專利名稱：：測定病毒粒子/病毒抗原濃度的方法測定病毒粒子/病毒抗原濃度的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明提供了一種測定樣品中病毒粒子/病毒抗原濃度的方法。具體地說，本發(fā)明涉及測定樣品中流感病毒粒子/流感病毒抗原的濃度。本發(fā)明還涉及離子交換基質(zhì)在測定樣品中病毒粒子和/或病毒抗原濃度中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：在制備抗病毒相關(guān)疾病的疫苗時通常需要大量病毒。因此要在合適的宿主系統(tǒng)中以高產(chǎn)率生產(chǎn)各種病毒?，F(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)描述了一些增殖和培養(yǎng)病毒的方法。使病毒增殖的常規(guī)方法包括，例如，在原代細(xì)胞或者甚至在更加復(fù)雜的細(xì)胞培養(yǎng)物系統(tǒng)中培養(yǎng)病毒。例如，流感疫苗可來源于采用具胚雞蛋的病毒增殖培養(yǎng)物。在這些培養(yǎng)物中，從受感染雞蛋的尿囊液中分離病毒，而用作疫苗的抗原為完整或不完整病毒顆粒的形式。一些病毒，如流感病毒、狂犬病病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、風(fēng)疹病毒和蜱媒腦炎病毒也可采用特定的哺乳動物細(xì)胞系來復(fù)制。這些細(xì)胞培養(yǎng)物能夠經(jīng)濟地復(fù)制病毒并提供相比，例如，雞蛋更加可靠的增殖系統(tǒng)。在哺乳動物細(xì)胞中培養(yǎng)病毒的方法描述于，例如，WO97/37000。為實現(xiàn)高病毒產(chǎn)率，宿主系統(tǒng)、培養(yǎng)條件或要增殖的病毒必需相互適應(yīng)。盡管己經(jīng)做出努力來優(yōu)化各種增殖系統(tǒng)，但病毒增殖培養(yǎng)物的病毒主產(chǎn)率在不同批次或生產(chǎn)輪次之間極為不同。因此，重要的是提供一種能確定某次病毒制備的病毒產(chǎn)率的方法。目前，流感病毒增殖培養(yǎng)物的主產(chǎn)率(primaryyield)是通過，例如，測量血凝素(HA)效價來測定的。此時，母雞紅血球的凝集被用來表示無細(xì)胞病毒制品，如給定培養(yǎng)物的粗樣品等分試樣中病毒衍生的血凝素的量。通過提高該樣品的稀釋度便可估算HA的量。血凝素的量表明了樣品中病毒粒子的數(shù)目。然而，該方法受毒株限制，且只是半定量的。事實上，只能測定靈敏度的2-步驟因子(factor2-step)?；蛘?，可采用廣泛接受的單徑向免疫擴散(文獻中也稱為SRID或SRD檢測)估算流感病毒產(chǎn)率。該檢測詳細(xì)描述于《歐洲藥典》(EuropeanPharmacopoda)第五版中。該檢測基于病毒抗原與其同源抗體在支持瓊脂糖凝膠中發(fā)生的可視反應(yīng)。優(yōu)選將病毒抗原摻入凝膠并使抗血清從加入點徑向擴散經(jīng)過固定的抗原?？捎^察到抗原-抗體復(fù)合物形成的可測區(qū)。當(dāng)外部和內(nèi)部反應(yīng)物之間建立平衡時，從外部反應(yīng)物位置開始的環(huán)狀沉淀的面積與加入的抗原量成正比并與凝膠中的抗體濃度成反比。用于該檢測的標(biāo)準(zhǔn)抗原和標(biāo)準(zhǔn)抗體由英國的大不列顛國立生物標(biāo)準(zhǔn)品和對照研究所(NIBSC，BritishNationalInstituteforBiologicalStandardsandControl)提供。注意，進行SRID檢測時至少需要兩天。上述方法目前在該領(lǐng)域應(yīng)用時的一個重要缺點在于，根據(jù)上述方法評價給定的病毒增殖培養(yǎng)物的病毒主產(chǎn)率只能在已經(jīng)從培養(yǎng)基分離病毒之后才能可靠地進行。然而，從大量增殖培養(yǎng)物純化病毒不僅費用昂貴而且耗時。目前還不可能在數(shù)小時甚至更短時間內(nèi)評價給定的病毒增殖培養(yǎng)物中的病毒量。因此，需要有能夠迅速提供有關(guān)病毒制品，如流感病毒增殖培養(yǎng)物，主產(chǎn)率信息的方法。優(yōu)選地，該測定方法應(yīng)迅速提供結(jié)果，以使該結(jié)果可被用作判斷能否進一步處理病毒增殖培養(yǎng)物并對其進行純化的基礎(chǔ)。本發(fā)明解決了這一問題，同時提供了額外的益處。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了一種在較短時間內(nèi)測定含病毒樣品中病毒粒子和或抗原濃度的方法。所述含病毒樣品可以是病毒增殖培養(yǎng)物，如MDCK細(xì)胞培養(yǎng)物的粗制樣品，且本發(fā)明所述方法采用所述培養(yǎng)物的等分試樣進行。有利地是，檢測等分試樣時無需對所有培養(yǎng)物進行下游純化。因此，本發(fā)明提供了一種測定樣品中病毒粒子/病毒抗原濃度的方法，該方法包括以下步驟a)在允許病毒粒子和/或病毒抗原與離子交換基質(zhì)結(jié)合的條件下將含有所述病毒粒子和/或病毒抗原的樣品施加于所述離子交換基質(zhì)，從而將所述病毒粒子和/或病毒抗原與其他樣品組分分離；b)從所述基質(zhì)上洗脫所述結(jié)合的病毒粒子和/或病毒抗原；和c)檢測所述病毒粒子和/或病毒抗原；其中，檢測信號指示了樣品中所述病毒粒子和/或病毒抗原的濃度。在本發(fā)明過程中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)給定樣品中病毒粒子和/或病毒抗原的量與可被離子交換基質(zhì)優(yōu)選陽離子交換基質(zhì)結(jié)合并從其洗脫的病毒的量正相關(guān)。這點非常奇怪，因為在本發(fā)明之前從未認(rèn)為這種柱可用于定量分析病毒粒子，如流感病毒粒子。根據(jù)本發(fā)明的方法，樣品中的病毒粒子和/或病毒抗原在第一個步驟中與離子交換基質(zhì)結(jié)合。例如，任何裝載能夠結(jié)合病毒粒子或蛋白質(zhì)的離子交換樹脂材料，優(yōu)選陽離子交換材料的層析柱都可以使用。這種柱可方便地購自許多制造商，如購自GE健康護理生命科技公司(GEHealthcareLifeSciences)的SPSepharoseTMXL、購自薩特瑞斯公司(Sartorius)的SartobindS，等等。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選方面，用于本發(fā)明所述方法的柱包含纖維素基質(zhì)。根據(jù)一個特別優(yōu)選的實施方式，纖維素基質(zhì)的凝膠排阻限為2000-4000道爾頓，更優(yōu)選3000道爾頓。纖維素基質(zhì)優(yōu)選含有活化基團。優(yōu)選的活化基團包括，例如，硫酸酯或其他弱陽離子交換基團，如羧甲基(CM)。根據(jù)一個優(yōu)選的實施方式，纖維素基質(zhì)包含硫酸酯作為活化基團。通常，硫酸酯以相當(dāng)?shù)偷臐舛却嬖谟诶w維素基質(zhì)上。例如，所述基質(zhì)每克干重中可含有500-卯0(ig，優(yōu)選700嗎硫。特別適用于本發(fā)明所述方法的纖維素基質(zhì)可購自德國埃斯波恩的密理博有限公司(MilliporeGmbH，Eschborn，Germany),其商品名為MatrexCellufineSulfate。在允許病毒粒子和/或病毒抗原與離子交換基質(zhì)結(jié)合的條件下使含有所述病毒粒子和/或病毒抗原的樣品接觸所述離子交換基質(zhì)。優(yōu)選地，這種條件是低離子強度條件，即步驟a)中所述病毒粒子和/或病毒抗原的結(jié)合是在低鹽條件下進行的。優(yōu)選地，接觸和結(jié)合是在合適的緩沖溶液中進行的。通常，緩沖液的選擇并不重要，因此大多數(shù)通常用于離子交換層析的緩沖溶液都可使用。因此，使病毒粒子和/或病毒抗原接觸基質(zhì)時使用的緩沖溶液可包含NaCl、Na2HP04、NaHP04、Na3P04、Na2S04、KCl、K2HP04、KHP04、K3P04、K2S04、MgCl2、NH4C1，等等。樣品的總鹽濃度最高可達(dá)O.lmol/l，例如，0.01mol/1或0.05mol/l。當(dāng)包含病毒粒子和/或病毒抗原的材料(例如病毒增殖培養(yǎng)物的等分試樣)具有較高鹽濃度時，可用上述緩沖溶液方便地稀釋該材料以提供可用于本發(fā)明方法的低離子強度的樣品。此外，在將樣品用于離子交換層析之前可對包含病毒粒子和/或病毒抗原的材料進行脫鹽。優(yōu)選地，步驟a)中所述病毒粒子和/或病毒抗原的接觸受含Na2HP04的緩沖液存在的影響。更優(yōu)選地，樣品中Na2HP04的濃度為0.01-0.1mo1/1。最優(yōu)選地，樣品中Na2HPO4的濃度為0.05mo1/1。樣品與基質(zhì)的接觸可在pH范圍約6.0-8.0,優(yōu)選7.0-7.8時進行。最優(yōu)選地，接觸在pH為7.5時進行。為得到量化結(jié)果，我們必需確保各基質(zhì)的結(jié)合容量遠(yuǎn)髙于待檢測樣品中病毒粒子和/或病毒抗原的量。如果病毒粒子和/或病毒抗原濃度過高，則應(yīng)考慮進行稀釋。病毒粒子和/或病毒抗原己經(jīng)與離子交換基質(zhì)結(jié)合之后可進行若干次洗滌步驟以將污染的樣品組分，例如來源于用于病毒增殖的宿主細(xì)胞或培養(yǎng)基組分的細(xì)胞碎片，與病毒粒子和/或病毒抗原分離?？砂凑諏游鲱I(lǐng)域采用的常規(guī)方法用熟知的低離子強度的緩沖液進行洗滌。各種層析方法或技術(shù)的概述可參見"離子交換層析的原則和方法"(IonExchangeChromatography,PrinciplesandMethods),AmershamPharmaciaEditionAA(1998)。優(yōu)選地，洗滌時采用的緩沖液與使病毒粒子和/或病毒抗原接觸離子交換基質(zhì)時采用的緩沖液相同。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，優(yōu)選使用濃度為10-100mmol/1的磷酸鈉緩沖液，如Na2HP04,進行洗滌。例如，緩沖液的濃度可以是20、40、60、80或100mmol/l。優(yōu)選地，Na2HP04緩沖液的濃度為50mmol/l。精通本領(lǐng)域的技術(shù)人員將了解，洗滌緩沖液可含有一些其他組分，例如其他緩沖劑，如TRIS(三(羥甲基)-氨基甲烷)、MOPS(3-(N-嗎啉代)-丙磺酸)或HEPES(N-(2-羥基-乙基)-哌嗪-N，-乙磺酸)，或洗滌劑，如Triton-X100、十二烷基硫酸鈉、聚山梨醇酯、聚氧乙烯山梨醇酯類如聚山梨醇酯80(吐溫-80)或聚山梨醇酯20(吐溫-20)，聚氧丙烯-聚氧乙烯酯類如泊洛沙姆188、聚氧乙烯醇類如芐澤35，等等。之后，可用含有干擾病毒粒子和/或病毒抗原與離子交換基質(zhì)相互作用的物質(zhì)的緩沖液從柱上洗脫病毒粒子和/或病毒抗原。這種緩沖液中含有的鹽與用于將病毒粒子和/或病毒抗原結(jié)合到柱上的緩沖液(見上文)可能相同，但其濃度較高。因此，步驟C)中所述病毒粒子和/或病毒抗原的洗脫是在高鹽條件下進行的。用于洗脫的緩沖液濃度取決于緩沖液的性質(zhì)。例如，洗脫緩沖液的鹽濃度范圍可以約為0.8-5mo1/1。具體說，洗脫緩沖液的鹽濃度可以是1、1.2、1.5、1.8、2、2.2、2.5、2.8、3、3.5、4或4.5mo1/1。優(yōu)選地，步驟c)中所述病毒粒子和/或病毒抗原的洗脫受NaCl緩沖液存在的影響。NaCl緩沖液的濃度優(yōu)選為1.0-2.0mo1/1，更優(yōu)選1.2mo1/1。或者，濃度為1.0-2.0mo1/1的NH4S04緩沖液也可用于洗脫?？刹捎貌煌瑵舛鹊木彌_液用兩個或多個步驟進行洗脫。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式，洗脫是分兩個步驟進行的，其中，進行第一次洗脫時采用1.2mo1/1的氯化鈉緩沖液，隨后用3mo1/1的氯化鈉緩沖液進行第二次冼脫。精通本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解，可通過以線性梯度提高鹽濃度來進行洗脫。根據(jù)本發(fā)明，可測定完整病毒粒子和/或其特定部分，如表面蛋白或其他蛋白質(zhì)組分(文中稱為病毒抗原)的濃度。如實施例所示，本發(fā)明的方法尤其適合測定樣品中完整病毒粒子，如流感病毒粒子的濃度。因此，提供了用于測定已經(jīng)被病毒，如流感病毒感染的病毒增殖培養(yǎng)物，如MDCK細(xì)胞培養(yǎng)物的產(chǎn)率的方法?；蛘撸绻划a(chǎn)生隨后用于疫苗的病毒的某些蛋白質(zhì)組分，則該方法還可用于測定它們的濃度。此外，可平行測定完整病毒粒子和病毒抗原的濃度，只要采用不同保留時間洗脫它們即可。當(dāng)洗脫病毒粒子和/或病毒抗原時，可通過合適方法檢測從柱上洗脫下來的病毒相關(guān)物質(zhì)。例如，可在特定波長測定洗脫物質(zhì)的吸光度。波長的選擇取決于待檢測病毒的性質(zhì)。例如，病毒粒子如流感病毒粒子的檢測范圍可以是210-350nm，例如280nm。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選方面，在280nm波長下通過測量吸光度檢測洗脫物質(zhì)。出于該目的，可采用層析領(lǐng)域熟知的UV檢測裝置。根據(jù)本發(fā)明方法，要檢測的病毒粒子和/或病毒抗原可源自不同病毒類型，例如來自正黏病毒科、腺病毒科、皰疹病毒科、沙粒病毒科、黃病毒科(flaviridae)、逆轉(zhuǎn)錄病毒科、嗜肝DNA病毒科、乳多空病毒科、細(xì)小病毒科、痘病毒科等科的病毒。優(yōu)選的病毒是HCV、麻疹病毒、HAV、HBV、牛痘病毒、拉沙病毒、HSV-1、HSV-2、黃熱病毒、風(fēng)疹病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、HIV和流感病毒。優(yōu)選地，所述病毒粒子和/或病毒抗原源自于流感病毒。所述流感病毒可選自例如以下毒株A/NewCaledoniaH1N1、B/Jingsu、A/WyomingH3N2、A7NewYorkH3N2、B/Malaysia和其他毒株。包含病毒粒子和/或病毒抗原的樣品優(yōu)選是病毒增殖培養(yǎng)物的等分試樣。文中，"病毒增殖培養(yǎng)物"表示為增殖病毒或病毒抗原目的服務(wù)的任何培養(yǎng)物。該術(shù)語具體包括任何類型的細(xì)胞或或組織培養(yǎng)物，其中的細(xì)胞或組織，如脊椎動物細(xì)胞被用作病毒復(fù)制的宿主。所述等分試樣可取自培養(yǎng)過程末期的病毒增殖培養(yǎng)物。本發(fā)明所述方法能夠測定樣品中病毒粒子和/或病毒抗原的濃度?？煞奖愕貙⒃摑舛韧馔频酵暾呐囵B(yǎng)物體積。根據(jù)本發(fā)明，包含病毒粒子和/或病毒抗原的樣品可衍生自雞蛋培養(yǎng)物或細(xì)胞培養(yǎng)物，如哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物。根據(jù)一個優(yōu)選的實施方式，所述樣品衍生自MDCK、MDBK、VERO、CV-1、MRC-5、WI-38或LLC-MK2細(xì)胞培養(yǎng)物。根據(jù)一個更優(yōu)選的實施方式，所述樣品衍生自MDCK細(xì)胞培養(yǎng)物。由本發(fā)明所述測定方法獲得的結(jié)果可用作判斷是否應(yīng)該進一步處理和/或純化病毒增殖培養(yǎng)物的基礎(chǔ)。由于對所有病毒增殖培養(yǎng)物進行下游處理和/或純化極其昂貴且費力，本發(fā)明的方法提供了一種更加經(jīng)濟且節(jié)省費用的生產(chǎn)方法。據(jù)此，在培養(yǎng)期末只顯示出低病毒/抗原含量的培養(yǎng)物可被丟棄而無需進行下游處理和/或純化。例如，可接受的流感病毒增殖培養(yǎng)物的產(chǎn)率為約10-20Hg/ml培養(yǎng)物。然而，根據(jù)病毒類型和培養(yǎng)方法，產(chǎn)率可以不同?；蛘?，測定結(jié)果也可以作為判斷是否要進一步培育病毒增殖培養(yǎng)物和/或是否要優(yōu)化培養(yǎng)條件的基礎(chǔ)。應(yīng)理解，在后一種情況下，病毒增殖培養(yǎng)物等分試樣必需在無菌條件下獲取。根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方式，測定樣品中流感病毒粒子和/或流感病毒抗原濃度的方法還包括下述步驟將檢測信號與至少一個通過檢測含有已知濃度所述病毒粒子和/或病毒抗原的樣品(參比樣品)獲得的參考值進行比較以確定樣品中病毒粒子和/或病毒抗原的濃度。換句話說，用于本發(fā)明方法的具體設(shè)備在用于含有未知濃度的病毒粒子和/或病毒抗原的樣品之前已經(jīng)校準(zhǔn)。用參比樣品獲得的檢測信號可能與病毒粒子和/或病毒抗原的比濃度相關(guān)聯(lián)。優(yōu)選地，將檢測信號與一個以上的參考值進行比較。例如，可通過測定不同已知濃度的若干樣品的檢測信號制得標(biāo)準(zhǔn)曲線。每毫升參比樣品可含有5-50嗎病毒粒子和/或病毒抗原。通常使用病毒粒子和/或病毒抗原濃度遞增的參比樣品。例如，可使用每毫升含有5嗎、10嗎、15嗎、20pg、25嗎、30嗎、35嗎、40嗎、45嗎和50嗎病毒粒子和/或病毒抗原的樣品來生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。可將獲自含有未知濃度病毒粒子和/或病毒抗原的樣品的檢測信號與標(biāo)準(zhǔn)曲線進行比較，以估算病毒粒子和/或病毒抗原的濃度。優(yōu)選地，建立每種病毒類型的參考值。在一些情況下還可能需要建立給定病毒類型不同毒株的參考值(如在流感病毒的情況下)。例如，可建立流感毒株A/NewCaledoniaH1N1、B/Jingsu、A/WyomingH3N2、A7NewYorkH3N2、B/Malaysia的參考值。一些情況下，還可能發(fā)現(xiàn)，建立在一種毒株基礎(chǔ)上的參考值能夠測量和評估含有其他毒株病毒粒子和/或病毒抗原的樣品?？山⒍局晏禺愋韵嚓P(guān)因子，該因子考慮到使用該參考值。如果相同設(shè)備使用相同實驗條件(即相同的檢測器設(shè)置、流速等)，還可以將檢測器信號(例如，表示為測得峰的比面積)作為病毒粒子和/或病毒抗原濃度的指標(biāo)。在下述實施例中，峰面積與通過標(biāo)準(zhǔn)方法(分別為SRD和HA滴定)測得的病毒粒子和/或病毒抗原的濃度正相關(guān)。當(dāng)在細(xì)胞培養(yǎng)物中培養(yǎng)流感病毒時，宿主細(xì)胞的感染取決于若干因素，如是否在感染培養(yǎng)基中加入諸如胰蛋白酶之類的蛋白酶。蛋白質(zhì)專門將血凝素的前體蛋白切割成參與細(xì)胞感染過程的活性血凝素。然而，加入蛋白酶通常不會使每一個批次產(chǎn)生可重復(fù)的結(jié)果。此外，由于加入蛋白酶時要求打開培養(yǎng)容器至少一次，因此有污染病毒增殖培養(yǎng)物的風(fēng)險。然而，這種污染將使從細(xì)胞培養(yǎng)物獲得的病毒產(chǎn)品不適合隨后的疫苗制備。根據(jù)另一個優(yōu)選的方面，本發(fā)明所述方法能夠定性評價病毒增殖培養(yǎng)物。例如，如果除要增殖的病毒之外的微生物污染了培養(yǎng)物，可通過本發(fā)明的方法檢測這種污染，其表現(xiàn)為病毒產(chǎn)率較低或?qū)游龇治鲋谐霈F(xiàn)了其他峰。這種污染的培養(yǎng)物將被丟棄而不對其進行下游純化。本發(fā)明所述方法優(yōu)選用于測定樣品中存在的完整病毒粒子的濃度。然而，該方法還可測定其他病毒抗原，如獨特表面蛋白的濃度。在本發(fā)明過程中發(fā)現(xiàn)，如果游離的(即未結(jié)合病毒的)流感病毒表面蛋白濃度較高，則生長在MDCK細(xì)胞培養(yǎng)物中的完整流感病毒粒子的濃度較低。因此，這種表面蛋白的濃度也可作為樣品中病毒粒子產(chǎn)率的指標(biāo)。最后，本發(fā)明涉及離子交換基質(zhì)，優(yōu)選陽離子交換基質(zhì)在測定樣品中病毒粒子和/或病毒抗原濃度中的應(yīng)用。優(yōu)選地，所述離子交換基質(zhì)是陽離子交換基質(zhì)。附圖簡述圖1顯示了采用AKTAprime層析系統(tǒng)，在MatrexCellufinesulfate柱上運行含流感病毒粒子的樣品獲得的譜圖。在柱子上加入50ml流感病毒A/Wellington株的發(fā)酵收獲物。43.53分鐘的峰代表流感病毒粒子組分。如SDS-PAGE分析所示，該病毒粒子組分的純度大于80%(未顯示數(shù)據(jù))。實施例應(yīng)理解，以下實施例僅為列舉本發(fā)明而不是要限制本發(fā)明，本發(fā)明的范圍由所附的權(quán)利要求書限定。采用以下設(shè)備1.設(shè)備A層析系統(tǒng)AKTAprime(GE健康護理公司(GEhealthcare)),50ml進樣環(huán)，在線檢測280nm的UV吸光度，在線檢測電導(dǎo)率柱HR16/10(GE健康護理公司)，20mlMatrexCellufinesulfate(密理博有限公司)洗滌緩沖液50mMNa2HPO4，用1MNaOH調(diào)至pH7.5洗脫緩沖液1:1.2MNaCl，50mMNa2HP04，用1NaOH調(diào)至pH7.5洗脫緩沖液2:3.0MNaCl，50mMNa2HP04，用1NaOH調(diào)至pH7.5清洗緩沖液0.1NaOH儲存緩沖液洗滌緩沖液+20%乙醇程序流速5ml10分鐘(50ml):柱平衡10分鐘(50ml):進樣，20分鐘(100ml):用洗滌緩沖液洗滌柱10分鐘(50ml):用洗脫緩沖液1洗脫10分鐘(50ml):用洗脫緩沖液2洗脫10分鐘(50ml):用清洗緩沖液清洗2.設(shè)備B層析系統(tǒng)AKTAbasic(GE健康護理公司)，2ml進樣環(huán)，在線檢測280nm和350nm的UV吸光度柱Tricorn10/20(GE健康護理公司)，2mlMatrexCellufmeTMsulfate(密理博有限公司)洗滌緩沖液50mMNa2HPO4，用1MNaOH調(diào)至pH7.5洗脫緩沖液3.0MNaCl，50mMNa2HPO4，用1MNaOH調(diào)至pH7.5清洗緩沖液0.1MNaOH儲存緩沖液洗滌緩沖液+20%乙醇程序流速5ml，2分鐘(10ml):進樣并用洗滌緩沖液洗漆柱.2分鐘(10ml):用30%洗脫緩沖液、80%洗滌緩沖液洗脫.2分鐘(10ml):用100%洗脫緩沖液洗脫2分鐘(10ml):用100%清洗緩沖液清洗，2分鐘(10ml):用洗滌緩沖液平衡柱實施例1流感病毒樣品的層析分析用0.45pm濾膜過濾被流感毒株A/Wellington感染的MDCK(Madin-Darby犬腎)細(xì)胞培養(yǎng)物發(fā)酵罐收獲物衍生出的樣品，然后裝入層析柱。采用的流速為5ml/分。柱用洗滌緩沖液平衡IO分鐘。然后加入50ml樣品。柱用100ml洗滌緩沖液洗滌。用50ml洗脫緩沖液1洗脫以洗脫完整的病毒，再用50ml洗脫緩沖液2洗脫以洗脫不與完整病毒粒子結(jié)合的病毒表面蛋白。后者(蛋白質(zhì))可能是病毒生產(chǎn)未完成的產(chǎn)物。最后用50ml清洗緩沖液沖洗該柱。圖1顯示了洗脫液的吸收光譜。43.53分鐘的峰代表病毒粒子成分。峰面積揭示，病毒增殖培養(yǎng)物足以經(jīng)過進一步處理來制造例如疫苗。還發(fā)現(xiàn)未與完整病毒粒子結(jié)合的病毒表面蛋白可用來進一步表示出病毒增殖培養(yǎng)物的病毒粒子產(chǎn)率。這些未結(jié)合的病毒蛋白質(zhì)的濃度越高則病毒粒子濃度越低。如果目的是制造完整病毒粒子，則43.53分鐘的峰的面積應(yīng)該較大，同時當(dāng)用3MNaCl洗脫時應(yīng)該沒有峰(或有面積較小的峰)。實施例2流感病毒樣品的層析分析結(jié)果和SRD分析結(jié)果的相關(guān)性根據(jù)己知方法在MDCK培養(yǎng)物上繁殖不同流感病毒毒株。培養(yǎng)期結(jié)束時，先用0.45pm濾膜過濾除去細(xì)胞碎片，然后用分析型CS-層析(Matrex⑧Celluflnesulfate;密理博有限公司)測定2ml樣品中病毒粒子和/或病毒抗原的濃度。用相同樣品平行進行已建立的HA滴定法。SRD測定的置信限為+200/。。所得結(jié)果列于表l。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>通過SRD和分析型CS-層析測定病毒粒子濃度的結(jié)果實施例3流感病毒樣品的層析分析結(jié)果和HA滴定分析結(jié)果的相關(guān)性根據(jù)已知方法在MDCK培養(yǎng)物上繁殖不同流感病毒毒株。培養(yǎng)期結(jié)束時，先用0.45pm濾膜過濾除去細(xì)胞碎片，然后用分析型CS-層析(Matrex⑧Cellufinesulfate;密理博有限公司)測定2ml樣品中病毒粒子和/或病毒抗原的濃度。用相同樣品平行進行已建立的HA滴定法。SRD測定的置信限為+20。/0。所得結(jié)果列于表l。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表2:通過HA滴定和分析型CS-層析測定病毒粒子濃度的結(jié)果由上表可知，各病毒峰的峰面積與通過常規(guī)方法測得的樣品中病毒粒子和/或病毒抗原的濃度強烈相關(guān)。峰面積與通過SRD和HA滴定測得的濃度值的相關(guān)性在所有檢測的流感病毒株之間是不同的。280nm的比吸收在檢測的病毒株之間似乎是不同的。可以假設(shè)，毒株特異性相關(guān)因子可補償這種觀測結(jié)果。由于分析型CS-層析可在1小時內(nèi)完成，所以該方法明顯使感染過程的耗時得到優(yōu)化。與耗時2-3天的SRD法不同，分析型CS-層析可用作過程質(zhì)量控制，例如以判斷生產(chǎn)規(guī)模發(fā)酵罐的最佳收獲時間。權(quán)利要求1.一種測定樣品中病毒粒子和/或病毒抗原濃度的方法，該方法包括以下步驟a)在允許病毒粒子和/或病毒抗原與離子交換基質(zhì)結(jié)合的條件下將含有所述病毒粒子和/或病毒抗原的樣品施加于所述離子交換基質(zhì)，從而將所述病毒粒子和/或病毒抗原與其他樣品組分分離；b)從所述基質(zhì)上洗脫所述結(jié)合的病毒粒子和/或病毒抗原；和c)檢測所述病毒粒子和/或病毒抗原；其中，檢測信號指示了樣品中所述病毒粒子和/或病毒抗原的濃度。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法還包括下述步驟將所述檢測信號與至少一個通過檢測含有己知濃度所述病毒粒子和/或病毒抗原的樣品獲得的參考值進行比較以確定所述樣品中所述病毒粒子和/或病毒抗原的濃度。3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，將所述檢測信號與一個以上的參考值進行比較。4.如權(quán)利要求1-3中任一項所述的方法，其特征在于，所述離子交換基質(zhì)是陽離子交換基質(zhì)。5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述陽離子交換基質(zhì)包含纖維素基質(zhì)。6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述纖維素基質(zhì)的凝膠排阻限為2000-4000道爾頓。7.如權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述纖維素基質(zhì)包含硫酸酯作為活化基團。8.如權(quán)利要求1-7中任一項所述的方法，其特征在于，所述方法用于測定病毒粒子的濃度。9.如權(quán)利要求1-8中任一項所述的方法，其特征在于，所述病毒是流感病毒。10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述病毒是選自以下毒株的流感病毒A/NewCaledoniaHIN1、B/Jingsu、A/WyomingH3N2、A7NewYorkH3N2、B她laysia。11.如權(quán)利要求1-10中任一項所述的方法，其特征在于，所述樣品是病毒增殖培養(yǎng)物的等分試樣。12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述樣品衍生自雞蛋培養(yǎng)物。13.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述樣品衍生自細(xì)胞培養(yǎng)物。14.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述樣品衍生自MDCK細(xì)胞培養(yǎng)物。15.如權(quán)利要求1-14中任一項所述的方法，其特征在于，步驟a)中所述病毒粒子和/或病毒抗原的結(jié)合是在低鹽條件下進行的。16.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，步驟a)中所述病毒粒子和/或病毒抗原的接觸受含Na2HP04緩沖液存在的影響。17.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述緩沖液中Na2HP04的濃度為0.01-0.1mo1/1。18.如權(quán)利要求1-17中任一項所述的方法，其特征在于，步驟c)中所述病毒粒子和/或病毒抗原的洗脫是在高鹽條件下迸行的。19.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，步驟c)中所述病毒粒子和/或病毒抗原的洗脫受NaCl緩沖液存在的影響。20.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述緩沖液中NaCl的濃度為1.0-2.0mo1/1。21.如權(quán)利要求1-20中任一項所述的方法，其特征在于，步驟c)中的檢測是通過測量洗脫組分的UV吸光度進行的。22.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述UV吸光度是在280nm波長下測量的。23.離子交換基質(zhì)在測定樣品中病毒粒子和/或病毒抗原濃度中的應(yīng)用。24.如權(quán)利要求23所述的應(yīng)用，其特征在于，所述離子交換基質(zhì)是陽離子交換基質(zhì)。全文摘要本發(fā)明提供了一種測定樣品中病毒粒子和/或病毒抗原濃度的方法。具體地說，本發(fā)明涉及測定樣品中流感病毒粒子/流感病毒抗原的濃度。本發(fā)明還涉及離子交換基質(zhì)在測定樣品中病毒粒子和/或病毒抗原濃度中的應(yīng)用。文檔編號C12N7/02GK101395477SQ200780006618公開日2009年3月25日申請日期2007年1月12日優(yōu)先權(quán)日2006年1月13日發(fā)明者H·科斯特申請人:諾華疫苗和診斷公司