專利名稱：通過d⁸或d¹⁰金屬絡合物對生物分子的無標記光學檢測及表征的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于樣品中攜帶多個電荷的生物分子的無標記光學檢 測及表征的方法和材沖+ 。
背景技術：
核酸，DNA或RNA,單鏈或雙鏈的，是活細胞中最基本和最重要 的生物分子。DNA編碼可在后代間進行傳遞的遺傳信息。通過轉錄， 編碼的信息轉移到可與核糖體(特定的核糖體RNA和蛋白質的復合物) 結合的mRNA中。在含反義密碼子和特定氨基酸的tRNA的協(xié)助下， mRNA中攜帶的信息被翻譯為由20種氨基酸組成的精確的多肽序列。 多肽折疊成確定的三維結構，從而得到蛋白質。各種類型的蛋白質可 作為構建模塊、酶和調控因子。蛋白質與其它類型的生物分子一起負 責活細胞的構建及執(zhí)行正確的功能。
由于核酸具有帶多個陰性電荷的磷酸功能基團，因此是聚陰離子。 在生理條件下，聚(天冬氨酸)和聚(谷氨酸)形成聚羧酸酯，它們 也屬于聚陰離子。另一方面，聚賴氨酸、聚精氨酸和聚組氨酸(在酸 性水溶液中)攜帶多個陽性電荷，稱為聚陽離子。許多蛋白質在溶液 pH不在其等電點(pl)值時可攜帶多個凈的陽性或陰性電荷。根據(jù)以 上所述，檢測和表征具有多個電荷的生物分子是非常重要的，這不僅 可幫助我們理解細胞是如何發(fā)揮功能的，輔助生物/生物化學研究，而 且可提供推動生物醫(yī)學研究、臨床診斷和新藥開發(fā)的途徑。
正方形扁平的(18或d"金屬絡合物的令人驚奇的結構和鍵合特性 已引起人們長久興趣，最近對該類金屬絡合物的分光鏡性質產(chǎn)生了極 大的興趣。已知這些金屬絡合物在固態(tài)下具有形成高度有序的延伸的 線
配體的兀*"兀堆積相互作用導致可觀察到有趣的分光鏡性質和發(fā)光特 性，最近已有基于這些發(fā)現(xiàn)而進行分子識別、化學檢測及光電子應用
方面的寺艮道。(17, 23, 27)
上述(18或d"金屬絡合物的代表性例子是炔基鉑(II)三聯(lián)吡啶絡 合物(25, 26， 28)。通過改變溶劑的極性，或使用聚電解質(聚陰離子)， 即聚丙烯酸鹽，可誘導(18或cP金屬絡合物聚集和自組裝，從而使 UV/vis和發(fā)射光譜發(fā)生可觀察到的顯著變化。
目前有多種檢測方法可對多電荷生物分子進行沖企測和表征。4旦大 部分常用的現(xiàn)存方法需要精密的分析技術和昂貴的設備。許多方法需 要用放射性同位素或熒光物質等檢測基團進行標記，而且需要雜交流 程進行核酸檢測。因此，這些方法通常需要高昂的花費，復雜的技術， 而且是耗時的。
本發(fā)明提供了一種新型的檢測和表征多電荷生物分子的無標記檢 測法。將d8或d1Q金屬絡合物與帶相反電荷的生物分子結合可誘導金屬 絡合物的聚集和自組裝，從而可產(chǎn)生明顯的UV/vis、發(fā)射和CD強度 的變化。該檢測法不僅提供了一種檢測多電荷生物分子存在的方法， 而且可用于研究其二級結構及結構/構象變化。
發(fā)明概述
一般來說，本發(fā)明提供了檢測和/或表征帶多個電荷的生物分子的 組合物、方法和試劑盒。將帶電荷的dS或d"金屬絡合物與生物分子混 合。帶電荷的金屬絡合物與帶相反電荷的生物分子的靜電結合可誘導 金屬絡合物通過金屬-金屬相互作用和/或金屬絡合物中相應的配位體 間的兀， *兀堆積相互作用而進行聚集和自組裝，從而使金屬絡合物的光 學性質發(fā)生顯著改變，例如UV/vis、發(fā)射和CD強度的變化(29)。
本發(fā)明提供了 一種檢測和/或表征多電荷生物分子的包含帶電荷的 W或d"金屬絡合物的組合物，其中金屬絡合物與多電荷生物分子靜電 結合，從而誘導金屬絡合物通過金屬-金屬相互作用、兀*"兀相互作用 或兩種相互作用的組合而進行聚集和自組裝。
本發(fā)明也提供了 一種檢測樣品中目標多電荷生物分子存在的檢測 方法，所述方法包括(a)將帶電荷的W或d"金屬絡合物與可能含有 目標多電荷生物分子的樣品在有效使(18或d"金屬絡合物與目標多電 荷生物分子通過靜電相互作用彼此結合的條件下進行合并，其中金屬 絡合物包含至少一種過渡態(tài)金屬和至少一種相應的配位體，然后使帶
電荷的W或(11()金屬絡合物聚集體自組裝，和(b)檢測帶電荷的dS或d1G
金屬絡合物聚集體的光學性質。
本發(fā)明進 一 步提供了用于檢測樣品中多電荷生物分子的試劑盒，
包括(a)含有帶電荷的(18或(11()金屬絡合物的組合物，其中金屬絡合物 與多電荷生物分子靜電結合，以誘導(18或d"金屬絡合物通過金屬". 金屬相互作用和兀'"兀相互作用而聚集和自組裝，和(b)使用說明書。
附圖的簡要描述


圖1顯示了作為說明性實例的兩種陽離子dS金屬絡合物。
圖2顯示了合成圖1所示一個說明性實例(絡合物2)的代表性途徑。
圖3顯示了其中一個代表性(18金屬絡合物——30pM絡合物l(線 a )的覆蓋電子吸收光譜，以及與90pM聚(dA)2s (線b )、聚(dG)25 (線
C)、聚(dC)25 (線d)和聚(dT)25 (線e)結合后吸收光鐠的變化。
圖4顯示了其中 一個代表性d8金屬絡合物——30pM絡合物2 (線 a )的覆蓋電子吸收光譜，以及與90pM聚(dA)25 (線b )、聚(dC)25 (線 c)、 聚(dG)25 (線d)和聚(dT)25 (線e)結合后吸收光譜的變化。
圖5顯示了其中一個代表性(18金屬絡合物——30jaM絡合物l(線 a )的覆蓋發(fā)射光譜，以及與90 pM聚(dA)25 (線b )、聚(dC)25 (線c )、 聚(dG)25 (線d)和聚(dT)25 (線e)結合后發(fā)射光譜的變化。
圖6顯示了其中 一個代表性d8金屬絡合物——30pM絡合物2 (線 a)的覆蓋發(fā)射光譜，以及與90pM聚(dA)25 (線b)、聚(dC)25 (線c )、
聚(dG)25 (線d)和聚(dT)25 (線e)結合后發(fā)射光譜的變化。
圖7顯示了其中 一個代表性單鏈核酸——90jxM聚(dT)25 (線a )的 覆蓋CD光譜，以及其與(18金屬絡合物30pM絡合物1 (線b )和絡合 物2 (線c )結合后CD光譜的變化。
圖8顯示了其中一個代表性單鏈核酸——90|liM聚(dA)25 (線a) 的覆蓋CD光譜，以及其與dS金屬絡合物30pM絡合物l(線b )和30pM 和60|iiM絡合物2 (線c和d )結合后CD光譜的變化。備注通過從 線c中減去線a而得到差別CD光鐠。
圖9顯示了其中一個代表性單鏈核酸——90pM聚(dC)25 (線a) 的覆蓋CD光譜，以及其與(18金屬絡合物30|iiM絡合物l(線b )和30|uM 和45^M絡合物2 (線c和d)結合后CD光譜的變化。
圖IO顯示了其中一個代表性單鏈核酸——90pM聚(dG)25 (線a) 的覆蓋CD光譜，以及其與dS金屬絡合物30jiM絡合物1 (線b )和絡 合物2 (線c)結合后CD光鐠的變化。
圖11顯示了 G四聯(lián)體(quadruplex)結構中4個鳥噤呤堿基間的 氫鍵。
圖12顯示了代表性(18金屬絡合物——30)uM絡合物l (線a)和2 (線b)的覆蓋電子吸收光譜，以及其與90|uM polyU (線c和d分別 為絡合物1和2)結合后吸收光譜的變化。
圖13顯示了代表性dS金屬絡合物——30)uM絡合物l (線a)和2 (線b)的覆蓋發(fā)射光譜，以及其與90pMpolyU結合后發(fā)射光譜的變 化(線c和d分別為絡合物1和2 )。
圖14顯示了其中 一個代表性(f金屬絡合物——30jaM絡合物l(線 a)的覆蓋電子吸收光譜，以及其與90pM聚(天冬氨酸鈉)(線b )和聚 (谷氨酸鈉)(線c)結合后吸收光譜的變化。
圖15顯示了其中 一個代表性dS金屬絡合物——30pM絡合物2(線 a)的覆蓋電子吸收光譜，以及其與90jaM聚(天冬氨酸鈉)(線b )和聚 (谷氨酸鈉)(線c)結合后吸收光譜的變化。
圖16顯示了代表性W金屬絡合物——30pM絡合物l (線a)和2 (線b )的覆蓋發(fā)射光譜，及其與90|iiM聚(天冬氨酸鈉)(線c和d分 別為絡合物1和2)和聚(谷氨酸鈉)(線e和f分別為絡合物1和2) 結合后發(fā)射光譜的變化。
圖17顯示了其中一個代表性dS金屬絡合物——30jiM絡合物2結 合90pM聚(天冬氨酸鈉)(線a)和聚(谷氨酸鈉)(線b)后的覆蓋CD 光譜。
圖18顯示了胞嘧啶-質子化胞嘧啶(C-C+)堿基對間的氬鍵。
圖19顯示了 90 |uM聚(dC)25 + 30|uM絡合物2所的覆蓋UV-vis吸
收和發(fā)射光譜。介質5 mMHOAc-NaOAc、 10mMNaCl、 pH 5.0。 圖20顯示了聚(dC)25 (線a)及其與絡合物2結合后(線b)的覆
蓋CD光"i普。介質5mMHOAc畫NaOAc、 10mMNaCl、 pH 5.0。
圖21顯示了 30|aM絡合物2 (線a )及其與90(aM聚(dA)25結合后 (線b )的覆蓋UV-vis吸收光譜。介質80%水緩沖液(5 mM Tris-HCl、 10 mM NaCl、 pH 7.5 ) + 20% CH3CN。
圖22顯示了 30|iiM絡合物2 (線a )及其與90)liM聚(dA》5結合后 (線b)的覆蓋發(fā)射光鐠。介質80%水緩沖液(5 mMTris-HCl、 10 mM NaCl、 pH 7.5 ) + 20% CH3CN。
圖23顯示了 30pM絡合物2(線a)及其與寡核苦酸(CAT TAC TGG ATC TAT CAA CAG GAG )(線b )結合后的覆蓋UV-vis吸收光譜。介 質80%水緩沖液(5 mM Tris-HCl、 10mMNaCl、 pH 7.5 ) + 20% TFE。
圖24顯示了與90|iiM(總堿基濃度)寡核苷酸(CAT TAC TGG ATC TAT CAA CAG GAG )結合后的30)liM絡合物2的CD光鐠。介質80% 水緩沖液(5 mMTris-HCl、 10mMNaCl、 pH 7.5 ) + 20% TFE。
圖25顯示了與45|uM聚(dA)25 + 45)uM聚(dT)25 (線a ); 90|uM聚 (dA)25 + 90|liM聚(dT)25 (線b ); 180jiM ,A)25 + 180, fl(dT)25 (線 c ); 270juM聚(dA)25 + 270|liM聚(dT)25 (線d )結合后的30jiM絡合物 2的覆蓋UV-vis吸收光譜。介質5 mM Tris-HCl、 10mMNaCl、 pH 7.5。
圖26顯示了與45|uM聚(dA)25 + 45|uM聚(dT)25 (線a ); 90|uM聚 (dA)25 + 90|uM聚(dT)25 (線b ); 180)liM聚闊25 + 180|uM ,T)25 (線 c ); 270|uM聚(dA)25 + 270|uM聚(dT)25 (線d )結合后的30)liM絡合物 2的覆蓋發(fā)射光譜。介質5mMTris-HCl、 10mMNaCl、 pH7.5。
優(yōu)選實施方案的詳細描述 定義
以下每個在本申請中使用的術語除非特別聲明外均具有以下闡述 的含義
此處所用術語"單鏈核酸"可以是任何長度的，天然或人工合成的單 鏈DNA、 RNA,任何衍生物或其類似物，只要它攜帶負電荷及核堿基 序列即可?？梢允请p螺旋DNA或RNA部分，任何DNA、 RNA、蛋白 質、糖、脂的組合部分及其衍生物?？梢栽谌芤褐凶杂煞植?，或固定 在固體支持物表面。核酸可以直接從樣品溶液或從擴增的基因或基因 片段獲得。
此處所用術語"蛋白"或"多肽"可以是任何長度的天然或人工合成 的蛋白質，任何衍生物或其類似物，只要它帶有基本的肽序列即可。
可以是任何DNA (雙鏈或單鏈)、RNA(雙鏈或單鏈)、蛋白質、糖、
脂的任何組合部分，或其衍生物?？梢栽谌芤褐凶杂煞植?，或固定在
固體支持物表面。
此處所用術語"生物分子"可以是DNA、 RNA、蛋白質、糖、月旨、
其組合及帶有多電荷的衍生物。可以在溶液中自由分布，或固定在固
體支持物表面。
此處所用術語"電荷的"可以是陰離子的或陽離子的。
此處所用術語"帶電荷的W或d"金屬絡合物聚合體"可以是任何含
至少一種(18或d1Q電子構象，帶有凈的正或負電荷的金屬中心的金屬絡
合物間的靜電相互作用而引起金屬絡合物的局部濃度濃縮。
此處所用術語"相應的配位體"可以是任何可與金屬中心形成配<介 鍵的供體配體。
本發(fā)明實施方案
本發(fā)明提供一種檢測和/或表征多電荷生物分子的包含帶電荷的d8 或d"金屬絡合物的組合物，其中金屬絡合物與多電荷生物分子靜電結 合，以通過金屬*"金屬相互作用、兀"*兀相互作用或兩種相互作用的 組合來誘導金屬絡合物的聚集和自組裝。
在一個實施例中，帶電荷的(18或d^金屬絡合物包含至少一種過渡 態(tài)金屬和至少 一種相應的配位體。過渡態(tài)金屬的非限制性實例包括可 參與金屬"'金屬相互作用的鉑(Pt)、金(Au)、 4巴(Pd)、銠(Rh)、 銥(Ir)和銀(Ag)。相應的配位體的非限制性例子包括芳基、烷基、 炔基及其書t生物；氮供體配體包括吡咬、聯(lián)吡咬、三耳關吡i定、多吡咬、 芳基吡啶、二芳基吡啶、芳基聯(lián)吡啶、菲咯啉、二。秦、三。秦、酞菁、 亞胺、二亞胺、三亞胺、卟啉及其衍生物；硫、磷及氧供體配體包括 膦、硫醇鹽、羧酸鹽及其衍生物。相應的配位體也可以具有以下結構 (a)<formula>formula see original document page 11</formula>
(b)<formula>formula see original document page 11</formula>
帶電荷的(58或d"金屬絡合物應至少帶有一個正或負電荷。優(yōu)選 地，金屬絡合物具有扁平結構或部分扁平結構，及具有至少一個可進 行兀* ，兀堆積相互作用的相應的配位體。
優(yōu)選地，多電荷生物分子應帶有至少3個凈電荷，以誘導帶電荷 的(18或(11()金屬絡合物的聚集。
本發(fā)明也提供了一種檢測樣品中目標多電荷生物分子存在或不存 在的檢測方法，所述方法包括(a)將帶電荷的W或d"金屬絡合物與 可能含有目標多電荷生物分子的樣品在有效使W或<11()金屬絡合物與 目標多電荷生物分子通過靜電相互作用彼此結合的條件下進行合并， 其中金屬絡合物包含至少一種過渡態(tài)金屬和至少一種相應的配位體， 然后使帶電荷的d8或cT金屬絡合物聚集體自組裝，和(b)檢測帶電荷 的W或cT金屬絡合物聚集體的光學性質。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供一種檢測樣品溶液中目標單鏈核 酸分子的方法。目標核酸分子可直接^:分析，或在分析前進行擴增。 該方法包括將帶電荷的(18或d^金屬絡合物與可能含目標核酸分子的 樣品溶液在可有效使至少一個單鏈核酸與(18或(11()金屬絡合物靜電結 合的條件下合并；測定是否至少有一個單鏈核酸與W或cT金屬絡合物 靜電結合，其中(18或(11()金屬絡合物的自組裝及隨后目標核酸分子存在 與否通過光學性質，例如比色檢測法、光致發(fā)光檢測法或CD光譜分析 中的變化來指示。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種表征目標單鏈核酸的結構 特征的方法。該方法包括將其結構特征已良好表征的單鏈核酸分子與 帶電荷的(18或(11()金屬絡合物在有效使至少一個單鏈核酸與(18或d1Q
金屬絡合物靜電結合的條件下合并，以形成結合絡合物；然后使(f或 (T金屬絡合物進行自組裝，其中(18或d^金屬絡合物的自組裝是通過 其光學性質，例如比色檢測法、光致發(fā)光檢測法或CD光譜分析來進 行記錄的。通過用不同已知結構性質的核酸分子進行這種實驗，其組 合信息可提供一種有效地推測目標單鏈核酸結構特征的方法。
在另 一個實施方案中，本發(fā)明提供了 一種檢測目標單鏈核酸結構 變化的方法。該方法可通過兩種不同方式進行。在一個實施方案中， 該方法包括將目標單鏈核酸分子與dS或d"金屬絡合物在有效使至少 一個單鏈核酸與dS或(11()金屬絡合物靜電結合的條件下合并，以形成結 合絡合物；然后使(18或d^金屬絡合物進行自組裝，其中dS或d"金屬 絡合物的自組裝是通過其光學性質，例如比色檢測法、光致發(fā)光檢測 法或CD光譜分析來進行記錄的。通過在不同條件(例如不同溫度、不 同離子強度或加入可能引起目標核酸分子結構特征改變的化合物)下 進行這種實驗，記錄光學性質，從而可通過比較光學性質的變化而推 測其結構性質的變化。
在另一個實施方案中，該方法包括將目標核酸分子暴露在可引起 結構性質變化的不同條件下；將目標核酸分子與帶電荷的d8或d1G金屬 絡合物在有效使至少一個單鏈核酸與W或(11()金屬絡合物靜電結合的 條件下合并，以形成結合絡合物；然后使(18或d"金屬絡合物自組裝， 其中018或d"金屬絡合物的自組裝是通過其光學性質，例如比色檢測 法、光致發(fā)光檢測法或CD光語分析來進行記錄的。然后用記錄的光學 性質的變化來推測目標核酸分子結構性質的變化。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種檢測樣品溶液中目標核 酸分子的突變的方法。該方法包括獲得含有目標核酸分子的樣品溶液； 將含有目標核酸分子的樣品溶液與具有能夠與可含有一個或幾個突變
的目標核酸分子區(qū)雜交的核香酸序列的單鏈核酸探針合并，以形成檢 測雜交溶液；將包括不含突變的新目標核酸分子的對照溶液與能夠和 目標核酸分子完全雜交的單鏈核酸探針合并，以形成對照雜交溶液； 維持雜交溶液溫度在第一雜交溶液的融解溫度與第二對照雜交溶液的 融解溫度之間，將4企測和對照雜交溶液在有^^f吏雜交溶液至少一個未 雜交的探針與W或d"金屬絡合物靜電結合的條件下暴露于帶電荷的 ds或d"金屬絡合物，以形成結合絡合物；然后使dS或d"金屬絡合物
自組裝，其中W或d"金屬絡合物的自組裝是通過其光學性質，例如比
色檢測法、光致發(fā)光檢測法或CD光譜分析來進行記錄的；并測定檢測 和對照雜交溶液的光學性質是否顯著不同，從而推測目標核酸分子中 是否存在突變。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種^r測樣品溶液中目標多 電荷蛋白存在的方法。該方法包括將帶電荷的d8或d1G金屬絡合物與可 能含有目標多電荷蛋白的樣品溶液在有效使至少一個目標多電荷蛋白
與dS或(11()金屬絡合物靜電結合的條件下合并，然后使(f或W金屬絡 合物自組裝；并測定是否至少有一個目標多電荷蛋白與(18或d"金屬絡 合物靜電結合，其中d8或d1G金屬絡合物的自組裝和隨后的目標多電荷 蛋白是否存在是通過其光學性質的變化，例如比色檢測法、光致發(fā)光 檢測法或CD光譜分析來進行指示。
本發(fā)明進一步提供了包括各個構成部分，可使用戶進行一個或多 個本發(fā)明上述方法的試劑盒。具體地，本發(fā)明進一步提供了一種用于 檢測樣品中多電荷生物分子的試劑盒，所述試劑盒包括(a)含有帶電荷 的cf或cT金屬絡合物的組合物，其中金屬絡合物與多電荷生物分子靜 電結合，以誘導cf或d"金屬絡合物通過金屬'"金屬相互作用和兀，"兀 相互作用而聚集和自組裝，和(b)使用說明書。
該試劑盒最少包括第一容器，所述第一容器包含可以是陽離子或 陰離子的帶電荷(18或d"金屬絡合物的溶液，和第二容器，所述第二容 器包含包括至少一個帶至少3個與dS或c^金屬絡合物的電荷相反的凈 電荷的多電荷生物分子的水溶液。
實施例
以下實施例用于舉例說明本發(fā)明，而不對本發(fā)明的范圍進行限定。 本領域中熟練人員應認識到本發(fā)明的各種變化和修改均不偏離其主題
和范圍。
實施例1 - (18或(11()金屬絡合物的代表性實施例
提供了兩個金屬絡合物的實例(圖1)。絡合物1是通過本領域技 術人員已知的現(xiàn)有文獻中的方法制備的，而絡合物2是通過圖2所示
的合成途徑制備的。兩種金屬絡合物均具有本發(fā)明所述的特別適于聚
集研究的特征。兩種絡合物均含有一個金屬中心(Pt)，它是(18過渡態(tài)
金屬離子，能夠參與金屬*"金屬相互作用。它們也包括可通過兀"*兀 堆積相互作用而纟皮此相互作用的芳族三吡，定配體。
實施例2-通過UV/vis光譜研究圖l所示的d8金屬絡合物與單鏈DNA
的結合
聚電解質，即去質子化聚丙烯酸可在甲醇和乙腈的有機溶劑混合
液中誘導絡合物1的聚集和自組裝。誘導的自組裝可根據(jù)金屬絡合物
和聚電解質的結構特征進行解釋。絡合物的結構幾乎是扁平的，并且
攜帶正電荷。另一方面，去質子化聚丙烯酸帶有負電荷。正負電荷的
靜電相互作用使金屬絡合物與聚電解質非常接近，即引起金屬絡合物
與聚陰離子結合。因此，金屬絡合物的局部濃度增加。同樣重要地， 金屬絡合物的正電荷被聚合物的負電荷平衡，從而大大消除金屬絡合
物間的排斥力。因此絡合物可通過金屬"'金屬相互作用和兀*"兀相互
作用或兩種作用的組合而容易地聚集和自組裝。
在水溶液中，情況略微不同，但基本原理是一樣的，其中芳族三 聯(lián)吡啶配體的疏水堆積相互作用可能起更重要的作用。另外的要求是 金屬絡合物必須在水中可充分溶解。絡合物1具有有限的溶解性，而 絡合物2在水溶液中表現(xiàn)出很好的溶解性。但這兩種絡合物在適于本 發(fā)明結合和聚集研究的濃度范圍(約30pM)都是易溶解的。
圖3和4顯示的是絡合物1和2的覆蓋電子吸收光譜，以及當與 各種寡核苷酸，即poly(dA)25、 poly(dG)25、 poly(dC)25和poly(dT)25 (此 處及全文中poly(dA)25、 poly(dG)25、 poly(dC)25和poly(dT)25分別代表 具有25個重復的A、 G、 C和T單位的寡核苷酸)混合后相應光譜的 變化。在整個本發(fā)明中的實驗條件下，在室溫，含有5 mM Tris pH7.5/10 mMNaCl的水溶液中，可檢測到顯著的吸收變化。吸收變化根據(jù)寡核 苷酸的序列而顯著改變。對于poly(dT)25,絡合物1和2最大的吸收增 加和新峰形成分別在約581 nm和544 nm,對于poly(dA)25,沒有新峰 形成，僅觀察到吸收變化，對于poly(dC)25和poly(dG)25,可觀察到新 峰形成及中度的吸收變化。
根據(jù)我們以前的工作和其他相關研究，絡合物1和2在更長波長 處形成的新帶是由于金屬絡合物通過金屬*"金屬相互作用，兀*"兀相 互作用或兩種作用的組合而聚集導致的金屬-金屬-配體電荷轉移 ("MMLCT")過渡態(tài)。
實施例3-通過發(fā)射光譜研究圖1所示的dS金屬絡合物與單鏈DNA的
結合
隨著明顯的UV/vis變化，對某些寡核苷酸來說，在聚集和自組裝 后，在約800 nm處由于MMLCT三重來源而出現(xiàn)新的發(fā)射帶。
圖5和6顯示的是絡合物1和2的覆蓋發(fā)射光譜，以及其與各種 寡核苷酸(此處和全文中，發(fā)射光譜不進行有關PMT反應的校正)的 混合物相應的發(fā)射光譜?？捎^察到各種金屬絡合物-寡核苷酸混合物顯 著的發(fā)射強度的變化。絡合物1和2本身在研究條件下幾乎是非發(fā)射 的。強度變化根據(jù)寡核苷酸序列而顯著改變。對于poly(dT)25,分別在 約784 nm和760 nm》見察到絡合物1和2最大的吸收增加和發(fā)射帶， 而p對于oly(dA)25,則具有一個很寬的，幾乎無結構的弱強度的帶。 對于poly(dC)25和poly(dG)25而言，觀察到新帶，其中在780-790 nm范 圍具有最大帶，并且具有中等強度。
實施例4-通過CD光譜研究圖1所示的d8金屬絡合物與單鏈DNA的
結合
圖7-10顯示的是被研究的寡核苷酸的CD光語，以及與絡合物1 和2混合后的相應光譜變化。對某些寡核苷酸而言，可觀察到顯著的 光譜變化。當絡合物2與poly(dT)25混合時，觀察到在約307 nm到550 nm的中等強度的寬的陰性帶，在約296 nm到278 nm的中等強度的陽 性帶，以及在約207 nm的一個很強的陽性帶(圖7 )。相反，當絡合 物2與poly(dC)25混合時，觀察到相反結果，其中觀察到在約315 nm到 525 nm的中等強度的寬的陽性帶，在約294 nm、 270 nm和239 nm (肩 部)的中等強度的陰性帶以及在約197 nm的一個很強的陰性帶(圖9 )。 某些混合物表現(xiàn)出很小的光譜變化，例如當poly(dG)25與金屬絡合物混 合時，僅可觀察到很小的強度改變，而且沒有新帶產(chǎn)生(圖10)。
非手性分子可通過兩條不同途徑獲得手性(i)將非手性分子接近 手性中心，即將非手性發(fā)色團置于手性環(huán)境中(例如苯酚與環(huán)糊精結 合)，(ii)非手性分子可排列成螺旋結構，從而獲得手性(21)。已知核 酸是天然的手性的，因為它們含有手性的糖部分。然而，我們的結果 清晰地表明絡合物與核酸的結合不總是誘導手性。例如，絡合物1和2 與poly(dG)25結合均不能引起任何CD光譜變化，而絡合物1與 poly(dC)25結合也只引起很小的CD光鐠變化。因此結果表明誘導的手 性不是簡單的將鉑絡合物與手性核酸接近的結果，而更可能與鉑絡合 物與陰離子磷酸位點結合，由這些正方形-扁平cf鉑(II)三聯(lián)吡啶單 位通過金屬，"金屬和w兀相互作用誘導而進行螺旋排列有關。絡合 物的螺旋超分子排列的證據(jù)可通過在聚(L-谷氨酸)和聚(D-谷氨酸)存在 下獲得的CD光譜的鏡向關系和其與在也可以具有不同螺旋手性的各 種寡核苷酸存在下CD光譜的相似性而反映出來(圖17,參見實施例5)。 因此結果表明金屬絡合物陽離子與寡核苷酸結合后可自組裝成具有不 同手性的螺旋超分子排列。
金屬絡合物與各種寡核苷酸混合后光學性質的改變明顯與絡合物 的結構性質相關，，以及更重要地，與寡核苷酸的一級和二級結構明顯 相關。例如，性質與其它寡核苷酸明顯不同的poly(dA)25導致最小程度 的金屬絡合物聚集，這可能是由于核酸堿基腺噪呤與配體三聯(lián)吡啶環(huán) 通過芳族兀* *兀相互作用而發(fā)生強烈的相互作用，從而干涉金屬絡合物 的自組裝過程。值得注意的是，其它噤呤堿基，鳥嘌呤堿基dG可誘導 更好的金屬絡合物的聚集，這可能是因為poly(dG)25在水溶液中形成一 種非常特有的稱為G四聯(lián)體的二級結構，其中鳥嘌呤堿基通過氫鍵相 互堆積在一起(圖11),因此，避免了與金屬絡合物的兀"'兀相互作用。 胸腺嘧啶堿基dT不能通過兀，"兀堆積相互作用而相互結合，而且其相 對疏水特性和較大的甲基的存在也可能阻止其與金屬絡合物的w兀 相互作用，因此，poly(dT)25可誘導最大程度的金屬絡合物的聚集和自 組裝。
實施例5-通過UV/vis、發(fā)射和CD光譜研究圖1中所示(18金屬絡合物
與RNA分子(polvU)、聚f天冬氨酸鈉)和聚(谷氨酸鈉)的結合
圖12和13顯示的是絡合物1或2與polyU混合后的UV/vis和發(fā) 射光譜的變化。圖14-17顯示的是絡合物1或2與聚(天冬氨酸鈉)和聚 (谷氨酸鈉)混合后UV/vis、發(fā)射和CD光譜的變化。這些生物分子在水 溶液中于接近中性pH條件下均帶有多個負電荷，因此就象與單鏈核酸 結合一樣，當與帶正電荷的金屬絡合物混合時，會誘導絡合物1和2 發(fā)生聚集和自組裝，從而導致隨后的顯著光譜性質的變化。
實施例6-通過UV/vis、發(fā)射和CD光譜研究圖1中所示d8金屬絡合物
2與i-基序DNA結構的結合
雖然已知poly(dC)在堿性條件下可形成螺旋構象，但在酸性條件 下，poly(dC)作為C-C+ (胞嘧啶-質子化胞嘧啶)堿基配對的結果而形 成非常獨特的i-基序結構(圖18)。在pH5.0,我們的結果表明絡合物 2與poly(dC)25混合時可改善自組裝，表現(xiàn)為在UV-vis和發(fā)射光譜中 MMLCT帶均有增強(圖19)。然而，發(fā)現(xiàn)由金屬絡合物結合而誘導的 CD光譜與以前獲得的螺旋組裝非常不同，而且與金屬絡合物結合前最 初形成的i-基序結構(圖20)的CD信號不一樣。雖然這種緊湊的i-基序結構與CD顯示的螺旋組裝不同，但是它有利于絡合物陽離子的自 組裝。
實施例7-通過UV/vis、發(fā)射和CD光譜研究圖1中所示W(wǎng)金屬絡合物 2與單鏈DNA的結合，有機溶劑的影響
由于眾所周知加入有機溶劑可以降低水介質中的疏水相互作用， 并且在這種情況下降低與絡合物自組裝形成竟爭的與寡聚體的兀* '兀 相互作用，因此研究了加入有機溶劑對絡合物自組裝性質的影響。在 絡合物2與poly(dA)25的結合研究中，加入20% CH3CN完全消除了絡 合物單體的發(fā)射，而且UV-vis和發(fā)射光語的變化也表明絡合物形成非 常好的自組裝(圖21和22)。結果表明增加有機溶劑含量降低了帶來 絡合物單體發(fā)射光譜的金屬絡合物與與核酸堿基間的兀，"兀疏水相互 作用。但可觀察到弱的CD信號，這表明在這種條件下螺旋性降低。加 入20%三氟乙醇(TFE)也可得到類似的結果。對于poly(dT)25,在存
在20。/。TFE時，雖然比在水緩沖液中的強度弱一些，但根據(jù)UV-vis、 發(fā)射和CD的測定表明絡合物2可給出很確定的螺旋排列。
隨機選擇含所有四種堿基的寡核苷酸序列。序列為CATTACTGG ATCTATCAACAGGAG (標準載體引物)。在純緩沖液中，其與絡合 物2的混合物僅表現(xiàn)出很弱的絡合物的誘導自組裝，這可能是由于核 酸堿基與金屬陽離子間的疏水作用，以及寡核苷酸中某些未明確定義 的二級結構造成的。然而，當加入20y。TFE時，UV-vis和發(fā)射光譜均 表明金屬絡合物具有很好的自組裝(圖23),而且可觀察到強的CD信 號，表明這種排列是高度螺旋的(圖24)。
基于與四種不同核堿基的觀察表明，和DNA的疏水兀堆積相互作
用與金屬-金屬相互作用之間的微妙竟爭作用所幫助的鉑(II)絡合物 自組裝在控制二者間的精細平衡中起重要作用。
實施例8-通過UV/vis、發(fā)射和CD光譜研究圖1中所示(18金屬絡合物
2與雙鏈DNA的結合
我們也將我們的研究延伸到雙鏈DNA中。初步研究表明，將30|uM 絡合物2加入到通過將等量(45juM,堿基濃度)poly(dA)25和poly(dT)25 混合而制備的poly(dA)25-poly(dT)25雙鏈體(duplex)中，UV-vis和發(fā)射光 鐠均顯示明顯的MMLCT帶，也觀察到絡合物螺旋組裝而引起的典型 的CD信號變化。隨著二聯(lián)體的量增加，MMLCT吸收帶逐漸消失，在 UV-vis光鐠中425 nm處出現(xiàn)新帶(圖25 )。隨著UV-vis光鐠的改變， 在約800 nm處的發(fā)射帶逐漸消失，在約557 nm處出現(xiàn)新的強發(fā)射帶 (圖26)。另夕卜，在高雙鏈體濃度(270 )uM poly(dA)25 + 270fiM poly(dT)25,堿基濃度)時，加入30(iM絡合物2引起4艮小的CD光譜 變化。由于正方形扁平的鉑三聯(lián)吡啶型絡合物是眾所周知的雙螺旋 DNA嵌入劑，結果表明在低的雙鏈體濃度下，大部分絡合物與DNA 上的陰離子磷酸基團通過靜電作用相互結合，從而導致螺旋自組裝， 而在高的雙鏈體DNA濃度下，大部分絡合物與雙鏈體相互嵌入，從而 沒有觀察到絡合物的自組裝。吸收和發(fā)射帶分別移動到更短的波長425 nm和557 nm處，這強烈表明絡合物陽離子處于非常不同的環(huán)境中， 可能與核酸堿基對以嵌入方式而堆積在一起。
參考文獻
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權利要求
1.一種檢測多電荷生物分子的包含帶電荷的d8或d10金屬絡合物的組合物，其中金屬絡合物與多電荷生物分子靜電結合，以誘導金屬帶電荷絡合物通過金屬···金屬相互作用、π···π相互作用或兩種相互作用的組合而聚集和自組裝。
2. —種表征多電荷生物分子的包含帶電荷的(18或(11()金屬絡合物的組合物，其中金屬絡合物與多電荷生物分子靜電結合，以誘導金屬 絡合物通過金屬*"金屬相互作用、兀*"兀相互作用或兩種相互作用的 組合而聚集和螺旋狀自組裝。
3. 權利要求1的組合物，其中自組裝造成金屬絡合物一個或多個 光學性質的變化。
4. 權利要求2的組合物，其中自組裝造成金屬絡合物一個或多個 光學性質的變化。
5. 權利要求3的組合物，其中一個或多個光學性質變化是UV/vis、發(fā)射或CD強度的變化。
6.權利要求1的纟且合物，其中多電荷生物分子帶有不少于3個凈電荷。
7.權利要求2的纟且合物，其中多電荷生物分子帶有不少于3個凈電荷。
8.權利要求1的組合物，其中多電荷生物分子是單鏈核酸。
9.權利要求2的組合物，其中多電荷生物分子是單鏈核酸。
10.權利要求1的組合物，其中多電荷生物分子是蛋白或多肽。
11,權利要求2的組合物，其中多電荷生物分子是蛋白或多肽。
12.權利要求1的組合物，其中金屬絡合物包含至少一種過渡態(tài)金屬和至少 一種相應的配位體。
13. 權利要求2的組合物，其中金屬絡合物包含至少一種過渡態(tài)金 屬和至少一種相應的配位體。
14. 權利要求8的組合物，其中單鏈核酸形成i-基序結構。
15. 權利要求8的組合物，其中單鏈核酸形成G-四聯(lián)體。
16. 權利要求12的組合物，其中至少一種過渡態(tài)金屬是鉑(Pt)、 金(Au)、把(Pd)、銠(Rh)、銥(Ir)或銀(Ag )。
17. 權利要求12的組合物，其中至少一種相應的配位體是芳基、 烷基、炔基及其衍生物；氮供體配體；^L、磷或氧供體配體。
18. 權利要求17的組合物，其中所述氮供體配體是吡啶、聯(lián)吡啶、 三聯(lián)吡啶、多吡啶、芳基吡啶、二芳基吡啶、芳基聯(lián)吡啶、菲咯啉、 二。秦、三溱、酞菁、亞胺、二亞胺、三亞胺、卟啉或其衍生物。
19. 權利要求17的組合物，其中所述硫、磷和氧供體配體是磷膦、 硫醇鹽、羧酸鹽或衍生物。
20. 權利要求12的組合物，其中金屬絡合物具有扁平結構或部分 扁平結構，及至少 一個能夠發(fā)生兀* *兀堆積相互作用的相應的配位體。
21. 權利要求12的組合物，其中至少一種過渡態(tài)金屬是鉑(Pt)。
22. 權利要求12的組合物，其中至少一種相應的配位體是三聯(lián)吡啶。
23. 權利要求12的組合物，其中至少一種過渡態(tài)金屬是鉑(Pt), 且至少 一種相應的配位體是三聯(lián)吡咬。
24. 權利要求12的組合物，其中至少一種相應的配位體具有以下 結構<formula>formula see original document page 3</formula>
25.權利要求12的組合物，其中至少一種相應的配位體具有以下 結構
26. —種檢測樣品中目標多電荷生物分子存在的檢測方法，所述方 法包括(a) 將帶電荷的(18或(11()金屬絡合物與可能含有目標多電荷生 物分子的樣品在有效使d8或d"金屬絡合物與目標多電荷 生物分子通過靜電相互作用彼此結合的條件下進行合 并，其中金屬絡合物包含至少一種過渡態(tài)金屬和至少一 種相應的配位體，然后使帶電荷的cf或d"金屬絡合物聚集體自組裝，和 (b) 檢測帶電荷的(18或(^金屬絡合物聚集體的光學性質。
27. —種用于檢測樣品中多電荷生物分子的試劑盒，所述試劑盒包括(a) 含有帶電荷的(18或(11()金屬絡合物的組合物，其中金屬絡 合物與多電荷生物分子靜電結合，以誘導W或cT金屬絡 合物通過金屬"*金屬相互作用和兀，"兀相互作用而聚集 和自組裝，和(b) 使用說明書。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于檢測和/或表征多電荷生物分子的包含帶電荷的d⁸或d¹⁰金屬絡合物的組合物，其中金屬絡合物與多電荷生物分子靜電結合，從而通過金屬…金屬相互作用、π…π相互作用或這兩種相互作用的組合來誘導金屬絡合物的聚集和自組裝。本發(fā)明進一步提供了使用包含帶電荷的d⁸或d¹⁰金屬絡合物的組合物進行無標記光學檢測和/或表征帶多電荷的生物分子，例如單鏈核酸、聚天冬氨酸、聚谷氨酸的檢測方法和試劑盒。
文檔編號C07D403/14GK101360739SQ200780001656
公開日2009年2月4日 申請日期2007年2月5日 優(yōu)先權日2006年2月10日
發(fā)明者聰 于, 任詠華, 陳凱耀, 黃文忠 申請人:香港大學