專利名稱：：一種魚生長激素蛋白活性的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，更具體的，本發(fā)明涉及用于檢測魚生長激素蛋白活性的蛋白、多核苷酸、重組細胞以及檢測方法。
背景技術(shù)：
：魚生長激素是由魚腦下垂體前葉細胞分泌的一種單鏈蛋白質(zhì)，魚生長激素最基本的生理功能是促進魚體生長和參與多種促合成代謝作用，魚生長激素能夠促進魚體蛋白質(zhì)的合成，產(chǎn)生正氮平衡，提高肝臟或肌肉細胞對氨基酸的吸收率和RNA的合成率，達到提高食物的轉(zhuǎn)化率，從而促進魚體生長的目的。而且，重組方法獲得的外源魚生長激素也能夠增加魚體蛋白質(zhì)的合成，增強魚體對餌料中某些必需氨基酸的吸收，提高魚肝臟脂肪分解酶活力，促進脂肪的分解以作為能量物質(zhì)促進魚體生長，還能提高魚體的抗病能力。研究表明外源魚生長激素在魚類等水產(chǎn)品體內(nèi)不會產(chǎn)生積累，食用這些水產(chǎn)品后也不會對人體的代謝產(chǎn)生影響和干擾，這為水產(chǎn)養(yǎng)殖提供了前提。因此魚生長激素在魚類養(yǎng)殖領(lǐng)域具有極大的應(yīng)用價值，因而越來越受到重視。隨著基因技術(shù)的發(fā)展和成熟，利用重組表達法生產(chǎn)魚生長激素越來越多。但是，利用不同的載體、不同的細胞、在不同的條件下完成的重組表達所獲得的魚生長激素的活性存在很大的差異，因此需要一種穩(wěn)定、快速、簡單的活性鑒定模式。魚生長激素蛋白最主要的生物效應(yīng)是促進魚體生長，因此，對其活性的檢測，現(xiàn)有的方法很多是通過魚生長激素對魚體注射、浸泡、埋植、灌喂和投喂等方式，檢測其是否具有促生長的作用。這些方法雖然是最直接的，但在實際檢測中存在很多不利因素。注射、埋植和灌喂操作繁瑣，耗時較多。浸泡、投喂存在魚生長激素用量過大，促生長效果受多種因素干擾的缺點，這是由于魚生長激素蛋白在魚類消化道內(nèi)會被蛋白酶分解而失去部分生物活性所致。這些在魚體水平的活性檢測方法，共同的缺點是檢測周期長，而且檢測結(jié)果重復(fù)性不好，因為魚體的生長是受魚體自身、營養(yǎng)、環(huán)境等多因素影響的復(fù)雜過程，所以檢測的實驗條件難以統(tǒng)一、標(biāo)準(zhǔn)化。因此，在魚生長激素蛋白活性檢測這一領(lǐng)域，迫切需要一種簡便高效，周期短，重復(fù)性好，實驗條件統(tǒng)一的檢測方法，為魚生長激素活性評價提供新的途徑。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種魚生長激素受體蛋白，所述的魚生長激素受體在CH0細胞上表達可保留良好的生物學(xué)結(jié)構(gòu)，從而可靈敏地檢測魚生長激素蛋白的活性。本發(fā)明的另一目的在于提供一種在細胞水平上檢測魚生長激素蛋白活性的方法。在本發(fā)明的第一方面，提供一種分離的魚生長激素受體蛋白，所述的蛋白具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。在本發(fā)明的第二方面，提供一種分離的多核苷酸，所述的多核苷酸編碼所述的蛋白。在另一優(yōu)選例中，所述的多核苷酸具有SEQIDNO:l所示的核苷酸序列。在本發(fā)明的第三方面，提供一種載體，所述的載體含有所述的多核苷酸。在本發(fā)明的第四方面，提供一種宿主細胞，所述的宿主細胞含有所述的載體；或所述的宿主細胞上表達有所述的魚生長激素受體蛋白。在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細胞是CHO細胞。在本發(fā)明的第五方面，提供所述的宿主細胞的用途，用于檢測魚生長激素蛋白活性。在本發(fā)明的第五方面，提供一種檢測魚生長激素蛋白活性的方法，所述方法包括步驟(1)培養(yǎng)所述的宿主細胞，形成表達魚生長激素受體的細胞的培養(yǎng)物；和(2)將待測魚生長激素蛋白加入到步驟(1)獲得的表達魚生長激素受體的細胞的培養(yǎng)物中，檢測所述細胞的生長和/或增殖情況，從而獲知待測魚生長激素的活性。在另一優(yōu)選例中，步驟(2)包括在測試組中，將待測魚生長激素蛋白加入到步驟(1)獲得的表達魚生長激素受體的細胞的培養(yǎng)物中；和檢測測試組的培養(yǎng)物中細胞的生長和/或增殖情況，并與對照組比較，其中所述的對照組是不添加待測魚生長激素蛋白的表達魚生長激素受體的細胞的培養(yǎng)物；其中，如果測試組中細胞的生長和/或增殖在統(tǒng)計學(xué)上快于對照組，就表明該待測魚生長激素蛋白具有活性；或者，根據(jù)測試組中細胞的生長和/或增殖比對照組快的程度來評估待測魚生長激素蛋白活性的強弱。在另一優(yōu)選例中，在步驟(2)中，將待測魚生長激素加入到表達魚生長激素受體的細胞的培養(yǎng)物中16-48小時，檢測所述細胞的生長和/或增殖情況。在另一優(yōu)選例中，將待測魚生長激素加入到表達魚生長激素受體的細胞的培養(yǎng)物中24-36小時，檢測所述細胞的生長和/或增殖情況。在另一優(yōu)選例中，在步驟(2)中，所述的待測魚生長激素蛋白在培養(yǎng)物中的終濃度為20-2000ng/raL。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。圖l顯示了gcGHR轉(zhuǎn)化細菌的重組載體的PCR和酶切產(chǎn)物電泳結(jié)果，其中泳道1:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，選用TaKaRa公司的人-HindIII消化；泳道2:重組載體的PCR擴增產(chǎn)物；泳道3:以pcDNA3.1空載體作為模板的PCR反應(yīng)；泳道4:重組載體的雙酶切產(chǎn)物；泳道5:pcDNA3.1空載體單酶切產(chǎn)物。圖2顯示了CH0-gcGHR細胞總西A的RT-PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果，其中泳道1:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，選用Ferraentas公司的GeneRuler,100bpLadderPIUS;泳道2:CH0-gcGHR細胞RT-PCR擴增出的actin片段；泳道3:CHO-gcG服細胞RT-PCR擴增出的gcGHR片段；泳道4:CHO-gcGHR細胞RT-PCR反應(yīng)的陰性對照；泳道5:CH0-K1細胞RT-PCR擴增出的actin片段；泳道6:CH0-K1細胞RT-PCR擴增gcGHR的反應(yīng)；泳道7:CH0-Kl細胞RT-PCR反應(yīng)的陰性對照。圖3顯示了CHO-gcGHR細胞總蛋白的WesternBlot結(jié)果，其中泳道l:蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，選用Fermentas公司的預(yù)染Marker;泳道2:CH0-K1細胞蛋白WesternBlot結(jié)果；泳道3:CHO-gcGHR細胞蛋白WesternBlot的陰性對照；泳道4:CHO-gcGHR細胞蛋白WesternBlot檢測出gcGHR蛋白的結(jié)果。圖4顯示了魚生長激素促細胞增殖活性檢測。具體實施方式本發(fā)明人經(jīng)過大量的篩選和反復(fù)的試驗，找到一種特別適合于構(gòu)建魚生長激素蛋白活性檢測用細胞模型的魚生長激素受體，其來源于草魚(a朋o;力s2T/7^^o;7jVe77a)，其氨基酸序列和DNA序列與目前已有的魚生長激素受體蛋白的序列均不同。將所述的魚生長激素受體基因轉(zhuǎn)入到宿主細胞CH0后，獲得可表達魚生長激素受體的重組CHO細胞，該細胞所表達的魚生長激素受體保留有良好的生物學(xué)構(gòu)型，較之利用同樣方法表達于細胞上的其它魚生長激素受體具有更高的靈敏度，因而可良好地應(yīng)用于檢測魚生長激素的活性。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。草魚生長激素受體蛋白及其編碼基因如本文所用，"分離的"是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。如本文所用，"草魚生長激素受體蛋白或多肽"是指草魚生長激素受體蛋白基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化草魚生長激素受體蛋白?；旧霞兊亩嚯脑诜沁€原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。本發(fā)明的蛋白可以是重組蛋白、天然蛋白、合成蛋白，優(yōu)選重組蛋白。本發(fā)明的蛋白可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主中產(chǎn)生。在本發(fā)明中，術(shù)語"草魚生長激素受體蛋白"指具有結(jié)合魚生長激素活性的SEQIDNO:2所示序列的蛋白(多肽)，該蛋白的序列與其它已有的魚生長激素受體的序列均不同。本發(fā)明還提供了編碼所述草魚生長激素受體蛋白的多核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。作為本發(fā)明的最優(yōu)選方式，編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQIDNO:1所示的編碼區(qū)序列相同。本發(fā)明的多核苷酸的序列通?？梢杂肞CR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關(guān)序列。一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關(guān)序列。本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或草魚生長激素受體蛋白編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細胞。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的細胞是CHO細胞；最優(yōu)選的，所述的CH0細胞是CH0-K1。所述的CH0細胞可在其細胞膜上穩(wěn)定地表達本發(fā)明的魚生長激素受體。所述的表達載體可以是任何適合在本發(fā)明的宿主細胞中表達的載體，例如，所述的表達載體可以是pc匪3.1。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含草魚生長激素受體蛋白編碼DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等(Sambroook，etal.MolecularCloning,aLaboratoryManual,coldSpringHarborLaboratory.NewYork,1989)。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當(dāng)啟動子上，以指導(dǎo)mRNA合成。此外，表達載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細胞的表型性狀。包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷毎允蛊淠軌虮磉_蛋白質(zhì)。檢測方法本發(fā)明的檢測方法的主要原理是魚生長激素可結(jié)合到不同靶組織細胞膜上的特異性受體，再由受體介導(dǎo)，激發(fā)一系列胞內(nèi)的生化反應(yīng)并最終導(dǎo)致相應(yīng)的生物效應(yīng)的發(fā)生。因此，通過將魚生長激素受體穩(wěn)定地表達于細胞膜，利用待測魚生長激素進行刺激，然后觀察該細胞的生物學(xué)效應(yīng)的變化(如生長加快、增殖加快)程度，從而可得知待測魚生長激素的活性。獲得良好的檢測結(jié)果的較為重要前提是魚生長激素受體可以被穩(wěn)定地表達于細胞膜上，表達后的構(gòu)型不被破壞或發(fā)生影響結(jié)合的改變。盡管目前已經(jīng)有人將魚生長激素受體表達于細胞膜來檢測魚生長激素活性的報導(dǎo)，然而已有的報導(dǎo)采用的魚生長激素與本發(fā)明人采用的不同，并且這些魚生長激素活性檢測細胞模型的靈敏度不高(檢測低限約在150ng/mL)，這可能是由于在表達過程中受到細胞內(nèi)環(huán)境的影響，構(gòu)型發(fā)生變化或穩(wěn)定性差等原因引起的。而本發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，采用獲自草魚的魚生長激素受體表達于CH0細胞膜所構(gòu)建的檢測用細胞模型的檢測靈敏度異常理想，檢測低限約20ng/mL。因此，本發(fā)明提供了一種方法，所述的方法包括步驟(1)培養(yǎng)宿主細胞，所述的宿主細胞可表達魚生長激素受體，從而形成表達魚生長激素受體的細胞的培養(yǎng)物；(2)將待測魚生長激素蛋白加入到步驟(l)的表達魚生長激素受體的細胞的培養(yǎng)物中，檢測所述細胞的生長和/或增殖情況，從而獲知待測魚生長激素的活性。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，可通過設(shè)置對照組來更為準(zhǔn)確地評估待測魚生長激素的活性。對照組通常是不添加待測魚生長激素蛋白而其它條件不變的表達魚生長激素受體的細胞的培養(yǎng)物。如果添加待測魚生長激素蛋白的細胞培養(yǎng)物中細胞的生長和/或增殖在統(tǒng)計學(xué)上快于對照組，就表明該待測魚生長激素蛋白具有活性；此外，還可根據(jù)兩組細胞的生長和/或增殖的快慢程度來評估待測魚生長激素蛋白活性的強弱。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的待測魚生長激素蛋白是選自下組鰱魚生長激素，或其他淡水魚生長激素和海水魚生長激素。不同種類的魚生長激素雖然在一級結(jié)構(gòu)上會有差異，但是其活性蛋白的高級結(jié)構(gòu)中存在相似的保守功能結(jié)構(gòu)域，這些保守結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)了生長激素蛋白與受體的結(jié)合作用。所以不同種類的魚生長激素具有相似的結(jié)合本發(fā)明中草魚生長激素受體的作用。例如，所述的魚生長激素是由以下基因編碼的魚生長激素Genbank登錄號M94348(鰱魚生長激素)、X13670、X60419、E01353等。。所述的魚生長激素蛋白是來源于以下途徑天然的魚生長激素或其變異體，或重組的魚生長激素或其突變體。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的宿主細胞是CHO細胞，進一步優(yōu)選的是CHO-Kl細胞。此外，魚生長激素蛋白促進細胞生長或增殖的作用還受其它一些因素的影響。這些因素包括細胞接入量，魚生長激素濃度范圍，魚生長激素與細胞孵育時間以及孵育前細胞生長時間范圍。通過調(diào)節(jié)這些因素，可使得檢測更為靈敏和準(zhǔn)確。本發(fā)明人長期的實踐發(fā)現(xiàn)，待測魚生長激素與表達生長激素受體的細胞孵育的時間過短可導(dǎo)致生長激素刺激不完全，由生長激素引發(fā)的細胞內(nèi)生物學(xué)效應(yīng)還沒有產(chǎn)生；而孵育時間過長，細胞不能得到生長所需的足夠營養(yǎng)，細胞發(fā)生代謝異?；蛩劳觥Ｒ虼?，作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，在步驟(2)中，將待測魚生長激素加入到表達魚的培養(yǎng)物中16-48小時，再檢測所述細胞的生長和/或增殖情況。更優(yōu)選地，將待測魚生長激素加入到表達魚生長激素受體的細胞的培養(yǎng)物中24-36小時，再檢測所述細胞的生長和/或增殖情況。刺激培養(yǎng)時，魚生長激素蛋白的濃度高低會較明顯地影響對細胞的促增殖作用。濃度過低，不能形成有效的作用濃度；濃度過高，反而會一定程度抑制細胞增殖。本發(fā)明人摸索了多種來源的魚生長激素蛋白的作用情況，發(fā)現(xiàn)濃度范圍在20-2000ng/mL是合適的。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，在步驟(l)中，所述的細胞在細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)，如96孔細胞培養(yǎng)板。優(yōu)選的，每孔(孔的容量約400ul，培養(yǎng)面積約0.33cm"細胞接入數(shù)量為4000-6000個，較佳的每孔4000-5000個細胞。在檢測時，細胞培養(yǎng)板每孔的細胞接入數(shù)適當(dāng)，則檢測效果較為理想。細胞數(shù)量過少，最終顯色讀數(shù)會偏小，容易造成實驗誤差，掩蓋實驗結(jié)果；細胞數(shù)量過大，細胞會過早長滿，造成接觸抑制，細胞增殖受到影響，魚生長激素不能發(fā)揮作用。發(fā)明人嘗試了不同的細胞接入數(shù)量，發(fā)現(xiàn)每孔4000-6000個范圍能獲得較優(yōu)異的實驗結(jié)果。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，細胞培養(yǎng)條件為，溫度37土2。C(優(yōu)選37士rC)，0)2含量約5%，F(xiàn)12培養(yǎng)基加入10%胎牛血清。在魚生長激素蛋白刺激前，細胞培養(yǎng)時間的長短也會對最終結(jié)果造成一定的影響作用。時間過短，細胞貼壁不牢，換培養(yǎng)液時容易帶走細胞，造成實驗誤差。因此，作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，在魚生長激素蛋白刺激前，用含有血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞24-48小時，較佳的36-48小時。更佳的步驟是去除含血清的培養(yǎng)基，換用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞6-12小時后，再用含有魚生長激素蛋白的無血清培養(yǎng)基與細胞孵育24-36小時。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，在步驟(2)中，在魚生長激素與細胞孵育后，還加入MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽)以檢測細胞存活和生長情況，活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性的MTT還原為難溶性的藍紫色結(jié)晶物Forraazan，并沉積在細胞中，而死細胞無此作用。在一定細胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶物形成的量與細胞數(shù)成正比。更佳的，采用的MTT濃度為5±2mg/ml，與細胞孵育3-4小時。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，溶解MTT酶裂解產(chǎn)物Formazan的溶劑是異丙醇，加入量每孔100-150^1。在本發(fā)明的具體實施例中，公開了一種魚生長激素蛋白活性的檢測方法。所述的方法是克隆得到新的草魚生長激素受體基因(gcGHR)，序列第459位氨基酸由Asn變成Ser，將gcGHR插入表達載體多克隆位點，獲得重組表達載體，轉(zhuǎn)染CH0-Kl細胞，篩選穩(wěn)定表達草魚生長激素受體基因的細胞(CHO-gcG服)。提取CHO-gcGHR細胞總RNA，RT-PCR檢測gcGHR基因在細胞內(nèi)獲得轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生對應(yīng)的mRNA。WesternBlot檢測CH0-gcGHR細胞總蛋白，鑒定細胞表達了gcGHR蛋白。檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CH0-gcGHR細胞在20-2000ng/mL濃度范圍的魚生長激素蛋白的刺激下，細胞增殖表現(xiàn)出與生長激素濃度依賴的關(guān)系。隨著魚生長激素濃度的升高，刺激效果加大，在200ng/mL的濃度，促細胞增殖效果達到峰值，細胞數(shù)量增多50-60%，在20ng/mL的濃度，細胞數(shù)量增殖度與空白對照存在顯著差異(實驗表面效應(yīng)屬于誤差的概率P〈0.05)，所以魚生長激素蛋白活性檢測的最低濃度檢出限為20ng/raL。本發(fā)明的檢測方法更接近魚生長激素蛋白體內(nèi)作用的過程，因此檢測結(jié)果更加有效、可信。本發(fā)明的方法從加入魚生長激素蛋白刺激到檢測出結(jié)果，只需要24小時左右，而且全部反應(yīng)在細胞培養(yǎng)板里進行，所以具有操作簡便，檢測周期短、成本低，結(jié)果重復(fù)性好，適合高通量檢測的優(yōu)點。本發(fā)明的主要優(yōu)點在于(1)揭示一種特別適合于構(gòu)建魚生長激素蛋白活性檢測用細胞模型的魚生長激素受體基因，將所述的魚生長激素受體基因轉(zhuǎn)入到宿主細胞CHO后，獲得可表達魚生長激素受體的重組CHO細胞，該細胞所表達的魚生長激素受體保留有良好的生物學(xué)構(gòu)型，較之其它利用同樣方法表達于細胞上的魚生長激素受體具有更高的靈敏度，因而可良好地應(yīng)用于檢測魚生長激素的活性。(2)揭示了一種在細胞水平的魚生長激素蛋白活性檢測方法，方法簡便，檢測周期短，結(jié)果重復(fù)性好，成本低，適合大量樣品的快速檢測。下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室指南(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。實施例1構(gòu)建穩(wěn)定表達草魚生長激素受體基因的CH0-K1細胞(CH0-gcGHR)1.材料A.菌株及載體真核細胞CH0-K1(CCTCC編號為GDC018),購自武漢中國典型培養(yǎng)物保藏中心；大腸桿菌XL1-Blue感受態(tài)細胞，購自Stratagene公司；表達載體購自Invitrogen公司的pcDNA3.1(+)。B.分子生物學(xué)試劑限制性內(nèi)切酶Hind工II、Apal、T4DNA連接酶均購自TaKaRa公司；KODplusDNA聚合酶購自ToYoBo公司。DNAMarker購自Fermentas公司的GeneRuler,lOObpLadderPlus(產(chǎn)品號SM0321)和TaKaRa公司的入-HindIIIDigest(產(chǎn)品號:D3403A)。蛋白Marker購自Fermentas公司的預(yù)染Marker(產(chǎn)品號SM0671)。RNA提取試劑盒購自Qiagen公司。RT-PCR試劑盒購自Invitrogen公司。質(zhì)粒提取試劑盒，凝膠回收試劑盒購自Tiangen公司。轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司的LipofectamineTM2000。F12培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司。G418購自Sigma公司。引物合成由上海賽百盛基因技術(shù)有限公司完成。DNA測序由上海桑尼生物科技有限公司完成。草魚生長激素受體蛋白N端的多抗pcDNA3.l-gcGHR為模板，利用上游引物5，GGGATTCCATATGTCCAAGCTGTTCACTGCA3，(SEQIDNO:5)，下游引物5，CTCAAGCTTTTATCAATGCACAATGTTTTCCACTG3，(SEQIDNO:6)擴增gcGHR基因上游片段355bp，其對應(yīng)編碼生長激素受體蛋白N端的多肽133AA。擴增產(chǎn)物與表達載體pET-22b(+)用Ndel和HindIII雙酶切，T4DNA連接酶連接酶切產(chǎn)物，獲得的重組表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-Blue感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化子經(jīng)PCR和雙酶切鑒定出陽性細菌克隆。重組表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌HMS174(DE3)感受態(tài)細胞，挑單克隆轉(zhuǎn)接LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)表達草魚生長激素受體蛋白N端多肽。以表達的多肽作為抗原，常規(guī)方法免疫新西蘭兔，從而獲得對應(yīng)的多克隆抗體。2.方法(1)RT-PCR克隆草魚生長激素受體基因設(shè)計可用于擴增草魚生長激素基因的引物，從草魚肝組織提取總RNA，通過RT-PCR，擴增草魚生長激素受體基因。引物序列見表l。表1SEQIDNO:引物序列35，ATGGCTTACTCTCTCTCACTCAG3，45，TCATGGAGTCAGGTTTCCC3，(2)pcDNA3.1-gcGHR表達載體的構(gòu)建在表l的上游引物(SEQIDNO:3)的5'端設(shè)計了Kozak序列和Hindlll酶切位點，在下游引物(SEQIDNO:4)的5'端設(shè)計了Apal酶切位點，以RT-PCR擴增產(chǎn)物為模板進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物和pcDNA3.1表達載體經(jīng)HindIII，ApaI雙酶切，采用T4DNA連接酶連接酶切后的擴增產(chǎn)物和載體，獲得的重組表達載體稱為pcDNA3.1-gcG服，將該重組表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-Blue感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化子經(jīng)PCR和雙酶切鑒定出陽性細菌克隆。DNA測序鑒定插入序列的方向和讀框是否正確，與已有序列進行比對。(3)篩選穩(wěn)定表達gcGHR基因的細胞CHO-gcGHRpcDNA3.1-gcGHR重組表達載體經(jīng)Lipofectamine2000介導(dǎo)，轉(zhuǎn)染96孔細胞培養(yǎng)板單孔的CH0-K1細胞，轉(zhuǎn)接70mm細胞培養(yǎng)皿，稀釋濃度1/10。含有80(Vg/ml的G418的F12培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，每隔3天換液1次，連續(xù)篩選2周后，挑取陽性細胞克隆傳代培養(yǎng)。RT-PCR、Western鑒定陽性細胞的草魚生長激素受體基因轉(zhuǎn)錄和翻譯。3.結(jié)果A.草魚生長激素受體基因的克隆及重組表達載體的構(gòu)建用設(shè)計的引物從草魚肝組織的總RNA中RT-PCR獲得1.8kb的生長激素受體基因DNA，與預(yù)期大小相符，見圖l。擴增產(chǎn)物與表達載體連接后，轉(zhuǎn)化XL1-Blue感受態(tài)細胞，挑取陽性細菌克隆，PCR和雙酶切鑒定表明，插入片段與擴增產(chǎn)物大小一致，見圖1。測序結(jié)果表明，本發(fā)明人克隆到的草魚生長激素受體基因具有SEQIDNO:l所示的核苷酸序列，其編碼的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。與Genbank中最接近的草魚生長激素受體cDNA序列(Genbank登錄號AY283778)相比，本發(fā)明的草魚生長激素受體基因的核酸序列在多處有差異，反映在蛋白序列(Ge叩印t登錄號AAP37033)上，第459位氨基酸由Asn變成Ser，部分比較結(jié)果見表2。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>因此，擴增產(chǎn)物的序列和翻譯的蛋白序列與目前已有的魚生長激素受體的序列均不同。B.草魚生長激素受體基因的轉(zhuǎn)錄分析穩(wěn)定表達細胞在培養(yǎng)瓶中傳代培養(yǎng)，提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA模板，以表l設(shè)計的引物，PCR擴增模板，以actin的兩端引物(分別是上游引物5，ACAGGGAAAAGATGACACAGAT3，(SEQIDNO:7)，下游引物5'GCAAGACTCCATACCCAAGAA3，(SEQIDNO:8))，PCR擴增cDNA模板，作為反應(yīng)的陽性對照，以沒有加引物的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液作為模板的PCR反應(yīng)作為反應(yīng)的空白對照。以沒有轉(zhuǎn)染的CH0-K1細胞RT-PCR反應(yīng)作為轉(zhuǎn)錄分析的陰性對照。DNA瓊脂糖凝膠電泳分析擴增結(jié)果，見圖2。結(jié)果表明，穩(wěn)定表達gcGHR的細胞CHO-gcGHR和未轉(zhuǎn)染的CHO-Kl細胞，都擴增出e-actin的特征片段，說明提取的總RNA以及RT-PCR反應(yīng)沒有異常。用表l的特異引物，從CHO-gcGHR細胞總RNA中，RT-PCR獲得了全長1.8kb的草魚生長激素受體基因的特征片段，而未轉(zhuǎn)染的CH0-K1細胞用表1的特異引物沒有擴增出產(chǎn)物，說明CHO-gcGHR細胞的草魚生長激素受體基因獲得轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生了gcGHRmRNA。C.草魚生長激素受體基因的翻譯分析穩(wěn)定表達細胞在培養(yǎng)瓶中傳代培養(yǎng)，Triton破碎細胞后，細胞破碎液和預(yù)染蛋白Marker進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，以沒有轉(zhuǎn)染的CHO-Kl細胞，作為陰性對照。WesternBlot分析電泳結(jié)果，見圖3。結(jié)果表明，用草魚生長激素受體蛋白N端的多抗檢測出穩(wěn)定表達細胞CHO-gcGHR唯一的一條蛋白條帶，蛋白分子量顯示約為60KD,與草魚生長激素受體蛋白分子量近似，對照反應(yīng)和沒有轉(zhuǎn)染的CH0-K1細胞都沒有任何條帶。說明CH0-gcGHR細胞表達了草魚生長激素受體蛋白。實施例2鰱魚生長激素蛋白的制備1.材料載體大腸桿菌HMS174(DE3)，OrigamiTM(DE3)感受態(tài)細胞購自MERCK公司，大腸桿菌XL1-Blue感受態(tài)細胞購自Stratagene公司；表達載體pET-21(+)購自MERCK公司。分子生物學(xué)試劑限制性內(nèi)切酶EcoRI，HindIII，T4DNA連接酶均購自TaKaRa公司；KODplusDNA聚合酶購自ToYoBo公司；RNA提取試劑盒購自Qiagen公司；RT-PCR試劑盒購自Invitrogen公司；質(zhì)粒提取試劑盒，凝膠回收試劑盒購自Tiangen公司；鎳親和柱填料購自Qiagen公司；引物合成由上海賽百盛基因技術(shù)有限公司完成；DNA測序由上海桑尼生物科技有限公司完成；其他試劑均為分析純。2.方法(1)RT-PCR克隆鰱魚生長激素基因(scGH)從鰱魚腦下垂體組織提取的總RNA，通過反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA作為模板，根據(jù)Genbank中鰱魚生長激素基因序列(M94348)設(shè)計引物，PCR擴增鰱魚生長激素基因，引物序列見表3。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>(2)構(gòu)建pET21-scGH表達載體在上表的引物1的5'端設(shè)計EcoRI酶切位點，在引物2的5'端設(shè)計HindIII酶切位點，以RT-PCR擴增產(chǎn)物為模板進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物和pET-21(+)經(jīng)EcoRI，HindIII雙酶切，用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-Blue感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化子經(jīng)PCR和雙酶切鑒定出陽性細菌克隆，DNA測序表明插入序列的方向，讀框正確。(3)鰱魚生長激素蛋白可溶表達pET21-scGH載體轉(zhuǎn)化Origami(DE3)(Novagen)感受態(tài)細胞，挑單菌落接種LB液體培養(yǎng)基(含100ug/ml氨芐青霉素)，置37'C搖床過夜培養(yǎng)，1%轉(zhuǎn)接LB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)3小時，加入異丙基硫代-e-D-半乳糖苷(IPTG)至終濃度lmmol/L，置于2(TC搖床誘導(dǎo)12小時。離心收集菌體，重懸于20mmol/LTris-HCl(pH8.0)，500mmol/LNaCl，10%甘油的緩沖液，超聲破碎，離心收集上清。鎳親和柱純化上清蛋白溶液，獲得鰱魚生長激素蛋白(GH1)。(4)鰱魚生長激素蛋白包涵體的獲得及純化pET21-scGH載體轉(zhuǎn)化HMS174(DE3)(Novagen)感受態(tài)細胞，挑單菌落接種LB液體培養(yǎng)基(含100ug/ml氨芐青霉素)，置37。C搖床過夜培養(yǎng)，1%轉(zhuǎn)接LB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)3小時，加入異丙基硫代-D-半乳糖苷(IPTG)至終濃度lmmol/L，37。C誘導(dǎo)4小時。離心收集菌體，重懸于20誦ol/LTris-HCl(pH8.0)，500mmol/LNaCl的緩沖液，超聲破碎，離心收集沉淀。液體培養(yǎng)基1/10體積的6mol/L鹽酸胍(PH8.0)溶解沉淀30分鐘，溶解的蛋白溶液置于透析袋中，在蛋白溶液IO倍體積的20國ol/LTris-HCl(pH8.0)，500mmol/LNaCl，10%Glycerol的透析液中透析16小時，八小時換透析液一次。透析后的蛋白溶液過鎳親和柱純化，獲得鰱魚生長激素蛋白(GH2)。實施例3檢測魚生長激素蛋白促CHO-gcGHR細胞增殖的生物活性1.材料A.菌株及載體真核細胞CH0-Kl(CCTCC編號為GDC018)，購自武漢中國典型培養(yǎng)物保藏中心；表達載體購自Invitrogen公司的pcDNA3.1(+)。B.分子生物學(xué)試劑F12培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司。MTT購自Amresco公司。2.方法(1)在96孔細胞培養(yǎng)板每孔接入4000個前述制備的CH0-gcGHR細胞，用含有10。/。胎牛血清的F12培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞48小時，細胞培養(yǎng)溫度為37r，C02含量為5%;(2)去除含血清的培養(yǎng)基，換用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞6小時，再換用含有魚生長激素蛋白的F12培養(yǎng)基與細胞共同孵育24小時，蛋白濃度范圍20-2000ngM;(3)每孔加入5rag/ml濃度的MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽)10-20^1，與細胞孵育4小時；(4)去除每孔的液體，加入100-150^1異丙醇，充分溶解沉淀，選擇570mn波長，測每孔的光吸收值。3.結(jié)果可溶表達的鰱魚生長激素蛋白(GH1)，在20-2000ng/mL濃度范圍內(nèi)，能刺激CH0-gcGHR細胞增殖，細胞增殖表現(xiàn)出與生長激素濃度依賴的關(guān)系。隨著濃度的升高，刺激效果加大，在200ng/mL的濃度，生長激素刺激細胞增殖效果達到最大峰值，細胞數(shù)量增多50-60%，隨后，生長激素濃度升高，刺激效果減弱，見圖4。通過包涵體變性復(fù)性得到的鰱魚生長激素蛋白(GH2)，也能刺激CHO-gcG服細胞增殖，細胞增殖也表現(xiàn)出與生長激素濃度依賴的關(guān)系，與GH1相比，GH2有效濃度范圍窄，為100-1000ng/mL，促細胞增殖的最大峰值低10%。這是因為包涵體表達的鰱魚生長激素蛋白經(jīng)過了蛋白變性和復(fù)性的過程，其活性有一定程度的下降。結(jié)果表明，鰱魚生長激素蛋白在一定濃度范圍內(nèi)，具有刺激CHO-gcGHR細胞增殖的活性，濃度為200ng/mL，具有最大促增殖作用。在20ng/mL的濃度，細胞數(shù)量增殖度與未加魚生長激素蛋白的空白對照結(jié)果存在顯著差異(t檢驗說明，實驗表面效應(yīng)屬于誤差的概率P〈0.05)，所以此方法魚生長激素蛋白活性檢測的最低濃度檢出限為20ng/mL。此外，本發(fā)明人還分別檢測了含有魚生長激素蛋白的F12培養(yǎng)基與細胞共同孵育12小時以及52小時，其它條件相同的情況下，魚生長激素蛋白的活性。檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，孵育時間為12小時時，檢測獲得的魚生長激素蛋白的活性與同樣條件下孵育24小時的相比，明顯過低。而孵育時間為52小時時，發(fā)現(xiàn)有一定比例的細胞發(fā)生死亡，檢測結(jié)果不理想。討論本發(fā)明人從草魚肝組織克隆到草魚生長激素受體基因，并構(gòu)建了穩(wěn)定表達的CHO-Kl細胞(CHO-gcGHR)，在鰱魚生長激素蛋白的刺激作用下，細胞增殖與激素濃度有依賴關(guān)系，最大刺激效果下，細胞數(shù)量增加50-60%,表現(xiàn)出魚生長激素蛋白明顯的促細胞增殖活性，因此，可以作為檢測魚生長激素活性的一種新方法。研究過程中，在對魚生長激素受體的選擇中，本發(fā)明人還驗證了其它許多種魚生長激素受體(包括與本發(fā)明的魚生長激素受體同源性較高的一些魚生長激素受體)，將之在CHO細胞上表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些魚生長激素受體存在表達效果不理想或者檢測靈敏度不高的現(xiàn)象，效果明顯不如本發(fā)明的魚生長激素理想。采用本發(fā)明的方法，從加入魚生長激素蛋白刺激到檢測出結(jié)果，只需要約24小時左右，而且全部反應(yīng)只需在細胞培養(yǎng)板里進行即可，所以具有操作簡便，檢測周期短、成本低，結(jié)果重復(fù)性好，適合高通量檢測的優(yōu)點。在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。序列表<110>075837<120〉一種魚生長激素蛋白活性的檢測方法<130>上海中科伍佰豪生物工程有限公司<160〉8<170〉Patentlnversion3.3〈210〉1<211〉1818<212〉DNA<213〉草魚(Ctenopharyngodonidella)<400〉1<formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula><210〉2<211>605<212>PRT<213〉草魚(Ctenopharyngodonidella)<400〉2TyrMetAla1GlyAsn■ProSerThrPhe50ProGly65GluTrpTyrPheLeuArgValGlu130LeuLeu145TrpAlaValTyrLeuAspAspLys210AsnPhe225AlsSerVallieGinArgLysGly290AsnSer305GluAspGluLysGlyArg35ArgAlaLysAsnSer115AsnAsnProGinLeu195GluGlyLysGlyLeu275lieLeuProAsnSerLeu20GlyCysLeuGluLys100VallieValProVal180GluTyrGluGluVal260MetAspLeuTrpSer340Leu5ValProTrpArgCys85ThrProValSerPro165GinSerGluPheSer245ValValProSerVal325GlySerSerHisTrpVal70ProPheGinHisLeu150SerTyrGlyValSer230ThrlielieGluSer310GluSerLeuAlaPheSer55PheAspThrAsnPro135SerAlaArgThrArg215AspPheLeuPheLeu295GinPheAspSerArgThr40AlaTyrTyrHislie120AspGlyAspValGin200ValSerLeuLeuLeu280LeuAsplieThrLeuGly25GlyGlyGinThrlie105ThrProLeuValArg185GinArglieThrlie265ProtysMetGinGin345Leu10SerCysThrThrHis90TrpTyrProHisGin170AsnSerCyslieThr250LeuProAsnTyrLeu330HisCysLysArgPheLys75ThrThrAspliePhe155ThrAsnlieLysVal235LeuLeulieGlyLys315AspLeuLeuLeuSerGin60AsnValSerGluGly140AspGlySerTyrMet220HisVallieProLys300ProteuLeuGlyPheArg45AsnAlaGluTyrAla125LeulieTrpGinGly205SerValLeuPheAla285LeuAspAspGlyLeuThr30GluLeuLeuAsnCys110CysAsnLeuMetTrp190LeuAlaAlalieSer270ProAspPheAspLeu350LeuCys15AlaAspGinGluThrGluSerSer80GluCys95lieGinPheThrTrpThrValArg160SerLeu175GluMetHisThrPheAspGinlie240PheGly255GinGinLyslieGinLeuTyrHis320ProAla335SerHisSerArgSer385SerGluValGlyLys465AspAspAla370LeuArgValAsnVal450GluGlySer355SerLeuSerValMet435ValGluAlaSerCysProSerGlu420AspLeuGluTyrValProProSer500GinAlaValGlu515SerAspSerGin530lieLeuProPro545GinHisSerLeuSerGlyHisTyrSerLeu595Pro580ThrArgTyrGlySer405ThrPheSerAsnThr485ProGlyThrValLeu565AsnProValAspHis390SerProTyrProGlu470SerSerAsnProSer550LeuLysAspLeuPro375SerlielieAlaGly455LysGluProLeuTyr535AspAsnHisLeuAsn360GluGlyProGinGin440GinLysAsnGluTrp520LeuTyrProLeuLeu600PheThrArgAspThr425ValLeuLysMetGin505AsnLeuThrProPro585GlyLysProGlyLeu410GinSerAsnlieAla490GlyGlyProValSer570AlaAsnSerAspGlu395GlyProAspSerGin475ArgTyrGluGluVal555SerLeuLeuAspPro380GinValAlaPheSer460LeuGinGinTyrAla540GinGinProThrAsp365GluHisGinValThr445ProGinLeuSerLeu525ProGluProThrPro605AspAspProGinPro430ProGluLeuSerLeu510ValProValThrMet590SerLeuteuThr415SerAlaLysLeuSer495ProSerValAspVal575ProGlyAlaVal400SerTrpGlyLysSer480AspThrAlaProAla560CysMet<210〉3<211〉23<212>DNA<213〉人工序列<220〉<221〉misc_feature<223〉引物<400〉3atggcttactctctctcactcag23<210>4〈211〉19<212〉DNA23<213〉人工序列〈220〉<221〉misc—feature<223>引物<400〉4tcatggagtcaggtttccc<210〉5<211〉21<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<221>misc—feature<223〉引物<400>5atgtcagagaaccagcggctc<210>6<211>21<212〉DNA<213〉人工序列<220><221〉misc_feature<223〉引物<400〉6ctacagggtgcagtttgaatc<210>7<211〉22<212〉腿<213>人工序列<220〉<221〉misc一feature<223>引物<400>7<210>8<211〉21〈212〉DNA<213>人工序列<220〉<221〉misc一feature<223〉引物<400〉8gcaagactccatacccaagaa2權(quán)利要求1.一種分離的魚生長激素受體蛋白，其特征在于，所述的蛋白具有SEQIDNO2所示的氨基酸序列。2.—種分離的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸編碼權(quán)利要求1所述的蛋白。3.—種載體，其特征在于，所述的載體含有權(quán)利要求l所述的多核苷酸。4.一種宿主細胞，其特征在于，所述的宿主細胞含有權(quán)利要求3所述的載體；或所述的宿主細胞上表達有權(quán)利要求l所述的魚生長激素受體蛋白。5.如權(quán)利要求4所述的宿主細胞，其特征在于，所述的宿主細胞是CHO細胞。6.權(quán)利要求4所述的宿主細胞的用途，其特征在于，用于檢測魚生長激素蛋白活性。7.—種檢測魚生長激素蛋白活性的方法，其特征在于，所述方法包括步驟(1)培養(yǎng)權(quán)利要求4所述的宿主細胞，形成表達魚生長激素受體的細胞的培養(yǎng)物；和(2)將待測魚生長激素蛋白加入到步驟(1)獲得的表達魚生長激素受體的細胞的培養(yǎng)物中，檢測所述細胞的生長和/或增殖情況，從而獲知待測魚生長激素的活性。8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，步驟(2)包括在測試組中，將待測魚生長激素蛋白加入到步驟(1)獲得的表達魚生長激素受體的細胞的培養(yǎng)物中；和檢測測試組的培養(yǎng)物中細胞的生長和/或增殖情況，并與對照組比較，其中所述的對照組是不添加待測魚生長激素蛋白的表達魚生長激素受體的細胞的培養(yǎng)物；其中，如果測試組中細胞的生長和/或增殖在統(tǒng)計學(xué)上快于對照組，就表明該待測魚生長激素蛋白具有活性；或者，根據(jù)測試組中細胞的生長和/或增殖比對照組快的程度來評估待測魚生長激素蛋白活性的強弱。9.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，在步驟(2)中，將待測魚生長激素加入到表達魚生長激素受體的細胞的培養(yǎng)物中16-48小時，檢測所述細胞的生長和/或增殖情況。10.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，在步驟(2)中，所述的待測魚生長激素蛋白在培養(yǎng)物中的終濃度為20-2000ng/mL。全文摘要本發(fā)明公開了一種新的、適合于構(gòu)建魚生長激素蛋白活性檢測用細胞模型的魚生長激素受體及其編碼基因。將所述的魚生長激素受體基因轉(zhuǎn)入到宿主細胞CH0后，獲得可表達魚生長激素受體的重組CH0細胞，該細胞所表達的魚生長激素受體保留有良好的生物學(xué)構(gòu)型，因而可良好地應(yīng)用于檢測魚生長激素蛋白的活性。文檔編號C07K14/615GK101397338SQ20071004655公開日2009年4月1日申請日期2007年9月28日優(yōu)先權(quán)日2007年9月28日發(fā)明者煒胡,毅龔申請人:上海中科伍佰豪生物工程有限公司