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  • 多肽作為抑球蟲劑和/或抑組織滴蟲劑的用途的制作方法

    文檔序號(hào):3540662閱讀:400來(lái)源:國(guó)知局

    專利名稱::多肽作為抑球蟲劑和/或抑組織滴蟲劑的用途的制作方法第1/17頁(yè)多肽作為抑球蟲劑和/或抑組織滴蟲劑的用途本發(fā)明涉及下文定義的多肽在食物或動(dòng)物詞料中作為抑球蟲劑(coccidiostat)禾Q/或抑組織滴蟲劑(histomonastat)的用途。本發(fā)明多肽的一個(gè)例子是來(lái)自萬(wàn)ac/〃uy/z'c/zem/o,&ATCC14580的所謂的L12蛋白質(zhì),其具有本文SEQIDNO:2的氨基酸+1至1」+85的氨基酸序列(在下文中稱作SEQIDNO:2的氨基酸1-85)。球蟲(Coccidia)是給予一種單細(xì)胞原生動(dòng)物的屬名,所述單細(xì)胞原生動(dòng)物是感染脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物的腸寄生蟲。所述生物引起球蟲病,并通常沉積在小腸如結(jié)腸中。農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物被球蟲感染不僅可嚴(yán)重降低生長(zhǎng),而且會(huì)危及生命。球蟲感染的癥狀包括上皮細(xì)胞損失、腸粘膜剝脫和腹瀉(通常伴隨著失血)。對(duì)一些農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物(如家禽)而言,球蟲感染可能是致命的,否則嚴(yán)重?fù)p傷動(dòng)物的健康。家禽尤其易受球蟲病傷害是因?yàn)槿舾蓚€(gè)原因(1)6到8天的寄生周期在第2周和第4周之間的關(guān)鍵階段擊中它們,該階段時(shí)通常表現(xiàn)出最大的生長(zhǎng)。因?yàn)榧纳x實(shí)際上破壞整個(gè)腸上皮,所以營(yíng)養(yǎng)物的吸收被顯著降低,這導(dǎo)致可觀的生長(zhǎng)抑制。直到5或6周屠宰時(shí),已沒(méi)有足夠的時(shí)間恢復(fù)。(2)存在7種能夠感染家禽的Eimeria物種,多于任何其它的動(dòng)物范疇,并且它們中至少4種在商業(yè)操作中經(jīng)常見到。因此,當(dāng)一種感染循環(huán)己被終止時(shí),另一種可能處于早期階段,從而使球蟲病成為慢性的。(3)在家禽中觀察到致病性最強(qiáng)的物種KJS/5.2.2007(Eimeriatenella,E.necatrix),其誘導(dǎo)嚴(yán)重的出血,并且在某些情況下可引起多達(dá)50%的死亡率。這樣的急性球蟲病病例可輕易毀掉家禽農(nóng)場(chǎng)主。(4)深厚垃圾(deeplitter)上家禽的密集飼養(yǎng)(一棟房中100,000或更多只雞)便于家禽通過(guò)食糞便接近糞便中的球蟲傳染期,并因此支持該疾病在整個(gè)家禽群體間快速傳播。如果衛(wèi)生條件不嚴(yán)格,則該疾病也會(huì)傳遞至相同農(nóng)場(chǎng)的其它家禽舍內(nèi),并在該場(chǎng)所停留數(shù)年。為了抗擊球蟲病,通常對(duì)動(dòng)物伺料補(bǔ)充抑球蟲劑。已被EEC批準(zhǔn)用于家禽(雞、火雞、肉雞和蛋雞)的抑球蟲劑包括磺酰亞胺(sulphonimides)、安普羅銨、地考喹酯和離子載體。然而,這些抑球蟲劑中的一些是非天然的無(wú)機(jī)化合物,并因此必須被合成制造。這表示它們相對(duì)昂貴。因此需要天然存在的抑球蟲劑。組織滴蟲病也是由原生動(dòng)物引起的。在該特異的情況下,原生動(dòng)物感染火雞、雞以及偶然地其它鵪鶉目鳥(galliformbird)的盲腸,然后感染肝。在火雞中,大部分感染是知名的;在其它鳥中,死亡率較低。原生動(dòng)物寄生蟲i/i^tomo"aw附e/eagn.cfe最經(jīng)常在盲月5線蟲/^eteraAzJg"〃z>zfln^的胚月臺(tái)卵中傳播,有時(shí)通過(guò)與被感染的鳥接觸而直接傳播。爆發(fā)通過(guò)直接接觸在群體中快速蔓延。較大百分比的雞帶有該蠕蟲,并且組織滴蟲位于兩種性別的成年蠕蟲中。這些蚯蚓物種可帶有含Hme/eagn'tfo的/7ga//ham幼蟲,其對(duì)雞和火雞均有感染性。we/eag^fo在i/"eraA^卵中存活更長(zhǎng)時(shí)間,所述股temfe卵是有抵抗力的,并可在土壤中存活數(shù)年。線蟲進(jìn)入后數(shù)天,組織滴蟲由盲腸中的幼蟲釋放,并在盲腸組織中快速?gòu)?fù)制。寄生蟲遷移進(jìn)粘膜下層和粘膜肌層并引起廣泛和嚴(yán)重的壞死。組織滴蟲通過(guò)血管系統(tǒng)或通過(guò)腹膜腔達(dá)到肝,肝表面上迅速出現(xiàn)圓形的壞死斑。組織滴蟲與其它腸道生物如細(xì)菌和球蟲相互作用,并且依賴于它們得到完全毒性。傳統(tǒng)上組織滴蟲被認(rèn)為能感染火雞,但是對(duì)雞幾乎沒(méi)有損傷。然而,在雞中的爆發(fā)能夠引起高發(fā)病率、中度死亡率和廣泛的報(bào)廢(culling)。在雞中肝損傷傾向于較不嚴(yán)重,但是在年輕的蛋雞(layerpullet)或肉雞(breederpullet)中發(fā)病率會(huì)特別高。為了抗擊組織滴蟲病,通常對(duì)動(dòng)物飼料補(bǔ)充抑組織滴蟲劑。家禽(雞,火雞)使用的抑組織滴蟲劑可包括例如4-硝基苯胂酸,這是一種非天然的化合物因此必須合成制造。另外已知UK當(dāng)局在2003年撤銷了剩余的最后一種用于火雞的被授權(quán)的抑組織滴蟲劑Nifursol。因此,還存在對(duì)新的和另外的例如天然存在的抑組織滴蟲劑的需要。除了使用天然化合物的常見優(yōu)點(diǎn)之外,這些可能比合成化合物更便5宜。本發(fā)明基于下述發(fā)現(xiàn)下文定義的多肽具有針對(duì)球蟲病和組織滴蟲病的活性,并因此可被用作抑球蟲劑和/或抑組織滴蟲劑。盡管所述多肽已被建議作為動(dòng)物飼料的添加劑(WO-A-2006/099871),但是迄今為止尚未明確這些化合物能夠有效對(duì)抗球蟲或組織滴蟲病。事實(shí)上,在WO-A-2006/099871中是將多肽添加進(jìn)動(dòng)物詞料中,從而通過(guò)改善飼料轉(zhuǎn)化比(FCR)和/或調(diào)控腸微生物區(qū)系來(lái)促進(jìn)動(dòng)物飼料利用。并且未提到任何針對(duì)球蟲和組織滴蟲病的活性。因此,本發(fā)明涉及下述多肽作為抑球蟲劑和/或抑組織滴蟲劑的用途,所述多肽選自(a)包含下述氨基酸序列的多肽,所述氨基酸序列與SEQIDN0:2的氨基酸1-85具有至少33%的同一性程度;(b)由在低嚴(yán)格度條件下與(i)SEQIDNO:1的核苷酸124-378,(ii)至少100個(gè)核苷酸的(i)的亞序列,或(iii)(i)或(ii)的互補(bǔ)鏈;雜交的核酸序列編碼的多肽;(c)具有SEQIDNO:2的氨基酸1-85的氨基酸序列的多肽變體,其包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代、缺失、延伸和/或插入;(dMa)或(b)的等位變體;和(e)(a)、(b)、(c)或(d)的片段。通過(guò)使用在上文中被定義為例如抑球蟲劑的多肽,可使用針對(duì)球蟲病被治療的人或動(dòng)物來(lái)說(shuō)更可能被接受的天然存在的化合物。另外,工業(yè)和消費(fèi)者團(tuán)體通常贊成使用天然存在的化合物而不是合成化合物。多肽是有機(jī)的,并因此可比合成的無(wú)機(jī)化合物更便宜地提供。在一些具體的實(shí)施方案中,多肽具有下述氨基酸序列、基本由下述氨基酸序列組成或由下述氨基酸序列組成,所述氨基酸序列與SEQIDNO:2的氨基酸1-85具有至少33%的同一性程度,例如SEQIDNO:2的氮基酸1-85的多肽。其它特定的例子是SEQIDNO:8、9和10任一的氨基酸1-85的多肽(在本文實(shí)施例1的PCR-測(cè)試的基礎(chǔ)上被鑒定為L(zhǎng)12-樣)。本發(fā)明的多肽可以是細(xì)菌或真菌多肽。在第二個(gè)具體的實(shí)施方案中,多肽是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌多肽如Sacz7/^多肽或其變體,例如為S"d//^//c/em/orw^y多月太,例如衍生自5ad〃wfeAew/onrn^ATCC14580,其為"cAem/w7m、的模式株并可根據(jù)要求得自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心ATCC。優(yōu)選的Bac"/us/z'c/iem/w7m^菌株在本文實(shí)施例1的測(cè)試中是陽(yáng)性的,例如以下Sacz'〃w//cAem/orm^菌株ATCC14580(=NCIB9375)、NCIMB6346(=DSM8785)、NCTC1024、NCTC1025、NCTC2120、NCTC7589、NCTC9932、ATCC21424、NCIMB10689和ATCC53757。本發(fā)明的第二方面涉及上文定義的多肽在抑球蟲劑或抑組織滴蟲劑組合物的制備中的用途。本發(fā)明的又一方面涉及動(dòng)物飼料組合物(如適用于單胃或非反芻動(dòng)物),其包含如上文定義的多肽,所述多肽作為抑球蟲劑和/或抑組織滴蟲劑存在。根據(jù)本發(fā)明的多肽優(yōu)選地以具有抑球蟲劑活性或有效對(duì)抗球蟲的量存在。術(shù)語(yǔ)動(dòng)物包括所有動(dòng)物。除家禽外其它動(dòng)物的例子是反芻動(dòng)物,包括例如綿羊、山羊和牛(cattle),例如牛(cow)如肉牛和奶牛。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中,動(dòng)物是非反芻動(dòng)物。非反芻動(dòng)物包括寵物動(dòng)物例如貓或犬,和單胃動(dòng)物例如除家禽以外的豬(pig)或豬(swine)(包括但不限于小豬、正在生長(zhǎng)的豬和大母豬(sow));魚(包括但不限于鮭魚、鱒魚、羅非魚、鯰魚和鯉魚);和甲殼動(dòng)物(包括但不限于奸和對(duì)蟲下)。本發(fā)明的又一方面涉及預(yù)混物或添加劑組合物,如要被添加進(jìn)一種或多種可食用的飼料物質(zhì)或成分中,例如用于制備或補(bǔ)充現(xiàn)存的飼料,形成伺料組合物。根據(jù)本發(fā)明,多肽可作為經(jīng)分離的純多肽或在多肽的混合物中使用。如本文所定義的,"經(jīng)分離的"或"純"多肽是基本不含其它多肽的多肽,例如至少80%純,優(yōu)選地至少85%、86%、87%、88%、89%或至少90%純,更優(yōu)選地至少91%、92%、93%、94%、95%或至少96%純,如通過(guò)SDS-PAGE所測(cè)定的(例如通過(guò)考馬斯-染色并隨后通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法掃描)。也可通過(guò)HPLC,優(yōu)選地通過(guò)RP-HPLC測(cè)定純度(例如使用WatersM-BondapakCl8柱,流動(dòng)相A:0.1%TFA,流動(dòng)相B:乙腈+0.1%TFA,在280nm下檢測(cè))。SDS-PAGE純度以及HPLC純度是指相對(duì)于總蛋白質(zhì)量的本發(fā)明的多肽量。在可選的實(shí)施方案中,多肽可以是至少20%、40%、60%或至少70%純的??赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法如KjddaW方法(A.O.A.C.,1984,OfficialMethodsofAnalysis14thed.,AssociationofOfficialAnalyticalChemists,WashingtonDC)來(lái)測(cè)定總蛋白質(zhì)的量,并且可通過(guò)本領(lǐng)域也已知的SDS-PAGE和隨后的掃描測(cè)定本發(fā)明的多肽量。由本發(fā)明的核酸序列編碼的多肽也包括融合多肽或可切割的融合多肽,其中另一多肽與多肽或其片段的N-端或C-端融合。融合多肽通過(guò)將編碼另一多肽的核酸序列(或其部分)與本發(fā)明的核酸序列(或其部分)融合產(chǎn)生。生產(chǎn)融合多肽的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的,并且包括連接編碼多肽的編碼序列,使得它們按照讀碼框融合,并且融合多肽的表達(dá)處于相同啟動(dòng)子和終止子的控制下。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中,多肽是低變應(yīng)原性變體,其被設(shè)計(jì)為暴露于動(dòng)物(包括人)時(shí)引起降低的免疫應(yīng)答。術(shù)語(yǔ)免疫應(yīng)答應(yīng)當(dāng)被理解為暴露于多肽的動(dòng)物免疫系統(tǒng)的任何反應(yīng)。一種免疫應(yīng)答是變應(yīng)性應(yīng)答,其導(dǎo)致暴露的動(dòng)物中提高的IgE水平??墒褂帽绢I(lǐng)域已知的技術(shù)制備低變應(yīng)原性變體。例如可將多肽與多聚體部件綴合,所述多聚體部件掩蔽涉及免疫應(yīng)答的多肽部分或表位。與多聚體的綴合可涉及多聚體與多肽的體外化學(xué)偶聯(lián),例如WO96/17929、WO98/30682、WO98/35026禾口/或WO99/00489中所述。綴合可另外或可選地涉及多聚體與多肽的體內(nèi)偶聯(lián)。這類綴合可通過(guò)編碼多肽的核苷酸序列的基因工程完成。提供低變應(yīng)原性變體的另一種方式是編碼多肽的核苷酸序列的基因工程,從而引起多肽自身寡聚體化,結(jié)果是多肽單體可遮蔽其它多肽單體的表位,從而降低寡聚體的抗原性。這類產(chǎn)物及其制備描述于例如WO96/16177中。免疫應(yīng)答中涉及的表位可通過(guò)多種方法鑒定,如WO00/26230和WO01/83559中所述的噬菌體展示方法,或EP561907中所述的隨機(jī)方法。一旦鑒定了表位,可通過(guò)已8知的基因操作技術(shù)如位點(diǎn)定向誘變(見例如WO00/26230、WO00/26354和/或WO00/22103)改變其氨基酸序列,以產(chǎn)生多肽改變的免疫學(xué)特性,或可在足夠接近表位處進(jìn)行多聚體的綴合,使得多聚體遮蔽表位。在又一方面中,本發(fā)明涉及3""7/w菌株在動(dòng)物飼料中的用途,所述菌株的DNA被收獲和用作PCR反應(yīng)中的模板時(shí),導(dǎo)致產(chǎn)生約0.4kb大小的PCR片段,所述PCR反應(yīng)使用SEQIDNOs:6和7作為引物。該測(cè)試用于鑒定具有L12-樣基因的菌株,見本文的實(shí)施例1。這些S^^/m菌株也可用于制備在動(dòng)物飼料中用作抑球蟲劑的組合物。在第一個(gè)具體的實(shí)施方案中,Sa"7/w菌株是益生菌微生物。術(shù)語(yǔ)"益生菌"通常表示喂養(yǎng)給動(dòng)物(包括鳥)的非致病性細(xì)菌,作為防止致病微生物(例如protazoa)建群的一種途徑。益生菌也可以被定義為活的,或可存活的微生物,其有益地影響健康和有正常機(jī)能的人和動(dòng)物的腸內(nèi)平衡。在第二個(gè)具體的實(shí)施方案中,5a"7/m菌株以孢子形式被使用。孢子可以是外生孢子或優(yōu)選地為內(nèi)生孢子。內(nèi)生孢子是在生物(通常為細(xì)菌)內(nèi)產(chǎn)生的任何孢子。內(nèi)生孢子可在環(huán)境脅迫周期間存活,并因此能夠存活著通過(guò)上部胃腸道的苛刻(酸性)環(huán)境,同時(shí)僅在達(dá)到腸道時(shí)顯示其作用,在所述腸中會(huì)形成正常的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞。在又一個(gè)具體的實(shí)施方案中,Bac〃/w菌株是5ac〃/tw/〖cAem/onw;s的菌株,其優(yōu)選地選自以下5ad〃ws/,c/^m/o,&菌株ATCC14580(=NCIB9375)、NCIMB6346(=DSM8785)、NCTC1024、NCTC1025、NCTC2120、NCTC7589、NCTC9932、ATCC21424、NCIMB10689禾nATCC53757。一個(gè)優(yōu)選的亞組包括5a"7/w/z'c/em/om^ATCC14580(=NCIB9375)和5ac"/w"cAew/onw;sNCIMB6346(=DSM8785)。實(shí)施例1的測(cè)試是PCR反應(yīng),在該實(shí)施例中用分離自Sa"7/^//c/zem/wTwh多種菌株的DNA進(jìn)行。在該測(cè)試的一個(gè)具體的實(shí)施方案中,作為PCR反應(yīng)模板使用的DNA是可通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法分離的染色體DNA。獲得正確大小的PCR片段時(shí),實(shí)施例1測(cè)試的結(jié)果是陽(yáng)性的。在實(shí)施例1中,正確的大小被指定為0.4kb。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中,正確的大小在0.35kb和0.44kb之間(-350bp-440bp)。在可選的實(shí)施方案中,正確的大小是330-430bp、340-420bp、350-410bp、360-400bp、370-390bp或385-395bp。SEQIDNO.1的編碼序列(CDS)的大小約為380bp(即378bp)。WO-A-2006/099871中描述了編碼上文定義的多肽的經(jīng)分離的核酸序列、核酸構(gòu)建體、載體和下述宿主細(xì)胞以及上文中舉例的益生菌菌株,所述宿主細(xì)胞包含用于表達(dá)和生產(chǎn)上文定義的經(jīng)分離的多肽的核酸序列。該公開的內(nèi)容,尤其是根據(jù)本發(fā)明的多肽和菌株的變體及其生產(chǎn)通過(guò)參考并入本文。多肽組合物可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法制備,并且可以是液體或干燥組合物的形式。例如,多肽組合物可以是顆粒或微型顆粒的形式。組合物中要包含的多肽可根據(jù)本領(lǐng)域己知的方法被穩(wěn)定化。本發(fā)明組合物的具體例子如下-包含(a)本發(fā)明的多肽;和(b)至少一種脂溶性維生素,(c)至少一種水溶性維生素,(d)至少一種微量礦物質(zhì),和/或(e)至少一種大量礦物質(zhì)的動(dòng)物飼料添加劑;-動(dòng)物詞料組合物,其具有50到800g/kg粗蛋白質(zhì)含量并包含本發(fā)明的多肽;-包含(a)題為"細(xì)菌菌株;益生菌Saa'//^菌株"章節(jié)中定義的^^7/^菌株;和(b)至少一種脂溶性維生素,(C)至少一種水溶性維生素,(d)至少一種微量礦物質(zhì),和/或(e)至少一種大量礦物質(zhì);禾口-動(dòng)物詞料組合物,其具有50到800g/kg的粗蛋白質(zhì)含量并包含題為"細(xì)菌菌株;益生菌萬(wàn)ac〃/w菌株"章節(jié)中定義的5flc"/w菌株。所謂的預(yù)混物是本發(fā)明的動(dòng)物詞料添加劑的例子。預(yù)混物優(yōu)選地表示一種或多種微量成分與稀釋劑和/或運(yùn)載體的均一混合物。預(yù)混物被用于促進(jìn)微量成分在更大混合物中的均一分布。術(shù)語(yǔ)詞料或飼料組合物表示適合或旨在被動(dòng)物攝入的任何化合物、制劑、混合物或組合物。在根據(jù)本發(fā)明的用途中,多肽和/或Sa"7/"5菌株可在膳食之前、之后或同時(shí)喂養(yǎng)給動(dòng)物。后者是優(yōu)選的。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中,多肽在被添加進(jìn)飼料的形式中或包含在飼料添加劑中時(shí),是充分確定的。術(shù)語(yǔ)"充分確定的"表示多肽制劑至少50%純。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中,充分確定的多肽制劑至少為60、70、80、85、88、90、92、94或至少95%純。充分確定的多肽制劑是有利的。例如,向飼料中以正確劑量添加(dosecorrectly)下述多肽容易得多,所述多肽基本不含干擾性或污染性的其它多肽。術(shù)語(yǔ)"以正確劑量添加"尤其表示獲得一致和恒定結(jié)果的目的,和根據(jù)期望的效果優(yōu)化劑量的能力。然而,對(duì)在動(dòng)物飼料中使用而言,多肽不需要這么純;其可例如包含其它多肽如動(dòng)物飼料酶,在這種情況下其也可以被稱作多肽制劑。多肽制劑可被(a)直接添加至飼料(或在蛋白質(zhì)的處理過(guò)程中直接使用),或(b)其可被用于一種或多種隨后被添加進(jìn)飼料的中間體組合物的生產(chǎn)中(或被用于處理過(guò)程中),所述中間體組合物如飼料添加劑或預(yù)混物。上述純凈程度表示原始多肽制劑的純度,無(wú)論是根據(jù)上文(a)還是(b)。使用。具有這種數(shù)量級(jí)純度的多肽制劑尤其可使用重組生產(chǎn)方法獲得,但是通過(guò)傳統(tǒng)發(fā)酵方法生產(chǎn)多肽時(shí),它們不是如此容易獲得并且也經(jīng)受了高級(jí)得多的批次批次之間的變化。多肽可以以任何形式被添加至飼料,其為相對(duì)純的多肽,或是與旨在添加進(jìn)動(dòng)物飼料的其它成分的混合物,即為動(dòng)物飼料添加劑的形式,如所謂的動(dòng)物飼料預(yù)混物。除本發(fā)明的多肽和/或S"d//1^菌株外,本發(fā)明的動(dòng)物飼料添加劑含有至少一種脂溶性維生素,和/或至少一種水溶性維生素,和/或至少一種微量礦物質(zhì),和/或至少一種大量礦物質(zhì)。另外,任選的詞料添加劑成分為著色劑,例如類胡蘿卜素如/5-胡蘿卜素、蝦青素和葉黃素;芳香化合物;穩(wěn)定劑;抗微生物肽;其它抑球蟲劑;產(chǎn)活性氧的物類;和/或至少一種選自以下的酶植酸酶(EC3丄3.8或3丄3.26);木聚糖酶(EC3.2丄8);半乳聚糖酶(EC3.2丄89);a-半乳糖苷酶(EC3.2丄22);蛋白酶(EC3.4.,磷月旨酶Al(EC3丄1.32);磷脂酶A2(EC3丄1.4);溶血磷脂酶(EC3丄1.5);磷脂酶C(EC3丄4.3);磷脂酶D(EC3丄4.4);淀粉酶例如a-淀粉酶(EC3.2丄1);禾口/或/5-葡聚糖酶(EC3.2.1.4或EC3,2.1.6)??刮⑸镫?AMP)的例子為CAP18、LeucocinA、Tritrpticin、Protegrin-l、Thanatin、Defensin、Lactoferrin、Lactoferricin禾卩Ovispirin如Novispirin(RobertLehrer,2000)、Plectasins和抑制素(Statins),包括WO03/044049和WO03/048148中公開的化合物和多肽,以及以上的保留抗微生物活性的變體或片段??拐婢嘣绿?AFP)的例子是Ayjergz7/wsgz'ganfeus禾口yls^e廠g7.//1^m.ger肽,及其保留抗真菌活性的變體和片段,如WO94/01459和WO02/090384中所公開的。也可使用的其它抑球蟲劑的例子為離子載體,如拉沙洛西、莫能菌素(monensin)、鹽霉素(salinomycin)、馬杜霉素(maduramycin)、semduramycin和化學(xué)試劑如amproliura、硝卡巴嗪(nicarbazin)地克珠利(diclazuril)。如WO-A-2003/009700中所公開的,已發(fā)現(xiàn)多不飽和脂肪酸同樣具有抑球蟲劑的活性。因此,在本發(fā)明的一個(gè)具體的優(yōu)選的實(shí)施方案中,其它飼料添加劑成分為多不飽和脂肪酸(PUFA)。(動(dòng)物飼料)組合物可包含每kg飼料從0.001、0.01g或lg到多達(dá)0.01或100g的PUFA,優(yōu)選地從0.0001到100g/kg。用量可低至每kg詞料從0.0001到多達(dá)0.1gPUFA,例如每kg飼料從0.0025(或0.05或0.08)至U0.001(或0.01g)PUFA。典型地,組合物會(huì)包含每kg飼料從0.002到0.01gPUFA,優(yōu)選地每kg飼料從0.0004g到0.08gPUFA。上述用量是指PUFA的重量,因此如果以油(例如具有30到40%的PUFA)的形式添加PUFA,則可相應(yīng)地計(jì)算存在(或添加)的油量,例如通過(guò)將PUFA量乘以100/x來(lái)計(jì)算,其中X表示油中PUFA的百分比。因此,例如具有30(或35)%到40(或45或50)。/。PUFA含量時(shí),可添加的油量可成比例地變化,如每kg詞料從0.00033或0.00025g到至多330或250g油。PUFA可以是單一的PUFA或兩種或更多不同的PUFA。每種PUFA可以是n-3或n-6家族的。優(yōu)選地,氣味C18、C20或C22PUFA。其可具有至少18個(gè)碳原子和3個(gè)雙鍵。PUFA可以以游離脂肪酸形式、鹽形式、作為脂肪酸酯(例如甲酯或乙酯)、作為磷脂和/或甘油單酯、甘油二酯或甘油三酯的形式提供。合適的(n-3和n-6)PUFA包括-二十二碳六烯酸(DHA,22:6Q3),適當(dāng)?shù)貋?lái)自藻類或真菌,如(溝鞭藻類)Crypthecodinium或(真菌)Thraustochytrium;-y-亞麻酸(GLA,18:fi6);畫a隱亞麻酸(ALA,18:fi3);-共軛的亞麻酸(十八碳二烯酸,CLA);-二高-y-亞麻酸(DGLA,20:Q6);-花生四烯酸(八1^,20:1]6);和-二十碳五烯酸(EPA,20:5Q3)。優(yōu)選的PUFA包括花生四烯酸(ARA)、二十二碳六烯酸(DHA)、二十碳五烯酸(EPA)和/或y-亞麻酸(GLA)。尤其優(yōu)選ARA。PUFA可來(lái)自天然(例如植物或海產(chǎn))來(lái)源,或可來(lái)自單細(xì)胞或微生物來(lái)源。PUFA尤其可由細(xì)菌、藻類、真菌或酵母生產(chǎn)。優(yōu)選真菌,優(yōu)選地為Mwcora/as目,例如MoWere〃a、尸/^com少c&s、5/aA:es/ea、爿5perg7'〃ws、2Traws^c/y^n'm附、jP少,/u'm肌或^EVz^mop/z,Aora。優(yōu)選白勺ARA來(lái)源是來(lái)自A/o廠"'ere//。"http://7&<2、5/a&as7e(2Zn'^pona、y^perg^/iwterreus或尸j^/u'MmzVmWo5wm。藻類可以是溝鞭藻類禾卩/或包J舌i^廠p/^n'Jz'wm、7VitozcAz'a或CV7/,/zecoAm'wm(例如CVj/^AecoAm'wmco/m")。酵母包括i^c/n'a或jSacc/zarom少cas的屬,如尸z'c/hVzc^r"。細(xì)菌可以是om'6fifctehwm的屬。PUFA可作為(例如可食用的)油存在于或被添加進(jìn)組合物中。油可以(在室溫下)是液體的。油可以是微生物(例如單細(xì)胞)油、海產(chǎn)(例如金槍魚)油或植物油。包含ARA的合適油可在商品名VEVODAR下得自DSMN.V.,AlexanderFleminglaan1或Wateringseweg1,P.O.Box1,2600MADelft,荷蘭。另一種可商業(yè)獲得的(ARA)油是來(lái)自MartekCorporation,6480DobbinRoad,Columbia,MD21045,美國(guó)的ARASCO。其它PUFA是可獲得的,例如作為DHA油獲得DHA(在商標(biāo)PAX下來(lái)自MartekCorporationorDHAfromPronova,挪威的DHASCO)。大量文件描述了粗PUFA油的生產(chǎn)。WO-A-92/13086(Martek)中公開了含ARA的微生物油,WO-A-91/14427(Martek)中公開了含EPA的微生物油,WO-A-91/11918(Martek)中公開了含DHA的微生物油。從微生物來(lái)源提取PUFA油的多種方法可見于WO-A-97/36996禾QWO-A-97/37032(均屬于Gist-brocades)。含ARA、DHA和EPA的油也描述于WO-A-92/12711(Martek)中。優(yōu)選地,大部分PUFA是甘油三酯的形式。因此,優(yōu)選地,至少50%,如至少60%,或任選地至少70%的PUFA是甘油三酯形式。然而,甘油三酯的量可更高,如為油的至少85%,優(yōu)選地至少90%,任選地至少95%或98%。優(yōu)選地,添加劑或預(yù)混物包含的PUFA(或其它組分,如酶)是飼料的10到1,000倍,如25或50到750倍,優(yōu)選地為75或100到250或500倍。這是因?yàn)橹圃靹?dòng)物伺料時(shí),預(yù)混物可被"稀釋"10到1,000倍(從而預(yù)混物組成最終飼料的10%到0.1%)。因此,可使用任何這些數(shù)字乘以下一章節(jié)中公開的PUFA量的(最大和/或最小)值,從而獲得預(yù)混物中PUFA的濃度。然而,濃度的寬闊范圍可以是1至'j100g/kg。預(yù)混物可以是顆?;驁F(tuán)粒的形式。產(chǎn)活性氧物類的例子是化學(xué)品如過(guò)硼酸鹽、過(guò)硫酸鹽或過(guò)碳酸鹽;和酶如氧化酶、加氧酶或合成酶。通常脂溶和水溶的維生素以及微量礦物質(zhì)形成旨在被添加進(jìn)飼料中的所謂的預(yù)混物部分,而大量礦物質(zhì)通常被獨(dú)立地添加進(jìn)飼料中。這些組合物種類任一富含本發(fā)明的多肽或^""7/w菌株時(shí),是本發(fā)明的動(dòng)物詞料添加劑。以下是這些組分的非排他性列表-脂溶性維生素的例子是維生素A、維生素D3、維生素E和維生素K,例如維生素K3。-水溶性維生素的例子是維生素B12、生物素和膽堿、維生素B1、維生素B2、維生素B6、煙酸、葉酸和泛酸,例如D-泛酸鈣。-微量礦物質(zhì)的例子為鎂、鋅、鐵、銅、碘、硒和鈷。-大量礦物質(zhì)的例子是鈣、磷和鈉。這些組分的營(yíng)養(yǎng)需要量(nutritionalrequirement)(以家禽和小豬/豬為例)列于WO01/58275的表A中。營(yíng)養(yǎng)需要量表示這些組分應(yīng)當(dāng)以指定的濃度在膳食中提供。動(dòng)物飼料組合物或膳食具有相對(duì)高的蛋白質(zhì)含量。價(jià)錢和豬膳食的特征可如WO01/58275的表B中第2-3列所示。魚膳食特征可如該表B的第4列中所示。另外,這些魚膳食通常具有200-310g/kg的粗脂肪含量。WO01/58275對(duì)應(yīng)于US09/779334,其通過(guò)引用并入本文。根據(jù)本發(fā)明的動(dòng)物飼料組合物具有50-800g/kg的粗蛋白質(zhì)含量,并另外包含至少一種多肽和/或至少一種如本文所述和/或要求保護(hù)的萬(wàn)a"7/w菌株。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中,本發(fā)明的動(dòng)物飼料組合物含有至少一種植物蛋白或蛋白質(zhì)來(lái)源。其也可含有動(dòng)物蛋白,如肉和骨粉,和/或魚粉,典型地以0-25%的量含有。本文使用術(shù)語(yǔ)植物蛋白是指包含至少一種下述蛋白質(zhì)的任何復(fù)合物、組合物、制劑或混合物,所述蛋白質(zhì)衍生自植物或來(lái)源于植物,包括經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)衍生物。在具體的實(shí)施方案中,植物蛋白的蛋白質(zhì)含量至少為10%、20%、30%、40%、50%或60%(w/w)c植物蛋白可衍生自植物蛋白質(zhì)來(lái)源,如豆類和谷物,例如來(lái)自Fabaceae(Leguminosae)、Cruciferaceae、Chenopodiaceae禾口Poaceae禾斗的植物,如大豆粉、羽扇豆粉和油菜籽粉。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中,植物蛋白質(zhì)來(lái)源是來(lái)自一種或多種Fabaceae科植物例如大豆、羽扇豆、豌豆或黃豆的材料。在另一具體的實(shí)施方案中,植物蛋白質(zhì)來(lái)源是來(lái)自一種或多種Chenopodiaceae科植物例如甜菜(beet)、甜菜(sugarbeet)、菠菜或藜谷(quinoa)的材料。動(dòng)物膳食可例如被制成醪液伺料(mashfeed)(未制成團(tuán)粒)或團(tuán)粒飼料。通常,混合研磨過(guò)的飼料原料,并根據(jù)正在討論的物種的技術(shù)指標(biāo)添加足量的必需維生素和礦物質(zhì)。多肽和/或Sacz7/w菌株可作為固體或液體配制物被添加。例如,固體多肽配制物典型地在混合步驟之前或期伺添加;液體多肽制劑典型地在制粒步驟之后添加。多肽也可被摻入詞料添加劑或預(yù)混物中。膳食中的最終多肽濃度在每kg膳食0.01-200mg蛋白質(zhì)的范圍內(nèi),例如在每kg動(dòng)物膳食0.1-20mg蛋白質(zhì)的范圍內(nèi)。多肽和/或^^7/w菌株當(dāng)然應(yīng)當(dāng)以有效量使用,即以足夠促進(jìn)詞料轉(zhuǎn)化的量使用。目前預(yù)期以一種或多種以下用量(劑量范圍)施用多肽0.01-200;0.01-100;0.5-100;1-50;5-100;10-100;0.05-50;1-10或0.10-10,這些范圍的單位均為每kg飼料mg多肽蛋白質(zhì)(ppm)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中,劑量范圍為l-9、1-8、2-7、2-6或2-5ppm。尤其優(yōu)選的劑量范圍的例子是0.5-15.0、1.0-12.5、1.5-10.0和2.5-7.5ppm。目前預(yù)期以一種或多種以下用量(劑量范圍)施用S""7/t菌株10E2-14、10E4-12、10E6-10、10E7-9,優(yōu)選地10E8CFU/g的飼料(名稱E表示指數(shù),即例如10E2-14表示102-1014)。為了測(cè)定每kg飼料的mg多肽蛋白質(zhì),從飼料組合物中純化多肽,并計(jì)算以每kg飼料mg多肽蛋白質(zhì)為單位的劑量,例如如WO-A-2006/099871的實(shí)施例10中所述。相同的原則適用于測(cè)定飼料添加劑中的mg多肽蛋白質(zhì)。本文描述和要求保護(hù)的本發(fā)明在范圍上不受本文公開的特定實(shí)施方案的限制,因?yàn)檫@些實(shí)施方案旨在闡述本發(fā)明的若干方面。任何等同的實(shí)施方案旨在屬于本發(fā)明的范圍內(nèi)。事實(shí)上,除本文顯示和描述的這些外,本領(lǐng)域技術(shù)人員從前文的描述中會(huì)明白發(fā)明的多種變更。這些變更也旨在落入附帶的權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。在沖突的情況下,以包含定義的本公開為準(zhǔn)。實(shí)施例l:如通過(guò)PCR所鑒定的,具有L12-樣基因的Sflcz7/w菌株通過(guò)PCR,在大量其它Sad〃iw/Zc/^m/o,^菌株中鑒定了與編碼L12蛋白質(zhì)(SEQIDNO:l)的基因相似的基因。從十一種不同的^cz7/w"c/^m/wvw:s菌株中分離出了用作PCR反應(yīng)模板的DNA,所述菌株在TY瓊脂平板上于37。C下過(guò)夜生長(zhǎng)。將含有來(lái)自各個(gè)菌株的細(xì)胞的一個(gè)培養(yǎng)管懸浮于0.1mlH20中并煮沸IO分鐘,離心,并且在如下文所述的PCR反應(yīng)中使用來(lái)自每管的5微升上清液作為DNA模板。在來(lái)自AmershamBiosciences的"PureTaqTMReady-To—GoTMPCRBeads"中進(jìn)行PCR反應(yīng)5微升DNA模板+2x1微升引物Pep481(SEQIDNO:6)和Pep482(SEQIDNO:7)+18微升H20。PCR程序1)95°C3分鐘;2)95。C10秒;3)65。C30秒,每循環(huán)-l°C;4)72°C1分鐘;5)回到2)9次;6)95°C10秒;7)55°C30秒;8)72。Cl分鐘;9)回到6)19次;10)72。C5分鐘;11)4。C保持,這表示歩驟10)以后溫度被降低至4X:。引物Pep481AATTACGCGTGTTGGTGCGATAGTAGTAACG-3,(SEQIDNO:6)將得到的來(lái)自五個(gè)不同陽(yáng)性菌株(陽(yáng)性表示給出大小正確的DNA條帶)的0.4kbPCR片段純化,并用在DNA測(cè)序?qū)嶒?yàn)中,所述實(shí)驗(yàn)再次使用Pep481(SEQIDNO:6)和Pep482(SEQIDNO:7)引物作為測(cè)序引物。五個(gè)陽(yáng)性菌株中的三個(gè)給出了相同的DNA序列Saa7/wATCC14580、5acz'腸/z'cAem/o層;sNCIMB6346(=DSM8785)和5ac/〃w//cAem/0,z'5菌株712,得到SEQIDNO:2的氨基酸序列。在萬(wàn)adZ/w/fcAem/onm'j菌株470中,DNA改變導(dǎo)致兩個(gè)氨基酸改變(SEQIDNO:9),但是成熟的肽中沒(méi)有改變。在Sacz7/us//c/^m/onm、菌株009中,DNA改變導(dǎo)致十五個(gè)氮基酸改變(SEQIDNO:8),其中八個(gè)在成熟的肽中。另外,從SEQIDNOs:2、8和9衍生了共有序列(SEQIDNO:10)。注意在該實(shí)驗(yàn)中,編碼SEQIDNO:2的七個(gè)C-端氨基酸的核苷酸包括在Pep481引物(SEQIDNO:6)中,因此SEQIDNOs:8-9的七個(gè)C-端氨基酸殘基可能不正確。然而,稍后確認(rèn)了SEQIDNOs:8-9的正確性。從命名為BioPlusTM2B(由Chr.HansenA/S,10-12BoegeAHe,DK-2970Hoersholm,丹麥提供)的飼料益生菌制品分離的Sa"7/ws"cAem/orm^菌株包括在經(jīng)測(cè)試但為陰性的H"^—個(gè)菌株中。另外,如上所述測(cè)試萬(wàn)fl"7/肌//cAem/ow^的44個(gè)其它菌株。在27個(gè)這些菌株中發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性的PCR-應(yīng)答。被發(fā)現(xiàn)為L(zhǎng)12-陽(yáng)性的其它公眾可獲得的5acZ〃M/z'c/^m/ow^菌株的例子具有以下的保藏號(hào)NCTC1024、NCTC1025、NCTC2120、NCTC7589、NCTC9932、ATCC21424、NCIMB10689、ATCC53757。NCTC是典型培養(yǎng)物國(guó)家保藏中心(theNationalCollectionofTypeCultures)。ATCC是美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(theAmericanTypeCultureCollection)。NCIMB是工業(yè)、海產(chǎn)和食物細(xì)菌國(guó)家保藏中心(theNationalCollectionofIndustrial,MarineandFoodBacteria)。實(shí)施例2:動(dòng)物飼料和添加劑動(dòng)物飼料添加劑通過(guò)向以下的預(yù)混物(每kg預(yù)混物)添加25g被包裹的T-顆粒制備動(dòng)物飼料添加劑,所述T-顆粒以20g/kg的量包含經(jīng)純化的L12(如EP569468Bl的實(shí)施例3所述制備,然而具有約7%的氫化棕櫚油和約13%的CaC03):<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>動(dòng)物飼料通過(guò)將成分混合制備具有以下組成(%,w/w)的肉雞培養(yǎng)者(broilergrower)膳食。小麥、黑麥禾口SBM48可得自MoulinModerneHirsinque,Hirsingue,法國(guó)。混合后,將飼料在期望的溫度例如約7(TC下制成小球(3x25mm)。<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>得到的動(dòng)物飼料每千克包含5.0mg經(jīng)純化的L12蛋白質(zhì)(5ppm)。以相同的方式制備另外的動(dòng)物飼料和詞料添加劑組合物,但是用1013菌落形成單位(CFU)的^^7/r^/ZcAem/om^ATCC14580(優(yōu)選地為內(nèi)生孢子形式)代替每kg預(yù)混物25g經(jīng)包裹的L12CT顆粒,這得到每克飼料組合物含約108CFU的動(dòng)物飼料。權(quán)利要求1.經(jīng)分離的多肽作為抑球蟲劑和/或抑組織滴蟲劑制劑或用于制備它們的用途,所述多肽選自(a)包含下述氨基酸序列的多肽,所述氨基酸序列與SEQIDNO2的氨基酸1-85具有至少33%的同一性程度;(b)由在嚴(yán)格條件下與(i)SEQIDNO1的核苷酸124-378,(ii)至少100個(gè)核苷酸的(i)的亞序列,或(iii)(i)或(ii)的互補(bǔ)鏈雜交的核酸序列編碼的多肽;(c)具有SEQIDNO2的氨基酸1-85的氨基酸序列的多肽變體,其包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代、缺失、延伸和/或插入;(d)(a)或(b)的等位變體;和(e)(a)、(b)、(c)或(d)的片段組成的組。2.下述Sfl"7/w菌株在動(dòng)物飼料中作為抑球蟲劑和/或抑組織滴蟲劑的用途,所述菌株的DNA被收集并在使用SEQIDNOs:6和7作為引物的PCR反應(yīng)中用作DNA模板時(shí)導(dǎo)致產(chǎn)生尺寸約0.4kb的PCR片段。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的抑球蟲劑和/或抑組織滴蟲劑在動(dòng)物飼料中的用途。4.根據(jù)權(quán)利要求1到3中任一項(xiàng)的用途,其中經(jīng)分離的多肽與至少一種多不飽和脂肪酸(PUFA)組合,所述多不飽和脂肪酸具有抑球蟲劑活性和/或能有效對(duì)抗球蟲。5.根據(jù)權(quán)利要求1的多肽或根據(jù)權(quán)利要求2的菌株在制造下述動(dòng)物飼料或飼料添加劑中的用途,所述動(dòng)物飼料或飼料添加劑用于治療或預(yù)防球蟲病和/或組織滴蟲病。6.包含根據(jù)權(quán)利要求1的多肽或根據(jù)權(quán)利要求2的S""7/m菌株的動(dòng)物飼料組合物、或添加劑或其預(yù)混組合物作為抑球蟲劑和/或抑組織滴蟲劑的用途。7.根據(jù)權(quán)利要求6的組合物,其還包含至少一種多不飽和脂肪酸(PUFA)。8.用于動(dòng)物飼料組合物的添加劑或預(yù)混組合物,其包含根據(jù)權(quán)利要求1的多肽或根據(jù)權(quán)利要求2的5""7/m菌株作為抑球蟲劑。全文摘要本發(fā)明涉及經(jīng)分離的多肽作為抑球蟲劑和/或抑組織滴蟲劑的用途。本發(fā)明多肽的一個(gè)例子是來(lái)自BacilluslicheniformisATCC14580的所謂的L12蛋白質(zhì)。本發(fā)明還涉及生產(chǎn)與L12相關(guān)的蛋白質(zhì)的Bacillus菌株的益生菌用途。文檔編號(hào)C07K14/195GK101627051SQ200780047606公開日2010年1月13日申請(qǐng)日期2007年12月17日優(yōu)先權(quán)日2006年12月22日發(fā)明者吉爾伯特·韋伯,吉瑞·布洛茲申請(qǐng)人:帝斯曼知識(shí)產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司
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