Wnt信號通路抑制劑的新用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及Wnt信號通路抑制劑的新用途，特別涉及Wnt信號通路抑制劑一XAV939在治療常染色體顯性遺傳性多囊腎中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]XAV939是小分子選擇性抑制劑，可以抑制Wnt通路轉(zhuǎn)錄因子β -catenin調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄。XAV939通過抑制端錨聚合酶1、2 (Tankyrase 1 and Tankyrase 2),使二者不能與Axin高保守區(qū)相互作用，進而阻止了 Axin被泛素途徑降解。由于XAV939能夠穩(wěn)定β-catenin降解復(fù)合體中的組成成分Axin,延長其半衰期,使Axin的濃度上升,從而促使細胞內(nèi)的β -catenin降解加速,進而抑制經(jīng)典Wnt通路的活性。XAV939作用于端錨聚合酶1和端錨聚合酶1時IC50分別為llnM和4nM。
[0003]目前，該藥已用于臨床I期實驗。
[0004]常染色體顯性遺傳性多囊腎(AutosomalDominant Polycystic Kidney Disease,ADPKD)疾病是最常見的單基因遺傳性腎病之一。其主要臨床癥狀為雙側(cè)腎臟形成大量大小不等的球形液性囊腫，并進行性增大，破壞腎臟的結(jié)構(gòu)和功能，最終導(dǎo)致腎功能衰竭。ADPKD通常在成人中發(fā)病，其發(fā)病率為1:400-1000，是目前世界上終末腎衰竭的第三大病因。除腎病表型外，ADPKD患者的非腎臟部位病變表型也十分明顯:83%的ADPKD患者出現(xiàn)肝囊腫，16%的患者出現(xiàn)腦動脈瘤。其他病理表型包括主動脈根，胸部動脈異常，二尖瓣脫垂以及腹壁疝氣。約50%的患者年滿60歲后將出現(xiàn)終末腎衰竭。正常人的尿素氮(BUN)參考范圍為2.14-7.14mmol/L，血肌酐(CRE)參考范圍為44-133 μ mol/L，當(dāng)血肌酐超過133ymol/L為炎癥損傷期，超過186 μ mol/L為腎功能損傷期，超過451umol/L為腎功能衰竭期。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供Wnt信號通路抑制劑的新用途。
[0006]本發(fā)明所提供的Wnt信號通路抑制劑的新用途，可為Wnt信號通路抑制劑在制備治療常染色體顯性遺傳性多囊腎(ADPKD)的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0007]進一步，Wnt信號通路抑制劑在制備如下任一產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍:
[0008](1)減弱患病機體腎囊腫程度的產(chǎn)品；
[0009](2)降低患病機體腎臟體重比的產(chǎn)品；
[0010](3)降低患病機體的腎臟囊腫指數(shù)的產(chǎn)品；
[0011](4)降低患病機體血液中肌酐和/或尿素氮含量的產(chǎn)品。
[0012]在本發(fā)明中，所述Wnt信號通路抑制劑具體為XAV939(化學(xué)式:C14HnF3N20S)。
[0013]所述患病機體為具有常染色體顯性遺傳性多囊腎(ADPKD)臨床癥狀的機體，如常染色體顯性遺傳性多囊腎(ADPKD)患者。在本發(fā)明中，以Vil-Cre:Pkd2f3/f3小鼠作為ADPKD動物模型，即為具有常染色體顯性遺傳性多囊腎(ADPKD)臨床癥狀的機體，上述(1)則具體表現(xiàn)為減弱Vil-Cre:Pkd2f3/f~j、鼠的腎囊腫程度；上述(2)則具體表現(xiàn)為降低Vil-Cre:Pkd2f3/fM、鼠的腎臟體重比；上述(3)則具體表現(xiàn)為降低Vil-Cre:Pkd2f3/fM、鼠的腎臟囊腫指數(shù)；上述(4)則具體表現(xiàn)為降低Vil-Cre:Pkd2f3/f3小鼠血液中的肌酐和/或尿素氮含量。
[0014]本發(fā)明的再一個目的是提供一種產(chǎn)品。
[0015]本發(fā)明所提供的產(chǎn)品的活性成分為Wnt信號通路抑制劑，該產(chǎn)品具有如下用途中的至少一種:
[0016](a)治療常染色體顯性遺傳性多囊腎；
[0017](b)減弱患病機體腎囊腫程度；
[0018](c)降低患病機體腎臟體重比；
[0019](d)降低患病機體的腎臟囊腫指數(shù)；
[0020](e)降低患病機體血液中肌酐和/或尿素氮含量。
[0021]在本發(fā)明中，所述Wnt信號通路抑制劑具體為XAV939(化學(xué)式:C14HnF3N20S)。
[0022]所述患病機體為具有常染色體顯性遺傳性多囊腎(ADPKD)臨床癥狀的機體，如常染色體顯性遺傳性多囊腎(ADPKD)患者。在本發(fā)明中，以Vil-Cre:Pkd2f3/f3小鼠作為ADPKD動物模型，即為具有常染色體顯性遺傳性多囊腎(ADPKD)臨床癥狀的機體，上述(b)則具體表現(xiàn)為減弱Vil-Cre:Pkd2f3/f~j、鼠的腎囊腫程度；上述(c)則具體表現(xiàn)為降低Vil-Cre:Pkd2f3/f3小鼠的腎臟體重比；上述⑷則具體表現(xiàn)為降低Vil-Cre:Pkd2f3/f3小鼠的腎臟囊腫指數(shù)；上述(e)則具體表現(xiàn)為降低Vil-Cre:Pkd2f3/f3小鼠血液中的肌酐和/或尿素氮含量。
[0023]在以上所述的各應(yīng)用或產(chǎn)品中，所述產(chǎn)品具體可為藥物。
[0024]以上所有的所述Vil-Cre:Pkd2f3/f3小鼠均按照包括如下步驟的方法構(gòu)建得到:
[0025](I)將 Pkd2f3/f3 小鼠(記載于 “l(fā)ngyu Kim, Tianbing Ding, Yulong Fu, etal.Condit1nal Mutat1n of Pkd2 Causes Cystogenesis and Upregulates β -Catenin.J Am Soc Nephrol，2009 (20): 2556-2569”一文)與帶有 Vil-Cre 重組酶的轉(zhuǎn)基因小鼠(購自 The Jackson Laboratory,Strain Name:B6.SJL-Tg (Vil~cre)997Gum/J,Stock Number:004586，詳見網(wǎng)址:http: //jaxmice.jax.0rg/strain/004586, html)進行雜交，得到 FI 代(其中理論上有1/2后代的基因型為Vil-Cre:Pkd2+/f3 ；1/2后代的基因型為Pkd2+/f3)；
[0026](II)將步驟⑴得到的F1代(Vil-Cre:Pkd2+/f3)與所述Pkd2f3/f3小鼠進行回交，得到回交后代；
[0027](III)從步驟(II)得到的回交后代中篩選出Pkd2基因純合，同時表達Vil-Cre的小鼠，即為 Vil-Cre:Pkd2f3/f3 小鼠。
[0028]其中，步驟(III)中所述“從步驟(II)得到的回交后代中篩選出Pkd2基因純合，同時表達Vil-Cre的小鼠”，可按照如下方法實現(xiàn):以所述回交后代的小鼠基因組為模板，采用針對 Pkd2 基因的引物(三條:5，-TCT GAC TTG CAG ACT GTG GG_3，，5，-AGG TAG GGGAAG GTC AGG GTT GG-3’，5’ -TTTACGTCCAGCCAAGCT-3’)和針對 Cre 基因的引物(兩條:5，-CCA GGT TAC GGA TAT AGT TCA TG_3，，5，-TGC CAC GAC CAA GTG ACA GC-3，)分別進行PCR擴增；針對？1?12基因進行PCR擴增得到大小為650bp的單一條帶(Pkd2基因純合)，同時針對Cre基因進行PCR擴增得到大小為650bp的條帶(表達Vil-Cre)的小鼠即為所述 Vil-Cre:Pkd2f3/f3 小鼠。
[0029]本發(fā)明以Vil-Cre:Pkd2f3/f3小鼠作為ADPKD動物模型，進行了 Wnt信號通路抑制劑一XAV939對常染色體顯性遺傳性多囊腎(ADPKD)治療的效果研究，結(jié)果表明，Wnt信號通路抑制劑一XAV939對于治療常染色體顯性遺傳性多囊腎具有一定的效果，具體體現(xiàn)在:
(1)可減弱Vil-Cre:Pkd2f3/fM、鼠的腎囊腫程度；(2)可降低Vil-Cre:Pkd2f3/f3小鼠的腎臟體重比；(3)可降低Vil-Cre:Pkd2f3/f3小鼠的血液中肌酐和/或尿素氮的含量。本發(fā)明對于常染色體顯性遺傳性多囊腎(ADPKD)發(fā)病機制的分析，對于治療常染色體顯性遺傳性多囊腎(ADPKD)的藥物的研發(fā)均具有重要意義。
【附圖說明】
[0030]圖1為回交后代小鼠基因型的PCR檢測結(jié)果。其中，A為針對Pkd2基因PCR檢測結(jié)果，Pkd2f3/f3為Pkd2基因純合，Pkd2+/f3為Pkd2基因雜合；B為針對Cre基因的PCR檢測結(jié)果，Vil-cre為表達Vil-Cre ；WT為不表達Vil-Cre。
[0031]圖2為Vil-Cre:Pkd2f3/f3小鼠模擬人類ADPKD的疾病表型。其中，A為Vil-Cre:Pkd2f3/f3小鼠腎臟形態(tài)；B為Vil-Cre:Pkd2f3/f3小鼠肝臟形態(tài)；C為Vil-Cre:Pkd2f3/f3小鼠胰腺形態(tài)；D為Vil-Cre:Pkd2f3/f3小鼠的腎臟橫切面；E為Pkd2f3/f3小鼠的腎臟橫切面。
[0032]圖3為兩組小鼠的腎臟HE染色結(jié)果。其中，A表示治療組；B表示對照組。A和B中，1、2、3、4均表示兩組不同個體小鼠的腎臟HE染色結(jié)果。
[0033]圖4為兩組小鼠的腎臟體重比測定結(jié)果。
[0034]圖5為兩組小鼠的腎臟囊腫指數(shù)測定結(jié)果。
[0035]圖6為兩組小鼠的血液中尿素氮(BUN)與肌酐(CRE)的含量測定結(jié)果。其中，A表示肌酐含量表示尿素氮含量。
【具體實施方式】
[0036]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0037]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0038]Pkd2f3/f3 小鼠:記載于“l(fā)ngyu Kim, Tianbing Ding, Yulong Fu, etal.Condit1nal Mutat1n of Pkd2 Causes Cystogenesis and Upregulates β -Catenin.J Am Soc Nephrol，2009(20): 2556-2569” 一文中。其構(gòu)建及鑒定過程大體如下:首先，在Pkd2基因的3號外顯子兩側(cè)插入兩個ΙοχΡ位點，在陽性選擇性Neo的兩側(cè)有FRT位點，由于該結(jié)構(gòu)沒有完全阻斷正常Pkd2基因的表達，所以用這種載體通過基因打靶技術(shù)產(chǎn)生的Pkd2nf3小鼠可避免死于胚胎期。再將Pkd2nf3小鼠與ACTB-F1印小鼠雜交，即產(chǎn)生沒有Neo元件的Pkd2f3/f3小鼠。鑒于在Pkd2f3/f3小鼠中沒有觀察到多囊表型，PC2的表達也沒有發(fā)生改變，認為這種Pkd2f3等位基因不會導(dǎo)致Pkd2的表達失活。
[0039]帶有Vil-Cre 重組酶的轉(zhuǎn)基因小鼠:購自 The Jackson Laboratory, Strain Name:B6.SJL-Tg(Vi 1-cre)997Gum/J, Stock Number:004586,詳見網(wǎng)址:http://jaxmice.jax.0rg/strain/004586, html。
[0040]XAV939:Selleck 公司，產(chǎn)品目錄號 S1180。分子量:312.31 ;化學(xué)式:C14HnF3N20S ；CAS 號:284028-89-3 ;溶解性(25。。):DMSO 12mg/mL，水〈lmg/mL，乙醇〈lmg/mL ;穩(wěn)定性:3年-20°C粉狀，6月-80°C溶于DMSO。
[0041]實施例l、Vil-Cre:Pkd2f3/f3小鼠模型的構(gòu)建及鑒定
[0042]Vi