專利名稱：抗輪狀病毒藥物作用靶標及其構(gòu)建方法和應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種藥物作用靶標，特別涉及一種抗輪狀病毒藥物作用靶標，還涉及 該靶標的構(gòu)建方法，以及應(yīng)用該靶標篩選抗輪狀病毒藥物的方法。
背景技術(shù)：
輪狀病毒(Rotavirus，RV)感染是導致嬰幼兒腹瀉的主要病因，每年引起約1. 25 億例兒童胃腸炎，導致352，000-592, 000例5歲以下兒童因輪狀病毒感染死亡，主要發(fā)生在
發(fā)展中國家。輪狀病毒屬于呼腸弧病毒科，為無胞膜雙鏈RNA(dsRNA)病毒，11條dsRNA各纏繞 1分子的RNA依賴RNA多聚酶(VPl)和1分子的鳥苷酸及甲基轉(zhuǎn)移酶(VP3)位于病毒顆粒 的核心，編碼12種蛋白質(zhì)，包括6種結(jié)構(gòu)蛋白(VPl 4、6 7)與6種非結(jié)構(gòu)蛋白(NSP1 6)。VP2構(gòu)成輪狀病毒的內(nèi)層衣殼包裹病毒基因組；VP6構(gòu)成的中層衣殼包繞VP2形成輪狀 病毒雙層衣殼顆粒(DLP) ；VP4和VP7構(gòu)成的外層衣殼再包繞DLP形成完整的輪狀病毒三層 衣殼顆粒(TLP)。輪狀病毒在受體的介導下穿過細胞膜進入細胞，脫掉外層衣殼形成DLP開 始復制過程，新生成的病毒dsRNA與蛋白在胞漿中聚集形成病毒質(zhì)粒，并在其中組裝生成 DLPjDLP不具有感染能力，其隨后進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，與新合成的VP4和VP7裝配成具有感染能力 的TLP并分泌出宿主細胞，完成病毒的復制過程。在病毒復制過程中，病毒組分(新生的病毒核酸與蛋白等)裝配成完整的病毒顆 粒是非常關(guān)鍵的步驟，正確而高效地裝配直接決定著病毒產(chǎn)生的水平。在病毒裝配過程中， 病毒各組分被轉(zhuǎn)運到細胞內(nèi)的特定位置，自發(fā)地或在病毒編碼的形態(tài)發(fā)生因子指導下進行 衣殼裝配。宿主因素對病毒顆粒的組裝有著重要的影響。病毒核酸或蛋白必須在細胞內(nèi)經(jīng) 過合適的折疊及修飾(如糖基化等)并被轉(zhuǎn)運到正確的位置才能有效的進行裝配。目前已 經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些宿主蛋白如groE、ABCEU Staufenl等在病毒顆粒的組裝過程中發(fā)揮著重要作 用。一旦這些宿主蛋白的功能出現(xiàn)異常，就會導致病毒顆粒結(jié)構(gòu)或功能的缺陷，影響病毒的 有效復制。目前對感染后宿主細胞對病毒感染的反應(yīng)機制知之甚少。對輪狀病毒感染宿主細 胞后引起宿主細胞的反應(yīng)進行研究，有助于深入了解輪狀病毒與宿主細胞間相互作用的特 點，從而為進一步研究如何預(yù)防或治療輪狀病毒感染及開發(fā)抗輪狀病毒藥物提供有益的借 鑒。病毒感染宿主細胞后引起宿主細胞發(fā)生一系列反應(yīng)，包括基因與蛋白表達的改變、干擾 素反應(yīng)及細胞表面分子的調(diào)節(jié)。研究表明，輪狀病毒感染后會導致宿主細胞出現(xiàn)一系列變 化，引起細胞蛋白表達水平顯著下降，細胞內(nèi)Ca2+濃度改變(與病毒成熟也可能與細胞死 亡有關(guān))，細胞骨架的組織構(gòu)建的改變，細胞間緊密連接的結(jié)構(gòu)與功能的改變及細胞死亡裂 解。對輪狀病毒感染的細胞中蛋白質(zhì)表達特點的研究有助于了解病毒的致病機理。近年來 對輪狀病毒感染細胞中一些細胞基因的mRNA及蛋白質(zhì)表達水平已經(jīng)有了一些研究。AIMIN 等通過Northern blot和二維凝膠電泳技術(shù)發(fā)現(xiàn)，在輪狀病毒SAll株感染的MA104細胞 中，兩種存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的分子伴侶GRP78和GRP94在mRNA及蛋白水平表達均升高。Rollo等研究發(fā)現(xiàn)在猴輪狀病毒感染的HT-29細胞中，多種趨化因子及干擾素的mRNA表達水平升 高。Mariela等用含人類38，OOO種cDNA的基因芯片對輪狀病毒感染的人腸細胞系Caco-2 研究發(fā)現(xiàn)，在感染后16小時，508種基因的表達發(fā)生大于2倍的變化，其中73%是上調(diào)且大 部分發(fā)生在感染12小時后。但是鑒于細胞內(nèi)復雜的基因表達和翻譯調(diào)控機制，mRNA的改 變并不必然等同于蛋白質(zhì)的改變，而蛋白質(zhì)才是各種生命活動的直接參與者。因此，對輪狀 病毒感染后尤其是在感染早期細胞蛋白表達譜改變的研究，將有助于深入認識宿主細胞對 輪狀病毒感染的反應(yīng)特點。蛋白質(zhì)組學研究是近年來生命科學領(lǐng)域熱點之一。蛋白質(zhì)組是指由一個細胞或組 織的基因組表達的全部蛋白質(zhì)，是生命狀態(tài)的直接體現(xiàn)。不僅同一生物體的細胞蛋白質(zhì)組 成和數(shù)量隨細胞的種類和功能狀態(tài)不同，而且在發(fā)育的不同階段、所處環(huán)境的變遷都會使 蛋白表達發(fā)生改變。蛋白質(zhì)組學將先進的蛋白分離技術(shù)、現(xiàn)代質(zhì)譜學技術(shù)和生物信息學 結(jié) 合起來從整體的蛋白質(zhì)水平探討、發(fā)現(xiàn)生命活動的規(guī)律和重要生理、病理現(xiàn)象的本質(zhì)。除 了大量的雙向電泳數(shù)據(jù)庫和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫建立外，蛋白質(zhì)組學的技術(shù)方法已經(jīng)在細胞生 長發(fā)育調(diào)節(jié)、信號轉(zhuǎn)導、蛋白質(zhì)的磷酸化和糖基化、蛋白-蛋白間相互作用、疾病診斷的分 子標記以及藥物開發(fā)研究等多領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用，成為功能基因組學的重要部分。通過蛋白 組學技術(shù)鑒定輪狀病毒感染宿主細胞后蛋白譜系的變化，進而結(jié)合生物信息學分析可能相 互作用的潛在靶蛋白，最后采用分子生物學技術(shù)進行確證可望揭示輪狀病毒干擾的分子機 制、發(fā)展?jié)撛诳共《局苿┖驼页隼硐氲囊呙绨锌乖砦?。迄今為止，人們對輪狀病毒感染機制研究還很不充分，臨床上主要是對癥治療，缺 乏直接針對病毒感染的安全有效的藥物。傳統(tǒng)的抗病毒藥物Y干擾素及代謝類抗病毒藥 物由于毒副作用或效果不佳等原因較少用于抗輪狀病毒感染。為降低感染率和死亡率，臨 床上對能夠抗輪狀病毒感染的特效藥物有著十分緊迫的需求。藥物作用靶標是指疾病發(fā)生和發(fā)展過程中能夠在最關(guān)鍵病理環(huán)節(jié)上起決定作用 的關(guān)鍵功能生物大分子，包括受體、酶、轉(zhuǎn)運蛋白、DNA、RNA等。找到藥物作用靶標的前提是 能從蛋白分子水平對病毒宿主相互作用關(guān)系有系統(tǒng)的理解和認識。蛋白組學的核心是從蛋 白水平詮釋病毒感染后宿主蛋白與病毒蛋白、宿主蛋白與宿主蛋白、病毒蛋白與病毒蛋白 之間的相互作用對病毒復制、裝配等的影響。篩選出病毒復制或裝配過程中關(guān)鍵作用宿主 蛋白即可找到藥物作用靶標?，F(xiàn)代藥物研究的核心是以藥物作用靶標為基礎(chǔ)，篩選或設(shè)計 能與靶標結(jié)構(gòu)互補、激動或拮抗靶標介導的生物功能的藥物先導物，從而研發(fā)出高效低毒 的特異性藥物。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供一種抗輪狀病毒藥物作用靶標；目的之二 在于提供所述抗輪狀病毒藥物作用靶標的構(gòu)建方法；目的之三在于提供應(yīng)用所述抗輪狀病 毒藥物作用靶標篩選抗輪狀病毒藥物的方法。為達到上述目的，本發(fā)明首先對輪狀病毒感染細胞的蛋白表達譜系進行了全面的 組學分析，對輪狀病毒的基因表達產(chǎn)物進行了深入的生物信息學分析，識別出輪狀病毒感 染人體的途徑，然后用分子生物學方法驗證這一作用途徑，再根據(jù)這一作用途徑篩選活性 化合物并進行病毒水平的測試，確證抗輪狀病毒藥物作用靶標，從而完成了本發(fā)明。
1、抗輪狀病毒藥物作用靶標，為輪狀病毒VP6蛋白與人親環(huán)素A(CyCl0philinA， CypA)相互作用的復合物三維結(jié)構(gòu)模型，所述輪狀病毒VP6蛋白的氨基酸序列如SEQ No. 1 所示，與人親環(huán)素A相互作用的功能區(qū)域為第52至第100位和第343至第392位氨基酸， 其中活性位點包括Asn 53、Ala 348、Val 349、Ile 355和Pro 363 ；所述人親環(huán)素A的氨基 酸序列如SEQ No. 2所示，與輪狀病毒VP6蛋白相互作用的功能區(qū)域為第54至第150位氨 基酸，其中活性位點包括Arg 55、Gin 63、Lys 125和Arg 148。2、抗輪狀病毒藥物作用靶標的構(gòu)建方法，包括以下步驟a、用蛋白組學方法對輪狀病毒感染細胞進行全細胞表達譜分析，發(fā)現(xiàn)輪狀病毒感 染可誘導人親環(huán)素A表達升高；b、用生物信息學方法對輪狀病毒蛋白質(zhì)與人親環(huán)素A的相互作用進行網(wǎng)絡(luò)分析， 揭示輪狀病毒VP6蛋白和人親環(huán)素A有相互作用；c、用同源蛋白模建方法構(gòu)建輪狀病毒VP6蛋白與人親環(huán)素A相互作用的復合物三 維結(jié)構(gòu)模型，確定輪狀病毒VP6蛋白與人親環(huán)素A相互作用的功能區(qū)域和活性位點；d、用分子生物學方法驗證輪狀病毒VP6蛋白與人親環(huán)素A的相互作用，證明輪狀 病毒VP6蛋白與人親環(huán)素A確實存在相互作用；e、針對輪狀病毒VP6蛋白與人親環(huán)素A相互作用的功能區(qū)域和活性位點，用計算 機虛擬篩選方法搜尋活性化合物，并對所得活性化合物進行病毒水平的測試，確證抗輪狀 病毒藥物作用靶標的建立。3、應(yīng)用抗輪狀病毒藥物作用靶標篩選抗輪狀病毒藥物的方法，包括以下步驟a、針對抗輪狀病毒藥物作用靶標中輪狀病毒VP6蛋白與人親環(huán)素A相互作用的功 能區(qū)域和活性位點，檢測候選化合物與輪狀病毒VP6蛋白的功能區(qū)域和活性位點的結(jié)合常 數(shù)，或者檢測候選化合物與人親環(huán)素A的功能區(qū)域和活性位點的結(jié)合常數(shù)，篩選出具有較 強親和力的化合物；b、檢測步驟a所得化合物抑制輪狀病毒VP6蛋白與人親環(huán)素A結(jié)合的能力，篩選 出具有較強抑制能力的化合物；c、檢測步驟b所得化合物對輪狀病毒感染細胞的保護作用。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明提供了一種抗輪狀病毒藥物作用靶標及其構(gòu)建方 法和應(yīng)用方法，采用本發(fā)明的抗輪狀病毒藥物作用靶標及其應(yīng)用方法，能夠簡便快速地篩 選或設(shè)計能阻斷輪狀病毒VP6蛋白與人親環(huán)素A相互作用的化合物，從而研發(fā)出高效低毒 的特異性抗輪狀病毒藥物；參照本發(fā)明的抗輪狀病毒藥物作用靶標的構(gòu)建方法，本領(lǐng)域技 術(shù)人員可以構(gòu)建出其它藥物作用靶標，從而大大推進我國新藥研發(fā)。


為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進 一步的詳細描述，其中圖1顯示輪狀病毒感染誘導人親環(huán)素A表達升高，其中A為二維電泳篩選輪狀病 毒感染12小時后上調(diào)表達的蛋白質(zhì)，箭頭所指處為一表達明顯上調(diào)的蛋白質(zhì)；B為A中箭 頭所指處的放大圖；C為質(zhì)譜結(jié)合數(shù)據(jù)庫檢索鑒定該蛋白質(zhì)為親環(huán)素A ;D為Western-blot 證實該蛋白質(zhì)為親環(huán)素A;
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圖2顯示輪狀病毒VP6蛋白含有人親環(huán)素A識別、結(jié)合并催化的af-ag結(jié)構(gòu)域；圖3顯示輪狀病毒VP6蛋白和人親環(huán)素A相互作用的復合物三維結(jié)構(gòu)模型，其中輪狀病毒VP6蛋白由藍色和綠色帶狀結(jié)構(gòu)顯示，綠色部分表示與人親環(huán)素A相互作用的功 能區(qū)域；親環(huán)素A由橙色和黃色帶狀結(jié)構(gòu)顯示，黃色部分表示與輪狀病毒VP6蛋白相互作用 的功能區(qū)域；圖4顯示輪狀病毒VP6蛋白和人親環(huán)素A的細胞共同定位，其中輪狀病毒VP6蛋 白用綠色熒光抗體標記；人親環(huán)素A用紅色熒光抗體標記；圖B為相應(yīng)圖A中方框處的放大 圖；圖5顯示環(huán)孢素A對感染輪狀病毒的MA104細胞的保護作用，其中A為2 μ M環(huán)孢 素A(CsA)對感染過程中輪狀病毒產(chǎn)量的影響(C-為未加環(huán)孢素Α，C+為加環(huán)孢素Α) ；B為 2 μ M FK506對感染過程中輪狀病毒產(chǎn)量的影響(F-為未加Π(506，F(xiàn)+為加Π(506)。
具體實施例方式以下將參照附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細的描述。優(yōu)選實施例中未注明 具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實驗指南(第三版，J.薩姆布魯克 等著，黃培堂等譯，科學出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。1、蛋白組學方法分析宿主細胞被輪狀病毒感染后的蛋白變化譜用13cm pH3_llNL 的IPG預(yù)制膠條做雙向電泳(IEF)，分析感染了輪狀病毒W(wǎng)a株或SAll株及模擬感染(mock infected)的MA104細胞蛋白譜表達情況(圖1A，B)。以模擬感染組為對照，Wa株感染組 分別可檢測出772和798個蛋白點，SAll株感染組分別可檢測出1230和1312個蛋白點。 通過圖像分析及膠與圖像的比對，重復3次，發(fā)現(xiàn)Wa株感染組感染12小時后，有14個蛋白 點表達上調(diào)2倍以上，37個蛋白點表達下調(diào)50%以上；SAll株感染組感染12小時后，有24 個蛋白點表達上調(diào)2倍以上，29個蛋白點表達下調(diào)50 %以上。鑒于輪狀病毒感染后會弓I起 細胞蛋白表達的普遍下降，那些感染后表達反而上調(diào)的蛋白在輪狀病毒與宿主細胞相互作 用中更有意義，故選擇在感染后表達上調(diào)的蛋白點進行蛋白鑒定。 采用MALDI-T0F-MS技術(shù)，并通過mascot用NCBInr數(shù)據(jù)庫進行數(shù)據(jù)庫檢索以鑒定 在感染后表達上調(diào)的蛋白。質(zhì)譜分析結(jié)果顯示，表達升高的蛋白包括輪狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋 白 NSP3， plectin Iisoform 6， cortactin-binding protein 2 與 leucine-zipper-like transcription regulator，lisoform 1 的復合物，KRT8 protein 與 reticulocalbin 1 的 復合物，親環(huán)素A等(圖1C)。這些蛋白可能與抑制宿主蛋白表達、胞內(nèi)信號傳遞、胞內(nèi)代 謝、病毒復制與運輸及宿主細胞發(fā)育分化相關(guān)，顯示出輪狀病毒感染后對宿主細胞的改造， 使之適合于自身在胞內(nèi)生存。進一步Western-blot結(jié)果證實親環(huán)素A等在輪狀病毒感染 后上調(diào)表達(圖1D)。2、生物信息學分析輪狀病毒VP6蛋白與人親環(huán)素A的相互作用生物信息學分析輪狀病毒VP6蛋白的氨基酸一級結(jié)構(gòu)和三維晶體結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，VP6 蛋白C末端序列af-ag環(huán)中含有親環(huán)素A最易識別、結(jié)合并催化其中的脯氨酸構(gòu)象改變的 X-GP-X序列(圖2)。提示輪狀病毒VP6蛋白與人親環(huán)素A有相互作用，推測這種作用對病 毒的成熟、病毒的復制和新病毒顆粒的形成起重要作用。3、同源蛋白模建方法構(gòu)建輪狀病毒VP6蛋白與人親環(huán)素A相互作用的復合物三維結(jié)構(gòu)模型
根據(jù)輪狀病毒W(wǎng)a株VP6蛋白(登錄號為P03530)三維晶體結(jié)構(gòu)和人親環(huán)素A三 維晶體結(jié)構(gòu)(蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫PDB編號為1AK4)，采用INSIGHTII工作站，將輪狀病 毒VP6蛋白Leu 343到Arg 392組成的loop區(qū)對接到人親環(huán)素A結(jié)合口袋中，獲得輪狀病 毒VP6蛋白與人親環(huán)素A的復合物的初始結(jié)構(gòu)，再用分子力學進行優(yōu)化，采用的力場參數(shù)為 Amber力場和Kollman-all-atom電荷。優(yōu)化的復合物三維結(jié)構(gòu)模型如圖3所示。由該復合 物三維結(jié)構(gòu)模型可以獲知輪狀病毒VP6蛋白與人親環(huán)素A相互作用的功能區(qū)域為第52至 第100位和第343至第392位氨基酸，其中主要活性位點為Asn 53, Ala 348, Val 349, Ile 355和Pro 363 ；人親環(huán)素A與輪狀病毒VP6蛋白相互作用的功能區(qū)域為第54至第150位 氨基酸，其中主要活性位點為Arg 55, Gln 63，Lys 125和Arg 148。4、免疫熒光激光共聚焦驗證輪狀病毒VP6蛋白與人親環(huán)素A的相互作用在確定輪 狀病毒VP6蛋白與人親環(huán)素A相互作用的功能區(qū)域和活性位點的基礎(chǔ)上，本發(fā)明用不同顏 色熒光抗體分別標記輪狀病毒VP6蛋白與人親環(huán)素A，免疫熒光激光共聚焦顯示VP6蛋白與 親環(huán)素A在輪狀病毒感染細胞中共同定位(圖4)，證明輪狀病毒VP6蛋白與人親環(huán)素A之 間確實存在相互作用。這種相互作用可能有助于輪狀病毒VP6蛋白的多聚、DLP形成以及 后期與VP4、VP7等外殼蛋白共同組裝成TLP，形成成熟的輪狀病毒顆粒。5、計算機虛擬篩選方法針對輪狀病毒VP6蛋白與人親環(huán)素A相互作用的功能區(qū)域 和活性位點搜尋活性化合物及所得活性化合物的抗輪狀病毒活性測試由上述結(jié)果可以初步判定，輪狀病毒VP6蛋白與人親環(huán)素A的相互作用與輪狀病 毒感染人體有關(guān)，二者相互作用的復合物三維結(jié)構(gòu)模型可能作為藥物作用靶標用于篩選抗 輪狀病毒藥物。為此，按照通常的藥物作用靶標確證原則，本發(fā)明對輪狀病毒VP6蛋白與人 親環(huán)素A相互作用的復合物三維結(jié)構(gòu)模型用作抗輪狀病毒藥物作用靶標進行了確證。首先，本發(fā)明針對輪狀病毒VP6蛋白與人親環(huán)素A相互作用的功能區(qū)域和活性位 點，用計算機虛擬篩選方法篩選了 MDL公司的藥物數(shù)據(jù)庫CMC和現(xiàn)有化合物數(shù)據(jù)庫ACD的 化合物樣品庫，獲得了一批與親環(huán)素A具有較強親和力的化合物，包括已知免疫抑制劑環(huán) 孢素A。其次，本發(fā)明采用等離子表面激光共振生物傳感(SPR)研究了環(huán)孢素A抑制輪狀 病毒VP6蛋白與人親環(huán)素A結(jié)合的能力先用IOOmM NHS/400mM EDC活化BIAcore傳感芯 片(Pharmacia LKB Biotechnology)，注入VP6蛋白通過活化的表面，未反應(yīng)的活性基團用 IM乙醇胺(pH 8. 5)失活，再將不同濃度的環(huán)孢素A和親環(huán)素A以lOul/min的流速注入流 動池，連續(xù)記錄所得的共振信號(RU)，用BIAevaluation 2. 1軟件(Pharmacia Biosenor) 分析所得的結(jié)合曲線，計算VP6蛋白與親環(huán)素A的表觀解離常數(shù)。結(jié)果顯示，VP6蛋白與親 環(huán)素A的結(jié)合速率常數(shù)ka = 3. 16xl03s，解離速率常數(shù)kd = 2. δθχΙ Γ4^，結(jié)合平衡常數(shù)Ka =1. 38x10^,解離平衡常數(shù)Kd = 7. 89x1 O^9M ；環(huán)孢素A能夠有效地抑制輪狀病毒VP6蛋 白與人親環(huán)素A的結(jié)合，且隨著環(huán)孢素A的濃度增加，其抑制VP6蛋白與親環(huán)素A結(jié)合的強 度也增加，呈現(xiàn)出良好的劑量效應(yīng)關(guān)系。再次，本發(fā)明在病毒水平上測試了環(huán)孢素A對輪狀病毒感染細胞的保護作用將 ΜΑ104細胞接種于96孔培養(yǎng)板，在溫度37°C、二氧化碳氣體體積分數(shù)為5%的條件下培養(yǎng)， 加入輪狀病毒和不同稀釋濃度的環(huán)孢素A，同時設(shè)病毒空白對照、293FT細胞對照和樣品Π(506對照，觀察細胞變性反應(yīng)(CPE)，并用輪狀病毒特異性熒光抗體染色測定病毒滴度記 錄FFU值。結(jié)果如圖5所示，濃度為IuM或2uM的環(huán)孢素A均對輪狀病毒感染MA104細胞 有較明顯的保護作用。根據(jù)以上實驗結(jié)果，本發(fā)明確證了輪狀病毒VP6蛋白與人親環(huán)素A相互作用的復 合物三維結(jié)構(gòu)模型可以作為抗輪狀病毒藥物作用靶標，用于篩選或設(shè)計能阻斷輪狀病毒 VP6蛋白與人親環(huán)素A相互作用的化合物，從而研發(fā)出高效低毒的特異性抗輪狀病毒藥物。最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過參 照本發(fā)明的優(yōu)選實施例已經(jīng)對本發(fā)明進行了描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當理解，可 以在形式上和 細節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明 的精神和范圍。
權(quán)利要求
抗輪狀病毒藥物作用靶標，其特征在于為輪狀病毒VP6蛋白與人親環(huán)素A相互作用的復合物三維結(jié)構(gòu)模型，所述輪狀病毒VP6蛋白的氨基酸序列如SEQ No.1所示，與人親環(huán)素A相互作用的功能區(qū)域為第52至第100位和第343至第392位氨基酸，其中活性位點包括Asn 53、Ala 348、Val 349、Ile 355和Pro 363；所述人親環(huán)素A的氨基酸序列如SEQ No.2所示，與輪狀病毒VP6蛋白相互作用的功能區(qū)域為第54至第150位氨基酸，其中活性位點包括Arg 55、Gln 63、Lys 125和Arg 148。
2.權(quán)利要求1所述抗輪狀病毒藥物作用靶標的構(gòu)建方法，其特征在于包括以下步驟a、用蛋白組學方法對輪狀病毒感染細胞進行全細胞表達譜分析，發(fā)現(xiàn)輪狀病毒感染可 誘導人親環(huán)素A表達升高；b、用生物信息學方法對輪狀病毒蛋白質(zhì)與人親環(huán)素A的相互作用進行網(wǎng)絡(luò)分析，揭示 輪狀病毒VP6蛋白和人親環(huán)素A有相互作用；c、用同源蛋白模建方法構(gòu)建輪狀病毒VP6蛋白與人親環(huán)素A相互作用的復合物三維結(jié) 構(gòu)模型，確定輪狀病毒VP6蛋白與人親環(huán)素A相互作用的功能區(qū)域和活性位點；d、用分子生物學方法驗證輪狀病毒VP6蛋白與人親環(huán)素A的相互作用，證明輪狀病毒 VP6蛋白與人親環(huán)素A確實存在相互作用；e、針對輪狀病毒VP6蛋白與人親環(huán)素A相互作用的功能區(qū)域和活性位點，用計算機虛 擬篩選方法搜尋活性化合物，并對所得活性化合物進行病毒水平的測試，確證抗輪狀病毒 藥物作用靶標的建立。
3.應(yīng)用權(quán)利要求1所述抗輪狀病毒藥物作用靶標篩選抗輪狀病毒藥物的方法，包括以 下步驟a、針對抗輪狀病毒藥物作用靶標中輪狀病毒VP6蛋白與人親環(huán)素A相互作用的功能區(qū) 域和活性位點，檢測候選化合物與輪狀病毒VP6蛋白的功能區(qū)域和活性位點的結(jié)合常數(shù)， 或者檢測候選化合物與人親環(huán)素A的功能區(qū)域和活性位點的結(jié)合常數(shù)，篩選出具有較強親 和力的化合物；b、檢測步驟a所得化合物抑制輪狀病毒VP6蛋白與人親環(huán)素A結(jié)合的能力，篩選出具 有較強抑制能力的化合物；c、檢測步驟b所得化合物對輪狀病毒感染細胞的保護作用。
全文摘要
本發(fā)明公開了抗輪狀病毒藥物作用靶標，為輪狀病毒VP6蛋白與人親環(huán)素A相互作用的復合物三維結(jié)構(gòu)模型，其中VP6蛋白的功能區(qū)為第52至第100位和第343至第392位氨基酸，活性位點包括Asn 53、Ala 348、Val 349、Ile 355和Pro 363；親環(huán)素A的功能區(qū)為第54至第150位氨基酸，活性位點包括Arg 55、Gln 63、Lys 125和Arg 148；本發(fā)明還公開了該靶標的構(gòu)建方法和應(yīng)用方法，利用該靶標及其應(yīng)用方法能夠簡便快速地篩選或設(shè)計能阻斷輪狀病毒VP6蛋白與人親環(huán)素A相互作用的化合物，研發(fā)出高效低毒的特異性抗輪狀病毒藥物；該靶標的構(gòu)建方法有助于其它藥物作用靶標的構(gòu)建。
文檔編號C12Q1/70GK101863966SQ20101018002
公開日2010年10月20日 申請日期2010年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月21日
發(fā)明者何海洋, 吳玉章, 李晉濤, 王書峰 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學