專利名稱：番茄eil1重組蛋白的制備及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及到分子生物學和基因工程領域中的一種番茄重組蛋白質的制備及其應用。
背景技術：
植物果實是人類的重要食物來源，人們希望通過對果實成熟機理的研究，尋求提高果實 產(chǎn)量、品質的方法。
乙烯是五大植物激素中最簡單的一種，對生長發(fā)育的許多過程，特別是果實發(fā)育、成熟有 著廣泛而深遠的影響。對乙烯信號通路的深入研究能使更加透徹的闡明果實的生長發(fā)育模式 和機制。EIN3/EILs蛋白家族是乙烯信號轉導途徑上一個重要的轉錄因子，該蛋白家族接受乙 烯信號而得到激活，并啟動一系列調節(jié)乙烯的目標基因的表達，對乙烯反應起正調控作用。
番茄不僅是一種被廣泛食用的蔬菜，同時也是一種研究果實發(fā)育成熟的重要模式植物。 Tieman于2001年從番茄克隆了 3個五/AA3-丄汰e基因丄e五/丄7、丄e五/丄2和其中Ze五/L7 基因序列與煙草r五/Z基因的同源性為79%，與擬南芥五/ V3、五/"、 和的同源性 分別為59%、 56%、 52%、和46%。長期以來對番茄基因的研究大多淺止于轉錄水平， 但對在植物生命活動中直接起作用的EIL1蛋白質卻研究甚少。近年來現(xiàn)代分子生物學的研究 趨勢已從基因組學轉向蛋白質組學，蛋白質的功能、結構以及與其他功能因子的相互作用等 已經(jīng)逐漸成為研究重點。如何獲得番茄EIL1蛋白質以供研究及其他功用仍然是一項技術空 白，因此番茄EIL1重組蛋白質的制備是EIL1功能研究的重要基礎，對明確其功能結構及其 調控機制具有重要意義。

發(fā)明內容
本發(fā)明的首要目的是提供一種番茄EIL1重組蛋白質的制備方法。采用分子生物學方法克 隆得到番茄￡/丄7基因，并構建EIL1重組蛋白質表達工程菌，通過甲醇誘導培養(yǎng)的方式批量 獲得人工表達的EIL1重組蛋白質。
通過下述方案來實現(xiàn)
番茄EIL1重組蛋白質的制備，包括如下步驟
(一) 番茄EIL1重組蛋白質表達工程菌的構建
采用pPIC9k為番茄五/ZJ基因的表達載體，以畢赤酵母KM71為表達宿主細胞，構建的 番茄EIL1重組蛋白質表達工程菌，在不含組氨酸的MD培養(yǎng)基上篩選陽性轉化子，通過G418 抗性壓力篩選高表達效率的工程菌，最終篩選到能大量表達分泌型的番茄EIL1重組蛋白質的 工程菌。
(二) 重組蛋白質的誘導表達
富集培養(yǎng)表達工程菌后，將菌體轉移到BMMY培養(yǎng)基中，采用0.5%的甲醇誘導表達外
源重組蛋白質。
(三) 重組蛋白質的分離純化
將表達產(chǎn)物與His-bind樹脂充分混勻，待重組蛋白與樹脂充分結合后，采用咪唑梯度洗 脫的方式，逐步將雜蛋白洗去，最后采用高濃度咪唑溶液將目的重組蛋白質洗脫，透析過后， 經(jīng)冷凍干燥最終獲得番茄EIL1重組蛋白質。
本發(fā)明的再一 目的在于提供番茄EIL1重組蛋白質的應用。 制備的番茄EIL1重組蛋白質能在多個領域得到應用，例如
(一) 番茄EIN3/EILs蛋白質家族DNA結合功能域(DNA Binding Domain, DBD)及 轉錄活性功能域(Transcriptional Activation Domain, TAD)研究應用
人工合成DNA結合探針，與番茄EIL1重組蛋白相雜交后，經(jīng)凝膠阻滯分析研番茄EIL1 蛋白質的DBD及TAD區(qū)域。
(二) 番茄EILl重組蛋白在篩選番茄乙烯應答基因上的應用
將制備的番茄EIL1重組蛋白質固定在基質上，與番茄總DNA相互雜交后，反復洗脫非 目的核酸；將EILl-核酸復合體從基質上洗脫，用蛋白酶消化EIL1重組蛋白，最終獲得番茄 乙烯應答基因片段。
(三) 番茄EIL1單克隆抗體的制備方面的應用
番茄EIL1重組蛋白質能應用于番茄EIL1單克隆抗體的制備，該單克隆抗體在番茄五/ZJ 基因蛋白質表達水平的研究有極重要的作用，具體應用如下
A、 番茄EILl蛋白質作為免疫原與佐劑混合制成乳劑皮下注射BALB/c小鼠，進行免疫。
B、 番茄EIL1蛋白質作為包被原，ELISA檢測免疫血清的效價。


圖1為番茄EIL1重組蛋白質表達載體的結構圖。
圖2為工程菌誘導表達產(chǎn)物和分離純化后的番茄EIL1重組蛋白質的SDS-PAGE電泳圖； 其中，M:蛋白質Marker, 1:純化的EIL1重組蛋白質，2-4:工程菌表達產(chǎn)物，C:對照菌 表達產(chǎn)物。
具體實施例方式
通過附圖和實施例對本發(fā)明具體實施方式
進行說明。 實施例1番茄EIL1重組蛋白表達載體的構建
選用分泌型酵母表達載體pPIC9k作為目的基因的表達載體，該載體能表達分泌型的外源 蛋白質，有利于重組蛋白質的分離純化。
(1) 設計上游引物PEIL^coRI : 5'-TTTGAATTCCATCATCATCATCATCATATGA TGATGTTTGAGGAAATGGGGTTCAG-3，，下游引物PEIL-iVofl: 5，-TTCGCGGCCCTAGTAC CAAATAGGAGCATC-3'，以番茄果實cDNA為模板，進行PCR擴增獲得目的基因(94°C， 3 min， 94°C， 1 min， 68°C, 2min， 35個循環(huán)，72°C， 10min)。
(2) 采用EcoRI和ATon限制性內切酶雙酶切目的基因片段和pPIC9K載體，在T4連接 酶的催化下，16'C連接反應12h。
(3) 將連接產(chǎn)物與100;/L的大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞混合，采用熱激法將重組質粒 轉化進入JM109宿主細胞，在含有Amp抗生素的LB培養(yǎng)基平板上篩選陽性轉化子，經(jīng)PCR 檢測陽性克隆，并基因測序。表達載體結構圖如圖l所示。
實施例2番茄EIL1重組蛋白質表達工程菌的構建
(1) 重組質粒pPIC9k-EILl經(jīng)I酶切后，呈線性化。
(2) 將線性化后的重組質粒與80 #1山梨醇懸浮的畢赤酵母KM71感受態(tài)細胞混勻， 轉入預冷的電轉化杯中，冰浴5min。
(3) 將電轉化杯放于電脈沖儀的兩極間電擊2次，電擊條件為電壓1400 V，電阻 200 0，電功率25;/F，電擊時間2-4ms，溫度0。C。
(4) 加入lmL預冷的lmM山梨醇，混勻后以200/d每平板的量涂布于MD培養(yǎng)基 平板上。
(5) 28。C培養(yǎng)4 6d，待單菌落長出后，挑單菌落接種于lmLYPD液體培養(yǎng)基中，富 集培養(yǎng)12h，超聲裂解細胞，以重組酵母的總DNA為模板，進行PCR檢測陽性轉化菌株。
(6) G418梯度抗性壓力篩選高效表達菌株。
實施例3重組蛋白質的誘導表達
(1) 將篩選到的高效表達的酵母菌株接種于5mLYPD培養(yǎng)液中，28°C， 220rpm，培 養(yǎng)16 h。
(2) 取100/^L上述菌液，接種于lOmLBMGY培養(yǎng)基中，28°C， 220rpm，富集培養(yǎng)
24 h。
(3) 將上述菌液4。C， 3500rpm離心5min，收集菌體，棄上清，將細胞重懸于20mL BMMY培養(yǎng)液中，加入終濃度為0.5%的甲醇，28°C， 220rpm誘導培養(yǎng)。
(4) 每24h補充一次甲醇，連續(xù)誘導培養(yǎng)4d后，4'C， 12000 rpm離心15 min，棄 沉淀，收集表達產(chǎn)物，加入PMSF后保存于-2(TC備用。見圖2中2、 3、 4泳道。
實施例4重組蛋白質的分離純化
(1) 將100 mL表達產(chǎn)物移入規(guī)格為D50 mm，分子量為5000的透析袋內，4°C， 50 倍產(chǎn)物體積的無菌水透析16 h，每隔4 h換水一次。
(2) 將透析后的蛋白溶液4°C， 12000 rpm離心棄沉淀，緩慢攪拌下加入150 mL PEG6000 (50%， w/v溶于無菌水)使其終濃度達到30%。
(3) 冰上操作，繼續(xù)攪拌混合溶液lh，使蛋白質完全沉淀。4'C， 10000rpm離心10 min，收集蛋白質沉淀。
(4) 冰上操作，采用2倍沉淀體積的pH7.5的Tris-HCl溶解蛋白沉淀，將蛋白質濃 縮液-2(TC保存?zhèn)溆谩?br> (5) 取lmL蛋白質濃縮液，與200/zL His-bind樹脂充分混勻，室溫孕孵1 h，使目 的重組蛋白質充分與樹脂結合。
(6) 采用漂洗緩沖液(pH7.9， 0.5MNaCl， 20mMTris-HCl， 0.2M咪唑)反復漂洗 樹脂，充分洗脫雜蛋白
(7) 采用洗脫緩沖液(pH7.5， 0.5mMNaCl， 20 mMTris-HCl， 1M咪唑)洗脫目的 重組蛋白質。見圖2中l(wèi)泳道。
(8) 4°C，在去離子水中透析上述的純化蛋白，時間為16h;然后冷凍干燥，最終獲 得番茄EIL1重組蛋白質干粉。
實施例5番茄EILl重組蛋白質在EIN3/EILs蛋白質結構和功能研究的應用
A. 取制備的番茄EIL1重組蛋白質進行晶體衍射試驗，預測EIL1蛋白的三級結構。
B. 取2^L番茄EILl重組蛋白質與l/iL標記好的核酸探針、2^L凝膠阻滯5倍結 合緩沖液、5 ^L無核酸酶的水混勻，室溫反應20min后，可進行凝膠阻滯實驗， 根據(jù)結果分析EIL1蛋白的的DBD和TAD結構及區(qū)域。
實施例6番茄EIL1重組蛋白質在番茄乙烯應答基因篩選中的應用
(1) 取10〃L番茄EIL1重組蛋白質與20//LHis-bind樹脂充分混勻，室溫孕孵30min。
(2) 往上述樹脂中加入10 //L的超聲破碎過的番茄總DNA和10 /iL凝膠阻滯5倍結 合緩沖液，室溫反應20min，每5min混勻一次。
(3) 使用pH7.9， 0.5mMNaCl， 20 mMTris-HCl的漂洗緩沖液，反復漂洗上述樹脂。
(4) 使用pH7.5， 0.5mMNaCl， 20 mM Tris-HCl的洗脫緩沖液，將蛋白陽核酸復合體 從樹脂上洗脫下來。
(5) 加入等體積的苯酚氯仿異戊醇(25: 24: 1)，反復抽提2次，4°C， 12000 rpm 離心10min，取上清。
(6) 加入2倍體積的預冷無水乙醇，冰上放置lh， 4'C， 12000 rpm離心10 min，棄 上清，室溫放置，待乙醇完全揮發(fā)，加入20^L去離子水。
(7) 將獲取的DNA片段插入Ti質粒，并進行測序分析。
實施例7重組蛋白質在番茄EIL1單克隆抗體制備方面的應用
(1) 將番茄EIL1重組蛋白質與弗氏完全佐劑等體積混勻，腹腔注射BALB/c小鼠，進 行第一次免疫，劑量50^g/只。
(2) 3周后，將EIL1重組蛋白質與弗氏不完全佐劑等體積混勻，腹腔注射以上小鼠， 進行第二次免疫，劑量50/ig/只。
(3) 再3周后，將EIL1重組蛋白質不加佐劑，腹腔注射以上老鼠，進行第三次免疫， 劑量50^g/只。
(4) 第三次免疫10天后，取小鼠尾部血清，釆用間接ELISA法，與EIL1重組蛋白質
進行免疫反應，檢測抗體效價。 對實施例中的一些名詞解釋 JM109: —種大腸桿菌宿主菌； KM71: —種畢赤酵母宿主菌； Amp:氨芐青霉素， 一種光譜殺菌抗生素；
G418: —種氨基糖苷類抗生素，與慶大霉素和卡那霉素相似；
YPD、 MD、 BMGY、 BMMY:培養(yǎng)基，配方參照《分子克隆實驗指南》;
PMSF:苯甲基磺酰氟，是一種蛋白酶抑制劑；
His-bind樹脂能與聚組氨酸肽鏈特異性結合的樹脂。
序列表
〈110>重慶大學
<120〉番茄EIL1重組蛋白的制備及其應用
〈130〉
<160> 4
〈170> Patentln version 3.5
〈210> 1
〈211〉 56 〈212〉腿 <213>人工序列
<220>
〈221〉 misc—feature 〈222〉 (1)..(56)
〈223〉用于番茄EIL1基因擴增的前引物PEIL-EcoR I
〈400〉 1
tttgaattcc atcatcatca tcatcatatg atgatgtttg gigga威ggg gttcag 56
〈210〉 2
<211> 30
〈212〉 DNA <213>人工序列
〈220>
〈221〉 misc—feature 〈222〉 (1)..(30)
<223>用于番茄EIL1基因擴增的后引物PEIL-Not I
〈400〉 2
ttcgcggccc tagtaccaaa taggagcatc 30
<210> 3
〈211〉 610
〈212〉 PRT <213〉人工序列
<220〉
<221> misc一feature
<222> (1)..(610)
<223>番茄EIL1重組蛋白質的氨基酸殘基序列
〈400〉 3
Met Met Met Phe Glu Glu Met Gly Phe Cys Gly A印Leu Asp Phe Phe
15 10 15
Pro Ala Pro Leu Lys Glu Val Glu Val Ser Ala Pro Gin Ser Gin Thr
20 25 30
Glu Pro Asp Ser Val Val Asp Asp Asp Tyr Ser Asp Glu Glu Glu lie
35 40 45
Glu Val Asp Glu Leu Glu Arg Arg Met Trp Arg Asp Lys Met Lys Leu
50 55 60
Lys Arg Leu Lys Glu Met Ser Lys Ser Lys Glu Gly Val Asp Pro Ala
65 70 75 80
Lys Gin Arg Gin Ser Gin Glu Gin Ala Arg Arg Lys Lys Met Ser Arg
85 90 95
Ala Gin Asp Gly lie Leu Lys Tyr Met Leu Lys Met Met Glu Val Cys
100
Lys Ala Gin Gly 115
Val Ser Gly Ala 130
Arg Phe Asp Arg 145
His Ala lie Pro
Pro His Thr Leu 180
Ser Ala Leu Met 195
Glu Lys Gly Val 210
Trp Pro Gin Leu 225
Lys Pro His Asp
Val lie Lys His 260
Arg Gin Ser Lys 275
105 110 Phe Val Tyr Gly lie lie Pro Glu Lys Gly Lys Pro
120 125 Ser Asp Asn Leu Arg Glu Trp Trp Lys Asp Lys Val
135 140 Asn Gly Pro Ala Ala lie Ala Lys Tyr Gin Ala Asp 150 155 160
Gly Met Asn Glu Gly Ser Asn Pro Val Gly Pro Thr 165 170 175
Gin Glu Leu Gin Asp Thr Thr Leu Gly Ser Leu Leu
185 190 Gin His Cys Asp Pro Pro Gin Arg Arg Phe Pro Leu
200 205 Pro Pro Pro Trp Trp Pro Thr Gly Lys Glu Asp Trp
215 220 Gly Leu Gin Lys Asp Gin Gly Ser Leu Pro Tyr Lys 230 235 240
Leu Lys Lys Ala Trp Lys Val Gly Val Uu Thr Ala 245 250 255
Met Phe Pro Asp lie Ala Lys lie Arg Lys Leu VaJ
265 270 Cys Leu Gin Asp Lys Met Thr Ala Lys Glu Ser Ala 280 285
Thr Trp Leu Ala lie lie Ser Gin Glu Glu Ala Leu Ala Arg Glu Uu
290 295 300
Tyr Pro Asp Arg Cys Pro Pro Leu Ser Ser Ala Gly Val Ser Gly Asn
305 310 315 320
Phe Met Leu Asn Asp Ser Ser Glu Tyr Asp Val Glu Gly Ala Gin Asp
325 330 335
Glu Pro Asn Phe Asp Val His Glu Gin Lys Pro Asn His Leu Asn Leu
340 345 350Leu Asn lie Ser Ala Glu Arg Phe Lys Glu Thr Met Pro Leu Gin Gin 355
His Pro Asn Lys
Gin Ser 370
Leu Lys Arg Lys Gin 385
lie Tyr Thr Cys
Phe 360
Glu Leu Val Thr
Asp Glu Leu Val Thr Asn 375 380 Asn Glu Pro Thr Val Met
Pro 365 Leu
Ala Asn Glu Pro Thr Val Met Met 390 395 Phe Leu Gin Cys Pro His Asn Glu Leu
Asp Phe Ser Asp
Gly Phe Gin Asp 420
Ser Thr Cys Phe
Glu Phe Leu Gin Cys Pro 405 410 Arg Ser Ser Arg Asp Asn His Gin Phe
Tyr Arg Ser 435
Pro Val Val Phe Pro Gin Gin Tyr Val
Gly 440 Gin
Asp 425
Val Ser Asn Phe
Gin Lys 400 Arg His 415
Cys Leu
Ala 430
lie Asn Glu
Val Lys 450
Ala Leu Pro Val Asn Gin 465 470 Gly Val Pro Glu Asp Gly Gin Arg Met
Pro 455
Gly Pro Pro Ser
Gin 460
Phe Asp Leu Ser 475
Asn Glu Leu Met
Gin 445
Pro Lys Ser Ser
Tyr Asp Ser Asp 500
Lys Glu Gin Pro
Asp Gly Gin Arg Met lie 485 490 Val Gin Gly Ser Lys Arg Gin Asn Arg
Ala Leu Thr 515
Asn Tyr Leu Leu Ser Gin 530
Thr Asn lie Ser Thr Thr 545 550 Asp Gin Ser Lys Ala Phe
Lys 505
His Gin Gin Pro Arg 520
lie Met Asp Gly
Gly lie 480 Ser lie 495 Gly Asn lie 510
His Gin Asp
Gly 535
Gin Ser Met Leu
Val 525
lie Phe Lys Asn
Asn 540
Gin Val Asp
Pro 555
Asn Ala Gly Ser Asn Asp Asn Phe
Met Phe Gly Ser 580 lie
Ala Phe Asn Ala Gly Ser 565 570 Pro Phe Asn lie Gin Ser Thr Asn Tyr
Pro Phe 560 His Phe 575
Gly Asn
Gin Ser Thr Asn Tyr Asn 585 590 Leu Pro Ser lie Gly Tyr Asp Thr Thr Pro Lys Gin Asp Ala Pro lie
595 600 605
Trp Tyr 610
<210> 4
<211〉 13
<212> PRT <213〉人工序列
〈220>
<221> misc一feature
〈222> (8).. (13)
<223>重組蛋白N端的聚組氨酸標簽，用于重組蛋白質的分離和鑒定
<400> 4
Glu Ala Glu Ala Tyr Val Glu His His His His His His 1 5 10
權利要求
1.一種番茄EIL1重組蛋白質的制備方法及其應用，其特征在于一種制備番茄EIL1重組蛋白的方法及重組蛋白相關的應用。
2. 權利要求l所述的重組蛋白的制備方法，包括(1) 融合基因的克隆設計引物上游引物PEIL-五coRI : 5，-TTTGAATTCCATCATCATCATCATCATATGATG ATGTTTGAGGAAATGGGGTTCAG-3 ，，下游引物PEIL-iVof 1: 5 ， -TTCGCGGCCCTAGTACC AAATAGGAGCATC-3'，以番茄cDNA為模板，PCR擴增融合基因。(2) 酵母表達工程菌的構建采用￡COR I和iVW I限制性內切酶雙酶切目的基因片段和pPIC9K載體，在丁4連接酶的 催化下，16t連接反應12h。將連接產(chǎn)物與100//L的大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞混合，采 用熱激法將重組質粒轉化進入JM109宿主細胞，在含有Amp抗生素的LB培養(yǎng)基平板上篩選 陽性轉化子，進行PCR鑒定，并進行基因測序。重組質粒pPIC9k-EILl經(jīng)S"cI酶切后，電 轉化進入畢赤酵母KM71，涂布于缺乏組氨酸的MD培養(yǎng)基中，挑單菌落進行PCR鑒定，G418 梯度抗性壓力篩選高表達菌株。(4) 重組蛋白質的誘導表達將酵母表達工程菌富集培養(yǎng)后，轉移至BMMY培養(yǎng)基中，保持終濃度為0.5%的甲醇連續(xù)誘導培養(yǎng)4天。(5) 重組蛋白質的分離純化使用PEG6000對表達產(chǎn)物進行濃縮，取1 mL蛋白質濃縮液，與200 //L His-bind樹脂 充分混勻，室溫孕孵lh，使目的重組蛋白質充分與樹脂結合。采用漂洗緩沖液(pH7.9， 0.5 MNaCl， 20mMTris-HCl， 0.2M咪唑)反復漂洗樹脂，充分洗脫雜蛋白采用洗脫緩沖液(pH 7.5， 0.5mMNaCl， 20 mM Tris-HCl， 1 M咪唑)洗脫目的蛋白質。4°C,在去離子水中透析 洗脫的重組蛋白質16h，冷凍干燥后，獲得番茄EIL1重組蛋白質干粉。
3. 權利要求1所述的番茄EIL1重組蛋白的應用，例如(1) 重組蛋白質在番茄EIN3/EILs蛋白質在DBD和TAD研究領域的應用，其特征在于重 組蛋白具有完整的生物活性。(2) 重組蛋白在篩選番茄乙烯應答基因研究領域的應用，其特征在于重組蛋白具有聚組 氨酸標簽，能吸附于His-Bind樹脂，同時具有DNA結合活性，能與乙烯應答基因結合。(3) 重組蛋白在番茄EIL1單克隆抗體制備過程中的應用，其特征在于重組蛋白具有抗 原活性。
4.權利要求2中所制備的番茄EIL1重組蛋白，其特征在于一種帶有聚組氨酸標簽的番茄EIL1 重組蛋白質，是由(a)和(b)所組成的蛋白質-(a) 其氨基酸序列如SEQIDNO: 3所示；(b) 其氨基酸序列如SEQIDNO: 4所示，處于(a)肽鏈的N-端。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種番茄EIL1重組蛋白質的制備方法，該方法包括表達重組蛋白的基因工程菌的構建；重組蛋白的誘導表達；重組蛋白的分離純化。本發(fā)明還提供了上述番茄EIL1重組蛋白質的一些應用，包括番茄EIN3/EILs蛋白家族的結構、功能研究應用；番茄乙烯應答基因的篩選；番茄EIL1單克隆抗體的制備等。
文檔編號C07K16/16GK101368183SQ20081006971
公開日2009年2月18日 申請日期2008年5月22日 優(yōu)先權日2008年5月22日
發(fā)明者季 李, 李正國, 楊迎伍, 羅安才, 偉 鄧 申請人:重慶大學