專利名稱：：排斥性引導(dǎo)分子(rgm)蛋白質(zhì)家族的蛋白質(zhì)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域及其功能性片段和它們的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及排斥性引導(dǎo)分子(repulsiveguidancemolecular,RGM)蛋白質(zhì)家族成員的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(receptorbindingdomain)的鑒定和用途，并且涉及從其衍生的多肽片段。根據(jù)本發(fā)明的結(jié)構(gòu)域和肽片段適宜作為主動(dòng)或被動(dòng)免疫個(gè)體的藥劑，并且適宜作為用于疾病或病理狀況(其中在所述疾病或病理狀況的t艮或進(jìn)程當(dāng)中牽涉RGM家族成員和該分子的細(xì)胞受體)的診斷劑和治療劑。本發(fā)明還涉及抗本發(fā)明結(jié)合結(jié)構(gòu)域和抗從其衍生的多肽的單克隆和多克隆抗體，并且涉及用于制備本發(fā)明的結(jié)構(gòu)域、多肽和抗體的方法。
背景技術(shù)：
：RGM蛋白質(zhì)家族成員的功能由Monnier，P.P.等，Nature,419，pp.392-395,2002第一次描述。該家族包括目前>^開(kāi)的三個(gè)成員，它們分別稱作RGMA、RGMB(也稱作DRAGON)和RGMC(也稱作血幼素(hemojuvelin扉iederkoflerV.等，J.Neurosci.24，808-18，2004)。它們是通過(guò)脂質(zhì)錨(糖基磷脂酰肌醇錨-GPI錨)結(jié)合至質(zhì)膜的糖蛋白。該蛋白質(zhì)家族的成員與其他蛋白質(zhì)沒(méi)有任何廣泛的序列同源性，并且已經(jīng)鑒定的結(jié)構(gòu)特征基本上是如下區(qū)域N-末端信號(hào)肽；RGD序列；M酸序列GDPH附近的蛋白水解切割位點(diǎn)；vonWillebrand因子結(jié)構(gòu)域(vWFD)的結(jié)構(gòu)同系物；鄰近C末端的疏水序列以及C-末端GPI錨共有序列(還可參見(jiàn)圖2)。在人中，RGMA的編碼序列位于15號(hào)染色體，RGMB的編碼序列位于5號(hào)染色體，并且RGMC的編碼序列位于1號(hào)染色體。觀察到特征性表達(dá)方式。RGMA和B尤其表達(dá)于成人腦和脊髓，RGMC尤其表達(dá)于骨骼肌、肝臟和心肌。RGMB還表達(dá)于軟骨組織。RGM蛋白質(zhì)最初作為在神經(jīng)元拓樸投射形成中起重要作用的候選蛋白質(zhì)而被鑒定出來(lái)(StahlB.等，Neuron5:p735-43，1990;MudlerB.K.等，Curr.Biol.6,pp.1497-1502，1996;MuellerB.K，《MolecularBasisofAxonGrowthandNervePatternFormation》，H.Fujisawa編，JapanScientificSocietiesPress,215-229，1997)。它們以排斥或抑制方式對(duì)生長(zhǎng)的神經(jīng)纖維產(chǎn)生作用的能力是一項(xiàng)決定性的功能特征，該特征在其分離、克隆和表征當(dāng)中起著重要的作用?？梢栽跇悠芳?xì)胞分析試驗(yàn)系統(tǒng)中容易地檢測(cè)該活性。RGM蛋白質(zhì)在兩種不同的細(xì)胞分析試驗(yàn)中具有抑制或排斥效應(yīng)。在塌陷試驗(yàn)(collapseassay)中，RGM蛋白質(zhì)加入到生長(zhǎng)的神經(jīng)纖維中。RGM與RGM受體的結(jié)合誘導(dǎo)一個(gè)由神經(jīng)元生長(zhǎng)錐的所有膜元件參與的強(qiáng)力反應(yīng)。由此，最初延伸的手樣生長(zhǎng)錐轉(zhuǎn)變成細(xì)線。在RGM存在下，神經(jīng)纖維持繼受到抑制、極大回縮并且不再能夠繼續(xù)生長(zhǎng)。RGM蛋白質(zhì)通過(guò)結(jié)合至RGM受體再生蛋白(Neogenin)發(fā)揮其部分作用(RajagopalanS.等，NatCellBiol.6,pp.756-62，2004)。再生蛋白與DCC(在結(jié)直腸癌中缺失(這eletedin￡olorectalgancer))受體密切相關(guān)。兩個(gè)受體均M疫球蛋白超家族的成員并且具有細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。兩個(gè)受體均被描述為另一配體導(dǎo)蛋白-1的受體，但是只有再生蛋白，而不是DCC結(jié)合RGM蛋白質(zhì)。這些受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域由四個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域組成，其后是6個(gè)纖連蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域。RGMA在神經(jīng)系統(tǒng)中的功能了解最深，并且特別值得注意的是其在非常低的濃度時(shí)具有抑制神經(jīng)纖維生長(zhǎng)的作用。在成年人類和在成年大鼠中，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷導(dǎo)致RGM蛋白質(zhì)在損害部位積累(SchwabJ.M.等，Arch.Neurol.待版，2005;SchwabJ.M.等，Eur.J.Neurosci.21:p.387-98,2005)。由此，損傷的神經(jīng)纖維的重新向外生長(zhǎng)(outgrowth)被阻止，并且發(fā)生持久的或多或少嚴(yán)重的功能缺陷(這取決于損害的部位的位置)。RGM的這種對(duì)神經(jīng)纖維生長(zhǎng)的抑制活性通過(guò)結(jié)合至再生蛋白受體而介導(dǎo)(RajagopalanS.等，見(jiàn)上引文)。然而，同一受體通過(guò)結(jié)合導(dǎo)蛋白-1也介導(dǎo)刺激神經(jīng)纖維生長(zhǎng)的相反效應(yīng)。最新的結(jié)果表明，RGM蛋白質(zhì)還在中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)中、在調(diào)節(jié)鐵代謝方面、在腫瘤病中、在炎性過(guò)程中以及在骨和軟骨組織的形成中起著重要的作用?；赗GMA、B和C以高親和力結(jié)合再生蛋白受體的觀察，本發(fā)明的一個(gè)目的是詳細(xì)表征這些分子、特別是RGMA的功能性結(jié)合結(jié)構(gòu)域。這將使得可以產(chǎn)生抗該結(jié)構(gòu)域的抗體和抗從該結(jié)構(gòu)域衍生的活性RGM肽的抗體，其中所述的抗體高度可能中和RGM的抑制活性，并且由此可能刺激神經(jīng)纖維的再生或重新向外生長(zhǎng)。此外，結(jié)合結(jié)構(gòu)域或從其衍生的活性RGM肽本身可以作為治療有效劑而提供。發(fā)明簡(jiǎn)述通過(guò)分離和表征人RGM蛋白質(zhì)、特別是RGMA的結(jié)合結(jié)構(gòu)域及其活性多肽片段，令人驚訝地實(shí)現(xiàn)了上述目的。附圖簡(jiǎn)述圖1顯示人RGMA(GenBank#NP—064596.1)RGMB(GenBank#NP—001012779)和RGMC(GenBank#NP—998818.1)的序列比對(duì)。圖2以圖表形式顯示RGM分子的結(jié)構(gòu)。在N-末端信號(hào)肽和C-末端GPI錨之間顯示了RGD序列、vonWillebrand因子結(jié)構(gòu)域(vWFD)和錨區(qū)域之前的C末端區(qū)域內(nèi)的疏7jC序列。根據(jù)本發(fā)明的目的結(jié)合結(jié)構(gòu)域區(qū)推測(cè)位于vWFD和疏水區(qū)之間。表下顯示人RGMA中的相應(yīng)氨基酸位置，蛋白水解切割位點(diǎn)位于M酸168和169之間。圖3A通過(guò)焚光顯微照片顯示不同RGMA肽片段對(duì)大鼠神經(jīng)元細(xì)胞的神經(jīng)纖維生長(zhǎng)的影響。雖然肽l在10ng/ml的濃度時(shí)具有抑制活性，但是相同濃度的肽4是無(wú)活性的。顯示了相應(yīng)的與緩沖液或PBS的對(duì)照混合物，用于比較。圖3B顯示所測(cè)量的軸突生長(zhǎng)指數(shù)(軸突所覆蓋的面積相對(duì)于細(xì)胞聚集物大小的度量；顯示了平均值和標(biāo)準(zhǔn)差)的柱形圖，以說(shuō)明本發(fā)明的RGMA肽1的軸突生長(zhǎng)抑制活性的濃度依賴性。對(duì)于RGMA肽4的相應(yīng)的柱形圖示于圖3C。圖4A顯示人神經(jīng)元NTera細(xì)胞的熒光顯微照片，以說(shuō)明RGMA肽1和肽4(每一個(gè)的濃度為30照/ml)對(duì)這些細(xì)胞的神經(jīng)纖維生長(zhǎng)的影響。與所示的對(duì)照?qǐng)D像(與PBS而不是肽孵育)相比，說(shuō)明只有肽1對(duì)神經(jīng)纖維生長(zhǎng)具有抑制性作用。圖4B顯示對(duì)于用肽1、肽4和對(duì)照(PBS)進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)系列相應(yīng)測(cè)量到的軸突生長(zhǎng)指數(shù)(上圖各單獨(dú)的測(cè)量值和平均值，下圖帶有平均值和標(biāo)準(zhǔn)差的柱形圖)。圖5A顯示在NTera神經(jīng)纖維生長(zhǎng)分析試驗(yàn)中對(duì)RGMA片段的分析結(jié)果。RGMA片段2(218-284)和6(168-422)均以90nM的濃度加入到Ntera神經(jīng)元中。兩個(gè)片段均強(qiáng)烈地抑制Ntera神經(jīng)元的神經(jīng)纖維生長(zhǎng)。***=相對(duì)于PBS對(duì)照具有p<0.001的顯著性。圖5B顯示在Ntera神經(jīng)纖維生長(zhǎng)分析試驗(yàn)中對(duì)RGMA片段的分析結(jié)果的焚光顯微照片。吸取所示濃度的RGMA片段2(218-284)、3(266-335)、4(316-386)和6(168-422)加入到Ntera神經(jīng)元中。對(duì)軸突生長(zhǎng)具有活性的、有意義的抑制作用的片段是2，3和6，但是片段4無(wú)活性。圖5C顯示在Ntera神經(jīng)纖維生長(zhǎng)分析試驗(yàn)中對(duì)RGMA片段的其它分析結(jié)果。RGMA片段3(286-335)和6(168-422)以6pg/ml的濃度加入到Ntera神經(jīng)元中。該兩個(gè)片段強(qiáng)烈地抑制Ntera神經(jīng)元的神經(jīng)纖維生長(zhǎng)。**=相對(duì)于緩沖液對(duì)照具有p<0.01的顯著性，***=相對(duì)于緩沖液對(duì)照具有p<0.001的顯著性。圖6A顯示在Ntera神經(jīng)纖維生長(zhǎng)分析試驗(yàn)中對(duì)RGMA肽1及與其部分重疊的兩個(gè)肽(Down-l和Up-1)的分析結(jié)果。肽以10照/ml或30將/ml的濃度加入到Ntera聚集物中。24-36小時(shí)后，將培養(yǎng)物固定、染色并分析。全部3種RGMA肽在30照/ml的濃度時(shí)具有活性，并且非常顯著地抑制神經(jīng)纖維生長(zhǎng)。圖6B顯示在Ntera神經(jīng)纖維生長(zhǎng)分析試驗(yàn)中對(duì)三種另外的RGMA肽的分析結(jié)果。RGMA肽以10將/ml或30jug/ml的濃度加入到Ntera聚集物中。24-36小時(shí)后，將培養(yǎng)物固定、染色并分析。全部3種RGMA肽(5-Ak，6-Ak，7-Ak)在10fig/ml的濃度時(shí)無(wú)活性；只有肽7-Ak和6-Ak在較高的濃度時(shí)在抑制神經(jīng)纖維生長(zhǎng)方面顯出明顯傾向。圖7A顯示RGMA-再生蛋白結(jié)合分析試驗(yàn)的結(jié)果。在該分析試驗(yàn)中，抗肽Dowii-l的多克隆抗體是非常有效的，并且甚至在最低的濃度(Down18641和Down18640)也阻斷了RGMA配體與其受體再生蛋白的相互作用。對(duì)照抗體(兔對(duì)照)無(wú)作用，而從R&DSystems商業(yè)得到的多克隆抗體(PAB抗RGM抗體)同樣阻斷了RGMA-再生蛋白的相互作用，但是具有實(shí)質(zhì)性較差的效果。圖7B顯示在Ntera神經(jīng)纖維生長(zhǎng)分析試驗(yàn)中，Down-1特異性多克隆抗體如何中和有效的RGMA片段2的抑制性活性。在此向外生長(zhǎng)分析試驗(yàn)中，用PBS、或片段2(2將/ml)或同時(shí)用片段2(2ing/ml)及多克隆抗體Down-l(0.6jug/ml)處理Ntera培養(yǎng)物。發(fā)明詳述I一般術(shù)語(yǔ)的解釋"受體"在本發(fā)明上下文中特別是指與細(xì)胞膜結(jié)合的表面分子，該表面分子能夠與例如可溶性配體相互作用，并且作為該相互作用的結(jié)果可以誘導(dǎo)定向于例如細(xì)胞內(nèi)部的信號(hào)或者信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)(也稱作發(fā)信號(hào))。"配體，，指"受體"的天然(即體內(nèi)形成)或人工產(chǎn)生的低或高分子量的結(jié)合配偶體。配體優(yōu)選地能夠在細(xì)胞外環(huán)境中自由移動(dòng)。"免疫原"指適于誘導(dǎo)形成抗該免疫原的抗體的、糖基化或非糖基化形式的本發(fā)明肽片段。適當(dāng)時(shí)，免疫原(作為半抗原)與大分子載體的結(jié)合可能是有利的。"表位"或抗原決定簇指決定抗原例如蛋白質(zhì)的抗體特異性的區(qū)域。如果該表位是例如通過(guò)外部影響如蛋白質(zhì)與配體的相互作用而新近在蛋白質(zhì)區(qū)段中形成的或者在可接近的分子表面呈現(xiàn)的，則所用的術(shù)語(yǔ)是"新表位(neoepitope)，，。蛋白質(zhì)或抗體的"結(jié)構(gòu)域，，指通過(guò)a-螺旋和/或p-片層元件形成的并且在蛋白質(zhì)內(nèi)被劃分出來(lái)的復(fù)雜結(jié)構(gòu)。除非另外指出，術(shù)語(yǔ)"本發(fā)明的RGM蛋白質(zhì)"包括RGM分子家族成員，特別是RGMA、B和C的再生蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域及從其衍生的多肽。還尤其包括"具有抑制性活性"的功能性多肽。"抑制性，，多肽或"具有抑制性活性，，的多肽是在本文所述的神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)分析試驗(yàn)中降低或者完全抑制神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)的那些多肽。除非另外指出，"RGM"代表RGMA、B和C，特別是RGMA。"再生蛋白"或"再生蛋白受體，，是同義的術(shù)語(yǔ)。II.本發(fā)明的具體方面本發(fā)明的第一方面涉及優(yōu)選來(lái)源于哺乳動(dòng)物如人、大鼠或小鼠或家禽如雞的、糖1^化或者尤其是非糖基化形式的、排斥性引導(dǎo)分子(RGM)的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、特別是再生蛋白受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案涉及衍生自如SEQIDNO:2所示人RGMA、如SEQIDNO:4所示人RGMB或者如SEQIDNO:6所示人RGMC的再生蛋白受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。關(guān)于這一點(diǎn)，結(jié)合結(jié)構(gòu)域尤其包含RGM的M酸序列區(qū)域，特別是RGM如RGMA的相對(duì)于RGD切割位點(diǎn)的C端和相對(duì)于GPI錨區(qū)域的N端的區(qū)域，的至多150，例如至多125、至多100、至多80、至多30或至多20、例如10-20、例如ll、12、13、14、15、16、17、18或19個(gè)連續(xù)氨基酸殘基長(zhǎng)度的M酸序列。本發(fā)明特別涉及通過(guò)下列如SEQIDNO:7所示的部分序列所表征的那些再生蛋白受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域GXAVEX^AXsYIGTTXAXgRQ其中X,至Xs是任何氨基酸殘基。其中，特別地Xi是Gln、His或Asn;X2是His或Tyr;X3是Ile或Met;X4是Gln或His;X5是Lys、Arg或Ala;X6是Ile或Val;X7是Val、Phe或Ile;以及Xs是Val或Ile?？梢蕴岬降木唧w實(shí)例是GQHVEIQAKYIGTTIWRQ(SEQIDNO:8)GHYVEMHARYIGTTVFVRQ(SEQIDNO:9)GNHVEIQAAYIGTTIIIRQ(SEQIDNO:10)再生蛋白受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的實(shí)例包括衍生自如SEQIDNO:2所示氨基酸位置200-350的#^酸序列、衍生自如SEQIDNO:4所示M酸位置200-330的氨基酸序列或者衍生自如SEQIDNO:6所示氨基酸位置180-350的M^列，或者它們的功能性再生蛋白受體結(jié)合片段。此類結(jié)構(gòu)域或片段特別包括如SEQIDNO:2所示的^J^酸位置200-325、200-300、200-285、250-285或260-285或260-280或者片段215-340、260-340、250-300、260-291、210-260或290-350;或者可以自SEQIDNO:2與SEQIDNO:4和6的序列比對(duì)(參見(jiàn)附圖1)得到的、對(duì)應(yīng)于上面所詳述的SEQIDNO:2位置的、SEQIDNO:4和6的序列片段；和如SEQIDNO:4所示的^J^酸位置200-300、280-340、240-300、260-300或240-280，或如SEQIDNO:6所示的^J^酸位置200-350、200-320、220-310、250-290或260-280。適合本發(fā)明的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的其它具體實(shí)例是衍生自RGMA的KITEKVSGQHVEIQAKYIGTTIWRQVGRYLT(SEQIDNO:23);衍生自RGMB的RIVERESGHYVEMHARYIGTTVFVRQVGRYLT(SEQIDNO:24);衍生自RGMC的SIQTANPGNHVEIQAAYIGTTIIIRQTAGQLS(SEQIDNO:25);衍生自RGMA的KITEKVSGQHVEIQAK(SEQIDNO:26);衍生自RGMA的YIGTTIWRQVGRYLT(SEQIDNO:27);衍生自RGMA的WNAVEDWDSQGLYLC(SEQIDNO:28);衍生自RGMA的TIIFKNFQECVDQKVYQA(SEQIDNO:29);衍生自RGMB的RIVERESGHYVEMHAR(SEQIDNO:31);衍生自RGMB的YIGTTVFVRQVGRYLT(SEQIDNO:32);衍生自RGMC的SIQTANPGNHVEIQAA(SEQIDNO:33);和衍生自RGMC的YIGTTIIIRQTAGQLS(SEQIDNO:34)。再生蛋白受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域或其結(jié)合片段的其它實(shí)例包括衍生自上述肽之一的、或者衍生自如SEQIDNO:2所示位置260-291或267-285的序列區(qū)域、衍生自如SEQIDNO:4所示位置260-325的序列區(qū)域或者衍生自如SEQIDNO:6所示位置250-300的序列區(qū)域的、至少10、例如10-30、10-25、10-20或10-15、例如尤其是IO、11、12、13、14或15個(gè)連續(xù)氨基酸殘基。本發(fā)明的另一方面涉及如上所定義的再生蛋白受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗原多肽片段。本發(fā)明尤其涉及可以用于產(chǎn)生免疫球蛋白分子并且調(diào)節(jié)、尤其是部分地或完全地拮抗RGM與再生蛋白受體結(jié)合的那些抗原多肽片段?？梢蕴峒袄绨ㄈ鏢EQIDNO:7、8、9、10、23-29或31-34所示肽的至少10、例如10-30、10-25、10-20或10-15、例如尤其是10、11、12、13、14或15個(gè)連續(xù)M酸殘基的那些抗原多肽片段。本發(fā)明的再一方面涉及如上面所定義的再生蛋白受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域或者如上面所定義的多肽片段用于產(chǎn)生抗RGM的多克隆抗血清或者單克隆抗體的用途，其中抗血清或者抗體調(diào)節(jié)、優(yōu)選部分地或完全地拮抗特別是RGM與再生蛋白受體的結(jié)合。本發(fā)明還涉及用于診斷或治療的如上所定義的抗RGM的多克隆抗血清或單克隆抗體。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的多克隆抗血清或單克隆抗體的用途，所述用途為產(chǎn)生用于診斷或治療由再生蛋白受體與RGM或RGM片段相互作用介導(dǎo)的疾病或疾病狀態(tài)的藥物組合物。這些疾病或疾病狀態(tài)尤其選自a)頭骨、腦和脊髓的機(jī)械損傷，b)慢性病如神經(jīng)變性病、炎性疾病和自身免疫病，c)神經(jīng)元再生、軸突芽生、軸突延伸和神經(jīng)元可塑性的損害，d)腫瘤病和腫瘤轉(zhuǎn)移。本發(fā)明還涉及如上面所定義的再生蛋白受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域或者如上面所定義的多肽片段用于產(chǎn)生組合物的用途，所述組合物用于診斷或治療由受損的RGM或RGM片段與相關(guān)受體(例如再生蛋白受體)的相互作用介導(dǎo)的疾病或疾病狀態(tài)。這些疾病或疾病狀態(tài)特別選自a)由過(guò)度神經(jīng)元芽生和/或病理性突觸發(fā)生所導(dǎo)致的、精神病和慢性疼痛相關(guān)的、改變的軸突發(fā)生過(guò)程，b)與受損的鐵代謝、特別是年輕型血色素沉著癥(juvenilehemochromatosis)相關(guān)的病癥，c)與受損的骨生長(zhǎng)相關(guān)的病癥，d)與退行性軟骨改變相關(guān)的病癥，e)與推間盤和推骨損傷相關(guān)的病癥，f)與失調(diào)的、不受控制的細(xì)胞遷移過(guò)程相關(guān)的病癥。本發(fā)明的再一方面涉及如上面所定義的再生蛋白受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域或者如上面所定義的多肽片段作為靶標(biāo)在檢測(cè)或鑒定RGM結(jié)合性配體中的用途。本發(fā)明的另一方面涉及如上所定義的再生蛋白受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域或者如上所定義的多肽片段作為免疫原在主動(dòng)或凈皮動(dòng)免疫中的用途。本發(fā)明還涉及可以通過(guò)用抗原量的如上所定義的再生蛋白受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域或者如上所定義的多肽片段免疫哺乳動(dòng)物而得到的多克隆抗血清；和抗如上所定義的再生蛋白受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域或者抗如上所定義的多肽片段的單克隆抗體，或者其抗原結(jié)合片段，適當(dāng)時(shí)可以為人源化的形式。本發(fā)明還涉及藥物組合物，其包含在可藥用載體中的至少一種選自下列的活性成分a)如上所定義的再生蛋白受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域或者如上所定義的多肽片段，b)如上所定義的單克隆或多克隆抗體。該類型的藥物組合物特別可用于鞘內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、口服或腸胃夕卜、經(jīng)鼻和吸入施用。本發(fā)明還涉M達(dá)載體，其包含與至少一個(gè)調(diào)節(jié)核酸序列有效連接的(operativelylinked)至少一個(gè)編碼如上所定義的再生蛋白受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域或者如上所定義的多肽片段的編碼核酸序列。本發(fā)明還涉及-包含至少一個(gè)如上所定義的載體的重組微生物。-產(chǎn)生如上所定義的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系。-產(chǎn)生如上所定義的再生蛋白受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域或者如上所定義的多肽片段的方法，其中培養(yǎng)如上所定義的重組微生物，并且從培養(yǎng)物中分離所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。在本發(fā)明中，培養(yǎng)如上所定義的雜交瘤細(xì)胞系，并且從培養(yǎng)物中分離所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。III.用于實(shí)施本發(fā)明的其它信息1.多肽本發(fā)明特別涉及RGM家族的蛋白質(zhì)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及衍生自這些結(jié)構(gòu)域的肽片段。雖然本發(fā)明具體研究了RGMA及其結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及從其衍生的片段，但本發(fā)明還涉及同源蛋白質(zhì)，例如特別是RGM家族的同源成員，例如特別是RGMB和RGMC的相應(yīng)結(jié)構(gòu)域和片段。所具體/>開(kāi)的RGM結(jié)構(gòu)域或多肽的"功能等效物"或類似物在本發(fā)明中指這樣的多肽，所述多肽與本發(fā)明的多肽不同，例如與如SEQIDNO:2、4或6所示蛋白質(zhì)的再生蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的同源性程度小于100%但仍具有期望的生物學(xué)活性。特別地，它們應(yīng)該能夠結(jié)合再生蛋白受體和/或在本文所述的神經(jīng)纖維生長(zhǎng)分析試驗(yàn)中顯示出抑制作用，并且還統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性地&<=0.05)部分地或完全地抑制神經(jīng)纖維生長(zhǎng)。根據(jù)本發(fā)明，"功能等效物"尤其指這樣的突變體，其在上述具體序列的至少一個(gè)序列位置上具有與該具體提到的序列不同的氨基酸，然而卻具有本文所提到的生物學(xué)活性之一。因此，"功能等效物，，包括可以通過(guò)一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加、替換、缺失和/或倒位得到的突變體，其中可以在任何序列位置出現(xiàn)所迷改變，只要它們導(dǎo)致產(chǎn)生具有本發(fā)明性質(zhì)譜的突變體即可。尤其是，當(dāng)突變體和未改變的多肽在反應(yīng)方式上性質(zhì)一致，即例如觀在功能等效性。氨基酸殘基的適宜替換實(shí)例如下原始?xì)埢鎿Q實(shí)例AlaSerArgLysAsnGin;HisAspGluCysSerGinAsnGluAspGlyProHisAsn;GinlieLeu;ValLeulie;ValLysArg;Gin;MetLeu;liePheMet;Leu;SerThrThrSerTrpTyrTyrTrp;PheValHe;Leu在上述含義中，"功能等效物"還可以是所述多肽的前體、和多肽的功能衍生物和鹽。術(shù)語(yǔ)"鹽"意思是指本發(fā)明蛋白質(zhì)分子的氛基的鹽和氨基的酸加成鹽兩者。氛基鹽可以以本身已知的方式制備，并且包括無(wú)機(jī)鹽，例如鈉鹽、鈣鹽、銨鹽、鐵鹽和鋅鹽，以及與有機(jī)堿如胺如三乙醇胺、精氨酸、賴氨酸、哌咬等形成的鹽。酸加成鹽，如與無(wú)機(jī)酸如鹽酸或硫酸形成的鹽和與有機(jī)酸如乙酸和草酸形成的鹽，同樣也是本發(fā)明的一個(gè)方面。本發(fā)明多肽的"功能衍生物"還可以借助于已知技術(shù)在氨基酸側(cè)鏈官能基團(tuán)上或者在多肽的N-末端或者C-末端上制備。這些類型的衍生物包括例如羧酸基團(tuán)的脂族酯、羧酸基團(tuán)的酰胺(可以通過(guò)與氨或伯胺或仲胺反應(yīng)得到)；通過(guò)與?；鶊F(tuán)反應(yīng)制備的游離M基團(tuán)的N-?；苌?；或者通過(guò)與?；鶊F(tuán)反應(yīng)制備的游離羥基基團(tuán)的O-?；苌?。當(dāng)然，"功能等效物，，也包括可以從其它生物得到的多肽和天然存在的變體。例如，可以通過(guò)序列比較發(fā)現(xiàn)同源序列區(qū)域的范圍，并且可以基于本發(fā)明的具體需求建立等效的酶。此外，"功能等效物，，可以是融合蛋白，所述融合蛋白具有功能性N-或C-末端連接(即融合蛋白的各部分相互間的功能損害可忽略)的上述多肽序列或從其衍生的功能等效物之一以及與其功能不同的至少一個(gè)另外的異源序列。此類異源序列的非限定性實(shí)例為例如酶和免疫球蛋白。本發(fā)明包括的"功能等效物"還可以是具體公開(kāi)的蛋白質(zhì)和肽的同系物(homolog)。這些同系物與具體公開(kāi)的序列之一具有至少40%、或至少50%、或至少60%、例如至少75%、或特別是至少85%、例如卯％、95%或99%的同源性，其中同源性是通過(guò)例如Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad，Sci.(USA)85(8)，1988，2444-2448的算法計(jì)算的。本發(fā)明同源多肽的同源性百分?jǐn)?shù)尤其是指基于本文具體描述的M酸序列之一的全長(zhǎng)的氨基酸殘基的同一性百分?jǐn)?shù)。根據(jù)本發(fā)明，除非另外指出，否則"衍生的"氨基酸序列指與初始序列具有至少80%或至少90%、特別是91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%和99%同一性的序列。兩個(gè)序列之間的"同一性"是指在每一情況下跨越序列全長(zhǎng)的氨基酸殘基的同一性，例如通過(guò)借助于來(lái)自Informax(USA)的VectorNTISuite7.1軟件，使用Clustal方法(HigginsDG，SharpPM.Fastandsensitivemultiplesequencealignmentsonamicrocomputer.ComputAppl.Biosci.1989Apr;5(2):151-1)和下列參數(shù)設(shè)置，通過(guò)比較計(jì)算的同一性多序列比對(duì)參數(shù)空位開(kāi)放罰分10空位拓展罰分10空位分離罰分范圍8空位分離罰分(gapseparationpenalty)關(guān)比對(duì)延遲的同一性(identityforalignmentdelay)%40殘基特異性空位關(guān)親水殘基空位關(guān)轉(zhuǎn)變力口權(quán)(transitionweighing)0成對(duì)序列比對(duì)^it:FAST算法開(kāi)K-tuple大小1空位罰分3窗口大小5最佳對(duì)角線數(shù)5為了進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明包括的同系物，參考下表，在下表中顯示了RGMB和C與RGMA在全長(zhǎng)蛋白質(zhì)上以及在本發(fā)明特別感興趣的某些部分序列區(qū)域上的一致性百分?jǐn)?shù)。<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>1)氨基酸殘基，指示基于RGMA序列(SEQIDNO:2)的位置2)全長(zhǎng)蛋白質(zhì)和肽片段的M酸同一性百分?jǐn)?shù)3)方法BLAST2SEQUENCESVERSIONBLASTP2.2.5[Nov-16-2002]矩陣Blosum62(空位開(kāi)放11空位拓展1)在蛋白質(zhì)可能存在糖基化的情況下，本發(fā)明的等效物包括去糖基化或糖基化形式的和可以通過(guò)改變糖基化模式而得到的修飾形式的上迷類型的蛋白質(zhì)。本發(fā)明肽的同系物可以通過(guò)篩選突變體，如截短突變體的組合文庫(kù)來(lái)鑒定。例如，可以通過(guò)在核酸水平組合誘變，例如通過(guò)將合成的寡核苷酸的混合物進(jìn)行齊&連接，產(chǎn)生肽變體的多樣性文庫(kù)。存在可以從簡(jiǎn)并寡核苷^列產(chǎn)生潛在同系物文庫(kù)的大量方法。簡(jiǎn)并基因序列的化學(xué)合成可以在自動(dòng)DNA合成儀上開(kāi)展，然后合成的基因可以連接進(jìn)入適宜的表達(dá)栽體。一組簡(jiǎn)并基因的使用使得在一個(gè)混合物中提供編碼一組目的潛在蛋白質(zhì)序列的所有序列成為可能。合成簡(jiǎn)并寡核苷酸的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的(例如Narang，S.A.(1983)Tetrahedron39:3;Itakura等，(1984)Annu.Rev.Biochem.53:323;Itakura等，(1984)Science198:1056;Ike等，(1983)NucleicAcidsRes.11:477)。2.核酸本發(fā)明還涉及上述RGM結(jié)合結(jié)構(gòu)域和多肽的編碼核酸序列，尤其是如SEQIDNO:1、3和5所示的序列，以及從其衍生的核酸序列或部分序列。本發(fā)明的所有核酸序列(單鏈和雙鏈DNA和RNA序列，例如cDNA和mRNA)可以以本身已知的方式通過(guò)化學(xué)合成從核苷酸單元制備，例如通過(guò)各個(gè)重疊的、互補(bǔ)的雙螺旋核酸單位的片段縮合來(lái)制備。寡核苷酸的化學(xué)合成可以例如以已知的方式通過(guò)亞磷酰胺方法進(jìn)行(Voet，Voet，第2版，WileyPressNewYork,第896~897頁(yè))。合成的寡核普酸的加入以及使用DNA聚合酶Klenow片段進(jìn)行的缺口補(bǔ)平和連接反應(yīng)，以及一般克隆方法描述于Sambrook等，(1989)，MolecularCloning:Alaboratorymanual.ColdSpringHarborLaboratoryPress,根據(jù)本發(fā)明，除非另外指出，否則"衍生的"核酸序列意思是指與初始序列具有至少80%或至少90%、特別是91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%和99%同一性的序列。兩個(gè)核酸之間的"同一性"在每一情況下均指跨越全長(zhǎng)核酸的核苷酸同一性，特別是借助于來(lái)自Informax(USA)的VectorNTISuite7.1軟件使用Clustal方法(見(jiàn)上)通過(guò)比較得到的同一性。本發(fā)明還涉及編碼上迷肽之一的核酸序列以及可以通過(guò)例如使用人工核苷酸類似物得到的其功能等效物。本發(fā)明涉及編碼本發(fā)明肽或其生物活性片段的分離的核酸分子，以及可以例如用作雜交探針或者引物用于鑒定或者擴(kuò)增本發(fā)明的編碼核酸的核酸片段。本發(fā)明的核酸分子還可以在基因編碼區(qū)的3，和/或5'末端包含非翻譯序列。"分離的"核酸分子是與存在于該核酸的天然來(lái)源中的其它核酸分子相分離的核酸分子，并且其還可以基本上不含其它細(xì)胞材料或培養(yǎng)基(如果通過(guò)重組技術(shù)制備的話)或不含化學(xué)前體或其它化學(xué)品(如果是化學(xué)合成的話)。本發(fā)明的核酸分子可以通過(guò)分子生物學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)和本發(fā)明提供的序列信息來(lái)分離。例如cDNA可以通過(guò)使用具體公開(kāi)的完全序列之一或者其片段作為雜交探針并使用標(biāo)準(zhǔn)雜交技術(shù)(如描述于Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.和Maniatis，T.MolecularCloning:ALaboratoryManual.第2版，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY，1989)從適宜的cDNA文庫(kù)中分離。此外，可以通過(guò)聚合^式反應(yīng)使用基于本發(fā)明序列之一構(gòu)建的寡核苷酸引物分離包含該序列或其片段的核酸分子。以該方式擴(kuò)增的核酸可以克隆入適宜的載體中并且通過(guò)DNA序列分析表征。本發(fā)明的寡核苷酸還可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)合成方法，例如使用自動(dòng)DNA合成儀制備。本發(fā)明還包括與具體確描述的核苷酸序列互補(bǔ)的核酸分子或其片段。從本發(fā)明的核苷酸序列可以產(chǎn)生用于鑒定和/或克隆其它細(xì)胞類型和生物中的同源序列的探針和引物。此類探針和引物通常包含在嚴(yán)格雜交條件下與本發(fā)明核酸序列的有義鏈或相應(yīng)的反義鏈的至少約12、優(yōu)選至少約25、例如約40、50或75個(gè)連續(xù)核苷酸雜交的核苦酸序列區(qū)。本發(fā)明的其它核酸序列可以衍生自本發(fā)明的RGM結(jié)構(gòu)域和肽的編碼序列，并且與其不同之處在于一個(gè)或多個(gè)核苷酸的添加、替換、插入或缺失，但仍編碼具有期望特性鐠的肽。本發(fā)明還包括這樣的核酸序列，其包含所謂的沉默突變，或者與具體提到的序列以及天然存在的變體如其剪接變體或等位基因變體相比，按照具體來(lái)源生物或者宿主生物的密碼子選擇進(jìn)行了修飾。可以通過(guò)保守核普酸替換(即相關(guān)氨基酸被具有同樣電荷、大小、極性和/或可溶性的氨基酸替換)得到的序列同樣也是一個(gè)方面。本發(fā)明還涉及通過(guò)序列多態(tài)性衍生自具體公開(kāi)的核酸的分子。這些遺傳多態(tài)性可以因群體中個(gè)體之間的天然變異而存在。這些天然變異通常導(dǎo)致基因的核苷,列中產(chǎn)生1-5%的差異。本發(fā)明還包括與上述編碼序列雜交或者與其互補(bǔ)的核酸序列。這些多核苷酸可以通過(guò)篩選基因組文庫(kù)或者cDNA文庫(kù)找到，并且適宜的話可以通過(guò)使用適宜引物及PCR從其擴(kuò)增，并且隨后使用例如適宜的探針?lè)蛛x。另一種可能性是用本發(fā)明的多核苷酸或載體轉(zhuǎn)化適宜微生物，以繁殖微生物并由此擴(kuò)增多核苷酸，然后分離多核苷酸。再一種可能性是還可以通過(guò)化學(xué)途徑合成本發(fā)明的多核苷酸。能夠"雜交"至多核苷酸上的特性是指多核苷酸或寡核苷酸在嚴(yán)格IHt下結(jié)合至幾乎互補(bǔ)序列的能力，而在這些條件下不存在非互補(bǔ)配偶體之間的非特異性結(jié)合。為此目的，序列應(yīng)該具有70-100%、特別是90-100%、例如95%、96%、97%、98%或99%的互補(bǔ)性。互補(bǔ)序列能夠彼此特異性結(jié)合的特性能夠用于例如Northern印跡或Southern印跡4支術(shù)或者PCR或RT-PCR的引物結(jié)合當(dāng)中。為此目的，通常采用長(zhǎng)度為30個(gè)g對(duì)或者更長(zhǎng)的寡核苷酸。嚴(yán)格條件，例如在Northern印跡技術(shù)中，是指使用洗滌溶液如含0.1。/。SDS的0.1xSSC緩沖液(20xSSC:3MNaCl，0,3M檸檬酸鈉，pH7.0)于50-70。C、優(yōu)選60-65°C洗脫非特異性雜交的cDNA探針或寡核普酸。在該情況下，如上面所提到，只有高度互補(bǔ)的核酸仍然彼此結(jié)合。嚴(yán)格條件的建立是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且描述于例如Ausubel等，CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6。本發(fā)明的再一方面涉及反義核酸。這包含與編碼有義核酸互補(bǔ)的核苷酸序列。反義核酸可以與全部編碼鏈互補(bǔ)或者僅與其部分互補(bǔ)。在另一實(shí)施方案中，反義核酸分子與核苷酸序列編碼鏈的非編碼區(qū)是反義的。術(shù)語(yǔ)"非編碼區(qū)"涉及稱作5，-和3，-非翻譯區(qū)的序列部分。反義寡核苷酸的長(zhǎng)度可以是例如大約5、10、15、20、25、30、35、40、45或50個(gè)核苷酸。本發(fā)明的反義核酸可以使用本領(lǐng)域已知的方法通過(guò)化學(xué)合成和^連接反應(yīng)構(gòu)建。反義核酸可以使用天然存在的核苷酸或者不同地修飾的核香酸化學(xué)合成，其中所述修飾的核苷酸的構(gòu)型使得其可以提高分子的生物學(xué)穩(wěn)定性或者提高反義和有義核酸之間所形成的雙鏈體的物理穩(wěn)定性?？梢允褂玫膶?shí)例是硫代磷酸酯衍生物和吖咬取代的核苷酸?？梢杂糜诋a(chǎn)生反義核酸的修飾核苷酸的實(shí)例尤其是5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-珙尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙?；奏?、5-(羧基羥甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫脲苷、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、p-D-半乳糖基辮苷、肌苷、N6-異戊烯基腺嘌呤、1-甲基鳥(niǎo)嘌呤、l-甲基肌苷、2,2-二曱基鳥(niǎo)嘌呤、2-甲基腺噤呤、2-甲基鳥(niǎo)嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鳥(niǎo)嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫脲嘧啶、p-D-甘露糖基辮苷、5，-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-異戊烯基腺嘌呤、尿嗜咬-5-氧基乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧咬、辮苷、2-巰基胞嘧啶、5-曱基-2-疏脲嘧啶、2-硫脲嘧啶、4-硫脲嘧啶、5-甲基尿嘧啶、甲基尿嘧咬-5-氧基乙酸酯、尿嘧啶-5-氧基乙酸~)、5-甲基-2-硫脲嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧咬，(acp3)w和2，6-二氨基噤呤。反義核酸還可以通過(guò)使用表達(dá)栽體以生物學(xué)方法產(chǎn)生，在該表達(dá)載體中核酸已經(jīng)以反義方向進(jìn)行亞克隆。3.表達(dá)構(gòu)建體和載體本發(fā)明還涉M達(dá)構(gòu)建體，所i^達(dá)構(gòu)建體包含處于調(diào)節(jié)性核酸序列遺傳控制下的編碼本發(fā)明RGM蛋白質(zhì)或功能等效物或者免疫球蛋白的核酸序列，并且還涉及包含至少一個(gè)這樣的表達(dá)構(gòu)建體的載體。本發(fā)明的此類構(gòu)建體優(yōu)選包含位于具體編碼序列5，-上游的啟動(dòng)子和位于3，-下游的終止序列，以及適當(dāng)?shù)脑捚渌Ｒ?jiàn)調(diào)節(jié)元件(特別地，它們的每一個(gè)都與編碼序列有效連接)。"有效連接，，意思是指以這樣一種方式連續(xù)排列啟動(dòng)子、編碼序列、終止子以及適當(dāng)?shù)脑捚渌{(diào)節(jié)元件，以致于每一調(diào)節(jié)元件對(duì)于編碼序列的表達(dá)都能夠?qū)崿F(xiàn)其預(yù)期功能?？梢杂行нB接的序列的實(shí)例是靶向序列和增強(qiáng)子、多腺苷酸化信號(hào)等。其它調(diào)節(jié)元件包括選擇標(biāo)記、擴(kuò)增信號(hào)、復(fù)制起點(diǎn)等。適宜的調(diào)節(jié)序列描述于例如Goeddel,GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185，AcademicP訓(xùn)，SanDiego，CA(1990)。除了人工的調(diào)節(jié)序列外，還可以在實(shí)際結(jié)構(gòu)基因前面仍保留天然調(diào)節(jié)序列。這種天然調(diào)節(jié)可以根據(jù)需要通過(guò)遺傳修飾來(lái)關(guān)閉，并且基因的表達(dá)可以裙:提高或者降低。然而，基因構(gòu)建體也可以具有更簡(jiǎn)單的結(jié)構(gòu)，也就是iJL在結(jié)構(gòu)基因前面沒(méi)有插入額外的調(diào)節(jié)信號(hào)，并且天然啟動(dòng)子及其調(diào)節(jié)作用沒(méi)有缺失。作為替代，可以將天然調(diào)節(jié)序列突變以致于不再發(fā)生調(diào)節(jié)作用，并且基因表達(dá)被增強(qiáng)或者降低。核^列可以以一個(gè)或多個(gè)拷貝存在于基因構(gòu)建體中?？梢浴嚼粲玫膯?dòng)子的實(shí)例是cos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、laelq、T7、T5、T3、gal、trc、ara、SP6、入-PR或入-PL啟動(dòng)子，它們有利地用于革蘭氏陰性細(xì)菌；以及革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌啟動(dòng)子amy和SP02,酵母啟動(dòng)子ADC1、MFot、AC、P-60、CYC1、GAPDH或植物啟動(dòng)子CaMV/35S、SSU、OCS、lib4、usp、STLS1、B33、not或泛素或菜豆蛋白啟動(dòng)子。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的使用是特別優(yōu)選的，例如光誘導(dǎo)啟動(dòng)子以及特別是溫度誘導(dǎo)啟動(dòng)子如Pr&啟動(dòng)子。原則上，可以使用所有天然啟動(dòng)子及它們的調(diào)節(jié)序列。此外，還可以有利地使用合成性啟動(dòng)子。所述的調(diào)節(jié)序列旨在使核酸序列特異性表達(dá)以及蛋白質(zhì)表達(dá)成為可能。這可以意味著，例如取決于宿主生物，基因僅在誘導(dǎo)后表達(dá)或過(guò)表達(dá)或者基因立刻表達(dá)和/或過(guò)表達(dá)。此外，調(diào)節(jié)序列或因子可以優(yōu)選正向影響，并因此增加或降低表達(dá)。因此，調(diào)節(jié)元件的增強(qiáng)作用可以通過(guò)使用強(qiáng)轉(zhuǎn)錄信號(hào)如啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子在轉(zhuǎn)錄水平有利地發(fā)生。然而，還可以通過(guò)例如提高mRNA的穩(wěn)定性增強(qiáng)翻譯。通過(guò)將適宜的啟動(dòng)子與適宜的編碼序列和終止信號(hào)或多腺苷酸化信號(hào)融合產(chǎn)生表達(dá)盒。為此目的可以使用重組和克隆的常規(guī)技術(shù)，例如描述于T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，MolecularCloning:ALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor,NY(1989)以及T.J.Silhavy，M丄.Berman和L.W.Enquist，ExperimentswithGeneFusions,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY(1984)以及Ausubel，F(xiàn).M.等，CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingAssoc.andWileyInterscience(1987)中的常規(guī)技術(shù)。對(duì)于在適宜宿主生物中的表達(dá)，重組核酸構(gòu)建體或者基因構(gòu)建體可以有利地插入到宿主特異的載體中，這使得基因可以在宿主中最佳地表達(dá)。載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，并且可以在例如"CloningVectors，，(PouwelsP，H.等編，Elsevier,Amsterdam-NewYork-Oxford,1985)中找到。載體不僅僅指質(zhì)粒，還指技術(shù)人員已知的所有其它載體，例如噬菌體、病毒，如SV40、CMV、桿狀病毒和腺病毒、轉(zhuǎn)座子、IS元件、噬菌粒、粘粒以及線性或環(huán)狀DNA。這些載體可在宿主生物中自主復(fù)制或隨染色體復(fù)制而復(fù)制。可以提到的適宜表達(dá)載體的實(shí)例是常規(guī)融合表達(dá)栽體，如pGEX(PharmaciaBiotechInc;Smith,D.B.和Johnson,K.S.(1988)Gene67:31-40)，pMAL(NewEnglandBiolabs，Beverly,MA)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ),其可以分別用于將谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、麥芽糖E-結(jié)合蛋白和蛋白A與重組靶蛋白融合。非融合蛋白質(zhì)表達(dá)載體，如pTrc(Amann等，(1988)Gene69:301-315)和pETlld(Studier等，GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185，AcademicPress,SanDiego，California(1990)60-89)。用于在釀酒酵母(S.cerevisiae)中表達(dá)的酵母表達(dá)載體，如pY印Secl(Baldari等，(1987)EmboJ.6:229-234)、pMFa(Kurjan和Herskowitz(1982)Cell30:933-943)、pJRY88(Schultz等，(1987)Gene54:113-123)和pYES2(InvitrogenCorporation,SanDiego,CA)。適用于其它真菌如絲狀真菌的載體和用于構(gòu)建載體的方法包括詳細(xì)描述于vandenHondel，C.A.M.J.J.&Punt，P.J.(1991)"Genetransfersystemsandvectordevelopmentforfilamentousfungi,in:AppliedMolecularGeneticsofFungi,J.F.Peberdy等編，第1-28頁(yè),CambridgeUniversityPress:Cambridge中的那些?？傻玫降挠糜谠谂囵B(yǎng)的昆蟲細(xì)胞(例如Sf9細(xì)胞)中表達(dá)蛋白質(zhì)的桿狀病毒載體包括pAc系列(Smith等，(1983)Mol.CellBiol.3:2156-2165)和pVL系列(LucklowandSummers(1989)Virology170:31-39)。植物表達(dá)載體如詳細(xì)描述于Becker,D.，Kemper,E.，Schell，J.和Masterson，R.(1992)"Newplantbinaryvectorswithselectablemarkerslocatedproximaltotheleftborder",PlantMol.Biol.20:1195-1197;以及Bevan，M.W.(1984)"BinaryAgrobacteriumvectorsforplanttransformation",Nucl.AcidsRes.12:8711-8721中的那些。哺乳動(dòng)物表達(dá)栽體如pCDM8(Seed，B.(1987)Nature329:840)和pMT2PC(Kaufman等，(1987)EMBOJ.6:187-195)。用于原核細(xì)胞和真核細(xì)胞的其它適宜表達(dá)系統(tǒng)描述于Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecularcloning:ALaboratoryManual,第2版，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY，1989中的第16和17章。4.重組宿主生物:本發(fā)明的載體可以用于產(chǎn)生重組生物，所述的重組生物用例如至少一種本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化并且可以用來(lái)產(chǎn)生本發(fā)明的結(jié)構(gòu)域或多肽?？梢詫⑸鲜龅谋景l(fā)明重組構(gòu)建體有利地導(dǎo)入適宜的宿主系統(tǒng)并在其中表達(dá)。技術(shù)人員熟悉的克隆和轉(zhuǎn)染方法，例如共沉淀、原生質(zhì)體融合、電穿孔、逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染等優(yōu)選用于使所述核酸在特定表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。適宜的系統(tǒng)描述于例如CurrentProtocolsinMolecularBiology,F.Ausubel等編，WileyInterscience,NewYork1997，或Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY，1989。適宜的宿主生物原則上是能夠表達(dá)本發(fā)明核酸、它們的等位基因變體、它們的功能等效物或者衍生物的所有生物。宿主生物指例如細(xì)菌、真菌、酵母、植物或動(dòng)物細(xì)胞。優(yōu)選的生物是細(xì)菌，如埃希氏菌屬(Escherichia)如大腸桿菌(Escherichiacoli)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、芽孢桿菌屬(Bacillus)或假單胞菌屬(Pseudomonas)的那些細(xì)菌，真核微生物如釀酒酵母、曲霉菌屬(AspergiHus)、來(lái)源于動(dòng)物或植物的高等真核細(xì)胞，如Sf9、CHO或HEK293細(xì)胞。成功轉(zhuǎn)化的生物可以通過(guò)同樣存在于載體或表達(dá)盒中的標(biāo)記基因來(lái)選擇。此類標(biāo)記基因的實(shí)例是賦予抗生素抗性的基因和賦予酶活性的基因，該酶催化形成顏色的反應(yīng)，從而導(dǎo)致所轉(zhuǎn)化的細(xì)胞被染色。然后，這些細(xì)胞可以通過(guò)自動(dòng)化細(xì)胞分選被選擇出來(lái)。已經(jīng)成功地用載體轉(zhuǎn)化并且含有適當(dāng)抗生素(例如G418或者潮霉素)抗性基因的^t生物可以通過(guò)適當(dāng)?shù)陌股氐呐囵B(yǎng)基或營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基來(lái)選擇。存在于細(xì)胞表面的標(biāo)記蛋白質(zhì)可以通過(guò)親和層析的方法用于選擇。如果希望的話，基因產(chǎn)物還可以在轉(zhuǎn)基因生物中表達(dá)，如轉(zhuǎn)基因動(dòng)物如特別是小鼠、綿羊或轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明還涉及用于重組產(chǎn)生本發(fā)明RGM結(jié)構(gòu)域或多肽或其功能性生物活性片段的方法，其中培養(yǎng)產(chǎn)生肽的重組宿主生物，根據(jù)需要誘導(dǎo)多肽的表達(dá)并且從培養(yǎng)物中分離多肽。如果希望的話，肽也可以以該方式以工業(yè)規(guī)^莫生產(chǎn)。重組宿主可以通過(guò)已知方法培養(yǎng)和發(fā)酵。細(xì)菌可以生長(zhǎng)于例如TB或LB培養(yǎng)基中和20-40°C的溫度以及6-9的pH下。適宜培養(yǎng)條件的細(xì)節(jié)描述于例如T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY(1989)。如果多肽不分泌i^培養(yǎng)基中，則將細(xì)胞破碎并且通過(guò)已知的蛋白質(zhì)分離方法從裂解物中得到產(chǎn)物。備選地，細(xì)胞可以通過(guò)下列方法破碎通過(guò)高頻超聲、通過(guò)高壓如在弗氏細(xì)胞壓碎器中、通過(guò)滲透裂解、通過(guò)去污劑作用、通過(guò)溶菌酶或有機(jī)溶劑、通過(guò)勻漿器或者通過(guò)多種所提到的方法的組合。肽可以通過(guò)已知層析方法如分子篩層析(凝膠過(guò)濾)，如Q-Sepharose層析、離子交換層析和疏水層析以及通過(guò)其它常用方法如超濾、結(jié)晶、鹽析、透析和非變性凝膠電泳純化。適宜的方法描述于例如Cooper,T.G.，BiochemischeArbeitsmethoden,VerlagWalterdeGruyter，Berlin,NewYork或Scopes,R.，ProteinPurification,SpringerVerlag，NewYork,Heidelberg,Berlin中。對(duì)于重組肽的分離而言，有利的是使用載體系統(tǒng)或者寡核苷酸通過(guò)特定核苷酸序列延長(zhǎng)cDNA并且由此編碼可以用于例如使純化更簡(jiǎn)單的修飾多肽或融合蛋白。適宜的該類型修飾是例如充當(dāng)錨的所謂的標(biāo)簽，例如稱作六組氨酸錨的修飾，或者可以被抗體作為抗原識(shí)別的表位(描述于例如Harlow,E.和Lane,D.，1988，Antibodies:ALaboratoryManual.ColdSpringHarbor(N.Y.)Press)。這些錨可用于使肽附著于固相支持物，例如聚合物基質(zhì)(其可以例如填裝在層析柱中或者可以用在微量滴定板或者另一支持物上)。這些錨還可以同時(shí)用于肽的識(shí)別。對(duì)于肽的識(shí)別，也可以使用常規(guī)標(biāo)記例如焚光染料、與底物反應(yīng)后形成可檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物的酶標(biāo)記、或者放射性標(biāo)記，所述標(biāo)記可以單獨(dú)或者與錨聯(lián)合用于肽的衍生化。5.免疫球蛋白5.1定義本發(fā)明涉及特異性結(jié)合本發(fā)明RGM蛋白質(zhì)或其衍生物/等效物的單克隆或多克隆抗體，即對(duì)本發(fā)明RGM蛋白質(zhì)或其衍生物/等效物具有特異性的抗體。本發(fā)明還涉及這些抗體的部分，特別是其抗原結(jié)合部分，即可以結(jié)合本發(fā)明RGM蛋白質(zhì)或其衍生物/等效物的抗體片段。優(yōu)選選擇對(duì)于特異性結(jié)合本發(fā)明的RGM蛋白質(zhì)或其衍生物/等效物而言具有特定的結(jié)合動(dòng)力學(xué)(例如高親和性、幾乎不解離、低解離速率(koff)、強(qiáng)中和活性)的本發(fā)明抗體。因此，可以提供對(duì)于本發(fā)明RGM蛋白質(zhì)或其衍生物/等效物的親和力為KD=l(r6-l(r12M的抗體。根據(jù)另一個(gè)方面，可以如此選擇本發(fā)明的抗體，以致于它們以0.1s"或更小的koff速率常數(shù)結(jié)合RGM蛋白質(zhì)或其衍生物/等效物?？贵w優(yōu)選是分離的抗體。根據(jù)另一個(gè)方面，抗體是中和抗體。本發(fā)明的抗體尤其包括單克隆抗體和重組抗體。本發(fā)明的抗體可以包含完全從單一物種得到的M酸序列，并且因此可以是人抗體或小鼠抗體。根據(jù)其它的實(shí)施方案，抗體可以是嵌合抗體或者CDR嫁接抗體或者另一個(gè)類型的人源化抗體。術(shù)語(yǔ)"抗體"旨在指由4個(gè)多肽鏈，即兩個(gè)重鏈(H)和兩個(gè)輕鏈(L)形成的免疫球蛋白分子。這些鏈通常通過(guò)二硫鍵連接在一起。每一個(gè)重鏈由重鏈可變區(qū)(在本文縮寫為HCVR或VH)和重鏈恒定區(qū)組成。重鏈恒定區(qū)由CH1、CH2和CH3三個(gè)結(jié)構(gòu)域組成。每一個(gè)輕鏈由輕鏈可變區(qū)(在本文縮寫為L(zhǎng)CVR或VL)和輕鏈恒定區(qū)組成。輕鏈恒定區(qū)由CL結(jié)構(gòu)域組成。VH和VL區(qū)可以進(jìn)一步劃分出稱作互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的高變區(qū)，高變區(qū)之間散置稱作構(gòu)架區(qū)(FR)的更為保守的區(qū)域。每一個(gè)VH和VL區(qū)由三個(gè)CDR和四個(gè)FR形成，它們從N端至C端以下列順序排列FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。術(shù)語(yǔ)抗體的"抗原結(jié)合部分"(或簡(jiǎn)稱做"抗體部分")指對(duì)本發(fā)明的RGM蛋白質(zhì)或其衍生物/等效物具有特異性的抗體的一個(gè)或多個(gè)片段，其中所述片段仍然具有特異性結(jié)合RGM蛋白質(zhì)或其衍生物/等效物的能力。已經(jīng)證實(shí)，抗體的抗原結(jié)合功能可以由完整抗體的片段實(shí)現(xiàn)。在術(shù)語(yǔ)抗體的"抗原結(jié)合部分"的含義之中的結(jié)合片段的實(shí)例包括(i)Fab片段，即由VL、VH、CL和CH1結(jié)構(gòu)域組成的單價(jià)片段；(ii)F(ab，)2片段，即由在鉸鏈區(qū)通過(guò)二硫鍵連接在一起的兩個(gè)Fab片段組成的雙價(jià)片段；(iii)Fd片段，其由VH和CH1結(jié)構(gòu)域組成；(iv)Fv片段，其由抗體單臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成；(v)dAb片段(Ward等，(1989)Nature341:544-546)，其由VH結(jié)構(gòu)域、或VH、CH1、CH2、DH3、或VH、CH2、CH3組成；和(vi)分離的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。雖然Fv片段的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，即VL和VH由分開(kāi)的不同基因編碼，但是它們可以通過(guò)重組方法由一個(gè)合成的接頭連接在一起，由此它們可以作為一個(gè)單一蛋白質(zhì)鏈產(chǎn)生，其中VL和VH區(qū)一起存在以便形成單價(jià)分子(稱作單鏈Fv(ScFv)，見(jiàn)例如Bird等，(1988)Science^:423畫426;和Huston等，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA^:5879-5883)。此類單鏈抗體也旨在包括在術(shù)語(yǔ)抗體的"抗原結(jié)合部分"之內(nèi)。其它類型的單鏈抗體如雙抗體(diabody)同樣也屬于該術(shù)語(yǔ)范圍之內(nèi)。雙抗體是雙價(jià)、雙特異性抗體，其中VH和VL結(jié)構(gòu)域表達(dá)在單一多肽鏈上，但是該抗體使用的接頭對(duì)于共存于同一條鏈上的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域而言太短以致于迫使這些結(jié)構(gòu)域與另一條鏈上的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對(duì)并形成兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)(見(jiàn)例如Holliger，P.等,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA2^:6444-6448;Poljak，R.J.等，(1994)Structure1:1121-1123)。對(duì)于抗體或者其抗原結(jié)合部分的另一種可能性是作為較大的免疫粘附分子的一部分，所迷分子通過(guò)抗體或抗體部分與一個(gè)或多個(gè)另外的蛋白質(zhì)或肽的共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合形成。此類免疫粘附分子可以涉及使用鏈霉親和素核心區(qū)，以便產(chǎn)生四聚體scFv分子(Kipriyanov，S.M.等，(1995)HumanAntibodiesandHybridomas6:93-101)，以及涉及使用半胱氨酸殘基、標(biāo)記肽和C-末端多組氨酸標(biāo)簽，以便產(chǎn)生二價(jià)和生物素化的scFv分子(Kipriyanov，S.M.等，(1994)Mol.Immunol.^1:1047-1058)?？贵w部分，如Fab和F(ab，)2片段可以通過(guò)常規(guī)技術(shù)，如用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化從完整抗體中產(chǎn)生。還可以通過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)得到抗體、抗體部分和免疫粘附分子。"對(duì)本發(fā)明的RGM蛋白質(zhì)或其衍生物/等效物具有特異性的分離的抗體"描述這樣的抗體，其對(duì)本發(fā)明的RGM蛋白質(zhì)或其衍生物/等效物具有特異性并且基本上不含具有不同抗原特異性的其它抗體。術(shù)語(yǔ)"中和抗體"描述這樣的抗體，其與特定抗原的結(jié)合導(dǎo)致該抗原生物學(xué)活性的抑制?？乖飳W(xué)活性的這種抑制可以通過(guò)使用適宜的體外或體內(nèi)分析法測(cè)量抗原生物學(xué)活性的一個(gè)或多個(gè)指標(biāo)來(lái)評(píng)定。術(shù)語(yǔ)"單克隆抗體"描述源自雜交瘤的抗體(例如，由通過(guò)雜交瘤技術(shù)如K6hler和Milstein的標(biāo)準(zhǔn)雜交瘤方法所產(chǎn)生的雜交瘤分泌的抗體)。來(lái)源于雜交瘤并對(duì)本發(fā)明RGM蛋白質(zhì)或其衍生物/等效物具有特異性的抗體因此被稱作單克隆抗體。術(shù)語(yǔ)"重組抗體"描述通過(guò)重組方法生產(chǎn)、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的抗體，如通過(guò)使用轉(zhuǎn)染進(jìn)入宿主細(xì)胞的重組表達(dá)威體而表達(dá)的抗體；從重組組合抗體文庫(kù)分離的抗體；從具有人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如小鼠)分離的抗體(見(jiàn)例如Taylor,L.D.等，(1992)Nucl.AcidsRes.20:6287-6295);或者通過(guò)涉及特定免疫球蛋白基因序列(例如人免疫球蛋白基因序列)與其它DNA序列相組合的任何其它方式生產(chǎn)、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的抗體。重組抗體包括例如嵌合抗體、CDR嫁接抗體和人源化抗體。術(shù)語(yǔ)"人抗體"描述這樣的抗體，其可變區(qū)和恒定區(qū)對(duì)應(yīng)于人種系的免疫球蛋白序列，如Kabat等，(見(jiàn)Kabat等，(1991)SequencesofProteinofImmunologicalInterest,第5版，U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIHPublicationNo.91-3242)所描述的序列，或者是從該序列衍生的。然而，本發(fā)明的人抗體可以包含不是由人種系免疫球蛋白序列所編碼的氨基酸殘基(例如通過(guò)體外隨機(jī)或位點(diǎn)特異誘變或者通過(guò)體內(nèi)的體細(xì)胞突變引入的突變)，例如在CDR中并且尤其在CDR3中。本發(fā)明的重組(見(jiàn)Kabat，E.A.等，(1991)SequencesofProteinofImmunologicalInterest,第5版，U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIHPublicationNo.91-3242)。然而根據(jù)特定的實(shí)施方案，可以對(duì)此類重組人抗體進(jìn)行體外誘變(或者，如果使用含有人Ig序列的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的話，進(jìn)行體內(nèi)體細(xì)胞誘變)，以致于重組抗體VH和VL區(qū)的氨基酸序列是這樣的序列，即雖然它們與人種系的VH和VL序列相關(guān)或者從其衍生而來(lái)，但是它們不天然存在于體內(nèi)的人抗體種系語(yǔ)中。根據(jù)特定的實(shí)施方案，此類重組抗體是選##變或者回復(fù)突變或者兩者的結(jié)果。術(shù)語(yǔ)"回復(fù)突變"指這樣的方法，其中人抗體中的一些或全部體細(xì)胞突變的M酸被同源種系抗體序列的相應(yīng)種系殘基代替。本發(fā)明人抗體的重鏈和輕鏈序列分別與VBASE數(shù)據(jù)庫(kù)中的種系序列比較，以便鑒定出具有最大同源性的序列。本發(fā)明人抗體中的偏離通過(guò)在編碼此異常氨基酸的確定核苷酸位置進(jìn)行的突變而恢復(fù)至種系序列。研究以該方式鑒定為回復(fù)突變的候選者的每一氨基酸對(duì)于抗原結(jié)合的直接或間接的重要性，并且在最終的人抗體中不包含突變后損害人抗體的期望特性的氨基酸。為了使回復(fù)突變的^J^酸數(shù)量最小化，可以不改變?nèi)缦耹t^酸位置，所述位置雖然偏離了最接近的種系序列，但是與第二種系序列的相應(yīng)M^列是相同的，條件是第二種系序列與本發(fā)明的人抗體序列在所述氨基酸兩側(cè)有至少10個(gè)并且優(yōu)選12個(gè)M酸相同并線性對(duì)應(yīng)?；貜?fù)突變可以在抗體優(yōu)化的任何階段進(jìn)行。術(shù)語(yǔ)"嵌合抗體"包含其中分子的不同部分衍生自不同物種的抗體。因此，嵌合抗體是(但不限于)例如包含來(lái)自一個(gè)物種的重鏈和輕鏈可變區(qū)序列，但是其中VH和/或VL的一個(gè)或多個(gè)CDR區(qū)序列被另一物種的CDR序列替換的抗體。在此類抗體中可變區(qū)可以具有小鼠重鏈和輕鏈，其中一個(gè)或多個(gè)小鼠CDR(例如CDR3)凈ilACDR序列替換。術(shù)語(yǔ)"人源化抗體"描述這樣的抗體，其包含來(lái)自非人物種(例如小鼠、大鼠、兔、雞、駱駝、山羊)的重鏈和輕鏈可變區(qū)序列，但是其中VH和/或VL序列的至少一部分已經(jīng)被修飾以便"更像人"，即像人種系的可變區(qū)序列。一種類型的人源化抗體是CDR嫁接抗體，其中人CDR序列被插入到非人VH和VL序列中以便于替換相應(yīng)的非人CDR序列。用于測(cè)定抗體結(jié)合動(dòng)力學(xué)的一種方法基于所謂的表面等離振子共振。術(shù)語(yǔ)"表面等離振子共振，，指一種光學(xué)現(xiàn)象，利用這種現(xiàn)象可以通過(guò)使用生物傳感器基質(zhì)，例如4吏用BIAcore系統(tǒng)(PharmaciaBiosensorAB,Uppsala,SwedenandPiscataway，NJ)檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度的改變來(lái)分析生物特異性相互作用。對(duì)于進(jìn)一步的描述見(jiàn)J6nsson，U.等，(1993)Ann.Biol.Clin,a:19畫26;JRinsson，U.等，(1991)Biotechniques11:620-627;Johnsson，B.等，(1995)J.Mol.Recognit.&125-131;和Johnnson，B.等，(1991)Anal.Biochem,198:268-277。術(shù)語(yǔ)"K。ff"描述抗體從抗體/抗原復(fù)合物上解離下來(lái)的解離速率常數(shù)。術(shù)語(yǔ)"Kd，，描述特定抗體-抗原相互作用的解離常數(shù)。本發(fā)明抗體的結(jié)合親和力可以通過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)體外免疫分析法，如ELISA或BIAcore分才斤評(píng)定。5.2免疫球蛋白的產(chǎn)生5.2.1多克隆抗體的產(chǎn)生本發(fā)明涉及抗本發(fā)明RGM結(jié)構(gòu)域和多肽的多克隆抗體以及其生產(chǎn)。為此目的，宿主用至少一種本發(fā)明的RGM蛋白質(zhì)或其衍生物/等效物免疫；并且得到因免疫應(yīng)答而形成的宿主的含抗體血清。如果所使用的RGM多肽僅具有弱的免疫原性或者沒(méi)有免疫原性，則它們的免疫原性可以通過(guò)將其偶聯(lián)至載體，優(yōu)選載體蛋白質(zhì)如如匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)、美洲鱟(Limuluspolyphenus)血藍(lán)蛋白(LPH)、牛血清白蛋白(BSA)或卵白蛋白(OVA)而增加。多種偶聯(lián)可能方案對(duì)技術(shù)人員而言是可以得到的，并且是通常已知的。一種方便的可能方案是例如與戊二醛反應(yīng)，例如通過(guò)將RGM蛋白質(zhì)與水或者水溶劑中的適宜肽或肽混合物孵育。該反應(yīng)可以在環(huán)境溫度，通常指室溫下方便地開(kāi)展。然而，冷卻或溫和加熱也可能是有利的。反應(yīng)通常在數(shù)小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生期望結(jié)果，并且反應(yīng)時(shí)間例如2小時(shí)處于正常的范圍。戊二醛濃度通常在ppm至％范圍內(nèi)，有利的是從10ppm至1。/0，優(yōu)選地從100ppm至0.5。/。。反應(yīng)參數(shù)的優(yōu)化在技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。組合物除了包含抗原外，通常還包含賦形劑，特別是正常用于免疫的佐劑，例如弗氏佐劑。尤其是，完全弗氏佐劑用于第一次免疫，而所有的進(jìn)一步的免疫用不完全弗氏佐劑開(kāi)展。免疫雞尾酒式混合物通過(guò)向賦形劑中加入抗原(免疫原)，優(yōu)選地以上述組分混合物的形式，產(chǎn)生。在該情況下，抗原通常被乳化。適宜的宿主特別是嚙齒類或兔。這些宿主或其它適宜宿主用免疫雞尾酒式混合物優(yōu)選以皮下方式注射?？贵w效價(jià)可以使用免疫分析法確定，例如使用抗宿主IgG的綿羊抗血清和標(biāo)記的RGM蛋白質(zhì)的竟?fàn)幮悦庖叻治龇?。由此可以在免疫結(jié)束時(shí)決定特定的宿主是否適用于得到抗體。如果開(kāi)展4次免疫，可以在第3次免疫后確定抗體效價(jià)，然后可以從顯示具有足夠抗體效價(jià)的動(dòng)物得到抗體。優(yōu)選地在幾周或數(shù)月內(nèi)從宿主采^Ufii液，以便得到所形成的抗體。最終可以對(duì)宿主進(jìn)行放血。包含目的抗體的血清可以以本身已知的方式從以該方式得到的血液中得到。以該方式得到的全血清可以根據(jù)需要以技術(shù)人員已知的方式進(jìn)一步純化，以便濃縮其中存在的抗體級(jí)分，特別是識(shí)別RGM蛋白質(zhì)的抗體。在該方法的一個(gè)特定實(shí)施方案中，選擇血清中的至少一種特異性識(shí)別作為免疫原使用的RGM蛋白質(zhì)或其衍生物/等效物的抗體。關(guān)于這一點(diǎn)，特異性是指抗體對(duì)免疫原的結(jié)合親和力高于對(duì)其它蛋白質(zhì)、特別是免疫原性相關(guān)蛋白質(zhì)的結(jié)合親和力。5.2.2單克隆抗體的產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明有用的免疫球蛋白可以使用本身已知的方法得到。因此，可以利用雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生針對(duì)目的抗原的單特異性抗體。此外，已經(jīng)M了重組抗體技術(shù)，如體外抗體文庫(kù)篩選，并且這些技術(shù)同樣可以用于產(chǎn)生此類特異性抗體。因此，例如動(dòng)物可以用目的抗原免疫。該體內(nèi)方法可以進(jìn)一步包括從動(dòng)物的淋巴細(xì)胞或脾細(xì)胞建立一系列雜交瘤并且選擇分泌特異性結(jié)合抗原的抗體的雜交瘤。待免疫的動(dòng)物可以是例如小鼠、大鼠、兔、雞、駱駝或綿羊或者上述動(dòng)物之一的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，例如帶有人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，該小鼠在用抗原刺激后會(huì)產(chǎn)生人抗體?？梢悦庖叩钠渌愋蛣?dòng)物包括已經(jīng)用人外周血單核細(xì)胞(嵌合hu-PBMC-SCID小鼠)或用淋巴細(xì)胞或其前體重構(gòu)的重度聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠，以及已經(jīng)接受過(guò)致死性全身輻射處理、隨后用來(lái)自重度聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠的骨髓細(xì)胞進(jìn)行防輻射損害的保護(hù)處理并且隨后移植了功能性人淋巴細(xì)胞的小鼠(所謂的trimera系統(tǒng))?？擅庖叩牧硪环N類型的動(dòng)物是在其基因組中編碼目的抗原的內(nèi)源基因已經(jīng)被關(guān)閉("敲除")，如通過(guò)同源重組關(guān)閉的動(dòng)物(例如小鼠)，該動(dòng)物在用該抗原免疫后識(shí)別作為外來(lái)物的該抗原。技術(shù)人員知道，通過(guò)這些方法產(chǎn)生的多克隆抗體或單克隆抗體可通過(guò)已知的篩選方法來(lái)表征及選擇，所述方法包括ELISA技術(shù)，但不限于此。才艮據(jù)另一實(shí)施方案，使用抗原篩選重組抗體文庫(kù)。重組抗體文庫(kù)可以在例如噬菌體表面或者酵母細(xì)胞表面或者細(xì)菌細(xì)胞表面上表達(dá)。重組抗體文庫(kù)可以是例如scFv文庫(kù)或Fab文庫(kù)。在另一實(shí)施方案中，抗體文庫(kù)可以作為RNA-蛋白質(zhì)融合物表達(dá)。產(chǎn)生本發(fā)明抗體的另一種方法包括體內(nèi)和體外方法的組合。例如，通過(guò)用抗原體內(nèi)免疫動(dòng)物使抗原作用于抗體鐠(antibodyrepertoire)，隨后使用抗原體外篩選由動(dòng)物淋巴樣細(xì)胞產(chǎn)生的重組抗體文庫(kù)或單結(jié)構(gòu)域抗體文庫(kù)(例如帶有重鏈和/或輕鏈)。根據(jù)另一種方法，通過(guò)用抗原體內(nèi)免疫動(dòng)物使抗原作用于抗體譜，然后將從動(dòng)物淋巴樣細(xì)胞產(chǎn)生的重組抗體文庫(kù)或單結(jié)構(gòu)域文庫(kù)進(jìn)行親和力成熟。根據(jù)另一種方法，通過(guò)用抗原體內(nèi)免疫動(dòng)物使抗原作用于抗體i普，然后選擇分泌目的抗體的抗體生產(chǎn)單細(xì)胞，并且從所選擇的這些細(xì)胞中得到重鏈和輕鏈可變區(qū)的cDNA(例如通過(guò)PCR)并且在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中體外表達(dá)該重鏈和輕鏈可變區(qū)(這稱作淋巴細(xì)胞-抗體選捧方法或者SLAM，即選擇性淋巴細(xì)胞抗體方法)，這允許對(duì)所選擇的抗體基因序列進(jìn)行進(jìn)一步的選擇和操作。單克隆抗體還可以利用表達(dá)克隆來(lái)選擇，所述的表達(dá)克隆為在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)重鏈和輕鏈的抗體基因，并且選擇分泌具有目的結(jié)合親和力的抗體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。本發(fā)明〗吏得可以得到RGM結(jié)合結(jié)構(gòu)域或多肽形式的確定的抗原用于篩選和反向篩選。因此，根據(jù)本發(fā)明可以選擇具有如上所定義的本發(fā)明期望特性i普的多克隆抗體和單克隆抗體。用于產(chǎn)生抗體的本發(fā)明方法可以用于產(chǎn)生各種類型的抗體。這基本上包括人抗體、嵌合抗體、人源化抗體和CDR嫁接抗體、以及其抗原結(jié)合部分。用于產(chǎn)生本發(fā)明抗體的方法在下面描述。關(guān)于這一點(diǎn)，區(qū)分為體內(nèi)方法、體外方法或者這兩種方法的組合。體內(nèi)方法可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，如最初由K6hler和Milstein描述的雜交瘤技術(shù)(1975，Nature256:495-497)(還可參見(jiàn)Brown等，(1981)J.Immunol127:539-46;Brown等，(1980)JBiolChem255:4980-83;Yeh等，(1976)PNAS76:2927-31;以及Yeh等，(1982)Int.J.Cancer29:269-75)，從在體內(nèi)產(chǎn)生抗體的細(xì)胞開(kāi)始，生產(chǎn)單克隆抗體。用于產(chǎn)生單克隆抗體雜交瘤的才支術(shù)眾所周知(一般參見(jiàn)R.H.Kenneth，inMonoclonalAntibodies:ANewDimensionInBiologicalAnalyses,PlenumPublishingCorp.,NewYork,NewYork(1980);E.A.Lerner(1981)YaleJ.Biol.Med.，54:387-402;M.L.Gefter等，(1977)SomaticCellGenet.，3:231-36)。為此目的，將永生化的細(xì)胞系(典型的是骨髓瘤)與用本發(fā)明RGM蛋白質(zhì)或其衍生物/等效物免疫的哺乳動(dòng)物的淋巴細(xì)胞(典型的是脾細(xì)胞或淋巴結(jié)細(xì)胞或者外周血淋巴細(xì)胞)融合，并且篩選所得到的雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清以鑒定產(chǎn)生對(duì)本發(fā)明RGM蛋白質(zhì)或其衍生物/等效物具有特異性的單克隆抗體的雜交瘤。為此目的，可以使用充分熟知的多種用于融合淋巴細(xì)胞和永生化細(xì)胞系的方法中的任何方法(還可參見(jiàn)G.Galfre等，(1977)Nature266:550-52;Gefter等，SomaticCellGenet.，在上引用；Lerner，YaleJ.Biol.Med.，在上引用；Kenneth,MonoclonalAntibodies,在上引用)。技術(shù)人員還知道此類方法的多種不同變型方法，它們同樣可以使用。典型地，永生化細(xì)胞系(例如骨髓瘤細(xì)胞系)與淋巴細(xì)胞來(lái)源于相同的哺乳動(dòng)物物種。例如可以通過(guò)將用本發(fā)明免疫原性制劑免疫的小鼠的淋巴細(xì)胞與永生化的小鼠細(xì)胞系融合以建立鼠雜交瘤。優(yōu)選的永生化細(xì)胞系是對(duì)包含次黃噤呤、M蝶呤和胸苷的培養(yǎng)基(HAT培養(yǎng)基)敏感的小鼠骨髓瘤細(xì)胞系。諸多骨髓瘤細(xì)胞系中的任何一種都可以用作標(biāo)準(zhǔn)融合中的融合配偶體，例如P3-NSl/l-Ag4-l、P3-x63-Ag8.653或Sp2/0-Agl4骨髓瘤系。這些骨髓瘤細(xì)胞系可從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，Rockville，MD得到。典型地，使用聚乙二醇(PEG)將HAT-敏感性小鼠骨髓瘤細(xì)胞與小鼠脾細(xì)胞融合。然后，使用HAT培養(yǎng)基選擇來(lái)自融合的雜交瘤細(xì)胞，由此未融合的以及非生產(chǎn)性融合的骨髓瘤細(xì)胞將被殺死(未融合的脾細(xì)胞在幾天后死亡，因?yàn)樗鼈兾幢晦D(zhuǎn)化)。特異性識(shí)別本發(fā)明RGM蛋白質(zhì)或者其衍生物/等效物的產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞通過(guò)篩選雜交瘤培養(yǎng)上清中的此類抗體而鑒定出來(lái)，例如4吏用標(biāo)準(zhǔn)ELISA分析法篩選，以便選擇能夠特異性結(jié)合本發(fā)明RGM蛋白質(zhì)或者其f汴生物/等效物的那些抗體。可以使用不同的宿主動(dòng)物進(jìn)行體內(nèi)免疫，這依賴于目的抗體的性質(zhì)?？梢允褂米陨肀磉_(dá)內(nèi)源性目的抗原的宿主。備選地，可以使用對(duì)于內(nèi)源性目的抗原而言為缺陷型的宿主。例如，已經(jīng)證明，通過(guò)在特定內(nèi)源基因上的同源重組產(chǎn)生的相應(yīng)內(nèi)源蛋白質(zhì)缺陷的小鼠(即敲除小鼠)可以對(duì)用于免疫其的該蛋白質(zhì)產(chǎn)生體液免疫反應(yīng)，并且因此可以用于產(chǎn)生抗該蛋白質(zhì)的高親和性單克隆抗體(見(jiàn)例如Roes，J.等，(1995)J.Immunol.Methods巡:231-237;Lunn，M.P.等，(2000)J.Neurochem.2:404-412)。許多非人哺乳動(dòng)物適宜作為抗體產(chǎn)生的宿主，用于產(chǎn)生抗本發(fā)明RGM蛋白質(zhì)或其衍生物/等效物的非人抗體。這些動(dòng)物包括小鼠、大鼠、雞、駱駝、兔和山羊(以及其基因敲除形式)，但是優(yōu)選小鼠用于雜交瘤生產(chǎn)。還可以使用表達(dá)人抗體i普的非人宿主動(dòng)物用于生產(chǎn)抗人抗原的具有雙重特異性的實(shí)質(zhì)人抗體。此類非人動(dòng)物包括帶有人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如小鼠)(嵌合的hu-PBMC-SCID小鼠)和A/小鼠輻射嵌合體，這些動(dòng)物在下面詳細(xì)描述。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，用本發(fā)明RGM蛋白質(zhì)或其衍生物/等效物免疫的動(dòng)物是非人哺乳動(dòng)物，優(yōu)選帶有人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，從而在抗原刺激后該非人哺乳動(dòng)物制造人抗體。有代表性地，具有人種系構(gòu)型的重鏈和輕鏈免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因被導(dǎo)入此類動(dòng)物中，其中所述動(dòng)物已經(jīng)被修飾以致于重鏈和輕鏈的內(nèi)源性基因座是失活的。用抗原(例如人抗原)刺激此類動(dòng)物導(dǎo)致產(chǎn)生衍生自人免疫球蛋白序列的抗體(即人抗體)。人單克隆抗體可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)雜交瘤技術(shù)從此類動(dòng)物的淋巴細(xì)胞中產(chǎn)生。對(duì)于帶有人免疫球蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠及其在人抗體生產(chǎn)中的用途的進(jìn)一步描述見(jiàn)例如美國(guó)專利號(hào)5,939,598、，WO96/33735、WO96/34096、WO98/24893和WO99/53049(AbgenixInc.)、以及美國(guó)專利號(hào)5,545,806、5,569,825、5,625,126、5，633，425、5,661,016、5,770,429、5,814,318、5，877，397和WO99/45962(GenpharmInc.);同樣參見(jiàn)MacQuitty，J.J.和Kay，R.M.(1992)Science，1188;Taylor,L.D.等，(1992)NucleicAcidsRes.^:6287-6295;Lonberg，N.等，(1994)Nature巡:856-859;Lonberg，N.和Huszar，D.(199S)Int.Rev.Immunol.J^:65-93;Harding,F.A.undLonberg，N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci.2^:536-546;Fishwild，D.M.等，(1996)NatureBiotechnologyJi:845-851;Mendez，M.J.等，(1997)NatureGeneticsIf:146-156;Green，L丄.和Jakobovits，A.(1998)J.Exp.Med.188:483-495;Green，L丄.(1999)J.Immunol.Methods231:11-23;Yang，X.D.等，(1999)J.Leukoc.Biol.^￡:401-410;Gallo，M丄.等，(2000)Eur.J.Immunol.^:534-540。在再一實(shí)施方案中，用本發(fā)明RGM蛋白質(zhì)或其衍生物/等效物免疫的動(dòng)物可以是已經(jīng)用人外周血單核細(xì)胞或用淋巴細(xì)胞或其前體重構(gòu)的重度聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠。被稱作嵌合hu-PBMC-SCID小鼠的此類小鼠，已經(jīng)被證明可以在抗原刺激后產(chǎn)生人免疫球蛋白反應(yīng)。對(duì)于這些小鼠及其用于產(chǎn)生抗體的用途的進(jìn)一步描述見(jiàn)例如Leader,K.A.等，(1992)Immunology2jl:229-234;Bombil,F.等，(1996)Immunobiol.195:360-375;Murphy,W丄等，(1996)Semin.Immunol.絲:233-241;Herz,U.等，(1997)Int.Arch.AllergyImmunol.JJi:150-152;Albert,S，E.等，(1997)J，Immunol.1393-1403;Nguyen,H.等，(1997)Microbiol.Immunol.U:卯l-907;Arai,K.等，(1998)J.Immunol.Methods^12:79-85;Yoshinari，K.和Arai，K.(1998)Hybridoma12:41-45;Hutchins，W.A.等，(1999)Hybridoma18:121-129;Murphy,W，J.等，(1999)Clin.Immunol.2i_:22-27;Smithson，S丄.等，(1999)Mol.Immunol.^:113-124;Chamat，S.等，(1999)J.Infect.Diseases180:268-277;和Heard,C.等，(1999)Molec.Med,S:35-45。在另一實(shí)施方案中，用本發(fā)明RGM蛋白質(zhì)或其衍生物/等效物免疫的動(dòng)物是已經(jīng)用致死性全身輻射處理過(guò)、隨后用來(lái)自重度聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠的骨髓細(xì)胞進(jìn)行輻射保護(hù)并且隨后移植了功能性人淋巴細(xì)胞的小鼠。這種類型的嵌合體^:稱作trimera系統(tǒng)，通過(guò)用目的抗原免疫該小鼠、隨后使用標(biāo)準(zhǔn)雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生單克隆抗體，該小鼠可以用于生產(chǎn)人單克隆抗體。對(duì)于這些小鼠以及其用于產(chǎn)生抗體的用途的進(jìn)一步描述見(jiàn)例如Eren，R.等，(1998)Immunology2^:154-161;Reisner，Y和Dagan，S.(1998)TrendsBiotechnol.M:242-246;Ilan,E.等，(1999)Hepatology29:553-562;以及Bocher，W.O.等，(1999)Immunology￡^:634-641。體外方法作為通過(guò)免疫和選擇來(lái)產(chǎn)生本發(fā)明抗體的一種替代方法，可以通過(guò)用本發(fā)明RGM蛋白質(zhì)或其衍生物/等效物篩選重組的組合免疫球蛋白文庫(kù)、以由此分離特異性結(jié)合RGM蛋白質(zhì)或其衍生物/等效物的免疫球蛋白文庫(kù)成員，來(lái)鑒定和分離本發(fā)明的抗體。用于產(chǎn)生和篩選展示文庫(kù)的試劑盒是商業(yè)可得的(例如來(lái)自Pharmacia的重組噬菌體抗體系統(tǒng)，目錄號(hào)27-9400-01;以及來(lái)自Stratagene的SurfZAP噬菌體展示試劑盒，目錄號(hào)240612)。在許多實(shí)施方案中，展示文庫(kù)是scFv文庫(kù)或Fab文庫(kù)。用于篩選重組抗體文庫(kù)的噬菌體展示技術(shù)已經(jīng)有充分描述。特別有利地用于產(chǎn)生和篩選抗體展示文庫(kù)的方法和化合物的實(shí)例可以在例如下列文獻(xiàn)中找到McCafferty等，WO92/01047，美國(guó)專利號(hào)5,969,108和EP589877(特別描述了scFv的展示)，Ladner等，美國(guó)專利號(hào)5,223,409、5,403,484、5,571,698、5,837,500和EP436597(描述了例如pill融合)；Dower等，WO91/17271，美國(guó)專利號(hào)5,427,908，美國(guó)專利號(hào)5,580,717和EP527839(特別描述了Fab的展示)；Winter等，國(guó)際公布WO92/20791和EP368，684(特別描述了免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域序列的克隆)；Griffiths等，美國(guó)專利號(hào)5,885,793和EP589877(特別描述了j吏用重組文庫(kù)對(duì)抗人抗原的人抗體的分離)；Garrard等，WO92/09690(特別描述了噬菌體表達(dá)技術(shù))；Knappik等，WO97/08320(描述了人重組抗體文庫(kù)HuCal);Salfeld等，WO97/29131(描述了抗人抗原(人腫瘤壞死因子a)的重組人抗體的產(chǎn)生，以及該重組抗體的體外親和力成熟)以及Salfeld等，美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/126,603和基于其的專利申請(qǐng)(同樣描述了抗人抗原(人白細(xì)胞介素-12)的重組人抗體的產(chǎn)生，以及該重組抗體的體外親和力成熟)。對(duì)篩選重組抗體文庫(kù)的其它描述可以在下列科學(xué)出版物中找到如Fuchs等，(1991)Bio/Technology9:1370-1372;Hay等，(1992)HumAntibodHybridomas3:81-85;Huse等，(1989)Science246:1275-1281;Griffiths等，(1993)EMBOJ12:725-734;Hawkins等，(1992)JMolBiol226:889-896;Clarkson等，(1991)Nature352:624-628;G腦等，(1992)PNAS89:3576-3580;Garrad等，(1991)Bio/Technology9:1373-1377;Hoogenboom等，(1991)NucAcidRes19:4133-4137;Barbas等，(1991)PNAS88:7978畫7982;McCafferty等，Nature(19卯)348:552-554;以及Knappik等，(2000)J.Mol.Biol.296:57-86。作為對(duì)使用噬菌體展示系統(tǒng)的一個(gè)替代，可以在酵母細(xì)胞或者細(xì)菌細(xì)胞表面上表達(dá)重組抗體文庫(kù)。用于產(chǎn)生和篩選在酵母細(xì)胞表面上表達(dá)的文庫(kù)的方法描述于WO99/36569。用于產(chǎn)生和篩選在細(xì)菌細(xì)胞表面上所表達(dá)的文庫(kù)的方法詳細(xì)描述于WO98/49286。一旦從組合文庫(kù)中鑒定出目的抗體，編碼抗體輕鏈和重鏈的DNA可以通過(guò)分子生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，如通過(guò)PCR擴(kuò)增來(lái)自在文庫(kù)篩選過(guò)程中分離的展示包(displaypackage)(例如噬菌體)的DNA來(lái)分離?？梢杂糜诋a(chǎn)生PCR引物的抗體輕鏈和重鏈基因的核苷,列是技術(shù)人員已知的。許多此類序列描述于例如Kabat，E.A.等，(1991)SequencesofProteinofImmunologicalInterest,第5版，U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIHPublicationNo.91-3242以;5LA種系序列數(shù)據(jù)庫(kù)VBASE中。本發(fā)明的抗體或抗體部分可以通過(guò)在宿主細(xì)胞中重組表達(dá)免疫球蛋白輕鏈和重鏈基因產(chǎn)生。對(duì)于抗體的重組表達(dá)，宿主細(xì)胞用一個(gè)或多個(gè)帶有編碼抗體免疫球蛋白輕鏈和重鏈的DNA片段的重組表達(dá)栽體轉(zhuǎn)染，以致于輕鏈和重鏈在宿主細(xì)胞中表達(dá)，并且優(yōu)選地分泌進(jìn)入培養(yǎng)宿主細(xì)胞所用的培養(yǎng)基中?？贵w可以從該培養(yǎng)基中得到。可以使用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA方法得到抗體重鏈和輕鏈基因、將這些基因插入到重組表達(dá)載體中并且將栽體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中。該類型的方法描述于例如Sambrook，F(xiàn)ritsch和Maniatis(編者)，MolecularCloning;ALaboratoryManual,第2版，ColdSpringHarbor,N.Y"(1989)，Ausubel，F(xiàn).M.等，(編者)CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingAssociates,(1989)以及Boss等的美國(guó)專利號(hào)4,816,397中。一旦得到編碼目的抗體VH和VL片段的DNA片段，這些DNA片段可以使用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)進(jìn)一步操作，以便例如將可變區(qū)基因轉(zhuǎn)變成全長(zhǎng)抗體鏈基因、轉(zhuǎn)變成Fab片段的基因或者轉(zhuǎn)變成scFv基因。這些操作導(dǎo)致編碼VL或VH的DNA片段與編碼另一蛋白質(zhì)，例如抗體恒定區(qū)或者柔性接頭的另一DNA片段有效連接。術(shù)語(yǔ)"有效連接"在這里旨在指兩個(gè)DNA片段以這樣一種方式連接在一起，該方法使得兩個(gè)DNA片段編碼的M絲列依然處于讀碼框中(符合讀框的)。通過(guò)將編碼VH區(qū)的DNA與編碼重鏈恒定區(qū)(CH1、CH2和CH3)的另一DNA分子有效連接，編碼VH區(qū)的分離的DNA可以凈皮轉(zhuǎn)變成全長(zhǎng)重鏈基因。人重鏈恒定區(qū)基因序列充分已知(見(jiàn)例如Kabat,E.A.等，(1991)SequencesofProteinofImmunologicalInterest，F(xiàn)ifthEdition，U.S.DepartmentofHealthandHumanServices，NIHPublicationNo.91-3242)，并且跨這些區(qū)域的DNA片段可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增得到。重鏈恒定區(qū)可以是來(lái)自IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD的恒定區(qū)，優(yōu)選來(lái)自IgGl或IgG4的恒定區(qū)。重鏈Fab片段的基因可以通過(guò)將編碼VH的DNA與僅編碼重鏈恒定區(qū)CHI的另一DNA分子有效連接得到。通過(guò)編碼VL的DNA與編碼輕鏈恒定區(qū)CL的另一DNA分子有效連接，編碼VL區(qū)的分離的DNA可以轉(zhuǎn)變成全長(zhǎng)輕鏈的基因(和Fab輕鏈的基因)。人輕鏈恒定區(qū)的基因序列充分已知(見(jiàn)Kabat,E,A.等，(1991)SequencesofProteinofImmunological'Interest,第5版,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIHPublicationNo.91-3242)，并且跨這些區(qū)域的DNA片段可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增得到。輕鏈恒定區(qū)可以是恒定區(qū)K或k,優(yōu)選恒定區(qū)K。scFv基因可以通過(guò)有效連接編碼VH和VL的DNA片段與編碼柔性接頭如^J^紗歹'J(Gly4-Ser)3的另一片段而產(chǎn)生，以致于VH和VL序列作為連續(xù)的單鏈蛋白質(zhì)表達(dá)，其中VL和VH區(qū)通過(guò)該柔性接頭連接在一起(見(jiàn)Bird等，(1988)Science242:423-426;Huston等，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA^f:5879-5883;McCafferty等，Nature(1990)348:552-554)。對(duì)本發(fā)明RGM蛋白質(zhì)或其個(gè)汙生物/等效物具有特異性的VH和VL單結(jié)構(gòu)域可以使用上述方法從單結(jié)構(gòu)域文庫(kù)中分離?？梢允褂镁哂心康奶禺愋缘膬蓚€(gè)VH單結(jié)構(gòu)域鏈(帶有或不帶有CH1)或兩個(gè)VL鏈或一對(duì)VH鏈和VL鏈來(lái)結(jié)合本發(fā)明的RGM蛋白質(zhì)或其衍生物/等效物。本發(fā)明的重組抗體或抗體部分可以通過(guò)將編碼部分或全長(zhǎng)輕鏈和重鏈的DNA插入到表達(dá)載體中，使基因與轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列有效連接來(lái)表達(dá)。關(guān)于這一點(diǎn)，術(shù)語(yǔ)"有效連接，，旨在指抗體基因以這樣一種方式連接在栽體中，該方式使得載體中的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列可以實(shí)現(xiàn)它們調(diào)節(jié)抗體基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯的預(yù)期功能。選擇表達(dá)載體和表達(dá)控制序列以便它們與用于表達(dá)的宿主細(xì)胞兼容?？贵w輕鏈基因和抗體重鏈基因可以插入到不同的載體中，或者通常情況是兩個(gè)基因插入到同一個(gè)表達(dá)載體中。抗體基因通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法(例如將抗體基因片段和栽體上的互補(bǔ)性限制性切割位點(diǎn)連接，或者將鈍末端連接(如果不存在限制性切割位點(diǎn)的話))插入到表達(dá)載體中。表達(dá)載體可以在插入輕鏈和重鏈序列之前已經(jīng)具有抗體恒定區(qū)序列。一種方法例如是通過(guò)將VH和VL序列插入到已經(jīng)分別編碼重鏈和輕鏈恒定區(qū)的表達(dá)載體中(以致于VH片段與栽體中的CH片段有效連接，并且VL片段與載體中的CL片段也有效連接)從而將VH和VL序列轉(zhuǎn)變成全長(zhǎng)抗體基因。另外的或者備選的可能方案是編碼信號(hào)肽的重組表達(dá)栽體，所述信號(hào)肽有利于抗體鏈從宿主細(xì)胞的分泌?？梢詫⒖贵w鏈的基因克隆到該載體中，使信號(hào)肽與抗體鏈基因的N末端在讀框內(nèi)連接。信號(hào)肽可以是免疫球蛋白信號(hào)肽或異源信號(hào)肽(即來(lái)自非免疫球蛋白的信號(hào)肽)。本發(fā)明表達(dá)載體除了具有抗體鏈的基因以外，還可以具有控制抗體鏈基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)的調(diào)節(jié)序列。術(shù)語(yǔ)"調(diào)節(jié)序列"旨在包括控制抗體鏈基因轉(zhuǎn)錄或翻譯的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和其它的表達(dá)控制元件(例如多腺苷酸化信號(hào))。此類調(diào)節(jié)序列描述于例如Goeddel;GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185，AcademicPress,SanDiego，CA(1990)中。技術(shù)人員將明了表達(dá)栽體的設(shè)計(jì)，包括調(diào)節(jié)序列的選擇，可以取決于諸多因素如待轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選擇、蛋白質(zhì)表達(dá)的目的強(qiáng)度等。對(duì)于在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中表達(dá)而言優(yōu)選的調(diào)節(jié)序列包括導(dǎo)致在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中蛋白質(zhì)強(qiáng)表達(dá)的病毒元件，如啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子，這些元件可以衍生自巨細(xì)胞病毒(CMV)(如CMV啟動(dòng)子/增強(qiáng)子)、猿猴病毒40(SV40)(如SV40啟動(dòng)子/增強(qiáng)子)、腺病毒(例如晚期腺病毒主要啟動(dòng)子(AdMLP，即，AdenovirusMajorLatePromoter的縮寫))和多瘤病毒。對(duì)于病毒調(diào)節(jié)元件和其序列的進(jìn)一步描述見(jiàn)例如Stinski的美國(guó)專利號(hào)5，168，062、Bdl等的美國(guó)專利號(hào)4,510,245以及Schaffner等的美國(guó)專利號(hào)4，968，615。本發(fā)明的重組表達(dá)栽體除了具有抗體鏈基因和調(diào)節(jié)序列之外，還可以具有額外的序列，如調(diào)節(jié)載體在宿主細(xì)胞中的復(fù)制的序列(例如復(fù)制起點(diǎn))和選擇標(biāo)記基因。選擇標(biāo)記基因利于選擇其中已經(jīng)導(dǎo)入了載體的宿主細(xì)胞(見(jiàn)例如Axd等的美國(guó)專利號(hào)4,399,216、4,634,665和5,179,017)。例如，選擇標(biāo)記基因通常使已經(jīng)插入了載體的宿主細(xì)胞抵抗活性物質(zhì)，如G418、潮霉素或氨甲蝶呤。優(yōu)選的選棒標(biāo)記基因包括二氫葉酸還原酶基因(DHFR)(用于dhfr-宿主細(xì)胞和氨甲蝶呤選擇/擴(kuò)增)和neo基因(用于G418選擇)。為了表達(dá)輕鏈和重鏈，編碼重鏈和輕鏈的表達(dá)載體使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)被轉(zhuǎn)染進(jìn)入宿主細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)染"的各種形式旨在包括通常用于將外源DNA引入原核或真核宿主細(xì)胞的大量技術(shù)，例如電穿孔、磷酸釣沉淀、DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染等。雖然理論上可以在原核或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的抗體，但是優(yōu)選在真核細(xì)胞、尤其是哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中表達(dá)抗體，因?yàn)樵诖祟愓婧思?xì)胞、尤其是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中裝配和分泌正確折疊的免疫活性抗體的可能性比在原核細(xì)胞中高。已有報(bào)道，抗體基因的原核表達(dá)無(wú)法有效地大量生產(chǎn)活性抗體(Boss，M,A.和Wood,C.R.(1985)ImmunologyTodayg:12畫13)。優(yōu)選用于表達(dá)本發(fā)明重組抗體的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞包括CHO細(xì)胞(包括dhfrCHO細(xì)胞，其描述于Urlaub和Chasin，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA22:4216-4220，并且如例如R.J.Kaufman和P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.^2:601-621中所述與DHFR選擇標(biāo)記一起4吏用)、NS0骨髓瘤細(xì)胞、COS細(xì)胞和SP2細(xì)胞。如果編碼抗體基因的重組表達(dá)載體被導(dǎo)入到哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中，則通過(guò)培養(yǎng)宿主細(xì)胞直至抗體在宿主細(xì)胞中表達(dá)或者優(yōu)選地抗體被分泌到宿主細(xì)胞生長(zhǎng)所在的培養(yǎng)基中來(lái)生產(chǎn)抗體。通過(guò)使用純化蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)方法可以從培養(yǎng)基中得到抗體。同樣可以使用宿主細(xì)胞產(chǎn)生完整抗體的部分，如Fab片段或scFv分子。本發(fā)明當(dāng)然包括上述方法的變體。例如可能期望用編碼本發(fā)明抗體的輕鏈或重鏈(但不是兩者)的DNA轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。如果存在對(duì)于目的抗原的結(jié)合而言非必需的輕鏈或重鏈，則可以通過(guò)重組DNA技術(shù)部分地或者全部地缺失掉編碼一個(gè)此輕鏈或者一個(gè)此重鏈或者兩者的DNA。通過(guò)此類截短DNA分子表達(dá)的分子同樣屬于本發(fā)明的抗體。還可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)方法將本發(fā)明的抗體與第二抗體交聯(lián)來(lái)產(chǎn)生雙功能性抗體，在該抗體中一個(gè)重鏈和一個(gè)輕鏈?zhǔn)潜景l(fā)明的抗體，而另外的重鏈和輕鏈對(duì)目的抗原之外的抗原具有特異性。在重組表達(dá)本發(fā)明抗體或其抗原結(jié)合部分的優(yōu)選系統(tǒng)中，將編碼抗體重鏈和抗體輕鏈兩者的重組表達(dá)載體通過(guò)磷酸鉤介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染導(dǎo)入到dhfr-CHO細(xì)胞中。在重組表達(dá)載體中，抗體重鏈和輕鏈的基因各與調(diào)節(jié)性CMV增強(qiáng)子/AdMLP啟動(dòng)子元件有效連接以使基因強(qiáng)力轉(zhuǎn)錄。重組表達(dá)載體還可以具有DHFR基因，該基因可以用于通過(guò)氨甲蝶呤選擇/擴(kuò)增來(lái)選擇轉(zhuǎn)染有載體的CHO細(xì)胞。培養(yǎng)所選擇的轉(zhuǎn)化了的宿主細(xì)胞，以表達(dá)抗體重鏈和輕鏈并且從培養(yǎng)基中得到完整的抗體。可以使用分子生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)以產(chǎn)生重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞、選擇轉(zhuǎn)化體、培養(yǎng)宿主細(xì)胞和從培養(yǎng)基中得到抗體。因此，本發(fā)明涉及通過(guò)在適宜培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞直到本發(fā)明的重組抗體被合成來(lái)合成本發(fā)明重組抗體的方法。該方法還可以包括從培養(yǎng)基中分離重組抗體。作為通過(guò)噬菌體展示篩選重組抗體文庫(kù)的替>(戈，可以采用技術(shù)人員已知的另外的方法篩選大的組合文庫(kù)，以鑒定本發(fā)明的抗體。在一種類型的備選表達(dá)系統(tǒng)中，如Szostak和Roberts的WO98/31700以及Roberts,R.W.和Szostak,J.W.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA21:12297-12302中所述以RNA-蛋白質(zhì)融合物的形式表達(dá)重組抗體文庫(kù)。在該系統(tǒng)中，通過(guò)合成性mRNA的體外翻譯在mRNA和其所編碼的肽或蛋白質(zhì)之間產(chǎn)生共價(jià)融合，其中該mRNA在其3，末端攜帶有噤呤霉素，一種肽基接納體抗生素。因此可以基于所編碼肽或蛋白質(zhì)(例如抗體或其部分)的特性，如抗體或其部分與本發(fā)明RGM蛋白質(zhì)或其f汙生物/等效物的結(jié)合，從mRNA的復(fù)雜混合物(例如組合文庫(kù))中富集特異mRNA。編碼抗體或其部分并且從篩選此類文庫(kù)中得到的核酸序列可以通過(guò)重組方法以上述方式表達(dá)(例如在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中)，此外還可以通過(guò)在更多輪中篩選mRNA-肽融合物(在這種情況下突變被引入到最初選擇的序列中)或者通過(guò)使用重組抗體體外親和力成熟的其它方法開(kāi)展進(jìn)一步的親和力成熟。體內(nèi)和體外方法的組合本發(fā)明的抗體同樣可以通過(guò)采用體內(nèi)和體外方法的組合產(chǎn)生，如以下的方法，即最初允許本發(fā)明的RGM蛋白質(zhì)或其衍生物/等效物在宿主動(dòng)物中體內(nèi)作用于抗體谞，以便刺激產(chǎn)生結(jié)合RGM蛋白質(zhì)或者衍生物/等效物的抗體，隨后借助于一種或多種體外技術(shù)開(kāi)展進(jìn)一步的抗體選擇和/或抗體成熟(即優(yōu)化)。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，此組合方法可以包括首先用本發(fā)明的RGM蛋白質(zhì)或其衍生物/等效物免疫非人動(dòng)物(例如小鼠、大鼠、兔、雞、駱駝、山羊或者它們的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或者嵌合體小鼠)以刺激針對(duì)抗原的抗體反應(yīng)，隨后使用來(lái)自淋巴細(xì)胞(其已經(jīng)通過(guò)RGM蛋白質(zhì)或衍生物/等效物體內(nèi)作用而被體內(nèi)刺激)的免疫球蛋白序列產(chǎn)生并篩選噬菌體展示抗體文庫(kù)。該組合方法的第一個(gè)步驟可以以上述方式結(jié)合體內(nèi)方法開(kāi)展，而該方法的第二個(gè)步驟可以以上述方式結(jié)合體外方法開(kāi)展。用于超免疫非人動(dòng)物，然后體外篩選從所刺激的淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的噬菌體展示文庫(kù)的優(yōu)選方法包括由BioSiteInc.所描述的那些，見(jiàn)例如WO98/47343、WO91/17271、美國(guó)專利號(hào)5,427,908和美國(guó)專利號(hào)5,580,717。才艮據(jù)另一實(shí)施方案，組合方法包括首先用本發(fā)明的RGM蛋白質(zhì)或其衍生物/等效物免疫非人動(dòng)物(例如小鼠、大鼠、兔、雞、駱駝、山羊或者其敲除和/或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、或嵌合體小鼠)以刺激針對(duì)RGM蛋白質(zhì)或其衍生物/等效物的抗體反應(yīng)，并且通過(guò)篩選雜交瘤(例如由所免疫動(dòng)物產(chǎn)生)選擇產(chǎn)生具有目的特異性的抗體的淋巴細(xì)胞。抗體基因或者單結(jié)構(gòu)域抗體的基因從所選擇的克隆中分離(通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)克隆方法，如逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))并且體外開(kāi)展親和力成熟，由此改善所選擇抗體(一種或多種)的結(jié)合特性。該方法的第一個(gè)步驟可以以上述方式結(jié)合體內(nèi)方法完成，而該方法的第二個(gè)步驟可以以上述方式結(jié)合體外方法、特別是通過(guò)使用如WO97/29131和WO00/56772中描述的那些體外親和力成熟方法來(lái)完成。在另一個(gè)組合方法中，重組抗體通過(guò)使用技術(shù)人員已知的稱作淋巴細(xì)胞抗體選擇方法(SLAM)的程序從單個(gè)分離的淋巴細(xì)胞中產(chǎn)生，所述方法描述于美國(guó)專利號(hào)5，627，052、WO92/02551以及Babcock，J.S.等，(1996)Proc，Natl.Acad.Sci,USA￡^:7843-7848中。在該方法中，首先非人動(dòng)物(例如小鼠、大鼠、兔、雞、駱駝、山羊或者它們的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、或者嵌合體小鼠)用本發(fā)明的RGM蛋白質(zhì)或者其衍生物/等效物體內(nèi)免疫，以刺激針對(duì)RGM蛋白質(zhì)或衍生物/等效物的免疫反應(yīng)，然后使用抗原特異性的溶血噬斑試驗(yàn)選擇分泌目的抗體的單個(gè)細(xì)胞。為此目的，RGM蛋白質(zhì)或其衍生物/等效物或者結(jié)構(gòu)相關(guān)的目的分子可以使用接頭如生物素與綿羊紅細(xì)胞偶聯(lián)，從而可以通過(guò)溶血噬斑試驗(yàn)鑒定出分泌具有適宜特異性的抗體的各個(gè)單細(xì)胞。在鑒定出分泌目的抗體的細(xì)胞之后，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶-PCR從細(xì)胞中得到輕鏈和重鏈可變區(qū)的cDNA，然后這些可變區(qū)可以在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞如COS或CHO細(xì)胞中與適宜的免疫球蛋白恒定區(qū)(例如人恒定區(qū))相連接表達(dá)。轉(zhuǎn)染該擴(kuò)增的免疫球蛋白序列(來(lái)源于體內(nèi)選擇的淋巴細(xì)胞)的宿主細(xì)胞然后可以進(jìn)行進(jìn)一步體外分析和選擇，例如通過(guò)擴(kuò)增轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以分離表達(dá)具有目的特異性的抗體的細(xì)胞。此外，所擴(kuò)增的免疫球蛋白序列還可以體外操作。6.藥物組合物本發(fā)明還涉及藥物組合物，其包含作為活性物質(zhì)的本發(fā)明的蛋白質(zhì)(RGM蛋白質(zhì)；RGM蛋白質(zhì)結(jié)合配體，如抗RGM蛋白質(zhì)的抗體)或者編碼RGM蛋白質(zhì)的核酸序列，以及如果適當(dāng)?shù)脑捒伤幱幂d體。本發(fā)明的藥物組合物還可以包含至少一種其它的治療劑，例如一種或多種用于治療本文所述疾病之一的其它治療劑?？伤幱幂d體包括所有的溶劑、M介質(zhì)、包衣料、抗微生物劑、張力劑;sj^遲吸收劑等，只要它們是生理相容性的即可?？伤幱幂d體包括例如水、鹽溶液、磷酸緩沖鹽溶液、乳糖、右旋糖、,蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯樹(shù)膠、磷酸釣、藻酸鹽、黃蓍膠、明膠、硅酸釣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、糖漿和曱基纖維素。制劑還可以包含可藥用栽體或常規(guī)賦形劑，如潤(rùn)滑劑，例如滑石、硬脂酸鎂和礦物油；濕潤(rùn)劑；乳化及懸浮劑；防腐劑，如羥苯甲酸甲酯和羥苯曱酸丙酯；抗氧化劑；抗刺激劑；螯合劑；包衣助劑；乳化穩(wěn)定劑膜形成劑；凝膠形成劑；遮味劑，掩蓋氣味的香料，樹(shù)脂類；親水膠體(hydrocolloids);溶劑；增溶劑；中和劑；滲透促進(jìn)劑；色素；季胺類化合物；加脂劑(refattingagent)和富脂劑(superfattingagent);軟膏、霜或油的基質(zhì)；硅氧烷衍生物；擴(kuò)散助劑(spreadingagent);穩(wěn)定劑；殺菌劑；栓劑基質(zhì)；片劑賦形劑如粘合劑、填充劑、潤(rùn)滑劑、崩解劑或包衣劑；拋射劑；干燥劑；遮光劑；增稠劑；蠟；增塑劑；白油。關(guān)于此的安朝一基于吵口在Fiedler,H.P.，LexikonderHilfsstoffeftirPharmazie，KosmetikundangrenzendeGebiete,4thedition，Aulendorf:ECV-Editio-Cantor-Verlag，1996中所述的專業(yè)知識(shí)進(jìn)行。還可參考Hager，sHandbuehderPharmazeutischenPraxis，SpringerVerlag,Heidelberg。藥物組合物可以適用于例如腸胃外施用。為此目的，活性物質(zhì)如抗體優(yōu)選地制備成可注射溶液，其中活性物質(zhì)含量為0.1-250mg/ml?？勺⑸淙芤嚎梢灾苽涑梢后w形式或者凍干形式放置于無(wú)色玻璃小瓶、安瓿瓶中或填充式注射器中作為劑量形式。緩沖液可以包含L-組氨酸(l-50mM，優(yōu)選5"10mM)并且pH值為5.0-7.0、優(yōu)選6.0。其它適宜的緩沖液包括但不限于琥珀酸鈉、檸檬酸鈉、磷酸鈉或磷酸鉀緩沖液。可使用氯化鈉調(diào)節(jié)溶液的張力至濃度0-300mM(對(duì)于液體劑量形式優(yōu)選150mM)。對(duì)于凍干劑量形式，可以包含冷凍保護(hù)劑，例如蔗糖(例如0-10%，優(yōu)選0.5-1.0%(w/w))。其它的適宜冷凍保護(hù)劑包括海藻糖和乳糖。對(duì)于凍干劑量形式，可以包含填充劑，例如甘露醇(例如1-10%,優(yōu)選2-4。/。(w/w))。可以在液體劑量形式和凍干劑量形式中使用穩(wěn)定劑，例如L-甲硫氨酸(例如l-50mM，優(yōu)選5-10mM)。其它的適宜的填充劑包^"氨酸和精氨酸。同樣可以使用表面活性劑，例如聚山梨醇酯80(例如0-0.05%，優(yōu)選0.005-0.01%(w/w))。其它表面活性劑包括聚山梨醇酯20和BRIJ表面活性劑。本發(fā)明的組合物可以采取多種形式。這些形式包括液體劑型、半固體劑型和固體劑型，如液體溶液(例如可注射和可輸注溶液劑、洗劑、滴眼劑和滴耳劑)、脂質(zhì)體、分散劑或混懸劑以及固體劑型如口服散劑、撒布劑(dustingpowder)、顆粒劑、片劑、錠劑、囊劑(sachet)、扁嚢劑(cachet)、包衣片劑、膠嚢劑如硬明膠膠嚢和軟明皿嚢、栓劑或陰道藥物形式、半固體藥物形式如軟膏劑、霜?jiǎng)?jC凝膠、糊劑或貼劑。還可以使用植入遞送裝置以施用本發(fā)明的活性物質(zhì)。優(yōu)選的形式依賴于預(yù)期的施用模式和治療用途。典型地，優(yōu)選可注射或可輸注溶液形式的組合物。適宜的施用途徑是例如腸胃外(例如靜脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、肌內(nèi))。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，活性物質(zhì)通過(guò)靜脈輸注或注射施用。根據(jù)另一優(yōu)選實(shí)施方案，活性物質(zhì)通過(guò)肌內(nèi)或皮下注射施用。治療組合物典型地必須是無(wú)菌的并且在生產(chǎn)和儲(chǔ)存條件下是穩(wěn)定的。組合物可以被配制成溶液、微乳液、分散液、脂質(zhì)體或適宜高活性物質(zhì)濃度的其它有序結(jié)構(gòu)。無(wú)菌注射溶液可以如下產(chǎn)生，即將所需量的活性化合物(例如抗體)，如適當(dāng)?shù)脑?，根?jù)需要與一種上述成分或者上述成分的組合一起加入到適宜溶劑中，然后通過(guò)過(guò)濾除菌。分歉劑通常如下制備，即將活性化合物加入到無(wú)菌載體(vehicle)中，其中載體包含基本的a介質(zhì)和如適當(dāng)?shù)脑捔硗獾乃璩煞?。?duì)于用于制備無(wú)菌注射溶液的無(wú)菌凍干粉末，優(yōu)選的制造方法是真空干燥和噴霧干燥，導(dǎo)致從先前已過(guò)濾滅菌的溶液產(chǎn)生活性成分和如適當(dāng)?shù)脑捚渌谕煞值姆勰??？梢酝ㄟ^(guò)例如使用包衣料如卵磷脂，在M劑的情況下，維持所需的顆粒大小，或者使用表面活性劑來(lái)維持溶液的適當(dāng)流動(dòng)性。注射組合物的延長(zhǎng)吸收可通過(guò)向組合物中摻入延遲吸收的藥劑，如單硬脂酸鹽和明膠來(lái)實(shí)現(xiàn)。雖然皮下注射、靜脈注射或輸注是諸多治療應(yīng)用的優(yōu)選施用方式，但'是本發(fā)明的活性物質(zhì)可以使用技術(shù)人員已知的大量方法施用。技術(shù)人員知道，施用途徑和/或模式依賴于期望的結(jié)果。根據(jù)某些實(shí)施方案，活性化合物可以與保護(hù)化合物不被快速釋放的載體一起制備，例如控釋制劑，包括埋植劑、經(jīng)皮貼劑和^t嚢化遞送系統(tǒng)?？梢允褂蒙锟山到獾纳锵嗳菪跃酆衔?，如乙烯-醋酸乙烯酯、聚酐類、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯類和聚乳酸。制備這些制劑的方法一般是技術(shù)人員已知的，見(jiàn)例如SustainedundControlledReleaseDrugDeliverySystems,J.R.Robinson,編，MarcelDekker，Inc.,NewYork,1978。根據(jù)某些實(shí)施方案，本發(fā)明的活性物質(zhì)可以口服施用，例如在惰性稀釋劑中或者可吸收的可食載體中。活性物質(zhì)(和如需要話其它成分)也可以包在硬或軟明皿囊中、壓制成片劑或者直接加入到食物中。對(duì)于口服治療施用，可以將活性物質(zhì)與賦形劑混合并以可吞咽片劑、口含片劑、膠嚢劑、酏劑、混懸劑、糖漿劑等形式使用。如果本發(fā)明的活性成分?jǐn)M通過(guò)非腸胃外的途徑施用，則可能需要選擇1^止其失活的包衣材料。本發(fā)明的活性物質(zhì)可以與一種或多種可以用于治療上述疾病的另外的治療劑一起施用。本發(fā)明的藥物組合物通常包含治療有效量或者預(yù)防有效量的至少一種本發(fā)明的活性物質(zhì)。可以依據(jù)期望的治療、如是否期望治療性治療還是預(yù)防性治療來(lái)選擇和調(diào)整劑量方案。例如，依賴于治療狀況的需要，可以施用單一劑量、分布于一段時(shí)間內(nèi)的多次分開(kāi)的劑量或者增加的或降低的劑量。特別有利的是配制成單位劑量形式的腸胃外組合物以利于施用和保證劑量的一致性。治療醫(yī)師能夠容易地確定對(duì)于特定治療和特定活性物質(zhì)而言最適合的劑量形式、施用方式和劑量。治療有效量或者預(yù)防有效量的本發(fā)明活性物質(zhì)可以是例如在0.1-20mg/kg、并且優(yōu)選l-10mg/kg范圍內(nèi)，但不限于此。當(dāng)然，這些量可以隨待緩解的疾病狀況的性質(zhì)和嚴(yán)重程度而變化。6.2疫苗本發(fā)明的RGM蛋白質(zhì)和其衍生物/等效物可以用作免疫原，用于對(duì)待治療患者進(jìn)行疫苗接種。可用于該目的的疫苗一般是包含至少一種本發(fā)明RGM蛋白質(zhì)和/或至少一種其衍生物/等效物的藥物組合物。該組合物還可以包含生理耐受性栽體和如適當(dāng)?shù)脑捚渌x形劑，例如免疫刺激劑。雖然原則上可以按希望選擇適宜的載體，但是載體的性質(zhì)通常由施用途徑所控制。因此，本發(fā)明的疫苗特別可以配制成適宜腸胃外，例如靜脈內(nèi)施用、肌內(nèi)施用和皮下施用的形式。在這些情況下，載體優(yōu)選包含水、鹽溶液、醇、脂肪、蠟和/或緩沖液?？梢栽诒景l(fā)明的疫苗中使用大量免疫刺激劑中的任何一種。例如可以包括佐劑。大多數(shù)佐劑包含旨在保護(hù)抗原免受快速降解的物質(zhì)，如氫氧化鋁或礦物油、和矛汙生自脂質(zhì)A、百日咳博德特菌(Bordetellapertussis)或結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)的蛋白質(zhì)。適宜的佐劑通常可以商業(yè)性獲得，例如完全或不完全弗氏佐劑；AS-2;鋁鹽如氫氧化鋁(根據(jù)需要以凝膠的形式)或磷酸鋁；鈣、鐵或鋅鹽；?；野彼岬牟蝗苄詰腋∫海货；穷悾魂?yáng)離子或陰離子衍生的多糖；聚磷腈；生物可降解微球；單磷酰脂A。細(xì)胞因子如GM-CSF或白細(xì)胞介素-2、白細(xì)胞介素-7或白細(xì)胞介素-12同樣可用作佐劑。7.治療方法7.1.神經(jīng)元疾病的治療現(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)公開(kāi)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的情況中觀察到RGM蛋白質(zhì)在損害部位積累(參見(jiàn)Schwab等，見(jiàn)上引文)。同時(shí)，受損神經(jīng)纖維的重新向外生長(zhǎng)由此凈皮抑制。對(duì)神經(jīng)纖維生長(zhǎng)的這種有害影響是通過(guò)RGM與受體分子再生蛋白的結(jié)合介導(dǎo)的。因此，調(diào)節(jié)、特別是抑制RGM與受體分子再生蛋白的相互作用將適用于消除RGM對(duì)神經(jīng)纖維生長(zhǎng)的抑制活性。7.2.腫瘤病的治療長(zhǎng)期以來(lái)有跡象表明，再生蛋白與腫瘤病的發(fā)生和/或*可能存在因i果關(guān)聯(lián)。因此，例如Meyerhardt等在Oncogene(1997)14，1129-1136中報(bào)道，在多于50種所研究的癌細(xì)胞系中可以檢測(cè)到再生蛋白，所述細(xì)胞系包括成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞系，以及來(lái)自結(jié)腸直腸癌、乳腺癌、胰腺癌和宮頸癌的細(xì)胞系。在食管癌細(xì)胞系中也觀察到再生蛋白的過(guò)表達(dá)(Hue等，ClinicalCancerResearch(2001)7，2213-2221)。最近對(duì)3588個(gè)基因在211例肺腺癌患者中的表達(dá)語(yǔ)的全面研究提供了又一證據(jù)，表明再生蛋白參與腫瘤病的發(fā)生展和進(jìn)程(Berrar等，J.Comput.Bio1.(2005)12(5)，534-544)。由于還已知RGM可以通過(guò)結(jié)合至腫瘤細(xì)胞相關(guān)再生蛋白受體而阻止細(xì)胞死亡從而表現(xiàn)出潛在的肺瘤促進(jìn)作用(Matsunaga等，NatureCellBiol.6，749-755，2004)，因此可以通過(guò)調(diào)節(jié)RGM-再生蛋白的相互作用、特別是通過(guò)借助于特異性抗RGM的抗體阻斷這種相互作用而建立治療腫瘤病的新的治療方法。7.3.鐵代謝障礙的治療RGMC，也稱作血幼素，對(duì)人和動(dòng)物的鐵代謝必不可少。年輕型血色素沉著病是遺傳性的、相對(duì)罕見(jiàn)的鐵代謝障礙，其表現(xiàn)為身體中鐵超負(fù)荷。這種障礙是由于血幼素分子中的突變?cè)斐傻?參見(jiàn)Huang等，TheJournalofClinicalInvestigation(2005)，115，2087-2091)。因此，本發(fā)明的功能性RGM蛋白質(zhì)或其活性結(jié)構(gòu)域的施用是一種緩解此類鐵代謝障礙的有用的治療方法。7.4.促進(jìn)骨組織形成在現(xiàn)有技術(shù)中有跡象表明，RGM蛋白質(zhì)家族的一個(gè)成員，具體地RGMB(也稱作DRAGON)參與骨形態(tài)發(fā)生。因此，例如Samad等在出版中的JBC論文(2005年1月25日版)中描述了DRAGON與骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)的I型和II型受體的相互作用。因此，可以想到通過(guò)施用本發(fā)明的RGM多肽產(chǎn)生促進(jìn)骨生長(zhǎng)的作用，并因此產(chǎn)生一種新的治療具有受損的骨生長(zhǎng)的疾病或骨損傷的方法。8.診斷方法物以及抗它們的抗體。因此，本發(fā)明通過(guò)檢測(cè)疾病典型抗原或抗體使得尤其可以定性或定量改進(jìn)地確定上述的病理狀態(tài)。所述確定優(yōu)選使用免疫學(xué)方法實(shí)現(xiàn)。原則上，這可以使用任何采用抗體的分析或診斷測(cè)試方法。這些方法包括凝集和沉淀技術(shù)、免疫測(cè)定法、免疫組織化學(xué)方法和免疫印跡技術(shù)，例如Western印跡或點(diǎn)印跡方法。還包括體內(nèi)方法，例如成4象方法。使用免疫測(cè)定法是有利的。適用的方法是竟?fàn)幮悦庖邷y(cè)定法和夾心免疫測(cè)定法，竟?fàn)幮悦庖邷y(cè)定法即抗原和標(biāo)記的抗原(示蹤物)竟?fàn)幣c抗體結(jié)合，夾心免疫測(cè)定法即使用通常是標(biāo)記的第二抗體檢測(cè)特異性抗體與抗原的結(jié)合。這些測(cè)定法可以是均相的，即不分成固相和液相，或者是多相的，即例如通過(guò)與固相結(jié)合的抗體將結(jié)合的標(biāo)記物與未結(jié)合的標(biāo)記物分離。各種多相和均相免疫測(cè)定形式可以4艮據(jù)標(biāo)記和測(cè)定方法歸于特定類型，例如RIA(放射免疫測(cè)定法)、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法)、FIA(熒光免疫測(cè)定法)、LIA(發(fā)光免疫測(cè)定法)、TRFIA(時(shí)間分辨FIA)、IMAC(免疫活化)、EMIT(酶擴(kuò)大免疫測(cè)定法)、TIA(免疫濁度測(cè)定法)、I-PCR(免疫-PCR)。對(duì)于本發(fā)明的抗原測(cè)定優(yōu)選竟?fàn)幟庖邷y(cè)定法。在該情況下，標(biāo)記的抗原(示蹤物)與樣品中待定量的抗原竟?fàn)幣c所使用的抗體結(jié)合?？乖牧浚礃悠分锌乖牧靠梢越柚跇?biāo)準(zhǔn)曲線根據(jù)置換出的示蹤物的量確定。在可以得到的用于這些目的的標(biāo)記物當(dāng)中，酶被證明是有利的。例如可以使用基于過(guò)氧化物酶，特別是辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶和(3-D-半乳糖苷酶的系統(tǒng)。這些酶的特異底物是可以得到的，并且可以通過(guò)例如光度測(cè)定法追蹤底物的轉(zhuǎn)化。適宜的底物系統(tǒng)基于用于堿性磷酸酶的對(duì)硝基苯基磷酸(p-NPP)、5-溴-4-氯-3-P引哚基磷^/硝基藍(lán)四氮唑(BCIP/NPT)、堅(jiān)牢紅/萘酚-AS-TS磷酸；用于過(guò)氧化物酶的2，2-聯(lián)氮基雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)、鄰苯二胺(OPD)、3，3，，5，5，-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、鄰聯(lián)茴香胺、5-氨基水楊酸、3-二甲氨基苯甲酸(DMAB)和3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙(MBTH);用于P-D-半乳糖苷酶的鄰硝基苯基(3-D-半乳糖苷(o-NPG)、對(duì)硝基苯基P-D-半乳糖苷和4-甲基馓形基(lumbdlifer)卩-D-半乳糖苷(MUG)。這些底物系統(tǒng)在多數(shù)情況下是以即用的形式商業(yè)可得的，例如以片劑的形式，所述形式也可以包含另外的試劑，如適宜的緩沖液等。為制備示蹤物，將標(biāo)記物與肽或抗體偶聯(lián)可以以本身已知的方式開(kāi)展。此外，可以得到許多為了與蛋白質(zhì)綴合而被有利修飾的標(biāo)記物，例如生物素一、親和素-、extravidin-或鏈霉親和素-綴合的酶、馬來(lái)酰亞胺活化的酶等。這些標(biāo)記物可以與待根據(jù)本發(fā)明使用的分子直接反應(yīng)。如果選擇多相免疫測(cè)定方式，為了分離的目的，可以例如通過(guò)偶聯(lián)至支持物上的抗獨(dú)特型抗體，例如抗兔IgG的抗體，使抗原-抗體復(fù)合物結(jié)合至支持物上。用適當(dāng)抗體包被的支持物、特別是微量滴定板是已知的并且是商業(yè)可得的。本發(fā)明還涉及具有至少一種上述抗體和另外成分的免疫測(cè)定包(set)。這包含通常表現(xiàn)為單元包(packunit)形式的一組用于開(kāi)展本發(fā)明測(cè)定的工具的集合。為了使使用最大可能簡(jiǎn)化，這些工具優(yōu)選以基本上即用的形式提供。一種有利的配置是通過(guò)免疫測(cè)定試劑盒提供的。試劑盒通常包含多個(gè)容器用于將成分分開(kāi)放置。所有成分均可以以即用的稀釋形式，用于稀釋的濃縮物形式或者以用于溶解或懸浮的干物質(zhì)或凍干物形式提供；單個(gè)成分或者全部成分可以冷凍或者儲(chǔ)存在環(huán)境溫度下直至使用。血清優(yōu)選驟激冷凍(shock-frozen),例如于-20。C下，以致于在這些情況下，免疫測(cè)定包必須優(yōu)選保存在冷凍溫度下直至使用。加入到免疫測(cè)定包中的另外的成分可以是標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)、示蹤物、對(duì)照血清、微量滴定板(優(yōu)選用抗體包被)、緩沖液(例如用于測(cè)試、用于洗滌或者用于底物反應(yīng))以及酶底物本身。免疫測(cè)定法的一般原理以及抗體的產(chǎn)生和在實(shí)驗(yàn)室和臨床上的用途可以在例如Antibodies,ALaboratoryManual(Harlow，E.和Lane，D.編，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY，1988)中找到。9.篩選方法本發(fā)明還涉及用于檢測(cè)RGM受體再生蛋白的效應(yīng)物的方法，其中將懷疑存在效應(yīng)物的樣品與RGM蛋白質(zhì)或多肽一起孵育并且研究混合物中效應(yīng)物-RGM蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成。此類效應(yīng)物可以具有激動(dòng)、部分激動(dòng)、拮抗或反向激動(dòng)作用。它們可以是例如合成的低分子量物質(zhì)、合成肽、天然的或合成的抗體分子或者天然物質(zhì)。本發(fā)明的此類方法通?？梢宰鳛轶w外篩選方法開(kāi)展，使用該方法可以從大量不同物質(zhì)中選擇出最有希望未來(lái)使用的物質(zhì)。例如，可以通過(guò)組合化學(xué)的手段構(gòu)建包含大量潛在活性物質(zhì)的龐大物質(zhì)文庫(kù)。在組合物質(zhì)文庫(kù)中篩選具有期望活性的物質(zhì)可以通過(guò)自動(dòng)化實(shí)現(xiàn)。使用機(jī)器人篩選設(shè)備可以有效評(píng)價(jià)優(yōu)選安排在微量滴定板上的各個(gè)測(cè)定。因此，本發(fā)明還涉及篩選方法，即初級(jí)篩選方法和次級(jí)篩選方法，在其中優(yōu)選使用至少一個(gè)下述方法。如果使用多個(gè)方法，可以連續(xù)或者同時(shí)在同一個(gè)樣品上或者在待研究物質(zhì)的不同樣品上進(jìn)行。實(shí)施此類方法的一項(xiàng)有效技術(shù)是閃爍親近測(cè)定法(scintillationproximityassay)，縮寫成SPA，其在活性物質(zhì)篩選領(lǐng)域是已知的。用于開(kāi)展此分析的試劑盒和成分可以商業(yè)購(gòu)買，例如從AmershamPharmaciaBiotech購(gòu)買。原理上，將溶解的或膜結(jié)合的受體固定于包含閃爍體的小的焚光微球上。例如，如果放射性配體結(jié)合至固定的受體上，因?yàn)殚W爍體和放射性配體空間接近，則閃爍體被激發(fā)而發(fā)射出光。開(kāi)展此類方法的另一個(gè)有效技術(shù)是活性物質(zhì)篩選領(lǐng)域已知的FlashPlateR技術(shù)。用于開(kāi)展此分析的試劑盒和成分可以商業(yè)購(gòu)買，例如從NENLifeScienceProducts購(gòu)買。該原理同樣基于用閃爍體包被的微量滴定板(96孔或者384孑L)。本發(fā)明同樣涉及可以通過(guò)這些方法鑒定的物質(zhì)或者物質(zhì)混合物的部分?，F(xiàn)在，本發(fā)明參考下列非限制性的制備和用途實(shí)施例更加詳細(xì)地解釋。實(shí)驗(yàn)部分1.一般信息分析方法l:在神經(jīng)元向外生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)中使用大鼠皮層神經(jīng)元證明RGM肽的作用通過(guò)開(kāi)展神經(jīng)元向外生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)研究RGM肽的體外作用。為此目的，使用下列培養(yǎng)基制備大鼠皮層神經(jīng)元|&存培養(yǎng)基每升90mlGB5，100ml極限必需培養(yǎng)基—Eagk(10x;Gibco，訂貨號(hào)21430.020)，用Millipore水調(diào)節(jié)至1000ml。pH7.0,280-310mosm。GB5:每升26.6gNaHC03，44.4g葡萄糖，過(guò)濾除菌。平板培養(yǎng)基(PM):每升0.8mM谷氨酰胺，100ml熱滅活的胎牛血清(FCS)，100ml熱滅活的馬血清，用貯存培養(yǎng)基調(diào)節(jié)至1000ml。維持培養(yǎng)基(MM)每升0.8mM谷氨酰胺，100ml熱滅活的馬血清，用貯存培養(yǎng)基調(diào)節(jié)至1000ml。胰蛋白酶溶液在PBS中的0.1%胰蛋白酶，0.04%EDTA,無(wú)鉤/鎂，過(guò)濾除菌。頸脫臼法處死懷孕大鼠，打開(kāi)腹腔，取出帶有胚胎的子宮(胎齡18天(E18))并用PBS洗滌，由此得到皮層神經(jīng)元。使用顯微解剖剪縱向切開(kāi)子宮，取出并暴露胚胎。通過(guò)割喉處死胚胎，取出腦并且解剖前腦皮層。皮層在1ml0.1%濃度的胰蛋白酶溶液中37°C孵育5分鐘，用維持培養(yǎng)基(MM)終止反應(yīng)，在總共10ml的MM中孵育5分鐘后，用帶有漸減管口直徑的尖端火焰拋光的巴斯德吸管研磨。細(xì)胞懸液于1200轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，并且上清液i皮吸出并丟棄。向細(xì)胞沉淀中加入8mlMM并且小心地重懸。在Neubauer計(jì)數(shù)板中計(jì)數(shù)細(xì)胞，并且在MM中將細(xì)胞數(shù)量調(diào)整至大約400000個(gè)細(xì)胞/0.2ml并預(yù)聚集。為此目的，將每孔200jul的細(xì)胞懸液置于玻璃室載玻片上(LabTek，訂貨號(hào)H7402)并于37°C孵育24h。在此過(guò)程中形成神經(jīng)元聚集物。將10-80^的此聚集物鋪于聚D-賴氨酸包被的96孑L板(例如BectonDickinsonBiocoat96孑Lblackplate#354640)的每一孔中，并且根據(jù)需要用MM補(bǔ)足至70-卯pl。l小時(shí)后，加入10pl體積的各種濃度的RGM肽并且根據(jù)需要用MM補(bǔ)足至100pl。24-48h后，首先通過(guò)在光學(xué)顯孩史鏡下檢查來(lái)評(píng)定軸突的向外生長(zhǎng)，然后培養(yǎng)物通過(guò)加入100pi的4%多聚甲醛溶液來(lái)固定并于4°C儲(chǔ)存至少12小時(shí)。通過(guò)免疫熒光染色制備^:管蛋白細(xì)胞骨架的所有步驟，除了與一級(jí)抗體的孵育之外均在室溫下進(jìn)4亍。將孔用100-300piPBS洗滌一次5-15分鐘，然后在100pi0.1%TritonX-100中孵育10-20分鐘以透化細(xì)胞?？子?00piPBS洗滌兩次5-15分鐘，然后與100piPBS中的1%牛血清白蛋白溶液孵育60分鐘。一級(jí)抗體(例如Sigma,單克隆抗P-微管蛋白同種型III克隆SDL3D10，#T8660;Abcam，TuJI弁abl4545)用PBS中的1%牛血清白蛋白溶液以1:1000稀釋，并且以每孔50pi于4。C孵育過(guò)夜。將孔用100-300的PBS洗滌三次，5-15分鐘。熒光標(biāo)記的二級(jí)抗體(JacksonImmunoResearch,Cy3綴合的親和純化驢抗小鼠抗體#715-165-151)用PBS中的1%牛血清白蛋白溶液以1:500稀釋，所述溶液還包含0.5pg/ml雙苯甲亞胺(bisbenzimide，H33258)以便顯示細(xì)胞核，每孔50jtl的該稀釋溶液于室溫醉育1-2小時(shí)或者于4°C孵育過(guò)夜。孔用100-300piPBS洗滌兩次，5-15分鐘，吸掉PBS，向每個(gè)孔中加入一滴(約50pl)FluoromouiitG(SouthernBiotechnologyAssociatesInc#010001)。在倒置熒光顯微鏡(Zeiss，Axiovert200M)中記錄圖^^，在每一情況下均檢測(cè)所標(biāo)記的二級(jí)抗體的熒光和雙苯甲亞胺的熒光。借助于圖像分析程序(MediaCybernetics,Image-ProPlus)確定兩種熒光所覆蓋的面積。為了確定軸突生長(zhǎng)指數(shù)(AG-I)，計(jì)算二級(jí)抗體染色(染色向外生長(zhǎng)的軸突和細(xì)胞聚集物)與雙苯甲亞胺染色(染色細(xì)胞聚集物)的面積差并且除以雙苯甲亞胺染色的面積。因此，該指數(shù)是軸突所覆蓋面積相對(duì)于細(xì)胞聚集物大小的度量。分析方法2:在神經(jīng)元生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)中利用人皮層神經(jīng)元證明RGM肽的作用人多能性癌細(xì)胞系Ntera(DSMZACC527)是一個(gè)已建立的細(xì)胞培養(yǎng)物模型。在本例中，軸突從細(xì)胞聚集物中生長(zhǎng)出來(lái)并且圍繞相應(yīng)聚集物形成軸突冠。為此目的，將2.5x106個(gè)Ntera細(xì)胞接種于175cm2瓶中并且在10nM^見(jiàn)黃酸(Sigma)(培養(yǎng)基D-MEM(Gibco/Invitrogen31966-021)，10%胎牛血清，100u/ml青霉素，100照/ml鏈霉素(均來(lái)自Gibco/Invitrogen))中分化3周。然后將分化的細(xì)胞以1:6分到新的瓶中并且在無(wú)視黃酸的情況下再培養(yǎng)2天。附著在所得的細(xì)胞層上的神經(jīng)元細(xì)胞通過(guò)去覆蓋(capping)而分離并且通過(guò)在搖瓶中Neurobasal培養(yǎng)基(Neurobasal培養(yǎng)基(Gibco/Invitrogen21103-049),2mML-谷氨酰胺(Gibco/Invitrogen25030-024)，100u/ml青霉素，100照/ml鏈霉素(均來(lái)自Gibco/Invitrogen))中緩慢搖動(dòng)過(guò)夜(在孵育箱中)而聚集。次日，將Ntera聚集物接種于聚D-賴氨酸和層粘連蛋白(Sigma)(10ng/ml)包被的96孑L平板(BiocoatPoly-D-LysineCelhvare96-WellBlack/ClearPlate(BectonDickinson#356640)中。通過(guò)加入不同濃度的待測(cè)試物質(zhì)《—斤RGM肽和片段的抑制作用。分析方法3:RGMA-再生蛋白結(jié)合試驗(yàn)a)材料ImmunoPlate:Cert.MaxiSorpF96(NUNC，439454)重組人RGMA，R&DSystems;產(chǎn)品號(hào)2495-RM(260照/ml)重組人再生蛋白Fc，Abbott;Ludwigshafen(ALU1514/122;425照/ml)過(guò)氧化物酶綴合的、親和純化的小鼠抗人IgGFc片段Ab(JacksonImmunoResearch,Code:209-035-098(0.8mg/ml))顯色底物ImmunoPureTMB底物試劑盒(Pierce，#34021)硫酸(Merck，#4.80354.1000)b)方法1.RGMA結(jié)合至immunoplate:50mMNa2C03中的2.5照/mlRGMA(R&D)(50pl/孔)37。C孵育1小時(shí)2.洗滌步驟用PBS/0.02%Tween20(100pl/孑L)洗滌3次3.非特異性結(jié)合位點(diǎn)的封閉用PBS/0.02%Tween中的3%BSA(200pl/孔)封閉37。C孵育1小時(shí)4.再生蛋白結(jié)合加入在1%BSAPBS/0.02%Tween中稀釋的(最初濃度1照/ml)再生蛋白37。C孵育1小時(shí)5.洗滌步驟用PBS/0.02%Tween20(100pl/孑L)洗滌3次6.所結(jié)合再生蛋白的抗體檢測(cè)加入HRP偶聯(lián)的小鼠抗人IgGFc片段Ab(在PBS/1%BSA中以1:2500稀釋)(50jniy孔)37。C孵育l小時(shí)一-丄、a，v*7.沈欲，銀用PBS/0.02%Tween20(100j^l/孔)洗滌3次8.顯色加入50^U/孔顯色底物(ImmimoPureTMB底物，Pierce)室溫孵育1-30分鐘用50pi2.5MH2SCV孔終止反應(yīng)2.制備實(shí)施例制備實(shí)施例1:在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中制備RGMA蛋白質(zhì)片段為了在軸突生長(zhǎng)和再生蛋白結(jié)合分析試驗(yàn)方法中表征活性RGMA結(jié)構(gòu)域，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞(HEK293)中以AP融合蛋白形式表達(dá)了RGMA(AA168-422)和70-80個(gè)氨基酸大小的RGMA片段(片段1:169-238;片段2:218-284;片段3:266-335;片段4:316-386;片段5:369-238;和片段6:168-422))。為此目的，將編碼各個(gè)片段的DNA克隆進(jìn)栽體pDESTAP/ccdb/Myc/His(Invitrogen，GatewayVektorSystem)(AP-堿性磷酸酶；PPC-前切割蛋白酶(PreScissonprotease))。為此目的，通過(guò)PCR從RZPD克隆(克隆AL136826(DKFZp434D0727);公布的RZPD序歹'J:BC015886,AL136826))擴(kuò)增編碼各個(gè)片段的DNA。下列寡核苷酸用于該目的片段169-238:GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTTCTGGAA(3TTCTGTTCCAGGGGCCCCCACACCTCAGGACTTTCACCGAC(SEQIDNO:11)G(3GGACCACTTTGTACAAGAAAGCTG(5GTC3CTCGTCCATCTCAGCCTGGTACACC(SEQIDNO:12>片段218-284:GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGfCTTTCTGGAAGTTCTGTTCCAGGGGCCCATrATrTTCAAGAACTTCCAGGAGTGTG(SEQIDNO'13>,wbmobAbe^GCCCATCATC^GGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGGCGCACCACGATGGTGGTG卿IDNO:片段316-386:GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTTCTGGAAGTTCTGTTCCAGC3GGCCCTCAGGCCAGCACGTGGAGATCC(SEQIDNCM5)^'t^AGQGG^G右CCAC^GTACMG媒GCTGGGTCCTCAGCATTGGTGTGGAAGGCC(SEQ,D片段266-335:GGGGACAAGTTrGTACAAAAAAGCAGGCTTTCTGGAAGTTCTGTTCCAGGGGCCCCTGCGGGGCTGCCCCCTC(SEQIDNO:17)GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCGCCCGTGGTGAGGAGGTCG(SEQIDNO:18)片段368-422:GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTTCTGGAAGTTCTGTTCCAGGGGCCCCTGCCGGTGGAGGACCTGTAC(SEQIDNO:19>GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTGCCTGGCAGGTCCCGAGTC(SEQIDNO:20)片段169-422:GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTTCTGGAAGTTCTGTTCCAGGGGCCCCCACACCTCAGGACTTTCACCGAC(SEQIDNO:21)GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTGCCTGGCAGGTCCCGAGTC(SEQIDNO:22)通過(guò)特異性重組(attLxattR)將得到的PCR產(chǎn)物克隆入載體pDESTAP/ccdb/Myc/His，并且通過(guò)測(cè)序檢查正確序列。HEK293細(xì)胞(ATCCCRL1573)用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。為此，在轉(zhuǎn)染前一天，將細(xì)胞以80%的密度接種于15cm平板中。次日，按照廠商的方法將DNA與Lipofectamine2000(Invitrogen)混合，并與細(xì)胞孵育12小時(shí)。隨后在選擇培養(yǎng)條件下(D-MEM(Gibco/Invitrogen31966-021)，10%胎牛血清，100u/ml青霉素，100jiig/ml鏈霉素(均來(lái)自Gibco/Invitrogen)，150照/mlzeocin/Invitrogen)再培養(yǎng)4周，之后通過(guò)檢測(cè)生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的堿性磷酸酶來(lái)選擇穩(wěn)定表達(dá)的克隆。為了產(chǎn)生蛋白質(zhì)，將穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中擴(kuò)增，當(dāng)達(dá)到70%匯合時(shí)，轉(zhuǎn)移至生產(chǎn)培養(yǎng)基中(Pro293培養(yǎng)基(BioWhittaker/Cambrex，12-764Q),2mM谷氨酰胺(Invitrogen))。在再培養(yǎng)4天后，收獲生產(chǎn)培養(yǎng)基，去除細(xì)胞碎片并且通過(guò)膜濃縮器(Vivaspin30)濃縮。然后，所表達(dá)的AP-RGM融合蛋白通過(guò)Ni-螯合親和層析從上清液中純化。為此目的，Ni-NTA-瓊月旨(Qiagen)在緩沖液A(50mMHEPES-KOH，lOOmMNaCl,10%甘油，10mM咪唑)中平衡。然后，濃縮的上清液與Ni-NTA-瓊脂在旋轉(zhuǎn)情況下于4°C孵育1小時(shí)。通過(guò)離心將Ni-NTA-瓊脂洗滌三次，然后用洗脫緩沖液(含250mM咪峻的緩沖液A)洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)。借助于斑點(diǎn)印跡、SDS-PAGE和Western印跡分析開(kāi)展對(duì)蛋白質(zhì)的分析。通過(guò)Bradford蛋白質(zhì)測(cè)定和AP濃度的ELISA測(cè)定來(lái)確定濃度。3.示例性實(shí)施方案示例性實(shí)施方案1:用表達(dá)再生蛋白的HEK293細(xì)胞分析片段b)—般先前已知，雞的活性RGMA蛋白質(zhì)的生長(zhǎng)抑制活性位于M酸位置150和350之間的區(qū)域。因此制備了覆蓋該范圍的人RGMA蛋白質(zhì)片段。在其表面上內(nèi)源性攜帶RGM受體的HEK293細(xì)胞用這些片段轉(zhuǎn)染，以便制備產(chǎn)生各個(gè)蛋白質(zhì)片段并且將它們釋放進(jìn)入培養(yǎng)基中的克隆化細(xì)胞培養(yǎng)物。所有片段均作為與堿性磷酸酶連接的融合蛋白質(zhì)產(chǎn)生。在這些細(xì)胞中活性結(jié)構(gòu)域的存在應(yīng)使其本身可以通過(guò)較低的細(xì)胞增殖、增加的細(xì)胞死亡和/或改變的細(xì)胞-基底粘附而被注意到。當(dāng)然，增加的細(xì)胞死亡和較差的增殖對(duì)活性片段的產(chǎn)生量具有直接的影響。所產(chǎn)生片段的量借助于半定量斑點(diǎn)印跡試驗(yàn)評(píng)定。b)方法將在制備實(shí)施例1中所制備的RGMA片段導(dǎo)入HEK293細(xì)胞。在培養(yǎng)基(D-MEM(Gibco/Invitrogen31966-021)，10%胎牛血清，100u/ml青霉素，100照/ml鏈霉素(均來(lái)自Gibco/Invitrogen)，150照/mlzeocin(Invitrogen))中培養(yǎng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞至匯合。然后，將1ml培養(yǎng)上清通過(guò)狹縫印跡槽中的硝酸纖維素膜(Sartorius)過(guò)濾。固定在膜上的AP-RGM融合蛋白通過(guò)檢測(cè)堿性磷酸酶活性(通過(guò)將硝酸纖維素膜與NBT/BCIP底物(Roche)孵育)檢測(cè)。所產(chǎn)生的活性片段的量借助于半定量斑點(diǎn)印跡試驗(yàn)確定。基于該分析試驗(yàn)，穩(wěn)定的細(xì)胞克隆被分成下列幾類-強(qiáng)生產(chǎn)性細(xì)胞克隆(S生產(chǎn)者)-適度強(qiáng)生產(chǎn)性克隆-弱生產(chǎn)性克隆-非生產(chǎn)性克隆(O生產(chǎn)者)。此外，確定了強(qiáng)生產(chǎn)性克隆與非生產(chǎn)性克隆的比率。c)結(jié)果對(duì)于所分析的各個(gè)RGMA片段得到下列數(shù)值片段比率強(qiáng)生產(chǎn)性細(xì)胞克隆的<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>在該分析試驗(yàn)中片段3和6尤其顯示具有顯著的活性。示例性實(shí)施方案2:在神經(jīng)纖維生長(zhǎng)分析試驗(yàn)中研究合成的RGMA肽為此目的，合成了下列RGMA肽并且在上述的神經(jīng)纖維生長(zhǎng)分析試驗(yàn)中(分析方法1和分析方法2)分析不同濃度的RGMA肽肽1:AA267-285肽2:AA308-325肽3:AA358-377肽4:AA378-400(編號(hào)基于SEQIDNO:2)在目前所分析的肽當(dāng)中，肽1可靠地且可重復(fù)地顯示抑制活性。因此可以推測(cè)肽l(AA267-285)形成了RGM蛋白質(zhì)的活性結(jié)構(gòu)域的一部分。實(shí)驗(yàn)結(jié)果示于圖3A,B，C和4A，B。圖3A顯示，與肽4相比，在用大鼠神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中(分析方法1)，10照/ml濃度的肽1明顯抑制神經(jīng)纖維生長(zhǎng)。圖3B表明不同濃度(0-30pg/ml)的肽1對(duì)皮層神經(jīng)元神經(jīng)纖維生長(zhǎng)的影響。在大于3pg/ml和更高的濃度時(shí)可檢測(cè)到顯著的抑制活性。與^目反，在相同條件下肽4沒(méi)有顯示出活性(參見(jiàn)圖3C)(AG-I=軸突生長(zhǎng)指數(shù)，相當(dāng)于神經(jīng)元聚集物與相關(guān)軸突的總面積減去聚集物的面積)。圖4A表明，肽1而非肽4在30照/ml的濃度時(shí)(分析方法2)顯著抑制人Ntera細(xì)胞的神經(jīng)纖維生長(zhǎng)。圖4B表明所觀察到的肽1的抑制作用具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。示例性實(shí)施方案3:在神經(jīng)纖維生長(zhǎng)分析試驗(yàn)中研究合成的RGMA片段在軸突生長(zhǎng)試驗(yàn)(參見(jiàn)上面的分析方法2)中使用人Ntera神經(jīng)細(xì)胞分析了如制備實(shí)施例1中制備的并列于下面的6個(gè)不同的RGMA片段的抑制活性。片段l:氨基酸169-238片段2:氨基酸218-284片段3:氨基酸266-335片段4:氨基酸316-386片段5:^J^酸369-422片段6:氨基酸168-422(每一例中的編號(hào)基于SEQIDNO:2)結(jié)果總結(jié)于后附的圖5A，B和C。在Ntera向外生長(zhǎng)試驗(yàn)中，總共分析了6個(gè)不同的RGMA片段。片度2，3和6具有活性，而片段l，4和5不具有活性。片段6對(duì)應(yīng)于活性的、完全加工的RGMA蛋白質(zhì)(其也已經(jīng)在體內(nèi)描述過(guò))。從這些資料中可以知道，人RGMA蛋白質(zhì)的重要的神經(jīng)纖維生長(zhǎng)抑制性結(jié)構(gòu)域位于片段2和3的區(qū)域中，即在^J^酸218和335之間。為了更準(zhǔn)確地表征該抑制性結(jié)構(gòu)域，因此在下一步中分析來(lái)自片段2和3的區(qū)域中的短RGMA肽。示例性實(shí)施方案4:在神經(jīng)纖維生長(zhǎng)分析試驗(yàn)中研究合成的RGMA肽在軸突生長(zhǎng)分析試驗(yàn)中(參見(jiàn)上面的分析方法2)分析下表中所示的肽。表合成與肽1鄰近的RGMA肽并且用于軸突生長(zhǎng)分析試驗(yàn)中<table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table>在示例性實(shí)施方案2中已經(jīng)分析了肽1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果示于圖6A和B。在Ntera生長(zhǎng)分析試驗(yàn)中，在所分析的RGMA肽當(dāng)中有三個(gè)導(dǎo)致神經(jīng)纖維生長(zhǎng)極大降低(圖6A)。這些活性RGMA肽是如下肽肽1、肽down-l和肽up-l。無(wú)活性或僅微弱活性的肽是下列肽肽5-Ak，肽6-Ak和肽7-Ak(圖6B)。這表明，RGMA的抑制性結(jié)構(gòu)域之一位于由三個(gè)活性RGMA肽固定下來(lái)的區(qū)域，即大約從位置250延伸至300的人RGMA蛋白質(zhì)區(qū)域，特別是大約260-291，因此包括從位置267至285的核心區(qū)(參見(jiàn)SEQIDNO:7，8)。基于肽6-Ak和7-Ak的活性(該兩個(gè)肽顯示在較高的肽濃度下具有抑制生長(zhǎng)的趨勢(shì)(圖6B))，完全可以想到RGMA具有其它的抑制性結(jié)構(gòu)域并且因此本發(fā)明也涉及位于大約210-260和大約290-350區(qū)域中的結(jié)構(gòu)域。示例性實(shí)施方案5:用抗體中和RGMA的抑制性結(jié)構(gòu)域該實(shí)驗(yàn)的目的是檢查針對(duì)RGMA抑制性結(jié)構(gòu)域的活性肽產(chǎn)生的多克隆抗體是否能夠阻斷RGMA與其受體再生蛋白的相互作用以及是否能夠體外中和最有效的RGMA活性片段2(參見(jiàn)示例性實(shí)施方案2)的神經(jīng)纖維生長(zhǎng)抑制作用。使用肽down-l作為例子，因?yàn)槠錁?gòu)成活性RGMA片段2的一部分。與載體蛋白(LPH)偶聯(lián)后，該肽用于按照下面方案免疫2只兔。<table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table>在幾次免疫之后，純化產(chǎn)生的down-l特異性抗體并且在多種分析試驗(yàn)系統(tǒng)中采用。a)RGMA-再生蛋白結(jié)合分析試驗(yàn)該方法如在分析方法3中所述開(kāi)展；實(shí)驗(yàn)結(jié)果示于圖7A。b)在軸突生長(zhǎng)分析試驗(yàn)中對(duì)活性RGMA片段的中和作用針對(duì)肽down-l產(chǎn)生的多克隆抗體非常有效地阻斷RGMA蛋白質(zhì)與其受體再生蛋白的相互作用。因此，在接下來(lái)的分析中，研究了down-l特異性抗體是否能夠中和非常有力的RGMA片段2(參見(jiàn)示例性實(shí)施方案3)。方法如在分析方法2中所述開(kāi)展；實(shí)驗(yàn)結(jié)果示于圖7B?？傊?，在RGMA再生蛋白結(jié)合分析試驗(yàn)中抗肽down-l的多克隆抗體阻止了再生蛋白與RGMA的相互作用，并且在軸突生長(zhǎng)分析試驗(yàn)中其幾乎完全中和了RGMA片段的抑制性活性。因此，位于RGMA蛋白質(zhì)的氨基端氨基酸250至300、特別是260至291之間的區(qū)域?qū)τ谄湟种菩曰钚远蕴貏e重要，并且因此,皮描述為新的功能相關(guān)結(jié)構(gòu)域。權(quán)利要求1.排斥性引導(dǎo)分子(RGM)的再生蛋白受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。2.權(quán)利要求1所述的再生蛋白受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其衍生自哺乳動(dòng)物RGM。3.權(quán)利要求1或2所述的再生蛋白受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其衍生自如SEQIDNO:2所示的人RGMA，如SEQIDNO:4所示的人RGMB或如SEQIDNO:6所示的人RGMC。4.如前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)所述的再生蛋白受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其包含來(lái)自相對(duì)于RGD切割位點(diǎn)而言的C-端以及相對(duì)于GPI錨區(qū)域而言的N-端的RGMM酸序列區(qū)域的、長(zhǎng)度不超過(guò)150個(gè)連續(xù)氨基酸殘基的氨基,列。5.如前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)所述的再生蛋白受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其特征在于如SEQIDNO:7所示的下列部分序列GX^VEXAAXsYIGTTXAXgRQ其中&至X8是任何氨基酸殘基。6.如前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)所述的再生蛋白受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其包含來(lái)自如SEQIDNO:2所示^J^酸位置200-350、來(lái)自如SEQIDNO:2所示"^酸位置200-325、或來(lái)自如SEQIDNO:2所示^J^酸位置200-300、或來(lái)自如SEQIDNO:2所示氨基酸位置200-285、或來(lái)自如SEQIDNO:2所示氨基酸位置250-285、或來(lái)自如SEQIDNO:2所示氨基酸位置260-285、或來(lái)自如SEQIDNO:2所示氨基酸位置215-340、或來(lái)自如SEQIDNO:2所示^J^酸位置260-340、或來(lái)自如SEQIDNO:2所示氨基酸位置250-300、或來(lái)自如SEQIDNO:2所示^J^酸位置260-291、或來(lái)自如SEQIDNO:2所示氨基酸位置210-260、或來(lái)自如SEQIDNO:2所示氨基酸位置290-350的M酸序列，或其功能性的再生蛋白受體結(jié)合片段。7.再生蛋白受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域或其結(jié)合片段，其包含來(lái)自如SEQIDNO:2所示位置260-291或267-285的序列區(qū)域、來(lái)自如SEQIDNO:4所示位置260-325的序列區(qū)域、或者來(lái)自如SEQIDNO:6所示位置250-300的序列區(qū)域的至少10個(gè)連續(xù)氨基酸殘基。8.如前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)所述的再生蛋白受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗原性多肽片段。9.如權(quán)利要求8所述的抗原性多肽片段，其可以用于產(chǎn)生調(diào)節(jié)RGM與再生蛋白受體結(jié)合的免疫球蛋白分子。10.如權(quán)利要求8所述的抗原性多肽片段，其包含具有如SEQIDNO:7、8、9、10或23-29或31-34所示序列之一的肽的至少10個(gè)連續(xù)氨基酸殘基。11.如權(quán)利要求1-7中任何一項(xiàng)所述的再生蛋白受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域或者如^5l利要求7-9中任何一項(xiàng)所述的多肽片段在制備抗RGM的多克隆抗血清或單克隆抗體中的用途。12.如權(quán)利要求11所述的用途，其中抗血清或抗體可以調(diào)節(jié)RGM與再生蛋白受體的結(jié)合。13.如權(quán)利要求11或12所述的抗RGM的多克隆抗血清或單克隆抗體，其用于診斷或治療。14.如權(quán)利要求13所述的多克隆抗血清或單克隆抗體在制備用于診斷或治療由再生蛋白受體與RGM或RGM片段的相互作用介導(dǎo)的疾病或疾病狀態(tài)的藥物組合物中的用途。15.如權(quán)利要求14所述的用途，其中疾病或疾病狀態(tài)選自a)頭骨，腦和脊髓的機(jī)械性損傷，b)l曼性病如神經(jīng)變性病，炎性疾病和自身免疫病，c)神經(jīng)元再生、軸突出芽、軸突延伸和神經(jīng)元可塑性的損害，d)腫瘤病和腫瘤轉(zhuǎn)移。16.如權(quán)利要求1-6中任意一項(xiàng)所述的再生蛋白受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域或者權(quán)利要求8-10中任意一項(xiàng)所述的多肽片段在制備用于診斷或治療由被破壞的或損傷的RGM或RGM片段與相關(guān)受體的相互作用所介導(dǎo)的疾病或疾病狀態(tài)的組合物中的用途。17.如權(quán)利要求16所述的用途，其中疾病或疾病狀態(tài)選自a)由過(guò)度軸突出芽和/或病理性突觸發(fā)生所導(dǎo)致的、精神病和慢性疼痛相關(guān)的、改變的軸突發(fā)生過(guò)程，b)與受損的4失代謝相關(guān)的病癥，c)與受損的骨生長(zhǎng)相關(guān)的病癥，d)與退行性軟骨改變相關(guān)的病癥，e)與推間盤和推骨損傷相關(guān)的病癥，f)與失調(diào)的、不受控制的細(xì)胞遷移過(guò)程相關(guān)的病癥。18.如權(quán)利要求1-7中任意一項(xiàng)所述的再生蛋白受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域或權(quán)利要求8-10中任意一項(xiàng)所述的多肽片段作為靶標(biāo)用于檢測(cè)或鑒定RGM結(jié)合配體的用途。19.如權(quán)利要求1-7中任意一項(xiàng)所述的再生蛋白受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域或權(quán)利要求8-10中任意一項(xiàng)所述的多肽片段作為免疫原用于主動(dòng)或被動(dòng)免疫的用途。20.可以通過(guò)使用抗原量的如權(quán)利要求1-7中任意一項(xiàng)所述的再生蛋白受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域或權(quán)利要求8-10中任意一項(xiàng)所述的多肽片段免疫哺乳動(dòng)物得到的多克隆抗血清。21.適當(dāng)時(shí)人源化形式的、抗如權(quán)利要求1-7中任意一項(xiàng)所述的再生蛋白受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域或權(quán)利要求8-10中任意一項(xiàng)所述的多肽片段的單克隆抗體，或其抗原結(jié)合片段。22.包含可藥用載體和至少一種選自下列的活性成分的藥物組合物a)如權(quán)利要求1-7中任意一項(xiàng)所述的再生蛋白受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域或權(quán)利要求8-10中任意一項(xiàng)所述的多肽片段，b)如權(quán)利要求20或21所述的單克隆或多克隆抗體。23.如權(quán)利要求22所述的藥物組合物，其用于鞘內(nèi)施用、靜脈內(nèi)施用、皮下施用、口服或腸胃外施用、經(jīng)鼻施用或吸入施用。24.表達(dá)載體，其包含與至少一個(gè)調(diào)節(jié)性核酸序列有效連接的至少一個(gè)編碼核酸序列，所述編碼核酸序列編碼如權(quán)利要求1-7中任意一項(xiàng)所述的再生蛋白受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域或者如權(quán)利要求8-10中任意一項(xiàng)所述的多肽片段。25.重組微生物，其含有至少一種如權(quán)利要求24所述的載體。26.產(chǎn)生如權(quán)利要求21所述的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系。27.用于產(chǎn)生如權(quán)利要求1-7中任意一項(xiàng)所述的再生蛋白受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域或如權(quán)利要求8-10中任意一項(xiàng)所述的多肽片段的方法，其中培養(yǎng)如權(quán)利要求25所述的重組微生物，并且從培養(yǎng)物中分離所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。28.用于產(chǎn)生如權(quán)利要求21所述的單克隆抗體的方法，其中培養(yǎng)如權(quán)利要求26所述的雜交瘤細(xì)胞系，并且從培養(yǎng)物中分離所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。全文摘要本發(fā)明涉及鑒定和使用排斥性引導(dǎo)分子(RGM)蛋白質(zhì)家族成員的再生蛋白受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域及衍生自其的多肽片段。本發(fā)明結(jié)構(gòu)域，即，肽片段，適宜作為藥劑用于主動(dòng)或被動(dòng)免疫個(gè)體以及作為診斷和治療劑用于起源或進(jìn)程涉及RGM家族成員和該分子的細(xì)胞受體的疾病或病理狀況。本發(fā)明還涉及抗本發(fā)明結(jié)合結(jié)構(gòu)域和抗由其衍生的多肽的單克隆抗體和多克隆抗體，以及制備本發(fā)明結(jié)構(gòu)域、多肽和抗體的方法。文檔編號(hào)C07K16/28GK101277974SQ200680036346公開(kāi)日2008年10月1日申請(qǐng)日期2006年9月29日優(yōu)先權(quán)日2005年9月30日發(fā)明者B·K·米勒,G·舍費(fèi)爾,R·米勒申請(qǐng)人:阿伯特有限及兩合公司