專利名稱：牛輪狀病毒重組vp6蛋白抗原及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種牛輪狀病毒重組蛋白抗原及其制備方法。
背景技術(shù)：
牛輪狀病毒(Bovine Rotavirus, BRA)又稱犢牛腹瀉病毒(Calf diarrhea virus),屬于呼腸孤病毒科(及eov/W^^)輪狀病毒屬(i otov/n/力。牛輪狀病毒主要 感染1 7日齡的犢牛，可引起犢牛消化道機(jī)能紊亂，臨床上以嘔吐、腹瀉、脫 水和酸堿平衡紊亂為特征，感染牛常發(fā)生死亡，病死率可達(dá)50%。由于牛輪狀 病毒具有流行廣、發(fā)病率高、危害大的特點(diǎn)，現(xiàn)己發(fā)展成為一種世界性疾病。
牛輪狀病毒的傳統(tǒng)診斷方法常根據(jù)流行病學(xué)和臨床表現(xiàn)作為初步診斷的 依據(jù)。但由于牛的輪狀病毒和牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus, BVDV)常常混合感染，且在流行病學(xué)和癥狀上很難區(qū)別，因此必須依靠病毒 分離和血清學(xué)實(shí)驗(yàn)才能最后確診。
1968年美國(guó)Nebraska州Mebus等人用電鏡從新生犢牛腹瀉糞便中檢測(cè)到 了輪狀病毒，證明為新生犢牛腹瀉的病原，并命名為NCDV株(Nebmska calf diarrhea Virus, NCDV)。隨后，歐、美各國(guó)以及澳大利業(yè)、新西蘭和日本等都 發(fā)現(xiàn)了輪狀病毒引起的犢牛腹瀉。此外，人們逐漸發(fā)現(xiàn)，將近一半的新生犢牛 腹瀉與輪狀病毒感染有關(guān)。
快速準(zhǔn)確的疫病診斷是防治犢牛輪狀病毒腹瀉的重要前提。而目前我國(guó)還 沒(méi)有一套行之有效的防治辦法。在臨床診斷上對(duì)可疑病料進(jìn)行病毒分離與鑒定 是本病最為直接的診斷方法，但分離病毒需一定的條件和相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間，因此， 目前病毒分離診斷方法存在著費(fèi)時(shí)、費(fèi)力又不能快速診斷的弊端。采用分子生 物學(xué)的RT-PCR方法是診斷犢牛輪狀病毒腹瀉目前常應(yīng)用的方法，具有特異性 強(qiáng)及靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)；但該方法需要病毒核酸提取，反轉(zhuǎn)錄過(guò)程及PCR反應(yīng) 等，過(guò)程繁瑣，同時(shí)又需要昂貴的分子生物學(xué)試劑及相應(yīng)的儀器設(shè)備等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了解決目前對(duì)犢牛輪狀病毒腹瀉沒(méi)有行之有效的防治
辦法，且采用病毒分離的診斷方法存在著費(fèi)時(shí)、費(fèi)力又不能快速診斷的弊端，
以及采用分子生物學(xué)的RT-PCR方法過(guò)程繁瑣、又需要昂貴的分子生物學(xué)試劑 及相應(yīng)的儀器設(shè)備等問(wèn)題，而提供的一種牛輪狀病毒重組VP6蛋白抗原及其 制備方法。
本發(fā)明牛輪狀病毒重組VP6蛋白抗原由重組載體質(zhì)粒pProEXHTa轉(zhuǎn)化的 大腸桿菌Rosetta(DE3)菌株表達(dá)；其中重組載體質(zhì)粒pProEXHTa中基因克隆 有牛輪狀病毒NCDV株VP6基因。
本發(fā)明上述牛輪狀病毒重組VP6蛋白抗原按以下步驟制備 一、提取牛 輪狀病毒NCDV株病毒核酸，然后以牛輪狀病毒NCDV株VP6基因的下游引 物P2進(jìn)行病毒基因組cDNA的合成，再用牛輪狀病毒NCDV株VP6基因的 上游引物Pl和下游引物P2進(jìn)行VP6基因的PCR擴(kuò)增；二、將擴(kuò)增得到的 VP6基因亞克隆至pMD18-T載體中，再經(jīng)5awffl和5WI雙酶切后克隆到原核 表達(dá)載體質(zhì)粒pProEXHTa中，獲得重組質(zhì)粒pPro-VP6;三、用重組質(zhì)粒 pPro-VP6轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta(DE3)，得到重組菌pPro-VP6/Rosetta(DE3);四、 重組VP6蛋白抗原的誘導(dǎo)表達(dá)；五、純化，即得到牛輪狀病毒重組VP6蛋白 抗原。
本發(fā)明為血清學(xué)方法診斷犢牛輪狀病毒腹瀉提供了診斷抗原，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明 本發(fā)明牛輪狀病毒重組VP6蛋白抗原具有極強(qiáng)的特異性和準(zhǔn)確性，能被抗血 清所識(shí)別。因此，使用本發(fā)明牛輪狀病毒重組VP6蛋白抗原、采用熒光抗體 試驗(yàn)和酶聯(lián)免疫吸附等血清學(xué)試驗(yàn)就可以克服病毒分離和RT-PCR法存在的問(wèn) 題，具有診斷方法省時(shí)、省力、快速的優(yōu)點(diǎn)，而且不需要昂貴的分子生物學(xué)試 劑及相應(yīng)的儀器設(shè)備。
本發(fā)明以大腸桿菌作為傳遞抗原的載體進(jìn)行牛輪狀病毒重組VP6蛋白， 設(shè)計(jì)了以編碼牛輪狀病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白VP6蛋白基因片斷為耙基因，構(gòu)建了 表達(dá)牛輪狀病毒VP6蛋白的重組原核表達(dá)系統(tǒng)，克服了抗原排毒、散毒的潛 在危險(xiǎn)。
同時(shí)本發(fā)明牛輪狀病毒重組VP6蛋白抗原為防治犢牛輪狀病毒腹渾奠定 了物質(zhì)基礎(chǔ)。
本發(fā)明表達(dá)牛輪狀病毒VP6蛋白重組大腸桿菌pPro-VP6/Rosetta(DE3)屬
于埃希氏菌屬(&c/zen'c^a)，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保 藏地址是武漢大學(xué)，保藏日期為2008年09月02日，保藏號(hào)為CCTCC M 208124。


圖l是具體實(shí)施方式
八中PCR鑒定結(jié)果圖；圖2是具體實(shí)施方式
八中步 驟四誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE鑒定結(jié)果圖；圖3是具體實(shí)施方式
八產(chǎn) 物Western-blot鑒定結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實(shí)施方式
，還包括各具體實(shí)施方 式間的任意組合。
具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式牛輪狀病毒重組VP6蛋白抗原由重組載體 質(zhì)粒pProEXHTa轉(zhuǎn)化的大腸桿菌Rosetta(DE3)菌株表達(dá)；其中重組載體質(zhì)粒 pProEXHTa中基因克隆有牛輪狀病毒NCDV株VP6基因。
本實(shí)施方式牛輪狀病毒重組VP6蛋白抗原蛋白分子質(zhì)量約為50ku，并能 激發(fā)較強(qiáng)的免疫應(yīng)答。
具體實(shí)施方式
二本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是牛輪狀病毒 重組VP6蛋白抗原完整的開放讀碼框的基因序列如SEQ ID NO: 1所示。其 它與實(shí)施方式一相同。
具體實(shí)施方式
三本實(shí)施方式牛輪狀病毒重組VP6蛋白抗原按以下步驟 制備 一、提取牛輪狀病毒NCDV株病毒核酸，然后以牛輪狀病毒NCDV株 VP6基因的下游引物P2進(jìn)行病毒基因組cDNA的合成，再用牛輪狀病毒NCDV 株VP6基因的上游引物Pl和下游引物P2進(jìn)行VP6基因的PCR擴(kuò)增；二、將 擴(kuò)增得到的VP6基因亞克隆至pMD18-T載體中，再經(jīng)BamHI和Sa/I雙酶切 后克隆到原核表達(dá)載體質(zhì)粒pProEXHTa中，獲得重組質(zhì)粒pPro-VP6;三、用 重組質(zhì)粒pPro-VP6轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta(DE3)，得到重組菌 pPro-VP6/Rosetta(DE3);四、重組VP6蛋白抗原的誘導(dǎo)表達(dá)；五、純化，即得 到牛輪狀病毒重組VP6蛋白抗原。
本實(shí)施方式中使用的藥品、試劑、酶、感受態(tài)細(xì)胞和質(zhì)粒等均容易購(gòu)得， 若無(wú)特殊要求則濃度為產(chǎn)品標(biāo)注濃度。本實(shí)施方式中的操作步驟參見試劑盒使
用操作手冊(cè)。
具體實(shí)施方式
四本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
三的不同點(diǎn)是步驟一中牛 輪狀病毒NCDV株VP6基因的上、下游引物的基因序列為
上游引物PI: 5，-GGATCCTTGGCTTTTAAACGAAGTCTT-3，，
下游引物P2: 5'-GTCGACAATACCTAGACGCATCCTT-3'。其它步驟及參 數(shù)與實(shí)施方式三相同。
具體實(shí)施方式
五本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
三的不同點(diǎn)是步驟一中 VP6基因的擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系為25(iL:水14.5jxL、 cDNA2.5^iL、 10XBuffer 2.5pL、 dNTP 4.0pL、 10OD引物上游1.0|xL、 10OD引物下游I.OjiL和rTaq 酶0.25^L; PCR反應(yīng)條件:95。C預(yù)變性5 min， 94。C變性30s、 48'C退火30s、 72。C延伸50s、 30個(gè)循環(huán)，72'C延伸5min。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式三相 同。
具體實(shí)施方式
六本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
三的不同點(diǎn)是步驟四重組 VP6蛋白抗原的誘導(dǎo)表達(dá)按以下步驟進(jìn)行a、將重組菌pPro-VP6/Rosetta(DE3) 接種于氨芐青霉素濃度為100ng/mL的LB液體培養(yǎng)基，置于37'C環(huán)境中振蕩 搖床培養(yǎng)過(guò)夜；b、將10mL過(guò)夜培養(yǎng)液接種于500mL氨芐青霉素濃度為 100pg/mL的LB液體培養(yǎng)基中，置于37。C、振蕩搖床環(huán)境中培養(yǎng)至OD外o值 達(dá)0.5; c、再加入濃度為lmol/L的異丙基-P-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至LB 液體培養(yǎng)基中異丙基-P-D-硫代半乳糖苷的終濃度為0.6 mmol/L，然后置于37 。C、振蕩搖床環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)至OD590值達(dá)1.0。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式 三相同。
具體實(shí)施方式
七本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
三的不同點(diǎn)是步驟五純化 按以下步驟進(jìn)行a、將N產(chǎn)-NTA凝膠介質(zhì)加入層析柱，然后用去離子水洗柱, 再用Buffer A溶液洗柱；b、步驟四誘導(dǎo)表達(dá)后的培養(yǎng)液在10000g/min的條件 下離心20min，棄去上清液，沉淀菌體用Buffer A溶液溶解、室溫環(huán)境攪拌lh， 再在4'C條件下繼續(xù)攪拌過(guò)夜；c、在4。C、 20000g/min的條件下離心40min， 取上清液以0.5mL/min的流速加入到Ni-NTA層析柱中，用Buffer B以 0.5mL/min的流速洗滌層析柱，收集洗脫液，即完成純化。其它步驟及參數(shù)與 實(shí)施方式三相同。
本實(shí)施方式Buffer A溶液能夠裂解菌體，溶解沉淀。
具體實(shí)施方式
八本實(shí)施方式牛輪狀病毒重組VP6蛋白抗原按以下步驟 制備 一、提取牛輪狀病毒NCDV株病毒核酸，然后以牛輪狀病毒NCDV株 VP6基因的下游引物P2進(jìn)行病毒基因組cDNA的合成，再用牛輪狀病毒NCDV 株VP6基因的上游引物Pl和下游引物P2進(jìn)行VP6基因的PCR擴(kuò)增；二、將 擴(kuò)增得到的VP6基因亞克隆至pMD18-T載體中，再經(jīng)5amffl和Sa/I雙酶切 后克隆到原核表達(dá)載體質(zhì)粒pProEXHTa中，獲得重組質(zhì)粒pPro-VP6;三、用 重組質(zhì)粒pPro-VP6轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta(DE3)， 得到重組菌 pPro-VP6/Rosetta(DE3);四、重組VP6蛋白抗原的誘導(dǎo)表達(dá)；五、純化，即得 到牛輪狀病毒重組VP6蛋白抗原；其中步驟一中牛輪狀病毒NCDV株VP6基 因的上、下游引物的基因序列為
上游引物Pl: 5，-GGATCCTTGGCTTTTAAACGAAGTCTT-3，，
下游引物P2: 5'畫GTCGACAATACCTAGACGCATCCTT-3，；
步驟一中VP6基因的擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系為25^L:水14.5mL、cDNA2.5^iL、 10XBuffer2.5^iL、 dNTP4.0nL、 10OD引物上游1.0pL、 10OD引物下游l.O^L 和rTaq酶0.25pL; PCR反應(yīng)條件95°C預(yù)變性5 min， 94。C變性30s、 48°C 退火30s、 72。C延伸50s、 30個(gè)循環(huán)，72。C延伸5min;
步驟四重組VP6蛋白抗原的誘導(dǎo)表達(dá)按以下步驟進(jìn)行a、將重組菌 pPro-VP6/Rosetta(DE3)接種于氨芐青霉素濃度為lOO^ig/mL的LB液體培養(yǎng) 基，置于37'C環(huán)境中振蕩搖床培養(yǎng)過(guò)夜；b、將10mL過(guò)夜培養(yǎng)液接種于500rnL 氨芐青霉素濃度為10(Hig/mL的LB液體培養(yǎng)基中，置于37。C、振蕩搖床環(huán)境 中培養(yǎng)至0059()值達(dá)0.5; c、再加入濃度為lmol/L的異丙基-P-D-硫代半乳糖 苷(IPTG)至LB液體培養(yǎng)基中異丙基-p-D-硫代半乳糖苷的終濃度為0.6 mmol/L，然后置于37。C、振蕩搖床環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)至00590值達(dá)1.0;
步驟五純化按以下步驟進(jìn)行a、將N產(chǎn)-NTA凝膠介質(zhì)加入層析柱，然后 用去離子水洗柱，再用Buffer A溶液洗柱；b、步驟四誘導(dǎo)表達(dá)后的培養(yǎng)液在 10000g/min的條件下離心20min，棄去上清液，沉淀菌體用Buffer A溶液溶解、 室溫環(huán)境攪拌lh，再在4。C條件下繼續(xù)攪拌過(guò)夜；c、在4。C、 20000g/min的 條件下離心40min，取上清液以0.5mL/min的流速加入到Ni-NTA層析柱中，
用Buffer B以0.5mL/min的流速洗滌層析柱，收集洗脫液，即完成純化。
本實(shí)施方式中使用的藥品、試劑、酶、感受態(tài)細(xì)胞和質(zhì)粒等均容易購(gòu)得， 若無(wú)特殊要求則濃度為產(chǎn)品標(biāo)注濃度。本實(shí)施方式中的操作步驟參見試劑盒使 用操作手冊(cè)。
本實(shí)施方式步驟二中經(jīng)5amffl和Sa/1雙酶切的VP6基因片段(約1.3kb) 與經(jīng)S"wffl和^SWT雙酶切的質(zhì)粒pProEXHTa片段連接；然后通過(guò)步驟三轉(zhuǎn)化 大腸桿菌Rosetta(DE3)進(jìn)行表達(dá)。進(jìn)行陽(yáng)性重組質(zhì)粒單酶切、雙酶切和PCR 鑒定，鑒定結(jié)果如圖1所示；圖1中"1"泳道標(biāo)樣為PCR擴(kuò)增獲得的VP6 基因片段(大小約1300bp)， "2"泳道標(biāo)樣為質(zhì)粒pProEXHTa經(jīng)BamHI單酶 切獲得的基因片段(大小約3900bp),"3"泳道標(biāo)樣為質(zhì)粒pProEXHTa經(jīng)BawHI 和5WI雙酶切獲得的基因片段(大小分別約2600bp和1300bp)， "4"和"8" 泳道標(biāo)樣為Marker, "5"泳道標(biāo)樣為以重組質(zhì)粒pPro-VP6為模板、Pl和P2 為引物PCR擴(kuò)增獲得的基因片段(大小約1300bp)——本實(shí)施方式目的基因 片段，"6"泳道標(biāo)樣為重組質(zhì)粒pPro-VP6經(jīng)BamHI單酶切獲得的基因片段 (大小約6100bp)， "7"泳道標(biāo)樣為重組質(zhì)粒pPro-VP6經(jīng)5amffl和Sa/I雙 酶切獲得的基因片段(大小分別約4800bp和1300bp)。鑒定結(jié)果說(shuō)明VP6基 因已插入到表達(dá)載體質(zhì)粒中，成功獲得陽(yáng)性重組菌pPro-VP6/ Rosetta(DE3)菌 株。
對(duì)本實(shí)施方式步驟四誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE鑒定，鑒定結(jié)果如 圖2所示；圖2中"1"泳道標(biāo)樣為標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量(97kD-14kD)， "2"泳道 標(biāo)樣為未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的pPro-VP6/Rosetta(DE3)菌體蛋白，"3"泳道標(biāo)樣為 經(jīng)IPTG誘導(dǎo)lh的pPro-VP6/ Rosetta(DE3)菌體蛋白，"4"泳道標(biāo)樣為經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)3h的pPro-VP6/ Rosetta(DE3)菌體蛋白，"5"泳道標(biāo)樣為經(jīng)IPTG誘導(dǎo) 5h的pPro-VP6/Rosetta(DE3)菌體蛋白，圖2中箭頭所示蛋白帶約51 kD。
將本實(shí)施方式步驟五純化后的產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)印NC膜，再分 別與鼠源抗NCDV高免血清和羊抗鼠IgG/HRP作用，Western-blot鑒定對(duì)比實(shí) 驗(yàn)結(jié)果如圖3所示；圖3中"1"泳道標(biāo)樣為未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的 pPro-VP6/Rosetta(DE3)菌體蛋白，"2 "泳道標(biāo)樣為經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的 pPro-VP6/Rosetta(DE3)菌體蛋白，"3"泳道標(biāo)樣為IPTG誘導(dǎo)的含質(zhì)粒
pProEXHTa的菌體蛋白；實(shí)驗(yàn)結(jié)果是"1"和"3"泳道都未出現(xiàn)預(yù)期的反應(yīng) 帶，"2"泳道在預(yù)期位置(分子量50KD左右)出現(xiàn)明顯的反應(yīng)帶，實(shí)驗(yàn)結(jié) 果說(shuō)明目的蛋白獲得了有效表達(dá)，表達(dá)的蛋白能被抗血清所識(shí)別，本實(shí)施方式 獲得的重組抗原具有良好的抗原反應(yīng)性。
采用病毒分離診斷和分子生物學(xué)RT-PCR多重診斷方法進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果證 明本實(shí)施方式獲得的牛輪狀病毒重組VP6蛋白抗原對(duì)牛輪狀病毒引發(fā)的犢牛 輪狀病毒腹瀉的診斷準(zhǔn)確率高達(dá)90%以上。
序列表
〈110〉東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
<120>牛輪狀病毒重組VP6蛋白抗原及其制備方法
<勝3
〈210> 1 <211> 1269 <212> ■
<213>牛輪狀病毒(bovine rotavirus, BRV)
<400> 1
atggatgtcctgtactccttgtc犯犯actcttaaagatgaattgtcgaa60
ggcacattatactcc犯tgtaagtgatctaattcaac犯ttt犯tc犯atgat肪ttact120
atg犯tgg幼atgagttccei犯Ctgg鄉(xiāng)3attggtaatctaccgatteigaaattggaat180
tttgattttggattacttggcta^ttt3gatgctaactacgtcgaaacg240
gcccgcaatacaattgattattttgtagattttgtagataatgtatgtatggacgeiaatg300
gttagagaattgg犯ttgcaccacaatcagattcacttag360
ggcattaaattta幼ag犯t犯6lttttgeLCaattcatcagaatacatagagaactggaat420
ttgcaaaatageiageicsL肌g犯cgggttttacatttcatatttcccttat480
tcagcttcattcacgttgaacagatcacaaccggctcatgataacttgatgggta^cgatg540
tggctc犯tgcgggatc卿aattcaggtcgctggattcgactactcatgtgcaa/taaac600
gCgCC3gCt8atttgagcatattgtacagcttcg^gggtgttgactaca660
ctcttttaccag3tgcaggiaagatttagttttccaagagtgatteiattca720
gctgacggagcgactacatggtacttc犯tccagtgattctaacgttgaa780
atagagtttct3ctas3Cggaatacttacctgg幼cgstc840
atagctag犯attttgatac^ttagattgtcatttcagttgatgagacc3ccaa3tatg900
acaccagcggtagcggcgttatttcca肪tgcgcagccatttg犯catcacgcaac￡igta960
ggactcacgcttsga3ttga3tCtgC3gtttgtg幼tC3gtacttgccgacgc肪gcg朋1020
caaatgtgaca/tctgttagacaag犯tacgcgatacceigttggaccagtt1080
tttccaccaggtatgaattggactgatttgattceiccatct卿gaggat1140
aacttgcagcgtg城ttac蹄tggcttccattagaagcatgcttgtc朋1200
6Lgctaaccacttggtatccgactttggtgagtatgtagctacgtcaagctgtttgaactc函
tgtaagtaa 1269
<210> 2 〈211> 27 <212> DNA <213>人工序列
〈220>
〈223>牛輪狀病毒NCDV株VP6基因的上游引物P1。 〈400〉 2
ggatccttgg cttttaaacg aagtctt 27
<210〉 3 〈211〉 25 〈212> DNA <213〉人工序列
〈220〉
<223〉牛輪狀病毒NCDV株VP6基因的下游引物P2。 〈400〉 3
gtcgacaata cctagacgca tcctt 2權(quán)利要求
1.牛輪狀病毒重組VP6蛋白抗原，其特征在于牛輪狀病毒重組VP6蛋白抗原由重組載體質(zhì)粒pProEXHTa轉(zhuǎn)化的大腸桿菌Rosetta(DE3)菌株表達(dá)；其中重組載體質(zhì)粒pProEXHTa中基因克隆有牛輪狀病毒NCDV株VP6基因。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛輪狀病毒重組VP6蛋白抗原，其特征在于牛 輪狀病毒重組VP6蛋白抗原完整的開放讀碼框的基因序列如下所示ATGGATGTCCTGTACTCCTTGTCAAAAACTCTTAAAGATGCTAGAGA CAAAATTGTCGAAGGCACATTATACTCCAATGTAAGTGATCTAATTCAAC AATTTAATCAAATGATAATTACTATGAATGGAAATGAGTTCCAAACTGGA GGAATTGGTAATCTACCGATTAGAAATTGGAATTTTGATTTTGGATTACTT GGAACAACTCTACTAAATTTAGATGCTAACTACGTCGAAACGGCCCGCAA TACAATTGATTATTTTGTAGATTTTGTAGATAATGTATGTATGGACGAAATG GTTAGAGAATCACAAAGAAATGGAATTGCACCACAATCAGATTCACTTA GAAAGTTATCAGGCATTAAATTTAAAAGAATAAATTTTGACAATTCATCA GAATACATAGAGAACTGGAATTTGCAAAATAGAAGACAAAGaACGGGTT TTACATTTCATAAACCAAACATTTTcCCTTATTCAGCTTCATTCACGTTGAA CAGATCACAACCGGCTCATGATAACTTGATGGGTACGATGTGGCTCAATG CGGGATCAGAAATTCAGGTCGCTGGATTCGACTACTCATGTGCAATAAAC GCGCCAGCTAATACGCAACAATTTGAGCATATTGTACAGCTTCGAAGGGT GTTGACTACAGCTACAATAACTCTTTTACCAGATGCAGAAAGATTTAGTT TTCCAAGAGTGATTAATTCAGCTGACGGAGCGACTACATGGTACTTCAAT CCAGTGATTCTTAGACCAAATAACGTTGAAATAGAGTTTCTACTAAACGG GCAGATAATAAATACTTACCAAGCAaGATTTGGAACGATCATAGCTAGAA ATTTTGATACAATTAGATTGTCATTTCAGTTGATGAGACCACCAAATATGAGTGTATTTACAGTGGCTTCCATTAGAAGCATGCTTGTCAAATGAGGACCA AGCTAACCACTTGGTATCCGACTTTGGTGAGTATGTAGCTACGTCAAGCT GTTTG AACTCTGTAAGTAA 。
3、 如權(quán)利要求1所述牛輪狀病毒重組VP6蛋白抗原的制備方法，其特征 在于牛輪狀病毒重組VP6蛋白抗原按以下步驟制備 一、提取牛輪狀病毒 NCDV株病毒核酸，然后以牛輪狀病毒NCDV株VP6基因的下游引物P2進(jìn) 行病毒基因組cDNA的合成，再用牛輪狀病毒NCDV株VP6基因的上游引物 P1和下游引物P2進(jìn)行VP6基因的PCR擴(kuò)增；二、將擴(kuò)增得到的VP6基因亞 克隆至pMD18-T載體中，再經(jīng)5awHI和&/I雙酶切后克隆到原核表達(dá)載體質(zhì) 粒pProEXHTa中，獲得重組質(zhì)粒pPro-VP6;三、用重組質(zhì)粒pPro-VP6轉(zhuǎn)化 大腸桿菌Rosetta(DE3)，得到重組菌pPro-VP6/Rosetta(DE3);四、重組VP6 蛋白抗原的誘導(dǎo)表達(dá)；五、純化，即得到牛輪狀病毒重組VP6蛋白抗原。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的牛輪狀病毒重組VP6蛋白抗原的制備方法，其 特征在于步驟一中牛輪狀病毒NCDV株VP6基因的上、下游引物的基因序列 為上游引物PI: 5，-GGATCCTTGGCTTTTAAACGAAGTCTT-3，， 下游引物P2: 5'-GTCGACAATACCTAGACGCATCCTT國(guó)3'。
5、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的牛輪狀病毒重組VP6蛋白抗原的制備方法，其 特征在于步驟一中VP6基因的擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系為25^L:水14.5pL、 cDNA 2.5(oL、 10 X Buffer 2.5pL、 dNTP4.0^L、 10OD引物上游1.0^iL、 10OD引物下 游1.0(jL和rTaq酶0.25^iL;PCR反應(yīng)條件95。C預(yù)變性5 min, 94*€變性30s、 48。C退火30s、 72。C延伸50s、 30個(gè)循環(huán)，72。C延伸5min。
6、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的牛輪狀病毒重組VP6蛋白抗原的制備方法，其 特征在于步驟四重組VP6蛋白抗原的誘導(dǎo)表達(dá)按以下步驟進(jìn)行a、將重組菌 pPro-VP6/Rosetta(DE3)接種于氨芐青霉素濃度為lOOpg/mL的LB液體培養(yǎng) 基，置于37'C環(huán)境中振蕩搖床培養(yǎng)過(guò)夜；b、將10mL過(guò)夜培養(yǎng)液接種于500rnL 氨芐青霉素濃度為10(Hig/mL的LB液體培養(yǎng)基中，置于37。C、振蕩搖床環(huán)境 中培養(yǎng)至0059。值達(dá)0.5; c、再加入濃度為lmol/L的異丙基-p-D-硫代半乳糖 苷至LB液體培養(yǎng)基中異丙基-P-D-硫代半乳糖苷的終濃度為0.6 mmol/L，然后置于37°C、振蕩搖床環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)至ODs卯值達(dá)1.0。
7、根據(jù)權(quán)利要求3所述的牛輪狀病毒重組VP6蛋白抗原的制備方法，其 特征在于步驟五純化按以下步驟進(jìn)行a、將N產(chǎn)-NTA凝膠介質(zhì)加入層析柱， 然后用去離子水洗柱，再用Buffer A溶液洗柱；b、步驟四誘導(dǎo)表達(dá)后的培養(yǎng) 液在10000g/min的條件下離心20min，棄去上清液，沉淀菌體用Buffer A溶 液溶解、室溫環(huán)境攪拌lh，再在4X:條件下繼續(xù)攪拌過(guò)夜；c、在4°C、20000g/min 的條件下離心40min，取上清液以0.5mL/min的流速加入到Ni-NTA層析柱中， 用Buffer B以0.5mL/min的流速洗滌層析柱，收集洗脫液，即完成純化。
全文摘要
牛輪狀病毒重組VP6蛋白抗原及其制備方法，它涉及一種牛輪狀病毒重組蛋白抗原及其制備方法。它解決了目前對(duì)犢牛輪狀病毒腹瀉的診斷方法存在著費(fèi)時(shí)、費(fèi)力又不能快速診斷的弊端，以及過(guò)程繁瑣、又需要昂貴的分子生物學(xué)試劑及相應(yīng)的儀器設(shè)備的問(wèn)題。牛輪狀病毒重組VP6蛋白抗原由重組載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌表達(dá)。制備方法一、VP6基因的PCR擴(kuò)增；二、獲得重組質(zhì)粒；三、獲得重組菌；四、重組VP6蛋白抗原的誘導(dǎo)表達(dá)；五、純化。本發(fā)明為血清學(xué)方法診斷犢牛輪狀病毒腹瀉提供了診斷抗原，具有極強(qiáng)的特異性和準(zhǔn)確性。使用本發(fā)明牛輪狀病毒重組VP6蛋白抗原、采用熒光抗體試驗(yàn)和酶聯(lián)免疫吸附等血清學(xué)試驗(yàn)具有診斷方法省時(shí)、省力、快速的優(yōu)點(diǎn)，且不需要昂貴的試劑及設(shè)備。
文檔編號(hào)C07K14/005GK101367870SQ20081013727
公開日2009年2月18日 申請(qǐng)日期2008年10月9日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月9日
發(fā)明者唐麗杰, 李一經(jīng), 葛俊偉, 馬廣鵬 申請(qǐng)人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)