專(zhuān)利名稱：：Jnk信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的細(xì)胞通透肽抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及蛋白激酶抑制劑，更具體地說(shuō)，涉及蛋白激酶c-Jim氨基末端激酶(c-JunN-terminalkinase,JNK)的抑制劑。另外，本發(fā)明提供JNK抑制劑序列、嵌合肽、編碼相同的核酸，以及用于治療與JNK信號(hào)相關(guān)的病理生理異常的藥用合成物。
背景技術(shù)：
：氨基末端激酶是促分裂素原活化蛋白(mitogen-activatedprotein,MAP)激酶的應(yīng)激活化組的成分之一。這些激酶用于控制細(xì)胞的成長(zhǎng)和分化，更通常地，用于響應(yīng)細(xì)胞的環(huán)境刺激。通過(guò)結(jié)合若干類(lèi)別的細(xì)胞表面受體，激活JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以響應(yīng)環(huán)境應(yīng)力。這些受體包括細(xì)胞因子受體、螺旋受體和受體酪氨酸激酶。在哺乳動(dòng)物的細(xì)胞中，JNK用于生物處理，例如致癌性轉(zhuǎn)化和調(diào)和適應(yīng)響應(yīng)環(huán)境壓力。JNK也用于調(diào)制免疫響應(yīng)，包括免疫細(xì)胞的熟化和分化，以及影響被免疫系統(tǒng)識(shí)別為破壞性的細(xì)胞中的程序性細(xì)胞死亡。JNK信號(hào)的唯一性使得其成為發(fā)展藥用干預(yù)的希望目標(biāo)。在一些神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，JNK信號(hào)特別地用于缺血性腦卒和帕金森病。治療與JNK信號(hào)密切相關(guān)的疾病的一種方法是提供JNK信號(hào)通路的抑制劑。作為在先技術(shù)已知的這些抑制劑特別地包括例如上游激酶抑制劑(例如，CEP-1347)、JNK的小化學(xué)抑制劑(SP600125和AS601245)、以及JNK與其基質(zhì)(D-JNKI和I-JIP)之間的相互作用的肽抑制劑(例如，Kuanetal.,CurrentDrugTargets-CNS&NeurologicalDisorders,February2005,vol.4,no.1,pp.63-67(5》，其中，通過(guò)例如與蛋白激酶的ATP—結(jié)合位點(diǎn)相競(jìng)爭(zhēng)，JNK的小化學(xué)抑制劑可直接影響激酶的活性。上游激酶抑制劑CEP-1347(KT7515)是混合系激酶家族的半合成抑制劑。5CEP-1347(KT7515)可促進(jìn)神經(jīng)元的劑量存活，以抑制施用有1-甲基-4-苯基-四氫吡啶的老鼠體內(nèi)的并在營(yíng)養(yǎng)減少后的主要胚胎培養(yǎng)和分化的PC12細(xì)胞中的氨基末端激酶的活性。進(jìn)一步地，CEP-1347(KT7515)可促進(jìn)培養(yǎng)的雞胚背根神經(jīng)節(jié)、交感神經(jīng)、睫狀和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)(例如，5oraw'oetal.,Neuroreport.9(7):1435-1439,MayIIth1998.)發(fā)現(xiàn)小化學(xué)JNK抑制劑SP600125可降低磷酸化C-Jun的水平，以保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元，避免細(xì)胞凋亡，并部分存儲(chǔ)C57BL/6N老鼠體內(nèi)MPTP所致PD中的多巴胺的水平(『朋g&a/.,A^wmsc/及es.20似FeZv4S0;202)。這些結(jié)果進(jìn)一步地指出JNK通路是在體內(nèi)MPTP的神經(jīng)中毒結(jié)果的主要介質(zhì)，并且抑制JNK的活性可作為治療PD的一種新的和有效的策略。小化學(xué)抑制劑的進(jìn)一步例子是前面所提到的JNK-抑制劑AS601245。AS601245抑制了JNK信號(hào)通路，并在腦缺血后，促進(jìn)了細(xì)胞的存活。在體內(nèi)，AS601245提供了顯著的保護(hù)，以抵制短暫性全面缺血的沙土鼠的海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的延遲損耗。通過(guò)JNK抑制，并因此通過(guò)c-Jun表達(dá)和磷化作用，以傳遞該影響(例如，Carbonietal.,JPharmacolExpTher.2004Jul;310(1):25-32.Epub2004Feb26*)。第三類(lèi)的JNK信號(hào)通路的抑制劑代表前面所提到的JNK和其基質(zhì)之間的相互作用的肽抑制劑。作為構(gòu)建該抑制劑肽的起點(diǎn)，將使用本身的JNK蛋白的序列。特別地，這些蛋白包括JNK結(jié)合區(qū)(JBD)，并發(fā)生在各種不同的胰島素結(jié)合(IB)蛋白，例如IBl或IB2。該示范性序列的結(jié)果是例如IBl[SEQIDN0:13]'IB2[SEQIDNO:14]、c-Jun[SEQIDNO:15]和ATF2[SEQIDNO:16]的JNK結(jié)合區(qū)之間的序列(例如，序列圖1A-1C)。該序列揭示了部分地保留的8氨基酸序列(例如，圖1A)。通過(guò)比較IBl和IB2的JBD，進(jìn)一步揭示了7和3氨基酸的兩塊，其高度保留在這兩個(gè)序列之間。例如，WO01/27268公開(kāi)了在該序列基礎(chǔ)上所構(gòu)建的序列。特別地，W001/27268公開(kāi)了小細(xì)胞滲透合成的肽，其包括所謂的TAT細(xì)胞滲透序列，該TAT細(xì)胞滲透序列衍生自HIV-TAT蛋白的基礎(chǔ)運(yùn)輸序列和IBl的最小的20氨基酸抑制序列。該兩個(gè)成分共價(jià)地互相耦聯(lián)。WO01/27268公開(kāi)的MAPK-JNK6信號(hào)通路的示范性(目前僅有)抑制劑是例如LJNKIl(由L氨基酸所組成的JNK-抑制劑肽)或者耐酸性蛋白酶DJNKI1肽(由非本身的D氨基酸所組成的JNK抑制劑肽)。這些JNK-抑制劑(JNKI)肽特別是指JNK(JNK1，JNK2andJNK3)。與上面所討論的這些小的化合物抑制劑相反，WO01/27268中的抑制劑序列，例如JNKI1抑制JNK與其基質(zhì)之間的相互作用。通過(guò)其衍生自TAT的運(yùn)輸序列，可有效的將融合肽傳送到細(xì)胞中。由于通過(guò)該運(yùn)算成分所得到的新特性，可活性地將融合肽傳送到細(xì)胞中，其中，融合肽將保持有效，知道蛋白水解降解。然而，根據(jù)WO01/27268，通過(guò)磷酸化酶(激酶)，仍然可容易地得到肽。作為對(duì)于激酶靶標(biāo)的肽的任何氨基酸因此要進(jìn)行磷酸化，其代表用于使得該肽失活的重要因素。因此，本發(fā)明的第一目的是提供新的抑制劑序列，以用于JNK信號(hào)通路，其可保持WO01/27268所公開(kāi)的肽的功能特性，并對(duì)于磷酸化酶(激酶)，提供增強(qiáng)的穩(wěn)定性。而且，根據(jù)WO01/27268，抑制劑序列的分離和純化步驟成本較高，特別是對(duì)于巨大數(shù)量的制備(例如，用于工業(yè)生產(chǎn))。因此，本發(fā)明的第二目的是提供抑制劑序列，相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，其能進(jìn)行更容易和更低成本的生產(chǎn)和分離。
發(fā)明內(nèi)容通過(guò)具有長(zhǎng)度少于150氨基酸的JNK抑制劑序列可實(shí)現(xiàn)這些目的，其中，如序列表中SEQIDNO:1,2,3或4、相應(yīng)的變體、片段或衍生物，JNK抑制劑序列包括至少一個(gè)氨基酸序列。優(yōu)選的，本發(fā)明的JNK抑制劑序列結(jié)合JNK和/或抑制至少一個(gè)有活性轉(zhuǎn)錄因子的JNK，例如c-Jun或ATF2(分別例如SEQIDNO:15和16)或Elkl。特別地，根據(jù)本發(fā)明，JNK抑制劑序列包括少于150氨基酸殘基的總長(zhǎng)度，優(yōu)選的范圍在5到15氨基酸殘基，更優(yōu)選的，10到100氨基酸殘基，特別更優(yōu)選的，10到75氨基酸殘基，最優(yōu)選的15到50氨基酸殘基。根據(jù)SEQIDNO:1、2、3或4、或片段、衍生物或相應(yīng)的變體，本發(fā)明的JNK抑制劑序列包括至少一個(gè)氨基酸序列。更優(yōu)選的，根據(jù)SEQIDNO:1、2、3或4、或變體、片段、或相應(yīng)的衍生物，本發(fā)明的JNK序列可包括1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)或甚至更多的氨基酸序列復(fù)本。如果本發(fā)明中多于一個(gè)復(fù)本的話，那么根據(jù)SEQIDN0:1、2、3或4、或變體、片段、或相應(yīng)的衍生物，這些發(fā)明的氨基酸序列可直接地互相耦聯(lián)，而不具有任何耦聯(lián)體序列(linkersequence)或經(jīng)過(guò)耦聯(lián)體序列，該耦聯(lián)體序列包括1到10，優(yōu)選1到5個(gè)氨基酸。優(yōu)選的，形成耦聯(lián)體序列的氨基酸選自氨基乙酸或脯氨酸，作為氨基酸殘基。更優(yōu)選的，根據(jù)SEQIDN0:1、2、3或4、或相應(yīng)的片段、變體或衍生物，因此可通過(guò)2、3或更多的脯氨酸殘基，將這些氨基酸序列隔離。如上面所定義的，本發(fā)明的JNK抑制劑序列可包括L-氨基酸、D-氨基酸或兩者的結(jié)合。優(yōu)選的，本發(fā)明的JNK抑制劑序列包括至少1個(gè)，優(yōu)選的至少3個(gè)，更優(yōu)選的至少6個(gè)和特別更優(yōu)選的至少10個(gè)D-和/或L-氨基酸，其中，在本發(fā)明的JNK抑制劑序列中，D-和/或L-氨基酸以區(qū)組(blockwise)、非區(qū)組或可替換的方式排列。根據(jù)一優(yōu)選實(shí)施例，本發(fā)明的JNK抑制劑序列可排它地包括L-氨基酸。然后，根據(jù)SEQIDN0:1或3，本發(fā)明的JNK抑制劑序列可包括至少一個(gè)本身的JNK抑制劑序列。在本文中，根據(jù)完全地具有L-氨基酸的任何的SEQIDN0:lor3，術(shù)語(yǔ)"本身的"或"本身的JNK抑制劑序列"是指非改變的發(fā)明的JNK抑制劑序列。因此，本發(fā)明的JNK抑制劑序列可包括至少一個(gè)(本身的)氨基酸序列NH2-Xnb-Xna-RPTTLXLXXXXXXXQD-Xnb-C00H[SEQIDNO:3]。作為在本文所使用，每一個(gè)X代表一個(gè)氨基酸殘基，優(yōu)選的，選自任意(本身的)氨基酸殘基。XJ代表一個(gè)氨基酸殘基，優(yōu)選的，選擇任意氨基酸殘基，除了絲氨酸或蘇氨酸，其中n是0或1。而且，每一個(gè)Xnb可選自任意的氨基酸殘基，其中n是0-5、5-10、10-15、15-20、20-30或更多，如果n是0，為了避免絲氨酸或蘇氨酸在C-末端，那么X/、X,不能包括絲氨酸或蘇氨酸。優(yōu)選的，X代表衍生自SEQIDN0:1或3的肽殘基的鄰近的伸展。更優(yōu)選的，本發(fā)明的JNK抑制劑序列進(jìn)一步包括至少一個(gè)(本身的)氨基酸序列NH2-RPKRPTTLNLFPQVPRSQD_C00H[SEQIDNO:1]。XJ和Xnb代表D或L氨基酸。根據(jù)另一優(yōu)選實(shí)施例，本發(fā)明的JNK抑制劑序列可部分地或排它地包括D-氨基酸。更優(yōu)選的，具有D-氨基酸的這些JNK抑制劑序列是上面(本身的)JNK抑制劑序列的非本身的D逆反序列。術(shù)語(yǔ)"逆反序列"是指線狀肽序列的異構(gòu)體，其中，序列的方向是相反的，并且每一個(gè)氨基酸殘基的手性是相反的(seee.g.Jamesonetal.，Nature,368，744-746(1994);Bradyetal.，Nature,368,692-693(1994))。結(jié)合的D-對(duì)映體和相反合成的優(yōu)點(diǎn)是在每一個(gè)酰胺結(jié)合中，羰基和氨基組的位置是可調(diào)換的，同時(shí)在每一個(gè)阿爾法碳，側(cè)鏈的位置是保留的。除非有特別的陳述，假定根據(jù)本發(fā)明，對(duì)于相應(yīng)的本身的L-氨基酸序列或肽，通過(guò)合成序列或肽的逆反，可將任意特定的L-氨基酸序列或肽轉(zhuǎn)換成D逆反序列或肽。如上所定義的本發(fā)明的D逆反序列具有許多有用的特性。例如，根據(jù)本發(fā)明，D逆反序列可與L-氨基酸序列一樣有效地進(jìn)入細(xì)胞，然而，與相應(yīng)的L-氨基酸序列相比，本發(fā)明的D-逆反序列更穩(wěn)定。因此，根據(jù)氨基酸序列NH2-Xnb-DQXXXXXXXLXLTTPR-Xna-Xnb-COOH[SEQIDNO:4]，本發(fā)明的JNK抑制劑序列可包括至少一個(gè)D逆反序列。作為本文所使用，X，XJ和Xnb如上所定義(優(yōu)選的，代表D氨基酸)，其中，優(yōu)選的X。b代表衍生自SEQIDNO:2or4的殘基的鄰近的伸展。更優(yōu)選的，根據(jù)氨基酸序列NH廠DQSRPVQPFLNLTTPRKPR-COOH[SEQIDNO:2],本發(fā)明的JNK抑制劑序列可包括至少一個(gè)D逆反序列。表l(SEQIDNO:l-4)示出上面所公開(kāi)的本發(fā)明的JNK抑制劑序列。該表示出本發(fā)明的JNK抑制劑序列的名稱、以及它們的序列標(biāo)識(shí)符數(shù)目、長(zhǎng)度和氨基酸序列。另外，根據(jù)WO01/27268(SEQIDNO:17-26)，現(xiàn)有技術(shù)序列給出了相當(dāng)?shù)睦碛?。這些現(xiàn)有技術(shù)序列并未在此公開(kāi)，以作為本發(fā)明的JNK抑制劑序列或本發(fā)明的嵌合肽，并因此明確地排除在本發(fā)明權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>(在表1中，對(duì)于SEQIDNO:1、2、5、6、9和11與SEQIDNO:3、4、7、8、10和12，分別示出示范性序列及其通式)根據(jù)另一優(yōu)選實(shí)施例，根據(jù)SEQIDN0:1、2、3或4，本發(fā)明的JNK抑制劑序列包括至少一個(gè)如上定義的本身的或非本身的氨基酸序列的相應(yīng)的變體、片段和/或衍生物。優(yōu)選的，這些變體、片段和/或衍生物保留了上面所公開(kāi)的本身的或非本身的JNK抑制物序列的生物活性，特別地，根據(jù)SEQIDN0:1、2、3或4，例如本身的或非本身的氨基酸序列結(jié)合JNK和/或抑制至少一個(gè)有活性的轉(zhuǎn)錄因子的JNK的活性，例如c-Jun、ATF2或Elkl?？赏ㄟ^(guò)各種測(cè)試，進(jìn)行功能性測(cè)試，例如，對(duì)于肽的目標(biāo)分子的結(jié)合測(cè)試，或通過(guò)生物物理方法，例如光譜、計(jì)算機(jī)建模、結(jié)構(gòu)分析等等。特別地，通過(guò)親水性分析(seee.g.HoppandWoods,1981.ProcNatlAcadSciUSA78:3824-3828)，可分析JNK抑制劑序列或相應(yīng)的變體、片段和/或衍生物，該親水性分析可用于識(shí)別肽的疏水和親水區(qū)域，因此有助于實(shí)驗(yàn)操作或抗體合成的基質(zhì)的設(shè)計(jì)，例如結(jié)合實(shí)驗(yàn)。也可執(zhí)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，以標(biāo)識(shí)(本發(fā)明)JNK抑制劑序列或其相應(yīng)的變體、片段和/或衍生物，其假設(shè)了特定的結(jié)構(gòu)基元(例如ChouandFasman，1974，Biochem13:222-223)。使用本領(lǐng)域中的計(jì)算機(jī)軟件程序，可實(shí)現(xiàn)操作、翻譯、二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、親水和疏水面、開(kāi)放閱讀框架預(yù)測(cè)和繪圖、以及序列同系性的確定。也可使用別的結(jié)構(gòu)分析，包括例如X射線結(jié)晶學(xué)(例如Engstrom，1974.BiochemExpBiol11:7-13)、質(zhì)譜分析和氣相色譜法(例如METHODSINPROTEINSCIENCE,1997，J.WileyandSons,NewYork,NY)和計(jì)算禾幾建禾莫(例如FletterickandZoller，eds.，1986.ComputerGraphicsandMolecularModeling,In:CURRENTCOMMUNICATIONSINMOLECULARBIOLOGY,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY)。因此，根據(jù)SEQIDN0:1、2、3或4，本發(fā)明的JNK抑制劑序列可包括至少一個(gè)(本身的或非本身的)氨基酸序列的相應(yīng)的變體。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，"根據(jù)SEQIDN0:1、2、3或4，(本身的或非本身的)氨基酸序列的相應(yīng)的變體"衍生自根據(jù)SEQIDN0:1、2、3或4的任意的序列，其中該變體包括根據(jù)SEQIDN0:1、2、3或4的氨基酸序列的氨基酸變更。特別地，這些變更包括根據(jù)SEQIDNO:1、2、3或4的1到20、優(yōu)選的1到10、以及更優(yōu)選的1到5的氨基酸的取代、加成和/或缺失，其中這些變體示出與至少大約30%、50%、70%、80%、90%、95%、98%或甚至99%的根據(jù)SEQIDNO:1、2、3或4的任意序列的序列一致性。如果通過(guò)特定氨基酸的取代，可得到根據(jù)SEQIDN0:1、2、3或4的本發(fā)明(本身的或非本身的)氨基酸序列的變體，那么優(yōu)選的該取代包括保守氨基酸取代。保守氨基酸取代可包括一組中的同義氨基酸殘基，該組具有充分的類(lèi)似的物理化學(xué)性質(zhì)，以便該組成員之間的取代將保留分子的生物活性ii(例如Grantham,R.(1974)，Science185，862-864).對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯然的，在上面所定義的序列中，也可插入和/或刪除氨基酸，并且不會(huì)改變它們的功能，特別地，如果插入和/或刪除僅僅涉及到少量的氨基酸，例如少于20，和優(yōu)選的少于10，并且不會(huì)去除或取代對(duì)于功能性活性非常重要的氨基酸，而且，在本發(fā)明中的變體所要避免的取代是將導(dǎo)致另外的蘇氨酸在氨基酸的位置，該位置對(duì)于磷酸化酶，優(yōu)選的激酶，可進(jìn)入，以便避免在生物體內(nèi)或體外，本發(fā)明的JNK抑制劑序列或嵌合肽的失活。優(yōu)選的，表2所定義的同義氨基酸殘基可分類(lèi)為同組，并特別地可通過(guò)保守氨基酸取代，進(jìn)行交換。表2同義氨基酸序列的優(yōu)選組氨基酸同義殘基SerSer，Thr，Gly，AsnArgArg，Gln，Lys,Glu,HisLeulie,Phe,Tyr，Met,Val，LeuProGly，Ala，(Thr),ProThrPro,Ser,Ala,Gly,His,Gln，ThrAlaGly,Thr，Pro,AlaValMet,Tyr，Phe，lie,Leu，ValGlyAla,(Thr),Pro,Ser,GlyHeMet,Tyr,Phe,Val，Leu,liePheTip,Met,Tyr,lie,Val,Leu，PheTyrTrp,Met,Phe,lie,Val,Leu，TyrCysSer,Thr,CysHisGlu，Lys,Gin,Thr,Arg,HisGinGlu，Lys,Asn,His,(Thr),Arg，GinAsnGin,Asp,Ser,AsnLysGlu,Gln，His,Arg,LysAspGlu,Asn,AspGluAsp,Lys,Asn，Gln,His,Arg，GluMetPhe,lie,Val,Leu,MetTipTrp根據(jù)本發(fā)明，SEQIDN0:1、2、3或4的變體的特定形式是本發(fā)明根據(jù)序列表中SEQIDN0:1、2、3或4所示的(本身或非本身的)氨基酸序列的片段，與SEQIDNO:l、2、3或4相比較，特別地通過(guò)至少一刪除，可對(duì)其進(jìn)行變更。優(yōu)選的，一片段包括任意SEQIDNO:l、2、3或4的至少4個(gè)連續(xù)的氨基酸，特別地，長(zhǎng)度要足夠使得抗原特定識(shí)別于任意的這些序列。進(jìn)一步更優(yōu)選的，該片段包括任意SEQIDN0:1、2、3或4的4到18、4至U5、或最優(yōu)4到10個(gè)連續(xù)的氨基酸。刪除的氨基酸可發(fā)生在SEQIDN0:1、2、3或4的任意位置，優(yōu)選的N-或C-末端。特別地，通過(guò)l、2、3、4或5氨基酸，可在N-或C-末端刪除SEQIDNO:2(DQSRPVQPFLNLTTPRKPR)的肽。換句話說(shuō)，SEQIDNO:2的優(yōu)選的較短的版本具有序列QSRPVQPFLNLTTPRKPR、SRPVQPFLNLTTPRKPR、RPVQPFLNLTTPRKPR、PVQPFLNLTTPRKPR、或VQPFLNLTTPRKPR或分別DQSRPVQPFLNLTTPRKP、DQSRPVQPFLNLTTPRK、DQSRPVQPFLNLTTPR、DQSRPVQPFLNLTTP、DQSRPVQPFLNLTT、或QSRPVQPFLNLTTPRKP、SRPVQPFLNLTTPRKP、SRPVQPFLNLTTPRK、RPVQPFLNLTTPRKP、RPVQPFLNLTTPRK或PVQPFLNLTTP。本發(fā)明所用的肽序列越短，其非特定性細(xì)胞毒性就越低。在一定的實(shí)施例中，所用的肽具有最短的序列可能，其仍然保留有生物功能，例如JNK抑制功能。而且，根據(jù)序列表中SEQIDN0:1、2、3或4所示的本發(fā)明的(本身或非本身的)氨基酸序列可定義為一序列，其共享至少大約30%、50%、70%、80%、90%、95%、98%、或甚至99%的SEQIDN0:1、2、3或4的的任意序列的序列一致。本發(fā)明的JNK抑制劑序列進(jìn)一步包括至少一個(gè)SEQIDN0:1、2、3或4(本身或非本身的)氨基酸序列的衍生物。在本文中，"根據(jù)SEQIDN0:1、2、3或4的(本身或非本身的)氨基酸序列的衍生物"優(yōu)選的是衍生自根據(jù)SEQIDN0:1、2、3或4的任意序列的氨基酸序列，其中該衍生物包括至少一個(gè)可修飾的L-或D-氨基酸(形成非天然的氨基酸)，優(yōu)選的1到20、更優(yōu)選的1到10、和甚至更優(yōu)選的1到5個(gè)可修飾的L-或D-氨基酸。相應(yīng)的變體或片段的衍生物也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。在此所公開(kāi)的任意的肽在它們的末端具有可修飾性，要么C-或N-末端，或者兩者末端。優(yōu)選的，通過(guò)氨基化合物，修飾c-末端，然而通過(guò)任意合適的冊(cè)2-保護(hù)基修飾N-末端，例如酰化產(chǎn)物。關(guān)于"修飾的氨基酸"可以是任意的氨基酸，該氨基酸可例如通過(guò)各種不同的有機(jī)體中的糖基化、通過(guò)磷酸化、或通過(guò)標(biāo)記特定的氨基酸，進(jìn)行改變。特別地，該標(biāo)記選自下面的標(biāo)記組中(i)放射性標(biāo)記，例如放射性磷酸化或使用硫、氫、碳、氮等等的放射性標(biāo)記；(ii)染色劑(例如digoxygenin等等)；(iii)熒光組(例如熒光素等等)；(iv)化學(xué)發(fā)光(chemoluminescent)組；(v)用于固相上的固定化的組(例如His-tag、生物素、str印-tag、flag-tag、抗體、抗原等等)；和(vi)(i)到(v)所涉及的兩個(gè)或多個(gè)標(biāo)記的組合。在上文中，氨基酸序列具有一序列，該序列共享對(duì)于本發(fā)明的待模建氨基酸序列的至少95%的序列一致性，這意味著目標(biāo)氨基酸序列的序列與待模建序列相一致，除了相對(duì)于待模建氨基酸序列的每100個(gè)氨基酸，目標(biāo)氨基酸序列可包括多達(dá)5個(gè)氨基酸變體。換句話說(shuō)，為了得到具有與待模建氨基酸序列至少95%相一致的序列的氨基酸序列，目標(biāo)序列中的達(dá)5%(100中的5)氨基酸殘基可由別的氨基酸插入或取代、或被刪除。對(duì)于不具有準(zhǔn)確相應(yīng)的序列，關(guān)于第二序列可確定第一序列的a^的一致性。一般地，相比較的這兩個(gè)序列排列成序列之間最大的相關(guān)性。這可包括在一個(gè)或兩個(gè)序列中插入"間隙"，以增強(qiáng)對(duì)準(zhǔn)度。接著，在相比較的每一個(gè)序列的整個(gè)長(zhǎng)度范圍，可確定A%—致性(所謂的全局對(duì)準(zhǔn))，這特別適合于相同或類(lèi)似長(zhǎng)度的序列，或在較小的范圍，即定義的長(zhǎng)度(所謂局部對(duì)準(zhǔn))，這更適合于不同長(zhǎng)度的序列。用于比較兩個(gè)或更多序列的一致性和同源性的方法也是本領(lǐng)域所熟知的。因此作為例子，在WisconsinSequenceAnalysisPackage,version9.1(Devereuxetal.，1984，NucleicAcidsRes.12，387—395.)中可用的程序，例如程序BESTFIT和GAP可用于確定兩個(gè)多核苷酸的％—致性，以及兩個(gè)多肽序列之間的％—致性和％同源性。BESTFIT使用(SmithandWaterman(1981)，J.Mol.Biol.147，195-197.)的"局部同源算法"。別的用于確定序列之間的一致性和/或類(lèi)似性的程序也是本領(lǐng)域熟知的，例如BLAST家族程序(Altschuletal.，1990，J.Mol.Biol.215，403-410)，通過(guò)萬(wàn)維網(wǎng)站ncbi.nlm.nih.gov,即NCBI的主頁(yè)可獲得，以及FASTA(Pearson(1990)，MethodsEnzymol.183，63-98;PearsonandLipman(1988)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A85，2444-2448.).通過(guò)本領(lǐng)域熟知的方法，例如通過(guò)如下所討論的化學(xué)合成或基因工程方法，可得到或生成根據(jù)本發(fā)明的JNK-抑制劑序列。例如，與本發(fā)明的JNK抑制劑序列的一部分相應(yīng)的肽，其包括所述的JNK抑制劑序列的期望區(qū)域，或在生物體外體內(nèi)或體外調(diào)解期望活性，通過(guò)使用多肽合成儀可合成該肽。根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供一種嵌合肽，其包括至少一個(gè)第一域和至少一個(gè)第二域，其中第一域包括運(yùn)輸序列，同時(shí)第二域包括如上所定義的本發(fā)明的JNK抑制劑序列。特別地，根據(jù)本發(fā)明的嵌合肽具有至少25個(gè)氨基酸殘基的長(zhǎng)度，例如25到250氨基酸殘基，更優(yōu)選的，25到200氨基酸殘基，進(jìn)一步更優(yōu)選的25到150氨基酸殘基，25到100，以及最優(yōu)選的25到50氨基酸殘基。作為第一域，優(yōu)選的，本發(fā)明的嵌合肽包括運(yùn)輸序列，其特別地選自任意的氨基酸的序列，該序列指引肽(該序列當(dāng)前所位于的)進(jìn)入期望的細(xì)胞目的地。因此，在此所使用的運(yùn)輸序列特別地指引該肽越過(guò)細(xì)胞膜，例如，從細(xì)胞外部，通過(guò)細(xì)胞膜，并進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。可選擇的或附加的，通過(guò)例如結(jié)合兩個(gè)成分(例如細(xì)胞滲透性成分核細(xì)胞核位置成分)或通過(guò)具有例如細(xì)胞膜運(yùn)輸和靶標(biāo)例如細(xì)胞核內(nèi)運(yùn)輸?shù)男再|(zhì)的單一成分，該運(yùn)輸序列可指引該肽到細(xì)胞中期望的位置，例如細(xì)胞核、核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)、溶酶體、或過(guò)氧化物酶體。該運(yùn)輸序列可附加地包括另外的成分，其可結(jié)合細(xì)胞質(zhì)成分或任意別的細(xì)胞成分或細(xì)胞區(qū)室(例如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、高爾基體、溶酶體囊泡)。因此，例如，第一域的運(yùn)輸序列核第二域的JNK抑制劑序列可位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞的任意區(qū)室中。這使得可確定在細(xì)胞中吸收后嵌合肽的位置。優(yōu)選的，運(yùn)輸序列(包括在本發(fā)明嵌合肽的第一域中)具有5到150氨基酸序列的長(zhǎng)度，更優(yōu)選的具有5到100的長(zhǎng)度，以及最優(yōu)選的5到50的長(zhǎng)度、5到30的長(zhǎng)度或甚至5到15氨基酸。更優(yōu)選的，該運(yùn)輸序列(包括在本發(fā)明的嵌合肽的第一域中)可作為第一域中連續(xù)的氨基酸序列的擴(kuò)展?？蛇x擇的，第一域中的該運(yùn)輸序列可分裂成兩個(gè)或更多的片段，其中所有的這些片段與整個(gè)運(yùn)輸序列類(lèi)似，并以1到10，優(yōu)選的1到5氨基酸，相互隔離，同時(shí)假定這些運(yùn)輸序列保留如上所公開(kāi)的載體性質(zhì)。將運(yùn)輸序列隔離開(kāi)的這些氨基酸，例如可選自不同于運(yùn)輸序列的氨基酸序列?？蛇x擇的，第一域可包括具有多于一個(gè)成分的運(yùn)輸序列，每一成分具有其自身的運(yùn)輸功能，以將第二域的載物JNK抑制劑序列，傳送到例如特定的細(xì)胞區(qū)室。如上所定義的這些運(yùn)輸序列可包括L-氨基酸、D-氨基酸、或兩者的組合。優(yōu)選的，本發(fā)明的運(yùn)輸序列包括至少l，優(yōu)選的至少3、更優(yōu)選的至少6、以及甚至更優(yōu)選的至少10L-氨基酸和/或D-氨基酸，其中，D-和/或L-氨基酸在本發(fā)明的JNK運(yùn)輸序列中以區(qū)組、非區(qū)組或可替換的方式排列。根據(jù)一優(yōu)選實(shí)施例，本發(fā)明的嵌合肽的運(yùn)輸序列可排它的包括L-氨基酸。更優(yōu)選的，本發(fā)明的嵌合肽的運(yùn)輸序列包括至少一個(gè)如上所定義的"本身的"運(yùn)輸序列。在本文中，術(shù)語(yǔ)"本身的"是指非改變的運(yùn)輸序列，完全地包括有L-氨基酸。根據(jù)本發(fā)明的另一可選擇的實(shí)施例，本發(fā)明嵌合肽的運(yùn)輸序列可排它的包括D-氨基酸。更優(yōu)選的，本發(fā)明嵌合肽的運(yùn)輸序列可包括如上所陳述的D逆反肽序列。通過(guò)天然原料，可得到本發(fā)明嵌合肽的第一域的運(yùn)輸序列，或通過(guò)使用基因工程或化學(xué)合成(例如，Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch,E.F"Maniatis,T.(1989)Molecularcloning:Alaboratorymanual.2ndedition.ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.)以制成。對(duì)于第一域的運(yùn)輸序列，可使用的天然原料包括例如本身的蛋白質(zhì)例如TAT蛋白質(zhì)(例如U.S.專(zhuān)利號(hào)為5，804，604和5，674，980，在此全文引用這兩篇文獻(xiàn))、VP22(例如WO97/05265;Elliottand0'Hare,Cell88:223-233(1997))、非病毒蛋白(Jacksonetal,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10691-10695(1992))、運(yùn)輸序列，該運(yùn)輸序列衍生自觸角足復(fù)合物(例如觸角足復(fù)合物載體序列)或衍生自堿性肽，例如該肽具有5到15氨基酸、優(yōu)選的10到12氨基酸并包括至少80%，更優(yōu)選85%或甚至更優(yōu)選90%堿性氨基酸，例如，精氨酸、賴氨酸和/或組氨酸。此外，在此所公開(kāi)用作運(yùn)輸序列的一個(gè)本身的蛋白質(zhì)的相應(yīng)的變體、片段和衍生物。關(guān)于相應(yīng)的變體、片段和衍生物，其是指如上對(duì)JNK抑制劑序列的定義。相應(yīng)的變體、片段以及衍生物與如上對(duì)JNK抑制劑序列的定義相對(duì)應(yīng)。特別地，在本文中的運(yùn)輸序列，相應(yīng)的變體或片段或衍生物定義為一序列，其與一個(gè)本身的蛋白共享如上所定義的至少30%、50%、70%、80%、90%、95%、98%、或甚至99%的序列一致性，該本身的蛋白用作為運(yùn)輸序列。在本發(fā)明嵌合肽的一優(yōu)選實(shí)施例中，第一域的運(yùn)輸序列包括衍生自人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV)1TAT蛋白的序列，86個(gè)氨基酸的一些或全部組成TAT蛋白。對(duì)于本發(fā)明的運(yùn)輸序列，全長(zhǎng)的TAT蛋白的部分序列用于形成TAT蛋白的功能有效的片段，例如，TAT肽，其包括調(diào)解進(jìn)入和吸收入細(xì)胞的區(qū)域。通過(guò)使用已知的技術(shù)(例如Frankedetal.，Proc.Natl.Acad.Sci，USA86:7397-7401(1989))，可確定該序列是否室TAT蛋白的功能有效的片段。因此，本發(fā)明的嵌合肽的第一域中的運(yùn)輸序列可衍生自TAT蛋白序列的功能有效的片段或部分，其具有氨基酸少于86，并且其示出可吸收入細(xì)胞，甚至可隨意地吸收入細(xì)胞核。更優(yōu)選的，TAT的部分序列(片段)可用作調(diào)解嵌合肽的滲透性，以越過(guò)細(xì)胞膜，該部分序列可包括全長(zhǎng)TAT的堿性區(qū)域(氨基酸48到57或49到57)。根據(jù)一更優(yōu)選的實(shí)施例，本發(fā)明的運(yùn)輸序列可包括一氨基酸序列，其包括TAT殘基48到57或49到57，以及最優(yōu)選的一般的TAT序列NH2-Xnb-RKKRRQRRR-Xnb-C00H[SEQIDNO:7]，其中，Xnb如上所定義?？蛇x擇的，本發(fā)明的運(yùn)輸序列可包括一肽，其包括例如氨基酸序列NH2-GRK證Q,-COOH[SEQIDNO:5]。根據(jù)另一更優(yōu)選的實(shí)施例，本發(fā)明的運(yùn)輸序列可包括如上所陳述序列的D逆反肽，例如一般TAT序列的D逆反序列，該一般TAT序列具有序列NH2-Xnb-RRRQRRKKR-Xnb-COOH[SEQIDN0:8]，同樣在此，Xnb如上所定義(優(yōu)選的代表D氨基酸)。而且，在任意的SEQIDN0:7-8中，〃X/殘基的數(shù)目不限于所描述的一個(gè)，并且可與上面描述的不一樣。最優(yōu)選的，本發(fā)明的運(yùn)輸序列可包括D逆反序列NH廠RRRQRRKKRG-COOH[SEQIDNO:6]。根據(jù)另一優(yōu)選實(shí)施例，本發(fā)明的運(yùn)輸序列可包括如上所定義的運(yùn)輸序列相應(yīng)的變體。優(yōu)選的，"運(yùn)輸序列相應(yīng)的變體"是衍生自如上所定義的運(yùn)輸序列的序列，其中該相應(yīng)的變體包括修飾，例如，如上所定義的運(yùn)輸序列中的至少一個(gè)氨基酸的添加、(內(nèi)部的)刪除(導(dǎo)致形成片段)和/或取代。特別地，該修飾包括1到20，優(yōu)選的1到10，以及最優(yōu)選的1到5個(gè)氨基酸的取代、添加和/或刪除。而且，優(yōu)選的，該相應(yīng)的變體示出與如上所定義的運(yùn)輸序列至少大約30%、50%、70%、80%、90%、95%、98%或甚至99%的序列一致性，更優(yōu)選的與任意的SEQIDNO:5to8的序列一致性。優(yōu)選的，該運(yùn)輸序列的修飾導(dǎo)致了運(yùn)輸序列增加或降低穩(wěn)定性?？蛇x擇的，運(yùn)輸序列的相應(yīng)的變體可設(shè)計(jì)為調(diào)解本發(fā)明的嵌合肽的細(xì)胞內(nèi)的位置。當(dāng)外生地進(jìn)行添加，特別地，設(shè)計(jì)如上所定義的該相應(yīng)的變體，以便保留運(yùn)輸序列進(jìn)入細(xì)胞的能力(例如，運(yùn)輸序列相應(yīng)的變體吸收進(jìn)入細(xì)胞充分地與用作運(yùn)輸序列的本身的蛋白相似)。例如，堿性區(qū)域的變更被認(rèn)為對(duì)于細(xì)胞核的位置很重要(例如DangandLee，J.Biol.Chem.264:18019-18023(1989);Hauberetal.，J,Virol.63:1181—1187(1989);etal.，J.Virol.63:1-8(1989))，其可使得JNK抑制劑序列的運(yùn)輸序列的細(xì)胞質(zhì)的位置或部分細(xì)胞質(zhì)的位置，為本發(fā)明的嵌合肽的成分。另外，進(jìn)一步的修飾可引入相應(yīng)的變體，例如通過(guò)耦聯(lián)，將例如膽固醇或別的類(lèi)脂半族耦聯(lián)到運(yùn)輸序列，以生成具有增強(qiáng)的膜溶解性的運(yùn)輸序列。特別地，通過(guò)使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的技術(shù)(例如Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.，Maniatis,T.(1989)Molecularcloning:Alaboratorymanual.2ndedition.ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.)，可生成任意的如上所公開(kāi)的本發(fā)明的運(yùn)輸序列相應(yīng)的變體。作為第二域，特別地，本發(fā)明的嵌合肽可包括本發(fā)明的JNK抑制劑序列，其選自如上所公開(kāi)的任意的本發(fā)明的JNK抑制劑序列，包括這些抑制劑序列的相應(yīng)的變體、片段和/或衍生物。該兩個(gè)域，例如本發(fā)明嵌合肽的第一和第二域可耦聯(lián)在一起，以形成功能單元。本領(lǐng)域熟知的任意的耦聯(lián)第一和第二域的技術(shù)都可使用。根據(jù)一實(shí)施例，優(yōu)選的，通過(guò)共價(jià)鍵，將本發(fā)明的嵌合肽的第一和第二域耦聯(lián)在一起。在此所定義的共價(jià)鍵可以是例如肽結(jié)合，其可通過(guò)將本發(fā)明的嵌入蛋白表達(dá)為融合蛋白以獲得?？梢耘c如下所描述的標(biāo)準(zhǔn)的重組細(xì)胞DNA技術(shù)相類(lèi)似或適當(dāng)改變的方法，形成并使用融合蛋白。然而，也可經(jīng)過(guò)側(cè)鏈耦聯(lián)兩個(gè)域，或通過(guò)化學(xué)耦聯(lián)體兩個(gè)半分子耦聯(lián)兩個(gè)域。在本發(fā)明的嵌合肽中，本發(fā)明的第一和/或第二域可出現(xiàn)一個(gè)或多個(gè)復(fù)本。如果兩個(gè)域出現(xiàn)在單一的復(fù)本中，第一域可耦聯(lián)到第二域的N-末端或C-末端。如果出現(xiàn)在多個(gè)復(fù)本中，第一和第二域可以任意可能的順序排列。例如，第一域可以多個(gè)復(fù)本數(shù)目，出現(xiàn)在本發(fā)明的嵌合肽中，例如以2、3或更多復(fù)本，優(yōu)選的其以連續(xù)的順序排列。接著，第二域可出現(xiàn)在單一復(fù)本中，并發(fā)生在具有第一域的序列的N-或C-末端?？蛇x擇的，第二域可以多個(gè)復(fù)本數(shù)目出現(xiàn)，例如以2、3或更多的復(fù)本，并且第一域可以單一復(fù)本出現(xiàn)。根據(jù)兩者可替換的，第一和第二域可發(fā)生在連續(xù)排列的任意位置。如下示出示范性的排列例如第一域-第一域-第一域-第二域；第一域-第一域-第二域-第一域；第一域-第二域-第一域-第一域；或例如第二域-第一域-第一域-第一域。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可理解的，這些例子僅作為示范性的目的，本發(fā)明并不限于該范圍。因此，作為初始化定義，復(fù)本的數(shù)目和排列可以各不相同。優(yōu)選的，第一和第二域可以直接地互相耦聯(lián)而不需要任意耦聯(lián)體。可選擇的，經(jīng)過(guò)耦聯(lián)體序列，它們可以互相耦聯(lián)，該耦聯(lián)體序列具有1到10，優(yōu)19選的1到5氨基酸。優(yōu)選的，形成耦聯(lián)體序列的氨基酸選自作為氨基酸殘基的氨基乙酸或脯氨酸。更優(yōu)選的，通過(guò)2、3或多個(gè)脯氨酸殘基，第一和第二域可相互隔離，該脯氨酸殘基位于第一和第二域之間。如上所定義的本發(fā)明的嵌合肽，包括至少一個(gè)第一和至少一個(gè)第二域，并可包括L-氨基酸、D-氨基酸或兩者的組合。因此，每一個(gè)域(以及耦聯(lián)體所使用的)可包括L-氨基酸、D-氨基酸或兩者的組合(例如D-TAT和L-IB1(s)或L-TAT和D-IBl(s)等等)。優(yōu)選的，本發(fā)明的嵌合肽包括至少l，優(yōu)選至少3，更優(yōu)選至少6，以及進(jìn)一步更優(yōu)選至少10個(gè)L-氨基酸和/或D-氨基酸，其中，D-和/或L-氨基酸在本發(fā)明的嵌合肽中，以區(qū)組、非區(qū)組或可替換的方式排列。根據(jù)一特定實(shí)施例，本發(fā)明的嵌合肽包括L-氨基酸嵌合肽，其依據(jù)一般的L-TAT-IB肽[NH廠Xnb-RKKRRQRRR-Xnb-Xna-RPTTLXLXXXXXXXQD-Xnb-C00H，SEQIDN0:10]，其中，優(yōu)選的，X、V和X如上所定義。更優(yōu)選的，本發(fā)明的嵌合肽包括L-氨基酸嵌合肽L-TAT-IBl[NH2-GRKKRRQRRRPPRPKRPTTLNLFPQVPRSQD-C00H，SEQIDNO:9]。根據(jù)本發(fā)明一可選擇的特定的實(shí)施例，本發(fā)明的嵌合肽包括如上所公開(kāi)的L-氨基酸嵌合肽的D-氨基酸嵌合肽。根據(jù)本發(fā)明的示范性的D逆反嵌合肽是例如，一般的D-TAT-IB肽[NH2-Xnb-DQXXXXXXXLXLTTPR-Xna-Xnb-RRRQR腿R-Xnb-C00H,SEQIDNO:12]。在此，優(yōu)選的，X、Xna和Xnb如上所定義(優(yōu)選的，代表D氨基酸)。更優(yōu)選的，本發(fā)明的嵌合肽包括D-氨基酸嵌合肽，其依據(jù)TAT-IBl肽[NH2-DQSRPVQPFLNLTTPRKPRPPRRRQRRKKRG-C00H,SEQIDNO:11]。然而，第一和第二域(代替PP)可包括-Xna-Xnb-，其如上所定義。特別地，SEQIDNO:ll的第二域，最終以-Xna-Xnb-代替(PP)，通過(guò)1、2、3、4或5個(gè)氨基酸，可在N-和/或C-末端將其刪除。在另一優(yōu)選實(shí)施例中，通過(guò)1或2氨基酸，可在其N(xiāo)-和/或C-末端刪除SEQIDNO:11的第一域。這些刪除可與第二域的末端的氨基酸殘基的刪除相組合。因此，SEQIDNO:11優(yōu)選的變體是例如如下的序列，其在N-和/或C-末端，具有第二域的刪除QSRPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRRQRRKKRG、SRPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-R,RRKKRG、RPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRRQRR證G、PVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRRQRRKKRG，或VQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-證QRRKKRG或、分別DQSRPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-RRRQRRKKRG、DQSRPVQPFLNLTTPRK-Xna-Xnb-RR,RKKRG、DQSRPVQPFLNLTTPR-Xna-Xnb-R,RRKKRG、DQSRPVQPFLNLTTP-Xna-Xnb-RRRQRR臓G、DQSRPVQPFLNLTT-Xna-Xnb-RRRQRRKKRG、或QSRPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-證Q腿KRG、SRPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-腿QRR證G、SRPVQPFLNLTTPRK-Xna-Xnb-RRRQRRKKRG、RPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-R,腿KRG、RPVQPFLNLTTPRK-Xna-Xnb-RRRQRRKKRG或PVQPFLNLTTP-Xna-Xnb-RRRQRRKKRG。優(yōu)選的實(shí)施例，包括僅僅在第一域的末端刪除QSRPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-,QRR證、QSRPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRRQRRKK、QSRPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRQR腿RG、QSRPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RQR腿RG、QSRPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRQR腿R、QSRPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RQRR證、QSRPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RQRRKK。在第一和第二域中刪除的組合的例子是QSRPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRRQRRKKR、SRPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-腿QR腿R、RPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRRQRRKKR、PVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRRQRR證、或VQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRRQRRKKR或、分別的、-Xna-Xnb-證QRR證、DQSRPVQPFLNLTTPRK-Xna-Xnb-R,RRKKR、DQSRPVQPFLNLTTPR-Xna-Xnb-RRRQRRKKR、DQSRPVQPFLNLTTP-Xna-Xnb-RRRQRRKKR、DQSRPVQPFLNLTT-Xna-Xnb-RRRQRRKKR、或QSRPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-RRRQR腿R、SRPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-RRRQRRKKR、SRPVQPFLNLTTPRK-Xna-Xnb-RRRQRRKKR、RPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-RRRQRRKKR、RPVQPFLNLTTPRK-Xna-Xnb-RRRQRRKKR或PVQPFLNLTTP-Xna-Xnb-RRRQRRKKR、QSRPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRRQR腿、SRPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRRQRRKKRG、RPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRRQRRKK、PVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-證QRRKK、或VQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRRQ腿K或、分別地，DQSRPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-腿QR腿、DQSRPVQPFLNLTTPRK-Xna-Xnb-R卿RRKK、DQSRPVQPFLNLTTPR-Xna-Xnb-RRRQRRKK、DQSRPVQPFLNLTTP-Xna-Xnb-RRRQRRKK、DQSRPVQPFLNLTT-Xna-Xnb-RRRQRRKK、或QSRPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-RRRQRRKK、SRPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-RRRQRRKK、SRPVQPFLNLTTPRK-Xna-Xnb-RRRQRRKK、RPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-R,RRKK、RPVQPFLNLTTPRK-Xna-Xnb-RRRQRRKK或PVQPFLNLTTP-Xna-Xnb-,Q腿K、QSRPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-,RRKKR、SRPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRQRRKKR、RPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRQRRKKR、PVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRQRRKKR、或VQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRQRRKKR或、分別地，DQSRPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-RRQRRKKR、DQSRPVQPFLNLTTPRK—Xna-Xnb—RRQRRKKR、DQSRPVQPFLNLTTPR-Xna-Xnb-RRQ腿KR、DQSRPVQPFLNLTTP-Xna-Xnb-RRQRR腿、DQSRPVQPFLNLTT-Xna-Xnb-RRQ腿KR、或QSRPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-RRQRR腿、SRPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-,RRKKRG、SRPVQPFLNLTTPRK-Xna-Xnb-RRQRRKKRG、RPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-RRQRRKKRG、RPVQPFLNLTTPRK-Xna-Xnb-RRQRRKKRG或PVQPFLNLTTP-Xna-Xnb-RRQRRKKRG、QSRPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRQRRKKRG或SRPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRQRR證G或RPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRQRRKKRG或PVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-,RRKKRG、或VQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRQRRKKRG或、分別地，DQSRPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-RRQRRKKRG、DQSRPVQPFLNLTTPRK-Xna-Xnb-RRQRRKKRG、DQSRPVQPFLNLTTPR-Xna-Xnb-RRQRRKKRG、DQSRPVQPFLNLTTP-Xna-Xnb-RRQR腿RG、DQSRPVQPFLNLTT-Xna-Xnb-,RRKKRG、或QSRPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-RRQRRKKRG、SRPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-RRQRRKKRG、SRPVQPFLNLTTPRK-Xna-Xnb-RRQRRKKRG、RPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-RRQRRKKRG、RPVQPFLNLTTPRK-Xna-Xnb-RRQRRKKRG或PVQPFLNLTTP-Xna-Xnb-RRQR匿RG、QSRPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RQ腿KRG、SRPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RQRRKKRG、RPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RQRR證G、PVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RQRRKKRG、或VQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RQRRKKRG或、分別地，DQSRPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-RQRRKKRG、DQSRPVQPFLNLTTPRK-Xna-Xnb-RQRRKKRG、DQSRPVQPFLNLTTPR-Xna-Xnb-RQR腿RG、DQSRPVQPFLNLTTP-Xna-Xnb-RQRRKKRG、DQSRPVQPFLNLTT-Xna-Xnb-RQRRKKRG、或QSRPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-RQRRKKRG、SRPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-RQRR證G、SRPVQPFLNLTTPRK-Xna-Xnb-RQRRKKRG、RPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-RQRRKKRG、RPVQPFLNLTTPRK-Xna-Xnb-RQRRKKRG或PVQPFLNLTTP-Xna-Xnb-RQRRKKRG。再次，該肽越短，它們的(非特定的)細(xì)胞毒性就越弱。然而，肽必須保持它們的生物功能，例如，它們的細(xì)胞膜滲透性(第一域)和它們的JNK抑制劑功能(第二域)。通過(guò)化學(xué)或生物化學(xué)的耦聯(lián)體，可將如上所定義的本發(fā)明嵌合肽的第一和第二域互相耦聯(lián)在一起，并以本領(lǐng)域熟知的任意合適的方式運(yùn)載，例如通過(guò)建立第一和第二域之間的肽結(jié)合、通過(guò)將第一和第二域表達(dá)為融合蛋白、或通過(guò)將本發(fā)明嵌合肽的第一和第二域交聯(lián)。許多熟知的化學(xué)交聯(lián)方法是非特定的，例如它們不把耦聯(lián)點(diǎn)指向運(yùn)輸多肽或貨體大分子上的任意特定位置。結(jié)果，非特定的交聯(lián)劑的使用可攻擊功能位或空間上阻滯活性位，使得結(jié)合蛋白生物性地失效。因此，優(yōu)選的，使用該交聯(lián)方法，其可允許第一和第二域更多特定的耦聯(lián)。增加耦聯(lián)特定性的一種方法是在第一和第二域的其中之一或兩者中，對(duì)于功能基團(tuán)的直接化學(xué)耦聯(lián)僅出現(xiàn)一次或幾次，以交聯(lián)在一起。例如，半胱氨酸僅僅其是具有硫醇的蛋白質(zhì)氨基酸，并在許多蛋白質(zhì)中僅出現(xiàn)幾次。又例如，如果多肽沒(méi)有包括賴氨酸殘基，將為該多肽的氨基末端，選擇特定用于伯胺的交聯(lián)劑。以增加耦聯(lián)特定性的這種方法的成功使用需要該多肽在分子的區(qū)域具有合適地少的和高度活性的殘基，如果沒(méi)有分子的生物活性的失效，這將發(fā)生變更。當(dāng)半胱氨酸殘基出現(xiàn)在多肽序列的某些部分中，其中它們參與的交聯(lián)反應(yīng)另外將很可能妨礙生物活性，該半胱酸胺殘基將被取代。當(dāng)半胱酸胺殘基被取代時(shí)，特別地，希望在多肽折疊中最小化由此造成的變體。當(dāng)取代物與24半胱氨酸在化學(xué)上和空間上類(lèi)似時(shí)，在多肽折疊中的變體將最小化。由于這些原因，絲氨酸優(yōu)選作為半胱氨酸的取代物。通過(guò)以下例子對(duì)其進(jìn)行例證，將半胱氨酸引入多肽氨基酸序列中，用于交聯(lián)。當(dāng)引入半胱氨酸時(shí)，優(yōu)選在氨基或羧基末端或附近進(jìn)行引入?？墒褂贸Ｒ?guī)的方法用于該氨基酸序列的修飾，其中，通過(guò)化學(xué)合成或重組DNA表達(dá)，可生成該多肽。經(jīng)過(guò)耦聯(lián)劑或連接劑，可實(shí)現(xiàn)第一和第二域的耦聯(lián)。目前有許多可使用的分子間的交聯(lián)劑(例如，MeansandFeeney，CHEMICALMODIFICATIONOFPROTEINS,Holden-Day，1974,pp.39-43)。其中這些試劑是，例如珀酰亞胺基-3-(2-吡啶二硫)丙酸酯(SPDP)或N，N，-(1，3-亞甲苯基)雙馬來(lái)酰亞胺(兩者都特用于巰基并且形成不可逆的聯(lián)接)；N，N'-乙撐雙(碘代乙酰胺)或別的具有6到11個(gè)碳亞甲橋的試劑(其相對(duì)特用于巰基)；1，5_二氟-2，4-二硝基苯(其與氨基團(tuán)和酪氨酸基團(tuán)形成不可逆的聯(lián)接)。別的此用途的交聯(lián)試劑包括p，p'-二氟-m，m'-二硝基苯(其與氨基和酚基團(tuán)形成不可逆的交聯(lián))；二甲氧苯丙胺(其特用于氨基團(tuán))；苯酚-l，4磺酰氯(其主要地與氨基團(tuán)起反應(yīng))；六亞甲基二異氰酸或二異硫氰酸鹽、或苯偶氮基對(duì)二異氰酸鹽(其主要與氨基團(tuán)起反應(yīng))；戊二醛(其主要與幾個(gè)不同的側(cè)鏈起反應(yīng))和去重氮聯(lián)苯胺(其主要與酪氨酸和組氨酸起反應(yīng))。交聯(lián)劑可以是同雙功能的，例如具有兩個(gè)功能基團(tuán)，它們經(jīng)歷相同的反應(yīng)。優(yōu)選的同雙功能的交聯(lián)劑是bismaleimidohexane("BMH")。BMH包括兩個(gè)馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)，其主要與巰基起反應(yīng)-在中性條件下(pH6.5-7.7)含有混合物。該兩個(gè)馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)通過(guò)碳?xì)浠衔镦滖盥?lián)在一起。因此，BMH對(duì)于多肽的不可逆交聯(lián)是很有用的，該多肽包括有半胱氨酸殘基。交聯(lián)劑也可以是異雙功能的。異雙功能交聯(lián)劑具有兩個(gè)不同的基團(tuán)，例如氨基反應(yīng)基團(tuán)和硫醇反應(yīng)基團(tuán)，其可將具有自由氨和硫醇的兩個(gè)蛋白分別耦聯(lián)在一起。異雙功能交聯(lián)劑的例子是琥珀酰亞胺4-(N-甲基異馬來(lái)酰亞胺)環(huán)己胺-1-羧酸酯(〃SMCC〃)、m-苯甲酰異馬來(lái)酰亞胺-N-羥基丁二酰亞胺酯(〃MBS〃)、以及琥珀酰亞胺4-(p-苯基異馬來(lái)酰亞胺)丁酸酯(〃SMPB〃)，其是MBS伸展鏈的相似體。這些交聯(lián)劑的琥珀酰亞胺基團(tuán)與伯胺反應(yīng)，并且硫醇反應(yīng)馬來(lái)酰亞胺與半胱胺酸形成共價(jià)的結(jié)合。交聯(lián)劑在水中通常具有低溶解性。親水基團(tuán)例如磺酸酯可添加到交聯(lián)劑中，以提高其水溶性。在這方面，Sulfo-MBS和Sulfo-SMCC是交聯(lián)劑作水溶性修改后的例子，根據(jù)本發(fā)明可對(duì)其進(jìn)行使用。許多交聯(lián)劑產(chǎn)生一個(gè)變體，即其在細(xì)胞條件下本質(zhì)上是不可裂開(kāi)的。然而，一些交聯(lián)劑包括共價(jià)鍵例如二硫化物，其在細(xì)胞條件下是可裂開(kāi)的。例如，Traut試劑、二硫代雙(succinimidylpropionate)(〃DSP〃)、以及N-琥珀酰亞胺基3-(2-吡啶二硫基)丙酸酯("SPDP")都是熟知的可裂的交聯(lián)劑?？闪训慕宦?lián)劑的使用使得在進(jìn)入目標(biāo)細(xì)胞后，貨體基團(tuán)和載體多肽相分離。也可使用直接的二硫化物的聯(lián)接。包括如上討論的許多交聯(lián)劑都作為商業(yè)使用。對(duì)它們的詳細(xì)介紹可通過(guò)商業(yè)的供應(yīng)商獲得。對(duì)于蛋白交聯(lián)和共軛準(zhǔn)備的通常參考文獻(xiàn)是Wong，CHEMISTRYOFPROTEINCONJUGATIONANDCROSSLINKING，CRCPress(1991)?；瘜W(xué)交聯(lián)的包括間隔臂的使用。間隔臂提供分子內(nèi)的柔性或調(diào)節(jié)共軛基團(tuán)之間的分子內(nèi)的距離，并因此有助于保持生物活性。間隔臂可以是多肽基團(tuán)的形式，其包括間隔氨基酸，例如脯氨酸?？蛇x擇的，間隔臂可以是交聯(lián)劑的一部分，例如在長(zhǎng)鏈SPDP中(PierceChem.Co.,Rockford，IL.,cat.No.21651H)。而且，如上所公開(kāi)的一個(gè)嵌合肽的相應(yīng)的變體/片段或衍生物在次也作了公開(kāi).對(duì)于片段和變體，通常是指如上對(duì)JNK抑制劑序列所作的定義。特別地，在本文中，"嵌合肽相應(yīng)的變體"優(yōu)選的是一序列，其衍生自根據(jù)SEQIDNO:9到12的任意序列，其中嵌合肽相應(yīng)的變體包括本發(fā)明的根據(jù)SEQIDNO:9到12的嵌合肽的氨基酸的變體。該變體特別地包括1到20、優(yōu)選的1到10、以及更優(yōu)選的1到5個(gè)根據(jù)SEQIDNO:9到12的氨基酸的取代、添加和/或刪除(產(chǎn)生的片段)其中，變體的本發(fā)明的嵌合肽示出與根據(jù)SEQIDNO:9、10、11或12的任意序列的至少大約30%、50%、70%、80%、或95%、98%、或甚至99%的一致性。優(yōu)選的，這些相應(yīng)的變體保留了包含在本發(fā)明中的嵌合肽的第一和第二域的生物活性，例如，如上所公開(kāi)的第一域的運(yùn)輸活性，以及抑制第二域的的活性，該活性用于結(jié)合JNK和/或抑制至少一個(gè)JNK激活的轉(zhuǎn)錄因子的活性。因此，本發(fā)明的嵌合肽也可包括在前所公開(kāi)的本發(fā)明的嵌合肽的片段，特別地是本發(fā)明的根據(jù)SEQIDNO:9、10、11或12的嵌合肽序列。因此，在本文中，"本發(fā)明的嵌合肽的片段"優(yōu)選的是一序列，其衍生自任意的根據(jù)SEQIDNO:9、10、11或12的序列，其中該片段包括任意的SEQIDNO:9、10、11或12的至少4個(gè)連續(xù)的氨基酸。該片段優(yōu)選包括的長(zhǎng)度是足夠可使得從任意的這些序列中特定識(shí)別出抗原決定基，并將該序列運(yùn)輸入細(xì)胞、細(xì)胞核或進(jìn)一步優(yōu)選的位置。甚至更優(yōu)選的，該片段包括任意的SEQIDNO:9、10、11或12的4到18、4到15、或最優(yōu)選的4到10個(gè)連續(xù)的氨基酸。本發(fā)明的嵌合肽的片段進(jìn)一步可定義為一序列，其與根據(jù)SEQIDNO:9、10、11或12的任意序列共享至少大約30%、50%、70%、80%、或95%、98%、或甚至99%的序列一致性。最后，本發(fā)明的嵌合肽也包括在前所公開(kāi)的本發(fā)明的嵌合肽的衍生物，特別地是根據(jù)SEQIDNO:9、10、11或12的本發(fā)明的嵌合肽。另外，本發(fā)明也涉及到核酸序列，其對(duì)如上多定義的本發(fā)明的JNK抑制劑序列、嵌合肽或它們的片段、變體或衍生物進(jìn)行編碼。優(yōu)選的合適的對(duì)本發(fā)明的JNK抑制劑序列進(jìn)行編碼的核酸選自人類(lèi)IB1核酸(GenBankAccessionNo.(AF074091)，ratIB1nucleicacid(GenBankAccessionNo.AF108959)，orhumanIB2(GenBankAccessionNoAF218778)。通過(guò)本領(lǐng)域熟知的方法(例如，通過(guò)PCR擴(kuò)增并使用可雜交到序列3'-和5'-末端的合成引物和/或從cDNA或基因組文庫(kù)克隆并使用特用于給定的基因序列的低核苷酸序列)，可得到編碼本發(fā)明的JNK抑制劑序列或嵌合肽的核酸。另外，在此也公開(kāi)了核酸序列，其可嚴(yán)格的條件下，與編碼如上所定義的(本身的)本發(fā)明的JNK抑制劑序列或嵌合肽的合適的鏈雜交。優(yōu)選的，該核酸序列包括至少6(連續(xù)的)核酸，其所具有的長(zhǎng)度足夠使得用于特定的雜交。更優(yōu)選的，該核酸序列包括6到38、甚至更優(yōu)選的6到30、以及最優(yōu)選的6到20或6到10個(gè)(連續(xù)的)核酸。"嚴(yán)格的條件"是序列依賴性，并且在不同的環(huán)境中各不相同。通常地，對(duì)于特定的序列并在定義的離子強(qiáng)度和PH，嚴(yán)格的條件可選擇為低于熱熔點(diǎn)(TM)大約5'C。該TM是指一溫度(在定義的強(qiáng)度和PH下)，在該溫度，50%的目標(biāo)序列將與完美匹配的探針相雜交。特別地，嚴(yán)格條件所指的是在其中鹽濃度至少為大約0.02摩爾、PH為7以及溫度至少大約為60°C。由于別的因素可影響雜交的嚴(yán)格性(包括堿的成分和互補(bǔ)鏈的大小)，有機(jī)溶劑的出現(xiàn)、鹽基失配的程度、以及參數(shù)的組合比任何一個(gè)絕對(duì)測(cè)量值更重要。"高嚴(yán)格的條件"可包括如下，例如，步驟l:在緩沖液中65°C條件下，對(duì)包含有DNA的濾餅通宵預(yù)處理8小時(shí)，該緩沖液包括6本SSC、50mM三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽(pH7.5)、1mMEDTA、0.02%PVP、0.02%聚蔗糖、0.02%BSA、以及500Pg/ml變性的鮭魚(yú)精液DNA。步驟2:在如上雜化前的混合物中65匸條件下，對(duì)濾餅進(jìn)行雜化48小時(shí)，在其中加入100mg/ml變性的鮭魚(yú)精液DNA和5-20*106cpm的32P標(biāo)記探針。步驟3:在包含有2*SSC、0.01%PVP、0.01%聚蔗糖和0.01%BSA的溶液中37。C條件下，對(duì)濾餅清洗1小時(shí)。步驟4:對(duì)濾餅進(jìn)行自動(dòng)射線照相。可使用本領(lǐng)域熟知的別的高嚴(yán)格性條件(例如，Ausubeletal.，(eds.)，1993，CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWileyandSons,NY;andKriegler，1990，GeneTransferandExpression,aLaboratoryManual,StocktonPress,NY)。"中等嚴(yán)格性條件"可包括如下步驟i:在包含有6*33(:、5*Denhardt's溶液、0.5%SDS和100mg/ml變性的鮭魚(yú)精液DNA的溶液中55。C條件下，對(duì)濾餅預(yù)處理6小時(shí)。步驟2:在相同溶液中添加5-20*106cpm的32P-標(biāo)記探針并在55'C條件下，對(duì)濾餅雜化18-20小時(shí)。步驟3:在包含有2*SSC，0.1%SDS的溶液中并在37'C條件下，對(duì)濾餅清洗l小時(shí)，接著，在包含有WSSC和0.1%SDS的溶液中并在6(TC的條件下，對(duì)其進(jìn)行30分鐘的兩次清洗。St印4:用吸墨紙將濾餅吸干并將其暴露進(jìn)行放射自顯影。可使用本領(lǐng)域熟知的別的中等嚴(yán)矛各條/f牛(例如，Ausubeletal.，(eds.)，1993，CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWileyandSons,NY;andKriegler，1990，GeneTransferandExpression,aLaboratoryManual,StocktonPress,NY)。最后，"低嚴(yán)格性條件"可包括步驟l:在包含有35%甲酰胺、5XSSC、50mM三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽(pH7.5)、5mMEDTA、0.1%PVP、0.1%聚蔗糖、1%BSA、以及500Pg/ml變性的鮭魚(yú)精液DNA的溶液中并在4(TC條件下，對(duì)濾餅預(yù)處理6小時(shí)。步驟2:在相同溶液中添加0.02%PVP、0.02%聚蔗糖，0.2%BSA，100Pg/ml鮭魚(yú)精液DNA、10%(wt/vo1)葡聚糖酶、以及5-20x106cpm的32P-標(biāo)記探針并在4(TC條件下，對(duì)濾餅雜化18-20小時(shí)。步驟3:在包含有2XSSC、25mM三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽(pH7.4)、5mMEDTA、以及0.1%SDS的溶液中并在55'C條件下，對(duì)濾餅清洗1.5小時(shí)。可用新的溶液將該清洗溶液取代，并在6(TC條件下，對(duì)其進(jìn)行額外的1.5小時(shí)的保溫試驗(yàn)。步驟4:用吸墨紙將濾餅吸干并將其暴露進(jìn)行放射自顯影。如果必須的話，可在65-68。C條件下，對(duì)濾餅進(jìn)行第三次清洗，并進(jìn)行重暴露拍攝。可使用本領(lǐng)域熟知的別的低嚴(yán)格性條件(例如，用于交叉種類(lèi)雜化)。例如，Ausubeletal.，(eds.)，1993，CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY,JohnWileyandSons,NY;andKriegler，1990，GENETRANSFERANDEXPRESSION,ALABORATORYMA腿L，StocktonPress,NY。本發(fā)明所提供的核酸序列可用于表達(dá)本發(fā)明的肽，例如本發(fā)明的JNK抑制劑序列或本發(fā)明的用于分析、表征或治療使用的嵌合肽；以及用作組織標(biāo)記，在其中擇優(yōu)地表達(dá)相應(yīng)的(本發(fā)明的)肽(要么在結(jié)構(gòu)上或在組織分化或發(fā)展的特定階段或在疾病階段)。別的核酸使用包括例如核酸的凝膠電泳中的分子量標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施例，也提供表達(dá)載體，用于如上所定義的一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的JNK抑制劑序列和/或嵌合肽的重組表達(dá)。術(shù)語(yǔ)"表達(dá)載體"在此用于標(biāo)明環(huán)形或線型的DNA或RNA，其要么是雙鏈或是單鏈。其進(jìn)一步包括至少一個(gè)本發(fā)明的核酸，并被傳送到宿主細(xì)胞或單細(xì)胞或多細(xì)胞宿主有機(jī)體。本發(fā)明的表達(dá)載體優(yōu)選的包括本發(fā)明核酸，用于編碼本發(fā)明的JNK抑制劑序列或片段或相應(yīng)的變體，或本發(fā)明的嵌合肽、或片段或相應(yīng)的變體。另29外，根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)載體包括用于支持表達(dá)的合適的成分，包括調(diào)整成分，例如來(lái)自病毒、細(xì)菌、植物、哺乳動(dòng)物和別的真核生物源的強(qiáng)化因子/促進(jìn)因子，以驅(qū)動(dòng)宿主細(xì)胞中插入的多核苷酸的表達(dá)，例如絕緣體、邊界元素、LCR(例如BlackwoodandKadonaga(1998)，Science281，61-63中所描述的)或核基質(zhì)/支架附著區(qū)(例如Li,HarjuandPeterson,(1999)，TrendsGenet.15，403-408中所描述的)。在一些實(shí)施例中，調(diào)整成分是異種的(例如，非本身的基因促進(jìn)因子)?？蛇x擇的，通過(guò)用于基因和/或側(cè)翼區(qū)的本身的促進(jìn)因子，也可提供必需的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)。術(shù)語(yǔ)"促進(jìn)因子"在此用于指DNA的一區(qū)域，其用于控制一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的核酸序列的轉(zhuǎn)錄，并可通過(guò)依賴于DNA的RNA聚合酶的結(jié)合位和別的DNA序列的出現(xiàn)，對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)上的識(shí)別，以產(chǎn)生交互作用從而調(diào)整促進(jìn)功能。促進(jìn)促進(jìn)因子的片段的功能表達(dá)是縮短的或截?cái)嗟拇龠M(jìn)序列，其作為促進(jìn)因子保留活性。通過(guò)本領(lǐng)域熟知的任意驗(yàn)定法，可測(cè)量促進(jìn)因子的活性(例如Wood,deWet,Dewji，andDeLuca，(1984)，BiochemBiophys.Res.Commun.124，592-596;SeligerandMcElroy，(1960)，Arch.Biochem.Biophys.88，136-141)orcommerciallyavailablefromPromega)。在本發(fā)明表達(dá)載體中所使用的"強(qiáng)化區(qū)域"特別地是指DNA的一區(qū)域，其用于增加一個(gè)或多個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄。更特別地，在此所使用的術(shù)語(yǔ)"強(qiáng)化因子"是DNA調(diào)整成分，用于增強(qiáng)、擴(kuò)大、改善或改良基因的表達(dá)，唯視要表達(dá)的基因，而無(wú)論其位置和方向。其也可以增強(qiáng)、擴(kuò)大、改善或改良多于一個(gè)促進(jìn)因子的表達(dá)。如上所定義的用于本發(fā)明的表達(dá)載體的促進(jìn)因子/強(qiáng)化因子序列可使用植物、動(dòng)物、昆蟲(chóng)或真菌調(diào)整序列。例如，可使用來(lái)自酵母菌或別的真菌的促進(jìn)因子/強(qiáng)化因子成分(例如，GAL4促進(jìn)因子、醇脫氫酶促進(jìn)因子、磷酸甘油激酶促進(jìn)因子、堿性磷酸酶促進(jìn)因子)?？蛇x擇的或另外的，它們包括動(dòng)物轉(zhuǎn)錄控制區(qū)，例如，(i)胰腺細(xì)胞內(nèi)激活的胰島素基因控制區(qū)(例如，Hanahan,etal.，1985.Nature315:115-122);(ii)淋巴細(xì)胞內(nèi)激活的免疫球蛋白基因控制區(qū)(例如Grosschedl，etal.，1984，Cell38:647-658);(iii)肝內(nèi)激活的白蛋白基因控制區(qū)(例如，Pinckert，etal.，1987.GenesandDev1:268-276);(iv)腦少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)激活的髓磷脂堿性蛋白基因控制區(qū)(例如，Readhead，etal.，1987，Cell48:703-712);以及(v)丘腦下部激活的促進(jìn)性腺激素-釋放荷爾蒙基因控制區(qū)(例如，Mason,etal.，1986，Science234:1372-1378),等等。另外地，本發(fā)明的表達(dá)載體可包括擴(kuò)增標(biāo)記。改擴(kuò)增標(biāo)記可選自例如腺苷脫胺酶(ADA)、二氫葉酸還原酶(DHFR)、多重抗藥性基因(MDR)、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶(ODC)和N-(磷酸乙酰)-L-)冬氨酸酯抵抗(CAD)。對(duì)如上定義的蛋白進(jìn)行編碼的基因的擴(kuò)增，例如感興趣的蛋白(POI)和/或本發(fā)明的融合蛋白，使得增加了這些蛋白的表達(dá)水平，以高于細(xì)胞中載體的整合(Kaufmanetal.(1985)，Mol.CellBiol.5，1750-1759)。示范性的表達(dá)載體或它們的適合于本發(fā)明的衍生物，特別地包例如人類(lèi)或動(dòng)物的病毒(例如，牛痘病毒或腺病毒)；昆蟲(chóng)病毒(例如，桿狀病毒)；酵母菌載體；噬菌體載體(例如，噬菌體)；質(zhì)粒病毒載體和粘粒載體。另外，本發(fā)明提供了許多宿主載體系統(tǒng)，其可用于表達(dá)對(duì)如上定義的本發(fā)明的核酸的序列進(jìn)行編碼的肽。這些包括但不限于(i)哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)，其可被牛痘病毒、腺病毒等等所感染；(ii)昆蟲(chóng)細(xì)胞系統(tǒng)，其可被桿狀病毒等等所感染；(iii)包含有酵母菌載體的酵母菌、或(iv)用噬菌體、DNA、質(zhì)粒DNA或粘粒DNA實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化的細(xì)菌。依賴于宿主載體系統(tǒng)的使用，可使用一些合適的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)運(yùn)成分。優(yōu)選的，所選擇的適合于該宿主載體系統(tǒng)的宿主細(xì)胞體是可以調(diào)節(jié)插入的感興趣的序列的表達(dá)、或修飾或處理表達(dá)的肽，通過(guò)該序列以期望的特定方式對(duì)該肽進(jìn)行編碼。另外，在選擇的受體菌中，出現(xiàn)特定的誘導(dǎo)劑可增強(qiáng)來(lái)自特定促進(jìn)因子的表達(dá)；因此便于控制基因改造肽的表達(dá)。而且，不同的宿主細(xì)胞擁有特有的和特定的機(jī)制，從而對(duì)表達(dá)的肽進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)和后轉(zhuǎn)運(yùn)處理，以及修飾(糖基化、磷酸化等等)。因此，選擇合適的細(xì)胞系或宿主系統(tǒng)，以確保實(shí)現(xiàn)對(duì)外來(lái)肽的期望的修飾和處理。例如，在細(xì)菌系統(tǒng)內(nèi)的肽表達(dá)可用于生成非糖基化的核心肽；然而，哺乳動(dòng)物內(nèi)的表達(dá)確保了異源肽的"本身的"糖基化。本發(fā)明進(jìn)一步提供抗體，以直接對(duì)抗本發(fā)明的JNK抑制劑序列和/或本發(fā)明的嵌合肽。而且，提供用于生產(chǎn)抗體的方法，以特用于根據(jù)本發(fā)明的JNK抑制劑序列或本發(fā)明的包含該抑制劑序列的嵌合肽。根據(jù)本發(fā)明，可象使用免疫原一樣，使用JNK抑制劑序列和/或本發(fā)明的嵌合肽，以及相應(yīng)的片段、變體或衍生物，以生成抗體，從而免疫特定地結(jié)合這些肽成分。這些抗體包括例如多克隆的、單克隆的、嵌入的、單鏈、Fab片段和Fab表達(dá)庫(kù)。在一特定的實(shí)施例中，本發(fā)明提供抗體給如上定義的本發(fā)明的嵌合肽或JNK抑制劑序列。本領(lǐng)域熟知的各種生產(chǎn)過(guò)程可用于生產(chǎn)這些抗體。作為例子，通過(guò)注射任意的如上定義的本發(fā)明的嵌合肽或JNK抑制劑序列，可對(duì)各種不同的宿主動(dòng)物進(jìn)行免疫，以生成多克隆抗體。因此，可使用各種佐劑，以增加免疫響應(yīng)，其包括但不限于Freund's佐劑(完全的或非完全的)、礦物凝膠(例如，氫氧化鋁)、表面活性劑(例如，溶血卵磷脂、復(fù)合多元醇、聚陰離子、肽、油乳液、二硝基酚等等)、CpG、聚合體、聚丙二醇與環(huán)氧乙烷的加聚物、以及人類(lèi)佐劑例如卡介苗和短小棒狀桿菌。對(duì)于制備導(dǎo)向如上所定義的本發(fā)明的嵌合肽或JNK抑制劑序列的單克隆抗體，可使用任意的通過(guò)連續(xù)的細(xì)胞系培養(yǎng)系統(tǒng)提供抗體分子生成的技術(shù)。這些技術(shù)包括但不限于雜種瘤技術(shù)(例如KohlerandMilstein,1975.Nature256:495-497)、三體瘤、人類(lèi)B-cell雜種瘤技術(shù)(例如Kozbor，etal.，1983，ImmunolToday4:72)和EBV雜種瘤技術(shù)，以生成人類(lèi)單克隆抗體(例如Cole，etal.,1985.In:MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,AlanR.Liss，Inc.,pp.77-96)。在本發(fā)明的實(shí)施中可使用人類(lèi)單克隆抗體，并且通過(guò)使用人類(lèi)雜種瘤(seeCote，etal.，1983.ProcNatlAcadSciUSA80:2026-2030)或通過(guò)在試管中使用EpsteinBarr病毒轉(zhuǎn)化人類(lèi)B-細(xì)胞(例如Cole，etal.，1985.In:MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy(AlanR.Liss，Inc.,pp.77-96)，轉(zhuǎn)化人類(lèi)B-細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明，可使得有關(guān)的技術(shù)適合于制備本發(fā)明的JNK抑制劑序列和/或本發(fā)明的嵌合肽特異的單鏈抗體(U.S.專(zhuān)利號(hào)4，946，778)。另外，可使得有關(guān)的方法適合于構(gòu)建Fab表達(dá)庫(kù)(例如Huseetal.,1989.Science246:1275-1281)，以使用如上所定義的這些JNK抑制劑序列和/或嵌合肽的期望的特異性，快速和有效的識(shí)別單克隆Fab段。通過(guò)使用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)(例如U.S.專(zhuān)利號(hào)5，225，539)，可將非人類(lèi)抗體人類(lèi)化。通過(guò)本領(lǐng)域熟知的技術(shù)，例如(i)通過(guò)抗體分子的胃蛋白酶消化，生成F(ab')2段；(ii)通過(guò)降低F(ab')2段的二硫鍵，生成Fab段；(iii)通過(guò)使用木瓜蛋白酶和還原劑，處理抗體分子，以生成Fab段；以及(iv)Fv段，制成關(guān)于JNK抑制劑序列和/或嵌合肽的包含有個(gè)體基因型的抗體片段。在本發(fā)明的一實(shí)施例中，篩選本發(fā)明的擁有期望特異性的抗體的方法包括但不限于酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)和別的本領(lǐng)域熟知的免疫誘導(dǎo)技術(shù)。在一特定實(shí)施例中，通過(guò)生成雜種瘤，便于選擇抗體，其中該抗體特異于本發(fā)明的JNK抑制劑序列和/或本發(fā)明的嵌合肽的一特定的抗原決定基(例如，在其中特別地包含有長(zhǎng)度從5到20、優(yōu)選的8到18和最優(yōu)選的8到11個(gè)氨基酸的片段)，該雜種瘤結(jié)合本發(fā)明的擁有該抗原決定基的JNK抑制劑序列和/或嵌合肽的片段。在此也提供特異于如上所定義的抗原決定基的這些抗體。本發(fā)明的抗體可用于本領(lǐng)域熟知的方法中，涉及到本發(fā)明的JNK抑制劑序列(和/或相應(yīng)的嵌合肽)的定位和/或定量，例如，用于在合適的生理樣本中測(cè)量肽的水平、用于診斷方法、或用于成像肽、等等。本發(fā)明的JNK抑制劑序列、嵌合肽、和/或核酸可以藥用合成物進(jìn)行闡明，也附上其構(gòu)成。除了這些材料中的一個(gè)外，這些成分可包括藥用上可接受的賦形劑、載體、緩沖劑、穩(wěn)定劑或本領(lǐng)域熟知的別的材料。這些材料應(yīng)該是無(wú)毒的，并且不能干擾活性成分的功效。載體或別的材料的準(zhǔn)確性質(zhì)取決于給藥途徑，例如，口的、靜脈內(nèi)的、皮膚的或皮下的、鼻的、肌肉的、腹膜內(nèi)的或貼劑途徑?？诜o藥的藥用合成物可以是片劑、膠囊、粉末或液體形式。片劑可包括固體載體例如凝膠或佐劑。液體藥用合成物通常包括液體載體例如水、石油、動(dòng)物或植物油、礦物油或合成油?？砂ㄉ睇}水溶液、葡萄糖或別的糖類(lèi)溶液或乙二醇例如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。對(duì)于靜脈內(nèi)、皮膚或皮下注射、或痛處位置的注射，活性成分將是非腸道可接受的水溶液，其是不致熱的，并且具有合適的PH值、等滲性和穩(wěn)定性。使用例如等滲工具例如氯化鈉注射液、林格注射液、以及乳酸林格注射液，本領(lǐng)域相關(guān)的技術(shù)可制備合適的溶液。如需要的話，可包括防腐劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑、抗氧化劑和/或別的添加劑。無(wú)論是否為多肽、肽或核酸分子、以及根據(jù)本發(fā)明的施用給個(gè)體的別的藥用上有用的混合物，給藥優(yōu)選的以"預(yù)防疾病有效數(shù)量"或"治療有效數(shù)量"(對(duì)于此例如此)，這足夠示出對(duì)個(gè)體的益處。實(shí)際給藥的數(shù)量、以及給藥的速率和時(shí)間將取決于治療的性質(zhì)和嚴(yán)重程度。治療的處方例如劑量的決定等等是一般的醫(yī)生或別的醫(yī)學(xué)專(zhuān)家的職責(zé)，并且特別地考慮治療的紊亂者、個(gè)體病人的條件、施用的位置、給藥的方法和醫(yī)生熟知的別的因子。如上所提到的這些技術(shù)和規(guī)約的例子可在"REMINGTON'SPHARMACEUTICALSCIENCES,16thedition,Osol，A.(ed)，1980."中獲得?？蛇x擇的，通過(guò)使用靶系統(tǒng)例如(靶)抗體或細(xì)胞特異性配體，靶向治療可用于施用更特異于一定類(lèi)型細(xì)胞的本發(fā)明的JNK抑制劑序列、嵌合肽和核酸。用于靶的抗體特別地更特異于與任意的如下定義的疾病相關(guān)的細(xì)胞的細(xì)胞表面蛋白。作為例子，這些抗體是指細(xì)胞表面抗體，例如，Bcell關(guān)聯(lián)表面蛋白例如MHCII級(jí)DR蛋白、CD18(LFA-1beta鏈)、CD45R0、CD40或Bgp95、或細(xì)胞表面蛋白，其選自例如CD2、CD2、CD4、CD5、CD7、CD8、CD9、CDIO、CD13、CD16、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD30、CD33、CD34、CD38、CD39、CD4、CD43、CD45、CD52、CD56、CD68、CD71、CD138等等。特別地，通過(guò)共價(jià)地結(jié)合本發(fā)明的JNK抑制劑序列、嵌合肽和核酸到特異于細(xì)胞表面蛋白的抗體、或通過(guò)結(jié)合到細(xì)胞特異配體，可準(zhǔn)備靶構(gòu)建。例如，蛋白可結(jié)合到該抗體或通過(guò)肽鍵或通過(guò)化學(xué)耦聯(lián)、交聯(lián)等等進(jìn)行結(jié)合。接著，通過(guò)如下定義的任意的給藥途徑，例如腹膜內(nèi)的、鼻的、靜脈內(nèi)的、口的或貼劑施用途徑，以施用給病人的藥用上有效的數(shù)量，執(zhí)行靶構(gòu)建，從而實(shí)施靶向治療。優(yōu)選的，例如，通過(guò)共價(jià)鍵的水解、通過(guò)肽酶或通過(guò)任意別的合適的方法，結(jié)合到如上所定義的靶抗體或細(xì)胞特異配體大的本發(fā)明的JNK抑制劑序列、嵌合肽或核酸可在生物體內(nèi)或試管中釋放?？蛇x擇的，如果本發(fā)明的JNK抑制劑序列、嵌合肽或核酸結(jié)合到小細(xì)胞特異配體，可不執(zhí)行該配體的釋放。如果出現(xiàn)在細(xì)胞表面，依據(jù)其運(yùn)輸序列的活性，本發(fā)明的嵌合肽可進(jìn)入細(xì)胞。由于不同的原因期望靶；例如如果JNK抑制劑序列、嵌合肽和核酸有不可接受的毒性或如果其需要高劑量。取代直接給藥本發(fā)明的JNK抑制劑序列和/或嵌合肽，通過(guò)來(lái)自引入細(xì)胞的編碼基因的表達(dá)，例如來(lái)自被給藥的病毒載體，可生成本發(fā)明的JNK抑制劑序列和/或嵌合肽。特別地，該病毒載體編碼本發(fā)明的JNK抑制劑序列和/或嵌合肽。該載體可耙向被治療的特異細(xì)胞。而且，該載體可包括調(diào)控元件，并可依據(jù)定義的調(diào)控，通過(guò)目標(biāo)細(xì)胞，可選擇地或多或少導(dǎo)通該調(diào)控元件。該技術(shù)代表了病毒定向酶的藥物前體治療(virus-directedenzymeprodrugtherapy,VDEPT)技術(shù)的變化，其使用成熟蛋白取代它們的前體形式?？蛇x擇地，通過(guò)使用抗體或病毒，可以前體形式，給藥本發(fā)明的JNK抑制劑序列和/或嵌合肽。接著，通過(guò)在治療的細(xì)胞中生成或靶向到其中的活化劑，可將本發(fā)明的JNK抑制劑序列和/或嵌合肽轉(zhuǎn)化為激活形式。該方法的類(lèi)型有時(shí)是熟知抗體定向酶的藥物前體治療(antibody-directedenzymeprodrugtherapy,ADEPT)或病毒定向酶的藥物前體治療(virus-directedenzymeprodrugtherapy,VDEPT);前者涉及通過(guò)結(jié)合到細(xì)胞特異抗體，將活化劑靶向到細(xì)胞，同時(shí)后者涉及通過(guò)來(lái)自病毒載體中的編碼DNA的表達(dá)，在載體中生成活化劑，例如JNK抑制劑序列或嵌合肽。(例如，EP-A-415731和WO90/07936)。本發(fā)明進(jìn)一步包括本發(fā)明的JNK抑制劑序列、嵌合肽和/或核酸的使用，以制備藥用合成物例如如上所定義的、以預(yù)防和/或治療與實(shí)驗(yàn)對(duì)象體內(nèi)的JNK活性相關(guān)的細(xì)胞增生紊亂("JNK關(guān)聯(lián)紊亂")。特別地，該根據(jù)本發(fā)明所使用的藥用合成物包括作為活性成分，例如(i)任意一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的JNK抑制劑序列和/或嵌合肽、和/或相應(yīng)的變體、片段或衍生物；和/或(ii)核酸，其編碼本發(fā)明的JNK抑制劑序列和/或嵌合肽和/或相應(yīng)的變體或片段;和/或(iii)細(xì)胞，其包括有任意一個(gè)或多本發(fā)明的JNK抑制劑序列和/或嵌合肽、和/或相應(yīng)的變體、片度或衍生物；和/或(iv)與載體和/或核酸轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，該載體和/或核酸編碼本發(fā)明本發(fā)明的JNK抑制劑序列和/或嵌合肽和/或相應(yīng)的變體或片段。特別地，根據(jù)本發(fā)明的預(yù)防和/或治療包括給藥本發(fā)明如上定義的藥用合成物。術(shù)語(yǔ)"調(diào)控"包括當(dāng)JNK過(guò)渡表達(dá)時(shí)，抑制其表達(dá)。也包括例如通過(guò)使用任意一個(gè)或多個(gè)SEQIDNO:1到4和/或9到12的肽，抑制c-jun、ATF2或NFAT4的磷酸化，其中該肽作為細(xì)胞中天然的c-jun、ATF2和NFAT4結(jié)合位的競(jìng)爭(zhēng)抑制劑。術(shù)語(yǔ)"調(diào)控"也包括抑制轉(zhuǎn)錄因子的異數(shù)或同數(shù)復(fù)合體，該轉(zhuǎn)錄因子由c-jun、ATF2或NFAT4以及它們的相關(guān)的配體組成，例如由c-jun、AFT2和c-fos組成AP-1復(fù)合體。當(dāng)細(xì)胞增生紊亂與JNK的過(guò)度表達(dá)相關(guān)時(shí)，該抑制的JNK抑制劑序列可引入到細(xì)胞。在一些例子中，"調(diào)控"可包括JNK表達(dá)的增加，例如通過(guò)使用IB-肽特異抗體，其屏蔽了IB-肽對(duì)JNK的結(jié)合，因此通過(guò)IB-關(guān)聯(lián)肽，預(yù)防JNK抑制。特別地可通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)對(duì)象給藥(在體內(nèi))所述藥用合成物的一定數(shù)量，以實(shí)現(xiàn)使用如上公開(kāi)的本發(fā)明的藥用合成物，預(yù)防和/或治療實(shí)驗(yàn)對(duì)象，其中該實(shí)驗(yàn)對(duì)象可以是例如哺乳動(dòng)物、人類(lèi)、靈長(zhǎng)類(lèi)的動(dòng)物、鼠、家鼠、狗、貓、牛、馬或豬。術(shù)語(yǔ)"治療有效"是指藥用合成物的活性成分是數(shù)量足夠的，以改善JNK關(guān)聯(lián)紊亂。如上所使用的術(shù)語(yǔ)"細(xì)胞增生紊亂"或"JNK關(guān)聯(lián)紊亂"特別地是指體內(nèi)或試管中惡性的和非惡性的細(xì)胞個(gè)數(shù)，其通常形態(tài)上和功能上不同于周?chē)慕M織，并且特別地通過(guò)JNK的異常水平所表征。"JNK的異常水平"是指實(shí)驗(yàn)對(duì)象的受治療的局部的JNK的增加或降低水平，其相對(duì)于非紊亂的實(shí)驗(yàn)對(duì)象的類(lèi)似的未被影響的局部所出現(xiàn)的。例如，本發(fā)明的藥用合成物可用于預(yù)防和/或治療各種器官系統(tǒng)的惡性腫瘤，在其中通常示出JNK的活性，例如肺、乳房、淋巴、腸胃和生殖泌尿道、以及腺癌，其包括惡性腫瘤，例如多數(shù)結(jié)腸癌、腎臟癌、前列腺癌、肺的非小細(xì)胞癌、小腸癌和食道癌。也包括與致癌轉(zhuǎn)變相關(guān)的白血病、病理生理異常，以及具有完全需要JNK活性的Bcr-Abl致癌轉(zhuǎn)變的癌癥。本發(fā)明的藥用合成物也應(yīng)用于預(yù)防和/或治療非惡性的或免疫關(guān)聯(lián)的細(xì)胞增生疾病，例如牛皮癬、尋常性天皰瘡、白塞氏綜合癥、急性呼吸困難綜合癥(ARDS)、心臟缺血性疾病、后透析綜合癥、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、獲得性免疫功能喪失綜合癥、血管炎、敗血性休克、以及別的急性炎癥類(lèi)型和含類(lèi)脂組織細(xì)胞增多癥。特別地，在病因上與JNK激酶活性相聯(lián)系的任意紊亂可認(rèn)為是容易得到預(yù)防或治療，例如與如上定義的細(xì)胞中的JNK活性相關(guān)的病理生理異常，例如再狹窄、聽(tīng)力損失、耳朵損傷、缺血、中風(fēng)和/或與免疫細(xì)胞的成熟與分化相關(guān)的病理生理異常、再灌注損傷、組織缺氧、凋亡相關(guān)的疾病(例如，發(fā)生在病毒感染中(例如AIDS)、自體免疫疾病、神經(jīng)紊亂疾病(例如中風(fēng)、腦損傷、脊髓損傷、肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)、亨丁頓舞蹈癥、阿耳茨海默氏硬化和帕金森疾病)、心血管疾病、骨質(zhì)疏松癥和老化)，壓力刺激響應(yīng)、以及由于使用例如前炎癥細(xì)胞因子治療導(dǎo)致的次效應(yīng)。本發(fā)明的藥用合成物也可用于治療或預(yù)防與糖尿病或細(xì)胞切應(yīng)力相關(guān)聯(lián)的影響，其中，病理狀態(tài)的誘導(dǎo)因子包括動(dòng)脈高血壓例如心臟肥大、動(dòng)脈硬化損害和血管分叉等等、放射線治療和紫外光(UV光)中所使用的電離輻射、自由基、DNA損傷劑例如化療藥物、缺血性/再灌注損傷、組織缺氧、和/或體溫過(guò)低和體溫過(guò)高。最終，在如上提到的疾病、病理生理異常的內(nèi)容中，本發(fā)明的藥用合成物可用于抑制基因的表達(dá)，這些基因的表達(dá)增加了活性多肽的出現(xiàn)。這些基因和基因產(chǎn)品特別地包括例如促炎癥細(xì)胞激素。發(fā)現(xiàn)這些激素的形式為發(fā)炎、自體發(fā)炎、免疫和自體免疫疾病、退化疾病、肌病、心臟病和移植排斥。本發(fā)明的JNK抑制劑序列、嵌合肽或核酸序列進(jìn)一步可用于任意的期望抑制JNK活性的情況，因?yàn)镴NK和其所有的異構(gòu)形式參與了病理狀態(tài)的發(fā)展和建立或相應(yīng)的途徑。這些使用可包括在試管中、離體、以及在體內(nèi)的應(yīng)用。因此，如上定義的本發(fā)明的核酸可用于本發(fā)明的一特定實(shí)施例中，以通過(guò)基因治療，調(diào)控活化的JNK信號(hào)通路，優(yōu)選的用于治療如上定義的條件、疾病、和/或紊亂的其中之一。在本文中，基因治療是指通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)對(duì)象給藥本發(fā)明的一特定核酸所執(zhí)行的治療，例如如上定義的藥用合成物，其中本發(fā)明的核酸排它地包括L-氨基酸。在本發(fā)明的該實(shí)施例中，核酸生成編碼肽，該編碼肽接著通過(guò)疾病或紊亂的調(diào)控功能，發(fā)揮其治療效應(yīng)。本領(lǐng)域中任意與基因治療相關(guān)聯(lián)的方法可用于本發(fā)明的實(shí)施中(例如Goldspiel，etal.，1993.ClinPharm12:488-505).在一優(yōu)選實(shí)施例中，用于基因治療的本發(fā)明的核酸是表達(dá)載體的一部分，其在合適的宿主內(nèi)，表達(dá)任意一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的IB關(guān)聯(lián)肽，例如本發(fā)明的JNK抑制劑序列和/或嵌合肽、或相應(yīng)的片段或衍生物。在一特定實(shí)施例中，該表達(dá)載體擁有促進(jìn)因子，其可操作地鏈接到JNK抑制劑序列的編碼區(qū)域。該促進(jìn)因子可作如上定義，例如可誘導(dǎo)或構(gòu)建、以及任選的組織特異。在另一特定的實(shí)施例中，本發(fā)明的核酸分子可用于基因治療，在其中，通過(guò)可在基因組內(nèi)期望位置促進(jìn)類(lèi)似重組的區(qū)域，側(cè)接本發(fā)明的核酸分子的編碼序列(以及任意別的期望的相應(yīng)序列)，以提供核酸的內(nèi)染色體表達(dá)(例如KollerandSmithies,1989.ProcNatlAcadSciUSA86:8932-8935).將本發(fā)明的核酸發(fā)送到病人體內(nèi)進(jìn)行基因治療，可以是直接的(例如，病人直接接受核酸或包含有核酸的載體)或間接的(例如，首先在試管中，用核酸轉(zhuǎn)化細(xì)胞，接著再移植到病人體內(nèi))。這兩種方法分別是熟知的體內(nèi)或體外exvivo基因治療。在本發(fā)明的一特定實(shí)施例中，在體內(nèi)直接地給藥本發(fā)明的核酸，其中，其表達(dá)為生成編碼產(chǎn)品。這可通過(guò)本領(lǐng)域熟知的任意方法實(shí)現(xiàn)，例如將核酸構(gòu)建為合適的核酸表達(dá)載體的一部分，并以同樣的方式給藥，使其進(jìn)入分子內(nèi)(例如，通過(guò)使用有缺陷的或減弱的逆轉(zhuǎn)錄病毒或別的病毒載體，進(jìn)行傳染；U.S.專(zhuān)利號(hào)為4，980，286)、直接注射nakedDNA、使用微粒狀轟擊(例如"基因槍"、Biolistic、DuPont)、用脂質(zhì)涂覆核酸、使用相關(guān)的細(xì)胞表面受體/轉(zhuǎn)染劑、以脂質(zhì)體、微粒狀或微囊體膠囊、以鏈接到熟知的進(jìn)入細(xì)胞核的肽對(duì)其進(jìn)行給藥、或通過(guò)鏈接到誘發(fā)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用的配體對(duì)其進(jìn)行給藥(例如，WuandWu，1987.JBiolChem262:4429-4432)，這可用于"標(biāo)靶"細(xì)胞類(lèi)型，該類(lèi)型特別地表達(dá)感興趣的受體等等。關(guān)于在本發(fā)明的實(shí)施中使用的基因治療的別的方法涉及到通過(guò)方法例如電轉(zhuǎn)化、脂染、可用磷酸鈣介導(dǎo)轉(zhuǎn)染、病毒傳染等等，將基因轉(zhuǎn)運(yùn)到試管中的組織培養(yǎng)系統(tǒng)中的細(xì)胞中。通常地，轉(zhuǎn)運(yùn)方法包括進(jìn)入細(xì)胞的可選擇標(biāo)記的伴隨物轉(zhuǎn)運(yùn)。接著，該細(xì)胞置于選擇壓力下(例如耐藥性)，以便這些已吸收的細(xì)胞的隔離，并表達(dá)轉(zhuǎn)運(yùn)的基因。接著，這些細(xì)胞被施用給病人。在一特定實(shí)施例中，在得到的重組細(xì)胞的體內(nèi)給藥之前，通過(guò)本領(lǐng)域熟知的任意的方法，例如轉(zhuǎn)染、電轉(zhuǎn)化、顯微注射、用病毒或包含有感興趣的核酸序列的抗菌素傳染、細(xì)胞融合、染色體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)運(yùn)、微細(xì)胞介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)運(yùn)、質(zhì)球融合、以及可確保受體細(xì)胞必要的發(fā)育核生理學(xué)功能不被轉(zhuǎn)運(yùn)破壞的類(lèi)似的方法，將核酸引入到細(xì)胞中。例如，LoefflerandBehr，1993.MethEnzymol217:599-618.選擇的技術(shù)應(yīng)該可將核酸穩(wěn)定轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞，以便細(xì)胞可表達(dá)該核酸。優(yōu)選的，細(xì)胞的后代可遺傳和表達(dá)轉(zhuǎn)運(yùn)的核酸。在本發(fā)明的一優(yōu)選實(shí)施例中，通過(guò)本領(lǐng)域熟知的各種技術(shù)，例如上皮細(xì)胞的注射(例如皮下地)、作為移植給病人的外皮的重組外皮細(xì)胞的應(yīng)用、以及重組血液細(xì)胞的靜脈內(nèi)注射(例如，造血干細(xì)胞或前體細(xì)胞)，得到的重組細(xì)胞可施用給病人。預(yù)想要使用的細(xì)胞的總量取決于期望的效應(yīng)、病人的狀態(tài)等等，并可由本領(lǐng)域的技術(shù)人員決定。用于基因治療的核酸所要引入的細(xì)胞可包括任意期望的、可用的細(xì)胞類(lèi)型，并且可以是異基因的、異質(zhì)的、同源的或自體的。細(xì)胞的類(lèi)型包括但不限于分化細(xì)胞例如上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、角化細(xì)胞、纖維原細(xì)胞、肌細(xì)胞、肝細(xì)胞和血細(xì)胞，或者特定的胚胎心臟肌細(xì)胞中的各種干或前體細(xì)胞、肝干細(xì)胞(國(guó)際專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)WO94/08598)、神經(jīng)干細(xì)胞(StempleandAnderson,1992,Cell71:973-985)、造血干或前體細(xì)胞例如從骨髓、臍帶血、外周血、胎兒肝臟等等得到的。在一優(yōu)選實(shí)施例中，用于基因治療的細(xì)胞是病人自體固有的。根據(jù)進(jìn)一步的實(shí)施例，本發(fā)明的JMC抑制劑序列、嵌合肽、關(guān)于本發(fā)明的JNK抑制劑序列或嵌合肽的核酸序列或抗體，可用于(試管中)測(cè)定(例39如免疫測(cè)定)，以識(shí)別、預(yù)測(cè)或監(jiān)控如上定義的各種條件、疾病、和/或紊亂，或監(jiān)控相應(yīng)的治療。通過(guò)具有將源自病人的樣本與關(guān)于本發(fā)明的JNK抑制劑序列、嵌合肽或核酸的抗體接觸的方法并在一定條件下，可執(zhí)行免疫測(cè)定，其中，在該一定條件下，可發(fā)生免疫專(zhuān)一的結(jié)合，并隨后通過(guò)該抗體，可檢測(cè)和測(cè)量任意免疫專(zhuān)一的結(jié)合的數(shù)量。在一特定的實(shí)施例中，特異于本發(fā)明的JNK抑制劑序列、嵌合肽或核酸的抗體可用于分析JNK或JNK抑制劑序列存在的病人的組織或血清樣本，其中JNK的異常水平表示患病的情況。可使用的免疫測(cè)定包括但不限于競(jìng)爭(zhēng)和非競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定系統(tǒng)，其所使用的技術(shù)例如免疫印跡、放射性免疫測(cè)定(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、"三明治"免疫測(cè)定、免疫沉淀反應(yīng)測(cè)定、沉淀反應(yīng)、凝膠擴(kuò)散沉淀反應(yīng)、免疫擴(kuò)散測(cè)定、凝集測(cè)定、熒光免疫測(cè)定、補(bǔ)體結(jié)合測(cè)定、免疫放射測(cè)定、以及蛋白質(zhì)-A免疫測(cè)定等等?？蛇x擇的，通過(guò)對(duì)目標(biāo)細(xì)胞施用本發(fā)明的JNK抑制劑序列、嵌合肽或關(guān)于本發(fā)明的JNK抑制劑序列或嵌合肽的抗體，可執(zhí)行(試管中)測(cè)定，并通過(guò)本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的生物物理方法，監(jiān)控細(xì)胞的反應(yīng)，其中，特別地該目標(biāo)細(xì)胞選自例如培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞、人類(lèi)細(xì)胞或微生物體。在此所使用的目標(biāo)細(xì)胞特別地可以是培養(yǎng)細(xì)胞(試管中)或體內(nèi)細(xì)胞，例如構(gòu)成活的動(dòng)物活人的器官或組織的細(xì)胞，或在活的動(dòng)物或人體中發(fā)現(xiàn)的微生物。另外，本發(fā)明提供用于診斷或治療用的工具，其包括一個(gè)或多個(gè)容器，其包含有本發(fā)明的JNK抑制劑序列、嵌合肽、核酸和/或關(guān)于本發(fā)明的JNK抑制劑序列或嵌合肽的抗體，例如反JNK抑制劑序列抗體、以及可選的，關(guān)于抗體的標(biāo)識(shí)結(jié)合配體。因此，合并入抗體內(nèi)的標(biāo)識(shí)包括但不限于化學(xué)發(fā)光的、酶的、熒光的、色度的或放射性的基團(tuán)。在陵夷特定的實(shí)施例中，提供的用于診斷的工具，其包括一個(gè)或多個(gè)具有核酸的容器，該核酸編碼本發(fā)明的JNK抑制劑序列和/或嵌合肽，或可選的，是本發(fā)明的JNK抑制劑序列和/或嵌合肽的補(bǔ)體，另外也提供關(guān)于這些核酸的標(biāo)識(shí)結(jié)合配體。在可選擇的特定的實(shí)施例中，該工具包括位于一個(gè)或多個(gè)容器中的低核苷酸引物(例如，每個(gè)長(zhǎng)度為6到20個(gè)核苷)，其可作為擴(kuò)增引物，用于聚核酶鏈反應(yīng)(PCR;例如Innis，etal.，1990.PCRPROTOCOLS,AcademicPress,Inc.，SanDiego,CA)、連接酶鏈反應(yīng)、循環(huán)探針?lè)磻?yīng)等等，以及本領(lǐng)域熟知的使用本發(fā)明的核酸的別的方法?？蛇x的，該工具進(jìn)一步包括預(yù)定純化的本發(fā)明的JNK抑制劑序列、嵌合肽或?qū)@些進(jìn)行編碼的核酸的數(shù)量，從而在測(cè)定中用于診斷、標(biāo)化或控制。本發(fā)明是通過(guò)幾個(gè)具體實(shí)施例進(jìn)行說(shuō)明的，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)明白，在不脫離本發(fā)明范圍的情況下，還可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種變換及等同替代。另外，針對(duì)特定情形或具體情況，可以對(duì)本發(fā)明做各種修改，而不脫離本發(fā)明的范圍。因此，本發(fā)明不局限于所公開(kāi)的具體實(shí)施例，而應(yīng)當(dāng)包括落入本發(fā)明權(quán)利要求范圍內(nèi)的全部實(shí)施方式。在此所引用的各種出版物，在此全文引用。除非另有定義，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在此所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有相同的意思。盡管與在此描述的類(lèi)似或相同的方法和材料可用于本發(fā)明的實(shí)施或測(cè)試，下面將描述合適的方法和材料。所有的出版物、專(zhuān)利申請(qǐng)文件、專(zhuān)利和在此所提及的別的參考資料在此全文引用。在發(fā)生沖突時(shí)，本說(shuō)明書(shū)包括定義是可控制的。另外，涉及的材料、方法和例子是僅作為例證并不是用于限制。本發(fā)明的各種優(yōu)點(diǎn)、各個(gè)方面和創(chuàng)新特征，以及其中所示例的實(shí)施例的細(xì)節(jié)，將在以下的說(shuō)明書(shū)和附圖詳細(xì)介紹中變得顯而易見(jiàn)。下面將結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，附圖中圖1A-C圖表示出顯示的轉(zhuǎn)錄因子中的保留的JBD域的排列。通過(guò)檢測(cè)這些序列的排列可識(shí)別JNK抑制劑序列。圖1A-1C示出示范性的這些排列的結(jié)果。圖1A示出IB1、IB2、c-Jun和ATF2的JBD之間的最高的同源區(qū)域。表B示出用于對(duì)比的L-IB1和L-IB1的JBD的氨基酸序列。星號(hào)示出完全保留的殘基，同時(shí)開(kāi)圓示出GFP-JBD23Mut載體中轉(zhuǎn)化為Ala的殘基。圖1C示出具有JNK抑制劑序列和運(yùn)輸序列的嵌入蛋白的氨基酸序列。在該例子中，運(yùn)輸序列衍生自人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV)TAT多肽，以及JNK抑制劑序列衍生自IB1多肽。在表B和C中，人類(lèi)、老鼠和家鼠的序列相同。圖2示出來(lái)自人類(lèi)、老鼠和家鼠的通有的TAT-IB融合蛋白的序列。圖3示出永久的MCAO模型中防御病灶性大腦缺血的神經(jīng)保護(hù)的評(píng)價(jià)結(jié)果。以不同的劑量確定保護(hù)的效率(見(jiàn)圖3)。從圖3可看出，至少llmg/kg、3mg/kg、0.3mg/kg和0.03mg/kg的劑量有助于大腦保護(hù)?？煽闯?.03mg/kg具有最好的保護(hù)。圖4示出短暫的MCAO模型中在防御病灶性大腦缺血的i.v.給藥后，通過(guò)本發(fā)明的根據(jù)SEQIDNO:ll的嵌合肽的神經(jīng)保護(hù)的評(píng)價(jià)。隨后在成年老鼠中引起缺血，在再灌注后的48h使得該老鼠致死。制備連續(xù)的冰凍切片并計(jì)算梗塞量。如圖4所示，本發(fā)明的嵌合肽提供有效的神經(jīng)保護(hù)。圖5示出通過(guò)NMDA刺激后測(cè)量LDH釋放，執(zhí)行對(duì)神經(jīng)培養(yǎng)的測(cè)定的結(jié)果。該結(jié)果清楚地示出本發(fā)明的嵌入D-JNK1肽(SEQIDNO:ll)的神經(jīng)保護(hù)的效果，因?yàn)橛捎邴怐A的暴露所引起的退化的改變被完全地抑制，并通過(guò)如上控制未出現(xiàn)顯著的LDH釋放示出。圖6示出在統(tǒng)一計(jì)量方法中，使用本發(fā)明的根據(jù)SEQIDN0:9和11的融合肽，抑制H印G2細(xì)胞中內(nèi)生植物JNK活性的結(jié)果。圖6示出，特別在圖6的表的中，根據(jù)SEQIDNO:ll的D-TAT-IB1(在此略寫(xiě)為D-JNKI)有效地抑制了JNK活性，甚至由于根據(jù)SEQIDNO:9的L-TAT-IB1(在此略寫(xiě)為L(zhǎng)-JNKI)。圖7示出防御聽(tīng)力永久喪失的D-TAT-IB1保護(hù)的保護(hù)效果。以最大沖擊頻率8kHz，持續(xù)20分鐘(暫時(shí)的閾值下降，TTS，灰色部分)的噪音損傷(120dB，6kHz，持續(xù)30分鐘)，并在噪音暴露后15天(永久閾值下降)，幾內(nèi)亞豬的聽(tīng)力閾值級(jí)別下降(dB聲壓級(jí)別)。要么在噪音損傷前30分鐘，或噪音損傷后30分鐘或4個(gè)小時(shí)，以透明質(zhì)酸凝膠形式將D-TAT-IB1，設(shè)置幾內(nèi)亞豬的耳蝸圓窗膜；非治療耳朵作為對(duì)照。在噪音損傷后20分鐘，測(cè)量TTS;同時(shí)15天后確定永久聽(tīng)力喪失PTS(黑色部分)。圖示出，如果在噪音暴露前防御性的使用D-TAT-IB1，而且在損傷后以時(shí)間依賴的方式給藥，其不能在噪音損傷后充分地保護(hù)以防止永久聽(tīng)力喪失。對(duì)于損傷后30分鐘和4小時(shí)進(jìn)行D-TAT-IB1給藥，治療耳中的PTS顯著低于非治療對(duì)照耳中的PTS。具體實(shí)施方式例子例l:JNK抑制劑序列的識(shí)別通過(guò)已知的JBD之間的序列排列，識(shí)別對(duì)于與JNK進(jìn)行有效的相互作用的重要的氨基酸序列。IBl[SEQIDNO:13]、IB2[SEQIDNO:14]、c-Jun[SEQIDNO:15]和ATF2[SEQIDNO:16]的JBD之間的序列比較定義了不牢固地保留的8個(gè)氨基酸序列(圖1A)。因?yàn)镮Bl和IB2的JBD具有大約100個(gè)折疊，其與結(jié)合JNK中的c-Jun或ATF2—樣有效(Dickensetal.Science277:693(1997)，這詳盡論述了IB1和IB2之間保留的殘基對(duì)于授予最大的結(jié)合的重要性。IBl和IB2的JBD之間的比較定義出具有7個(gè)氨基酸和3個(gè)氨基酸的兩個(gè)區(qū)組，并高度地保留在這兩個(gè)序列之間。這兩個(gè)區(qū)組位于L-IBl[SEQIDNO:1]中的19個(gè)氨基酸的肽序列中，并由于比較的原因在衍生自IBl[SEQIDNO:17]的23aa肽序列中示出。圖IB中示出這些序列，L-IB1中的長(zhǎng)劃線指出序列中的間隔，以便用L-IBl排列保留的殘基。例2:JNK抑制劑融合蛋白的制備通過(guò)共價(jià)地將SEQIDNO:1的C-末端鏈接到10氨基酸長(zhǎng)度的載體肽的N-末端，可合成根據(jù)SEQIDNO:9的本發(fā)明的JNK抑制劑融合蛋白，其中，該載體肽衍生自根據(jù)SEQIDNO:5的HIV-TAT4g57(Vivesetal.,JBiol.Chem.272:16010(1997))，該鏈接是經(jīng)過(guò)由兩個(gè)脯氨酸殘基構(gòu)成的鏈接體。該鏈接體可使得產(chǎn)生最大的靈活性，并防止非期望的次級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。L-IBl(s)(SEQIDNO:l)和L-TAT[SEQIDNO:5]分別制備和指定這兩個(gè)基本的結(jié)構(gòu)。因此，可合成根據(jù)SEQIDNO:ll的全D逆反肽。也可由D-IB1[SEQIDNO:2]和D-TAT[SEQIDNO:6]分別制備和指定這兩個(gè)基本的結(jié)構(gòu)。通過(guò)經(jīng)典的的FmockAll合成制成根據(jù)SEQIDNOs:9，10，11和12的本發(fā)明的D和L融合肽，并進(jìn)一步通過(guò)Mass光譜測(cè)定法分析。最后，通過(guò)HPLC對(duì)其進(jìn)行純化。為了確定脯氨酸鏈接體的影響，可制備兩種類(lèi)型的TAT肽，其中一個(gè)具有兩個(gè)脯氨酸，另一個(gè)不具有。添加的這兩個(gè)脯氨酸不可改變細(xì)胞內(nèi)的TAT肽的進(jìn)入或定位。圖2給出顯示保留的氨基酸殘基的一般肽。例3:JBD19產(chǎn)生的抑制細(xì)胞死亡研究關(guān)于JNK生物活性的19aa長(zhǎng)度的JBD的作用。該19aa序列鏈接到綠熒光蛋白的N-末端(GFPJBD19construct),并估計(jì)該結(jié)構(gòu)關(guān)于IL1所誘導(dǎo)的胰腺細(xì)胞凋亡作用。前面示出凋亡模式，并通過(guò)使用JBD1-280轉(zhuǎn)染，對(duì)其進(jìn)行屏蔽，然而，ERK1/2或p38的特定的抑制劑不產(chǎn)生保護(hù)作用(例如上述的A咖endrupetal.)。合成與JBD相應(yīng)并具有19個(gè)氨基酸的保留序列的低核苷酸，以及在完全保留區(qū)域變異的序列，直接將該低核苷酸和序列插入到編碼綠熒光蛋白(GFP，源自無(wú)性繁殖)的pEGFP-Nl的EcoRI和Sail位置。在RPMI1640培養(yǎng)液中，培養(yǎng)生成TC-3細(xì)胞的胰島素，該培養(yǎng)液中還具有10%FetalCalfSerum，100Pg/mL鏈霉素，100單位/mL青霉素和2mM谷氨酸鹽。使用指示載體轉(zhuǎn)染生成TC-3細(xì)胞的胰島素，并添加IL-l(lOng/mL)到該細(xì)胞培養(yǎng)液中。在添加IL-1后48小時(shí)，使用逆熒光顯微鏡，計(jì)算凋亡細(xì)胞的數(shù)量。通過(guò)細(xì)胞質(zhì)的"冒泡"特性，可將凋亡細(xì)胞區(qū)別于正常細(xì)胞，并在兩天都計(jì)算凋亡細(xì)胞。GFP是用作控制的綠熒光蛋白表達(dá)載體；JBD19是表達(dá)嵌入GFP的載體，該嵌入GFP鏈接到衍生自IBl的JBD的19aa序列。JBD19Mut是與GFP-JBD19一樣的載體，但具有在圖1B示出的4個(gè)保留的殘基處變異的JBD;JBD1-280是鏈接到整個(gè)JBD(aal-280)的GFP載體。TheGFP-JBD19表達(dá)結(jié)構(gòu)與整個(gè)JBD1-280—樣有效地預(yù)防胰腺細(xì)胞apoptos誘導(dǎo)的IL-l。作為附加控制，在完全地保留的IB1殘基處變異的序列極大地降低了預(yù)防凋亡的能力。例4:TAT-IB1肽的細(xì)胞引入評(píng)估TAT的L-和D-光學(xué)異構(gòu)的形式和本發(fā)明的TAT-IB1肽("TAT-IB肽")進(jìn)入細(xì)胞的能力。通過(guò)與熒光素共軛的氨基乙酸的N-末端添加，標(biāo)記L-TAT、D-TAT、本發(fā)明的L-TAT-IB1、以及D-TAT-IB1肽[分別地，SEQIDNO:5，6，9和12]。將標(biāo)記的肽(1MM)添加到TC-3細(xì)胞培養(yǎng)基，如例3所描述的。在預(yù)定的時(shí)間，用PBS沖洗細(xì)胞，并在冰甲醇-丙酮(1:1)中保持5分鐘，之后在熒光顯微鏡下對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。熒光素標(biāo)識(shí)的BSA(1MM，12摩爾/摩爾BSA)用作控制。結(jié)果證明，將所有的如上熒光素標(biāo)識(shí)的肽一次性的添加到培養(yǎng)液中，其可有效地和快速地(少于5分鐘)進(jìn)入細(xì)胞。相反地，熒光素標(biāo)識(shí)的牛血清白蛋白(l幽BSA，12摩爾熒光素/摩爾BSA)沒(méi)有進(jìn)入細(xì)胞。時(shí)間的研究指出在24小時(shí)周期后，用于L-光學(xué)異構(gòu)的肽的熒光信號(hào)的強(qiáng)度降低70%。相比較，細(xì)胞內(nèi)的D-TAT和本發(fā)明的D-TAT-IB1非常穩(wěn)定。一個(gè)星期后，來(lái)自這些全D-逆反肽的熒光信號(hào)仍然很強(qiáng)，并且在治療的兩星期后，該信號(hào)僅少許減弱。例5:試管中抑制c-JUN、ATF2和Elkl磷酸化在試管中研究肽對(duì)于它們的目標(biāo)轉(zhuǎn)錄因子的JNK介導(dǎo)磷酸化的影響。使用。使用轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)運(yùn)兔網(wǎng)狀細(xì)胞溶菌工具(Promega)，生成重組和非激活的JNK1、JNK2和JNK3，并將其與c-Jun、ATF2和Elkl，一起用于固相激酶測(cè)定，要么將這些材料單獨(dú)使用或融合到谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)中，以作為基體。執(zhí)行劑量響應(yīng)研究，其中本發(fā)明的L-TAT或L-TAT-IBl肽(0-25,)與重組JNK1、JNK2、或JNK3激酶在反應(yīng)緩沖劑(20raMTris-acetate，lmMEGTA，lOmMp-nitrophenyl-phosphate(pNPP)，5mM焦磷酸鈉，10mMp—glycerophosphate,lmMdithiothreitol)中混合20分鐘。矛妾著，通過(guò)添力口lOmM氯化鎂和5pCi33P--dATPand1ofeitherGST—Jun(aa1-89),GST-AFT2(aa1-96)orGST-ELK1(aa307-428)，將發(fā)起激酶反應(yīng)。可從Stratagene(LaJolla,CA)購(gòu)得GST融合蛋白。也可添加IO叱得谷胱甘肽瓊脂糖beads到該混合物中。接著，通過(guò)SDS-PAGE將反應(yīng)生成物隔離到變性得10%聚丙烯酰胺凝膠上。干燥該凝膠，接著暴露于X射線膠片。以2.5MM劑量得本發(fā)明的TAT-IB肽，可觀察到通過(guò)JNK，幾乎完全抑制c-Jun，ATF2和Elkl的磷酸化。然而，一個(gè)顯著的例外是未出現(xiàn)TAT-IB抑制Elkl的JM3磷酸化?？傊?，本發(fā)明的TAT-IB1肽在抑制它們的目標(biāo)轉(zhuǎn)錄因子的JNK家族的磷酸化方面，顯示了很好的效果。如上對(duì)D-TAT、D-TAT-IB1和L-TAT-IB1肽(0-250幽劑量研究)通過(guò)重組JNKl、JNK2和JNK3抑制GST-Jun(aa1_73)磷酸化的能力進(jìn)行了分析?？傊珼-TAT-IB1肽降低了c-Jim的JNK介導(dǎo)磷酸化，但其有效性水平大約少于L-TAT-IB110到20個(gè)折疊。例6:通過(guò)活性JNK，抑制c-JUN磷酸化使用GST-Jun降低來(lái)自UV光照射的HeLa細(xì)胞或IL-1處理的PTC細(xì)胞的JNK，以評(píng)估L-TAT或L-TAT-IB1肽對(duì)壓力刺激激活的JNK的作用。如上所述對(duì)PTC細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。在DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)HeLa細(xì)胞，該培養(yǎng)液添加有10%FetalCalfSerum、100Pg/mL鏈霉素、100單位/ml青霉素和2mM谷氨酸脂。在使用前1小時(shí)作細(xì)胞吸取準(zhǔn)備，使用如上所述的IL-1激活PTC細(xì)胞，然而，通過(guò)UV-光(20J/m2)激活HeLa細(xì)胞。從對(duì)照組制備細(xì)胞提取物；在細(xì)胞溶解緩沖液(20mMTris-acetate,1慮EGTA，1%TritonX-100，10mMP-硝基苯-磷酸鹽，5mM焦磷酸鈉，lOmMP-甘油磷酸，ImM蘇糖醇)中，通過(guò)刮取細(xì)胞培養(yǎng)基，制備UV光輻射的HeLa細(xì)胞和IL-1處理的TC-3細(xì)胞。通過(guò)離心機(jī)以15,000rpm和SS-34Beckmanrotor，過(guò)慮5分鐘，去除殘余物。在室溫使用GST-jim(氨基酸1到89)和IO叱谷胱苷肽瓊脂糖珠(Sigma)，培養(yǎng)100Pg提煉物l小時(shí)。在使用scraping緩沖液4次沖洗后，該珠再懸浮在同樣的緩沖液中20分鐘，該緩沖液添加有L-TAT或L-TAT-IBl肽(25MM)。接著通過(guò)添加10mMMgCl2和5pCi33P—dATP，發(fā)起激酶反應(yīng)，并在30。C，培養(yǎng)30分鐘。接著，通過(guò)SDS-PAGE，將反應(yīng)生成物隔離到變性的10%聚丙烯酰胺凝膠上。干燥該凝膠，隨后將其暴露于X攝像膠片(Kodak)。在這些實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)激活的JNK，本發(fā)明的TAT-IB肽有效地防止了c-Jun的磷酸化。例7:在體內(nèi)通過(guò)TAT-IB肽抑制c-JUN磷酸化為了確定本發(fā)明的細(xì)胞通透肽是否能在體內(nèi)屏蔽JNK信號(hào)，我們使用不同的GAL4系統(tǒng)。如上所述培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞，其與5xGAL-LUC指針載體和GAL-Jun表達(dá)結(jié)構(gòu)一起共轉(zhuǎn)染，該GAL-Jun表達(dá)結(jié)構(gòu)具有耦聯(lián)到GAL4DNA結(jié)合區(qū)域的c-Jun(氨基酸1到89)的活性區(qū)域。通過(guò)直接表達(dá)上游的激酶MKK4和MKK7的載體的共轉(zhuǎn)染，實(shí)現(xiàn)JNK的活性(例如Whitmarshetal.，Science285:1573(1999))。簡(jiǎn)要地，按著制造商說(shuō)明書(shū)的指示使用DOTAP(BoehringerMannheim),在3.5-cm器皿中，使用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染3x105細(xì)胞。由于實(shí)驗(yàn)涉及GAL-Jim，使用1Pg指針質(zhì)粒pFR-Luc和0.5Pg表達(dá)質(zhì)粒的MKK4或MKK7，轉(zhuǎn)染20ng的質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染后的3小時(shí)，改變細(xì)胞媒介，并添加TAT和TAT-IB1肽(lMM)。16小時(shí)后在蛋白質(zhì)含量正常后，使用來(lái)自Promega的〃雙重通信系統(tǒng)〃，測(cè)量熒光素酶的活性。在MKK4和MKK7調(diào)停JNK的活性后，添加TAT-IB1肽閉塞c-Jun的活性。因?yàn)镠eLa細(xì)胞表達(dá)JNK1和JNK2的異構(gòu)，但JNK3不行，因此，我們使用JNK3轉(zhuǎn)染細(xì)胞。再次，TAT-IB(s)肽抑制c-Jun的JNK2介導(dǎo)活性。例8:通過(guò)TAT-IB肽，抑制IL-1誘導(dǎo)的胰腺細(xì)胞死亡我們研究本發(fā)明的L-TAT-IB肽對(duì)于促進(jìn)IL-1引起的細(xì)胞凋亡的效果。使用l幽本發(fā)明的L-TAT-IB1肽并添加10ng/mL的IL-1，將TC-3細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)30分鐘。24小時(shí)后在此添加肽(1PM)。使用IL-1培養(yǎng)兩天后，再使用亞丙基(染成紅色細(xì)胞是死亡細(xì)胞)和Hoechst33342(染成藍(lán)色的細(xì)胞是具有完整質(zhì)膜的細(xì)胞)核染色，計(jì)算凋亡的細(xì)胞。在IL-1存在的情況下培養(yǎng)TC-3細(xì)胞兩天，添加本發(fā)明的TAT-IB肽抑制IL-1誘導(dǎo)的TC-3細(xì)胞的凋亡。除了使用肽和IL-1培養(yǎng)細(xì)胞12天外，通過(guò)如上所述的對(duì)TC-3細(xì)胞的處理，檢驗(yàn)長(zhǎng)期抑制的IL-1誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。每天添加肽(IMM)并每?jī)商焯砑覫L-l(10ng/mL)。在這些條件下，本發(fā)明的TAT-IBl肽提供了很強(qiáng)的防御凋亡的保護(hù)?？傊?，這些實(shí)驗(yàn)證明了本發(fā)明的TAT-IB肽是生物活性分子，其可防止JNK信號(hào)對(duì)細(xì)胞死亡的作用。例9:合成本發(fā)明全D逆反IB肽本發(fā)明肽是反向合成的全D氨基酸肽，以防止天然的蛋白質(zhì)水解(例如，全D逆反肽)。本發(fā)明的全D逆反肽所提供的肽，其功能特性相似于本身的肽，其中該合成的氨基酸的側(cè)基與本身的肽的排列相對(duì)應(yīng)，并保留有抗蛋白酶主鏈。本發(fā)明的逆反肽是使用D氨基酸合成的相似體，其通過(guò)將該氨基酸結(jié)合到肽鏈中，以便逆反肽相似體中氨基酸的序列正好與選擇的用于該模型的肽中氨基酸的序列相反。作為舉例說(shuō)明，如果天然產(chǎn)生的TAT蛋白(由L氨基酸形成)的序列為GRKKRRQRRR[SEQIDNO:5]，那么該肽的逆反肽相似體(由D氨基酸形成)的序列為RRRQRRKKRG[SEQIDNO:6]。用于合成D氨基酸鏈從而形成逆反肽的過(guò)程是本領(lǐng)域熟知的(例如Jamesonetal.,Nature,368，744-746(1994);Bradyetal.，Nature,368，692-693(1994);Guichardetal.，J.Med.Chem.39,2030-2039(1996))。特別地，通過(guò)經(jīng)典的F-mock合成以生成該逆反肽，并進(jìn)一步通過(guò)質(zhì)譜進(jìn)行分析。最后通過(guò)HPLC對(duì)其進(jìn)行純化。因?yàn)楸旧淼碾乃逃械膯?wèn)題是由于天然蛋白酶類(lèi)和固有的免疫原性所導(dǎo)致的降解，所以本發(fā)明的異構(gòu)二價(jià)或異構(gòu)多價(jià)混合物可包括期望的逆反肽的"逆反異構(gòu)體"。因此，為了保護(hù)肽避免天然的蛋白水解應(yīng)該增加特定的異構(gòu)二價(jià)或異構(gòu)多價(jià)混合物的有效性，兩者都通過(guò)延長(zhǎng)半衰期和降低主要在于有力地破壞該肽的免疫響應(yīng)的程度。例10:本發(fā)明的全D逆反IB肽的長(zhǎng)期生物活性如例5所示，由于為了保護(hù)本發(fā)明的D-TAT-IB肽避免由本身的蛋白酶類(lèi)導(dǎo)致的降解，在與本身的L氨基酸相似體比較時(shí)，可預(yù)計(jì)本發(fā)明的具有肽偶聯(lián)物的D-TAT-IB逆反的長(zhǎng)期生物活性。分析通過(guò)本發(fā)明的D-TAT-IB1抑制IL-1誘導(dǎo)的胰腺細(xì)胞死亡。使用單一添加指示肽(1MM)，并如上所述將TC-3細(xì)胞培養(yǎng)30分鐘，接著再添加IL-1(10ng/ml)。在使用IL-1培養(yǎng)兩天后，通過(guò)使用亞丙基和Hoechst33342核染色，計(jì)算凋亡的細(xì)胞。每次實(shí)驗(yàn)最少計(jì)算1000個(gè)細(xì)胞。標(biāo)準(zhǔn)平均誤差(SEM)顯示為n=5。D-TAT-IB1肽降低IL-1誘導(dǎo)的凋亡與L-TAT-IB肽的程度類(lèi)似。也可分析通過(guò)D-TAT-IB1肽長(zhǎng)期抑制IL-1P誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。使用單一添加指示肽(1MM)，并如上所述培養(yǎng)TC-3細(xì)胞30分鐘，接著添加IL-1(10ng/ml)，然后每?jī)商焯砑蛹?xì)胞因子。在使用IL-1培養(yǎng)15天后，通過(guò)使用亞丙基和Hoechst33342核染色，計(jì)算凋亡的細(xì)胞。值得注意，單一添加的TAT-IB1肽不能給予長(zhǎng)期保護(hù)。每次實(shí)驗(yàn)計(jì)算至少100O個(gè)細(xì)胞。結(jié)果，本發(fā)明的D-TAT-IB1而不是L-TAT-IBl可給予長(zhǎng)期(15天)的保護(hù)。例ll:通過(guò)TAT-IB肽抑制輻射誘導(dǎo)的朋夷腺細(xì)胞死亡通過(guò)電離輻射也可激活JNK。為了確定本發(fā)明的TAT-IB肽是否提供保護(hù)以防御輻射誘導(dǎo)的JNK破壞，在D-TAT、本發(fā)明的L-TAT-IBl或D-TAT-IBl肽(輻射前30分鐘添加1MM)存在或未存在的情況下，對(duì)"WiDr"細(xì)胞進(jìn)行輻射(30Gy)。不輻射控制細(xì)胞(CTRL)。48小時(shí)后，通過(guò)如上所述的PI和Hoechst3342染色，分析細(xì)胞。顯示SEM為N二3。本發(fā)明的L-TAT-IB1和D-TAT-IBl肽可防止人類(lèi)結(jié)腸癌中輻射誘導(dǎo)的凋亡。例12:通過(guò)本發(fā)明的TAT-IB肽實(shí)現(xiàn)對(duì)電離輻射的輻射防護(hù)為了確定本發(fā)明的TAT-IB肽輻射防護(hù)效果，使用PhillipsRT250R-ray并以O(shè).74Gy/min的劑量率(17mA，0.5mmCu過(guò)濾器)，對(duì)C57Bl/6老鼠(年齡為2到3個(gè)月)進(jìn)行輻射。輻射前30分鐘，使用TAT、本發(fā)明的L-TAT-IB1或D-TAT-IB1肽(301ImM溶液)，對(duì)該老鼠進(jìn)行注射。簡(jiǎn)要地，對(duì)老鼠作如下輻射將老鼠置于小塑料盒子中并且頭部置于該盒子外。該老鼠仰臥在輻射器下，以及它們的頸部固定在小的塑料管道中，以確保其頭部在正確的位置。用鉛保護(hù)其身體。在輻射前，以標(biāo)準(zhǔn)的顆粒老鼠固型食物喂養(yǎng)老鼠，然而輻射后，以半流體食物喂養(yǎng)老鼠，并每天更新食物。接著，根據(jù)Parkins等等(Parkinsetal，Radiotherapy&Oncology,1:165-173，1983)開(kāi)發(fā)的評(píng)分系統(tǒng)，由兩個(gè)獨(dú)立的觀察者，對(duì)唇粘膜反應(yīng)進(jìn)行評(píng)分，其中引用紅斑狀態(tài)，以及水腫、脫皮和滲汗的出現(xiàn)。另外，在每次記錄它們的紅斑/水腫狀態(tài)之前，對(duì)老鼠進(jìn)行稱重。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示本發(fā)明的TAT-IB肽可防止與電離輻射相關(guān)的重量減少和紅斑/水腫。例13:通過(guò)本發(fā)明的L-TAT-IB1抑制INK轉(zhuǎn)錄因子使用AP-1雙倍標(biāo)記探針，執(zhí)行凝膠阻滯測(cè)定(5'-CGCTTGATGAGTCAGCCGGAA-3，(SEQIDN0:27)。作為示例，可使用5ng/mlTNF-a對(duì)HeLa細(xì)胞核提取物處理l小時(shí)，或不作處理。在TNF-處理前分鐘，添加核本發(fā)明的L-TAT-IB1的肽。使出僅部分凝膠具有特異的AP-IDNA復(fù)合體(使用非標(biāo)記特異和非特異競(jìng)爭(zhēng)者，并通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)得到證明)。在TNF-a存在的情況下，本發(fā)明的L-TAT-IB1肽降低了AP-1DNA結(jié)合復(fù)合體的形成。例14:評(píng)估永久MCAO模型中防御病灶性大腦缺血的神經(jīng)保護(hù)-確定不同劑量的保護(hù)效果(圖3)在12天齡的小鼠中誘導(dǎo)病灶性大腦缺血。在誘導(dǎo)室中使用2%異氟烷麻醉小鼠，在操作的過(guò)程中，在2%異氟烷下使用面具維持麻醉。通過(guò)電凝大腦中動(dòng)脈(MCA)的主干，誘導(dǎo)MCAO。正面放置小鼠，并在耳和眼之間作斜皮切割。在切除顳肌后，從額縫中去除顱骨，直至顴弓之下。在MCA分叉進(jìn)入額支和頂支之前，正好暴露在鼻腔裂縫上的左MCA永久地電凝在大腦下靜脈。接著，閉合頭蓋皮膚切口。然后，將小鼠置于培養(yǎng)箱中并保持溫度為37。C，直到其蘇醒，最后再轉(zhuǎn)移到其母親處。6小時(shí)后，腹膜內(nèi)注射本發(fā)明的根據(jù)SEQIDNO:11的嵌入D-TAT-IB1肽。凝固后24小時(shí)，使用水合氯醛麻醉小鼠，并在PBS中，使用4%多聚甲醛，灌注通過(guò)升主動(dòng)脈。接著，移除腦髓并在相同的固定液中保持2小時(shí)，并將梯度為30X的蔗糖置于PBS中，保持溫度4°C持續(xù)15小時(shí)。在異戊烷中(-40°C)凍結(jié)腦髓并以-20°C存儲(chǔ)。收集50um冠狀恒溫箱切片于載玻片上。使用甲酚紫染色該切片。分析每第十個(gè)切片，并使用Neuroleucida程序，計(jì)算器官損害的體積。在對(duì)照組A中，平均的器官損害的體積是21.47mm3，所有的實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比具有較低的平均值。在組A和組C、E和F之間觀察到顯著的統(tǒng)計(jì)差分(單側(cè)t檢驗(yàn)分別為p二0.030，p=0.002,p=0.001)。圖4示出結(jié)果。結(jié)果，這些數(shù)據(jù)支持結(jié)論，即以劑量llmg/kg、3mg/kg、0.3mg/kg和0.03mg/kg給藥，本發(fā)明的根據(jù)SEQIDNO:11的嵌入D-TAT-IB1肽可保護(hù)大腦。將lmg/kg、0.003mg/kg和0，0003mg/kg的結(jié)果與空白組對(duì)比后，提出總樣本未足夠大以產(chǎn)生顯著的差異。觀察到劑量0.03mg/kg有最好的保護(hù)。例15:在短暫MCAO模型中，在iv給藥后，通過(guò)本發(fā)明的嵌合肽防御病灶性大腦缺血的神經(jīng)保護(hù)的評(píng)估(圖4)成年大鼠中短暫的局部缺血。使用雄性ICR-CD1老鼠(6周齡；18-37g;Harlan)，通過(guò)將纖維從頸外動(dòng)脈引入到頸內(nèi)動(dòng)脈，并進(jìn)一步引入到大腦后動(dòng)脈，以引起局部性缺血，因此閉塞中大腦動(dòng)脈。通過(guò)激光多普勒血流計(jì)，測(cè)量局部的腦血流量，其中，在再灌注io分鐘后，用探針固定在頭骨上遍及整個(gè)局部缺血區(qū)。測(cè)量直腸溫度并保持在37°C。再灌注后48小時(shí)致死老鼠。使用配備有Neurolucida程序(MicroBrightField)的計(jì)算機(jī)顯微鏡系統(tǒng)可掃描20Wn厚的連續(xù)的冰凍切片，并可使用Neurolucida程序計(jì)算(不可見(jiàn)的)局部性缺血區(qū)域的體積以及整個(gè)大腦的體積。XG-1020.3二0.3mg/kg，XG-1021=1mg/kg,XG-1025=5mg/kg如下示出，在成年大鼠模型中，再灌注6小時(shí)后，使用安慰劑和XG-1020.3、1、3mg/kgiv給藥后，梗塞的體積大小(mm3):梗塞對(duì)照n=572XG1020.3n=516XG1021n=l16XG1023n=515例16:在麗DA刺激后，通過(guò)測(cè)量LDH釋放，測(cè)定神經(jīng)元培養(yǎng)基(圖5)在姊妹培養(yǎng)基中，可評(píng)估D-TAT-IB(通用的)/D-JNKI1肽(SEQIDN0:12)的神經(jīng)保護(hù)效果，其中，在連續(xù)的暴露于100MM麗DA之前，使用指示濃度的肽或MK-801預(yù)處理該培養(yǎng)基30分鐘。麗DA處理12小時(shí)后，在使用5M的D-TAT-IB(通用的)/D-JNKI1預(yù)處理的培養(yǎng)基中，由于麗DA的暴露，并通過(guò)上述對(duì)照組(圖5)中未出現(xiàn)顯著的LDH釋放示出退變被完全抑制。形態(tài)上的外觀、數(shù)目和神經(jīng)元的分布并不能區(qū)別于對(duì)照組。皮質(zhì)神經(jīng)元培養(yǎng)基。從兩天齡小鼠的大腦切下小片皮質(zhì)，并使用200單位的木瓜蛋白酶在34°C將其培養(yǎng)30分鐘，接著，將神經(jīng)元以密度大約為1x106細(xì)胞/細(xì)胞培養(yǎng)板，放置在細(xì)胞培養(yǎng)板上，使用100Pg/ml多聚賴氨酸預(yù)先涂附該培養(yǎng)板。該放置媒介由B27/神經(jīng)基質(zhì)構(gòu)成(LifeTechnologies,Gaithersburg，MD)并附加有0.5mM谷氨酸脂、100U/ml青霉素、和100ug/ml鏈霉素。6carttype174乳酸脫氫酶(LDH)細(xì)胞毒測(cè)定。使用Cytotox96非放射性細(xì)胞毒測(cè)定(Promega，WI)，測(cè)量在麗DA給藥12、24和48小時(shí)后釋放到培養(yǎng)基池中的LDH(圖5)。例17:使用統(tǒng)一計(jì)量的方法，在H印G2細(xì)胞中抑制內(nèi)源JNK活性(圖6〉實(shí)驗(yàn)的前一天，以3000細(xì)胞/細(xì)胞培養(yǎng)井，培養(yǎng)H印G2細(xì)胞。接著，將增加濃度的白細(xì)胞介素-lp[IL-lotv)]或腫瘤壞死因子a[TNFa")]，(a)添加到激活的JNK中30分鐘。在20mMH印es、0.5%TweenpH7.4以及AlphaScreen處理的JNK中，使細(xì)胞溶解。(b)通過(guò)IOng/mlIL-1(3誘導(dǎo)用于JNK活性的Z'，并以384細(xì)胞培養(yǎng)井/細(xì)胞培養(yǎng)板(『96)對(duì)其進(jìn)行測(cè)量。(c)使用化學(xué)JNK抑制劑，抑制內(nèi)源的IL-ip誘導(dǎo)的JNK活性[staurosporin(?！岛蚐P600125()]。(d)根據(jù)SEQIDNO:9的肽抑制劑L-TAT-IB1(在此簡(jiǎn)稱為L(zhǎng)-貝i(v〉)、根據(jù)SEQIDN0:ll的D-TAT-IB1(在此簡(jiǎn)稱為D-JNKi())、以及JBDs()(相當(dāng)于不具有TAT序列的L-JNKI)對(duì)于IL-lp決定的JNK活性的影響。所有板代表3個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)(n二3)。方法透明顯示屏激酶測(cè)定原理AlphaScreen是一種非放射的磁珠技術(shù)，用于在酶標(biāo)板格式中研究生物分子的相互作用。ALPHA表示放大的發(fā)光鄰近均質(zhì)測(cè)定。其涉及生物的相互作用，該相互作用使得施體和受體以非常接近的形式形成珠，接著，產(chǎn)生復(fù)疊的化學(xué)反應(yīng)以生成放大的信號(hào)。接著以680nm進(jìn)行激光刺激，施體珠中的光敏劑(苯二甲藍(lán)染料)將周?chē)难蹀D(zhuǎn)換成激發(fā)單重態(tài)。在其4)^ec的半衰期內(nèi)，單重氧分子可溶液中擴(kuò)散200rnn，并且如果受體珠在其中并非常接近時(shí)，單重氧將與受體珠中的二甲基噻吩衍生物發(fā)生反應(yīng)，這將以370nm生成化合光，該化合光進(jìn)一步激發(fā)相同受體珠中的熒光團(tuán)。隨后，該激發(fā)的熒光團(tuán)以520-620nm發(fā)光。未出現(xiàn)受體珠的情況下，單重氧降為基態(tài)并不產(chǎn)生信號(hào)。首先在激酶緩沖劑(20raMTris-HClpH7.6，10mMMgC12，1mMDTT，100MMNa3V04,0.01%Tween-20)中，稀釋激酶試劑(B-GST-cjun，反P-cjun抗體和活性JNK3)，接著添加到細(xì)胞培養(yǎng)井中(15W)。然后，在具有10MMATP并在23°C條件下，反應(yīng)持續(xù)l小時(shí)；通過(guò)添加IOW珠混合物(蛋白A受體20Pg/ml和Str印tavidin施體20Pg/ml)，執(zhí)行檢測(cè)；接著在檢測(cè)緩沖液中稀釋(20mMTris-HC1pH7.4，20mMNaCl，80mMEDTA，0.3%BSA);然后，在黑暗中23。C條件下，再培養(yǎng)1小時(shí)。為了測(cè)量JNK內(nèi)源活性，除了通過(guò)細(xì)胞溶解產(chǎn)物取代激活的JNK3，進(jìn)行如上所述的激酶測(cè)定；在細(xì)胞溶解后，添加反應(yīng)激酶合成物。以相同的濃度使用B-GST-cjun和P-cJun抗體，但是以50MM而不是IOMM使用ATP。在Fusion或EnVision設(shè)備上，直接分析AlphaScreen信號(hào)。例18:治療噪音損傷要么在噪音損傷前30分鐘(120dB，6kHz，持續(xù)30分鐘)或在之后的30分鐘或4小時(shí)，將2微升凝膠形式的2.6%的緩沖透明質(zhì)酸中的D-TAT-IB1用于3組幾內(nèi)亞豬(每組6頭豬)的耳蝸圓窗膜。非治療的耳朵作為對(duì)照。在噪音損傷后20分鐘(暫時(shí)性的聽(tīng)力閾值下降，TTS)和損傷后的15天(永久性的聽(tīng)力閾值下降，PTS)，通過(guò)腦干聽(tīng)覺(jué)反應(yīng)測(cè)量評(píng)估聽(tīng)力閾值的下降。相比較非治療的耳朵，給藥D-TAT-IB1防止永久性的聽(tīng)力喪失，即使在暴露于過(guò)度噪音后使用。在噪音損傷后越早給藥D-TAT-IB1，保護(hù)效果就越強(qiáng)。因此，在噪音損傷中，D-TAT-IB1是非常有效的耳保護(hù)混合物。從前述本發(fā)明特定實(shí)施例的詳細(xì)描述中，對(duì)獨(dú)特的細(xì)胞通透生物活性嵌合肽和JNK抑制序列作了顯而易見(jiàn)的描述。本發(fā)明是通過(guò)幾個(gè)具體實(shí)施例進(jìn)行說(shuō)明的，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)明白，在不脫離本發(fā)明范圍的情況下，還可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種變換及等同替代。另外，針對(duì)特定情形或具體情況，可以對(duì)本發(fā)明做各種修改，而不脫離本發(fā)明的范圍。因此，本發(fā)明不局限于所公開(kāi)的具體實(shí)施例，而應(yīng)當(dāng)包括落入本發(fā)明權(quán)利要求范圍內(nèi)的全部實(shí)施方式。權(quán)利要求1.一種JNK抑制劑序列，具有少于150個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度，其特征在于，所述抑制劑序列包括至少一個(gè)如序列表中SEQIDNO1、2、3或4所示的氨基酸序列，或其片段、衍生物或變體。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的JNK抑制劑序列，其特征在于，所述JNK抑制劑序列包括5到150個(gè)氨基酸殘基，或10到100個(gè)氨基酸殘基，或10到75個(gè)氨基酸殘基，或15到50個(gè)氨基酸殘基。3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的JNK抑制劑序列，其特征在于，所述JNK抑制劑序列與JNK相結(jié)合。4、根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的JNK抑制劑序列，其特征在于，當(dāng)JNK表達(dá)細(xì)胞中存在所述JNK抑制劑序列時(shí)，所述JNK抑制劑序列抑制至少一個(gè)JNK標(biāo)靶轉(zhuǎn)錄因子的活性。5、根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的JNK抑制劑序列，其特征在于，所述JNK標(biāo)靶轉(zhuǎn)錄因子選自c-Jun、ATF2、和Elkl。6、根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的JNK抑制劑序列，其特征在于，當(dāng)JNK表達(dá)細(xì)胞中存在所述JNK抑制劑序列時(shí)，所述JNK抑制劑序列改變JNK的作用。7、一種嵌合肽，其特征在于，包括至少一個(gè)第一域和至少一個(gè)第二域；所述第一域和第二域通過(guò)共價(jià)鍵耦聯(lián)，所述第一域包括一個(gè)運(yùn)輸序列，所述第二域包括一個(gè)JNK抑制劑序列。8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的肽，其特征在于，所述運(yùn)輸序列包括人類(lèi)免疫缺陷病毒TAT多肽的氨基酸序列。9、根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的肽，其特征在于，所述運(yùn)輸序列包括如序列表中SEQIDNO:5、6、7或8所示的氨基酸序列。10、根據(jù)權(quán)利要求7至9中任一項(xiàng)所述的肽，其特征在于，所述運(yùn)輸序列增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)所述肽的攝取。11、根據(jù)權(quán)利要求7至9中任一項(xiàng)所述的肽，其特征在于，所述運(yùn)輸序列指示所述肽在細(xì)胞核中的位置。12、根據(jù)權(quán)利要求7至11中任一項(xiàng)所述的肽，其特征在于，所述JNK抑制劑序列是如權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的JNK抑制劑序列。13、根據(jù)權(quán)利要求7至12中任一項(xiàng)所述的肽，其特征在于，所述肽包括如序列表中SEQIDNO:9、10、11或12所示的氨基酸序列，或其片段或變體。14、一種隔離核酸，其特征在于，其用于對(duì)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的JNK抑制劑序列或權(quán)利要求7至13中任一項(xiàng)所述的嵌合肽進(jìn)行編碼。15、一種載體，其特征在于，包括權(quán)利要求14所述的核酸。16、一種細(xì)胞，其特征在于，包括權(quán)利要求15所述的載體。17、一種抗體，其特征在于，其與權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的JNK抑制劑序列或權(quán)利要求7至13中任一項(xiàng)所述的嵌合肽進(jìn)行免疫特異性的結(jié)合。18、一種藥用合成物，其特征在于，包括權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的JNK抑制劑序列，或權(quán)利要求7至13中任一項(xiàng)所述的嵌合肽，或權(quán)利要求14所述的核酸，以及藥用上可接受的載體。19、一種根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的JNK抑制劑序列或根據(jù)權(quán)利要求9至13的中任一項(xiàng)所述的嵌合肽的應(yīng)用，其特征在于，制備藥用合成物，以治療個(gè)體的與JNK活性相關(guān)的病理生理異常。20、根據(jù)權(quán)利要求19所述的應(yīng)用，其特征在于，所述病理生理異常選自肺、乳房、淋巴、腸胃和泌尿生殖道的惡性腫瘤以及腺癌；所述腺癌包括多數(shù)結(jié)腸癌、腎臟癌、前列腺癌、肺的非小細(xì)胞癌、小腸癌和食道癌、與致癌轉(zhuǎn)變相關(guān)的白血病、病理生理異常、以Bcr-Abl致癌轉(zhuǎn)變的癌癥、以及非惡性腫瘤的或免疫關(guān)聯(lián)的細(xì)胞增生疾病；所述細(xì)胞增生疾病選自牛皮癬、尋常性天皰瘡、白塞氏綜合癥、急性呼吸困難綜合癥、心臟缺血性疾病、后透析綜合癥、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、獲得性免疫功能喪失綜合癥(艾滋病)、血管炎、敗血性休克、以及細(xì)胞中的JNK活性相關(guān)的病理生理異常；所述病理生理異常選自再狹窄、聽(tīng)力損失、耳朵損傷、缺血、中風(fēng)和/或與免疫細(xì)胞的成熟與分化相關(guān)的病理生理異常、再灌注損傷、組織缺氧、凋亡相關(guān)的疾病、壓力刺激響應(yīng)、以及由于使用例如前炎癥細(xì)胞因子治療導(dǎo)致的次效應(yīng)、與糖尿病或細(xì)胞切應(yīng)力相關(guān)聯(lián)的影響；所述影響選自動(dòng)脈高血壓導(dǎo)致的病理狀態(tài)，所述病理狀態(tài)包括心臟肥大、動(dòng)脈硬化損害和血管分叉，所述病理狀態(tài)的誘導(dǎo)因子包括、放射線治療和紫外光中所使用的電離輻射、自由基、DNA損傷劑例如化療藥物、缺血性/再灌注損傷、組織缺氧、和/或體溫過(guò)低和體溫過(guò)高，或者是抑制發(fā)炎、自體發(fā)炎、免疫和自體免疫疾病、退化疾病、肌病、心臟病和移植排斥的過(guò)程。21、根據(jù)權(quán)利要求19或20所述的應(yīng)用，其特征在于，通過(guò)一定的給藥途徑，給藥所述藥用合成物，所述給藥途徑包括腹膜腔、鼻、靜脈內(nèi)、口和貼劑施用。22、一種制備根據(jù)權(quán)利要求7至13的中任一項(xiàng)所述的嵌合肽的方法，其特征在于，包括如下步驟(a)在可表達(dá)所述嵌合肽的條件下，培養(yǎng)具有權(quán)利要求14所述的核酸的細(xì)胞；以及(b)重獲所述表達(dá)的肽。23、一種工具，其特征在于，包括權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的JNK抑制劑序列，和/或權(quán)利要求7至13中任一項(xiàng)所述的嵌合肽，和/或權(quán)利要求14所述的核酸，和/或權(quán)利要求15所述的載體，和/或權(quán)利要求17所述的抗體。全文摘要本發(fā)明涉及蛋白激酶抑制劑，更特別地，涉及蛋白激酶c-Jun氨基末端激酶(c-JunN-terminalkinase，JNK)的抑制劑。另外，本發(fā)明提供JNK抑制劑序列、嵌合肽、編碼相同的核酸，以及用于治療與JNK信號(hào)相關(guān)的病理生理異常的藥用合成物。文檔編號(hào)C07K14/47GK101263157SQ200680033341公開(kāi)日2008年9月10日申請(qǐng)日期2006年9月12日優(yōu)先權(quán)日2005年9月12日發(fā)明者克里斯托夫·邦尼申請(qǐng)人:希根有限責(zé)任公司