專利名稱：：一種二萜類抗腫瘤化合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，是一種從海洋動(dòng)物海綿中分離得到的二砲類抗腫瘤化合物d晶(A,及其制備方法。
背景技術(shù)：
：海綿是一種海洋動(dòng)物，其生活環(huán)境具有低溫，高壓，高鹽等特點(diǎn)。本申請(qǐng)人曾從細(xì)薄星海綿中分離到幾種具有抗腫瘤活性的三萜類化合物并已申請(qǐng)專利(申請(qǐng)?zhí)?00710042653.6)。但至今未見(jiàn)從海綿中分離到具有抗腫瘤活性的二萜類化合物UH:"仏的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供一種從生長(zhǎng)于我國(guó)西沙海域的海綿中提取分離到的二萜類抗腫瘤化合物(7R)-2-甲氧基-5，7-二甲基-7-[(lS，3E)-l-乙基-3-己烯]-l-氧代-2，5-二烯-4-庚酮，分子式為C19H3。03，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式為〇。本發(fā)明化合物的制備方法如下l.制備總浸膏；按常規(guī)將新鮮的海綿用丙酮和甲醇以1:00:1比例混合的混合溶液分次進(jìn)行超聲提取或滲漉提取，至提取液無(wú)色，合并提取液，減壓回收丙酮和/或甲醇后，加入乙酸乙酯萃取，減壓回收乙酸乙酯，得總浸膏；2.純化將總浸膏溶于85%95%甲醇，用石油醚萃取，棄去石油醚層；調(diào)整甲醇濃度至60%70%，用二氯甲烷萃取，回收二氯甲焼，將所得的浸膏濃縮至干；用體積比為1:1的二氯甲垸/甲醇或者體積比為4:5:1的正己垸/二氯甲烷/甲醇混合溶劑將浸膏溶解，過(guò)SephandexLH20凝膠柱，用體積比為1:1的二氯甲烷/甲醇或者4:5:1的正己烷/二氯甲烷/甲醇混合溶劑洗脫，根據(jù)薄層色譜的監(jiān)測(cè)，收集含有化合物UH:,。0:,的流分，回收溶劑濃縮至干；過(guò)200400目的正相硅膠柱，以體積比為l:00:l石油醚/乙酸乙酯混合溶劑棵度洗脫，根據(jù)薄層色譜的監(jiān)測(cè)，收集含d晶。0:,的流分，再過(guò)ODS反相柱，以體積比為l:10:1的甲醇/水混合溶劑梯度洗脫，根據(jù)薄層色譜的監(jiān)測(cè)，收集含有化合物C19H:,。03的流分；再經(jīng)反相高效液相色譜分離，以甲醇水的體積比為7:38.5:1.5的混合溶劑進(jìn)行洗脫，根據(jù)薄層色譜的監(jiān)測(cè)，收集含有UH3。03的流分并減壓濃縮，得純化合物CI9H3。03。本發(fā)明化合物C,晶必,為無(wú)色液體，在電噴霧離子質(zhì)譜(ESI-MS)中出現(xiàn)329[M+Na]+，330[M++Na+H]+和635[2M+Na]+準(zhǔn)分子離子峰;紫外光譜入，(MeOH)二287.6nm，^和3C核磁共振數(shù)據(jù)見(jiàn)表1，從而確定了它的化學(xué)結(jié)構(gòu)。表1.C19H3。03的^和13C核磁共振數(shù)據(jù)表<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>本發(fā)明使用上海天甲生物有限公司提供的腫瘤細(xì)胞株H印G2(人肝癌細(xì)胞株)，Bcap-37(人結(jié)腸癌細(xì)胞株)，H460(人肺癌細(xì)胞株)，HT-29(人結(jié)腸癌細(xì)胞株)，對(duì)化合物UH3。03進(jìn)行體外抗腫瘤試驗(yàn)，表明其具有明顯的抑制腫瘤的活性，因此本發(fā)明化合物可以用于制備抗腫瘤藥物。具體實(shí)施例方式現(xiàn)結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)描述，但保護(hù)范圍不局限于如下實(shí)施例。實(shí)施例l從海綿中制備化合物d9H3。03選擇生長(zhǎng)于中國(guó)海南西沙海域的海綿1500克，洗凈，剪碎，分別用IOOO毫升的甲醇超聲提取三次，直至提取液為無(wú)色，合并提取液，減壓回收甲醇；加入乙酸乙酯萃取三次，每次1000毫升，合并萃取液，減壓回收乙酸乙酯，得總浸膏；將總浸膏溶于1000毫升90%甲醇，用石油醚萃取三次，每次1000毫升，棄去石油醚層，調(diào)整甲醇濃度至60%;用二氯甲烷萃取三次，每次1000毫升，合并萃取液，回收二氯甲烷，將所得的浸膏濃縮至干；加入體積比1:1的二氯甲烷/甲醇混合溶劑5毫升溶解，過(guò)S印hadexLH20凝膠柱，用流動(dòng)相體積比為1:1的二氯甲烷/甲醇混合溶劑洗脫，根據(jù)薄層色譜監(jiān)測(cè)，收集含UH:,。03流分，以真空減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收溶劑濃縮至干，得到浸膏10克；將浸膏過(guò)200目正相硅膠柱進(jìn)行色譜分離，以石油醚丙酮的體積比為50:15:1的混合溶劑進(jìn)行梯度洗脫，根據(jù)薄層色譜監(jiān)測(cè)，收集含Cl9H3Q03的流分，再經(jīng)反相高效液相色譜進(jìn)行分離，以甲醇水體積比為80:20的混合溶劑進(jìn)行洗脫，根據(jù)薄層色譜監(jiān)測(cè)，收集含UFUU勺流分。以真空減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后，得純化合物C19H3。0316.O毫克。實(shí)施例2從海綿中制備化合物C19H3。03選擇生長(zhǎng)于中國(guó)海南西沙海域的海綿1500克，洗凈，剪碎，用1000毫升的丙酮超聲提取三次，直至提取液為無(wú)色，合并提取液，減壓回收甲醇；加入二氯甲烷萃取三次，每次1000毫升，合并萃取液，減壓回收二氯甲烷，得總浸膏；將總浸膏溶于1000毫升95%甲醇，用石油醚萃取三次，每次1000毫升，棄去石油醚層，調(diào)整甲醇濃度至65%;用二氯甲垸萃取三次，每次1000毫升，合并萃取液，回收二氯甲烷，將所得的浸膏濃縮至干；加入體積比4:5:l的正己垸/二氯甲垸/甲醇混合溶劑5毫升溶解，過(guò)S印hadexLH20凝膠柱，用流動(dòng)相體積比為4:5:1的正己烷/二氯甲烷/甲醇混合溶劑洗脫，收集含化合物C19H3。03的流分，以真空減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收溶劑濃縮至干，得到浸膏9克，將浸膏過(guò)300目正相硅膠柱進(jìn)行色譜分離，以石油醚丙酮的體積比為50:l5:1的混合溶劑進(jìn)行梯度洗脫，根據(jù)薄層色譜監(jiān)測(cè)，收集含d9H3。0:,的流分，再經(jīng)反相高效液相色譜進(jìn)行分離，以甲醇水體積比為77:23的混合溶劑進(jìn)行洗脫，根據(jù)薄層色譜監(jiān)測(cè)，收集含C19H3。03的流分。以真空減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后，得純化合物d晶。03l5.3毫克。實(shí)施例3從海綿中制備化合物C19H3Q03選擇生長(zhǎng)于中國(guó)海南西沙海域的海綿1500克，洗凈，剪碎，用95%乙醇滲漉提取，直至提取液為無(wú)色，將提取液減壓回收乙醇；加入乙酸乙酯萃取三次，每次1000毫升，合并萃取液，減壓回收乙酸乙酯，得總浸膏；將總浸膏溶于1000毫升95%甲醇，用石油醚萃取三次，每次1000毫升，棄去石油醚層，調(diào)整甲醇濃度至65%;用二氯甲垸萃取三次，每次1000毫升，回收二氯甲烷，將所得的浸膏濃縮至干；加入體積比4:5:1的正己烷/二氯甲垸/甲醇混合溶劑5毫升溶解，過(guò)S印hadexLH20凝膠柱，用流動(dòng)相體積比為4:5:1的正己烷/二氯甲烷/甲醇混合溶劑洗脫，根據(jù)薄層色譜監(jiān)測(cè)，收集含化合物C19H3。03的流分，以真空減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收溶劑濃縮至干，得到浸膏9克；將浸膏過(guò)400目正相硅膠柱進(jìn)行色譜分離，以石油醚乙酸乙酯的體積比為50:l5:1的混合溶劑進(jìn)行梯度洗脫，根據(jù)薄層色譜監(jiān)測(cè)，收集含UH3。03的流分；再經(jīng)反相高效液相色譜進(jìn)行分離，以甲醇水體積比為75:25的混合溶劑進(jìn)行洗脫，根據(jù)薄層色譜監(jiān)測(cè)，收集含d晶。0:,的流分；以真空減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮得純化合物C19H3(A15.0毫克。體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)本發(fā)明對(duì)化合物Cl9HM03進(jìn)行了體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)使用的腫瘤細(xì)胞株為上海天甲生物有限公司提供的H印G2(人肝癌細(xì)胞株)、Bcap-37(人結(jié)腸癌細(xì)胞株)、H460(人肺癌細(xì)胞株)和HT-29(人結(jié)腸癌細(xì)胞株)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明化合物Cl9H3。0:s具有明顯的抑制腫瘤的活性，因此口」'以用于制備抗腫瘤藥物。實(shí)驗(yàn)方法采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法，臺(tái)盼蘭染色法(Mwh,/!;5b"&'e2^",,'5"Ae/a仏尸.eta丄/.TVa".Cs;cer.i/sLJ9W,《3757—66)。實(shí)驗(yàn)分3組空白對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組和本發(fā)明化合物G晶。03組。陽(yáng)性對(duì)照藥為長(zhǎng)春新堿。將本發(fā)明化合物和陽(yáng)性對(duì)照藥分別用DMSO溶解，配成IOO，50，25，12.5，6.25，3.125(微克/毫升)6種濃度，細(xì)胞先按常規(guī)以10%的小牛血清培養(yǎng)，傳代時(shí)貼壁細(xì)胞以0.2%的胰酶消化液消化。使細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，實(shí)驗(yàn)時(shí)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔接種180微升，濃度為5X104個(gè)/毫升的細(xì)胞懸液。于37。C的C02培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)過(guò)夜。預(yù)培養(yǎng)后，每孔加20微升藥物溶液，空白對(duì)照組加20微升DMS0，每種濃度重復(fù)5孔。藥物作用細(xì)胞3天后進(jìn)行MTT法測(cè)定，于96孔培養(yǎng)板每孔加入濃度為5毫克/毫升的MTT工作液10微升，37。C孵育4小時(shí)，棄上清液，加IOO微升DMSO，在570納米波長(zhǎng)下用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值。臺(tái)盼蘭排染法，加入臺(tái)盼蘭工作液，計(jì)數(shù)活細(xì)胞。按下列公式計(jì)算被測(cè)物對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率對(duì)照組細(xì)胞數(shù)一用藥組細(xì)胞數(shù)~"對(duì)照組細(xì)胞數(shù)半數(shù)有效抑制濃度IC5。值采用Logit法計(jì)算。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2表2.UH3。03對(duì)腫瘤細(xì)胞的半數(shù)有效抑制濃度(ug/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明化合物d孔。03對(duì)四種不同的腫瘤細(xì)胞株均顯示明顯抑制作用，因此可以用于制備抗腫瘤藥物。本發(fā)明為研制新的抗腫瘤藥物提供了新的先導(dǎo)化合物，為開發(fā)利中國(guó)的海洋藥用生物資源具有重要意義。權(quán)利要求1.一種二萜類抗腫瘤化合物，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下2.權(quán)利要求1所述抗腫瘤化合物的制備方法，步驟如下1)提取總浸膏將新鮮的海綿用丙酮和甲醇以體積比為1:00:1混合溶劑分次進(jìn)行超聲提取或滲漉提取，至提取液無(wú)色，合并提取液，減壓回收丙酮和/或甲醇，加入乙酸乙酯萃取，減壓回收乙酸乙酯，得總浸膏；2)純化將總浸膏溶于85%95%甲醇，用石油醚萃取，棄去石油醚層；調(diào)整甲醇濃度至60%70%，用二氯甲垸萃取，回收二氯甲院，將所得的浸膏濃縮至干；用體積比為1:1的二氯甲烷/甲醇或者體積比為4:5:1的正己烷/二氯甲垸/甲醇混合溶劑將浸膏溶解，過(guò)SephandexLH20凝膠柱，用體積比為1:1的二氯甲烷/甲醇或者4:5:1的正己烷/二氯甲烷/甲醇混合溶劑洗脫，根據(jù)薄層色譜的監(jiān)測(cè)，收集含有化合物C,9H3。03的流分，回收溶劑濃縮至干；過(guò)200400目的正相硅膠柱，以體積比為l:00:l石油醚/乙酸乙酯泡合溶劑梯度洗脫，根據(jù)薄層色譜的監(jiān)測(cè)，收集含C,9H3。03的流分，再過(guò)ODS反相柱，以體積比為l:10:i的甲醇/水混合溶劑梯度洗脫，根據(jù)薄層色譜的監(jiān)測(cè)，收集含有化合物clsao3的流分；再經(jīng)反相高效液相色譜分離，以甲醇水的體積比為7:38.5:1.5的混合溶劑進(jìn)行洗脫，根據(jù)薄層色譜的監(jiān)測(cè)，收集含有UH3。03的流分并減壓濃縮，得純二萜類化合物C^H3。03。3.按權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，提取總浸膏時(shí)，新鮮海綿用丙酮或甲醇分3次提?。患兓瘯r(shí)，總浸膏溶于90%甲醇，再用石油醚萃取，棄去石油醚層，調(diào)整甲醇濃度至60%，用二氯甲烷萃取，回收二氯甲垸，將所得的浸膏濃縮至干；過(guò)正相硅膠柱時(shí)，所用的是300目正相硅膠柱。4.權(quán)利要求1所述化合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體為從中國(guó)海綿中分離得到的一個(gè)具有抗腫瘤活性的二萜類化合物(7R)-2-甲氧基-5，7-二甲基-7-[(1S，3E)-1-乙基-3-己烯]-1-氧代-2，5-二烯-4-庚酮，結(jié)構(gòu)式如上，體外抗腫瘤試驗(yàn)表明，該化合物對(duì)HepG2人肝癌細(xì)胞和Bcap-37人結(jié)腸癌細(xì)胞等4種腫瘤細(xì)胞株有明顯的抑制作用。本發(fā)明可為研制新的抗腫瘤藥物提供先導(dǎo)化合物，對(duì)開發(fā)利用中國(guó)的海洋藥用資源具有重要價(jià)值。文檔編號(hào)C07D313/00GK101445499SQ20081020763公開日2009年6月3日申請(qǐng)日期2008年12月25日優(yōu)先權(quán)日2008年12月25日發(fā)明者張紅軍,樸淑娟,帆楊,林厚文,許誠(chéng)成,陳萬(wàn)生,陳建濤申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)