體相關(guān)眼狀況的治療明確包括預(yù)防、抑制、或減緩狀況的形成或者由狀況的一個階段發(fā)展成另一個更高階段或發(fā)展成更嚴(yán)重的相關(guān)狀況。疾病諸如補體相關(guān)疾病的"病理學(xué)"包括所有現(xiàn)象，包括患者的舒適感(well-being)。這包括但不限于異常或不受控制的細(xì)胞生長(嗜中性細(xì)胞、嗜曙紅細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞)、抗體生成、自身抗體生成、補體生成、干擾鄰近細(xì)胞的正常機能、以異常水平釋放細(xì)胞因子或其它分泌產(chǎn)物、任何炎性或免疫學(xué)應(yīng)答的遏制或加重、炎性細(xì)胞(嗜中性細(xì)胞、嗜曙紅細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞)浸潤進(jìn)入細(xì)胞空間(cellularspace)、玻璃疾形成、視力喪失等。術(shù)語"哺乳動物"在用于本文時指歸入哺乳類的任何動物，包括但不限于人、非人靈長類動物、家畜和牲畜，及動物園、運動或?qū)櫸飫游铮T如馬、豬、牛、犬、貓和雪貂等。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，哺乳動物指人或非人靈長類動物，最優(yōu)選人。"聯(lián)合"一種或多種其它治療劑的施用包括同時(并發(fā))施用和任意順序的順序施用。術(shù)語"細(xì)胞因子，，是由一種細(xì)胞群釋放的、作為細(xì)胞間介質(zhì)作用于另一細(xì)胞的蛋白質(zhì)的通稱。此類細(xì)胞因子的例子有淋巴因子、單核因子和傳統(tǒng)的多肽激素。細(xì)胞因子中包括生長激素，諸如人生長激素、n-曱硫氨酰人生長激素和牛生長激素；曱狀旁腺素；甲狀腺素；胰島素；胰島素原；松馳素；松馳素原；糖蛋白激素類，諸如促卵泡激素(FSH)、促曱狀腺激素(TSH)和促黃體激素(LH);肝生長因子；成纖維細(xì)胞生長因子；促乳素；胎盤催乳激素；腫瘤壞死因子-a和-{3;穆勒氏(Mullerian)抑制性物質(zhì)；小鼠促性腺激素相關(guān)肽；抑制素；激活素；血管內(nèi)皮生長因子；整聯(lián)蛋白；血小板生成素(TPO);神經(jīng)生長因子，諸如NGF-(3;血小板衍生生長因子；轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)，諸如TGF-a和TGF-p;胰島素樣生長因子-I和-II;4足紅細(xì)胞生成素(EPO);骨誘導(dǎo)因子；干擾素，諸如干擾素-a、-P和-y;集落刺激因子(CSF),諸如巨噬細(xì)胞CSF(M-CSF)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞CSF(GM-CSF)和粒細(xì)胞CSF(G-CSF);白介素(IL),諸如IL-1、IL陽la、IL隱2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、28IL-8、IL-9、IL-ll、IL-12;腫瘤壞死因子，諸如TNF-a或TNF-(3;及其它多肽因子，包括LIF和kit配體(KL)。在用于本文時，術(shù)語細(xì)胞因子包括來自天然來源或來自重組細(xì)胞培養(yǎng)物的蛋白質(zhì)及天然序列細(xì)胞因子的生物學(xué)活性等效物。"治療有效量"指在目標(biāo)疾病或狀況，諸如例如補體相關(guān)(眼)疾病或狀況或者癌的狀態(tài)，例如病理學(xué)中實現(xiàn)可測量改善所需活性CRIg、CRIg激動劑和拮抗劑的量。術(shù)語"控制序列"指在特定宿主生物體中表達(dá)可操作連接的編碼序列所必需的DNA序列。例如，適于原核生物的控制序列包括啟動子、任選的操縱基因序列、和核糖體結(jié)合位點。已知真核細(xì)胞利用啟動子、多腺苷酸化信號、和增強子。若一條核酸與另一條核酸序列處于功能性相互關(guān)系中，則它是"可操作連4妻，，的。例長口，若前序歹'J(presequence)或分泌前導(dǎo)(secretoryleader)的DNA表達(dá)成參與多肽分泌的前蛋白質(zhì)(preprotein),則它與多肽的DNA可操作連接；若啟動子或增強子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則它與該序列可操作連接；或者，若核糖體結(jié)合位點的位置促進(jìn)翻譯，則它與編碼序列可操作連接。通常，"可操作連接，，意味著相連的DNA序列是相鄰的，而且在分泌前導(dǎo)的情況中意味著相鄰且處于閱讀狀態(tài)。然而，增強子不必相鄰。連接可通過在方便的限制性位點處的連接反應(yīng)來實現(xiàn)。如果沒有此類位點，那么依照常規(guī)實踐使用合成的寡核苷酸銜接頭或接頭。雜交反應(yīng)的"嚴(yán)格性，，可以容易的由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員確定，而且通常根據(jù)探針長度、洗滌溫度、和鹽濃度憑經(jīng)驗計算。通常，較長的探針要求較高的溫度以正確退火，而較短的探針需要較低的溫度。雜交通常依賴于當(dāng)互補鏈存在于低于其解鏈溫度的環(huán)境中時變性DNA重新退火的能力。探針和可雜交序列之間的期望同源性程度越高，可使用的相對溫度也越高。結(jié)果是，推斷出較高相對溫度將趨向于使反應(yīng)條件更為嚴(yán)格，而較低溫度也就較不嚴(yán)格。關(guān)于雜交反應(yīng)嚴(yán)格性的另外細(xì)節(jié)和解釋，參見Ausubel等人，《CurrentProtocolsinMolecularBiology》,WileyIntersciencePublishers，1995。"嚴(yán)格條件"或"高嚴(yán)格性條件"，如本文中所定義的，可如下鑒別(1)采用低離子強度和高溫進(jìn)行洗滌，例如0.015M氯化鈉/0.0015M檸檬酸鈉/0.1%十二烷基硫酸鈉，50°C;(2)在雜交過程中采用變性劑，諸如曱酰胺，例如50。/。(v/v)曱酰胺及0.1%牛血清清蛋白/0.1%Ficoll/0.1%聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸鈉緩沖液pH6.5,含750mM氯化鈉，75mM檸檬酸鈉，42。C;或(3)采用50%曱酰胺，5xSSC(0.75MNaCl,0.075M檸檬酸鈉),50mM磷酸鈉(pH6.8),0.1%焦磷酸鈉，5xDenhardt氏溶液，超聲處理的鮭魚精DNA(50嗎/ml)，0.1。/。SDS,和10%硫酸右旋糖香，42°C,及42。C0.2xSSC(氯化鈉/檸檬酸鈉)和50%曱酰胺中洗滌，接著在含EDTA的O.lxSSC中于55。C進(jìn)行高嚴(yán)格性洗滌。"中等嚴(yán)格條件，，可以如Sambrook等人，《MolecularCloning:ALaboratoryManual》，NewYork,ColdSpringHarborPress,1989所述鑒別，包4舌4吏用比上文所述較不嚴(yán)格的洗滌溶液和雜交條件(例如溫度、離子強度和。/。SDS)。中等嚴(yán)格條件的一個例子是于37。C在含20%曱酰胺，5xSSC(150mMNaC1.15mM檸檬酸三鈉)，50mM磷酸鈉(pH7.6),5xDenhardt氏溶液，10%硫酸右旋糖苷，和20mg/ml變性剪切的鮭魚精DNA的溶液中溫育過夜，接著在lxSSC中于約37-50。C洗滌濾膜。技術(shù)人員將認(rèn)識到如何根據(jù)需要調(diào)整溫度、離子強度等以適應(yīng)諸如探針長度等因素。術(shù)語"表位標(biāo)記的"在用于本文時指包含與"標(biāo)簽多肽"融合的本發(fā)明多肽的嵌合多肽。標(biāo)簽多肽具有足夠殘基以提供表位而可制備針對其的抗體，但又足夠短使得其不干擾與其融合的多肽的活性。標(biāo)簽多肽優(yōu)選還是相當(dāng)獨特的，使得所述抗體基本上不與其它表位發(fā)生交叉反應(yīng)。合適的標(biāo)簽多肽通常具有至少6個氨基酸殘基且通常在約8個到約50個氨基酸殘基之間(優(yōu)選在約10個到約20個氨基酸殘基之間)。"有活性的"或"活性"在本發(fā)明CRIg多肽變體的語境中指保留天然的或天然存在的本發(fā)明多肽的生物學(xué)和/或免疫學(xué)活性的此類多肽的形式。一種優(yōu)選的生物學(xué)活性是結(jié)合C3b和/或影響補體或補體活化，特別是抑制補體旁路途徑和/或C3轉(zhuǎn)變酶的能力。對C3轉(zhuǎn)變酶的抑制可例如通過測量膠原或抗體誘發(fā)的關(guān)節(jié)炎期間正常血清中對C3周轉(zhuǎn)(turnover)的抑制或關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)中對C3沉積的抑制來測量。"生物學(xué)活性"在抗體、多肽或才莫擬CRIg生物學(xué)活性且可通過本文所公開的篩選測定法鑒定的其它分子(例如有機或無機小分子、肽等)的語境中部分指此類分子結(jié)合C3b和/或影響補體或補體活化，特別是抑制補體旁路途徑和/或C3轉(zhuǎn)變酶的能力。術(shù)語CRIg"激動劑"以最廣義使用，包括定性模擬天然序列CRIg多肽的生物學(xué)活性(如上文所定義的)任何分子。此CRIg激動劑明確包括CRIg-Ig，例如CRIg-Fc融合多肽(免疫粘附素)，還包括模擬至少一種CRIg生物學(xué)活性的小分子。優(yōu)選的是，生物學(xué)活性指阻斷補體途徑，尤其是補體旁路途徑。術(shù)語"拮抗劑"以最廣義使用，包括部分或完全定性阻斷、抑制、或中和天然多肽，諸如天然序列CRIg多肽的生物學(xué)活性的任何分子。合適的激動劑或拮抗劑分子明確包括激動性或拮抗性抗體或抗體片段，本發(fā)明天然多肽的片段、融合物或氨基酸序列變體，肽，小分子，包括有機小分子等。"小分子"在本文中定義為分子量低于約600，優(yōu)選低于約IOOO道爾頓。術(shù)語"抗體，，以最廣義使用，明確覆蓋但不限于單一抗CRIg單克隆抗體(包括激動性、拮抗性、和中和性抗體)和具有多表位特異性的抗CRIg抗體組合物。術(shù)語"單克隆抗體"在用于本文時指從一群基本上同質(zhì)的抗體獲得的抗體，即構(gòu)成群體的各個抗體相同，除了可能以極小量存在的可能的天然存在突變外。"抗體"(Ab)和"免疫球蛋白"(Ig)指具有相同結(jié)構(gòu)特征的糖蛋白。雖然抗體展示出對特定抗原的結(jié)合特異性，但是免疫球蛋白包括抗體和缺乏抗原特異性的其它抗體樣分子二者。后一類多肽例如由淋巴系統(tǒng)以^^水平生成和由骨髓瘤以升高的水平生成。術(shù)語"抗體"以最廣義使用，明確覆蓋但不限于完整的單克隆抗體、多克隆抗體、由至少兩種完整抗體形成的多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、和抗體片段，只要它們展示出期望的生物學(xué)活性。"天然抗體"和"天然免疫球蛋白"通常是由兩條相同的輕鏈(L)和兩條相同的重鏈(H)構(gòu)成的約150,000道爾頓的異四聚體糖蛋白。每條輕鏈通過一個共價二硫鍵與重鏈連接，而二硫鍵的數(shù)目在不同免疫球蛋白同種型的重鏈中有所變化。每條重鏈和輕鏈還具有間隔規(guī)律的鏈內(nèi)二硫鍵。每條重鏈在一端具有一個可變區(qū)(VH),接著是多個恒定區(qū)(Ch)。每條輕鏈在一端具有一個可變區(qū)(VL),而另一端是一個恒定區(qū)(C。。輕鏈的恒定區(qū)與重鏈的第一恒定區(qū)排列在一起，而輕鏈的可變區(qū)與重鏈的可變區(qū)排列在一起。認(rèn)為特定的氨基酸殘基在輕《連和重4連可變區(qū)之間形成界面。術(shù)語"可變的"指可變區(qū)中的某些部分在抗體序列中差異廣泛且用于每種特定抗體針對其特定抗原的結(jié)合和特異性的實情。然而，變異性并非均勻分布于抗體的整個可變區(qū)。它集中于輕鏈和重鏈可變區(qū)二者中稱作互補決定區(qū)(CDR)或高變區(qū)的三個區(qū)段。可變區(qū)中更加高度保守的部分稱作框架區(qū)(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變區(qū)各自包含四個FR,它們大多采取(3-折疊構(gòu)象，通過形成環(huán)狀連接且在有些情況中形成p-折疊結(jié)構(gòu)一部分的三個CDR連接。每條鏈中的CDR通過FR非常接近的保持在一起，并與另一條鏈的CDR—起促成抗體的抗原結(jié)合位點的形成(參見Kabatetal.,NIHPubl.No.91-3242,Vol.I,pages647-669(1991))。恒定區(qū)不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但展現(xiàn)出多種效應(yīng)物功能，諸如抗體依賴性細(xì)胞毒性中抗體的參與。"抗體片段"包含完整抗體的一部分，優(yōu)選完整抗體的抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)?？贵w片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；雙抗體；線性抗體(Zapataetal.,ProteinEng.8(10):1057-1062[1995]);單鏈抗體分子；及由抗體片段形成的多特異性抗體。具體而言，此定義所涵蓋的抗體片段的例子包括(i)Fab片段，其具有VL、CL、VH和CH1結(jié)構(gòu)域；(ii)Fab'片段，其是在CHI結(jié)構(gòu)域的C-末端具有一個或多個半胱氨酸殘基的Fab片段；(iii)Fd片段，其具有VH和CHI結(jié)構(gòu)域；(iv)Fd'片段，其具有VH和CHI結(jié)構(gòu)域及CHI結(jié)構(gòu)域C-末端的一個或多個半胱氨酸殘基；(v)Fv片段，其具有單臂抗體的VL和VH結(jié)構(gòu)域；(vi)dAb片段(Wardetal.,Nature341:544-546(1989))，其由VH結(jié)構(gòu)域構(gòu)成；(vii)分離的CDR區(qū)；(viii)F(ab')2片段，包含通過鉸鏈區(qū)的二硫鍵相連的兩個Fab'片段的二價片段；(ix)單鏈抗體分子(例如單鏈Fv;scFv)(Birdetal.,Science242:423-426(1988);Hustonetal"PNAS(USA)85:5879-5883(1988));(x)"雙抗體"，其具有兩個抗原結(jié)合位點，包含在同一條多肽鏈中相連的重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)(參見例如EP404,097;WO93/11161;Hollingeretal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993》；(xi)"線性抗體"，其包含一對串聯(lián)的Fd區(qū)段(VH-CH1-VH-CH1),與互補的輕鏈多肽一起形成一對抗原結(jié)合區(qū)(Zapataetal"ProteinEng.8(10):1057-1062(1995);美國專利5,641,870)。用木瓜蛋白酶消化抗體產(chǎn)生兩個相同的抗原結(jié)合片段，稱作"Fab"片段，各自具有一個抗原結(jié)合位點，和一個殘余"Fc"片段。"Fc"的名稱反映了易于結(jié)晶的能力。胃蛋白酶處理產(chǎn)生一個F(ab')2片段，它具有兩個抗原結(jié)合位點且仍能夠交聯(lián)抗原。"Fv"是包含完整抗原識別和抗原結(jié)合位點的最小抗體片段。此區(qū)由緊密、非共價結(jié)合的一個重鏈可變區(qū)和一個輕鏈可變區(qū)的二聚體組成。正是在這種構(gòu)造中，各個可變區(qū)的三個CDR相互作用而在V『VL二聚體表面確定了一個抗原結(jié)合位點。六個CDR共同賦予抗體以抗原結(jié)合特異性。然而，即使是單個可變區(qū)(或只包含對抗原特異的三個CDR的半個Fv)也具有識別和結(jié)合抗原的能力，盡管親和力低于完整結(jié)合位點。Fab片段還包含輕鏈的恒定區(qū)和重鏈的第一恒定區(qū)(CHl)。Fab'片段因在重鏈Cwl結(jié)構(gòu)域的羧基末端增加了少數(shù)殘基而與Fab片段有所不同，包括來自抗體鉸鏈區(qū)的一個或多個半胱氨酸。Fab'-SH是本文中對其中恒定區(qū)半胱氨酸殘基攜帶游離硫醇基的Fab'的稱謂。F(ab')2抗體片段最初是作為成對Fab'片段生成的，在Fab'片段之間具有鉸鏈半胱氨酸。還知道抗體片段的其它化學(xué)偶聯(lián)。根據(jù)其恒定區(qū)氨基酸序列，來自任何脊推動物物種的抗體(免疫球蛋白)輕鏈可歸入兩種截然不同類型中的一種，稱作卡帕(K)和拉姆達(dá)(l)。根據(jù)其重鏈恒定區(qū)氨基酸序列，免疫球蛋白可歸入不同的類別。免疫球蛋白有五種主要的類別IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,其中有些可進(jìn)一步分為亞類(同種型)，例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。將與不同免疫球蛋白類別對應(yīng)的重鏈恒定區(qū)分別稱作a、S、￡、Y和P。不同類別免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)造是眾所周知的。術(shù)語"單克隆抗體"在用于本文時指從一群基本上同質(zhì)的抗體獲得的抗體，即構(gòu)成群體的各個抗體相同，除了可能以極小量存在的可能的天然存在突變外。單克隆抗體是高度特異的，針對單一抗原性位點。另外，與通常包含針對不同決定簇(表位)的不同抗體的常規(guī)(多克隆)抗體制備物不同，每種單克隆抗體針對抗原上的單一決定簇。除了它們的特異性，單克隆抗體的優(yōu)越性體現(xiàn)在它們是通過雜交瘤培養(yǎng)合成的，未受到其它免疫球蛋白的污染。修飾語"單克隆"指示抗體從基本上同質(zhì)的抗體群獲得的特征，并不解釋為要求通過任何特定方法來生成抗體。例如，依照本發(fā)明使用的單克隆抗體可通過最初由Kohleretal.,Nature256:495(1975)記載的雜交瘤方法來制備，或者可通過重組DNA方法來制備(參見例如美國專利4,816,567)。"單克隆抗體"還可使用例如Clacksonetal.,Nature352:624-628(1991)和Marksetal.，J.Mol.Biol.222:581-597(1991)中記載的技術(shù)從噬菌體抗體庫分離。還可參見美國專利5,750,373，5,571,698,5,403,484和5,223,409,它們描述了使用謹(jǐn)菌粒和噬菌體載體制備抗體。單克隆抗體在本文中明確包括"嵌合"抗體(免疫球蛋白)，其中重《連和/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，而鏈的剩余部分與衍生自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，以及此類抗體的片段，只要它們展現(xiàn)所需生物學(xué)活性(美國專利4,816,567;Morrisonetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851-6855(1984》。非人(例如鼠)抗體的"人源化"形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(諸如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗體的其它抗原結(jié)合子序列)。在極大程度上，人源化抗體指人免疫球蛋白(受體抗體)中的互補決定區(qū)(CDR)的數(shù)個或所有殘基用具有期望特異性、親和力和能力的非人物種(供體抗體)諸如小鼠、大鼠或兔的CDR殘基替換的免疫球蛋白。在有些情況中，將人免疫球蛋白的Fv框架區(qū)(FR)殘基用相應(yīng)的非人殘基替換。此外，人源化抗體可包含在受體抗體或輸入CDR或框架序列中都沒有發(fā)現(xiàn)的殘基。進(jìn)行這些修飾是為了進(jìn)一步改進(jìn)抗體的性能和使其最大化。通常，人源化抗體將包含至少一個、通常兩個基本上整個如下可變區(qū)，其中整個或基本上整個CDR對應(yīng)于非人免疫球蛋白的CDR,且整個或基本上整個FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗體最好還將包含至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc),通常是人免疫球蛋白的。更多細(xì)節(jié)參見Jonesetal"Nature321:522-525(1986);Riechmannetal"Nature332:323-329(1988);Presta,CumOp.Struct.Biol.2:593-596(1992)。人源化抗體包括"靈長類化"(primatized)抗體，其中抗體的抗原結(jié)合區(qū)衍生自由通過用目的抗原免疫短尾猴(macaquemonkey)而生成的抗體。包含來自舊大陸猴類(OldWorldmonkeys)的殘基的抗體也有可能在本發(fā)明內(nèi)。參見例如美國專利5,658,570;5,693,780;5,681,722;5,750,105;和5,756,096。"單鏈Fv"或"sFv"抗體片段包含抗體的Vh和V^結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)域存在于一條多肽鏈上。優(yōu)選的是，該Fv多肽在Vh和VL結(jié)構(gòu)域之間還包含多肽接頭，使得sFv能夠形成抗原結(jié)合期望的結(jié)構(gòu)。關(guān)于sFv的綜述參見PltAckthun,《ThePharmacologyofMonoclonalAntibodies》，vol.113,Rosenburg和Moore編，Springer-Verlag，NewYork,pp.269-315,1994。術(shù)語"雙抗體"指具有兩個抗原結(jié)合位點的小型抗體片段，該片段在同一條多肽鏈(Vh-Vl)中包含相連的重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(Vl)。通過使用過短的接頭使得同一條鏈上的兩個結(jié)構(gòu)域之間不能配對，迫使結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補結(jié)構(gòu)域配對，并產(chǎn)生兩個抗原結(jié)合位點。雙抗體更完整的描述于例如EP404,097;WO93/11161;Hollingeretal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993)。人IgGFc區(qū)的"CH2結(jié)構(gòu)域"(也稱為"Cg2"結(jié)構(gòu)域)通常自約第231位氨基酸殘基延伸至約第340位氨基酸殘基。CH2結(jié)構(gòu)域的獨特之處在于它沒有與另一結(jié)構(gòu)域緊密配對。而是，兩個N-連接分支的碳水化合物鏈介入完整天然IgG分子的兩個CH2結(jié)構(gòu)域之間。推測碳水化合物可能提供結(jié)構(gòu)域-結(jié)構(gòu)域配對的替代且有助于穩(wěn)定CH2結(jié)構(gòu)域。Burton,Molec.Immunol.22:161-206(1985)。CH2結(jié)構(gòu)域在本文中可以是天然序列CH2結(jié)構(gòu)域或變異的CH2結(jié)構(gòu)域。"CH3結(jié)構(gòu)域"包含F(xiàn)c區(qū)中CH2結(jié)構(gòu)域C-末端的一段殘基(即自IgG的約第341位氨基酸殘基至約第447位氨基酸殘基)。CH3區(qū)在本文中可以是天然序列CH3結(jié)構(gòu)域或變異的CH3結(jié)構(gòu)域(例如在其一條鏈中具有引入的"隆起"(protroberance)而在其另一條鏈中具有相應(yīng)引入的"空腔"(cavity)的CH3結(jié)構(gòu)域。參見美國專利5,821,333，明確收入本文作為參考)。此類變異的CH3結(jié)構(gòu)域可用于生成本文所述多特異性(例如雙特異性)抗體。"鉸鏈區(qū)"通常定義為自人IgGl的約Glu216或約Cys226至約Pro230的區(qū)段(Burton，Molec.Immunol.22:161-206(1985》。其它IgG同種型的鉸鏈區(qū)可以通過將第一個和最后一個形成重鏈間S-S鍵的半胱氨酸殘基置于相同位置而與IgGl序列對比。鉸鏈區(qū)在本文中可以是天然序列鉸鏈區(qū)或變異的鉸鏈區(qū)。變異鉸鏈區(qū)的兩條多肽鏈通常每條多肽鏈保留至少一個半胱氨酸殘基，使得變異4交鏈區(qū)的兩條多肽鏈可在兩條鏈之間形成二好^建。本文中優(yōu)選的鉸鏈區(qū)是天然序列人鉸鏈區(qū)，例如天然序列人IgGl鉸鏈區(qū)。"功能性Fc區(qū)"具有天然序列Fc區(qū)的至少一種"效應(yīng)物功能"。例示性的"效應(yīng)物功能"包括Clq結(jié)合；補體依賴性細(xì)胞毒性(CDC);Fc受體結(jié)合；抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC);吞噬作用；細(xì)胞表面受體(例如B細(xì)胞受體；BCR)的下調(diào)；等。此類效應(yīng)物功能通常要求Fc區(qū)與結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如抗體可變區(qū))組合，而且可使用本領(lǐng)域知道的用于評估此類抗體效應(yīng)物功能的多種測定法來評估。"天然序列FC區(qū)"包含與自然界中發(fā)現(xiàn)的Fc區(qū)的氨基酸序列相同的氨基酸序列。"變異的Fc區(qū)"由于至少一處氨基酸修飾包含與天然序列Fc區(qū)的氨基酸序列不同的氨基酸序列。優(yōu)選的是，變異的Fc區(qū)與天然序列Fc區(qū)或與親本多肽的Fc區(qū)相比在天然序列Fc區(qū)或親本多肽的Fc區(qū)中具有至少一處氨基酸替代，例如約一個至約十個氨基酸替代，優(yōu)選約一個至約五個氨基酸替代。變異的Fc區(qū)在本文中將通常與天然序列Fc區(qū)和/或與親本多肽的Fc區(qū)具有例如至少約80%序列同一性，或至少約90%序列同一性，或至少約95%或更高序列同一性。"親和力成熟的"抗體指在其一個或多個CDR中具有導(dǎo)致抗體對抗原的親和力與沒有那些改變的親本抗體相比有所改進(jìn)的一處或多處改變的抗體。優(yōu)選的親和力成熟的抗體將具有納摩爾或甚至皮摩爾水平的對靶抗原的親和力。親和力成熟的抗體可通過本領(lǐng)域已知流程生成。Marksetal.,Bio/Technology10:779-783(1992)描述了通過VH和VL結(jié)構(gòu)域改組的親和力成熟。下列文獻(xiàn)描述了CDR和/或框架殘基的隨機誘變Barbasetal.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA91:3809-3813(1994);Schieretal.,Gene169:147-155(1995);Yeltonetal"J.Immunol.155:1994-2004(1995);Jacksonetal.,J.Immunol.154(7):3310-9(1995);及Hawkinsetal.,J.Mol.Biol.226:889-896(1992)。"柔性接頭，，在本文中指包含兩個或更多通過肽鍵相連的氨基酸殘基且為由其連接的兩段多肽(諸如兩個Fd區(qū))提供更多旋轉(zhuǎn)自由的肽。所述旋轉(zhuǎn)自由容許由柔性接頭連接的兩個或更多抗原結(jié)合位點各自更高效的4妻近輩巴抗原。合適的柔性4妾頭月太序列的例子包括gly-ser、gly-ser-gly-ser、ala-ser、和gly-gly-gly-ser。"單鏈Fv"或"sFv"抗體片段包含抗體的Vh和Vt結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)域存在于一條多肽鏈上。通常，該Fv多肽在Vh和VL結(jié)構(gòu)域之間還包含多肽接頭，使得sFv能夠形成抗原結(jié)合期望的結(jié)構(gòu)。關(guān)于sFv的綜述參見Pliickthun,《ThePharmacologyofMonoclonalAntibodies》，vol.113，Rosenburg和Moore編，Springer-Verlag,NewYork,pp.269-315,1994。"分離的，，多肽諸如抗體指已經(jīng)鑒定且與/由其天然環(huán)境的一種成分分開和/或回收的多肽。其天然環(huán)境的污染性成分指將會干擾該抗體的診斷或治療用途的物質(zhì)，可包括酶、激素、和其它蛋白質(zhì)性質(zhì)或非蛋白質(zhì)性質(zhì)的溶質(zhì)。在優(yōu)選的實施方案中，將多肽，包括抗體純化至(l)根據(jù)Lowry方法的測定，抗體重量超過95%，最優(yōu)選重量超過99%,(2)足以通過4吏用轉(zhuǎn)杯式測序儀獲得至少15個殘基的N-末端或內(nèi)部氨基酸序列的程度，或(3)根據(jù)使用考馬斯藍(lán)或優(yōu)選銀染色的還原性或非還原性條件下的SDS-PAGE，達(dá)到同質(zhì)。既然化合物天然環(huán)境的至少一種成分不會存在，那么分離的化合物，例如抗體或其它多肽包括重組細(xì)胞內(nèi)的原位化合物。然而，分離的化合物通常將通過至少一個純化步驟來制備。詞語"標(biāo)記物"在用于本文時指與化合物，例如抗體或多肽直接或間接偶聯(lián)從而產(chǎn)生"經(jīng)標(biāo)記"化合物的可4全測化合物或組合物。標(biāo)記物可以是自身就可檢測的(例如放射性同位素標(biāo)記物或熒光標(biāo)記物)，或者在酶標(biāo)記物的"固相，，指本發(fā)明的化合物可粘著的非水性基質(zhì)。本文中所涵蓋的固相的例子包括那些部分或完全由玻璃(例如可控孔徑玻璃)、多糖(例如瓊脂糖)、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇和聚硅氧(silicone)制成的固相。在某些實施方案中，根據(jù)語境，固相可包括測定板的孔；在其它實施方案中，它指純化柱(例如親和層析柱)。此術(shù)語還包括離散顆粒的不連續(xù)固相，諸如美國專利4,275,149中所述。"脂質(zhì)體"指由各種類型脂質(zhì)、磷脂和/或表面活性劑構(gòu)成的，可用于對哺乳動物投遞藥物(諸如本文中所公開的抗ErbB2抗體和任選的化療劑)的小嚢泡。與生物膜的脂質(zhì)排列相似，脂質(zhì)體的成分通常排列成雙層形式。在用于本文時，術(shù)語"免疫粘附素"指將異源蛋白質(zhì)("粘附素")的結(jié)合特異性與免疫球蛋白恒定區(qū)的效應(yīng)物功能聯(lián)合起來的抗體樣分子。在結(jié)構(gòu)上，免疫粘附素包括不同于抗體的抗原識別和結(jié)合位點(即是"異源"的)、具有期望結(jié)合特異性的氨基酸序列和免疫球蛋白恒定區(qū)序列的融合物。免疫粘附素分子的粘附素部分通常是至少包含受體或配體的結(jié)合位點的連續(xù)(contiguous)氨基酸序列。免疫粘附素中的免疫球蛋白恒定區(qū)序列可從任何免疫球蛋白獲得，諸如IgG-l、IgG-2、IgG-3或IgG-4亞型、IgA(包括IgA-l和IgA-2)、IgE、IgD或IgM。"血管發(fā)生因子或血管發(fā)生劑，，指刺激血管發(fā)育，例如促進(jìn)血管發(fā)生、內(nèi)皮細(xì)胞生長、血管穩(wěn)定性、和/或血管生成(vasculogenesis)等的生長因子。例如，血管發(fā)生因子包括但不限于例如VEGF和VEGF家族的成員、P1GF、PDGF家族、成纖維細(xì)胞生長因子家族(FGF)、T正配體(血管生成素)、ephrins、ANGPTL3、ANGPTL4等。它還將包括加速傷口愈合的因子，諸如生長激素、胰島素樣生長因子-I(IGF-I)、VIGF、表皮生長因子(EGF)、CTGF及其家族的成員、及TGF隱a和TGF-P。參見例如Klagsbmn和D，Amore,Annu.Rev.Physiol.53:217-39(1991);StreitandDetmar，Oncogene22:3172-3179(2003);Ferrara&Alitalo,NatureMedicine5(12):1359-1364(1999);Toninietal.,Oncogene22:6549-6556(2003)(例如列舉血管發(fā)生因子的表1);SatoInt.J.Clin.Oncol.8:200-206(2003)。"抗血管發(fā)生劑，，或"血管發(fā)生抑制劑，，指或直接或間接抑制血管發(fā)生(angiogenesis)、血管生成(vasculogenesis)、或不想要的血管通透'l"生的小分子量物質(zhì)、多核苷酸、多肽、分離的蛋白質(zhì)、重組蛋白、抗體、或其偶聯(lián)物或融合蛋白。例如，抗血管發(fā)生劑是上文定義的血管發(fā)生劑的抗體或其它拮抗劑，例如VEGF的抗體、VEGF受體的抗體、阻斷VEGF受體發(fā)4言號的小分子(例如PTK787/ZK2284,SU6668)。抗血管發(fā)生劑還包括天然血管發(fā)生抑制劑，例如血管他丁(angiostatin)、內(nèi)皮他丁(endostatin)等。參見例如KlagsbrunandD，Amore，Annu.Rev.Physiol.53:217-39(1991);StreitandDetmar，Oncogene22:3172-3179(2003)。術(shù)語"有效量"指有效治療(包括預(yù)防)哺乳動物中的疾病或紊亂的藥物的量。因此，在年齡相關(guān)黃斑變性(AMD)或脈絡(luò)膜新血管形成(CNV)的情況中，有效量的藥物可減輕或預(yù)防視力喪失。對于AMD療法，體內(nèi)功效可例如通過如下一項或多項來測量評估自基線至預(yù)期時間最佳矯正視力(BCVA)的平均變化；評估在預(yù)期時間與基線相比視力喪失少于15個字母的受試者的比例；評估在預(yù)期時間與基線相比視力獲得超過或等于15個字母的受試者的比例；評估在預(yù)期時間Snellen^L力相當(dāng)于20/2000或更差的受試者的比例；i平估NEI一見覺功能問巻(VisualFunctioningQuestionnaire);"i平估予貞期時間CNV的大小和CNV滲漏的量，通過熒光素血管造影術(shù)評估；等。如果適效量的藥物可抑制、減緩、或者部分或完全阻斷所述發(fā)展。在這種情況中，有效量的測定牽涉疾病的分級，監(jiān)測疾病發(fā)展的時間進(jìn)程，和在必要時調(diào)整劑量以實現(xiàn)期望結(jié)果。II.詳述本發(fā)明關(guān)注從胎肺文庫克隆得到的、鑒定為巨噬細(xì)胞相關(guān)的單次跨膜Ig超家族成員(STigMA)或免疫球蛋白家族的補體受體(CRIg)多肽、與A33抗原和JAM1具有同源性的新巨噬細(xì)胞相關(guān)受體的用途。天然人CRIg表達(dá)成兩種剪接變體，一種包含N-末端IgV樣結(jié)構(gòu)域和C-末端IgC2樣結(jié)構(gòu)域，而一種剪"t妄形式缺乏C-末端結(jié)構(gòu)域(分別是SEQIDNO:4和6)。兩種受體都具有單一跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，包含在體外在巨噬細(xì)胞中組成性磷酸化的酪氨酸殘基。發(fā)現(xiàn)小鼠同系物與人CRIg具有67。/。序列同源性(SEQIDNO:8)。全長人CRIg多肽還具有較短型式，缺失N-末端區(qū)段(SEQIDNO:2)。如下文實施例所示，CRIg結(jié)合補體C3b并抑制C3轉(zhuǎn)變酶。CRIg在駐留組織的巨噬細(xì)胞上選擇性表達(dá)，其表達(dá)受地塞米松和IL-10上調(diào)，受LPS和IFN-y下調(diào)，且抑制不依賴B或T細(xì)胞應(yīng)答的、膠原和抗體誘發(fā)的關(guān)節(jié)炎。另外，發(fā)現(xiàn)CRIg在Kupffer細(xì)胞上高度表達(dá)，結(jié)合C3b和iC3b調(diào)理素，且是快速清除循環(huán)中的病原體所要求的。在結(jié)構(gòu)上，CRIg與已知補體受體的不同之處在于它缺乏CR1和CR2中組合的C3b和C4b結(jié)合短共有重復(fù)序列，以及C3和CR4中存在的整聯(lián)蛋白樣結(jié)構(gòu)域。盡管補體受體CRl-4在極其多種細(xì)胞類型上表達(dá)，然而CRIg表達(dá)限于駐留組織的巨噬細(xì)胞，包括肝Kupffer細(xì)胞。消減研究確立了Kupffer細(xì)胞在感染早期在C3依賴性快速清除利斯特氏菌中的角色(Kaufmann,AnnuRev.Immunol.11:129-163(1993);Gregoryetal.，J.Immunol.168:308-315(2002))，但是此過程中牽涉的受體迄今尚未鑒定。下文實施例中呈現(xiàn)的研究證明了巨噬細(xì)胞表達(dá)的CRIg結(jié)合沉積在病原體表面上的C3b和iC3b。由于對C3b和iC3b的此雙重結(jié)合活性，CRIg是高效清除經(jīng)這兩種C3降解成分調(diào)理的單核細(xì)胞增生利斯特氏菌(LM)所要求的。CRIg在肝臟快速清除C3調(diào)理的顆粒中的重要性得到進(jìn)一步支持，即CRIg敲除(ko)小鼠未能從循環(huán)中有效清除C3調(diào)理的LM,導(dǎo)致多種器官中病原體的負(fù)荷升高和死亡率升高。在缺乏C3時，CRIg敲除野生型(wt)小鼠同樣好的清除利斯特氏菌，表明CRIg功能依賴C3的存在。補體受體CR1-4在肝Kupffer細(xì)胞清除LM中的角色尚未清楚確立。CR1和CR2在駐留組織的巨噬細(xì)胞上不存在，而且在濾泡樹突細(xì)胞和B細(xì)胞上以優(yōu)勢表達(dá)，在此它們擔(dān)任調(diào)節(jié)T和B細(xì)胞應(yīng)答的角色(Krych-GoldberandAtkinson,Immunol.Rev.180:112-122(2001);Molinaetal.，丄Exp.Med.175:Ul-129(1992);和實施例)。CR3在KC上以低水平表達(dá)，但是缺乏CR3和CR4二者的CD18共同[3鏈、導(dǎo)致非功能性受體的敲除型小鼠顯示出降低的、而非升高的對感染的易感性(Wuetal.,Infect.Immun.71:5986-5993(2003))。因此，CRIg代表了快速清除C3調(diào)理的顆粒中網(wǎng)狀-內(nèi)皮吞噬細(xì)胞系統(tǒng)的主要成分。除了它在肝Kupffer細(xì)胞上的表達(dá)，CRIg存在于多種組織中的巨噬細(xì)胞亞群上，包括腹膜、心、肺、腎上腺和腸。已知這些巨噬細(xì)胞在死細(xì)胞和細(xì)胞殘骸的吞謹(jǐn)作用中4旦4壬重要角色(Almeidaetal.,Ann.N.Y.Acad.Sci.1019:135-140(2004);CastellucciandZaccheo,Prog.Clin.Biol.Res.296:443-451(1989);Tayloretal.，Annu.Rev.Immunol.23:901-944(2005))。這些駐留巨噬細(xì)胞上的CRIg表達(dá)可介導(dǎo)多種顆粒的補體依賴性調(diào)理吞噬作用。這得到了如下發(fā)現(xiàn)的支持，即CRIg敲除型小鼠展示出其心和肝組織中的LM降低，盡管循環(huán)LM負(fù)荷升高。因此，CRIg代表了在組織巨噬細(xì)胞中表達(dá)且充當(dāng)快速清除補體調(diào)理的病原體的入口的新受體。下文實施例呈現(xiàn)的結(jié)果進(jìn)一步證明了CRIg在循環(huán)嚢泡的胞內(nèi)池上表達(dá)，由此確保細(xì)胞表面上CRIg的持續(xù)供應(yīng)，供結(jié)合C3調(diào)理的顆粒。另夕卜，表達(dá)CRIg的內(nèi)體迅速募集至顆粒接觸部位，在此它們可能有助于將膜交付給形成吞噬體。CRIg在C3調(diào)理的顆粒的吞噬作用中的重要性得到顯示，即缺乏CRIg的KC沒有能力結(jié)合C3b和iC3b,導(dǎo)致對C3調(diào)理的單核細(xì)胞增生利斯特氏菌的吞噬作用降低(見實施例)。CRIg的亞細(xì)胞定位和胞內(nèi)運輸與已知補體C3受體不同。盡管CRIg定位于組成性循環(huán)的內(nèi)體上，CR1、CR3和CR4位于分泌嚢泡上，所述分泌嚢泡在細(xì)胞因子刺激細(xì)胞時與質(zhì)膜融合(Sengelovetal.,J.Immunol.153:804-810(1994);和Sengelovetal.,Crit.Rev.Immunol.15:107-131(1995》，且只在受體交聯(lián)后通過大胞々大過程內(nèi)在化配體(Carpentieretal.,CellRegul.2:41-55(1991);Brownetal.,CumOpin.Immunol.3:76-82(1991))。結(jié)果是，纟田胞表面上的CRIg表達(dá)在刺激細(xì)胞后下調(diào)，而CR1和CR3細(xì)胞表面表達(dá)在刺激后升高。此升高充當(dāng)結(jié)合和吞噬作用中的重要步驟，且像CRIg—樣，CR3在C3調(diào)理的顆粒周圍的吞噬細(xì)胞杯和吞噬體中集中(AderemandUnderhill,Annu.Rev.Immunol.17:593-623(1999))。靜息巨喧細(xì)胞中CRIg對配體的組成性循環(huán)和內(nèi)吞作用與在炎性應(yīng)答前在細(xì)菌感染的初始階—段期間，以及在非炎性狀況下從循環(huán)中清除顆粒期間擔(dān)任結(jié)合補體調(diào)理的顆粒的作用(例如募集激活的吞噬細(xì)胞)一致。補體在機體防御中扮演關(guān)鍵角色，而且與免疫系統(tǒng)的其它成分一起保護(hù)個體免于病原體侵入機體。然而，如果沒有恰當(dāng)活化或控制，補體還可引起對宿主組織的損傷。補體的不當(dāng)活化牽涉多種疾病的發(fā)病機理，稱為補體相關(guān)疾病或紊亂，諸如免疫復(fù)合物和自身免疫病，及多種炎性狀況，包括補體介導(dǎo)的炎性組織損傷。補體相關(guān)疾病的病理學(xué)有所不同，可能牽涉一段較長或較短時間的補體活化，完整級聯(lián)、只有級聯(lián)之一(例如經(jīng)典或旁路途徑)、只有級聯(lián)的有些成分的活化，等。在有些疾病中，補體片段的補體生物學(xué)活性導(dǎo)致組織損傷和疾病。因此，補體的抑制劑具有高治療潛力。旁路途徑的選擇性抑制劑將是特別有用的，因為通過經(jīng)典途徑從血液中清除病原體和其它有機體將保持完整。已知C3b共價調(diào)理侵入機體的微生物的表面，且充當(dāng)吞噬細(xì)胞上存在的補體受體的配體，最終導(dǎo)致對病原體的吞噬作用。在許多病理狀態(tài)中，諸如上文所列，補體將在細(xì)胞表面上活化，包括血管壁、關(guān)節(jié)中的軟骨、肝中的小球(glomemli)或缺乏內(nèi)在補體抑制物的細(xì)胞。補體活化導(dǎo)致由過敏毒素C3a和C5a的化學(xué)引誘物特性引起的炎癥，而且可引起通過生成膜攻擊復(fù)合物對自身細(xì)胞的損傷。不限于任何具體理論，通過結(jié)合C3b，認(rèn)為CRIg抑制C3轉(zhuǎn)變酶，由此預(yù)防或減輕補體介導(dǎo)的疾病，其例子已列于上文。本發(fā)明的化合物丄夭,然#/{/和炎^C7/g/妖上文已經(jīng)討論了天然CRIg分子及其核酸和多肽序列的制備。實施例1顯示了SEQIDNO:4的全長huCRIg的克隆。CRIg多肽可通過培養(yǎng)經(jīng)包含CRIg核酸的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞來生成。當(dāng)然，設(shè)想了本領(lǐng)域眾所周知的、可用于制備CRIg的替代方法。例如，CRIg序列或其部分可使用固相技術(shù)通過直接肽合成來生成(參見例如Stewartetal.,Solid-PhasePeptideSynthesis,W.H.FreemanCo.,SanFrancisco,CA(1969);Merrifield，J.Am.Chem.Soc.85:2149-2154(1963))。體外蛋白質(zhì)合成可4吏用手工才支術(shù)或通過自動化來進(jìn)行。自動化合成可例如使用AppliedBiosystems肽合成儀(FosterCity,CA)使用制造商的說明書來實現(xiàn)。CRIg的各個部分可分別化學(xué)合成，并使用化學(xué)或酶j足方法組合以生成全長CRIg。CRIg變體可通過將適宜的核苷酸變化導(dǎo)入編碼天然序列CRIg多肽的DNA，或者通過合成期望的CRIg多肽來制備。本領(lǐng)域技術(shù)人員將領(lǐng)會氨基酸變化可能改變CRIg的翻譯后加工，諸如改變糖基化位點的數(shù)目或位置或者改變膜錨定特征?？蛇M(jìn)行本文所述天然序列CRIg多肽中的變異，例如使用用于保守和非保守突變的任何技術(shù)和方針，例如美國專利5,364,934中所列。變異可以是替代、刪除或插入一個或多個編碼天然序列或變異CRIg的密碼子，導(dǎo)致其氨基酸序列與相應(yīng)的天然序列或變異CRIg相比有變化。任選的是，變異是通過將天然序列CRIg多肽的一個或多個結(jié)構(gòu)域中的至少一個氨基酸用任何其它氨基酸替代。確定哪個氨基酸殘基可插入、替代或刪除而對期望活性沒有不利影響的方針可通過比較CRIg與同源已知蛋白質(zhì)分子的序列并將高同源區(qū)中進(jìn)行的氨基酸序列變化的數(shù)目最小化而找到。氨基酸替代可以是將一種氨基酸用具有相似結(jié)構(gòu)和/或化學(xué)特性的另一種氨基酸替換的結(jié)果，諸如用絲氨酸替換亮氨酸，即保守氨基酸替換。插入或刪除可以任選在1-5個氨基酸的范圍內(nèi)。允許的變異可通過在序列中系統(tǒng)進(jìn)行氨基酸插入、刪除或替代并在下文實施例中描述的體外測定法中測試所得變體的活性來確定。變異可使用本領(lǐng)域已知的方法來進(jìn)行，諸如寡核苷酸介導(dǎo)的(定點)誘變、丙氨酸掃描、和PCR誘變?？稍诳寺〉腄NA上進(jìn)行定點誘變(Carteretal.,Nucl.AcidsRes.13:4331(1986);Zolleretal.,Nucl.AcidsRes.10:6487(1987》、盒式誘變(Wellsetal.，Gene34:315(1985》、P艮制性選擇誘變(Wellsetal.,Philos.Trans.R.Soc.LondonSerA317:415(1986))或其它已知才支術(shù)以生成CRIg變體DNA。還可采用掃描氨基酸分析以鑒定沿著毗鄰序列可變化的一個或多個氨基酸。優(yōu)選的掃描氨基酸是相對較小的中性氨基酸。此類氨基酸包括丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸和半胱氨酸。丙氨酸通常是這一類中的優(yōu)選掃描氨基酸，因為它消除了(3-碳的側(cè)鏈且不大可能改變變體的主鏈構(gòu)象。丙氨酸通常還因為它是最常見的氨基酸而成為優(yōu)選的。此外，在隱藏的和暴露的位置都經(jīng)常可以找到它(Creighton,TheProteins,W.H.Freeman&Co.,N.Y.;Chothia,J.Mol.Biol.150:1(1976))。如果丙氨酸替代不產(chǎn)生足夠量的變體，那么可使用等構(gòu)(isoteric)氛基酸。發(fā)現(xiàn)消除或滅活整個或部分跨膜區(qū)和/或胞質(zhì)區(qū)不損害CRIg生物學(xué)活性。因此，跨膜區(qū)和/或胞質(zhì)區(qū)刪除/滅活的CRIg變體明確的在本發(fā)明范圍內(nèi)。類似的，有生物學(xué)活性的天然短型huCRIg和鼠同系物的存在證明，可消除IgC2區(qū)而不損害生物學(xué)活性。天然序列和變異CRIg多肽的共價修飾包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。一種類型的共價修飾包括使CRIg的靶定氨基酸殘基與有機衍生劑反應(yīng)，該試劑能夠與CRIg多肽的選定側(cè)鏈或N-或C-末端殘基反應(yīng)。使用雙功能劑的衍生化可用于例如使CRIg與不溶于水的支持物基質(zhì)或表面交聯(lián)，例如用于純化抗CRIg抗體的方法。常用的交聯(lián)劑包括例如1,1-雙(重氮乙酰)-2-苯乙烷、戊二醛、N-羥基琥珀酰亞胺酯例如與4-疊氮水楊酸的酯、同雙功能亞氨酸酯包括二琥珀酰亞氨基酯諸如3，3'-二硫代二(琥珀酰亞氨基丙酸酯)、雙功能馬來酰亞胺諸如二-N-馬來酰亞胺-l，8-辛烷、及諸如3-[(對疊氮苯基)二硫代]丙酰亞氨酸曱酯等試劑。其它1^飾包括谷氨酰胺酰和天冬酰胺酰殘基分別脫酰胺成相應(yīng)的谷氨酰和天冬氨酰殘基、脯氨酸和賴氨酸的羥基化、絲氨?；蛱K氨酰殘基羥基的磷酸化、賴氨酸、精氨酸和組氨酸側(cè)鏈a-氨基的曱基化(T.E.Creighton,Proteins:StructureandMolecularProperties,W.H.Freeman&Co.,SanFrancisco,pp.79-86(1983))、N-末端胺的乙?；⒓叭魏蜟-末端羧基的酰胺化。本發(fā)明范圍內(nèi)所包括的對CRIg多肽的另一種類型的共價修飾包括改變多肽的天然糖基化樣式。"改變天然糖基化樣式"在本文中意圖指刪除一個或多個在天然序列CRIg中發(fā)現(xiàn)的碳水化合物模塊(moiety)，和/或添加一個或多個在天然序列CRIg中不存在的糖基化位點，和/或改變附著于糖基化位點的糖殘基的比例和/或組成。在鼠CRIg的第170位發(fā)現(xiàn)預(yù)測的天然糖基化位點，序列為NGTG。多肽的糖基化通?；蚴荖-連接的或是O-連接的。N-連接糖基化指碳水化合物模塊附著于天冬酰胺殘基的側(cè)鏈。三肽序列天冬酰胺-X-絲氨酸和天冬酰胺-X-蘇氨酸(其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸)是將碳水化合物模塊酶促附著于天冬酰胺側(cè)鏈的識別序列。O-連接糖基化指糖類N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附著于羥基氨基酸，最常見的是絲氨酸或蘇氨酸，但在O-連接糖基化中也可能牽涉5-羥脯氨酸或5-羥賴氨酸。天然序列CRIg具有不顯著的N-糖基化。向CRIg多肽中添加糖基化位點可通過改變氨基酸序列來實現(xiàn)。改變可通過例如向天然序列CRIg中添加或^,^l一個或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基來進(jìn)行(用于O-連接的糖基化位點)，或者添加N-連接糖基化的識別序列?？扇芜x通過DNA水平的變化來改變CRIg氨基酸序列，特別是通過在預(yù)先選擇的堿基處突變編碼CRIg多肽的DNA,從而產(chǎn)生將翻譯成期望氨基酸的密碼子。增加CRIg多肽上碳水化合物模塊的數(shù)目的另一種手段是通過使糖苷與多肽化學(xué)或酶促偶聯(lián)。本領(lǐng)域?qū)Υ祟惙椒ㄓ忻枋?，例?987年9月11日公開的WO87/05330;和AplinandWriston,CRCCrit.Rev.Biochem"pp.259-306(1981)。消除CRIg多肽上存在的碳水化合物模塊可通過化學(xué)或酶促方法來實現(xiàn)，或者通過編碼充當(dāng)糖基化靶物的氨基酸殘基的密碼子的突變替代?；瘜W(xué)脫糖基化技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，而且描述于例如Hakimuddinetal.,Arch.Biochem.Biophys.259:52(1987)和Edgeetal.，Anal.Biochem.118:131(1981)。酶促切割多肽上的碳水化合物模塊可通過使用多種內(nèi)切和外切糖苷酶來實現(xiàn),如Thotakuraetal.,Meth.Enzvmol.138:350(1987)所述。對CRIg的另一種類型的共價修飾包括將CRIg多肽與多種非蛋白質(zhì)性質(zhì)的聚合物之一連接，例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化亞烷基(polyoxyalkylene),例如以美國專利4,640,835;4,496,689;4,301,144;4,670,417;4,791,192或4,179,337所述方式。還可以形成嵌合分子的方式修飾本發(fā)明的天然序列和變異CRIg，所述嵌合分子包含與另一種異源多肽或氨基酸序列融合的CRIg，包括CRIg的片段。在一個實施方案中，此類嵌合分子包括帶有標(biāo)簽多肽的CRIg的融合物，所述標(biāo)簽多肽提供了抗標(biāo)簽抗體可選擇性結(jié)合的表位。表位標(biāo)簽通常位于CRIg多肽的氨基或羧基末端。此類表位標(biāo)記形式的CRIg多肽的存在可使用針對所述標(biāo)簽多肽的抗體來檢測。而且，表位標(biāo)簽的提供使CRIg多肽易于使用抗標(biāo)簽抗體或其它類型的結(jié)合所述表位標(biāo)簽的親和基質(zhì)通過親和純化來純化。多種標(biāo)簽多肽及其相應(yīng)抗體是本領(lǐng)域眾所周知的。例子包括多組氨酸(poly-his)或多-組氨酸-甘氨酸(poly-his-gly)標(biāo)簽；流感HA標(biāo)簽多肽及其抗體12CA5(Fieldetal.,Mol.Cell.Biol.8:2159-2165(1988));c-myc標(biāo)簽及其抗體8F9,3C7，6E10，G4,B7和9E10(Evanetal.,MolecularandCellularBiology5:3610-3616(1985));及單純皰滲病毒糖蛋白D(gD)標(biāo)簽及其抗體(Paborskyetal"ProteinEngineering3(6):547-553(1990))。其它標(biāo)簽多肽包括Flag肽(Hoppetal.，BioTechnology6:1204-1210(1988》；KT3表位肽(Martinetal.，Science255:192-194(1992));a-微管蛋白表位肽(Skinneretal.，J.Biol.Chem.266:15163-15166(1991));及T7基因10蛋白肽標(biāo)簽(Lutz-Freyermuthetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:6393-6397(1990》。在另一個實施方案中，嵌合分子可包括CRIg多肽或其片段與免疫球蛋白或免疫球蛋白特定區(qū)的融合物。對于二價形式的嵌合分子，這樣的融合物可以是與IgG分子Fc區(qū)的融合。這些融合多肽是將異源蛋白質(zhì)("粘附素")的結(jié)合特異性與免疫球蛋白恒定區(qū)的效應(yīng)物功能聯(lián)合起來的抗體樣分子，常常稱為免疫粘附素。在結(jié)構(gòu)上，免疫粘附素包括不同于抗體的抗原識別和結(jié)合位點(即是"異源"的)、具有期望結(jié)合特異性的氨基酸序列和免疫球蛋或配體的結(jié)合位點的連續(xù)(contiguous)氨基酸序列。免疫粘附素中的免疫球蛋白恒定區(qū)序列可從任何免疫球蛋白獲得，諸如IgG-l、IgG-2、IgG-3或IgG-4亞型、IgA(包括IgA-l和lgA-2)、IgE、IgD或IgM。由受體序列與適宜的免疫球蛋白恒定區(qū)序列連接而構(gòu)建的嵌合物(免疫粘附素)是本領(lǐng)域已知的。文獻(xiàn)中報道的免疫粘附素包括T細(xì)胞受體(Gascoigneetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:2936-2940(1987》;CD4(Caponetal"Nature337:525-531(1989);Tmuneckeretal"Nature339:68-70(1989);Zettmeissletal"DNACellBiol.USA9:347-353(1990);Byrnetal"Nature344:667-670(1990》；L-選才奪蛋白(歸巢受體)(Watsonetal.，J.Cell.Biol.110:2221-2229(1990);Watsonetal.,Nature349:164-167(1991》；CD44(Aruffoetal"Cell61:1303-1313(1990));CD28和B7(Linsleyetal"J.Exp.Med.173:721-730(1991》；CTLA-4(Lisleyetal.,J.Exp.Med.174:561-569(1991》；CD22(Stamenkovicetal"Cell66:1133-11144(1991));TNF受體(Ashkenazietal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:10535-10539(1991);Lesslaueretal"Eur.J.Immunol.27:2883-2886(1991);Peppeletal.,J.Exp.Med.174:1483-1489(1991));NP受體(Bennettetal.,J.Biol.Chem.266:23060-23067(1991》；和IgE受體oc(Ridgwayetal"J,Cell.Biol.115:abstr.1448(1991))的融合物。最簡單和最直截了當(dāng)?shù)拿庖哒掣剿卦O(shè)計將"粘附素"蛋白質(zhì)的結(jié)合區(qū)與免疫球蛋白重鏈的鉸鏈和Fc區(qū)聯(lián)合起來。通常，在制備本發(fā)明的CRIg-免疫球蛋白嵌合物時，編碼CRIg多肽或CRIg多肽胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)的核酸在C-末端將與編碼免疫球蛋白恒定區(qū)序列N-末端的核酸融合，但N-末端融合物也是可能的。通常，在此類融合物中，所編碼嵌合多肽將至少保留在功能上有活性的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)鉸鏈和CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。還對恒定區(qū)Fc部分的C-末端進(jìn)行融合，或者直接對重鏈CHI或輕鏈相應(yīng)區(qū)的N-末端進(jìn)行融合。進(jìn)行融合的精確位點不是至關(guān)重要的；具體位點是眾所周知的，可以為了優(yōu)化CRIg-免疫球蛋白嵌合物的生物學(xué)活性、分泌或結(jié)合特征而選擇。在有些實施方案中，CRlg-免疫球蛋白嵌合物裝配成單體或者異或同多聚體，特別是二聚體或四聚體，基本上如WO91/08298中所述。在一個優(yōu)選的實施方案中，天然序列人CRIg多肽的序列，諸如例如huCRIg(長)(SEQIDNO:4)或huCRIg(短)(SEQIDNO:6)，或CRIg胞外結(jié)構(gòu)域序列(包括huCRIg(長)和huCRIg(短)的ECD)與抗體包含免疫球蛋白例如免疫球蛋白Gl(IgGl)效應(yīng)物功能的C-末端部分(特別是Fc結(jié)構(gòu)域)的N-末端融合。有可能將整個重鏈恒定區(qū)與CRIg或CRIg胞外結(jié)構(gòu)域序列融合。然而，更優(yōu)選的是，在融合中使用自鉸鏈區(qū)中緊挨著木瓜蛋白酶切割位點(它在化學(xué)上定義IgGFc;殘基216，以重鏈恒定區(qū)的第一個殘基或其它免疫球蛋白的類似位點為114)上游開始的序列。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，CRIg氨基酸序列與IgGl、IgG2或IgG3重鏈的鉸鏈區(qū)和CH2和CH3，或者與CH1、鉸鏈、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域融合。進(jìn)行融合的精確位點不是至關(guān)重要的，最佳位點可通過常規(guī)實驗確定。特定的CRIg-Ig免疫粘附素結(jié)構(gòu)例示于圖59-61。在有些實施方案中，CRIg-免疫球蛋白嵌合物裝配成多聚體，特別是同二聚體或四聚體。通常，這些裝配好的免疫球蛋白將具有已知的亞基結(jié)構(gòu)?；镜乃逆溄Y(jié)構(gòu)單元是IgG、IgD和IgE存在的形式。四鏈單元在較高分子量的免疫球蛋白中重復(fù)；IgM通常作為通過二硫鍵保持在一起的基本四鏈單元五聚體存在；IgA球蛋白和偶爾的IgG球蛋白也在血清中以多聚體形式存在。在多聚體的情況中，每個四鏈單元可以是相同的或不同的?；蛘?，CRlg或CRIg胞外結(jié)構(gòu)域序列可插入免疫球蛋白重鏈和輕鏈序列之間，從而得到包含嵌合重鏈的免疫球蛋白。在這個實施方案中，CRIg序列與免疫球蛋白每個臂中免疫球蛋白重鏈的3'末端融合，或是鉸鏈和CH2結(jié)構(gòu)i或之間或是CH2和CH3結(jié)構(gòu)i或之間。Hoogenboometal.,Mol.Immunol.28:1027-1037(1991)報道了相似構(gòu)建物。盡管在本發(fā)明的免疫粘附素中不要求存在免疫球蛋白輕鏈，免疫球蛋白輕鏈可以存在，或是與CRIg-免疫球蛋白重鏈融合多肽共價相連，或是直接與CRIg胞外結(jié)構(gòu)域融合。在前一種情況中，編碼免疫球蛋白輕鏈的DNA通常與編碼CRIg-免疫球蛋白重鏈融合蛋白的DNA共表達(dá)。在分泌時，雜合重鏈和輕鏈將共價相連以提供包含兩對以二硫鍵相連的免疫球蛋白重鏈-輕鏈的免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)。適于制備此類結(jié)構(gòu)的方法有例如1989年3月28曰授權(quán)的美國專利4,816,567中所公開的。編碼本發(fā)明的某些CRIg-Ig融合蛋白的核苷酸序列顯示于圖59、60和67-70。例如，如圖67-70所示，融合蛋白可在CRIg和免疫球蛋白序列之間包含接頭，諸如例如短肽序列，例如DKTHT。另夕卜，在有些構(gòu)建物中，CRIg跨膜(TM)區(qū)和免疫球蛋白(Fc)區(qū)之間的序列(在本文中稱為"莖"序列)可刪除。圖67-70所示各種CRIg構(gòu)建物中接頭開始的氨基酸位置如下huCRIg-長-Fc+莖:第267位；huCRIg-長-Fc-莖第233位；huCRIg-短-Fc+莖第173位；huCRIg-短-Fc-莖第140位。2夭,然'^/V^^T^C7ig/應(yīng)的對務(wù)編碼CRIg多肽的DNA可以從cDNA文庫獲得，所述cDNA文庫從認(rèn)為具有CRIgmRNA且以可檢測水平表達(dá)它的組織制備。因此，人CRIgDNA可以方便的從以人組織制備的cDNA文庫獲得，諸如實施例1中所述。CRIg編碼基因也可從基因組文庫或通過寡核苷酸合成而獲得。可以用設(shè)計用于鑒定目的基因或由其編碼的蛋白質(zhì)的探針(諸如CRIg的抗體或至少約20-80個堿基的寡核香酸)篩選文庫。用選定纟笨針篩選cDNA或基因組文庫可4吏用標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)4亍，il"如Sambrooketal.，MolecularCloning:ALaboratoryManual,NewYork,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989所述。分離編碼CRIg的基因的一種備選方法是使用PCR方法學(xué)(Sambrooketal.:見上文；Dieffenbachetal.,PCRPrimer:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1995)。實施例1描述了用于篩選cDNA文庫的技術(shù)。選作探針的寡核苷酸序列應(yīng)該足夠長且足夠明確(unambiguous),使得假陽性降到最低。寡核苷酸優(yōu)選是標(biāo)記的，使得它在與所篩選文庫中的DNA雜交時可檢測出。標(biāo)記方法是本領(lǐng)域眾所周知的，包括使用放射標(biāo)記物，像"P標(biāo)記的ATP、生物素化或酶標(biāo)記。雜交條件，包括中等嚴(yán)格性和高度嚴(yán)格性，見Sambrooketal，見上文。在此類文庫篩選方法中鑒定的序列可以與保藏的和公共數(shù)據(jù)庫諸如GenBank或其它私有序列數(shù)據(jù)庫中可得到的其它已知序列比較和對比。分子限定區(qū)域內(nèi)的或跨越全長序列的序列同一性(或是在氨基酸水平上或是在核苷酸水平上)可使用采用各種算法來測量同源性的計算機軟件程序，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、DNAstar、和INHERIT通過序列對比來測定。具有蛋白質(zhì)編碼序列的核酸可通過使用本文首次公開的推斷氨基酸序列篩選選定cDNA或基因組文庫來獲得，并且必要時，使用Sambrooketal.，見上文所述常規(guī)引物延伸流程來檢測可能不會逆轉(zhuǎn)錄為cDNA的mRNA的前體和加工中間產(chǎn)物。將宿主細(xì)胞用本文所述用于CRIg生成的表達(dá)或克隆載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化，并在為了誘導(dǎo)啟動子、選擇轉(zhuǎn)化子、或擴增編碼期望序列的基因而恰當(dāng)調(diào)整的常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件，諸如培養(yǎng)基、溫度、pH等等，可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員無需過多實驗就選擇。通常，用于使細(xì)胞培養(yǎng)物生產(chǎn)力最大化的原理、方案和實用才支術(shù)可參見MammalianCellBiotechnology:aPracticalApproach,M.Butler,ed.,IRLPress,1991和Sambrooketal.,見上文。轉(zhuǎn)染方法是普通技術(shù)人員所知道的，例如CaP04和電穿孔。根據(jù)所用宿主細(xì)胞，轉(zhuǎn)化使用對此類細(xì)胞適宜的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行。采用氯化鈣的鈣處理，如Sambrooketal.,見上文所述，或電穿孔通常用于原核生物或具有堅固細(xì)胞壁屏障的其它細(xì)胞。用才艮瘤土i裏桿菌(Jgra^cfer/wmrt^e/ac/era)的感染用于某些植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，如Shawetal"Gene23:315(1983)和1989年6月29日公開的WO89/05859所述。對于沒有此類細(xì)胞壁的哺乳動物細(xì)胞，可采用GrahamandvanderEb,Virology52:456-457(1978)的磷酸鈣沉淀法。哺乳動物細(xì)胞宿主系統(tǒng)轉(zhuǎn)染的一般情況參見美國專利4,399,216。進(jìn)入酵母的轉(zhuǎn)化通常依照VanSolingenetal"J.Bact.130:946(1977)和Hsiaoetal.，Pro"Natl.Acad.Sci.(USA)76:3829(1979)的方法來進(jìn)行。然而，也可使用用于將DNA導(dǎo)入細(xì)胞的其它方法，諸如核顯微注射、電穿孔、細(xì)菌原生質(zhì)體與完整細(xì)胞的融合、或聚陽離子例如polybrene、聚鳥氨酸。關(guān)于用于轉(zhuǎn)化哺乳動物細(xì)胞的多種技術(shù)見Keownetal.,MethodsinEnzvmology185:527-537(1990)和Mansouretal.，Nature336:348-352(1988)。適于克隆或表達(dá)本文載體中的DNA的宿主細(xì)胞包括原核生物、酵母、或高等真核細(xì)胞。合適的原核生物包括但不限于真細(xì)菌，諸如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體，例如腸桿菌科，諸如大腸桿菌。多種大腸桿菌菌株是公眾可獲得的，諸如大腸桿菌K12菌抹MM294(ATCC31,446);大腸桿菌X1776(ATCC31,537);大腸桿菌菌林W3110(ATCC27,325)和K5772(ATCC53,635)。除了原核生物以外，真核微生物，諸如絲狀真菌或酵母也是CRIg編碼載體的合適克隆或表達(dá)宿主。啤酒糖酵母(&7cc/Mram_ycwce"WWae)是常用的低等真核宿主微生物。適用于表達(dá)糖基化CRIg的宿主細(xì)胞衍生自多細(xì)胞生物體。無脊推動物細(xì)胞的例子包括昆蟲細(xì)胞諸如果蠅S2和夜蛾Sf9，以及植物細(xì)胞。有用的哺乳動物宿主細(xì)胞系的例子包括中國倉鼠卵巢(CHO)和COS細(xì)胞。更具體的例子包括用SV40轉(zhuǎn)化的猴腎CV1細(xì)胞(COS-7,ATCCCRL1651);人胚腎細(xì)胞(293或為了在懸浮培養(yǎng)中生長而亞克隆的293細(xì)胞，Grahametal.,J.GenVirol.36:59(1977));中國倉鼠卵巢細(xì)胞Z-DHFR(CHO，UrlaubandChasin:Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216(1980));小鼠塞托利(Sertoli)細(xì)胞(TM4，Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980));人肺細(xì)胞(W138，ATCCCCL75);人肝細(xì)胞(HepG2，HB8065);及小鼠乳瘤細(xì)胞(MMT060562，ATCCCCL51)。認(rèn)為適宜宿主細(xì)胞的選4奪在本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)。可以將編碼CRIg的核酸(例如cDNA或基因組DNA)插入復(fù)制型載體用于克隆(DNA擴增)或表達(dá)。多種載體是公眾可得到的。載體可以是例如質(zhì)粒、粘粒、病毒顆?；蚴删w的形式?？梢酝ㄟ^多種流程將適宜的核酸序列插入載體。通常，使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)將DNA插入適宜的限制性內(nèi)切酶位點。載體構(gòu)件通常包括但不限于下列一種或多種信號序列、復(fù)制起點、一種或多種標(biāo)志基因、增強子元件、啟動子、和轉(zhuǎn)錄終止序列。包含一種或多種這些構(gòu)件的合適載體的構(gòu)建采用技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)連接技術(shù)。CRIg多肽不4又可以直4妄重組生產(chǎn)，而且可以作為與異源多肽的融合多肽，所述異源多肽可以是在成熟蛋白質(zhì)或多肽的N-末端具有特定切割位點的信號序列或其它多肽。通常，信號序列可以是載體的構(gòu)件，或者它可以是.插入載體的CRIgDNA的一部分。信號序列可以是原核信號序列，選自例如堿性磷酸酶、青霉素酶、lpp、或熱穩(wěn)定的腸毒素II前導(dǎo)序列。為了酵母分泌，信號序列可以是例如酵母轉(zhuǎn)化酶前導(dǎo)序列、a因子前導(dǎo)序列(包括糖酵母和克魯維酵母的a-因子前導(dǎo)序列，后者見美國專利5,010,182)、或酸性磷酸酶前導(dǎo)序列、白色假絲酵母葡糖淀粉酶前導(dǎo)序列(1990年4月4日公開的EP362,179)、或1990年11月15日公開的WO90/13646中描述的信號。在哺乳動物細(xì)胞表達(dá)中，可以使用哺乳動物信號序列來指導(dǎo)蛋白質(zhì)的分泌，諸如來自相同或相關(guān)物種的分泌型多肽的信號序列，以及病毒分泌前導(dǎo)序列。表達(dá)和克隆載體都包含能夠使載體在一種或多種選擇的宿主細(xì)胞中復(fù)制的核酸序列。眾所周知多種細(xì)菌、酵母、和病毒的此類序列。來自質(zhì)粒pBR322的復(fù)制起點適合于大多數(shù)革蘭氏陰性細(xì)菌，2p質(zhì)粒起點適合于酵母，而各種病毒起點(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV、或BPV)可用于哺乳動物細(xì)胞中的克隆載體。表達(dá)和克隆載體通常將包含選擇基因，也稱為選擇標(biāo)志。典型的選擇基因編碼如下蛋白質(zhì)(a)賦予抗生素或其它毒素抗性，例如氨千青霉素、新霉素、甲氨蝶呤、或四環(huán)素；(b)補足營養(yǎng)缺陷；或(c)提供不能由復(fù)合培養(yǎng)基獲得的關(guān)鍵營養(yǎng)物，例如編碼芽孢桿菌D-丙氨酸消旋酶的基因。適于哺乳動物細(xì)胞的選擇標(biāo)志的一個例子是能夠鑒定有能力攝取CRIg核酸的細(xì)胞的選擇標(biāo)志，諸如DHFR或胸苷激酶。在采用野生型DHFR時，適宜的宿主細(xì)胞是DHFR活性缺陷的CHO細(xì)胞系，其制備和繁殖如Urlaubetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216(1980)所述。適用于酵母的選擇基因為存在于酵母質(zhì)粒YRp7中的基因(Stinchcombetal.,Nature282:39(1979);Kingsmanetal.，Gene7:141(1979);Tschemperetal.，Gene10:157(1980))。^7基因為缺乏在色氨酸中生長能力的酵母突變抹，例如ATCCNo.44076或PEP4-1提供了選擇標(biāo)志(Jones，Genetics85:12(1977))。表達(dá)和克隆載體通常包含與CRIg核酸序列可操作連接的啟動子以指導(dǎo)mRNA合成。受到多種潛在宿主細(xì)胞識別的啟動子是眾所周知的。適用于原核宿主的啟動子包括(3-內(nèi)酰胺酶和乳糖啟動子系統(tǒng)(Changetal.,Nature275:615(1978);Goeddeletal.,Nature281:544(1979》、；威性磷酸酶、色氨酸(trp)啟動子系統(tǒng)(Goeddel,NucleicacidsRes.8:4057(1980);EP36,776)、和雜合啟動子"^》口tac啟動子(deBoeretal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:21-25(1983))。用于細(xì)菌系統(tǒng)的啟動子還將包含與編碼CRIg的DNA可"t喿作連4妾的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。適用于酵母宿主的啟動序列的例子包括3-磷酸甘油酸激酶(Hitzemanetal.，J.Biol.Chem.255:2073(1980))或其它糖酵解酶(Hessetal.，J.Adv.EnzymeReg.7:149(1968);Holland,Biochemistry17:4900(1978))的啟動子，諸如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脫氬酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶、和葡糖激酶。作為具有由生長條件控制轉(zhuǎn)錄的額外優(yōu)點的誘導(dǎo)型啟動子的其它酵母啟動子是醇脫氫酶2、異細(xì)胞色素C、酸性磷酸酶、與氮代謝有關(guān)的降解酶、金屬硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、及負(fù)責(zé)麥芽糖和半乳糖利用的酶的啟動子區(qū)。適用于酵母表達(dá)的載體和啟動子進(jìn)一步描述于EP73,657。在哺乳動物宿主細(xì)胞中由載體轉(zhuǎn)錄CRIg受到例如由病毒諸如多瘤病毒、禽痘病毒(1989年7月5日公開的UK2,211,504)、腺病毒(諸如腺病毒2)、牛乳頭瘤病毒、禽類肉瘤病毒、巨細(xì)胞病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、乙肝病毒和猿猴病毒40(SV40)基因組、由異源哺乳動物啟動子例如肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子、及由熱休克啟動子獲得的啟動子的控制，倘若此類啟動子與宿主細(xì)胞系統(tǒng)相容的話。可通過在載體中插入增強子序列來提高高等真核生物對編碼CRIg多肽的DNA的轉(zhuǎn)錄。增強子是DNA的順式作用元件，通常大約10至300bp,作用于啟動子以增加其轉(zhuǎn)錄。已知來自哺乳動物基因(球蛋白、彈性蛋白酶、清蛋白、a-胎蛋白和胰島素)的許多增強子序列。然而，通常使用來自真核細(xì)胞病毒的增強子。例子包括SV40復(fù)制起點晚期一側(cè)的增強子(bp100-270)、巨細(xì)胞病毒早期啟動子增強子、多瘤病毒復(fù)制起點晚期一側(cè)的增強子、和腺病毒增強子。增強子可以剪接到載體中，位于CRIg編碼序列的5'或3'位置，但是優(yōu)選位于啟動子的5'位點。用于真核宿主細(xì)胞(酵母、真菌、昆蟲、植物、動物、人、或來自其它多細(xì)胞生物體的有核細(xì)胞)的表達(dá)載體還將包含終止轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定mRNA所必需的序列。此類序列通?？梢杂烧婧嘶虿《綝NA或cDNA非翻譯區(qū)的5'端和偶爾的3'端獲得。這些區(qū)域包含在編碼CRIg的mRNA的非翻譯部分中轉(zhuǎn)錄成聚腺苷酸化片段的核苷酸區(qū)段。適合在改動后在重組脊推動物細(xì)胞培養(yǎng)物中合成CRIg的其它方法、載體和宿主細(xì)胞見Gethingetal.，Nature293:620-625(1981);Manteietal.,Nature281:40-46(1979);EP117,060;和EP117,058?；虻臄U增和/或表達(dá)可以在樣品中直接測量，例如根據(jù)本文提供的序列，使用適宜的標(biāo)記探針，通過常規(guī)的Southern印跡、對mRNA轉(zhuǎn)錄定量的Northern印跡(Thomas，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:5201-5205(1980))、點印跡(DNA分析)或原位雜交?；蛘?，可采用能識別特定雙鏈體的抗體，所述雙鏈體包括DNA雙鏈體、RNA雙鏈體、及DNA-RNA雜合雙鏈體或DNA-蛋白質(zhì)雙鏈體。繼而可標(biāo)記抗體，并可進(jìn)行測定法，其中將雙鏈體結(jié)合到表面上，從而在雙鏈體在表面上形成時，可檢測與雙鏈體結(jié)合的抗體的存在。或者，為了直接對基因產(chǎn)物的表達(dá)定量，可通過免疫學(xué)方法測量基因表達(dá)，諸如細(xì)胞或組織切片的免疫組化染色和細(xì)胞培養(yǎng)物或體液的測定法?？捎糜诿庖呓M化染色和/或樣品液體測定法的抗體可以是單克隆的或多克隆的，而且可以在任何哺乳動物中制備。方便的是，可針對天然序列CRIg多肽或針對基于本文提供的DNA序列的合成肽或針對與CRIgDNA融合且編碼特定抗體表位的外源序列來制備抗體?？梢詮呐囵B(yǎng)液或從宿主細(xì)胞裂解物中回收各種形式的CRIg。如果是膜結(jié)合的，那么可使用合適的去污劑溶液(例如Triton-X100)或通過酶4足裂解使其從膜上釋放。CRIg表達(dá)中所采用的細(xì)胞可通過多種物理或化學(xué)手段破裂，諸如凍融循環(huán)、超聲處理、機械破裂、或細(xì)胞溶解劑?？赡芷谕麖闹亟M細(xì)胞蛋白質(zhì)或多肽純化CRIg。下面的流程是合適純化流程的例示在離子交換柱上的分級；乙醇沉淀；反相HPLC;在硅土或陽離子交換樹脂諸如DEAE上的層析；層析聚焦；SDS-PAGE;石克酸銨沉淀；使用例如SephadexG-75的凝膠過濾；蛋白ASepharose才主以除去'/虧染4勿諸^口IgG;及結(jié)合CRIg多肽的表位標(biāo)記形式的金屬螯合柱。可采用多種蛋白質(zhì)純化方法，此類方法是本領(lǐng)域已知的，并描述于例如Deutscher，MethodsinEnzymology182(1990);Scopes,ProteinPurification:PrincipesandPractice,Springer-Verlag，NewYork(1982)。選擇的純化步驟將取決于例如所用生成過程的性質(zhì)和所產(chǎn)生的具體CRIg。丄OWg/戚的/激動WCRIg多肽的激動劑將;f莫擬天然序列CRIg多肽的定性生物學(xué)活性。優(yōu)選的是，生物學(xué)活性是結(jié)合C3b和/或影響補體或補體活化，特別是抑制補體旁路途徑和/或C3轉(zhuǎn)變酶的能力。激動劑包括例如免疫粘附素、肽模擬物和模擬天然CRIg定性生物學(xué)活性的非肽有機小分子。上文已經(jīng)討論了CRIg-Ig免疫粘附素。另一組CRIg激動劑是天然序列CRIg多肽的肽模擬物。肽模擬物包括例如包含非天然存在氨基酸的肽，倘若該化合物保留本文所述CRIg生物學(xué)活性。類似的，肽模擬物和類似物可包括模擬本發(fā)明CRIg多肽重要結(jié)構(gòu)元件的結(jié)構(gòu)和保留CRIg生物學(xué)活性的非氨基酸化學(xué)結(jié)構(gòu)。術(shù)語"肽"在用于本文時指少于約50個氨基酸殘基，優(yōu)選少于約40個氨基酸殘基，受約束(即具有有些結(jié)構(gòu)元件，像例如存在啟動P-轉(zhuǎn)角或(3-折疊片的氨基酸，或者例如因存在二硫鍵Cys殘基而環(huán)化)或不受約束(例如線性)的氨基酸序列，包括其或其之間的多聚體諸如二聚體。對于少于約40個氨基酸殘基的肽，優(yōu)選約10個和約30個氨基酸殘基之間的肽，尤其是約20個氨基酸殘基的肽。然而，在閱讀本公開書后，技術(shù)人員將認(rèn)識到，不是根據(jù)特定肽的長度，而是根據(jù)它結(jié)合C3b和抑制C3轉(zhuǎn)變酶，特別是補體旁路途徑C3轉(zhuǎn)變酶的能力來辨別肽。肽可方便的使用固相肽合成來制備(Merrifield，J.Am.Chem.Soc.85:2149(1964);Houghten,Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:5132(1985))。固相合成從推定肽的羧基末端開始，將受保護(hù)的氨基酸偶聯(lián)至惰性固相支持物。惰性固相支持物可以是能夠充當(dāng)初始氨基酸C-末端錨的任何大分子。通常，大分子支持物是交聯(lián)聚合物樹脂(例如聚酰胺或聚苯乙烯樹脂)，如StewartandYoung,見上文的第2和4頁圖1-1和1-2所示。在一個實施方案中，C-末端氨基酸偶聯(lián)至聚苯乙烯樹脂以形成苯甲酯。大分子支持物的選4奪使得肽錨連接在用于肽合成中封閉的氨基酸a-氨基脫保護(hù)的條件下是穩(wěn)定的。若使用堿不穩(wěn)定的a-保護(hù)基，則希望在肽和固相支持物之間使用酸不穩(wěn)定的連接。例如，酸不穩(wěn)定的醚樹脂對是堿不穩(wěn)定的Fmoc氨基酸肽合成是有效的，如StewartandYoung,見上文的第16頁所述?；蛘?，可^f吏用對酸解作用差異不穩(wěn)定的肽錨連接和oc-保護(hù)基。例如，氨曱基樹脂諸如苯乙酰胺曱基(Pam)樹脂在與Boc-氨基酸肽合成聯(lián)合時運作很好，如StewartandYoung,見上文的第11-12頁所述。在起始氨基酸偶聯(lián)至惰性固相支持物后，起始氨基酸的cc-氨基保護(hù)基例如用三氟乙酸(TFA)在二氯曱烷中除去并例如在三乙胺(TEA)中中和。起始氨基酸的a-氨基脫保護(hù)后，加入合成中下一個a-氨基和側(cè)鏈?zhǔn)鼙Ｗo(hù)的氨基酸。然后通過縮合以預(yù)期次序順序偶聯(lián)剩余的a-氨基和必要時側(cè)鏈?zhǔn)鼙Ｗo(hù)的氨基酸以獲得與固相支持物相連的中間化合物?；蛘撸行┌被峥杀舜伺悸?lián)以形成期望肽的片段，隨后將肽片段加至成長中的固相肽鏈。兩個氨基酸或者氨基酸和肽或者肽和肽之間的縮合反應(yīng)可依照常用縮合方法進(jìn)行，諸如酸法、混合酸酐法、DCC(N,N'-二環(huán)己基碳二亞胺)或DIC(N,N'-二異丙基碳二亞胺)法、活潑酯法、對硝基苯酯法、BOP(苯并三唑-l-基-氧-三[二曱氨基]膦六氟磷酸鹽/酯)法、N-羥基琥珀酸亞氨酸酯法等，及Woodward試劑K法。肽的化學(xué)合成中共同的是用合適的保護(hù)基保護(hù)氨基酸的任何反應(yīng)性側(cè)鏈基團(tuán)。最終，這些保護(hù)基在順序裝配好期望多肽鏈后去除。同樣共同的是在氨基酸或肽片段的C-末端羧基與成長中的固相多肽鏈的游離N-末端氨基反應(yīng)時保護(hù)氨基酸或肽片段上的a-氨基，隨后將cc-氨基選擇性去保護(hù)以容許添加下一個氨基酸或肽片段至固相多肽鏈。因此，多肽合成中共同的是生成這樣的中間化合物，它包含在肽鏈中以期望序列定位的每個氨基酸殘基，其中個別殘基仍攜帶側(cè)鏈保護(hù)基。這些保護(hù)基可基本上在從固相切下后同時去除以生成期望多肽產(chǎn)物。a-和s-氨基側(cè)鏈可用下列基團(tuán)保護(hù)芐氧羰基(縮寫為Z)、異煙氧羰基(iNOC)、鄰氯芐氧羰基[Z(2C1)]、對硝基芐氧羰基[Z(N02)]、對曱氧基芐氧羰基[Z(OMe))]、叔丁氧羰基(Boc)、叔戊氧羰基(Aoc)、異水片氧羰基、金剛氧羰基、2-(4-聯(lián)苯基)-2-丙氧羰基(Bpoc)、9-芴基曱氧羰基(Fmoc)、曱磺酰乙氧羰基(Msc)、三氟乙?；?、鄰苯二?；貂；?-硝基苯磺?；?NPS)、二苯基硫膦基(Ppt)和二曱基硫膦基(Mpt),等等。羧基官能團(tuán)的保護(hù)基有例如苯曱酯(OBzl)、環(huán)己酯(Chx)、4-硝基苯曱酯(ONb)、叔丁酯(Obut)、4-吡咬基曱酯(OPic),等等。常常期望具有氨基和羧基以外官能團(tuán)的特定氨基酸諸如精氨酸、半胱氨酸和絲氨酸受到合適保護(hù)基的保護(hù)。例如，精氨酸的胍基可用硝基、對曱苯磺酰基、卡氧羰基、金剛氧羰基、對曱氧基苯磺?；?、4-曱氧基-2,6-二曱基苯磺?；?Nds)、1，3,5-三曱基苯磺?；?Mts),等等保護(hù)。半胱氨酸的巰基可用對曱氧基千基、三苯曱基，等等保護(hù)。上文所述許多受封閉的氨基酸可通過商業(yè)途徑獲得，諸如Novabiochem(SanDiego,Calif.)、BachemCA(Torrence,Calif.)或PeninsulaLabs(Belmont,Calif.)。StewartandYoung,見上文提供了關(guān)于肽制備流程的詳細(xì)信息。ot-氨基保護(hù)記載于第14-18頁，側(cè)鏈封閉記載于第18-28頁。胺、羥基和巰基功能保護(hù)基的列表見第149-151頁。在期望氨基酸序列完成后，肽可從固相支持物切下，回收和純化。通過能夠破壞肽-固相連接的試劑從固相支持物切下肽，并任選的是，將肽上受封閉的官能團(tuán)脫保護(hù)。在一個實施方案中，用液態(tài)氬氟酸(HF)通過酸解作用從固相切下肽，它還去除任何剩余的側(cè)鏈保護(hù)基。優(yōu)選的是，為了避免肽中殘基的烷化(例如曱硫氨酸、半胱氨酸和酪氨酸殘基的烷化)，酸解反應(yīng)混合液含有硫甲酚和曱酚清除劑。HF切割后，用醚清洗樹脂，并以乙酸溶液的連續(xù)清洗從固相提取游離肽。將合并的清洗液凍干，并純化肽。天然序列CRIg多肽的拮抗劑可用于治療受益于過度補體活化的狀況，包括腫瘤。一組優(yōu)選的拮抗劑包括特異性結(jié)合天然CRIg的抗體。例示性抗體包括多克隆、單克隆、人源化、雙特異性和異源偶聯(lián)的抗體。制備多克隆抗體的方法是技術(shù)人員已知的。多克隆抗體可在動物中生成，例如通過一次或多次注射免疫劑和根據(jù)需要的佐劑。通常，免疫劑和/或佐劑將通過多次皮下或腹膜內(nèi)注射而注射到動物中。免疫劑可包括本發(fā)明的CRIg多肽或其片段或融合蛋白。將免疫劑與已知在所免疫哺乳動物中有免疫原性的蛋白質(zhì)偶聯(lián)可能是有用的。此類免疫原性蛋白質(zhì)的例子包括但不限于匙孔i戚血藍(lán)蛋白、血清清蛋白、牛曱狀腺球蛋白和大豆胰蛋白酶抑制劑。可采用的佐劑的例子包括弗氏完全佐劑和MPL-TDM佐劑(單磷?；|(zhì)A、合成的海藻糖dicorynomycolate)。免疫方案可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員無需過多實驗做出選擇。或者，識別和結(jié)合本發(fā)明多肽或者作為其拮抗劑發(fā)揮作用的抗體可以是單克隆抗體。單克隆抗體可4吏用雜交瘤法制備，諸如KohlerandMilstein,Nature256:495(1975)所述。在雜交瘤法中，小鼠、倉鼠或其它適宜的宿主動物通常用免疫劑免疫以引發(fā)生成或能夠生成將特異性結(jié)合免疫劑的抗體的淋巴細(xì)胞?；蛘?，可以在體外免疫淋巴細(xì)胞。免疫劑將通常包括本發(fā)明的CRIg多肽、其抗原性片段或融合蛋白。通常，或是使用外周血淋巴細(xì)胞("PBL，，)，若希望人起源的細(xì)胞，或是使用脾細(xì)胞或淋巴節(jié)細(xì)胞，若希望非人哺乳動物來源。然后，使用合適的融合劑，諸如聚乙二醇，將淋巴細(xì)胞與永生化細(xì)胞系融合以形成雜交瘤細(xì)胞(Goding，MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice,AcademicPress(1986),pp.59-103)。永生化細(xì)胞系通常是轉(zhuǎn)化的哺乳動物細(xì)胞，特別是嚙齒類、牛和人起源的骨髓瘤細(xì)胞。通常，采用大鼠或小鼠骨髓瘤細(xì)胞系。雜交瘤細(xì)胞可在存活的一種或多種物質(zhì)。例如，如果親本細(xì)胞缺乏酶次黃噤呤鳥噤呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT),那么用于雜交瘤的培養(yǎng)基通常將含有次黃嘌呤、氨基喋呤和胸苷("HAT培養(yǎng)基")，這些物質(zhì)阻止HGPRT缺陷細(xì)胞生長。優(yōu)選的永生化細(xì)胞系是那些高效融合、支持選定的抗體生成細(xì)胞穩(wěn)定的高水平的表達(dá)抗體、并對諸如HAT培養(yǎng)基等培養(yǎng)基敏感的細(xì)胞系。更優(yōu)選的永生化細(xì)胞系是鼠源骨髓瘤系，可從例如索爾克研究所細(xì)胞分配中心(SalkInstituteCellDistributionCenter,SanDiege,California,USA)和美國典型i吝養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,Rockville，Maryland,USA)獲得。用于生成人單克隆抗體的人骨髓瘤和小鼠-人異源骨髓瘤細(xì)胞系也已有描述(Kozbor,J.Immunol.133:3001(1984);Brodeuretal.,MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications,MarcelDekker,Inc.,NewYork(1987)pp.51-63)。然后可對雜交瘤細(xì)胞在其中培養(yǎng)的培養(yǎng)基測定針對本發(fā)明多肽或與本發(fā)明多肽具有相似活性的單克隆抗體的存在。優(yōu)選的是，通過免疫沉淀或通過體外結(jié)合測定法，諸如放射免疫測定法(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)，測定由雜交瘤細(xì)胞生成的單克隆抗體的結(jié)合特異性。此類技術(shù)和測定法是本領(lǐng)域已知的。單克隆抗體的結(jié)合親和力可通過例如MunsonandPollard,Anal.Biochem.107:220(1980)的Scatchard分析來測定。在鑒定得到期望的雜交瘤細(xì)胞后，該克隆可通過有限稀釋流程進(jìn)行亞克隆，并通過標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行培養(yǎng)(Goding，見上文)。適于這一目的的培養(yǎng)基包括例如Dulbecco氏改良的Eagle氏培養(yǎng)基或RPMI-1640培養(yǎng)基?；蛘撸s交瘤細(xì)胞可在哺乳動物中作為腹水進(jìn)行體內(nèi)培養(yǎng)?？赏ㄟ^常規(guī)免疫球蛋白純化流程，諸如例如蛋白A-Sepharose、羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析，將亞克隆分泌的單克隆抗體與培養(yǎng)基或腹水分開或純化。單克隆抗體還可通過重組DNA技術(shù)來生成，諸如美國專利4,816,567中所述。編碼本發(fā)明單克隆抗體的DNA易于使用常規(guī)流程分離和測序(例如使用能夠特異性結(jié)合編碼鼠源抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)。本發(fā)明的雜交瘤細(xì)胞是此類DNA的優(yōu)選來源。一旦分離，可將DNA置于表達(dá)載體中，然后將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到不另外產(chǎn)生免疫球蛋白蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞中，諸如猿猴COS細(xì)胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或骨髓瘤細(xì)胞，以在重組宿主細(xì)胞中獲得單克隆抗體的合成。還可以修飾DNA,例如通過替代，即用人重鏈和輕鏈恒定區(qū)的編碼序列代替同源鼠源序列(美國專利4,816,567;Morrisonetal.,見上文)，或者通過共價接合免疫球蛋白編碼序列和非免疫球蛋白多肽的整個或部分編碼序列?？捎么祟惙敲庖咔虻鞍锥嚯奶娲景l(fā)明抗體的恒定區(qū)，或者可用它替代本發(fā)明抗體的一個抗原結(jié)合位點的可變區(qū)以產(chǎn)生嵌合二價抗體?？贵w優(yōu)選是單價抗體。用于制備單價抗體的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。例如，一種方法牽涉免疫球蛋白輕鏈和經(jīng)修飾重鏈的重組表達(dá)。重鏈通常在Fc區(qū)中的任何點截短，從而防止重鏈交聯(lián)?；蛘?，相關(guān)半胱氨酸殘基用另一種氨基酸殘基替代或者刪除，從而防止交聯(lián)。體外方法也適于制備單價抗體。消化抗體以生成其片段，特別是Fab片段，可使用本領(lǐng)域已知的常規(guī)技術(shù)來完成。本發(fā)明的抗體還可包括人源化抗體或人抗體。非人(例如鼠源)抗體的人源化形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(諸如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗體的其它抗原結(jié)合子序列)。人源化抗體包括人免疫球蛋白(受體抗體)中的互補決定區(qū)(CDR)殘基用具有期望特異性、親和力和能力的非人物種(供體抗體)諸如小鼠、大鼠或兔的CDR殘基替換的抗體。在有些情況中，將人免疫球蛋白的Fv框架殘基用相應(yīng)的非人殘基替換。人源化抗體還可包含在受體抗體和輸入CDR或框架序列中都沒有發(fā)現(xiàn)的殘基。通常，人源化抗體將包含至少一個、通常兩個基本上整個如下可變區(qū)，其中整個或基本上整個CDR對應(yīng)于非人免疫球蛋白的CDR,且整個或基本上整個FR是人免疫球蛋白共有序列的FR。人源化抗體任選還將包含至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)(Jonesetal.，Nature321:522-525(1986);Riechmannetal"Nature332:323-329(1988);Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。引入了一個或多個來自非人來源的氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基常常稱作"輸入"殘基，它們通常取自"輸入"可變區(qū)。人源化可基本上遵循Winter及其同事的方法進(jìn)行(Jonesetal.，Nature321:522-525(1986);RiechmannetaLNature332:323-327(1988);Verhoeyenetal.,Science239:1534-1536(1988)),即用嚙齒類CDR或CDR序列替代人抗體的相應(yīng)序列。因此，此類"人源化"抗體是嵌合抗體(美國專利4,816,567)，其中基本上少于整個人可變區(qū)用來自非人物種的相應(yīng)序列替代。在實踐中，人源化抗體通常是其中一些CDR殘基和可能的一些FR殘基用來自嚙齒類抗體中類似位點的殘基替代的人抗體。還可使用本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)生成人抗體，包括噬菌體展示庫(HoogenboomandWinter,J.Mol.Biol.227:381(1991);Marksetal"J.Mol.Biol.222:581(1991))。Cole等人和Boemer等人的技術(shù)也可用于制備人單克隆抗體(Coleetal.,MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,AlanR.Liss，p.77(1985);Boerneretal"J.Immunol.147(1):86-95(1991);U.S.5,750，373)。類似的，人抗體可通過將人免疫球蛋白基因座導(dǎo)入內(nèi)源免疫球蛋白基因已經(jīng)部分或完全滅活的轉(zhuǎn)基因動物，例如小鼠來生成。在攻擊時，觀察到人抗體生成，在所有方面與在人體中看到的非常相像，包括基因重排、裝配和抗體全集。此方法記載于例如美國專利5,545,807;5,545,806;5,569,825;5,625,126;5,633,425;5,661,016,及下歹寸牙牛學(xué)出片反4勿Marksetal.,Bio/Technology10:779-783(1992);Lonbergetal.,Nature368:856-859(1994);Morrison,Nature368:812-13(1994);Fishwildetal.，NatureBiotechnology14:845-51(1996);Neuberger,NatureBiotechnology14:826(1996);LonbergandHuszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995)。雙特異性抗體指對至少兩種不同抗原具有結(jié)合特異性的單克隆，優(yōu)選人或人源化抗體。在這種情況中，一種結(jié)合特異性可以是對本發(fā)明的多肽，另一種是對任何其它抗原，優(yōu)選對細(xì)胞表面蛋白或者受體或受體亞基。用于生成雙特異性抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。傳統(tǒng)上，雙特異性抗體的重組生成基于兩對免疫球蛋白重鏈-輕鏈的共表達(dá)，其中兩種重鏈具有不同的特異性(MillsteinandCuello，Nature305:537-539(1983))。由于免疫5求蛋白重鏈和輕鏈的隨4幾分配，這些雜交瘤(四源雜交瘤(quadroma))生成十種不同抗體分子的潛在混合物，其中只有一種具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。正確分子的純化通常通過親和層析步驟來完成。1993年5月13日公開的WO93/08829及Trauneckeretal.,EMBOJ.10:3655-3659(1991)中披露了類似的流程?？蓪⒕哂衅谕Y(jié)合特異性(抗體-抗原結(jié)合位點)的抗體可變區(qū)與免疫球蛋白恒定區(qū)序列融合。融合優(yōu)選使用包含至少部分鉸鏈、CH2和CH3區(qū)的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)。優(yōu)選在至少一種融合物中存在包含輕鏈結(jié)合所必需的位點的第一重鏈恒定區(qū)(CH1)。將編碼免疫球蛋白重鏈融合物及，如果需要，免疫球蛋白輕鏈的DNA插入分開的表達(dá)載體，并共轉(zhuǎn)染到合適的宿主生物體中。關(guān)于生成雙特異性抗體的更多詳情參見例如Sureshetal.,MethodsinEnzymology121:210(1986)。異源偶聯(lián)抗體由兩種共價接合的抗體構(gòu)成。此類抗體建議用于例如將免疫系統(tǒng)細(xì)胞靶向不想要的細(xì)胞(美國專利4,676,980),和用于治療HIV感染(WO91/00360;WO92/200373;EP03089)。設(shè)想了可使用合成蛋白質(zhì)化學(xué)中已知的方法在體外制備抗體，包括牽涉交聯(lián)劑的方法。例如，可使用二硫化物交換反應(yīng)或通過形成硫醚鍵來構(gòu)建免疫毒素。適于此目的的試劑的例子包括亞氨基硫醇鹽/酯和4-巰基丁亞氨酸曱酯及例如美國專利4,676,980中所公開的?？赡芟Ｍ谛?yīng)物功能方面修飾本發(fā)明的抗體，例如增強抗體在治療免疫相關(guān)疾病中的效力。例如，可以在FC區(qū)中引入半胱氨酸殘基，從而容許在該區(qū)中形成鏈間二硫鍵。如此產(chǎn)生的同二聚體抗體可具有改善的內(nèi)在化能力和/或提高的#卜體介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷和抗體依賴性細(xì)胞細(xì)胞毒性(ADCC)。參見Caronetal.，J.Exp.Med.176:1191-1195(1992)和Shopes,B.，J.Immunol,148:2918-2922(1992)。具有增強的抗腫瘤活性的同二聚體抗體還可4吏用如Wolffetal.，CancerResearch53:2560-2565(1993)中描述的異雙功能交聯(lián)劑來制備。或者，抗體可改造成具有雙重Fc區(qū)，由此可具有增強的補體溶解和ADCC能力。參見Stevensonetal.,Anti-CancerDrugDesign3:219-230(1989)。本發(fā)明還涉及包含偶聯(lián)有細(xì)胞毒劑的抗體的免疫偶聯(lián)物，所述細(xì)胞毒劑諸如化療劑、毒素(例如細(xì)菌、真菌、植物或動物起源的酶活毒素或其片l殳)或放射性同位素(即放射偶聯(lián)物)。上文已經(jīng)描述了可用于生成此類免疫偶聯(lián)物的化療劑?？墒褂玫拿富疃舅丶捌淦伟ò缀矶舅谹鏈、白喉毒素的非結(jié)合活性片段、外毒素A鏈(來自銅綠假單孑包菌(尸化i^fomw7asae廠Mg/"asa))、蓖麻毒蛋白A鏈、相思豆毒蛋白A鏈、蒴蓮根毒素(modeccin)A鏈、a-帚曲毒素(sarcin)、油桐(j/ewhfey/oni/z')毒蛋白、香石^H"(dianthin)毒蛋白、美洲商陸(P/zyto/aca爿men'ca"a)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordicacharantia)抑制物、麻瘋4對毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、月巴急草(sapaonariaofficinalis)抑制物、白樹毒素(gelonin)、絲林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依諾霉素(enomycin)和單端孑包菌毒素(tricothecenes)。有多種放射性同位素可用于生成放射偶聯(lián)抗體。例子包括^Bi、131I、131In、WY、和186Re?？墒褂枚喾N雙功能蛋白質(zhì)偶聯(lián)劑來生成抗體和細(xì)胞毒劑的偶聯(lián)物，諸如N-琥珀酰亞氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、亞氨基磁J克(IT)、亞氨酸酯(諸如鹽酸己二酰亞胺二曱酯)、活潑酯類(諸如辛二酸二琥珀酰亞胺酯)、醛類(諸如戊二醛)、雙疊氮化合物(諸如雙(對疊氮苯曱?；?己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對重氮苯曱?；?乙二胺)、二異氰酸酯(諸如曱苯2,6-二異氰酸酯)、和雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)的雙功能衍生物。例如，可如Vitettaetal.，Science238:1098(1987)中所述制備蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14標(biāo)記的l-異硫氰酸苯曱基-3-曱基二亞乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于將放射性核香酸與抗體偶聯(lián)的例示性螯合劑。參見WO94/11026。在另一個實施方案中，可將抗體與"受體"(諸如鏈霉親合素)偶聯(lián)，用于組織預(yù)定位，其中對患者施用抗體-受體偶聯(lián)物，隨后使用清除劑^M盾環(huán)中除去未結(jié)合的偶聯(lián)物，然后施用與細(xì)胞毒劑(例如放射性核苦酸)偶聯(lián)的"配體"(例如親合素)。5.《標(biāo)疾病5.7補沐^7;^疾病和炎'況本發(fā)明的CRIg多肽及其激動劑，尤其是CRIg-Ig免疫粘附素，可用于預(yù)防和/或治療補體相關(guān)疾病和病理狀況。所述疾病和狀況包括f旦不限于炎性和自身免疫性疾病。窘迫綜合征(ARDS)、缺血和再灌注后的遠(yuǎn)端組織損傷、心肺旁路手術(shù)過程中的補體激活、皮肌炎、天皰瘡、狼瘡腎炎及由此發(fā)生的腎小球腎炎和血管炎、心肺轉(zhuǎn)流術(shù)、心臟停搏誘發(fā)的冠狀動脈內(nèi)皮功能障礙、II型膜性增生性腎小球腎炎、IgA腎病、急性腎衰竭、冷球蛋白血癥、抗磷脂綜合征、黃斑變性病和其它補體相關(guān)眼狀況諸如年齡相關(guān)黃斑變性(AMD)、脈絡(luò)膜新血管形成(CNV)、葡萄膜炎、糖尿病性和其它缺血相關(guān)視網(wǎng)膜病變、眼內(nèi)炎和其它眼內(nèi)新血管疾病諸如糖尿病性黃斑水腫、病理性近一見、馮希-林二氏(vonHippel-Lindau)病、眼的組織胞漿菌病、視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞(CRVO)、角膜新血管形成、視網(wǎng)膜新血管形成、以及同種移植、超急性排斥反應(yīng)、血液透析、慢性阻塞性肺應(yīng)激綜合征(COPD)、哮喘和吸入性肺炎。5.2^^t^^狹炎'況CRIg多肽及其激動劑，尤其是CRIg-Ig免疫粘附素，特別可用于預(yù)防和治療補體相關(guān)眼狀況(所有其病理學(xué)牽涉補體，包括經(jīng)典和旁路途徑，特別是旁路途徑的補體眼狀況和疾病)，諸如例如黃斑變性病諸如所有階段的年齡相關(guān)黃斑變性(AMD)包括干性和濕性(非滲出性和滲出性)形式、脈絡(luò)膜新血管形成(CNV)、葡萄膜炎、糖尿病性和其它缺血相關(guān)視網(wǎng)膜病變、目艮內(nèi)炎和其它眼內(nèi)新血管疾病諸如糖尿病性黃斑水肺、病理性近浮見、馮希-林二氏(vonHippel-Lindau)病、眼的組織胞漿菌病、視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞(CRVO)、角膜新血管形成和^見網(wǎng)膜新血管形成。一組優(yōu)選的補體相關(guān)眼狀況包括年齡相關(guān)黃斑變性(AMD)，包括非滲出性(濕性)和滲出性(干性或萎縮性)AMD、脈絡(luò)膜新血管形成(CNV)、糖尿病性視網(wǎng)膜病變(DR)和眼內(nèi)炎。AMD指年齡相關(guān)黃斑變性，是超過60歲的個體中不可逆的視覺功能障礙的主導(dǎo)原因。AMD存在兩種類型，即非滲出性(干性)和滲出性(濕性)AMD。干性或非滲出性形式牽涉中央視網(wǎng)膜(黃斑)下面視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)的萎縮和肥厚變化，以及RPE上的沉積物(玻璃疣)。具有非滲出性AMD的患者可發(fā)展成濕性或滲出性形式的AMD，其中稱作脈絡(luò)膜新血管膜(CNVM)的異常血管在視網(wǎng)膜下發(fā)育，滲出液體和血液，最終在視網(wǎng)膜中和在視網(wǎng)膜下引起使人失明的盤狀瘢痕。非滲出性AMD,它通常是滲出性AMD的前身，是更常見的。非滲出性AMD的表現(xiàn)有所不同；可存在硬質(zhì)玻璃疣、軟質(zhì)玻璃疣、RPE地理性萎縮(geographicatr叩hy)和色素凝集。補體成分在AMD早期在RPE上沉積，是玻璃疣的主要組分。本發(fā)明明確關(guān)注高風(fēng)險AMD的治療，包括3類和4類AMD。3類AMD的特征是在兩只眼中都不存在晚期AMD,至少一只眼的視力有20/32或更好且有至少一個大個疣(例如125i^m)，廣泛的(通過玻璃疣面積測量)中間玻璃疣，或不牽涉黃斑中央的地理性萎縮(GA)，或其任意組合。3類AMD(仍認(rèn)為是"干性，，amd)具有轉(zhuǎn)變?yōu)槊}絡(luò)膜新血管形成(cnv)的高風(fēng)險。4類高風(fēng)險AMD(歸入"濕性"AMD)的特征是指標(biāo)眼(indexeye)中視力20/32或更好，且沒有晚期AMD(牽涉黃斑中央的GA或脈絡(luò)膜新血管形成的特征)。對側(cè)眼(felloweye)的特征是晚期AMD,或視力低于20/32,可歸于AMD黃斑病變。通常，如果不治療，高風(fēng)險AMD以比1或2類(風(fēng)險不高)AMD的發(fā)展速率高約10-30倍的速率快速發(fā)展成脈絡(luò)膜新血管形成(CNV)。CRIg及其激動劑，諸如CRIg-Ig免疫粘附素，特別可用于預(yù)防AMD(特別是3類或4類AMD)發(fā)展成CNV,和/或預(yù)防在不受影響或影響較小的對側(cè)眼中形成/發(fā)展AMD或CNV。在此語境中，術(shù)語"預(yù)防"以最廣義使用，包括完全或部分阻斷和減緩疾病的發(fā)展，以及延遲疾病更嚴(yán)重形式的發(fā)作。有高風(fēng)險形成或發(fā)展成高風(fēng)險(4類)AMD或CMV的患者尤其受益于本發(fā)明的這個方面。已知補體因子h(cfh)多態(tài)性與個體形成amd和/或cnv的風(fēng)險有關(guān)。CFH中的突變可激活補體，繼而可導(dǎo)致AMD/CNV。最近已有報道，補體因子H(CFH)多態(tài)性占到可導(dǎo)致AMD的風(fēng)險的50%(Kleinetal.,Science308:385-9(2005))。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CFH的一種常見單元型(HF1/CFH)使個體易患年齡相關(guān)黃斑變性(Hagemanetal"Proc,Natl.Acad.Sci.USA102(2):7227-7232(2005))。AMD已經(jīng)隔離成一種常染色顯性性狀，疾病基因座定位至染色體Iq25-q31,在標(biāo)志物D1S466和D1S413之間，最大優(yōu)勢對數(shù)計分(lodscore)約3.20(Kleinetal.，ArchOpthalmol.116(8):1082-9(1998);Majewskietal"Am.J.Hum.Genet.73(3):540-50(2003);Seddonetal"Am.J.Hum.Genet.73(4):780-90(2003);Weeksetal.,Am.J.Ophthalmol.132(5):682-92(2001);Iyengaretal"Am.J.Hum.Genet.74(1):20-39(2004》;染色體2q3/2q32,在標(biāo)志物D12S1391和D2S1384之間，最大優(yōu)勢對數(shù)計分2.32/2.03(Seddonetal"見上文)；3pl3，在標(biāo)志物D12S1300和D12S1763之間，最大優(yōu)勢對數(shù)計分2.19(Majewskietal"見上文；Schicketal"Am.J.Hum.Genet.72(6):1412-24(2003));6ql4，在標(biāo)志物D6S1056和DS249之間，最大優(yōu)勢對數(shù)計分3.59/3.17(Kniazevaetal.,Am.J.Ophthlmol.130(2):197-202(2000));9q33，在標(biāo)志物DQSW4處，最大優(yōu)勢對數(shù)計分2.06(Mejwskietal.,見上文)；10q26,在標(biāo)志物D10S1230處，最大優(yōu)勢對數(shù)計分3.06(Majewskietal.,見上文；Iyengaretal"見上文；Kenealyetal"Mol.Vis.10:57-61(2004));17q25,在標(biāo)志物D17S928處，最大優(yōu)勢對數(shù)計分3.16(Weeksetal.,見上文)；和22ql2，在標(biāo)志物D22S1045處，最大優(yōu)勢對數(shù)計分2.0(Seddonetal.,見上文)。因此，遺傳篩選是鑒定患者中誰是預(yù)防性處理，包括預(yù)防疾病發(fā)展成更嚴(yán)重形式，諸如從AMD發(fā)展成CNV的特別好的候選者的一個重要部分。另外，鑒于補體激活和年齡相關(guān)黃斑變性(AMD)間聯(lián)系的堅固證據(jù)，本發(fā)明提供了通過補體抑制，特別是抑制旁路途徑來預(yù)防和治療CNV和AMD的新方法。除了CRIg以外，旁路途徑的抑制劑包括融合蛋白(例如免疫粘附素)、激動性抗CRIg抗體、及肽和非肽小分子。^嫂炎'沈和名建病作為補體相關(guān)疾病例子的炎性狀況的更廣泛列表包括例如炎性腸病(IBD)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、幼發(fā)型慢性關(guān)節(jié)炎、脊推關(guān)節(jié)病、系統(tǒng)性硬化(硬皮病)、特發(fā)性炎性肌病(皮肌炎、多肌炎)、斯耶格倫氏(Sj6gren)綜合征、系統(tǒng)性血管炎、結(jié)節(jié)病、自身免疫性溶血性貧血(免疫性全血細(xì)胞減少、陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿)、自身免疫性血小板減少(特發(fā)性血小板減少性紫瘕、免疫介導(dǎo)的血小板減少)、曱狀腺炎(格雷夫斯氏(Graves)病、橋本氏(Hashimoto)曱狀腺炎、幼發(fā)型淋巴細(xì)胞性曱狀腺炎、萎縮性曱狀腺炎)、糖尿病、免疫介導(dǎo)的腎病(腎小球腎炎、腎小管間質(zhì)性腎炎)、中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的脫髓鞘病諸如多發(fā)性硬化、特發(fā)性多神經(jīng)病、肝膽病諸如傳染性肝炎(曱型、乙型、丙型、丁型、戊型和其它非嗜肝病毒肝炎)、自身免疫性慢性活動性肝炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化、肉芽腫性肝炎、和硬化性膽管炎、炎性和纖維化肺病(例如嚢性纖維化病)、麩膠敏感性腸病、惠普爾氏(Whipple)病、自身免疫或免疫介導(dǎo)的皮膚病包括大皰性皮膚病、多形紅斑和接觸性皮炎、4艮屑病、肺的變應(yīng)性疾病諸如嗜曙紅細(xì)胞性肺炎、特發(fā)性肺纖維化和超敏感性肺炎、移植相關(guān)疾病包括移植物排斥和移植物抗宿主病。在系統(tǒng)性紅斑狼瘡中，疾病的主要介質(zhì)是生成對自身蛋白質(zhì)/組織的自身反應(yīng)性抗體及隨后生成免疫介導(dǎo)的炎癥?？贵w或是直接或是間接介導(dǎo)組織損傷。盡管T淋巴細(xì)胞未顯示出直接牽涉組織損傷，然而T淋巴細(xì)胞是形成自身反應(yīng)性抗體所要求的。疾病的發(fā)生因此依賴T淋巴細(xì)胞。多個器官和系統(tǒng)在臨床上受到影響，包括腎、肺、肌肉骨骼系統(tǒng)、粘膜皮膚、眼、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、胃腸道、骨髓和血液。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是一種慢性系統(tǒng)性自身免疫性炎性疾病，主要牽涉多個關(guān)節(jié)的滑膜，由此導(dǎo)致對關(guān)節(jié)軟骨的損傷。發(fā)病機制依賴T淋巴細(xì)胞，而且與類風(fēng)濕因子，針對自身IgG的自身抗體的生成有關(guān)，由此導(dǎo)致免疫復(fù)合物的形成，它在關(guān)節(jié)液和血液中達(dá)到高水平。關(guān)節(jié)中的這些復(fù)合物可誘發(fā)顯著的淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤到滑膜中及隨后顯著的滑膜變化；關(guān)節(jié)腔/液受到類似細(xì)胞的浸潤及添加許多嗜中性粒細(xì)胞。受影響的組織主要是關(guān)節(jié)，常常是對稱樣式。然而，關(guān)節(jié)外疾病也存在兩種主要形式。一種形式是形成關(guān)節(jié)外損傷，伴有正在進(jìn)行的漸進(jìn)性關(guān)節(jié)病和肺纖維化、血管炎和皮膚潰瘍的典型損傷。關(guān)節(jié)外疾病的第二種形式是所謂的費爾提氏(Felty)綜合征，它發(fā)生在RA病程晚期，有時在關(guān)節(jié)病已經(jīng)沉寂后，且牽涉出現(xiàn)嗜中性粒細(xì)胞減少癥、血小板減少癥和脾腫大。這可伴隨著多個器官中的血管炎及梗塞、皮膚潰瘍和壞疽的形成?；颊哌€常常在受影響關(guān)節(jié)上面的皮下組織中形成類風(fēng)濕性節(jié)結(jié)；晚期的節(jié)結(jié)具有由混合的炎性細(xì)胞浸潤物包圍的壞死中心?？稍赗A中出現(xiàn)的其它表現(xiàn)包括心包炎、胸膜炎、冠狀動脈炎、伴有肺纖維化的間質(zhì)性肺炎、干燥性角膜結(jié)膜炎和類風(fēng)濕性節(jié)結(jié)。幼發(fā)型慢性關(guān)節(jié)炎是一種慢性特發(fā)性炎性疾病，常常開始于16歲之前。其表型與RA有些相似；類風(fēng)濕因子陽性的某些患者歸入幼發(fā)型類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。疾病細(xì)分為三種主要類別少數(shù)關(guān)節(jié)的、多關(guān)節(jié)的和系統(tǒng)性的。關(guān)節(jié)炎可以是嚴(yán)重的，通常是破壞性的，并導(dǎo)致關(guān)節(jié)僵硬和生長遲緩。其它表現(xiàn)可包括慢性前葡萄膜炎和系統(tǒng)性淀粉樣變。脊推關(guān)節(jié)病是具有一些普遍臨床特征且普遍與HLA-B27基因產(chǎn)物表達(dá)有關(guān)的一組紊亂。這些紊亂包括強直性脊柱炎、萊特爾氏(Reiter)綜合征(反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎)、與炎性腸病有關(guān)的關(guān)節(jié)炎、與銀屑病相關(guān)的脊推炎、幼發(fā)型脊推關(guān)節(jié)病及無差別(undifferentiated)脊推關(guān)節(jié)病。區(qū)別性特征包括具有或沒有脊推炎的骶髂關(guān)節(jié)炎；炎性不對稱關(guān)節(jié)炎；與HLA-B27有關(guān)(血清學(xué)上定義的MHCI型HLA-B基因座的等位基因)；眼炎癥；及與其它類風(fēng)濕性疾病有關(guān)的自身抗體的缺乏。對于誘發(fā)疾病來說關(guān)鍵的最相關(guān)細(xì)胞是CD8+T淋巴細(xì)胞，靶向由MHCI型分子呈遞的抗原的細(xì)胞。CD8+T細(xì)胞可與MHCI型等位基因HLA-B27反應(yīng)，就像它是由MHCI型分子表達(dá)的外源肽。已有假設(shè)，HLA-B27的表位可能模擬細(xì)菌或其它微生物的抗原性表位，因此誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。系統(tǒng)性硬化(硬皮病)的病因?qū)W未知。疾病的特點是皮膚硬化；這可能是由活性炎性過程誘導(dǎo)的。硬皮病可以是局部的或系統(tǒng)性的；血管損壞是普遍的，而且微血管系統(tǒng)中的內(nèi)皮細(xì)胞損傷是系統(tǒng)性硬化發(fā)展中的早期且重要的事件；血管損傷可能由免疫介導(dǎo)。皮膚損傷中存在單核細(xì)胞浸潤物及在許多患者中存在抗核抗體暗示免疫學(xué)基礎(chǔ)。ICAM-1常常在皮膚損傷中成纖維細(xì)胞的細(xì)胞表面上調(diào)，說明T細(xì)胞與這些細(xì)胞相互作用可能在疾病的發(fā)病機理中起作用。牽涉的其它器官包括胃腸道平滑肌萎縮和纖維化，導(dǎo)致異常蠕動/運動；腎同中心內(nèi)皮下內(nèi)膜增生，影響小弓形和葉間動脈，從而降低腎皮質(zhì)血流，導(dǎo)致蛋白尿、氮血癥和高血壓；骨骼肌萎縮、間質(zhì)性纖維化、炎癥；肺間質(zhì)性肺炎和間質(zhì)性纖維化；及心收縮帶壞死、疤痕化/纖維化。特發(fā)性炎性肌病，包括皮肌炎、多肌炎和其它，是導(dǎo)致肌肉軟弱的未知病因的慢性肌肉炎性紊亂。肌肉損傷/發(fā)炎常常是對稱的和漸進(jìn)的。自身抗體與大多數(shù)形式有關(guān)。這些肌炎特異性自身抗體針對并抑制牽涉蛋白質(zhì)合成的成分、蛋白質(zhì)和RNA的功能。斯耶格倫氏(Sj6gren)綜合征是由免疫介導(dǎo)的炎癥及隨后淚腺和唾液腺功能破壞引起的。該病可能與炎性結(jié)締組織疾病有關(guān)或伴隨著炎性結(jié)締組織疾病。該病與針對Ro和La抗原的自身抗體生成有關(guān)，這兩種抗原都是小RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。損害導(dǎo)致干燥性角膜結(jié)膜炎、口干燥、及其它表現(xiàn)或關(guān)聯(lián)，包括膽汁性肝硬化、外周或感覺神經(jīng)病和可觸知的紫瘕。系統(tǒng)性血管炎包括這樣的疾病，其中原發(fā)性損傷是炎癥，后續(xù)對血管的損傷導(dǎo)致由受影響血管供應(yīng)的組織缺血/壞死/變性，且在某些情況中最終導(dǎo)致終端器官功能障礙。血管炎病還可作為其它免疫-發(fā)炎介導(dǎo)疾病諸如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性硬化等的繼發(fā)損傷或后遺癥發(fā)生，特別是在還與免疫復(fù)合物形成有關(guān)的疾病中。原發(fā)性系統(tǒng)性血管炎組中的疾病包括系統(tǒng)性壞死性血管炎節(jié)結(jié)性多動脈炎、過敏性血管炎和肉芽腫病、多脈管炎；韋格納氏(Wegener)肉芽腫病；淋巴瘤樣肉芽腫??；和巨細(xì)胞性動脈炎。各種各樣的血管炎病包括粘膜與皮膚淋巴結(jié)綜合征(MLNS或川畸氏(Kawasaki)病)、分離的CNS血管炎、貝切特氏(Behet)病、血栓閉塞性血管炎(伯格氏(Buerger)病)和皮膚壞死性小靜脈炎。所列大多數(shù)類型的血管炎的發(fā)病機理認(rèn)為主要是由于免疫球蛋白復(fù)合物在血管壁中沉積及隨后經(jīng)ADCC、補體活化或者兩者誘導(dǎo)的炎性應(yīng)答。節(jié)結(jié)病是病因?qū)W未知，特征在于幾乎機體任何組織中都存在上皮樣肉芽肺的狀況；最常見的是牽涉肺。發(fā)病機理牽涉患病部位持續(xù)存在活化的巨噬細(xì)胞和淋巴樣細(xì)胞及隨后由這些細(xì)胞類型釋放局部和系統(tǒng)性活性產(chǎn)物而導(dǎo)致的慢性后遺癥。自身免疫性溶血性貧血，包括自身免疫性溶血性貧血、免疫性全血細(xì)胞減少癥和陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿，是由于生成與紅細(xì)胞(和在有些情況中其它血細(xì)胞，包括血小板)表面表達(dá)的抗原反應(yīng)的抗體的結(jié)果，是經(jīng)補體介導(dǎo)的溶解和/或ADCC/Fc受體介導(dǎo)的機制去除那些抗體包被細(xì)胞的反映。在自身免疫性血小板減少癥，包括血小板減少性紫癜，和其它臨床背景中免疫介導(dǎo)的血小板減少癥中，由于抗體或補體附著于血小板及隨后經(jīng)補體溶解、ADCC或Fc受體介導(dǎo)的機制去除而發(fā)生血小板破壞/去除。曱狀腺炎，包括格雷夫斯氏(Graves)病、橋本氏(Hashimoto)甲狀腺炎、幼發(fā)型淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎和萎縮性曱狀腺炎，是由于針對曱狀腺抗原的自抗體?，F(xiàn)有的實驗?zāi)Ｐ桶ㄗ园l(fā)性模型大鼠(BUF和BB大鼠)和雞(肥胖雞品系)；可誘導(dǎo)模型用曱狀腺球蛋白、曱狀腺微粒體抗原(曱狀腺過氧化物酶)免疫動物。I型糖尿病或胰島素依賴性糖尿病是胰島p細(xì)胞的自身免疫性破壞；該破壞由自身抗體和自身反應(yīng)性T細(xì)胞介導(dǎo)。胰島素或胰島素受體的抗體也可產(chǎn)生胰島素不響應(yīng)的表型。免疫介導(dǎo)的腎病，包括腎小球腎炎和腎小管間質(zhì)性腎炎，是由于抗體或T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的對腎組織的損傷，或是直接由于生成針對腎抗原的自身反免疫復(fù)合物在腎中沉積。因此，導(dǎo)致免疫復(fù)合物形成的其它免疫介導(dǎo)的疾病也可作為間接后遺癥誘導(dǎo)免疫介導(dǎo)的腎病。直接和間接的免疫機制都導(dǎo)致炎性應(yīng)答，它在腎組織中產(chǎn)生/誘導(dǎo)損傷形成，導(dǎo)致器官功能受損，在有些情況中發(fā)展成腎衰竭。體液和細(xì)胞兩種免疫機制都可牽涉損傷的發(fā)病機理。中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的脫髓鞘病，包括多發(fā)性^^化；特發(fā)性脫髓鞘多神經(jīng)病或格-巴二氏(Guillain-Barr6)綜合征；和慢性炎性脫髓鞘多神經(jīng)病，認(rèn)為具有自身免疫基礎(chǔ)，而且由于對少突膠質(zhì)細(xì)胞或?qū)λ梓[脂直接造成損害而導(dǎo)致神經(jīng)脫髓鞘。在MS中，有證據(jù)表明該病的誘導(dǎo)和發(fā)展依賴T淋巴細(xì)胞。多發(fā)性硬化是依賴T淋巴細(xì)胞的炎性脫髓鞘病，而且具有復(fù)發(fā)-緩和過程或漫長的漸進(jìn)過程。病因未知；然而，病毒感染、遺傳惡病質(zhì)、環(huán)境和自身免疫性都會起作用。損傷含有主要由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的浸潤物、小膠質(zhì)細(xì)胞和浸潤的巨噬細(xì)胞；CD4+T淋巴細(xì)胞是損傷處的主要細(xì)胞類型。少突膠質(zhì)細(xì)胞死亡和隨后脫髓鞘的機理未知，但是可能是由T淋巴細(xì)胞驅(qū)動的。炎性和纖維化肺病，包括嗜曙紅細(xì)胞性肺炎；特發(fā)性肺纖維化和超敏性肺炎，可能牽涉不受調(diào)控的免疫-發(fā)炎應(yīng)答。抑制該應(yīng)答將具有治療益處。自身免疫或免疫介導(dǎo)的皮膚病，包括大皰性皮膚病、多形性紅斑和4^觸性皮炎，由自身抗體介導(dǎo)，其發(fā)生依賴T淋巴細(xì)胞。銀屑病是T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的炎性疾病。損傷含有T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和抗原加工細(xì)胞，及一些嗜中性粒細(xì)胞的浸潤物。變應(yīng)性疾病，包括哮喘；變應(yīng)性鼻炎；特應(yīng)性皮炎；食物超敏性；和蕁麻滲，依賴T淋巴細(xì)胞。這些疾病主要由T淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)的炎癥、IgE介導(dǎo)的炎癥或二者組合介導(dǎo)。移植相關(guān)疾病，包括移植排斥和移植物抗宿主病(GVHD),依賴T淋巴細(xì)胞；抑制T淋巴細(xì)胞功能具有改善作用。為了預(yù)防、治療或降低補體相關(guān)(免疫相關(guān))疾病的嚴(yán)重程度，本發(fā)明化合物的適宜劑量將取決于如上定義的待治療疾病的類型、疾病的嚴(yán)重程度和進(jìn)程、藥劑是為了預(yù)防還是治療目的施用的、先前的療法、患者的臨床史和對化合物的響應(yīng)、及主治醫(yī)師的判斷。一次性或通過一系列治療將化合物合適的施用于患者。優(yōu)選的是，希望在人體測試前首先在體外，然后在有用的動物模型中測定本發(fā)明藥用組合物的劑量-響應(yīng)曲線。例如，根據(jù)疾病的類型和嚴(yán)重程度，施用于患者的初始候選劑量是約lpg/kg至15mg/kg(如0.1-20mg/kg)多肽，例如或是通過一次或多次分開施藥或是通過連續(xù)輸注。根據(jù)上述因素，典型日劑量的范圍可以是約l叫/kg至100mg/kg或更多。對于持續(xù)數(shù)天或更長的重復(fù)施藥，根據(jù)狀況，持續(xù)治療直至疾病癥狀發(fā)生期望的抑制。然而，其它劑量方案也可能是有用的。這種療法的進(jìn)程易于通過常規(guī)技術(shù)和測定法來監(jiān)測。本發(fā)明的化合物在用于預(yù)防或治療眼疾病或狀況時通常通過眼、眼內(nèi)、和/或玻璃體內(nèi)注射來施用。也可使用的其它施用方法包括但不限于局部、腸胃外、皮下、腹膜內(nèi)、肺內(nèi)、鼻內(nèi)和損傷內(nèi)施用。腸胃外輸注包括肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、腹膜內(nèi)或皮下施用。用于眼、眼內(nèi)或玻璃體內(nèi)施用的配制劑可使用本領(lǐng)域已知的方法和成分來制備。有效治療的一項主要要求是正確滲透穿過眼。與眼前部的疾病(在那里藥物可局部投遞)不同，視網(wǎng)膜疾病要求更加部位特異的方法。滴眼劑和軟膏劑^^少滲透眼后部，而且血-眼屏障阻礙系統(tǒng)施用的藥物滲透到眼組織中。因此，選擇用于藥物投遞以治療視網(wǎng)膜疾病，諸如AMD和CNV的方法通常是直接玻璃體內(nèi)注射。根據(jù)患者的狀況及所投遞藥物的特性和半衰期，玻璃體內(nèi)注射通常以一定間隔重復(fù)。為了眼內(nèi)(例如玻璃體內(nèi))滲透，通常優(yōu)選較小的分子。在CRIg的情況中，所有形式，包括huCRIg短型和長型的ECD及其Ig(Fc)融合物、全長huCRIg長型和短型及其Ig(Fc)融合物，都適于眼內(nèi)(包括玻璃體內(nèi))投遞。補體相關(guān)眼狀況，諸如AMD或CNV，的治療功效可通過評估眼內(nèi)疾病中常用的多個終點來測量。例如，可評估視力損失。視力損失可通過但不限于例如下列各項來評估測量自基線至預(yù)期時間點最佳矯正視力(BCVA)的平均變化(例如在BCVA基于早期處理糖尿病性視網(wǎng)膜病變研究(ETDRS)視力檢查表和以4米測試距離評估)；測量在預(yù)期時間點與基線相比—見力喪失少于15個字母的受試者的比例；測量在預(yù)期時間點與基線相比視力獲得超過或等于15個字母的受試者的比例；測量在預(yù)期時間點Snellen一見力相當(dāng)于20/2000或更差的受試者的比例；測量NEI視覺功能問巻(VisualFunctioningQuestionnaire);測量預(yù)期時間點CNV的大小和CNV滲漏的量，例如通過焚光素血管造影術(shù)；等?？蛇M(jìn)行眼評估，例如包括但不限于例如進(jìn)行眼4企查，測量眼內(nèi)壓，評估視力，測量裂隙燈壓(slitlamppressure),評估眼內(nèi)炎癥，等。CRIg拮抗劑，諸如CRIg的抗體，可用于治療腫瘤(癌)的免疫輔助療法?，F(xiàn)在完全確立了T細(xì)胞識別人腫瘤特異抗原。由MAGE、BAGE和GAGE基因家族編碼的一組肺瘤抗原在所有成人正常組織中是沉默的，但在腫瘤，諸如黑素瘤、肺腫瘤、頭和頸腫瘤、和膀胱癌中以顯著量表達(dá)。DeSmet,C.etal,Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:7149(1996)。已經(jīng)顯示出T細(xì)胞的共刺激在體外和在體內(nèi)都誘導(dǎo)月中瘤消退和抗月中瘤應(yīng)答。Melero,I.etal,NatureMedicine3:682(1997);Kwon,E.D.etal，Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:8099(1997);Lynch,D.H.etal,NatureMedicine3:625(1997);Finn,O.J.andLotze,M.T.,J.Immunol.21:114(1998)。本發(fā)明的CRIg拮抗劑可作為佐劑單獨施用或耳關(guān)合生長調(diào)節(jié)劑、細(xì)胞毒劑或化療劑以刺激T細(xì)胞增殖/激活和對腫瘤抗原的抗腫瘤應(yīng)答。生長調(diào)節(jié)劑、細(xì)胞毒劑或化療劑可以使用已知施用方案以常規(guī)量施用。本發(fā)明CRIg拮抗劑的免疫刺激活性容許降低生長調(diào)節(jié)劑、細(xì)胞毒劑或化療劑的量，由此潛在降低對患者的毒性。盡管有些巨噬細(xì)胞牽涉肺瘤根除，然而許多實體瘤已知包含支持腫瘤生長的巨喧細(xì)胞(Bingleetal"JPathol196:254-265(2002);Mantovanietal"TrendsImmunol23:549-555(2002))。這些巨噬細(xì)胞可在其表面上包含CRIg。阻斷CRIg抑制補體激活能力的抗體可用于活化腫瘤細(xì)胞上的補體并經(jīng)由補體介導(dǎo)的溶解來幫助根除腫瘤。此方法將在包含CRIg陽性巨噬細(xì)胞的腫瘤中特別有用。在本發(fā)明的治療方法中，本文中的組合物可聯(lián)合一種或多種用于預(yù)防或治療目標(biāo)疾病或狀況的其它治療形式。因此，例如，如果目標(biāo)是預(yù)防或治療補體相關(guān)眼狀況，那么CRIg(包括所有形式及其EC區(qū)和/或Ig融合物)的的施用，它正在AMD治療的臨床開發(fā)中。在最近結(jié)束的一項m期臨床試驗中，除了在患有濕性AMD的患者中達(dá)到了研究的主要功效終點，維持視力，根據(jù)糖尿病性視網(wǎng)膜病變早期處理(ETDRS)視力檢查表的測量，25%(59/238)用0.3mgLucentisTM處理的患者和34%(81/240)用0.5mgLucentis處理的患者視力得到改善，增加了15個字母或更多，比較而言對照組的患者只有約5%(11/238)。差不多40%(188/478)用LucentisTM處理的患者在12個月時達(dá)到視力得分20/40或更好，比較而言對照組只有11%(26/238)。在12個月時，與加入研究時的一見力相比，用LucentisTM處理的患者平均得到7個字母，而對照組患者平均丟失10.5個字母。如果目標(biāo)是治療補體相關(guān)炎性或自身免疫性疾病，CRIg(包括所有形式)的施用可聯(lián)合用于此類適應(yīng)癥的其它療法。因此，例如，如果目標(biāo)是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)，可l關(guān)合其它關(guān)節(jié)炎藥物，諸如水楊酸鹽/酯(salicialates)(例如阿司匹林)、傳統(tǒng)非類固醇抗炎分子(NSAIDs)(諸如例如Asaid、奧斯克(Arthrotec)、凱扶蘭(Cataflam)、布洛芬(Ibuprofen)、萘普生(Naproxen)等)、COX-2抑制劑(例如Celebrex、Vioxx)。在此語境中，"4關(guān)合"指同時施用或任意次序的順序施用，而且可以是任何劑量形式，相同或不同的投遞路徑。7.謬遂成法和動參凝fCRIg和CRIg激動劑，包括CRIg和CRIgECD的Ig融合物，可在補體相關(guān)疾病或紊亂的多種基于細(xì)胞的測定法和動物才莫型中評估。因此，例如，在預(yù)防和/或治療關(guān)節(jié)炎中的功效可在膠原誘發(fā)的關(guān)節(jié)炎模型(Teratoetal.BritJ.Rheum.35:828-838(1966))中如下文實施例7所示評估。潛在的關(guān)節(jié)炎預(yù)防劑/治療劑還可在通過靜脈內(nèi)注射四種單克隆抗體的混合物誘發(fā)的抗體介導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型中篩選，如Teratoetal.，J.Immunol.148:2103-8(1992);Teratoetal"Autoimmunity22:137-47(1995);和下文實施例8所述。用于預(yù)防和/或治療關(guān)節(jié)炎的候選物還可在轉(zhuǎn)基因動物模型中研究，諸如例如TNF-a轉(zhuǎn)基因小鼠(Taconic)。這些動物表達(dá)人胂瘤壞死因子(TNF-a),一種已經(jīng)牽連人的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病機制的細(xì)胞因子。TNF-oc在這些小鼠中的表達(dá)導(dǎo)致前爪和后爪的嚴(yán)重慢性關(guān)節(jié)炎，提供了筒單的炎性關(guān)節(jié)炎小鼠模型。最近幾年，還已開發(fā)出銀屑病動物模型。因此，無皮脂(Asebia)(a。、皮膚薄而易剝落(/^7)、和慢性增殖性皮炎(cp力是具有4艮屑病樣皮膚改變的自發(fā)性小鼠突變。皮膚過表達(dá)細(xì)胞因子，諸如干擾素-y、白介素-la、角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子-a、干擾素-6、血管內(nèi)皮生長因子或骨形態(tài)發(fā)療劑。銀屑病樣損傷還描述于與PL/J品系回交的p2-整聯(lián)蛋白亞效等位基因小鼠和卩l(xiāng)-整聯(lián)蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠、用CD4+/CD45RBhiT淋巴細(xì)胞重建的化,V/A^W小鼠、以及HLA-B27/hp2m轉(zhuǎn)基因大鼠。還知道使用人皮膚移植到免疫缺陷小鼠上的異種移植^l型。因此，本發(fā)明的化合物可在Schon，M.Retal,Nat.Med.3:183(1997)所述"W/"W小鼠模型中測試，其中小鼠展示與銀屑病類似的組織病理學(xué)皮膚損傷。另一種合適的模型是如Nickoloff,B.J.etal.,Am.J.Path.146:580(1995)所述制備的人皮膚/scid小鼠嵌合物。更多詳情參見例如Schon,M.P"JInvestDermatology112:405-410(1999)。重組(轉(zhuǎn)基因)動物模型可使用用于生成轉(zhuǎn)基因動物的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)通過將目的基因的編碼部分導(dǎo)入目的動物的基因組來改造?？沙洚?dāng)轉(zhuǎn)基因操作對象的動物包括但不限于小鼠、大鼠、兔、豚鼠、綿羊、山羊、豬和非人靈長類動物，例如狒狒、黑猩猩和其它猴類。本領(lǐng)域已知的用于將轉(zhuǎn)基因?qū)氪祟悇游锏?支術(shù)包4舌原才亥顯4鼓注射(pronucleicmicroinjection)(Hoppeand^Vanger,美國專利4,873,191);逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移進(jìn)入種系(例如VanderPuttenetal"Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:6148-615(1985》;胚胎干細(xì)胞中的基因?qū)ぐ?Thompsonetal.，Cell56:313-321(1989》;胚胎電穿孔(Lo，Mol.Cell.Biol.3:1803-1814(1983));精子介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移(Lavitranoetal.，Cell57:717-73(1989))。綜述參見例如美國專利4,736,866。為了本發(fā)明的目的，轉(zhuǎn)基因動物包括那些只在其部分細(xì)胞中攜帶轉(zhuǎn)基因的動物("鑲嵌動物，，)。轉(zhuǎn)基因可作為單一轉(zhuǎn)基因或者串聯(lián)物例如頭-頭或頭-尾串聯(lián)物整合。還可能如下將轉(zhuǎn)基因選擇性導(dǎo)入特定細(xì)胞類型，例如Laskoetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:623-636(1992)的技術(shù)。轉(zhuǎn)基因在轉(zhuǎn)基因動物中的表達(dá)可通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來監(jiān)測。例如，Southern印跡分析或PCR擴增可用于驗證轉(zhuǎn)基因的整合。然后可使用諸如原位雜交、Northern印跡分析、PCR或免疫細(xì)胞化學(xué)等技術(shù)分析mRNA表達(dá)水平。動物可進(jìn)一步檢驗免疫病病理學(xué)的征候，例如通過組織學(xué)檢驗以測定免疫細(xì)胞是否浸潤到特定組織中。還可進(jìn)行阻斷實驗，其中用CRIg或候選激動劑處理轉(zhuǎn)基因動物以測定對補體和補體激活，包括經(jīng)典和旁5^途徑，或者T細(xì)胞增殖的影響程度。在這些實驗中，將結(jié)合本發(fā)明多肽的阻斷性抗體施用于動物并監(jiān)測感興趣的生物學(xué)效果?；蛘?，作為編碼CRIg多肽的內(nèi)源基因和導(dǎo)入動物胚胎細(xì)胞的編碼相同多肽的改變的基因組DNA之間同源重組的結(jié)果，可構(gòu)建具有缺陷的或改變的編碼CRIg的基因的"敲除"動物。例如，編碼CRIg的cDNA可用于依照已建立的技術(shù)克隆編碼CRIg的基因組DNA。編碼CRIg的基因組DNA的一部分可刪除或用另一基因，諸如編碼可用于監(jiān)測整合的選擇標(biāo)志的基因的替換。通常，在載體中包含幾千堿基未改變的側(cè)翼DNA(5'和3'末端都有)(同源重組載體的描述參見例如ThomasandCapecchi,Cell51:503(1987))。將載體導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞系(例如通過電穿孔)，并選擇其中導(dǎo)入的DNA與內(nèi)源DNA發(fā)生同源重組的細(xì)胞(參見例如Lietal.,Cell69:915(1992))。然后將選擇的細(xì)胞注射到動物(例如小鼠或大鼠)的胚泡中以形成聚集嵌合物(參見例i口Bradley,inTeratocarcinomasandEmbryonicStemCell:APracticalApproach,E.J.Robertson,ed,(IRL,Oxford,1987),pp.113-152)。然后可將嵌合胚胎植入合適的假孕雌性代孕動物，并使胚胎足月生產(chǎn)以產(chǎn)生"敲除"動物。在其生殖細(xì)胞中包含同源重組DNA的后代可通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)鑒定，并用于繁殖其中動物的所有細(xì)胞都包含同源重組DNA的動物。敲除動物可以通過例如由于缺乏CRIg多肽而防御某些病理狀況的能力和形成病理狀況來表征。因此，CRIg或其潛在激動劑的生物學(xué)活性可在鼠CRIg敲除小鼠中進(jìn)一步研究，如下文實施例7所述。已經(jīng)描述了一種哮喘模型，其中通過用卵清蛋白使動物敏化，然后用通過氣霧劑投遞的相同蛋白質(zhì)對動物挑戰(zhàn)而誘導(dǎo)抗原誘發(fā)的氣道高反應(yīng)性、肺嗜曙紅細(xì)胞增多和炎癥。幾種動物模型(豚鼠、大鼠、非人靈長類動物)在的許多特征。測試CRIg和CRIg激動劑在治療哮喘中的活性和效力的合適流程記載于Wolyniec,W.W.etal"Am.J.Respir.CellMol.Biol.18:777(1998)及其引用的參考文獻(xiàn)。接觸超敏感性是細(xì)胞介導(dǎo)的免疫功能的一種筒單的體內(nèi)測定法。在此流程中，使表皮細(xì)胞暴露于外源半抗原，它引起遲發(fā)型超敏感性反應(yīng)，對此測量和定量。接觸超敏感性牽涉初始敏化階段，隨后是引發(fā)階段。引發(fā)階段在表皮細(xì)胞遭遇它們先前已經(jīng)接觸過的抗原時發(fā)生。發(fā)生腫脹和發(fā)炎，使之成為人過敏性接觸性皮炎的卓越模型。一種合適的流程詳細(xì)記載于CurrentProtocolsinImmunology,Eds.J.E.Cologan,A.M.Kruisbeek，D.H.Margulies,E.M.ShevachandW.Strober,JohnWiley&Sons,Inc.,1994,unit4.2。還可參見Grabbe，S.andSchwarz,T.,Immun.Today19(1):37-44(1998).移植物抗宿主病在將免疫活性細(xì)胞移植到免疫遏制或耐受的患者中時發(fā)生。供體細(xì)胞識別和響應(yīng)宿主抗原。應(yīng)答可從危及生命的嚴(yán)重炎癥至腹瀉和體重減輕的輕微病例變化。移植物抗宿主病模型提供了評估T細(xì)胞針對MHC抗原和次要移植抗原的反應(yīng)性的一種手段。一種合適的流程詳細(xì)記載于CurrentProtocolsinImmunology,見上文,unit4.3。皮膚同種移植物排斥的一種動物模型是測試T細(xì)胞介導(dǎo)體內(nèi)組織破壞能力的一種手段，這是它們在抗病毒和腫瘤免疫中的角色的指示和度量。最常用和承認(rèn)的模型使用鼠尾皮膚移植物。重復(fù)實驗顯示出皮膚同種移植物排斥是由T細(xì)胞、輔助T細(xì)胞和殺傷-效應(yīng)T細(xì)胞而非抗體介導(dǎo)的。Auchincloss，H.Jr.andSachs,D.H.,FundamentalImmunology,2nded.,W.E.Pauled.,RavenPress,NY,1989,889-992。一種合適的流程詳細(xì)記載于CurrentProtocolsinImmunology,見上文，unit4.4。可用于測試CRIg和CRIg激動劑的其它移植排斥模型有Tanabe,M.etal.，Transplantation58:23(1994)和Tinubu,S.A.etal.,J.Immunol.4330-4338(1994)描述的同種心移植模型。遲發(fā)型超敏感性的動物模型同樣提供了細(xì)胞介導(dǎo)的免疫功能的測定法。遲發(fā)型超敏感性反應(yīng)是T細(xì)胞介導(dǎo)的體內(nèi)免疫應(yīng)答，特征為在抗原挑戰(zhàn)后一段時間流逝后才達(dá)到峰值的炎癥。這些反應(yīng)也在組織特異性自身免疫病中發(fā)生，諸如多發(fā)性硬化(MS)和實驗性自身免疫腦脊髓炎(EAE,MS的一種模型)。一種合適的S危禾呈詳纟田i己載于CurrentProtocolsinImmunology,見上文，unit4.5。EAE是T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫病，特征為T細(xì)胞和單核細(xì)胞炎癥和隨后中樞神經(jīng)系統(tǒng)中軸突的脫髓鞘。EAE通常認(rèn)為是人MS的相關(guān)動物模型。Bolton,C.，MultipleSclerosis1:143(1995)。急性和復(fù)發(fā)-緩和兩種模型都已開發(fā)。CRIg及其激動劑和拮抗劑可針對免疫介導(dǎo)的脫髓鞘病測試T細(xì)胞刺激'l"生或4中制'l"生5舌'l"生，^f吏用CurrentProtocolsinImmunology,見上文，units15.1禾口15.2中所述方案。還可參見髓磷脂疾病的模型，其中將少突膠質(zhì)細(xì)胞或施旺(Schwann)纟田胞移才直到中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，如Duncan,I.D.etal.,Molec,Med.Today554-561(1997)所述。年齡相關(guān)黃斑變性(AMD)的一種動物模型由具有Ccl-2或Ccr-2基因無效突變的小鼠組成。這些小鼠形成AMD的主要特征，包括視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)中積聚脂褐質(zhì)和下面積聚玻璃疣、光受體萎縮和脈絡(luò)膜新血管形成(CNV)。這些特征晚于6月齡形成?？蓪RIg和CRIg激動劑測試玻璃疣形成、光受體萎縮和脈絡(luò)膜新血管形成。CNV可在多種激光誘發(fā)的脈絡(luò)膜新血管形成模型中測試。因此，例如，可在大鼠和獼猴中通過導(dǎo)致脈絡(luò)膜新血管形成的強烈激光光凝固而誘導(dǎo)CNV。此狀況的發(fā)展和治療可例如通過熒光素血管造影術(shù)，組織學(xué)和免疫組化評估，及治療前和治療后以不同時間間隔從動物采集的血清的藥動學(xué)、溶血、抗體篩選和補體活化測定法來評估。預(yù)防性施用的功效可通過類似方法來監(jiān)測，包括通過熒光素血管造影術(shù)監(jiān)測血管滲漏、激光燒傷部位對補體沉積的抑制、眼檢查、眼攝影術(shù)、收集玻璃體和視網(wǎng)膜組織、等等。下文實施例提供了更多詳情。心肌缺血-再灌注的模型可在小鼠或大鼠中進(jìn)行。將動物切開氣管并用小型動物通風(fēng)機換氣。將聚乙烯導(dǎo)管置于頸內(nèi)動脈和頸外靜脈中供測量平均動脈血壓。通過用6-0縫合線結(jié)扎左前降支動脈(LAD)來啟動心肌缺血再灌注。缺血是通過扎緊圍繞LAD的可逆結(jié)扎以完全閉塞血管而產(chǎn)生的。30分鐘后除去結(jié)扎，并對心灌注4小時。CRIg和CRIg激動劑的功效可通過測量心梗塞大小、心肌氨酸激酶活性、髓過氧化物酶活性和4吏用抗C3抗體的免疫組化來測試。糖尿病性視網(wǎng)膜病變的一種模型牽涉用鏈唑霉素(streptozotocin)處理小鼠或大鼠?？蓪RIg和CRIg激動劑測試它們對浮見網(wǎng)膜和玻璃體腔孩i靜脈膨脹(venuledilatation),視網(wǎng)膜內(nèi)微血管異常和新血管形成的影響。膜性增生性腎小球腎炎的一種模型可如下確立將雌性小鼠i.p.免疫CFA中的0.5mg對照兔IgG(第-7天)。七天后(第0天)，經(jīng)尾靜脈i.v.注射1mg兔抗小鼠腎小球基底膜(GBM)抗體。通過ELISA測量抗兔IgG抗體在血清中的升高。從代謝籠中的小鼠收集24小時尿樣，并通過在血液尿素氮之外測量尿蛋白來評估小鼠腎功能。藥用組合物本發(fā)明的活性分子，包括多肽及其激動劑，以及通過上文公開的篩選測定法鑒定的其它分子，可以藥用組合物的形式施用以治療炎性疾病。本發(fā)明的活性分子，優(yōu)選CRIg多肽或CRIg激動劑的治療用配制劑如下制備供貯存，即以凍千劑型或水溶液的形式，將具有期望純度的活性分子與任選的藥學(xué)可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑混合(Remington'sPharmaceuticalSciences,16thedition,Osol,A.Ed"1980)。可4妄受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑在所采用的劑量和濃度對接受者是無毒的，包括緩沖劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二曱基芐基銨；氯化己烷雙胺；苯扎氯銨、苯索氯銨；酚、丁醇或苯曱醇；對羥基苯曱酸烷基酯，諸如對羥基苯曱酸曱酯或丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；和間曱酚)；低分子量(少于約10個殘基)多肽；蛋白質(zhì)，諸如血清清蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，諸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA;糖類，諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽相反離子，諸如鈉；金屬復(fù)合物(例如Zn-蛋白質(zhì)復(fù)合物)；和/或非離子表面活性劑，諸如tweentm、PLURONICStm或聚乙二醇(PEG)。技術(shù)以類似方式配制。脂轉(zhuǎn)染或脂質(zhì)體也可用于將多肽、抗體或抗體片段投遞到細(xì)胞中。在使用抗體片段時，優(yōu)選特異性結(jié)合靶蛋白質(zhì)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的最小片段。例如，基于抗體的可變區(qū)序列，可設(shè)計保留結(jié)合靶蛋白質(zhì)序列的能力的肽分子。此類肽可化學(xué)合成，和/或通過重組DNA技術(shù)生成(參見例如Marascoetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:7889-7893(1993))。本文中的配制劑還可含有超過一種所治療具體適應(yīng)癥所必需的活性化合物，優(yōu)選彼此活性互補且沒有不利影響的?；蛘?另外，組合物可含有細(xì)胞毒劑、細(xì)胞因子或生長抑制劑。合適的是，此類分子以對于預(yù)定目的有效的量組合。活性分子還可包載于例如通過凝聚技術(shù)或通過界面聚合制備的微膠嚢中(例如分別是羥曱基纖維素或明膠微膠嚢和聚(曱基丙烯酸曱酉旨)微膠嚢)、在膠狀藥物投遞系統(tǒng)中(例如脂質(zhì)體、清蛋白微球體、微乳劑、納米顆粒和納米膠嚢)、或在粗滴乳狀液中。此類技術(shù)公開于Remington'sPharmaceuticalSciences,16thedition,Osol,A.Ed"(1980)。用于體內(nèi)施用的配制劑必須是無菌的。這可容易的通過使用無菌濾膜過可制備持續(xù)釋放制劑。持續(xù)釋放制劑的合適例子包括含有抗體的固體疏水性聚合物半透性基質(zhì)，該基質(zhì)是定型產(chǎn)品的形式，例如薄膜或微膠嚢。持續(xù)釋放基質(zhì)的例子包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美國專利3,773,919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸Y乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物諸如LUPRONDEPOT(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林構(gòu)成的可注射微球體)及聚-D-(-)-3—羥基丁酸。雖然諸如乙烯-乙酸乙烯和乳酸-乙醇酸等聚合物能夠釋放分子達(dá)100天以上，但是某些水凝膠釋放蛋白質(zhì)的時間較短。當(dāng)膠嚢化抗體在體內(nèi)長時間維持時，它們可能由于暴露于37。C的潮濕環(huán)境而變性或聚集，導(dǎo)致生物學(xué)活性損失和免疫原性可能改變。可以根據(jù)相關(guān)機制來設(shè)計合理的穩(wěn)定化策略。例如，如果發(fā)現(xiàn)聚集機制是經(jīng)由硫醇-二硫化物互換的分子間S-S鍵形成，那么可通過修飾巰基殘基、由酸性溶液凍干、控制濕度、采用適宜添加劑和開發(fā)特定聚合物基質(zhì)組合物來實現(xiàn)穩(wěn)定。對于眼內(nèi)施用，通常使用注射配制劑，通常相隔約六周給藥。眼在每次注射前麻醉。然而，也有可能使用具有CRIg或激動劑，諸如CRIg-Ig或CRIgECD-Ig融合物的持續(xù)釋放配制劑的植入物，用于玻璃體內(nèi)釋放。提供下面的實施例只是為了例示目的，并非意圖以任何方式限制本發(fā)明的范圍。在此明確收入本說明書中引用的所有專利和參考文獻(xiàn)的全文作為參考。實施例除另有說明外，實施例中提及的商品化試劑依照制造商的說明書使用。下文實施例和整篇說明書中以ATCC編號鑒別的那些細(xì)胞的來源是美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,10801UniversityBoulevard,Manassas,VA20110-2209)。實施例1:編碼人CRIg(PR0362)的cDNA克隆的分離使用Swiss-Prot公用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中的約950種已知的分泌型蛋白質(zhì)的胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)序列(包括分泌信號，如果有的話)檢索表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)數(shù)據(jù)庫。EST數(shù)據(jù)庫包括公用的EST數(shù)據(jù)庫(例如GenBank)和私有的ESTDNA數(shù)據(jù)庫(LIFESEQ,IncytePharmaceuticals,PaloAlto,CA)。檢索使用計算才幾程序BLAST或BLAST陽2(例如Altshuletal.,MethodsinEnzymology266:460-480(1996))，將ECD蛋白質(zhì)序列與EST序列的6種閱讀框翻i奪結(jié)果進(jìn)行比較。將BLAST得分為70(或在有些情況中為90)或更高但不編碼已4口蛋白質(zhì)的比專交用禾呈序"phrap"(PhilGreen,Universityof^Washington,Seattle,Washington)簇集并裝配成共有DNA序列。共有DNA序列是相對于其它EST序列使用phrap裝配出的。該共有序列在本文中稱為DNA42257(SEQIDNO:9)(見圖32)。根據(jù)圖32所示DNA42257(SEQIDNO:9)共有序列，合成寡核苷酸l)以通過PCR鑒定包含目的序列的cDNA文庫，和2)作為探針用于分離CRIg的全長編碼序列的克隆。正向和反向PCR引物的范圍通常是20-30個核苷酸，常常設(shè)計成產(chǎn)生長約100-1000bp的PCR產(chǎn)物。探針序列通常長40-55bp。在有些情況中，當(dāng)共有序列大于約1-1.5kbp時，合成另外的寡核苷酸。為了對幾個文庫篩選全長克隆，依照Ausubeletal,,CurrentProtocolsinMolecularBiology，通過PCR擴增用PCR引物對篩選來自文庫的DNA。然后使用探針寡核苷酸和引物對之一，將陽性文庫用于分離編碼目的基因的克隆。合成PCR引物(正向和反向)正向PCR引物1(42257.fl)5，-TATCCCTCCAATTGAGCACCCTGG-3'(SEQIDNO:10);正向PCR引物2(42257.G)5，畫GTCGGAAGACATCCCAACAAG-3，(SEQIDNO:11);反向PCR引物1(42257.rl)5，-CTTCACAATGTCGCTGTGCTGCTC-3，(SEQIDNO:12);反向PCR引物2(42257.r2)5，-AGCCAAATCCAGCAGCTGGCTTAC-3，(SEQIDNO:13)。另外，根據(jù)DNA42257共有序列構(gòu)建具有如下核苷酸序列的合成寡核苷酸雜交探針雜交探針(42257.pl)TGAT-3，(SEQIDNO:14)。為了對數(shù)個文庫篩選全長克隆的來源，用上文所述PCR引物對通過PCR擴增篩選來自文庫的DNA。然后使用探針寡核苷酸和PCR引物之一，將陽性文庫用于分離編碼CRIg基因的克隆。從人胎腦組織(LIB153)分離RNA用于構(gòu)建cDNA文庫。用于分離cDNA克隆的cDNA文庫是通過標(biāo)準(zhǔn)方法使用商品化試劑(諸如購自Invitrogen,SanDiego,CA)構(gòu)建的。將cDNA用含Notl位點的寡dT引發(fā)，與Sail半磷酸化(hemikinased)銜接頭以平端連接，用Notl切割，通過凝膠電泳恰當(dāng)分離，并以限定取向克隆到合適的克隆載體(諸如pRKB或pRKD;pRK5B是不含Sfil位點的pRK5D前體；參見Holmesetal.,Science253:1278-1280(1991))的唯一Xhol和Notl位點間。對如上所述分離的克隆進(jìn)行DNA測序，得到分離的CRIg多肽的DNA序列(本文中稱為UNQ317(DNA45416-1251)(SEQIDNO:l))。圖1(SEQIDNO:l)顯示了UNQ317(DNA45416-1251)的完整核苷酸序列?？寺NQ367(DNA45416-1251)(SEQIDNO:l)含單一可讀框，表觀翻譯起始位點位于核苷酸第1082-1084位(圖1,SEQIDNO:1)。預(yù)測多肽前體長321個氨基酸(圖1，SEQIDNO:2)。圖1所示CRIg蛋白質(zhì)具有估算分子量約35,544道爾頓，pi約8.51。對圖1(SEQIDNO:2)所示321個氨基酸的CRIg多肽的分析證明，在約第149位氨基酸至約第152位氨基酸處存在糖胺聚糖附著位點，約第276位氨基酸至約第306位氨基酸為跨膜結(jié)構(gòu)域。克隆UNQ317(DNA45416-125l)已經(jīng)保藏，ATCC保藏號為209620。與JAM家族成員類似，CRIg(PR0362)，最近稱為CRIg，是1型跨膜分子，免疫球蛋白超家族的成員。長型人CRIg(huCRIg(L))的胞外結(jié)構(gòu)域編碼V和C2型末端Ig結(jié)構(gòu)域二者(SmithandXue,J.Mol.Biol.274:530-545(1997))，而短型(huCRIg(S))只編碼單一V型Ig，類似于鼠CRIg(muCRIg)(圖42A)。人和鼠CRIg的C末端胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域都包含共有AP-2內(nèi)在化基序(分別為YARL和DSQALI，Bonafacino&Traub,AnnRevBiochem72:395(2003))。HuCRIg和muCRIg共享67%的整體序列同源性，IgV結(jié)構(gòu)域中存在83%的同源性。在JAM家族成員中，huCRIg與JAM-A最緊密相關(guān)。序列相似性限于形成Ig結(jié)構(gòu)域折疊的一段保守殘基(圖42A)。人和鼠CRIg都位于X染色體Xql2位置上，在該染色體上具有同線(syntenic)位置，側(cè)翼為膜鐵轉(zhuǎn)運輔助蛋白(hephaestin)和膜突蛋白。實施例2:蛋白質(zhì)的制備和純化將hu和muCRIg的胞外結(jié)構(gòu)域克隆到經(jīng)過修改的pRK5表達(dá)載體中，在CRIg序列下游編碼人或鼠IgGlFc區(qū)。鼠IgGl的Fc部分包含雙重突變(D265A,N297A)，防止Fc受體結(jié)合(Gongetal.，J.Immunol.174:817-826(2005)),用于控制Fc受體調(diào)節(jié)。使用人IREM-1和小鼠CLM-1Fc融合蛋白或者鼠抗gpl20IgG抗體作為對照。通過將CRIg的ECD與酵母亮氨酸拉鏈、Flag及C-末端(6)組氨酸融合，制得LFH標(biāo)記的CRIg。通過瞬時轉(zhuǎn)染4吏蛋白質(zhì)在CHO細(xì)胞中過表達(dá)。在全自動生物反應(yīng)器中培養(yǎng)細(xì)胞，使用以F-12/Dulbecco氏改良Eagle氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)添加了Ultra-LowIgG血清(Invitrogen)和PrimatoneHS(Sigma)的培養(yǎng)基。將培養(yǎng)維持7-12天直至收獲。Fc融合蛋白通過蛋白A親和層析然后SephacrylS-300凝膠過濾來純化丄FH融合蛋白在鎳柱上純化。人CRIg-ECD蛋白在吸附有單克隆抗體3C9的MilliporeGlyceryl-CPG(173700404)柱上親和純化。蛋白質(zhì)在pH3.0洗脫。hu和muCRIg-HIS如下制備將CRIgECD克隆到含C-末端(6)組氨酸的桿狀病毒表達(dá)載體中。將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染到Sf9細(xì)胞中，用上清液感染H5細(xì)胞，蛋白質(zhì)在鎳柱上純化。所有純化后蛋白質(zhì)的鑒定通過N-末端序列分析確認(rèn)，所有人或鼠CRIg制備物的脂多糖濃度<5Eu/mg。實施例3:抗體的制備多克隆抗體如下制備用完全氟氏佐劑中的200嗎huCRIg(L)-His免疫新西蘭兔，首次免疫后6周加強免疫。muCRIg和huCRIg的單克隆抗體如下制備通過爪墊注射用50jighis標(biāo)記的CRIg融合蛋白免疫Wistar大鼠和Balb/c小鼠。通過ELISA、FACS、Western印跡和免疫組織化學(xué)，根據(jù)與人和鼠CRIg-ECD的反應(yīng)性選擇克隆。除另有說明外，將獲得的抗體用于后續(xù)測試。實施例4:炎性細(xì)胞浸潤到豚鼠皮膚中下列實施例顯示，huCRIg(PR0362)是促炎性的，即它剌激炎性細(xì)胞(即噬中性細(xì)胞、噬曙紅細(xì)胞、單核細(xì)胞或淋巴細(xì)胞)浸潤到豚鼠皮膚中。本文所述測定法監(jiān)測此蛋白質(zhì)誘導(dǎo)炎性細(xì)胞浸潤到豚鼠皮膚中的能力。刺激炎性浸潤的化合物在增強炎性反應(yīng)有益的治療中是有用的。抑制淋巴細(xì)胞增殖的化合物在抑制炎性反應(yīng)有益的治療中是有用的。治療劑可采用例如針對CRIg的鼠-人嵌合抗體、人源化抗體或人抗體，模擬CRIg生物學(xué)活性的小分子、肽等，CRIg-Ig融合蛋白，CRIg胞夕卜區(qū)，等等的形式。將重350克或更重的無毛豚鼠(CharlesRiverLabs)通過肌肉內(nèi)注射氯胺酮(ketamine)(75-80mg/kg體重)和賽拉噪(xylazine)(5mg/kg體重)麻醉。將huCRIg和對照蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)樣品皮內(nèi)注射到每只動物的背部中，每個注射點100fil體積。每只動物約16-24個注射點。心臟內(nèi)注射1mL伊文思藍(lán)(Evansblue)染料(以1%溶于生理緩沖鹽水)。6小時后將動物安樂死，每一處皮膚注射點做活組織檢查，在福爾馬林中固定。皮膚經(jīng)處理供組織病理學(xué)評估。對個點評估炎性細(xì)胞浸潤到皮膚中的情況。有可見炎性細(xì)胞的點評為陽性。誘導(dǎo)炎性細(xì)胞浸潤的樣品評為促炎性物質(zhì)。CRIg在此測定法中測試為陽性，表明抗炎活性。實施例5:CRIg(PR0362)mRNA和多肽的表達(dá)A.原位雜交和免疫組化通過原位雜交、免疫組化和RT-PCR評估多種類型組織中CRIgmRNA的表達(dá)。就原位雜交而言，將組織固定(4%福爾馬林)，石蠟包埋，切片(3-5(im厚)，脫石蠟，用蛋白酶K(20嗎/ml)脫蛋白(15分鐘，37。C),并處理供原位雜交。通過PCR制備本發(fā)明多肽的探針。引物包含T7或T3RNA聚合酶起始位點，從而容許在體外從擴增產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄有義或反義探針。"P-UTP標(biāo)記的有義和反義探針雜交過夜(55。C)，洗滌(0.1XSSC，55。C,2小時)，浸入NBT2核通道乳劑(EastmanKodak,Rochester,NY)，曝光(4。(2,4-6周)，顯影，并用蘇木精和曙紅復(fù)染。通常出現(xiàn)代表性的成對的亮暗圖像。使用DAKO自動染色儀對5mm厚冰凍切片進(jìn)行免疫組化染色。用Kirkegaard和Perry封閉液(1:10,4分鐘，20。C)阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性。TBS/0.05%Tween-20(DAKO)中的10%NGS用于稀釋和封閉。MAb4F7,22.2抗CRIg(抗PR0362)或小鼠IgG以0.13mg/ml使用。生物素化山羊抗小鼠IgG(VectorLabs,Burlingame,CA)以1:20(H吏用，用VectorLabsStandardABCElite試劑盒(VectorLabs,Burlingame,CA)檢測。載玻片用Pierce金屬增強的二氨基聯(lián)苯胺(PierceChemicals,Rockford,IL)顯色。在冰凍切片上進(jìn)行CRIg(PR0362)和CD68表達(dá)的雙重免疫組化，以顯現(xiàn)CRIg表達(dá)對于巨噬細(xì)胞的定位。使用mAb4F7.22.2抗CRIg和購自DAKO的抗CD68mAbKP-1，分別通過藻紅蛋白和FITC標(biāo)志物4全測。在人和其它動物的很多種組織和細(xì)胞類型中檢驗了表達(dá)情況。a.正常組織檢驗的正常成人組織包括扁桃體、淋巴結(jié)、脾、腎、膀胱、肺、心、主動脈、冠狀動脈、肝、膽嚢、前列腺、胃、小腸、結(jié)腸、胰、曱狀腺、皮膚、腎上腺、胎盤、子宮、卵巢、睪丸、視網(wǎng)膜和腦(小腦、腦干、大腦皮層)。還檢驗了正常人胎組織，包括E12-E16周齡腦、脾、腸和曱狀腺。此外，還調(diào)查了鼠肝中的表達(dá)情況。b.發(fā)炎組織通過原位雜交檢驗的發(fā)炎組織包括患有慢性炎性疾病的組織，例如患有慢性哮喘、慢性支氣管肺炎、慢性支氣管炎/慢性慢性阻塞性肺病的肺，患有慢性淋巴細(xì)胞間質(zhì)性腎炎的腎，和患有因慢性丙型肝炎感染、自身免疫性肝炎或酒精性肝硬化引發(fā)的慢性炎癥和硬化的肝。c.原發(fā)瘤(PrimaryNeoplasms)通過原位雜交檢驗PR0362表達(dá)的原發(fā)人瘤包括乳癌、肺鱗狀細(xì)胞癌、肺腺癌、前列腺腺癌和結(jié)腸腺癌。2.結(jié)果發(fā)現(xiàn)CRIg(PR0362)在小鼠肝冰凍切片(圖6)、人肝冰凍切片(圖7)和多種組織巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞中表達(dá)，所述巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞包括結(jié)腸巨噬細(xì)胞(圖8A)、Kupffer細(xì)胞(圖8B)、腎上腺巨噬細(xì)胞(圖8C)、Hofbauer細(xì)胞(圖8D)、滑膜細(xì)胞(圖9)、胚泡(alveolar)巨噬細(xì)胞、腸固有層中的駐留巨噬細(xì)胞及多種組織中的間質(zhì)巨噬細(xì)胞。CRIg還在腦小膠質(zhì)中顯著表達(dá)(圖10)。在存在瘤或炎性疾病而激活時，這些組織中的CRIg表達(dá)顯著升高，所述炎性疾病包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(圖9)、炎性腸病、慢性肝炎(圖12)、肺炎、慢性哮喘(圖11)、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和支氣管炎。為了進(jìn)一步4企驗CRIg表達(dá)，對多種組織類型進(jìn)行免疫組化染色。對組織巨噬細(xì)胞，包括腎上腺巨噬細(xì)胞、肝Kupffer細(xì)胞、腦小膠質(zhì)細(xì)胞和胎盤Hofbauer細(xì)胞，進(jìn)行CRIg和CD68的雙重免疫組化染色，以測定CRIg和CD68是否在同一組織中表達(dá)。發(fā)現(xiàn)CRIg與CD6S在腎上腺巨噬細(xì)胞(圖1"、肝Kupffer細(xì)胞(圖l4)、腦小膠質(zhì)細(xì)胞(圖15)和胎盤Hofbauer細(xì)胞(圖16)中共表達(dá)。實施例6:CRIg(PR0362)牽涉慢性炎癥如實施例1和下文所述，克隆與A33抗原和JAM1具有同源性的新型巨噬細(xì)胞相關(guān)受體，并鑒定為單一跨膜Ig超家族成員巨噬細(xì)胞相關(guān)多肽(CRIg或PR0362)。CRIg表達(dá)為兩種剪接變體。一種變體為399個氨基酸的多肽，包含N-末端IgV樣結(jié)構(gòu)域和C-末端IgC2樣結(jié)構(gòu)域，稱為huCRIg或huCRIg-長(SEQIDNO:4)。長355個氨基酸、缺少C-末端結(jié)構(gòu)域的剪接形式稱為huCRIg-短(SEQIDNO:6)。兩種受體都具有單一跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，后者包含在體外在巨噬細(xì)胞中組成性磷酸化的酪氨酸殘基。本研究證明了CRIg在駐留組織的巨噬細(xì)胞子集中選擇性表達(dá)，而且與慢性炎癥有關(guān)。材津牛和方法細(xì)胞在知情同意后，從健康的成人志愿者靜脈穿刺取血，使用Ficoll-PaquePBMC,用冷PBS洗滌，用0.2%NaCl溶解30秒，用1.6%NaCl中和。細(xì)胞計數(shù)，保存在水上直至使用。為了分離外周血子集，按照制造商的說明書使用未開封的MACS試劑盒(MiltenyiBiotech,Auburn,CA)。通過將CD14+單核細(xì)胞在含10。/。(v/v)自體人血清、20%胎牛血清和10mMl-谷氨酰胺、青霉素和鏈霉素的HG-DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)可長達(dá)2周，誘導(dǎo)向巨噬細(xì)胞表型的分化。第5天更換培養(yǎng)基。為了流式細(xì)胞術(shù)分析，使用冰冷的細(xì)胞解離液(Sigma)使細(xì)胞從培養(yǎng)皿解離。通過向孔中直接添加0.5ml裂解緩沖液，制備用于Western印跡分析的裂解物。將裂解物與含有SDS和P-巰基乙醇的樣品緩沖液混合，在Tris-甘氨酸凝膠上電泳，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。通過錐蟲藍(lán)排除試驗，評估細(xì)胞存活力。流式細(xì)力包術(shù)用于流式細(xì)胞術(shù)分析的細(xì)胞用含2%胎牛血清和5嗎/ml人IgG(Calbiochem,SanDiego,CA)的PBS于4。C封閉30分鐘。接著，將細(xì)胞與抗CRIg(抗PR0362)單克隆抗體3C9—起溫育。用PBS洗滌后，將細(xì)胞用偶聯(lián)有藻紅蛋白(PE)的CDllb、CD14、CD163、CD15、CD68抗體(Pharmingen)染色。細(xì)胞-細(xì)胞粘附研究使含全長CRIg的pRK表達(dá)載體在人JurkatT細(xì)胞系中穩(wěn)定表達(dá)，如其它地方所述使用新霉素選擇和自動克隆(autoclone)分選。給細(xì)胞預(yù)加載熒光染料BCECF(MolecularProbes,Oregon),加到包凈皮有經(jīng)過或未經(jīng)10ng/mlTNFa處理的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)單層的96孔Maxisorb板(CORNINGtm)中。如下溫和洗滌細(xì)胞向孔中加入溫育緩沖液(含10mMCaCl、10mM鎂和1.5mMNaCl的HBSS)，接著將平板倒扣在一張吸水紙上。洗滌3次后，在突光分光儀中進(jìn)行萸光計數(shù)。熒光讀數(shù)代表仍然粘附于HUVEC細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)。Northern印跡分析使用Ambion試劑盒按照制造商的建議用隨機引發(fā)全長CRIgcDNA的32P標(biāo)記探針探查多個組織Northern印跡。將印跡于22°C對磷成像屏曝光4小時。切出印跡，用人或小鼠P-肌動蛋白的商品化探針(Clontech)再次探查，以評估每一道中的RNA負(fù)荷和數(shù)量，并用Storm磷成像儀(MolecularDynamics,Sunnyvale,CA)分析。實時RtPCR分析對于定量PCR分析(TAQMANtm),推薦來自人組織或原代細(xì)胞的總mRNA(100ng)(PerkinElmerLifeSciences)及基于CRIg編碼序列的引物。Fc和His融合蛋白的制備將人CRIg克隆到桿狀病毒表達(dá)載體pHIF(Pharmingen)中。HIS標(biāo)記的CRIg融合蛋白由CRIg胞外結(jié)構(gòu)域和8個組氨酸融合而成。使用鎳親和樹月旨，從懸浮培養(yǎng)的桿狀病毒感染昆蟲細(xì)胞的上清液純化His標(biāo)記的融合蛋白。單克隆和多克隆抗體的制備就本試驗而言，通過爪墊注射用10嗎CRIg-His8對雌性BALBc進(jìn)行免疫和加強免疫，如先前Ghilardietal.,J.Biol.Chem.277:16831-16836(2002)所述。通過ELISA篩選針對CRIg-His的單個克隆。針對JAM家族成員和人IgGFc測試選擇的克隆。將克隆滴定至單細(xì)胞密度，再次篩選。發(fā)現(xiàn)克隆3C9(IgGl)對CRIg有選擇反應(yīng)性。將克隆用于生成腹水并在蛋白G(AmershamPharmaciaBiotech)上纟屯4匕；4吏用PierceBCAi式劑(Pierce,Rockford,IL)測定蛋白質(zhì)濃度。通過給新西蘭兔注射150嗎CRIg-His，制備多克隆抗體。通過ELISA測定血清滴度。在循環(huán)IgG水平峰值時收集血清，在蛋白A柱上純化。原位雜交設(shè)計PCR引物(在上5'畫TCTCTGTCTCCAAGCCCACAG(SEQIDNO:18)和在下5，-CTTTGAGGAGTCTTTGACC(SEQIDNO:19》以擴增700bp的huJAM4片段。引物包含T7或T3脂A聚合酶起始位點，從而分別容許有義或反義探針在體外從擴增產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄。正常成人組織包括扁桃體、淋巴結(jié)、脾、腎、肺和心?；加新匝仔约膊〉慕M織包括患有慢性哮喘、慢性支氣管炎的肺，患有因慢性丙型肝炎感染引發(fā)的慢性炎癥和硬化的肝。將組織在4%福爾馬林中固定，石蠟包埋，切片(3-5iam厚)，脫石蠟，用20嗎/ml蛋白酶K脫蛋白(15分鐘，37°C),并如其它地方所述處理供原位雜交。免疫組化人肝獲自ArdaisCorporation,Lexington,MA。免疫組化染色j吏用DAKO自動染色4義對5-6(im厚的;水凍肝切片進(jìn)4亍。用Kirkegaard和Perry封閉液(1:10，4分鐘，20。C)阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性。TBS/0.05%Tween-20中的10Q/。正常山羊血清(NGS)用于稀釋和封閉。Mab3C9以1|_ig/ml使用。載玻片用Pierce金屬增強的二氨基聯(lián)苯胺(PierceChemicals)顯影。對于切片的免疫焚光染色，將切片用PBS/10%NGS封閉，與mAb3C9一起于20。C溫育1小時。使用偶聯(lián)至FITS的兔抗小鼠FITC標(biāo)記二抗作為檢測劑。對于雙重染色流程，隨后將切片用PE偶聯(lián)的人CD68的單克隆抗體染色。結(jié)果如實施例1所述，使用識別人JAM1保守Ig結(jié)構(gòu)域的筒并引物，從人胎cDNA文庫克隆得到huCRIg。對幾個克隆的測序揭示了321個氨基酸的可讀框(圖1,SEQIDNO:2)。Blast一全索證實與1型跨膜蛋白Z39Ig具有相似性(Langnaeseetal.,BiochimBiophysActa1492:522-525(2000))。后來發(fā)現(xiàn)這種321個氨基酸的蛋白質(zhì)丟失了一些C-末端氨基酸殘基。經(jīng)測定全長huSIgMA蛋白具有399個氨基酸殘基，如圖2所示(SEQIDNO:4)。CRIg的胞外區(qū)由2個Ig樣結(jié)構(gòu)域組成，包括一個N-末端V組結(jié)構(gòu)域和一個C-末端C2組結(jié)構(gòu)域。使用3，和5，引物克隆得到CRIg缺少近膜IgC結(jié)構(gòu)域的剪才妻變體，CRIg-短(305個氨基酸，圖3,SEQIDNO:6)。鼠CRIg的克隆及與人CRIg的序列比較使用huCRIg的完整可讀框和tblastn算法，檢索鼠表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)數(shù)據(jù)庫。對3個克隆的DNA測序產(chǎn)生相同的280個氨基酸的完整可讀框。使用3個引發(fā)區(qū)的引物從小鼠脾文庫克隆全長轉(zhuǎn)錄本。鼠的克隆類似于huCRIg的剪接形式，即缺少C-末端Ig樣結(jié)構(gòu)域。胞外IgV結(jié)構(gòu)域在人和鼠受體之間非常保守，具有93%同一性。鼠的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域保守性較差，比其人對應(yīng)物短20個氨基酸，同一性為40%。編碼鼠CRIg(muCRIg)的核酸及推測氨基酸序列在圖4中分別如SEQIDNOS:7和8所示。CRIg在多種組織中的駐留巨噬細(xì)胞子集上表達(dá)且其表達(dá)在炎癥中升高h(yuǎn)uCRIg的Northern印跡分析顯示1.5和1.8kb的兩種轉(zhuǎn)錄本(圖17)，在腎上腺、肺、心和胎盤中表達(dá)最高，在其它器官諸如脊髓、曱狀腺、乳腺和淋巴結(jié)中表達(dá)較低。在所有組織中，1.8kb轉(zhuǎn)錄本是最豐富表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本，可能編碼長型CRIg。在小鼠肝和心中檢測到約1.4kb的單一轉(zhuǎn)錄本。TAQMANTM實時PCR分析為了鑒定表達(dá)CRIg的特定細(xì)胞系，使用實時定量PCR和對N-末端Ig結(jié)構(gòu)域特異的引物々笨針。在經(jīng)PMA處理的骨髓細(xì)胞系HL-60和單核細(xì)胞細(xì)胞系THP-1中發(fā)現(xiàn)了低但可檢測的mRNA表達(dá)。B和T細(xì)胞系中未見表達(dá)(圖18A)。分化后單核細(xì)胞上的CRIg表達(dá)。為了確定CRIg在分化中單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞中表達(dá)時的詳細(xì)情況，我們測定了在存在人自體血清時經(jīng)誘導(dǎo)而分化的非吸附單核細(xì)胞和粘附單核細(xì)胞中的CRIgmRNA水平。CRIgmRNA水平隨時間逐漸升高，在鋪板后第7天達(dá)到最高水平(圖18B)。在此分化階段，mRNA水平比未分化單核細(xì)胞中的mRNA水平高100倍。單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞裂解物的Western印跡分析顯示，CRIg蛋白質(zhì)表達(dá)與CRIgmRNA表達(dá)的升高平行升高(圖18C)，表明在單核細(xì)胞分化而形成巨噬細(xì)胞時CRIg表達(dá)。印跡上出現(xiàn)48kDa條帶和40kDa條帶，可能代表長型和短型人CRIg。CRIg的分子表征CRIg在還原和非還原條件下的遷移類似，表明其以單體形式表達(dá)(圖19A)。在用PNGaseF對CRIg去糖基化時，遷移模式只有輕微改變，表明N-糖基化不顯著。在用過釩酸鹽處理過表達(dá)CRIg的細(xì)胞時，CRIg磷酸化(圖19B)。磷酸化CRIg的遷移表現(xiàn)為略高M(jìn)w的蛋白質(zhì)(55kDa)。在人HEK293細(xì)胞中，酪氨酸磷酸化的CRIg胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域不募集Syk激酶(結(jié)果未顯示)。外周血單核細(xì)胞上CRIg表達(dá)的流式細(xì)胞術(shù)分析為了測定CRIg在循環(huán)白細(xì)胞中的表達(dá)模式，使用單克隆抗人CRIg抗體3C9，對從健康供體的血液分離的淋巴細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。通過用八聚His標(biāo)記的人CRIg胞外結(jié)構(gòu)域免疫Balb/C小鼠，制備抗體。所述抗體是非阻斷性抗體，直接與ALEXAA488偶聯(lián)，可用于檢測丙酮固定的冰凍切片中的天然蛋白質(zhì)。用幾種免疫細(xì)胞表面抗原的PE偶聯(lián)抗體進(jìn)行復(fù)染。所有白細(xì)胞表面上均未發(fā)現(xiàn)CRIg,包括B-，T-，NK細(xì)胞、單核細(xì)胞和粒細(xì)胞(圖20)。然而，在巨噬細(xì)胞分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)了7天的單核細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)CRIg表達(dá)。單核細(xì)胞中CRIg表達(dá)的調(diào)控為了研究CRIg表達(dá)的調(diào)控，將巨噬細(xì)胞在存在各種促炎和抗炎細(xì)胞因子時培養(yǎng)7天，通過實時PCR或流式分析測定CRIg表達(dá)水平。巨噬細(xì)胞用IL-10和TGF-(3處理2天后，CRIgmRNA的表達(dá)升高，而IL-4、IL13和LPS使表達(dá)下調(diào)(圖21A)。與對照未處理巨噬細(xì)胞相比，地塞米松處理將表達(dá)提高5倍。為了測定細(xì)胞表面表達(dá)的CRIg的調(diào)控，對經(jīng)各種細(xì)胞因子和地塞米松處理5天的外周血單核細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)。使用偶寫關(guān)有ALEXAA488的單克隆抗體克隆3C9檢測CRIg。細(xì)胞用抗CD-14抗體共染色。在單核細(xì)胞用IL-10和LPS處理5天后，發(fā)現(xiàn)CRIg的表面表達(dá)升高(圖21B)。用地塞米松處理后，發(fā)現(xiàn)表面CRIg表達(dá)顯著升高。CRIg的亞細(xì)胞分布為了研究CRIg的亞細(xì)胞分布，將單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞(MDM)培養(yǎng)15天，然后固定，用單克隆抗體(克隆3C9)或多克隆兔抗體4F7，接著用FITC偶聯(lián)二抗和PE標(biāo)記抗CD63抗體染色。共焦顯微術(shù)顯示CRIg在核周細(xì)胞質(zhì)中高表達(dá)，與溶酶體膜蛋白CD63的表達(dá)交疊(圖22)。CRIg還在巨噬細(xì)胞的前及后緣表達(dá)，在此它的染色模式與CD63的不交疊。正常及疾病組織中的CRIg表達(dá)研究駐留組織的巨噬細(xì)胞中的CRIg表達(dá)及其表達(dá)在患有慢性炎性疾病的組織中的變化。使用原位雜交，對一組低聚曱醛固定的人組織測定CRIgmRNA表達(dá)。在從肺炎或慢性譯喘患者的肺尸檢獲得的肺泡巨噬細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了高表達(dá)水平(圖23，A，B,C和D)。在慢性肝炎患者的肝Kupffer細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了高mRNA表達(dá)(圖23,E和F)。在先前的研究(Walker,BiochimicaetBiophysicaActa1574:387-390(2002))和電子文庫篩選中，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的滑膜中發(fā)現(xiàn)了CRIgmRNA的高表達(dá)。因此，研究從類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎和變性(degenerative)骨病患者獲得的滑膜中CRIg的表達(dá)模式。在從骨關(guān)節(jié)炎患者獲得的滑膜細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了CRIgmRNA的高表達(dá)(圖24,B)。淺層中的滑膜細(xì)胞具有最高的CRIg表達(dá)(圖24，D)。此外，使用多克隆抗體6F1研究從類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者獲得的人滑膜的冰凍切片中的CRIg表達(dá)。CRIg在滑膜中的一部分(20-40%)滑膜細(xì)胞和組織巨吞噬細(xì)胞中表達(dá)(圖25,A,B,C)。這些細(xì)胞最有可能是A型巨噬細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞。對照滑膜中未見染色(圖25,D)。■還在許多不同組織中的巨噬細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)CRIg蛋白質(zhì)的表達(dá)。從穩(wěn)定表達(dá)CRIg的CHO細(xì)胞制備的水凍切片顯示CRIg的膜定位(圖26A)。在肺泡巨噬細(xì)胞(圖26，B)、小腸固有層中的組織細(xì)胞(圖26,C)、胎盤中的Hofbauer細(xì)胞(圖26,D)、腎上腺中的巨噬細(xì)胞(圖26,E)和肝中的Kupffer細(xì)胞(圖26，F(xiàn))中發(fā)現(xiàn)CRIg蛋白質(zhì)。動脈粥樣硬化斑含有大量緊緊粘附于主動脈腔壁上的巨噬細(xì)胞或巨噬細(xì)胞-泡沫細(xì)胞?？紤]到CRIg在巨噬細(xì)胞-內(nèi)皮粘附中的作用，研究動月永粥樣硬化斑中的CRIg表達(dá)。將斑的交替切片用抗CD63(圖27，A和B)或抗CRIg(圖27，C和D)染色。在排列血管壁的泡沫細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了抗CD63和CRIg的交疊染色模式，表明CRIg在動脈粥樣硬化中起作用。為了測定CRIg是否在巨噬細(xì)胞上選擇性表達(dá)，對心間質(zhì)巨噬細(xì)胞進(jìn)行雙重染色免疫熒光(圖28)。如覆蓋圖所示(圖28,第三張小圖)，CRIg陽性的間質(zhì)巨噬細(xì)胞大多數(shù)也是CD68陽性的。并非所有CD68陽性巨噬細(xì)胞都是CRIg陽性的，表明后者對于駐留組織的巨噬細(xì)胞的亞型是特異的。為了定量測定炎性腸病(IBD)綜合征中的mRNA表達(dá)水平，從獲自潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩氏(Crohn)病患者或者獲自無IBD表現(xiàn)的患者的結(jié)腸組織提取mRNA。使用對CRIg特異的引物進(jìn)行實時PCR，測量相對表達(dá)水平。與對照組織相比，潰瘍性結(jié)腸炎患者中的表達(dá)水平高出16倍，克羅恩氏病患者中高5倍(圖29,A)。類似地，測定肺組織中的相對RNA等價物，發(fā)現(xiàn)慢性阻塞性肺病患者的組織中最高(COPD:比正常高14倍)，哮喘患者中與正常沒有顯著差異(圖29,B)。眾所周知，Ig超家族分子介導(dǎo)細(xì)胞表面識別和細(xì)胞-細(xì)胞粘附。由于CRIg表達(dá)在排列于血管的間質(zhì)巨噬細(xì)胞中較高，所以研究CRlg在巨噬細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞粘附中的參與情況。將用全長CRIg-長(圖30A)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Jurkat細(xì)胞系加載熒光染料BCECF，把細(xì)胞加到已經(jīng)培養(yǎng)有HUVEC細(xì)胞單層的96孔maxisorb板的孔中。通過3次溫和洗滌后剩余熒光量測量粘附。與經(jīng)對照質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Jurkat細(xì)胞相比，表達(dá)CRIg的Jurkat細(xì)胞更多粘附對照及TNFa刺激的內(nèi)皮二者(圖30B)。討論本研究首次描述了新型Ig超家族成員CRIg/Z39Ig的組織分布、表達(dá)調(diào)控及分子表征，證實了其在駐留組織的巨噬細(xì)胞中的選擇性表達(dá)。在具有完全分化表型的駐留巨噬細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)了CRIg表達(dá)。其表達(dá)在慢性炎癥樣、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及炎性腸病的組織中升高。CRIg表達(dá)在這些通常特征在于Th2型疾病的疾病中的升高可能符合在體外Th2細(xì)胞因子對其表達(dá)的調(diào)控。這種表達(dá)升高是否是由于CRIg陽性巨噬細(xì)胞存在增加或者炎性巨噬細(xì)胞上的表達(dá)升高，還有待確定。CRIg可介導(dǎo)人巨噬細(xì)胞的效應(yīng)物功能之一，包括細(xì)菌識別、吞噬作用、抗原呈遞及細(xì)胞因子釋放。這些結(jié)果表明了CRIg在巨噬細(xì)胞對血管內(nèi)皮細(xì)胞壁粘附及可能的遷移中的作用。CRIg表達(dá)在非微生物炎性疾病像潰瘍性結(jié)腸炎和慢性阻塞性肺病(COPD)中升高，但在用LPS或其它細(xì)菌細(xì)胞壁成分像脂磷壁酸和細(xì)菌脂蛋白處理時在分離的巨噬細(xì)胞中下調(diào)。用LPS長時間處理，2天以上，引起CRIg的表達(dá)升高。這可能由于經(jīng)LPS刺激的巨噬細(xì)胞分泌的IL-10自分泌作用。在用地塞米松處理單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞時，發(fā)現(xiàn)CRIg的mRNA及蛋白質(zhì)兩種水平均顯著上調(diào)。發(fā)現(xiàn)在用地塞米松處理時，很少的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞表面受體表達(dá)升高。一個例子是CD163,但其受地塞米松的誘導(dǎo)才及不顯著。對抗炎細(xì)胞因子IL10和TGF(3引起的CRIg上調(diào)相當(dāng)感興趣，表明CRIg可能介導(dǎo)糖皮質(zhì)類固醇的抗炎作用。如本文所述，CRIg在一部分CD68陽性巨噬細(xì)胞上表達(dá)，它們可能是活化的巨噬細(xì)胞。使用CRIg和CRIg-Fc融合蛋白的阻斷性和激活性抗體，其在巨噬細(xì)胞效應(yīng)物功能、粘附和遷移中的作用及其在慢性炎性疾病中的作用已經(jīng)進(jìn)行了調(diào)查，描述見實施例7。只有很少的細(xì)胞表面標(biāo)志物在分化的巨噬細(xì)胞，諸如CD68和CD163上特異性表達(dá)。盡管CD68在所有人巨噬細(xì)胞群上明顯表達(dá)，然而在其它骨髓樣細(xì)胞上還有某些非骨髓樣細(xì)胞上也檢測到該抗原。因此，CRIg是在一部分間質(zhì)成熟巨噬細(xì)胞上選擇性表達(dá)的第一種細(xì)胞表面抗原。實施例7:DBA-1J小鼠中膠原誘發(fā)的關(guān)節(jié)炎(CIA)中的CRIg融合蛋白本試驗的目的是在疾病形成和CIA(膠原誘發(fā)的關(guān)節(jié)炎，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的一種實驗動物模型系統(tǒng))發(fā)展中比較CRIg融合蛋白與對照鼠IgGl。如實施例4中所討論的，CRIg在一部分巨噬細(xì)胞中特異性高表達(dá)，并且在慢性炎癥組織中升高。鼠CRIg在膠原誘發(fā)的關(guān)節(jié)炎小鼠的發(fā)炎關(guān)節(jié)中的巨噬細(xì)胞和滑膜細(xì)胞中高表達(dá)。體外研究顯示CRIg牽涉巨噬細(xì)胞對內(nèi)皮的粘附。CRIg-Fc融合蛋白或是通過影響組織巨噬細(xì)胞的特性或是通過影響其它細(xì)胞(例如T細(xì)胞、B細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞)的免疫應(yīng)答，影響自身免疫病的病程，在此案中是小鼠中膠原誘發(fā)的關(guān)節(jié)炎。這可導(dǎo)致關(guān)節(jié)中炎癥、腫脹和長期骨質(zhì)侵蝕的緩和。muCRIg-Fc融合蛋白如下制得將鼠IgGl的4交鏈、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域與鼠CRIg的胞外結(jié)構(gòu)域(第1-200位氨基酸)融合。將含有防止Fc受體結(jié)合的雙重突變的融合物用于控制Fc受體調(diào)控。muCRIg-Fc融合蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO:17所示。(相似huCRIg-Ig和huCRIg-短-Ig的編碼序列分別如SEQIDNO:15和16所示。)通過用質(zhì)粒DNA瞬時轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞生成蛋白質(zhì)。如下純化融合蛋白將細(xì)胞上清液運行蛋白A柱，接著是離子交換層析以消除聚集體。如下評估血清半衰期給C57B6小鼠注射一劑4mg/kgCRIg-Fc，然后以指定時間間隔從小鼠采集血清。通過夾心式ELISA測定鼠CRIg-Fc的血清水平，其中使用識別CRIg胞外結(jié)構(gòu)域上不同表位的抗CRIgmAb。動物模型物種小鼠種系DBA-1J供應(yīng)商JACKSON年齡范圍7-8周齡選擇小鼠作為物種來研究膠原誘發(fā)的關(guān)節(jié)炎(CIA)，因為CIA是與人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)具有相似臨床和病理學(xué)特征的炎性多關(guān)節(jié)炎。這種動物模型已經(jīng)被多家實驗室使用，CIA的組織病理學(xué)類似于具有滑膜增生且其發(fā)展成血管翳形成、軟骨變性/破壞和邊緣骨質(zhì)侵蝕及隨后關(guān)節(jié)變形的RA中所看到的。另外，小鼠在系統(tǒng)發(fā)生學(xué)上是最低等的哺乳動物。此外，還沒有體外模型能夠模擬RA復(fù)雜的多因素發(fā)病機理。試驗設(shè)計試驗組1)在200(il鹽水中皮下(SC)注射6mg/kgmlgGl同種型，3次/周，共7周(n二8)。2)在100^1鹽水中皮下(SC)注射4mg/kgmuCRIg，3次/周，共7周(n二8)。將小鼠用在CFS(Difco)中乳化的牛CII(100fig,Sigma,StLouis)皮內(nèi)免疫。21天后，將小鼠用在IFA(Difco)中乳化的CII再次挑戰(zhàn)。從第24天開始，一組小鼠(n二7)給予100嗎muCRIg(PR0362)Fc，每周3次，共6周，第二組(11=8)接受IOO嗎鼠IgGl作為對照。每天檢查小鼠關(guān)節(jié)炎癥的征候，并如下評分0,正常；1,紅斑和輕^1腫脹，限于踝關(guān)節(jié)；2，紅斑和輕^T吏腫脹，從踝擴散至跖和掌關(guān)節(jié)；3，紅斑和中度肺脹，從踝擴散至跖或掌關(guān)節(jié)；4,紅斑和重度肺脹，從踝擴散至爪趾。每只爪的最大關(guān)節(jié)炎得分為4，每只小鼠的最大得分為16(圖31)。第0天，將所有小鼠用在,1弗氏完全佐劑(CFA)中乳化的IOO嗎牛II型膠原免疫。將CFA中的II型膠原皮內(nèi)注射于尾根部右側(cè)。第21天時，在尾部左側(cè)皮內(nèi)給予第二次免疫，即ioo(ii弗氏不完全佐劑中的ioo嗎牛n型膠原。調(diào)查人員每天4全查動物(M-F)。使用Nestlet作為富集裝置(enrichmentdevice),為動物提供額外的填料。如有必要，在籠子底部放置弄濕的食物。咨詢獸醫(yī)人員后將虛弱的動物處死。在研究結(jié)束時采集末端faxitronX射線和microCT,評估關(guān)節(jié)損傷/侵蝕情況。此外，處理前和終止時對動物稱重。第35天和研究終止時，對第1-8組小鼠采血，供測定血清pK和抗II型膠原抗體滴度(100|Lll眼窩采血)。第70天時，所有小鼠最終在3。/。異氟烷下心內(nèi)采血，供終末血像(terminalhemogram)、白細(xì)胞分類計數(shù)和血清pK(G3)評估。在誘發(fā)關(guān)節(jié)炎后第70天，將小鼠安樂死。收集所有四肢，供放射成像、5CT和組織病理學(xué)。結(jié)果將CRIg融合蛋白muCRIg-Fc系統(tǒng)注射到膠原誘發(fā)關(guān)節(jié)炎小鼠(類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎動物模型)中顯示，與接受IgGl的對照組小鼠(圓圈)相比，接受CRIg融合蛋白的實驗組小鼠(方框)的CIA發(fā)展顯著減緩(見圖31:p值二0.0004)。通過注射在弗氏完全佐劑中乳化的牛II型膠原，誘發(fā)了膠原誘發(fā)的關(guān)節(jié)炎。首次免疫后21天給予加強免疫。將動物每周3次用鼠CRIg-Fc融合蛋白或用抗gpl20IgGl處理。劑量為4mg/kg，在100jilPBS中，皮下注射。處理從第21天開始，持續(xù)至第70天。每天對小鼠觀察后爪的腫脹情況，作為關(guān)節(jié)炎的征候。關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度分為如下1-16個等級0=未出現(xiàn)紅斑和肺脹，b紅斑和輕微肺脹限于中爪(mid-foot)(跗骨)或踝，2=紅斑和輕微腫脹，從踝擴散至中爪，3=紅斑和中度腫脹，從踝擴散至跖關(guān)節(jié)，4=紅斑和重度腫脹，涵蓋踝、爪和趾。重復(fù)試驗調(diào)整上述方案，重復(fù)并驗證膠原誘發(fā)的關(guān)節(jié)炎(CIA)模型中先前試驗的結(jié)果。調(diào)整后的方案包括根據(jù)體內(nèi)microCT成像的結(jié)果，調(diào)查放射性照射對疾病形成和發(fā)展的潛在作用。將70只DBA-1J小鼠(7-8周齡，JacksonLaboratories)分為5個處理組，兩組(G1和G3)每組各15只小鼠，兩組(G4和G5)每組各10只小鼠，一組(G2)20只小鼠。處理組Gl:在lOO)il鹽水中皮下注射4mg/kgMuIgGl同種型，3次/周，共7周(11=15)。G2:在100(il鹽水中皮下注射4mg/kgMuCRIg-IgGl，3次/周，共7周(n=20)。G3:在100^1鹽水中皮下注射4mg/kgMuTNFRII-IgGl同種型，3次/周，共7周(n:15)。G4:在100fil鹽水中皮下注射4mg/kgMuIgGl同種型，3次/周，共7周，用體內(nèi)microCT麻醉(n二10)。G5:在100^1鹽水中皮下注射1.0mg/kgMuTNFRII-IgGl,3次/周，共7周，用體內(nèi)microCT麻醉(n二10)。TNF是由單核吞噬細(xì)胞、Ag刺激的T細(xì)胞、NK細(xì)胞和肥大細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子。它牽涉正常的炎性和免疫應(yīng)答。TNF-a在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)的發(fā)病機理中發(fā)揮重要作用。發(fā)現(xiàn)RA患者滑液中TNF水平升高。在此方案中，使用mTNFRII-Fc作為陽性對照，阻斷TNF與其細(xì)胞表面受體之間的相互作用。第0天，將從G1到G5的所有小鼠用在100|il弗氏完全佐劑(CFA)中乳化的IOO嗎牛II型膠原免疫。將CFA中的II型膠原皮內(nèi)注射于尾根部右側(cè)。第21天時，在尾部左側(cè)皮內(nèi)給予第二次免疫，即氟氏不完全佐劑中的lOOjug牛II型膠原。每天檢查動物。每周將G4-5組的小鼠用異氟烷麻醉，進(jìn)行體內(nèi)microCt。在研究結(jié)束時采集末端faxitronX射線和microCT，評估關(guān)節(jié)損傷/侵蝕情況。第35天和研究終止時，對Gl-5組小鼠采血，供血清pK和抗II型膠原抗體滴度(100(^1眼窩采血)。第70天時，所有小鼠最終在3%異氟烷下心內(nèi)采血，供終末血像(terminalhemogram)、白纟田胞分類計數(shù)和血清pK(G3)。在誘發(fā)關(guān)節(jié)炎后第70天時，將小鼠安樂死。收集所有四肢，供放射成像、microCT和組織病理學(xué)。圖33顯示CRIg-Fc處理小鼠中關(guān)節(jié)腫脹顯著減輕。第70天時對從muCRIg處理動物獲得的福爾馬林固定、石蠟包埋組織(H&E染色)進(jìn)行的免疫組化顯示，關(guān)節(jié)炎癥因處理得到抑制。圖34顯示了用II型膠原免疫后70天的DBA1/J小鼠的跖關(guān)節(jié)H&E染色切片。A.在腱鞘周圍區(qū)域和關(guān)節(jié)腔周圍區(qū)域發(fā)現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤物；B.A的詳圖；C.CRIg-Fc處理小鼠的關(guān)節(jié)中的低度炎性浸潤物。在腱鞘和關(guān)節(jié)腔周圍區(qū)域發(fā)現(xiàn)很少的炎性細(xì)胞；D.B的詳圖。圖35顯示在muCRIg-Fc處理小鼠的關(guān)節(jié)中皮質(zhì)骨體積得到保持。注射膠原后70天處死對照IgG處理組和CRIg-Fc處理組小鼠，通過(iCT掃描關(guān)節(jié)。與mulgGI處理動物相比，代表CRIg-Fc組和對照IgG組的小鼠關(guān)節(jié)中的骨質(zhì)侵蝕和骨密度損失情況顯示于左圖。muCRIg-Fc處理動物中皮質(zhì)骨體積的保持顯著更大。該圖像是使用Analyze圖像分析軟件從^CT數(shù)據(jù)制作而成的三維表面透視圖。圖36顯示了CRIg-Fc既不改變駐留組織的巨噬細(xì)胞的數(shù)目也不改變其形態(tài)。將來自抗gpl加IgGl(左圖)或CRIg-Fc(右圖)處理小鼠的肝和肺解剖，在福爾馬林中固定，然后在石蠟中包埋。將7微米切片用F4/80的抗體染色。對切片的仔細(xì)檢查顯示，兩個試驗組中有相等數(shù)目的F4/80陽性巨噬細(xì)胞。此外，巨噬細(xì)胞的形態(tài)沒有觀察到任何差別。圖37顯示了muCRIg-Fc處理不影響血清抗膠原抗體滴度。免疫后70天測定抗膠原抗體的血清滴度。在用CRIg-Fc處理的動物與用抗gpl20處理的動物間在IgGl、IgG2a和IgM抗體亞型的血清滴度中沒有發(fā)現(xiàn)任何差另'J。這意味著CRIg-Fc不影響用II型膠原免疫的小鼠中的抗體應(yīng)答。圖38顯示了muCRIg-Fc降低循環(huán)炎性巨噬細(xì)胞的數(shù)目。免疫后70天從用CRIg-Fc和抗gpl20處理的動物采集外周血，使用炎性和非炎性單核細(xì)胞的標(biāo)志物通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。與抗gpl20處理組相比，用CRIg-Fc處理的動物顯示出炎性單核細(xì)胞數(shù)目顯著增加，非炎性單核細(xì)胞數(shù)目減少?？傊緦嵤├兴鰧嶒灥慕Y(jié)果證明，muCRIg-Fc融合蛋白抑制膠原誘發(fā)的關(guān)節(jié)炎。具體而言，該結(jié)果顯示CRIg-Fc抑制關(guān)節(jié)腫脹，抑制炎癥，保持皮質(zhì)關(guān)節(jié)骨體積，及減少循環(huán)炎性巨噬細(xì)胞數(shù)目。其它實驗已經(jīng)顯示出CRIg-Fc不影響體內(nèi)B細(xì)胞或T細(xì)胞應(yīng)答。實施例8:小鼠中抗體介導(dǎo)的CIA中的CRIg融合蛋白II型膠原)，取而代之的是注射識別II型膠原的抗體。由此，繞過適應(yīng)性B和T細(xì)胞應(yīng)答而經(jīng)由Fc受體和補體介導(dǎo)的活化直接誘導(dǎo)對巨噬細(xì)胞和嗜中性細(xì)胞上的效應(yīng)物功能?？梢酝ㄟ^靜脈內(nèi)注射由Arthrogen-CIA⑧小鼠B雜交瘤細(xì)胞系生成的四種不同單克隆抗體的組合來誘導(dǎo)抗體介導(dǎo)的CIA(Teratoetal.,J.Immunol.148:2103-8(1992))。所述單克隆抗體中的3種識別在84個氨基酸殘基的片段，CBll的LyC2(n型膠原的最小致關(guān)節(jié)炎片段)內(nèi)簇集的自身抗原性表位，第四種單克隆抗體與LyCl起反應(yīng)。所有四種抗體都識別各種II型膠原種類共有的保守表位，并與同源和異源II型膠原發(fā)生交叉反應(yīng)(Teratoetal.,supra;Teratoetal.,Autoimmunity22:137-47(1995))。Arthrogen-CIA⑧誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎的單克隆抗體混合物可通過商業(yè)途徑獲得(ChemiconInternational,Inc.,Temecula,CA,catalogNo.90035)。方案將10只4-5周齡的BALB-c小鼠(CR/Hollister)分成兩組，每組5只小鼠。從注射抗體混合物的前一天(第-1天)開始，將動物每天用IOO嗎muCRIg-Fc或100嗎對照-Fc(抗gpl20IgGl)處理，持續(xù)至第14天。在第14天。每天至少兩次4企查動物，保存觀察的書面記錄。通過目測^見察對疾病程度評分。目測評分系統(tǒng)0=未出現(xiàn)紅斑和腫脹1=紅斑和輕微肺脹，限于中爪2=紅斑和輕微腫脹，從踝擴散至中爪3=紅斑和中度腫脹，從踝擴散至跖關(guān)節(jié)4=紅斑和重度腫脹，涵蓋踝、爪和爪趾使用Nestlet作為富集裝置(enrichmentdevice),為動物提供額外的填料。在第14天時處死所有動物，采集關(guān)節(jié)供免疫組化染色或蘇木精-曙紅染色。采集血樣供血液學(xué)分析。結(jié)果圖39顯示了抗體誘發(fā)關(guān)節(jié)炎(AIA)后關(guān)節(jié)中的巨噬細(xì)胞浸潤，在未脫鈣的冰凍關(guān)節(jié)中用F4/80染色制得。給雌性Balb/C小鼠靜脈內(nèi)注射2mg抗膠原抗體(arthrogen)，接著在3天后腹膜內(nèi)注射25嗎LPS?？贵w注射后14天，將小鼠安樂死，收集爪，在聚乙烯醇中包埋。從冰凍關(guān)節(jié)切出7pm厚的切片，用鼠CRIg和巨噬細(xì)胞特異性標(biāo)志物F4/80的抗體染色。圖40表明muCRIg在Balb/c小鼠中防止抗體誘發(fā)關(guān)節(jié)炎后的關(guān)節(jié)腫脹。關(guān)節(jié)炎是通過Terato及其同事的方法(Teratoetal.,(1992),見上文；Teratoetal.,(1995)見上文)使用識別II型膠原上保守表位的4種單克隆抗體的混合物(Chemicon)誘導(dǎo)的。給6周齡的雌性Balb/C小鼠靜脈內(nèi)注射2mg抗CII抗體，接著在3天后腹膜內(nèi)注射25嗎LPS。將動物每天用鼠CRIg-Fc融合蛋白或者用對照-Fc融合蛋白處理。劑量為4mg/kg,在100plPBS中，皮下注射。處理從注射抗膠原抗體的前一天開始，持續(xù)至第14天將小鼠安樂死。注射LPS后每天對動物觀察后爪紳脹情況，作為關(guān)節(jié)炎的征候。關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度分為如下1-16個等級0=未出現(xiàn)紅斑和腫脹，1=紅斑和輕微腫脹，限于中爪(跗骨)或踝，2=紅斑和輕微肺脹，從踝擴散至中爪，3=紅斑和中度腫脹，從踝擴散至跖關(guān)節(jié)，4=紅斑和重度腫脹，涵蓋踝、爪和爪趾。治療性處理與預(yù)防性處理類似進(jìn)行，只是處理從第4天開始，而不是第-1天。muCRIg-Fc處理降低AIA小鼠爪中的炎性細(xì)胞因子水平。關(guān)節(jié)炎后爪中細(xì)胞因子C3a和C5a濃度的測量依照Kagarietal，J.Immunol.169:1459-66(2002)的方法進(jìn)行。簡而言之，在抗體誘發(fā)關(guān)節(jié)炎后的指定時間點，收集爪，在液氮中冷凍。此后，在液氮冷卻的金屬盤上研磨爪，在含0.1%PMSF(Sigma)的冰冷PBS中分散。將樣品用Vitatron(NL)勻漿器在冰上勻漿，通過以14000g離心10分鐘除去不溶部分，收集上清液。-使用購自BDPharmingen的細(xì)胞因子ELISA測量上清液中的細(xì)胞因子。muCRIg-Fc處理抑制AIA中補體C3在軟骨上的沉積，^旦不抑制IgG2a的沉積。給雌性Balb/C小鼠靜脈內(nèi)注射2mg抗膠原抗體(arthrogen),接著在3天后腹膜內(nèi)注射25嗎LPS。注射抗體后14天，將小鼠安樂死，收集爪，在聚乙烯醇中包埋，然后在置于干冰上冷卻的異戊烷中水凍。從冰凍關(guān)節(jié)切出7pm厚的切片，用鼠C3的FITC偶聯(lián)多克隆抗體(Calbiochem)和鼠IgG2a的A594偶聯(lián)多克隆抗體(JacksonImmunoresearch)染色。將切片在Leitz熒光顯^:鏡下照相。用H&E染色進(jìn)行的免疫組化的結(jié)果顯示于圖41。對照處理小鼠(muIgGl)具有中度至重度的關(guān)節(jié)炎(左側(cè)小圖)，而muCRIg處理小鼠具有很小程度關(guān)節(jié)炎至沒有關(guān)節(jié)炎(右側(cè)小圖)。該結(jié)果顯示出muCRIg抑制抗體誘發(fā)關(guān)節(jié)炎中的關(guān)節(jié)炎癥?？傊?，與用抗gpl20IgGl處理的動物相比，用鼠CRIg-Fc處理的動物具有顯著降低的臨床得分。CRIg在此動物模型中表現(xiàn)出預(yù)防和治療兩種功效。關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度的減輕還表現(xiàn)為關(guān)節(jié)中炎性細(xì)胞的減少，尤其是嗜中性細(xì)胞。循環(huán)中的嗜中性細(xì)胞數(shù)目增多，可能反映了遷移到關(guān)節(jié)中的嗜中性細(xì)胞減少。與RA的臨床表現(xiàn)平行，muCRIg-Fc抑制局部IL-1卩和IL-6生成。MuCRIg處理不影響免疫復(fù)合物沉積，但抑制補體C3在軟骨上的沉積。發(fā)現(xiàn)效應(yīng)物功能不依賴Fc受體結(jié)合。huCRIg-短-Fc還表現(xiàn)出顯著的預(yù)防活性。實施例9:鼠CRIg-Fc結(jié)合C3調(diào)理的綿羊紅細(xì)胞(E-IgM)將SRBC(MPBiomedicals,ICN/Cappel)用大鼠IgM(E-IgM)(ForssmanAg，Pharmingen)包被。將E-IgM用正常小鼠血清或來自C3敲除小鼠的血清調(diào)理。將調(diào)理后的E-IgM與不同濃度的鼠CRIg-Fc—起溫育。使用融合蛋白Fc部分的FITC標(biāo)記抗體，通過流式細(xì)胞術(shù)監(jiān)測融合蛋白與E-IgM的結(jié)合。如圖42所示，鼠CRIg以劑量依賴方式結(jié)合用正常小鼠血清調(diào)理的E-IgM,但不結(jié)合用C3缺陷血清調(diào)理的E-IgM，表明CRIg選擇性結(jié)合鼠C3或C3片段。實施例10:人CRIg-Fc與E-IgM的結(jié)合依賴C3將SRBC(MPBiomedicals,ICN/Cappel)用大鼠IgM(E-IgM)(ForssmanAg,Pharmingen)包被。將E-IgM用C3或C5缺陷的人血清調(diào)理。將調(diào)理后的E-IgM與不同濃度的人CRIg-Fc—起溫育。使用融合蛋白Fc部分的FITC標(biāo)記抗體，通過流式細(xì)胞術(shù)監(jiān)測融合蛋白與E-IgM的結(jié)合。如圖43所示，人CRIg以劑量依賴方式結(jié)合用C5缺陷血清調(diào)理的E-IgM，但不結(jié)合用C3缺陷血清調(diào)理的E-IgM,表明CRIg選擇性結(jié)合人C3或C3片段。使用人CRIgECD得到了相似結(jié)果。實施例11:血清調(diào)理顆粒與表達(dá)CRIg的CHO細(xì)胞的結(jié)合將50|il新鮮C57B6雌性血清+20pg/mlmCRIg-mFc(PUR5270-B)或mPIGR-mFc(4699)混合在一起。在37。C，在PBS/0.2%明膠/0.18%葡萄糖/ImMMgCl2(PBSgg+十)中加入來自MolecularProbes的A488顆粒、酵母聚糖、金黃色葡萄球菌或大腸桿菌達(dá)60分鐘。將調(diào)理后的顆粒用PBS洗滌兩遍，然后在37。C、存在或缺少CRIg-Fc或?qū)φ?Fc蛋白質(zhì)時加至表達(dá)鼠CRIg(克隆5C10)或人JAM2的CHO細(xì)胞達(dá)30分鐘。將細(xì)胞用PBS洗滌兩遍，如圖44所示，用C3缺陷血清調(diào)理的顆粒結(jié)合表達(dá)CRIg的CHO細(xì)胞，但不結(jié)合表達(dá)JAM2的CHO細(xì)胞。在存在CRIg-Fc融合蛋白時結(jié)合消除，但存在對照-Fc融合蛋白時則不然，表明CRIg結(jié)合C3b的結(jié)合位點位于胞外結(jié)構(gòu)域。實施例12:MuCRIgFc結(jié)合C3b使用Biacore⑧-2000設(shè)備進(jìn)行實時監(jiān)測表面等離振子共振測定法，然后使用BiaEvaluation3.0軟件(BiacoreAB,Uppsala,Sweden)分析數(shù)據(jù)。所有測定法中使用羧化右旋糖苷芯片(傳感器芯片CM5,研究級，購自BiacoreAB)。將CM5芯片的流動槽用于標(biāo)準(zhǔn)胺偶聯(lián)流程，或者制備用于C3b的直接酶促偶聯(lián)，其中使用標(biāo)準(zhǔn)活化-去活化流程，步驟之間不添加任何蛋白質(zhì)。用含W-羥基琥珀酰亞胺和7V-乙基-7V'-(二曱氨基丙基)-碳二亞胺的新鮮溶液實施活化步驟(BiacoreAB,以5(il/min的流速注射7-15分鐘)，然后用乙醇胺-HCl(1.0M,pH8.5)去活化(BiacoreAB,注射7-15分鐘)。使用Hepes緩沖鹽水(Biagrade,BiacoreAB)或VBS作為全程流動緩沖液。這些初始步驟后，使用VBS或VBS作為連續(xù)流動緩沖液，流速5)il/分鐘，只使用除氣后的緩沖液。摔蛋^l發(fā)偶^到S/acwe^^J:—使用制造商推薦的標(biāo)準(zhǔn)胺偶聯(lián)流程，將C3b、iC3b、C3c和C3d偶聯(lián)到CM5芯片上。將待偶聯(lián)蛋白質(zhì)對10mM醋酸鹽緩沖液(pH5.0-5.7)透析，獲得負(fù)凈電荷用于胺偶聯(lián)。簡而言之，將芯片表面用,乙基-7V'-(二曱氨基丙基)-碳二亞胺活化(注射7-15分鐘，5pl/min),然后注射純化的C3b(50嗎/ml，20jul)、C3c(70pg/ml，30jal)或C3d(130嗎/ml,20(^1)，直至達(dá)到適于結(jié)合試驗的偶聯(lián)水平，即1,000-5,000共振單位(RU)。然后，如上所述，將流動槽去活化。試驗前，用lOmM醋酸鹽緩沖液pH4.6中的VBS和3MNaCl徹底洗滌流動槽。炎^歷acore⑧的錄合解;t法一我們測試了CRIg-Fc對胺偶聯(lián)的C3b、C3c和C3d的結(jié)合。為了Biacore⑧注射，將試劑對VBS透析，用VBS稀釋，然后過濾(0.20jimMinisart,SartoriusCorp.,Edgewood,NY)或濃縮(10分鐘，14，000xg)。使用BCA蛋白質(zhì)測定法(Pierce)測量透析后試劑的蛋白質(zhì)濃度。將融合蛋白分開注射通過對照流動槽(活化及去活化但沒有任何偶聯(lián)蛋白質(zhì)的流動槽，"空白通道")和通過偶聯(lián)有蛋白質(zhì)的流動槽，流速5jil/min和22°C。所有結(jié)合測定法至少進(jìn)行一式兩份，使用獨立制備的傳感器芯片。如圖45所示，鼠CRIg-Fc顯示出C3b特異性結(jié)合傳感器芯片，計算Kd為250nM。實施例13:小鼠和人CRIg-Fc結(jié)合補體C3b將Maxisorb板用PBS中的3嗎/mlCl、C3a，b,c,d、C4、C6包被過夜。將板用PBS+4%BSA封閉2小時，與PBS+4%BSA+0.1%Tween中各種濃度的鼠或人CRIg-Fc融合蛋白一起于室溫溫育1小時。洗滌平板，與偶聯(lián)有過氧化物酶的山羊抗小鼠或山羊抗人Fc抗體一起溫育。洗滌后，將板與TNB底物一起溫育，在讀板儀上讀取OD值。圖46所示結(jié)果表明，鼠和人CRIg與C3b、C3c和C3bi的結(jié)合以依賴濃度的方式增加，與C1、C2、C4、C3a和C3d沒有結(jié)合。實施例14:小鼠和人CRIg-Fc抑制C3在酵母聚糖上的沉積使用利用酵母聚糖A顆粒(Sigma)上C3沉積的流式細(xì)胞術(shù)分析的方法研究對旁路途徑的抑制(Quiggetal.,J.Immunol,160:4553-4560(1998))。簡而言之，首先如下活化10ml0.15MNaCl中的50mg酵母聚糖顆粒煮沸60分鐘，然后用PBS洗滌2遍。在每個旁路途徑測定條件中，向含有終濃度10mMEGTA和5mMMgCl2的反應(yīng)管中加入2x107個顆粒。然后加入文中所述含10mMEDTA(陰性對照)或遞增數(shù)量鼠CRIg-Fc的樣品。添加10(ilBALB/c血清作為補體來源，所有樣品用PBS補至100|il。將樣品于37。C溫育20分鐘，加入1OmMEDTA終止反應(yīng)。離心顆粒，取上清液，冰凍用于后續(xù)分析。然后將顆粒用冷PBS,1%BSA洗兩遍，然后在冰上與FITC偶聯(lián)的山羊抗小鼠C3(Cappel，Durham,NC)—起溫育1小時。然后將樣品用冷PBS，1°/。BSA洗兩遍，重懸于PBS，然后使用EPICS細(xì)胞計數(shù)儀(Coulter,Hialeah,FL)通過流式細(xì)胞術(shù)分析。用如下公式計算抑制百分率[1-[樣品平均通道熒光-背景(10mMEDTA條件)/陽性對照平均通道熒光(無Crry-Ig)-背景]]x100。還通過Western印跡分析來自反應(yīng)的上清液以測定C3切割程度。在本分析中，取5^1上清液與等量含10%2-ME的SDS-PAGE上樣緩沖液混合。將樣品在7.5%丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行SDS-PAGE，在0.19MTris,0.025M甘氨酸、20%曱醇緩沖液轉(zhuǎn)移至Hybond增強型化學(xué)發(fā)光(ECL)紙(Amersham，ArlingtonHeights,IL)過4支。此后，將膜在含10%牛奶的PBS，0.1%Tween中封閉1小時。然后將已預(yù)滴定的抗C3mAbRmCllH9(Quiggetal.,見上文)加含l。/oBSA的相同緩沖液中的印跡。洗滌后，加入辣^^艮過氧化物酶偶^:的山羊抗大鼠IgG(SouthernBiotechnology,Birmingham,AL)(4十5于小鼠IgG予貞p及附)達(dá)1小時，然后洗滌印跡，用增強型化學(xué)發(fā)光(ECL)系統(tǒng)(Amersham)顯影。流式細(xì)胞術(shù)以檢測表面結(jié)合的C3(圖47A)，或者通過Western印跡分析酵母聚糖反應(yīng)上清液的等分試樣和使用抗C3mAb的檢測(圖47B)后，分析酵母聚糖顆粒上CRIg-Fc對補體活化的抑制。完整C3和C3'鏈在B中的位置如右邊箭頭所示。10mMEDTA泳道^C表陰性對照，第2-7泳道頂部顯示了CRIg-Fc的遞增劑量。實施例15:CRIg抑制SRBC的旁路途徑溶血對于旁路途徑，將兔紅細(xì)胞(RRBC)用含0.1。/。明膠的佛羅拿(veronal，巴比妥)緩沖液(BioWhittacker)洗滌，以1x109細(xì)胞/ml重懸于GVB。將10^1細(xì)胞懸浮液加至10^1含抑制劑的Clq消減血清。將混合液在溫室中于37°C振搖溫育35分鐘。加入200(il含10mMEDTA的GVB,將細(xì)胞以2500rpm離心5分鐘，取100^1等分試樣于412nm波長處讀數(shù)。對于經(jīng)典途徑，將用IgM調(diào)理的綿羊紅細(xì)胞(E-IgM)在ffl缺陷血清中溫育。方法學(xué)類似于旁路途徑測量。圖48所示結(jié)果顯示，鼠CRIg抑制旁路途徑誘導(dǎo)的溶血，但不影響經(jīng)典途徑溶血。用人CRIg獲得了相似的結(jié)果。實施例16:CRIg選擇性抑制補體旁路途徑使用全血清的溶血測定法按照Kostavasilietal.,J.Immunol.158:1763-71(1997)所述，用兔紅細(xì)胞(Er)評估補體旁路途徑。簡而言之，將Er(ColoradoSerum,Denver,CO)用GVB洗滌3遍，重懸至1x109/ml。取lOplEr加至lOplGVB/EGTA(0.1MEGTA/0.1MMgCl2)、抑制劑、10jilClq消減人血清，用GVB將體積調(diào)至100^1，于37。C溫育30分鐘。添加250^1GVB/10mMEDTA終止反應(yīng)，以500xg離心5分鐘。通過200|ig上清液在412nm處的吸光度，測定溶血情況。通過將無抑制劑存在時發(fā)生的溶解設(shè)定為100%溶解，將溶解百分率標(biāo)準(zhǔn)化。為了測定CRIg對補體經(jīng)典途徑的影響，遵循類似流程，只是用E-IgM代替Er且在6￥8++中在ffi缺陷人血清中進(jìn)行測定法。C3轉(zhuǎn)變酶介導(dǎo)的C3切割的測量為了檢驗CRIg對C3轉(zhuǎn)變酶(C3b.Bb)(來自Kostavasilietal.,見上文)的液相C3切割的影響，將0.4|iM純化的C3與GVB(20^1體積)中的huCRIg-長、huCRIg-短、muCRIg或因子H—起于37。C溫育15分鐘。此后，在存在50mMMgEGTA時在30(il總體積中加入0.4(iM因子B和0.04pM因子D以激活該途徑。于37。C溫育30分鐘后，反應(yīng)混合液用30(il含2-ME的Laemmli氏樣品緩沖液(BioRad)終止，煮沸3分鐘，在8%SDS-PAGE凝膠(Invitrogen)上電泳。通過用SimplyBlue染4斗(Invitrogen,Carlsbad,CA)染色顯現(xiàn)蛋白質(zhì)。掃描凝膠供密度測定分析，計算受到切割的C3的百分率。對照在GVBE(含10mMEDTA的GVB)中溫育以抑制切割。旁路途徑DAA的微量滴定板測定法如先前所述進(jìn)行(Krych-Goldbergetal.,J.Biol.Chem.274:31160-8(1999》。將微量滴定板用5嗎/mlC3b(AdvancedResearchTechnologies)磷酸鹽緩沖鹽水包被過夜。將板用含1%牛血清清蛋白和0.1%Tween20的磷酸鹽緩沖鹽水于37。C封閉2小時，與含71mMNaCl和0.05%Tween20的2.5mM佛羅拿緩沖液pH7.4中的10ng因子B、lng因子D和0.8mMNiCl2—起于37。C溫育15分鐘。使用相同緩沖液，與O.Ol-l嗎CRIg-Fc、0.129jig山羊抗人因子B抗體和lOO(ig1:15,000評希萍奪的偶耳關(guān)有夢束才艮過氧4匕物酶的抗山羊抗體(JacksonImmunoresearchLaboratories,WestGrove,PA)序貫溫育1小時。用鄰苯二胺顯色。在此測定法中，DAF和因子H如預(yù)料的作為衰變促進(jìn)活性的介質(zhì)起作用，使用AmershamPharmaciaBiotechdes-ArgRIA試劑盒檢測C3a#奪方文。C5轉(zhuǎn)變酶測定法使C3b沉積在酵母聚糖上，即將lx101()個酵母聚糖顆粒重懸于0.2ml10mg/mlC3,添加5嗎胰蛋白酶，然后于22。C溫育IO分鐘。重復(fù)胰蛋白酶導(dǎo)致的C3b沉積，細(xì)胞用5mlGVB洗滌6遍。將酵母聚糖顆粒重懸于lOOWGVB,與50|il含因子B(35嗎)和因子D(0.5略)的GVB及50(il10mMNiCl2混合。于22°C溫育5分鐘后，加入5|il0.2MEDTA。通過加入50(ilC3(500嗎)放大結(jié)合的C3b,將細(xì)胞于22°C溫育30分鐘。洗滌攜帶C3b的酵母聚糖顆粒，重復(fù)放大流程直至獲得期望數(shù)目的C3b/酵母聚糖。因為C5轉(zhuǎn)變酶形成所需時間不足1分鐘，所以在進(jìn)行測定法的同一反應(yīng)混合液中形成酶。如先前所述，在飽和濃度的因子B、因子D和C6下，在0.5毫升硅化微量離心管中測定酶速度(vdocity)。測定混合液含有不同濃度的C5(于37°C預(yù)溫育20分鐘以消除凍/融產(chǎn)生的背景C5b,6樣活性)、因子B(1.2嗎，516nM)，因子D(0.1(ig,167nM)、C6(2.5嗎，833nM)和0.5mMNiCl2。反應(yīng)由添加ZymC3b、ESC3b或ERC3b開始。根據(jù)每個細(xì)胞的C3b密度，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度使25(igGVB終體積中有9-35ng結(jié)合的c3b,導(dǎo)致2-8nM酶濃度。于37。C溫育15分鐘后，通過將測定管轉(zhuǎn)移至冰浴和添加冰冷的GVBE，防止C5的進(jìn)一步切割。立即通過使用EC的溶血測定法，對適當(dāng)稀釋的測定混合液滴定C5b，6形成情況。使用用純化的C5b，6制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線定量C5b,6。采用足以在后續(xù)步驟中將C5切割降至不可^f全測水平的冷的溫度和稀釋度，建立對照。使用EC溶解作為終點，兔紅細(xì)胞(ER)或綿羊紅細(xì)胞(ES)的溶解顯示貢獻(xiàn)出〈2。/。的C5b,6滴度。使用EC對人C5b-9導(dǎo)致的溶血溶解的敏感性，通過溶血測量C5b,6。向來自C5轉(zhuǎn)變酶測定法的稀釋樣品的等分試樣(25jil)中在終體積225(ilGVBE中加入1.2x107個EC和5^1合并正常人血清(NHS)的混合物作為補體蛋白C7-C9的來源。將反應(yīng)混合液于37。C溫育IO分鐘，然后通過以10，000xg離心l分鐘除去未溶解細(xì)胞。通過分光光度法在414nm定量血紅蛋白釋放量。測量2%NonidetP-40中的EC溶解作為100%溶解。含C5和C6但不含C5轉(zhuǎn)變酶的對照作為背景減去。含C5轉(zhuǎn)變酶但不含純化的C5或C6的對照證明，從EC溶解過程中用作C7-9來源的NHS沒有形成顯著量的C5b，6。結(jié)果結(jié)果顯示于圖49(A)-(E)。圖49(A)顯示了CRIg抑制Clq缺陷血清中兔紅細(xì)胞的溶血(旁路途徑)，但不抑制ffi缺陷血清中IgM調(diào)理綿羊紅細(xì)胞的溶血(經(jīng)典途徑)，表明hatCRIg選4奪性抑制補體旁^各途徑。如圖49(B)所示，CRIg抑制液相C3轉(zhuǎn)變酶活性。凝膠顯示了用漸增濃度的人CRIg-ECD(10-100nM)抑制對C3115kDaa鏈的切割。圖49(C)和(D)顯示了CRIg既不作為因子I介導(dǎo)的C3切割的輔因子，也不作為C3轉(zhuǎn)變酶衰變的促進(jìn)劑。圖49(E)中所列數(shù)據(jù)顯示了CRIg抑制酵母聚糖顆粒上形成的旁路途徑C5轉(zhuǎn)變酶。實施例17:CRIg在一部分組織巨噬細(xì)胞上表達(dá)制備對人和小鼠CRIg特異的單克隆抗體，用于確定CRIg的表達(dá)，如實施例3所述。盡管外周血C14+單核細(xì)胞上沒有CRIg,但是在單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞上通過流式細(xì)胞術(shù)很容易檢測到CRIg(圖50B)。外周血CD4+和CD8+T纟田月包、CD19+B纟田月包、CD56+NK細(xì)胞、CD15+粒細(xì)胞上不存在huCRIg(圖51A)。與huCRIg類似，外周血和脾白細(xì)胞上沒有muCRIg，包括CDllb+骨髓細(xì)胞，但是在肝Kupffer細(xì)胞上檢測到muCRIg(KC,圖50B)。在單核細(xì)胞分化成巨噬細(xì)胞時，通過55和48KMr蛋白質(zhì)證實了huCRIg(L)和(S)蛋白的表達(dá)(圖50C)。類似的，通過48KMr糖蛋白，在腹膜巨噬細(xì)胞(PM)中檢測到小鼠CRIg。MuCRIg具有一個預(yù)測的N-連接糖基化位點，并糖基化，表現(xiàn)為凝膠上約5kDa的遷移率變化(結(jié)果未顯示)。由于在肝中檢測到高水平CRIgmRNA，所以通過免疫組化進(jìn)一步分析肝中的CRIg表達(dá)。CRIg在人和小鼠肝中在CD68+KC上表達(dá)，但是在腎上腺、胎盤、滑膜、腸和腹膜的巨噬細(xì)胞上也檢測到CRIg(數(shù)據(jù)未顯示)。人脾巨噬細(xì)胞、郎格漢斯(Langerhan)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和骨髓衍生巨噬細(xì)胞，以及多種人和小鼠巨噬細(xì)胞細(xì)胞系(THP-1、RAW275、PUl.l、j774;結(jié)果未顯示)沒有CRIg?？傊@些結(jié)果表明CRIg在多種組織中的駐留巨噬細(xì)胞群上高表達(dá)。實施例18:CRIg結(jié)合C3b和iC3b材料和方法補體蛋白依照Hammeretal.,J,Biol.Chem.256(8):3995-4006(1981)的方法分離人和小鼠C3，另外用蛋白A柱除去污染性IgG。為了獲取hC3b,將hC3與摩爾比10:10:1的CVF、hffi和hfD—起在存在10mMMgCl2時于37。C溫育1小時。隨后用強陰離子交"l奐monoQ5/50(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)和SuperdexS-20010/300GL;疑月交過濾4主(AmershamBiosciences,Piscataway，NJ)分離hC3b片段，根據(jù)考馬斯藍(lán)染色的凝膠，純度>95%。為了制備C3b二聚體，將如上制備的C3b與曱醇中的雙馬來酰亞胺己烷(Pierce)以2.2:1摩爾比在PBSpH7.0中于4°C反應(yīng)3天。通過打斷^L酯鍵通過游離巰基產(chǎn)生交聯(lián)。采用此流程，產(chǎn)率高于50%。二聚體用SuperdexS-20010/300GL凝膠過濾柱(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)純化。才艮據(jù)考馬斯藍(lán)染色的凝膠，二聚體純度為95%。制備水解的C3，即向含10mMEDTA的PBS中的C3添加2M甲胺pH7.0，使得反應(yīng)體積中的終濃度為50mM。將反應(yīng)于37。C進(jìn)行4小時，然后在SuperdexS-20010/300GL凝膠過濾柱(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)上純4匕，^尋iC3b禾口C3c(AdvancedResearchTechnologies)在SuperdexS-20010/300GL凝膠過濾柱上純化，從二聚體中分離出單體。C3d、因子B、因子D和因子P、補體成分Cl-9、抗體敏化的綿羊纟工纟田月包禾口目艮纟竟蟲它毒因子獲自AdvancedResearchTechologes(SanDiego,CA)。結(jié)果CRIg在高度吞噬性細(xì)胞群上的表達(dá)促使我們探究CRIg是否牽涉調(diào)理后顆粒的結(jié)合。已經(jīng)證明補體和Fc受體介導(dǎo)吞噬作用。(綜述見AderemandUnderhill,Annu.Rev.Immunol.17:593-623(1999);UnderhillandOzinsky，Annu.Rev.Immunol.20:825-852(2002》。為了確定CRIg是否結(jié)合補體C3，對用兔IgG(E-IgG)或小鼠IgM(E-IgM)包被的綿羊紅細(xì)胞分析其在存在C3或C5缺陷人血清時與表達(dá)CRIgL的JurkatT細(xì)胞系形成玫瑰花結(jié)的能力。在存在C3時(C3+)表達(dá)CRIg(L)的Jurkat細(xì)胞而非對照J(rèn)urkat細(xì)胞與E-IgM形成玫瑰花結(jié)，但在不存在C3時(C3-)則不然(圖52A)。CRIg似乎不牽涉Fc受體介導(dǎo)的結(jié)合，因為用IgG調(diào)理的Es與JurkatCRIg細(xì)胞不形成玫瑰花結(jié)(結(jié)果未顯示)。為了測試CRIg是否能直接結(jié)合細(xì)胞表面上的補體成分，制備了一種可溶形式的人CRIg，其中CRIg的ECD與人IgGl的Fc部分融合。在存在C3時融合蛋白huCRIg-長-Fc而非對照-Fc與調(diào)理后的E-IgM結(jié)合，但在不存在C3時則不然(圖52B)。當(dāng)C3缺陷血清用純化的人C3重建時，結(jié)合又恢復(fù)了。V型Ig結(jié)構(gòu)域足以滿足結(jié)合所需，因為huCRIg(S)-Fc和muCRIg-Fc都能夠結(jié)合E-IgM(結(jié)果未顯示)。作為補體活化誘導(dǎo)酶促級聯(lián)反應(yīng)的結(jié)果，C3切割成其多種分解產(chǎn)物C3b、iC3b、C3c、C3dg和C3d,其中每一種都能充當(dāng)CRIg的結(jié)合配偶。使用板結(jié)合型ELISA,huCRIg(L)和huCRIg(S)-Fc而非對照Fc表現(xiàn)出與C3b和iC3b的可飽和結(jié)合(圖52C),與C3、C3a、C3c或C3d則不然(結(jié)果未顯示)。對于不含F(xiàn)c部分的huCRIgL-ECD和muCRIg-Fc觀察到相似的結(jié)果，與iC3b的結(jié)合大于與C3b的結(jié)合(結(jié)果未顯示)。相反，可溶性C3b還與板包被的huCRIg(L)-Fc結(jié)合，并且受到huCRIg(L)-ECD的竟?fàn)?結(jié)果未顯示)。因此，CRIg能結(jié)合溶液中的C3b和iC3b，或者當(dāng)C3b和iC3b結(jié)合于基底上時。由于C3b在沉積于細(xì)胞表面上時以多聚體形式存在，所以進(jìn)一步評估CRIg與人工組裝的C3b二聚體(C3b2)的結(jié)合。根據(jù)表面等離振子共振的測量，C3b2與huCRIg(L)結(jié)合的Kd為131nM(圖52D)，與huCRIg(S)結(jié)合的Kd為44nM(圖52D)。為了使這些生化研究完整，我們評估了細(xì)胞表面CRIg對C3衍生產(chǎn)物的結(jié)合特異性。A488標(biāo)記的C3b2二聚體形成結(jié)合CRIg+而非CRIg-的THP-1細(xì)胞的表面(圖52E)。結(jié)合是特異性的，因為它受到添加可溶性未標(biāo)記C3b2、C3b單體及huCRIg(L)-ECD而非天然C3的竟?fàn)?。除結(jié)合可溶性補體片段夕卜，在CHO細(xì)胞系表面上表達(dá)的muCRIg還結(jié)合在C3充足而非缺陷血清中調(diào)理的各種顆粒(圖51B)?？傊@些研究證明，在細(xì)胞表面上表達(dá)的CRIg以及可溶性CRIg(CRIg-Fc)是iC3b和C3b的受體。實施例19:Kupffer細(xì)胞上的CRIg表達(dá)是可溶性的或顆粒結(jié)合的C3片段結(jié)合所必需的材料和方法1.CRIg敲除(ko)小鼠的生成所有動物都在無菌無病原體條件下祠養(yǎng)，動物試驗得到了Genentech研究用動物護(hù)理和1"吏用委員會(institutionalanimalcareandusecommittee)的批準(zhǔn)。制備CRIg敲除胚胎干細(xì)胞，即通過電穿孔將外顯子1用新霉素抗性基因置換的線性化尋靶載體導(dǎo)入C2B6胚胎干(ES)細(xì)胞。選擇對新霉素有抗性的克隆，通過Southern印跡驗i正同源重組。所篩選的100個克隆中有7個為同源重組陽性。將兩個靶向克隆注射到C57VL/6胚泡中，轉(zhuǎn)移到假孕的4戈孕母獸(fostermother)中，將所得雄性嵌合小鼠與C57BL/6雌性小鼠交配以獲得+/-小鼠。通過Southern印跡分析或來自Fl子代的尾部DNA驗證2ES克隆的種系傳遞(圖42B)。進(jìn)行+/-小鼠雜交以生成-/-011§小鼠。這兩種克隆的表型是相同的。為了通過PCR方法進(jìn)行常規(guī)基因分型，使用公用有義引物5'-CCACTGGTCCCAGAGAAAGT-3'(SEQIDNO:22)及野生型特異性反義引物(5'-CACTATTAGGTGGCCCAGGA-3')(SEQIDNO:23)和敲除特異性反義引物(5'-GGGAGGATTGGGAAGACAAT-3')(SEQIDNO:24),對野生型等位基因擴增出306bp片段而對突變型等位基因擴增出406bp片段。C3敲除小鼠的生成先前已有描述(Naughtonetal.,Immunol.156:3051-3056(1996))。為了生成CRIg/C3雙重敲除小鼠，將混合sl29/B6背景(F2)的C3敲除小鼠與CRIg敲除小鼠雜交。然后，將兩種等位基因都是雜合的Fl雌獸與CRIg等位基因為半合子的C3雜合雄獸雜交。將由此交配得到的后代用于研究。通過流式細(xì)胞術(shù)分析CRIg表達(dá)所^吏用的C57B6小鼠購自JacksonLaboratories(BarHarbor)。2.Western印跡和脫糖基化將人和鼠巨噬細(xì)胞在含1%SDS,0.1%TritonX-100和蛋白酶抑制劑混合物(Boehringer)的PBS中溶解。以10，000g離心后，將可溶組分進(jìn)行SDS凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。顯現(xiàn)CRIg蛋白，即使用抗CRIg抗體和HRPO偶聯(lián)的二抗，然后通過ECL(Amersham)檢測所結(jié)合抗體的化學(xué)發(fā)光。為了測定CRIg的糖基化狀態(tài)，將表達(dá)CRIg-gD的細(xì)胞用抗gD抗體免疫沉淀，用PNGase、O-糖基化酶和神經(jīng)氨酸酶依照制造商的說明書(Biolabs,NE)處理，然后使用生物素化的抗gD抗體進(jìn)行Western印跡分析。結(jié)果為了研究CRIg的生物學(xué)功能，如上文所述和圖42A所示，通過同源重組生成CRIg基因有無效突變的小鼠。通過Southern印跡(圖53B)、腹膜滲出物細(xì)胞溶解物的Western印跡(圖54A)及流式細(xì)胞術(shù)(圖54B)驗證刪除。小鼠以預(yù)期孟德爾比率出生，沒有出現(xiàn)總體表型或組織病理學(xué)異常。在來自野生型動物和敲除動物的血液、脾和淋巴結(jié)中，不同淋巴區(qū)室中的免疫細(xì)胞絕對數(shù)是相似的(圖53C)。此外，在分別通過流式細(xì)胞術(shù)和免疫組化分析時，對F4/80十KC和心巨噬細(xì)胞數(shù)沒有觀察到差異(結(jié)果未顯示)。其它補體結(jié)合蛋白質(zhì)，包括CR3的cx鏈和P鏈及KC上的補體受體相關(guān)基因y(Crry),的表達(dá)水平?jīng)]有變化(圖54C)。類似的，野生型和敲除KC之間在CR1、CR2或CDllc、CR4(3鏈的表達(dá)低或不可檢測這一點上是類似的。接著，測試了CRIg野生型和CRIg敲除KC對C3降解產(chǎn)物的結(jié)合能力。C3片段(C3b、C3b2和iC3b)很容易在CRIg野生型KC的表面上沉積(圖54B)。相反，在CRIg野生型KC中沒有檢測到C3b、C3b2、iC3b或iC3b2的結(jié)合。檢測到C3和C3c對野生型或敲除KC的很少結(jié)合或沒有檢測到結(jié)合(圖53E)。為了將分析從可溶性C3片段的結(jié)合擴展至結(jié)合于細(xì)胞表面的C3片段的結(jié)合，檢驗了KC上的CRIg結(jié)合C3調(diào)理的IgM包被的紅細(xì)胞的作用。CRIg敲除KC在與CRIg野生型KC比較時，展現(xiàn)出E-IgM形成玫瑰花結(jié)減少約60%(圖54D)。在加入CR3封閉性抗體時觀察到玫瑰花結(jié)形成進(jìn)一步減少(<20%),所以CR3對總的結(jié)合活性貢獻(xiàn)甚微。因此，CRIg表達(dá)是C3降解產(chǎn)物和C3調(diào)理顆粒與Kupffer細(xì)胞結(jié)合所必需的。實施例20:CRIg內(nèi)在化并在再循環(huán)內(nèi)體上表達(dá)由于C3調(diào)理顆粒對其受體的結(jié)合可觸發(fā)將隨后的胞吞作用(Fearonetal.，丄Exp.Med,153:1615-1628(1981);Sengelov，Crit.Rev.Immunol.15:107-131(1995))，使用猝滅Alexa488熒光染料的多克隆抗體(Austinetal.,Mol.Biol.Cell15:5268-5282(2004))來分析CRIg和C3b是否在KC中內(nèi)在化。將A488偶聯(lián)的抗CRIgmAb與KC一起于4°C預(yù)溫育。于4°C添加抗A488抗體抑制表面結(jié)合的抗CRIg抗體的熒光，如圖47A小圖1所示。在將A488偶聯(lián)的抗CRIgmAb與KC一起于37。C溫育30分鐘，然后與抗A488抗體一起溫育時，熒光不受抑制(圖55A小圖4)，表明抗CRIg抗體在4。C-37。C在轉(zhuǎn)移至細(xì)胞時內(nèi)在化，因而不能猝滅抗A488抗體。對C3b發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果(圖55A小圖3和6)?？笴RIg抗體的內(nèi)在化不依賴C3的存在，因為在從C3敲除小鼠分離的KC中(圖55A小圖2和5)和不存在血清時(結(jié)果未顯示)發(fā)生了抗體攝取。免疫組化進(jìn)一步證實，在來自CRIg野生型而非敲除小鼠的KC的細(xì)胞質(zhì)中存在抗CRIg抗體和C3b(圖55B)。隨時間過去，用A488偶聯(lián)的抗CRIg抗體包被的KC在存在胞外抗A488抗體時溫育，觀察到熒光隨時間減少，表明抗CRIg抗體再循環(huán)回到細(xì)胞表面(圖55C)。再循環(huán)的時程再次不依賴C3,因為存在和不存在C3時猝滅的動力學(xué)相似(結(jié)果未顯示)。相反，溶酶體蛋白Lampl的抗體仍留在細(xì)胞內(nèi)，不隨時間減少。這些結(jié)果表明CRIg作為位于組成性再循環(huán)膜集合上的C3b受體發(fā)揮功能。為了進(jìn)一步確定CRIg在其中再循環(huán)的亞細(xì)胞區(qū)室，使用去褶合顯樣t鏡檢術(shù)顯現(xiàn)人單核細(xì)胞衍生巨噬細(xì)胞(MDM),其中使用運鐵蛋白作為再循環(huán)內(nèi)體的標(biāo)志物，使用Lampl作為溶酶體的標(biāo)志物。培養(yǎng)7天的MDM在60%顯示可飽和C3b結(jié)合的細(xì)胞上表達(dá)CRIg(圖55A)，這種結(jié)合可用huCRIg(L)的胞外結(jié)構(gòu)域竟?fàn)幍?結(jié)果未顯示)。用抗CRIg抗體于4。C包被的巨噬細(xì)胞在富含F(xiàn)-肌動蛋白的絲足突出中展現(xiàn)局部(focal)CRIg表達(dá)(箭頭，圖56A,小圖1-3)。此外，CRIg抗體與C3b共定位至細(xì)胞表面(結(jié)果未顯示)。將細(xì)胞從4。C轉(zhuǎn)移至37。C，然后于37。C溫育10分鐘(圖56B),導(dǎo)致CRIg抗體和C3b快速內(nèi)在化進(jìn)入位于細(xì)胞外圍的運鐵蛋白+內(nèi)體區(qū)室(圖56B,小圖"4，箭狀物)，接近Lampl+區(qū)室(箭狀物，圖57D，小圖1-4)。延長追蹤時間直至24小時，CRIg仍定位在內(nèi)體區(qū)室內(nèi)，而且沒有在溶酶體中降解(結(jié)果未顯示)。將巨噬細(xì)胞與抗CRIg抗體一起溫育不影響CRIg分布，因為內(nèi)在化的CRIg抗體與固定后用多克隆抗體檢測到的CRIg全部集合完全交疊(圖57C，小圖l-3)，不依賴培養(yǎng)基中C3的存在(圖57C，小圖4)。總之，這些結(jié)果表明，再循環(huán)和早期內(nèi)體上存在CRIg，而且在不存在配體或交聯(lián)抗體時發(fā)生CRIg的內(nèi)在化。由于C3b和iC3b大部分沉積在暴露于血清的顆粒上(Brown,Curr.Opin.Immunol.3:76-82(1991)),所以接下來我們探究了C3調(diào)理顆粒的吞噬過程中CRIg陽性內(nèi)體在巨噬細(xì)胞中的定位。在遭遇iC3b調(diào)理的綿羊紅細(xì)胞(E-IgM)時，CRIg從運鐵蛋白陽性嚢泡迅速(10分鐘)重新分布到正在形成的吞噬體，表現(xiàn)為環(huán)繞所吞沒紅細(xì)胞的環(huán)(圖56C,小圖1和4，箭狀物)。將巨噬細(xì)胞與C3調(diào)理的顆粒一起溫育后2小時，吞噬體就成熟了，表現(xiàn)為它們易位進(jìn)入溶酶體區(qū)室(圖56C,小圖5-8)。CRIg在圍繞C3調(diào)理顆粒的吞噬體膜上高表達(dá)(圖56C，小圖5和8，箭狀物)，大多數(shù)巨噬細(xì)胞不再存在于運鐵蛋白+內(nèi)體區(qū)室內(nèi)。盡管CRIg仍存在于溶酶體區(qū)室中的一部分吞噬體上，但是其表達(dá)與LAMP-1的表達(dá)不交疊(圖56C，小圖7和8，箭頭)。LAMP-1+膜中不存在CRIg不大可能是由于溶酶體對CRIg的降解，因為蛋白酶抑制劑在溫育期間持續(xù)存在。在一些已經(jīng)攝取E-IgM但缺乏CRIg+吞噬體的巨噬細(xì)胞中，CRIg+與運鐵蛋白+區(qū)室共定位(粗箭狀物，圖56C5，小圖5和8，粗箭狀物)，表明在E-IgM轉(zhuǎn)移至溶酶體區(qū)室后，CRIg+回到再循環(huán)區(qū)室?？傊@些結(jié)果表明，CRIg從內(nèi)體募集到顆粒攝取位點，參與吞噬體形成的初期，但是在吞噬體-溶酶體融合時，CRIg從吞噬體逃離回到內(nèi)體區(qū)室。實施例21:缺乏CRIg的小鼠易患單核細(xì)胞增生利斯特氏菌感染才才泮牛禾口方法1.微生物、小鼠感染及通過CFU計數(shù)測定的利斯特氏菌生長評估所有試驗使用有毒力的單核細(xì)胞增生利斯特氏菌(LM)(ATCC菌抹43251)。通過在BALB/c小鼠中連續(xù)傳代來維持細(xì)菌毒力。從受感染脾獲得新鮮分離物，在腦心浸液(液態(tài))或腦心浸液平板(DifcoLaboratories,Detroit,MI)中培養(yǎng)。將細(xì)菌反復(fù)洗滌，重懸于無菌磷酸鹽緩沖鹽水(PBS),然后在含40%甘油的PBS中分成小份保存于-80。C。將小鼠以不同劑量在尾靜脈中靜脈內(nèi)接種單核細(xì)胞增生利斯特氏菌。為了觀察細(xì)菌在各種器官中的生長，我們給小鼠靜脈內(nèi)注射1x1(^個菌落形成單位(CFU)的利斯特氏菌，該劑量對CRIg敲除小鼠或CRIg野生型小鼠都不會致死。通過將10倍連續(xù)稀釋液在腦-心浸液瓊脂(DifcoLaboratories)平板上鋪涂，測定接種物、肝和脾勻漿物、及受感染細(xì)胞中的活細(xì)菌數(shù)。于37。C溫育24小時后，對CFU數(shù)計數(shù)。2.測定Kupffer細(xì)胞中的利斯特氏菌-A488攝取用A-488標(biāo)記試劑盒依照制造商的說明書(MolecularProbes，Oregon)標(biāo)記活的單核細(xì)胞增生利斯特氏菌。通過菌落計數(shù)評估標(biāo)記流程后活的利斯特氏菌數(shù)。給CRIg野生型小鼠或CRIg敲除小鼠靜脈內(nèi)注射1千萬個CFU的LM。1小時后，依照上文所述方法灌注肝和分離Kupffer細(xì)胞。將細(xì)胞用PE標(biāo)記的抗F4/80抗體染色，使用抗PE珠(Miletnyi)分離陽性細(xì)胞，接著用MoFlo流式細(xì)胞儀(DakoCytomation,Ft.Collins,CO)分選。將F4/80陽性細(xì)胞收集到蓋玻片上，使用共聚焦和光學(xué)顯微鏡估算內(nèi)在化的標(biāo)記細(xì)菌^:。對每張載玻片上4個不同視野的400個細(xì)胞中每個細(xì)胞的細(xì)菌數(shù)計數(shù)。吞噬細(xì)胞指數(shù)如下計算，每個細(xì)胞的細(xì)菌數(shù)的平均值乘以含至少1個細(xì)菌的kupffer細(xì)胞的百分率。結(jié)果顯示了從四只不同動物獲得的吞噬細(xì)胞指數(shù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果根據(jù)CRIg與C3b/iC3b調(diào)理顆粒的結(jié)合，為了探究CRIg在體內(nèi)在補體調(diào)理顆粒的吞噬作用中的作用，將CRIg野生型小鼠和CRIg敲除小鼠感染不同劑量的單核細(xì)胞增生利斯特氏菌(LM)，它是一種革蘭氏陽性兼性細(xì)菌，在暴露于血清時，激活補體旁路途徑，該途徑主要將C3b和iC3b沉積在細(xì)菌表面上(Croizeetal.，Infec.Immunol.61:5134-5139(1993))。CRIg敲除小鼠對LM感染明顯更易感，表現(xiàn)為致死率升高(圖58A)。相反，CRIg-Ig融合蛋白預(yù)處理提高CRIg野生型小鼠而非CRIg敲除小鼠的易感性(圖62)。符合CRIg在補體C3調(diào)理顆粒的結(jié)合和吞噬中的作用，CRIg敲除小鼠在從血液中清除LM方面降低，導(dǎo)致脾和肺中LM荷載增加(圖58B)。受感染小鼠肝和心中LM荷載也減少，這可能反映了這些組織中存在表達(dá)CRIg的巨噬細(xì)胞(圖58B)。CRIg敲除小鼠中炎性應(yīng)答升高，表現(xiàn)為IFN-y、TNF-a及IL-6的血清水平升高(圖58C)。與清除C3調(diào)理顆粒對CRIg的要求一致，與CRIg野生型KC相比，CRIg敲除KC表現(xiàn)出LM的結(jié)合和吞噬顯著減少(圖58D)。最后，在CRIg敲除小鼠血液中檢測到的利斯特氏菌荷載的升高依賴于C3,因為C3敲除小鼠的感染消除了CRIg敲除小鼠與CRIg野生型小鼠之間的細(xì)菌滴度差異(圖58E)。有趣的是，與C3充足小鼠相比，C3敲除小鼠的細(xì)菌循環(huán)水平顯著較低，這有可能反映了對C3敲除小鼠中利斯特氏菌清除負(fù)責(zé)的不依賴C3的機制參與度升高。然而，缺乏C3時的快速清除不導(dǎo)致長期的有效清除病原體，因為C3缺陷小鼠在革蘭氏陽性細(xì)菌感染后2天內(nèi)死亡(Cunnionetal.,J.Lab.Clin.Med.143:358-365(2004))。這些結(jié)果有力的說明，在肝Kupffer細(xì)胞上表達(dá)的CRIg在從循環(huán)系統(tǒng)中快速清除補體C3調(diào)理的病原體中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。實施例22:用huCRIg分子抑制補體介導(dǎo)的免疫溶血完全清楚了，兔紅細(xì)胞特異性激活補體旁路途徑，導(dǎo)致C5b-9復(fù)合物溶角竿細(xì)胞(Polhill,etal.,J.Immunol.121(1):363-370(1978》。具體而言，兔紅細(xì)胞啟動旁路補體級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致形成的MACI起這些細(xì)胞的溶解。如果測1試化合物能夠抑制旁路途徑，那么將試劑加到浸泡在血清(在這種情況中是獼猴或人Clq消減血清)中的兔紅細(xì)胞應(yīng)該能夠防止細(xì)胞溶解。這可通過監(jiān)測由溶解的紅細(xì)胞釋放的血紅蛋白引起的412nm波長處的吸光度變化來評估。在獼猴血清試驗中，從獼猴的股靜脈采集血液。不使用抗凝劑。使樣品于室溫凝結(jié)。將樣品離心，收集血清，保存在設(shè)定維持-60。C至-80。C的冰箱中。將兔紅細(xì)胞(RRBC)用GVB(lx佛羅拿緩沖液(Biowhittaker),0.1%明膠)洗滌3遍，用GVB重懸至1x109/ml。加入GVB、huCRIg(短型或長型，或者長ECD),接著加入10^1GVB+/EGTA(GVB,0.1MEGTA,0.1MMgCl2)。加入lO(il獼猴血清或Clq消減血清(Quidel)，然后加入lO)ilRRBC,將混合液彈指混合。在溫室中于37。C振搖溫育45分鐘后，加入250filGVB/10mMEDTA，將混合液以2500rpm離心5分鐘。使用250(^1等分試樣，于412nm處讀數(shù)。圖63A和B(獼猴血清)及圖64-66(人血清)所示結(jié)果證明，所試CRJg化合物抑制補體。hST-L:人CRIg-長hST-S:人CRIg-短hST-LECD:人CRIg-長ECDhPIGR:人多聚免疫球蛋白受體fH:補體因子H實施例23:在脈絡(luò)膜新血管形成小鼠模型中測試鼠CRIg-Fc融合蛋白脈絡(luò)膜新血管形成(CNV)可通過激光灼傷視網(wǎng)膜而實驗誘發(fā)。在本研究中，將40只C57BL-6小鼠(CharlesRiverLaboratory)分為兩個處理組。第l組(對照)在第-1、1、3和5天，腹膜內(nèi)注射12mg/kggpl20mlgGl。第2組在第-1、1、3和5天，腹膜內(nèi)注射12mg/kg鼠CRIg(mCRIg)。每個組的動物通過皮下(s.c.)注射氯胺酮(25mg/g)和賽拉嗪(1.28mg/g)混合物麻醉。用一滴1%托吡卡胺放大瞳孔。然后將動物固定在塑料才莫具中。用二極管激光(lOO(im光點直徑)在眼中視神經(jīng)周圍產(chǎn)生3個激光照射斑點，使用OcuLightGL二極管激光(532nm)、Zeiss30W裂隙燈和顯微才喿作器。右眼用120mW、0.1秒及l(fā)OOiam裂隙大小照射激光。激光照射斑點除形成的泡表明Brach氏膜破裂。激光照射處理后7天，使用共聚焦顯微鏡檢術(shù)評估激光照射斑點。此時，將動物用異氟烷麻醉，穿過心灌注0.5ml含50mg/ml熒光素標(biāo)記右力炎糖苷(Sigma)的PBS。摘除眼，用10%磷酸鹽緩沖福爾馬林固定，棄除—見網(wǎng)月莫，將剩余的眼杯狀物(eyecup)平置于載玻片上。組織病理學(xué)檢查包括脈絡(luò)膜平鋪標(biāo)本的補體片段和彈性蛋白的免疫組化染色，及通過共聚焦顯微鏡檢術(shù)監(jiān)測眼中FITC-右旋糖苷染色血管系統(tǒng)來分析CNV復(fù)合物的大小。結(jié)果顯示于圖71A和B，其中右眼中的燒傷孔分別按照0-3及0-5的評分標(biāo)準(zhǔn)評分。實施例24:在遭受激光誘發(fā)的視網(wǎng)膜損傷的獼猴中測試CRIgECD和CRIg-Fc融合蛋白在本研究中使用24只獼猴，全部雄性或全部雌性，或者12只雄性和12只必何生。這些動物年齡為2-7歲，重量為2-5kg。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage111</column></row><table>施藥經(jīng)由頭靜脈的靜脈內(nèi)注射。動物在激光處理前至少服藥一次，在研究的剩余時間每周三次。劑量根據(jù)最近記錄的體重確定，在10-15mg/kg范圍內(nèi)。在第4天，所有動物每只眼的黃斑通過CORL接受激光處理，用532nm二極管綠色激光灼燒(OcuLightGL,IRIDEXCorpInc,MountainView,California),^f吏用裂隙燈才更遞系統(tǒng)及Kaufman-Wallow(OcularInstrumentsInc.,Bellevue,Wash)平底隱形眼鏡。激光及支持設(shè)備由CORL供應(yīng)。將動物用氯胺酮和賽拉。秦麻醉。9個區(qū)域?qū)ΨQ分布于每只眼的黃斑中。激光參數(shù)包括75微米光點直徑和O.l秒持續(xù)時間。通過生成水泡和少量出血的能力評估所用功率。除非在第一次激光處理時就觀察到出血，否則第二個激光斑點遵循相同的激光處理流程(除調(diào)整瓦數(shù)外)置于第一個附近。對于不鄰近凹的區(qū)域，初次功率設(shè)為500mW;如果設(shè)置第二個斑點，功率定為650mW。對于鄰近凹的區(qū)域，功率設(shè)為400mW(初次)和550mW(第二次)。根據(jù)眼科醫(yī)生的判斷，可根據(jù)激光照射時觀察到的情況調(diào)整功率設(shè)置。臨床眼科檢查每只動物在處理開始前及第8、15、22和29天各進(jìn)4亍一次臨床眼科斗全查。將動物用氯胺酮麻醉，用散瞳劑放大眼(瞳孔)。使用裂隙燈生物顯微鏡檢查雙眼的附件和前部。使用間接檢眼鏡檢查雙眼眼底。才艮據(jù)眼科醫(yī)師的判斷，可使用其它合適的儀器檢查眼睛，可拍照。眼睛拍照在激光處理當(dāng)天(激光處理后)、服藥期1第10、17、24和31天、及服藥期2第6天(尸檢當(dāng)天)各進(jìn)行一次眼睛拍照(OP)。在服藥期1期間同時進(jìn)行熒光素血管造影術(shù)時，首先進(jìn)行OP。將動物用氯胺酮麻醉，在同時進(jìn)行熒光素血管造影術(shù)時用異氟烷麻醉劑保持麻醉，單獨進(jìn)行時(即激光處理后)用氯胺酮和賽拉嗪麻醉。用散瞳藥放大眼(瞳孔)。對每只眼進(jìn)行彩色照相，包括視網(wǎng)膜和相關(guān)眼異常、后極的立體照相、及兩個中度-周邊視野(mid-peripheralfield)(顳部和鼻部)的非立體照相。熒光素血管造影術(shù)所有動物在處理開始前及服藥期1第10、17、24和31天(激光照射后第6、13、20和27天)各進(jìn)行一次熒光素血管造影術(shù)。使動物在熒光素血管造影術(shù)之前禁食。將動物用氯胺酮麻醉，用異氟烷維持麻醉，用散瞳藥放大眼(瞳孔)。給動物插管，因為熒光素注射后可能嘔吐。給動物靜脈內(nèi)注射焚光素。熒光素注射開始和結(jié)束時拍照。熒光素注射后，對右眼的后極進(jìn)行系列快速立體照相，接著在1分鐘前對左眼的后極作立體照相配對，然后對每只眼睛都進(jìn)行，在約l-2和5分鐘。在大約2-5分鐘之間，對每只眼的中度-周邊視野(顳部和鼻部)進(jìn)行非立體照相。如果在5分鐘時間點觀察到熒光素滲漏，在大約IO分鐘做立體照相配對。依照如下分級系統(tǒng)進(jìn)行熒光素血管造影照片評估，用于證明過度通透性(熒光素滲漏)或任何其它異常。損傷等級定義I沒有高熒光II高熒光，無滲漏m高熒光，早期或中期轉(zhuǎn)變和晚期滲漏IV明亮的高熒光，早期或中期轉(zhuǎn)變和晚期滲漏，越過處理區(qū)域的邊界材料保藏以下材料已經(jīng)保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC,AmericanTypeCultureCollection,10801UniversityBoulevard,Manassas,VA20110-2209,USA):名稱ATCC保藏號保藏曰期DNA45416-12512096201998年2月5日此保藏是依據(jù)布達(dá)佩斯條約關(guān)于用于專利程序的微生物保藏的國際認(rèn)可的規(guī)定及其(布達(dá)佩斯條約)細(xì)則進(jìn)行的。這保證了從保藏之日起保持保藏的存活培養(yǎng)物30年。此保藏物可根據(jù)布達(dá)佩斯條約的條款通過ATCC獲得，并服從Genentech公司和ATCC之間的協(xié)議，它保證了在有關(guān)美國專利授權(quán)時或者在任何美國或外國專利申請向公眾公開時，兩者中居先者，公眾可永久且不受限制的獲得保藏培養(yǎng)物的后代，而且保證了依據(jù)35USC§122及依照它的管理章程(包括37CFRS1.14,特別要提及8860G638)由美國專利和商標(biāo)局長決定的個人將有資格可獲得后代。本申請的受讓人已同意，若保藏的培養(yǎng)物在合適條件下培養(yǎng)時死亡、丟失或遭到破壞，則他將在接到通知后迅速用同一培養(yǎng)物更換。所保藏材料的踐本發(fā)明的許可。認(rèn)為前述書面說明足以使本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)嵺`本發(fā)明。本發(fā)明的范圍不受所保藏構(gòu)建物的限制，因為所保藏實施方案意圖作為本發(fā)明某些方面的單一例證，任何功能相當(dāng)?shù)臉?gòu)建物都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本文中的材料保藏不構(gòu)成承認(rèn)本文中所包含的書面說明不足以能夠?qū)嵺`本發(fā)明的任何方面，包括其最佳模式，也不應(yīng)解釋為將權(quán)利要求的范圍限制于它所呈現(xiàn)的具體例證。實際上，根據(jù)前述描述，除了本文所顯示和描述的，本發(fā)明的各種更改對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的，而且在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。權(quán)利要求1.用于預(yù)防或治療補體相關(guān)眼狀況的方法，包括對有需要的受試者施用預(yù)防或治療有效量的補體抑制物。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述補體抑制物是補體旁路途徑的選擇性抑制物。3.權(quán)利要求2的方法，其中所述補體抑制物是CRIg多肽或其激動劑。4.權(quán)利要求3的方法，其中所述CRIg多肽選自SEQIDNO:2，4,6,8的CRIg多肽和所述多肽的胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)。5.權(quán)利要求4的方法，其中所述CRIg多肽是SEQIDNO:2，4,6或8的CRIg多肽的ECD。6.權(quán)利要求5的方法，其中所述CRIg多肽是SEQIDNO:4或6的CRIg多肽的ECD。7.權(quán)利要求3的方法，其中所述CRIg多肽與免疫球蛋白序列融合。8.權(quán)利要求7的方法，其中所述免疫球蛋白序列是免疫球蛋白恒定區(qū)序列。9.權(quán)利要求8的方法，其中所述免疫球蛋白恒定區(qū)序列是免疫球蛋白重鏈的。10.權(quán)利要求9的方法，其中所述免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)序列與SEQIDNO:2,4,6或8的CRIg多肽的胞外區(qū)融合以生成CRIg-Ig融合蛋白。11.權(quán)利要求10的方法，其中所述免疫球蛋白恒定區(qū)序列是IgG的。12.權(quán)利要求ll的方法，其中所述IgG是IgG-l或lgG-3。13.權(quán)利要求12的方法，其中所述IgG-1重鏈恒定區(qū)序列至少包含4交鏈、CH2和CH3區(qū)。14.權(quán)利要求12的方法，其中所述IgG-l重鏈恒定區(qū)序列包含CH1、鉸鏈、CH2和CH3區(qū)。15.權(quán)利要求10的方法，其中所述CRIg-Ig融合蛋白在CRIg和Ig序列之間包含接頭。16.權(quán)利要求10的方法，其中所述CRIg-Ig融合蛋白由選自SEQIDNO:20,21,25,26,27和28的核酸編碼。17.權(quán)利要求l的方法，其中所述補體相關(guān)眼狀況選自年齡相關(guān)黃斑變性(AMD)、脈絡(luò)膜新血管形成(CNV)、葡萄膜炎、糖尿病性和其它在夾血相關(guān)視網(wǎng)膜病變、目艮內(nèi)炎、糖尿病性黃斑水腫、病理性近視、馮希-林二氏(vonHippel-Lindau)病、眼的組織胞漿菌病、視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞(CRVO)、角膜新血管形成、和視網(wǎng)膜新血管形成。18.權(quán)利要求17的方法，其中所述補體相關(guān)眼病是年齡相關(guān)黃斑變性(AMD)或脈絡(luò)膜新血管形成(CNV)。19.權(quán)利要求18的方法，其中所述方法包括預(yù)防CNV。20.權(quán)利要求18的方法，其中所述方法包括預(yù)防AMD發(fā)展。21.權(quán)利要求20的方法，其中所述方法包括預(yù)防AMD發(fā)展成CNV。22.用于預(yù)防年齡相關(guān)黃斑變性(AMD)形成或發(fā)展的方法，包括對在至少一只眼中有風(fēng)險形成AMD或診斷有AMD的受試者施用有效量的CRIg多肽或其激動劑。23.權(quán)利要求22的方法，其中所述CRIg多肽是SEQIDNO:2，4,6或8的多肽的胞外結(jié)構(gòu)域。24.權(quán)利要求23的方法，其中所述CRIg多肽是SEQIDNO:4或6的多肽的胞外結(jié)構(gòu)域。25.權(quán)利要求22的方法，其中所述激動劑是包含融合有免疫球蛋白序列的CRIg多肽序列的融合多肽。26.權(quán)利要求25的方法，其中所述融合多肽包含融合有免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)序列的SEQIDNO:4或6的多肽的胞外結(jié)構(gòu)域。27.權(quán)利要求26的方法，其中所述融合多肽選自由SEQIDNO:20,21,25,26,27和28的核苦酸序列編碼的融合多肽。28.權(quán)利要求22-27任一項的方法，其中所述受試者是人。29.權(quán)利要求28的方法，其中所述人受試者在至少一只眼中已經(jīng)診斷有AMD。30.權(quán)利要求29的方法，其中所述AMD是3類或4類干性AMD。31.權(quán)利要求30的方法，其中所述受試者已經(jīng)鑒定為有風(fēng)險形成CNV。32.權(quán)利要求31的方法，其中所述受試者在遺傳上有風(fēng)險形成CNV。33.權(quán)利要求30的方法，其中所述人受試者在兩只眼中都已經(jīng)診斷有AMD。34.權(quán)利要求33的方法，其中所述人受試者在兩只眼中都有3類或4類AMD。35.權(quán)利要求28的方法，其中所述施藥減緩AMD的發(fā)展。36.權(quán)利要求28的方法，其中所述施藥延遲AMD發(fā)展成CNV。37.權(quán)利要求28的方法，其中所述施藥預(yù)防AMD發(fā)展成CNV。38.權(quán)利要求29的方法，其中所述人受試者只在一只眼中已經(jīng)診斷有AMD。39.權(quán)利要求38的方法，其中所述施藥延遲在另一只眼中形成AMD。40.權(quán)利要求38的方法，其中所述施藥預(yù)防在另一只眼中形成AMD。41.權(quán)利要求28的方法，其中所述施藥通過玻璃體內(nèi)注射進(jìn)行。42.權(quán)利要求28的方法，還包括施用另外的藥劑來預(yù)防或治療AMD或CNV。43.權(quán)利要求42的方法，其中所述另外的藥劑是抗VEGF-A抗體。44.用于治療干性年齡相關(guān)黃斑變性(AMD)的方法，包括對需要的受試者施用預(yù)防或治療有效量的CRIg多肽或其激動劑。45.權(quán)利要求44的方法，其中所述CRIg多肽選自SEQIDNO:2，4，6,8的CRIg多肽和所述多肽的胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)。46.權(quán)利要求45的方法，其中所述CRIg多肽是SEQIDNO:2,4，6或8的CRIg多肽的胞外區(qū)。47.權(quán)利要求46的方法，其中所述CRIg多肽是SEQIDNO:4或6的CRIg多肽的胞外區(qū)。48.權(quán)利要求45的方法，其中所述CRIg多肽與免疫球蛋白序列融合。49.權(quán)利要求48的方法，其中所述免疫球蛋白序列是免疫球蛋白恒定區(qū)序列。50.權(quán)利要求49的方法，其中所述免疫球蛋白恒定區(qū)序列是免疫球蛋白重鏈的。51.權(quán)利要求50的方法，其中所述免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)序列與SEQIDNO:2,4,6或8的CRIg多肽的胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)融合。52.權(quán)利要求51的方法，其中所述免疫球蛋白恒定區(qū)序列是IgG的。53.權(quán)利要求52的方法，其中所述IgG是IgG-l或lgG-3。54.權(quán)利要求53的方法，其中所述IgG-l重鏈恒定區(qū)序列至少包含鉸鏈、CH2和CH3區(qū)。55.權(quán)利要求53的方法，其中所述IgG-l重鏈恒定區(qū)序列包含CH1、鉸鏈、CH2和CH3區(qū)。56.用于預(yù)防或治療補體相關(guān)疾病或狀況的方法，包括用預(yù)防或治療有效量的CRIg多肽或其激動劑處理需要此類治療的受試者。57.權(quán)利要求56的方法，其中所述CRIg多肽選自SEQIDNO:2，4,6,8的CRIg多肽和所述多肽的胞外區(qū)。58.權(quán)利要求57的方法，其中所述CRIg多肽與免疫球蛋白序列融合。59.權(quán)利要求58的方法，其中所述免疫球蛋白序列是免疫球蛋白恒定區(qū)序列。60權(quán)利要求59的方法，其中所述免疫球蛋白恒定區(qū)序列是免疫球蛋白重鏈的。61.權(quán)利要求60的方法，其中所述免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)序列與SEQIDNO:2,4,6或8的CRIg多肽的胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)融合。62.權(quán)利要求61的方法，其中所述免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)序列是IgG的。63.權(quán)利要求62的方法，其中所述IgG選自IgG-1和IgG-3。64.權(quán)利要求62的方法，其中所述IgG-1重鏈恒定區(qū)序列至少包含鉸鏈、CH2和CH3區(qū)。65.權(quán)利要求62的方法，其中所述IgG-1重鏈恒定區(qū)序列包含CH1、鉸鏈、CH2和CH3區(qū)。66疾病。67.權(quán)利要求66的方法，其中所述補體相關(guān)疾病選自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)、缺血和再灌注后的遠(yuǎn)端組織損傷、心肺旁路手術(shù)過程中的補體激活、皮肌炎、天皰瘡、狼瘡腎炎及由此發(fā)生的腎小球腎炎和血管炎、心肺轉(zhuǎn)流術(shù)、心臟停搏誘發(fā)的冠狀動脈內(nèi)皮功能障礙、II型膜性增生性腎小球腎炎、IgA腎病、急性腎衰竭、冷球蛋白血癥、抗磷脂綜合征、年齡相關(guān)黃斑變性、葡萄膜炎、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、同種移植、超急性排斥反應(yīng)、血液透析、慢性阻塞性肺應(yīng)激綜合征(COPD)、嗜喘、吸入性肺炎、蕁麻滲、慢性特發(fā)性蕁麻滲、溶血性尿毒癥綜合征、子宮內(nèi)膜異位、心源性休克、缺血再灌注損傷、和多發(fā)性硬化(MS)。68.權(quán)利要求66的方法，其中所述補體相關(guān)疾病選自炎性腸病(IBD)、系統(tǒng)性紅斑狼掩、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、幼發(fā)型慢性關(guān)節(jié)炎、脊推關(guān)節(jié)病、系統(tǒng)性硬化(硬皮病)、特發(fā)性炎性肌病(皮肌炎、多肌炎)、斯耶格倫氏(Sj6gren)綜合征、系統(tǒng)性血管炎、結(jié)節(jié)病、自身免疫性溶血性貧血(免疫性全血細(xì)胞減少、陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿)、自身免疫性血小板減少(特發(fā)性血小板減少性紫瘕、免疫介導(dǎo)的血小板減少)、曱狀腺炎(格雷夫斯氏(Graves)病、橋本氏(Hashimoto)曱狀腺炎、幼發(fā)型淋巴細(xì)月包性曱狀腺炎、萎縮性甲狀腺炎)、糖尿病、免疫介導(dǎo)的腎病(腎小王求腎炎、腎小管間質(zhì)性腎炎)、中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的脫髓鞘病諸如多發(fā)性硬化、特發(fā)性多神經(jīng)病、肝膽病諸如傳染性肝炎(曱型、乙型、丙型、丁型、戊型和其它非嗜肝病毒肝炎)、自身免疫性慢性活動性肝炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化、肉芽腫性肝炎、和硬化性膽管炎、炎性和纖維化肺病(例如嚢性纖維化病)、麩膠敏感性腸病、惠普爾氏(Whipple)病、自身免疫或免疫介導(dǎo)的皮膚病包括大皰性皮膚病、多形紅斑和接觸性皮炎、4艮屑病、肺的變應(yīng)性疾病諸如嗜曙紅細(xì)胞性肺炎、特發(fā)性肺纖維化和超^:感性肺炎、移植相關(guān)疾病包括移植物排斥、移植物抗宿主病、阿耳茨海默氏(Alzheimer)病、陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿、遺傳性血管性水腫和動脈粥樣硬化。69.權(quán)利要求66的方法，其中所述補體相關(guān)疾病是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、銀屑病或哮喘。70.權(quán)利要求57的方法，其中所述受試者是哺乳動物。71.權(quán)利要求70的方法，其中所述哺乳動物是人。72施用有效量的CRIg多肽或其激動劑。73.權(quán)利要求72的方法，其中所述CRIg多肽選自SEQIDNO:2，4,6,8的CRIg多肽和所迷多肽的胞外區(qū)。74.權(quán)利要求73的方法，其中所述CRIg多肽與免疫球蛋白序列融合。75.權(quán)利要求74的方法，其中所述免疫球蛋白序列是免疫球蛋白恒定區(qū)序列。76.權(quán)利要求75的方法，其中所述免疫球蛋白恒定區(qū)序列是免疫球蛋白重鏈的。77.權(quán)利要求76的方法，其中所述免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)序列與SEQIDNO:2，4,6或8的CRIg多肽的胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)融合。78.權(quán)利要求76的方法，其中所述免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)序列是IgG的。79.一又利要求78的方法，其中所述IgG選自IgG-1和IgG-3。80.權(quán)利要求79的方法，其中所述IgG-l重鏈恒定區(qū)序列至少包含鉸鏈、CH2和CH3區(qū)。81.權(quán)利要求79的方法，其中所述IgG-l重鏈恒定區(qū)序列包含CH1、鉸鏈、CH2和CH3區(qū)。82.用于在哺乳動物中選擇性抑制補體旁路途徑的方法，包括對所述哺乳動物施用有效量的CRIg多肽或其激動劑。全文摘要本發(fā)明關(guān)注最近發(fā)現(xiàn)的巨噬細(xì)胞特異受體CRIg，及其在預(yù)防和治療補體相關(guān)紊亂中的用途，包括補體相關(guān)眼狀況，諸如年齡相關(guān)黃斑變性(AMD)和脈絡(luò)膜新血管形成(CNV)。文檔編號A61P19/02GK101107005SQ200580042653公開日2008年1月16日申請日期2005年10月12日優(yōu)先權(quán)日2004年10月12日發(fā)明者卡里姆·Y·赫爾米,奧德麗·戈達(dá)德,奧斯汀·L·格尼,威廉·I·伍德,小肯尼思·J·卡奇克,方湘文,門諾·V·盧克倫,阿維·阿什克納齊申請人:健泰科生物技術(shù)公司