專利名稱：：硒代氨基酸的衍生物的制作方法硒代氨基酸的衍生物
背景技術(shù)：
1957年Schwarz和Foltz首先認(rèn)識到硒在營養(yǎng)中的重要作用(Schwarz，K.andFoltz，C.M.，Seleniumasanintegralpartoffactor3againstdietarynecroticliverdegeneration.J.Am.Chem.Soc.79:3292(1957))。這些研究者觀察到當(dāng)給大鼠詞喂維生素E缺乏的純化曰糧時，大鼠發(fā)生肝壞死。但是，在日糧中添加硒則避免了這種病變的發(fā)生。同年，Patterson等報道了日糧硒預(yù)防發(fā)生滲出性素質(zhì)的能力，滲出性素質(zhì)是雞中一種以血漿滲漏到腹腔和胸部的皮下間隙為特征的病變(Patterson,E丄.，Milstrey，R,,Stokstad，E丄.R.Effectofseleniuminpreventingexudativediathesisinchicks.Proc.Soc.Exp,Biol.Med.95:617-620(1957))。通過認(rèn)識到硒缺乏在家畜中的實際效果進(jìn)一步證實了硒在營養(yǎng)中的重要作用(Muth,O.H.，Oldfidd,J.E.,Remmert,L.F.,andSchubert,J.R.EffectsofseleniumandvitaminEonwhitemuscledisease.Science128:1090(1958)禾卩Hartley,W,J.，andGrant,A.B.AreviewofseleniumresponsivediseasesofNewZealandlivestock.Fed.Proc.20:679(1961))。隨后的工作證實硒是動物必需元素，其缺乏會造成各種疾病(Combs,G.F.Jr.,Combs,S.B.Theroleofseleniuminnutrition.AcademicPress,Orlando,Florida,pp265-399(1986b))。直到20世紀(jì)70年代才認(rèn)識到硒在人營養(yǎng)中的重要性及其缺乏對人體健康的影響。發(fā)現(xiàn)硒缺乏是克山病的病因之一，克山病是一種以擴張型心肌病為特征的人類病變，影響著生活在中國農(nóng)村地區(qū)的人們。克山病的發(fā)病率符合硒缺乏地區(qū)的分布(KeshanDiseaseResearchGroupoftheChineseAcademyofMedicalSciences.EpidemiologicstudiesontheetiologicrelationshipofseleniumandKeshandisease.Chin.MedJ.92:477-482(1979))。此外，前瞻性的安慰劑對照研究證實通過施用亞硒酸鈉片劑可以預(yù)防新病例的出現(xiàn)(KeshanDiseaseResearchGroupoftheChineseAcademyofMedicalSciences-ObservationsoneffectofsodiumsdeniteinpreventionofKeshandisease-Chin.MedJ.92:471-477(1979))。一些病例研究也報道了飲食誘導(dǎo)的硒缺乏對危重患者的有害作用。一例全腸外營養(yǎng)患者發(fā)生了骨骼肌病，通過靜脈內(nèi)施用硒代甲硫氨酸得到了逆轉(zhuǎn)(vanRij,A.M.,Thomson,C.D.，McKenzie,J.M.，Robinson,M.F.Seleniumdeficiencyintotalparenteralnutrition.Am.J.Clin.Nutr.32:2076-2085(1979))。還報道了一例在死亡前接受了腸外營養(yǎng)2年的43歲男性患者發(fā)生了營養(yǎng)性硒缺乏誘導(dǎo)的致死性心肌病(Johnson,R.A.，Baker,S.S.,Fallon,J.T.，Maynard，E.P.，Ruskin，J.N"Wen，Z，Ge，K.,andCohen,H丄Anoccidentalcaseofcardiomyopathyandseleniumdeficiency.TheNewEnglandJournalofMedicine.304:1210-1212(1981))。在1982年，報道了第2例與飲食性硒缺乏相關(guān)的致死性心肌病，這是一例家庭腸外營養(yǎng)至少2年的患者(SeleniumDeficiencyandFatalCardiomyopathyinaPatientonHomeParenteralNutrition.Gastroenterology.83:689-693(1982))。對硒在人和動物營養(yǎng)中的重要作用的認(rèn)識已經(jīng)使得建立了用于人的推薦每日供給量(RDA)并批準(zhǔn)在動物飼料中添加額外的硒化合物。最近，醫(yī)學(xué)研究所食品和營養(yǎng)委員會修訂了RDA，將硒的量規(guī)定為55(_ig(DietaryReferenceIntakesforVitaminC，VitaminE，Selenium,andCarotenoids.Washington,D.C.:NationalAcademyPress,(2000))。食品和藥品管理局(FDA)1974年批準(zhǔn)亞硒酸鈉和硒酸鈉用作詞料添加劑?？梢园丛谠~料干物質(zhì)中含0.3ppmSe的水平添加這些無機硒鹽。FDA在2000年6月1日批準(zhǔn)硒酵母在肉雞和蛋雞日糧中的應(yīng)用。在1973年開始形成涉及硒的有益作用的生物化學(xué)機制，當(dāng)時發(fā)現(xiàn)硒是抗氧化物酶谷胱甘肽過氧化物酶的重要組分(Rotmck,J.T.,Pope,A丄.,Ganther，H.E.，Swanson，A.B.，Hafeman，D.G.F.,andHockstra,W.G.Selenium:BiochemicalRoleasaComponentofGlutathionePeroxidase.Science,179:588-590(1973)禾QFlohe，L.,Gunzler,W.A.andShock,H.H.GlutathionePeroxidase.ASelenoenzyme.FEBSLett.32:132-134))。同時，在大鼠、獼猴和人血槳中都發(fā)現(xiàn)了胞外含硒蛋白質(zhì)(硒蛋白P)，并發(fā)現(xiàn)其不同于谷胱甘肽過氧化物酶(MoschosMP.SelenoproteinP.CellularandMolecularLifeSciences.57:1836-1845(2000))。硒的另一個功能是作為調(diào)節(jié)甲狀腺激素代謝的碘化甲狀腺氨酸脫碘酶的催化活性組分。更近些時候，在硫氧還蛋白還原酶的活性中心鑒定到了硒代半胱氨酸，這證實硒在經(jīng)這些酶催化的各種代謝過程中都發(fā)揮了作用。最近的研究已經(jīng)顯示硒在哺乳動物中的作用不限于含硒酶的生理功能?，F(xiàn)在顯示硒在對雄性能育性很重要的精子發(fā)生中有著非常特異的作用(UrsiniF.,HeimS.，KiessM.,MaiorinoM.,RoveriA.，WissingJ.,Flohe'L.DualFunctionoftheSelenoproteinPHGPxDuringSpermMaturation.Science285:1393-1396(1999))。在精核中鑒定到特異性含硒酶進(jìn)一步強化了硒在精子成熟中發(fā)揮的重要作用(PfeifbrH.,ConradM.,RoetheinD.，KyriakopoulosA.，BrielmeierM,，BornkammG.W"BehneD.IdentificationofaSpecificSpermNucleiSelenoenzymeNecessaryforProtamineThiolCross-LinkingDuringSpermMaturation.FASEBJ15:1236-1238(2001))。通過攝入含有天然存在的有機硒化合物的飲食通常可以滿足對硒的飲食需求。富含有機硒化合物的食物和飼料成分包括肉、魚、乳制品、一些蔬菜和谷物。植物來源的材料中硒的濃度常常取決于植物生長的土壤中硒的濃度。落基山地區(qū)的土壤比其他地區(qū)含有更高水平的硒，生長于這些土壤中的植物因此含有更高水平的硒。天然食物和詞料成分中的大多數(shù)有機硒以L-硒代甲硫氨酸的形式存在。一些生長在富硒土壤中的元素積聚植物和蔬菜(例如大蒜、洋蔥和綠花椰菜)都含有硒-甲基硒代半胱氨酸及其衍生物作為主要有機硒化合物。美國天然飼料植物中的其中一種主要的硒形式是硒酸鹽。在所研究的24種植物中，硒酸鹽占總硒量的5-92%。這些植物中除了一種含有占總硒量3°/。的亞硒酸鹽外，其他植物都不含亞硒酸鹽(WhangerRD.SelenocompoundsinPlantsandAnimalsandtheirBiologicalSignificance.JournaloftheAmericanCollegeofNutrition,12:223-232(2002))。無論所攝入的硒是何種形式，它都經(jīng)相同的中間池被各種代謝途徑轉(zhuǎn)化成特異性的含硒代半胱氨酸的含硒蛋白質(zhì)，這些含硒蛋白質(zhì)形成了硒的生物學(xué)作用。組織中這些含硒代半胱氨酸的含硒蛋白質(zhì)的水平表現(xiàn)為受體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的控制。攝入所供給的硒超過最佳需要量不會增加組織中特異性含硒蛋白質(zhì)的濃度。但是，硒代甲硫氨酸的攝入相對于其他硒來源造成了更高水平的硒滯留于組織中。這是因為只有一部分硒代甲硫氨酸與其他硒來源相似地經(jīng)中間池代謝為特異性含硒代半胱氨酸的蛋白質(zhì)這一事實。一定比例的攝入的硒代甲硫氨酸直接被非特異性地?fù)饺氲鞍踪|(zhì)中，代替了甲硫氨酸。這種非特異性結(jié)合的硒在富含甲硫氨酸的蛋白質(zhì)中以高濃度存在。所攝入的硫代甲硫氨酸中被摻入非特異性蛋白質(zhì)中的部分取決于硒代甲硫氨酸與甲硫氨酸的比例，而非硒的狀態(tài)。當(dāng)攝入低甲硫氨酸飲食時，蛋白質(zhì)中非特異摻入的硒代甲硫氨酸的增加造成特異性含硒蛋白質(zhì)的濃度和作用的下降。硒代甲硫氨酸的非特異性摻入發(fā)生于骨骼肌、紅細(xì)胞、胰腺、肝臟、胃、腎臟和消化道粘膜的蛋白質(zhì)中。機體蛋白質(zhì)釋放硒代甲硫氨酸與蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換有關(guān)。如果維持硒代氨基酸的攝入一段較長的時間，可以建立組織中硒代甲硫氨酸的穩(wěn)態(tài)濃度(SchrauzerGN.NutritionalSeleniumSupplements:ProductTypes,Quality,andSafety-JournaloftheAmericanCollegeofNutrition,20:1-4(2001))。已經(jīng)仔細(xì)地研究了硒代甲硫氨酸、硒-甲基硒代半胱氨酸、亞硒酸鹽和硒酸鹽在動物體內(nèi)的分布。這些動物營養(yǎng)中常見的硒來源利用不同于中間硒池的途徑，最終被摻入特異性含硒蛋白質(zhì)中或者進(jìn)一步被轉(zhuǎn)化成為可以被容易地排泄的極性代謝物。通過多種途徑除去一部分?jǐn)z入的硒來源。一部分口服攝入的亞硒酸鹽和硒酸鹽在消化道內(nèi)被還原成元素硒，并經(jīng)糞便排出。亞硒酸鹽和硒酸鹽也經(jīng)尿液排出。給動物飼料補充獲批準(zhǔn)的硒來源正變得越來越普遍。現(xiàn)在，無機來源(例如亞硒酸鹽和硒酸鹽)以及有機來源硒酵母都已經(jīng)被FDA批準(zhǔn)用作飼料組分。但是，規(guī)定了可以添加的硒的量以及可以補充的家畜的種類。批準(zhǔn)使用無機硒來源(例如亞硒酸鹽和硒酸鹽)作為飼料組分是非常匪夷所思的，因為這些無機硒來源并不以有效濃度天然地存在于詞料中。在天然食物和飼料中，L-硒代甲硫氨酸是最常見的硒的形式。但是，還不能以合理價格商品化地獲得用作家畜養(yǎng)殖中的飼料組分的合成L-硒代甲硫氨酸。因此，富硒酵母已經(jīng)被用作實際上用得起的L-硒代甲硫氨酸的來源。生長在富硒培養(yǎng)基中的特定釀酒酵母株—c由ra附戸sce，&—可以蓄積每克干物質(zhì)3000嗎的硒。酵母中的大部分硒都以L-硒代甲硫氨酸的形式存在。L-硒代甲硫氨酸主要是被摻入酵母蛋白質(zhì)中代替L-甲硫氨酸?？梢砸缘蜐舛却嬖诘钠渌袡C硒化合物包括硒-腺苷-硒代高半胱氨酸(2-5%)、硒代半胱氨酸(0.5%)、甲基硒代半胱氨酸(0.5%)、丙氨酸丁氨酸硒醚(0.5%)、和，谷氨酰-硒-甲基硒代半胱氨酸(0.5%)。只有微量的無機硒(如亞硒酸鹽或硒酸鹽)可存在于酵母中(SchrauzerG.N.Selenomethionine:AReviewofitsNutritionalSignificance,MetabolismandToxicity.J.Nutr.130:1653-1656(2000》。在過去的數(shù)年里已經(jīng)公開出版了一些研究，對亞硒酸鹽和硒酵母補充對硒狀態(tài)和家畜健康的影響進(jìn)行了比較。在硒缺乏動物中，血漿和組織中的硒濃度隨著硒攝入增加而線性增加到一個點，之后血漿和組織硒濃度不再隨著攝入的增加而發(fā)生顯著變化。例如，Maus等檢查了來自亞硒酸鈉的日糧硒與奶牛血漿和乳中的硒濃度之間的關(guān)系。隨著硒攝入從約2mg沃增加到6mg/天，血漿和乳中的硒濃度呈線性增加。攝入量的進(jìn)一步增加只造成血漿和乳中硒的輕微變化(MausR.W"MartzF.A.,BelyeaR丄.andWeissM.F.,RelationshipofDietarySeleniumtoSeleniuminPlasmaandMilkfromDairyCows,JDairySci,63:532-537(1980))。在一些動物研究中發(fā)現(xiàn)來自硒酵母的硒比來自亞硒酸鹽或硒酸鹽的硒有更高的生物利用率。經(jīng)硒酵母詞喂的動物的組織硒濃度的增加比經(jīng)亞硒酸鹽詞喂的動物更大。但是，無論補充硒的來源是哪一種，谷胱甘肽過氧化物酶活性的增加都基本相同。一些研究還證實硒補充對動物健康的有益作用。例如，如通過減少攜帶乳房炎病原體的百分比以及減少乳中的體細(xì)胞數(shù)所證實的那樣，硒補充提高了奶牛的乳房健康。硒酵母的作用同樣比亞硒酸鈉的作用更大(MalbeM.，KlassenM.，F(xiàn)angW"MyllsV"VikerpuurM.,NyholmK，，SankariS.,SourtaK.,andSandholmM.ComparisonsofSeleniteandSeleniumYeastFeedSupplementsonSe-incorporation，MastitisandLeucocyteFunctioninSe-deficientDairyCows，JVetMedA，42:111-121(1995》?？偠灾?，現(xiàn)在已經(jīng)清楚地知道飲食性硒是人類和動物的健康和福利所必需的。一些研究已經(jīng)證實有機來源的硒比無機來源的硒有更高的生物利用率。商品化可獲得的唯一有機硒來源是富硒酵母制劑。在酵母中，硒主要以富含L-硒代甲硫氨酸的蛋白質(zhì)的形式存在。盡管硒酵母現(xiàn)在已經(jīng)被廣泛地接受作為飲食性硒的來源，但是它的應(yīng)用有一些缺點。酵母中有機結(jié)合的硒的濃度受限于其從富含亞硒酸鹽的培養(yǎng)基形成L-硒代甲硫氨酸的能力。目前酵母中最高可能的硒濃度為2000|iig/g干物質(zhì)。其次，因為酵母中有機結(jié)合的硒是通過生物學(xué)過程生成的，而所述生物學(xué)過程容易受到大規(guī)模生產(chǎn)過程中的細(xì)微變化的影響，因此硒化合物的確切組成是可變化的，并且是不容易知道的。偶爾，酵母含有不同濃度的無機硒化合物例如亞硒酸鹽和硒酸鹽。第三，酵母中存在的有機硒化合物是作為胞內(nèi)蛋白質(zhì)的一部分。在這些化合物被消化后可吸收之前，酵母的細(xì)胞壁必須破裂以便將蛋白質(zhì)釋放到動物的胃腸道內(nèi)，在這里所述蛋白質(zhì)可以接受消化酶的蛋白水解作用。只有當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)被水解成單氨基酸或二肽后，硒化合物才能被吸收。從完整的酵母細(xì)胞將硒化合物釋放為單氨基酸或二肽是不完全的，并高度依賴于消化道中的條件。因為這些缺點，特別需要開發(fā)出富硒酵母的替代品用作容易進(jìn)行生物利用的飲食性硒的來源。本申請人更早期的專利US6,911,550涉及絡(luò)鹽。本發(fā)明的改進(jìn)涉及某些非常穩(wěn)定的酯和有機衍生物。最近，對具有提高的生物利用率的用作人和家畜補充劑的飲食性硒來源的需求有所增加。最近已經(jīng)可以以合理價格商品化地獲得合成的硒代氨基酸。但是，這些氨基酸具有低水溶性，且它們的結(jié)晶具有疏水特性，該性能導(dǎo)致低溶解速度。低溶解度和低溶解速度降低了這些化合物在詞喂給動物后的生物利用率。本發(fā)明的一個主要目的是鑒定具有提高的生物利用率的硒代氨基酸的衍生物，并制備所述衍生物。硒和硫一樣都是第VIA族元素的成員。存在著不同同素異形形式的硒，其具有-2、0、+2、+4、和+6價氧化態(tài)。硒是非金屬元素。它可以形成單原子陰離子，并從而可以形成離子鍵和共價鍵。在-2價氧化態(tài)時，硒與碳取代基形成共價鍵，并常?？梢匀〈烊淮嬖诘幕衔镏械牧?。硒的生物學(xué)作用歸功于這些天然存在的化合物，在所述化合物中硒以-2價氧化態(tài)存在，并常常與碳共價結(jié)合作為功能蛋白質(zhì)的一部分。已經(jīng)提出將硒代氨基酸作為硒的飲食性來源。但是，現(xiàn)在認(rèn)識到動物的營養(yǎng)狀態(tài)和飲食組成以及消化道內(nèi)容物都可能會顯著地降低這些化合物的生物利用率。因此，需要開發(fā)硒代氨基酸的衍生物，這可以提高這些氨基酸的生物利用率。在先前的專利(US6,911，550)中，本申請的發(fā)明人描述了具有提高的生物利用率的可逆的硒代氨基酸衍生物。這些可逆的衍生物是硒代氨基酸(例如L-硒代甲硫氨酸)的1:1鋅復(fù)合物。本發(fā)明的主要目的是制備具有提高的生物利用率的新的不可逆的硒代氨基酸衍生物。通過形成oc氨基和/或羧基和保護基團之間的共價鍵對硒代氨基酸進(jìn)行化學(xué)修飾形成這些新化合物。這些化學(xué)穩(wěn)定的化合物在被動物攝入后被酶促修飾成硒代氨基酸。本發(fā)明的另一個目的是描述制備這些衍生物的方法以及它們作為家畜飼料成分的用途。發(fā)明概述制備作為人和家畜的補充硒的有效飲食性來源的新的硒代氨基酸衍生物。所述新的衍生物相對于親代硒代氨基酸具有改善的物理學(xué)、化學(xué)或生物學(xué)特性。這些衍生物相對于硒代氨基酸具有增強的生物利用率和/或增加的穩(wěn)定性。它們是硒代氨基酸例如L-硒代甲硫氨酸的1:1復(fù)合物。具體實施例方式由于現(xiàn)有可用于飼料添加劑的硒來源的令人不滿意的性能，因此有必要開發(fā)具有提高的生物利用率的硒代甲硫氨酸的衍生物。所述新的衍生物所需特性包括1.所述衍生物必須是容易生物利用的硒來源。2.所述衍生物必須比親代化合物更穩(wěn)定。3.所述衍生物的物理學(xué)特性例如溶解度、溶解速度和氣味比親代化合物更為有利。4.可以通過利用商品化可獲得的試劑并以合理的代價從親代化合物容易地制備所述衍生物。5.認(rèn)識到所有含硒化合物都有著窄的安全性范圍，所述衍生物必須和親代化合物一樣安全。6.所述衍生物在瘤胃內(nèi)容物中必須是穩(wěn)定的，從而使得它可以用作反芻動物的硒來源。發(fā)現(xiàn)其他商品化可獲得的硒代氨基酸(例如甲基-L-硒代半胱氨酸)具有與L-硒代甲硫氨酸相似的不需要的物理學(xué)餘性。因此，也制備了這些硒代氨基酸的衍生物。發(fā)現(xiàn)這些衍生物具有與硒代甲硫氨酸相似的物理學(xué)特性。一組硒代氨基酸衍生物是簡單的脂肪族酯例如甲酯、乙酯、丙酯和異丙酯。在這個組中，異丙酯是優(yōu)選的化合物。在存在適當(dāng)?shù)拇呋瘎┗蚺悸?lián)劑的情況下，通過硒代氨基酸和異丙醇的反應(yīng)可以容易地制備這些酯。這些催化劑或偶聯(lián)劑包括濃硫酸和亞硫酰氯。通常以鹽酸化物的形式分離出氨基酸酯。L-硒代甲硫氨酸異丙酯鹽酸化物易溶于水，并且在固體狀態(tài)以及在溶液中都比L-硒代甲硫氨酸明顯更為穩(wěn)定。這些衍生物比親代硒代氨基酸具有更高的脂溶性，并可以在pH>5.0時通過被動擴散自腸內(nèi)容物中被快速地吸收。第二組研究的衍生物是硒代氨基酸的N-琥珀酰衍生物。通過硒代氨基酸與琥珀酐的反應(yīng)可以容易地獲得這些化合物。這些化合物是部分解離的酸，因為硒代氨基酸的a-氨基受到掩蔽?？梢苑蛛x這些化合物并容易地純化成其鹽的形式?？梢灾苽溻淃}、鈉鹽、銬鹽或鎂鹽。N-琥珀酰L-硒代甲硫氨酸的鈉鹽易溶于水。其在固體狀態(tài)或在溶液中都比L-硒代甲硫氨酸明顯更為穩(wěn)定。這些衍生物比親代硒代氨基酸具有更高的脂溶性，并且可以在pH々.0時通過被動擴散自胃腸內(nèi)容物中被快速地吸收。第三組研究的衍生物是硒代氨基酸的N-氨甲酰衍生物和乙內(nèi)酰脲衍生物。通過L-硒代甲硫氨酸和氰酸鉀于90°C在水溶液中反應(yīng)可以獲得N-氨甲酰L-硒代甲硫氨酸。在3N鹽酸中加熱N-氨甲酰衍生物提供L-硒代甲硫氨酸乙內(nèi)酰脲。N-氨甲酰衍生物的水溶性較高，并且其溶液也比親代硒代氨基酸更為穩(wěn)定。乙內(nèi)酰脲水溶性較低，但是比親代硒代氨基酸更為穩(wěn)定。上述化合物都是硒代氨基酸的可逆衍生物。在經(jīng)動物消化之后，預(yù)計它們可通過酶催化反應(yīng)容易地轉(zhuǎn)化為親代硒代氨基酸。例如，預(yù)期通過存在于血液以及其他組織例如肝臟中的酯酶可以容易地水解L-硒代甲硫氨酸異丙酯。酯在pH為7.4的血漿中的非酶促水解也是可能的。通過血漿和肝臟中的酰胺酶可以酶促水解N-琥珀酰衍生物?？梢詫⒈景l(fā)明所描述的硒代氨基酸衍生物添加到固體或液體飼料中用作容易利用的硒來源。添加的化合物的量將取決于所要供應(yīng)的動物。對于豬和家禽，日糧中要補充0.05-2.00ppm的硒，優(yōu)選0.1-0.3ppm的硒。對于牛，飼料中要補充0.05-10mg的硒/頭/天，優(yōu)選2-7mg的硒/頭/天。提供以下實施例，以舉例說明獲得這些化合物的實用方法、它們的特性、以及它們作為動物營養(yǎng)中硒的來源的應(yīng)用。實施例l:L-硒代甲硫氨酸異丙酯鹽酸化物(化合物l)的制備。向1000ml圓底燒瓶內(nèi)加入150ml異丙醇。將燒瓶放置在冰水浴中，并仔細(xì)地逐滴加入濃硫酸(43.208g，工業(yè)級，最小純度93%)，并持續(xù)攪拌。持續(xù)攪拌下仔細(xì)加入L-硒代甲硫氨酸(66.962g,0.338摩爾)。將Soxhlet提取管連接到燒瓶的頂部。將帶有充滿3A分子篩的燒結(jié)盤的玻璃提取筒放入到提取管內(nèi)。加入異丙醇填滿提取管。連接回流冷凝器和提取管。通過加熱罩使混合物加熱，引起異丙醇的輕微回流。在回流下加熱反應(yīng)混合物48小時。停止加熱，并將燒瓶放置于冰水浴中。持續(xù)混合下緩慢地加入氫氧化銨溶液。形成了大量的白色沉淀。過濾混合物，并用異丙醇洗滌沉淀。在減壓條件下濃縮合并的濾液和洗滌液，得到稠油。將殘渣溶解在100ml乙酸乙酯中。將乙酸乙酯溶液轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，并用稀釋的氫氧化銨溶液和鹽水(Brine)相繼進(jìn)行抽提。在無水硫酸鎂上干燥乙酸乙酯抽提液，過濾，在減壓條件下除去溶劑，得到黃色的稠油(42.337g，產(chǎn)率52.61%)。將油溶解在200ml異丙醇中，并加入濃鹽酸(20g)。在減壓條件下濃縮混合物，將殘渣溶解在最小量的乙酸乙酯中。逐滴加入無水乙醚直到出現(xiàn)渾濁。將混合物在冰箱內(nèi)存放4天。過濾出白色結(jié)晶沉淀，并用無水乙醚洗滌。固體溴化鉀沉淀的FTIR光譜顯示吸收峰大約位于3413.8(W)、2981.7(vs)、2877.6(vs)、2615.3(m)、2488.0(w)、2跳0(m)、1732.0(vs)、1585.4(m)、1512.1(m)、1465.8(m)、1442.7(m)、1377.1(m)、1276.8(s)、1242.1(vs)、U88.1(s)、蘭.l(vs)、1068.5(m)、902.6(m)和813.9(w)cm"(W，弱；m，中等；S，強；VS，非常強)。該光譜不同于L-硒代甲硫氨酸的光譜，后者的光譜顯示出吸收峰位于大約3433.1(w)、2923,9(s)、2731.0(m)、2611.4(m)、2117.7(w)、廳.5(s)、1581.5(vs)、1512.1(s)、1411.8(s)、1338.5(m)、1269.1(w)、1218.9(w)、1153.4(w)禾口利用UV/Vis檢測器于210nm通過HPLC分析含有l(wèi)mg/mlL-硒代甲硫氨酸異丙酯鹽酸化物的水溶液，并通過RheodyneLoop注射器向柱頭上注射20^1樣品。使用250X4.6mmDiscoveryCyano柱(Supelco)，以lml/min的0.1%乙酸作為流動相。L-硒代甲硫氨酸異丙酯鹽酸化物的滯留時間為4.467分。L-硒代甲硫氨酸在這一系統(tǒng)中的^^留時間為4.167分。用L-硒代甲硫氨酸異丙酯鹽酸化物獲得了占超過99%的檢測器響應(yīng)的單峰。這一系統(tǒng)可用于測定預(yù)混合物中的L-硒代甲硫氨酸異丙酯鹽酸化物。實施例2:N-琥珀酰L-硒代甲硫氨酸(化合物2)的制備。給250ml3頸圓底燒瓶裝配溫度計、回流冷凝器和加料漏斗。將乙酸乙酯(75ml)放入燒瓶內(nèi)。在研缽內(nèi)將琥珀酐(12.404g)精細(xì)地碾成粉末，并將其添加至燒瓶內(nèi)的乙酸乙酯中。用磁性攪拌器攪拌混合物，直到所有固體全部溶解。加入L-硒代甲硫氨酸(19.630g，0.1摩爾)。稀釋硫酸(用5份水稀釋1份濃硫酸得到l.Oml溶液)。在回流并持續(xù)攪拌的條件下加熱混合物1小時。過濾熱的澄清溶液。當(dāng)過濾液冷卻時，形成白色結(jié)晶沉淀。沉淀稱重為24.92g(產(chǎn)率84.14%)。溴化鉀沉淀的上面獲得的細(xì)磨晶體的FTER光譜顯示吸收峰位于約3313.5(m)、3091.7(w)、2931.6(m)、2626.9(w)、1714.6(vs)、1647.1(s)、1616.2(m)、1434.9(m)、1409.9(m)、1245,9(s)、1195.8(s)、964.3(w)、704.0(w)和636.5(w)cm"(w，弱；m，中等；s，強；vs，非常強)。這一光譜不同于L-硒代甲硫氨酸的光譜，后者顯示吸收峰位于約3433.1(w)、2923.9(s)、2731.0(m)、2611.4(m)、2117.7(w)、1608.5(s)、1581.5(vs)、1512.1(s)、1411.8(s)、1338.5(m)、1269.1(w)、1218.9(w)、1153.4(w)和540.0(w)cm"。利用UV/Vis檢測器于210nm通過HPLC分析含有l(wèi)mg/mlN-琥珀酰L-硒代甲硫氨酸的水溶液，并通過RheodyneLoop注射器向柱頭上注射20|il樣品。使用250X4.6mmDiscoveryCyano柱(Supelco),以lml/min的0.1。/。乙酸作為流動相。N-琥珀酰L-硒代甲硫氨酸的滯留時間為5.56分。L-硒代甲硫氨酸在這一系統(tǒng)中的滯留時間為4.167分。用N-琥珀酰L-硒代甲硫氨酸獲得了占超過99.54%的檢測器響應(yīng)的單峰。這一系統(tǒng)可用于測定預(yù)混合物中的N-琥珀酰L-硒代甲硫氨酸。實施例3:N-氨甲酰L-硒代甲硫氨酸(化合物3)的制備給250ml3頸圓底燒瓶裝配溫度計、回流冷凝器和加料漏斗。將水(40ml)放入燒瓶內(nèi)。將氰酸鉀(9.735g，0.115摩爾)加入燒瓶內(nèi)的水中，用磁性攪拌器攪拌冷卻的混合物直至所有固體全部溶解。加入L-硒代甲硫氨酸(19.815g，0.1摩爾)。在回流并劇烈攪拌的條件下加熱混合物。使內(nèi)部溫度達(dá)到94。C，然后下降到80-85。C。將反應(yīng)混合物于80-85。C保持2小時。將所獲得的澄清溶液冷卻至室溫。在持續(xù)攪拌的條件下，緩慢地加入鹽酸(11.272g,0.115摩爾)。形成了大塊白色結(jié)晶沉淀，減壓過濾。沉淀物稱重為20g(產(chǎn)率83.65°/。)。溴化鉀沉淀的上面獲得的細(xì)磨晶體的FTER光譜顯示吸收峰位于大約3458.1(s)、3303.8(m)、2929.7(w)、1685.7(vs)、1631.7(vs)、1560.3(vs)、1442.7(w)、1411.8(w)、1282.6(s)、1244.0(w)、1197.7(w)、1180.4(w)、1103.2(w)、931.6(w)、775.3(w)、719.4(w)、576.7(w)和478.3(w)cm"(w，弱；m，中等；s，強；vs，非常強)。這一光譜不同于L-硒代甲硫氨酸的光譜，后者顯示吸收峰位于大約3433.1(w)、2923.9(s)、2731.0(m)、2611.4(m)、2117.7(w)、1608.5(s)、1581.5(vs)、1512.1(s)、1411.8(s)、1338.5(m)、1269.1(w)、1218.9(w)、1153.4(w)和540.0(w)cm'1。利用UV/Vis檢測器于210nm通過HPLC分析含有l(wèi)mg/mlN-氨甲酰L-硒代甲硫氨酸的水溶液，并通過RheodyneLoop注射器向柱頭上注射20^1樣品。使用250X4.6mmDiscoveryCyano柱(Supelco)，以lml/min的0.1%乙酸作為流動相。N-氨甲酰L-硒代甲硫氨酸具有占超過99.54%的檢測器響應(yīng)的單峰，滯留時間為5.15分。L-硒代甲硫氨酸在這一系統(tǒng)中的滯留時間為4.167分。這一系統(tǒng)可用于測定預(yù)混合物中的N-氨甲酰L-硒代甲硫氨酸。實施例4:L-硒代甲硫氨酸乙內(nèi)酰脲(化合物4)的制備。給250ml3頸圓底燒瓶裝配溫度計、回流冷凝器和加料漏斗。將水(40ml)放入到燒瓶內(nèi)。將N氨甲酰L-硒代甲硫氨酸(11.969g，0.05摩爾)加入燒瓶內(nèi)的水中，邊冷卻邊用磁性攪拌器攪拌混合物。緩慢加入鹽酸(14.599g，0.15摩爾)。在回流并劇烈攪拌的條件下加熱混合物2小時。過濾澄清的熱溶液，然后冷卻到室溫。形成大塊白色結(jié)晶沉淀，并在減壓下過濾。沉淀稱重為8.72g(產(chǎn)率78.88%)。溴化鉀沉淀的上面獲得的細(xì)磨晶體的FTER光譜顯示吸收峰位于大約3062,7(w)、2761.9(w)、1774.4(s)、1732,0(vs)、1423.4(m)、1265,2(w)、1203.5(w)、748.3(w)、632.6(w)和455.2(w)cm"(w，弱；m，中等；S，強；VS，非常強)。這一光譜不同于L-硒代甲硫氨酸的光譜，后者顯示吸收峰位于大約3433.1(w)、2923.9(s)、2731.0(m)、2611.4(m)、2117.7(w)、1608.5(s)、1581.5(vs)、1512.1(s)、1411.8(s)、1338.5(m)、1269.1(w)、1218.9(w)、1153.4(w)和540.0(w)cm"。利用UV/Vis檢測器于210nm通過HPLC分析含有l(wèi)mg/mlL-硒代甲硫氨酸乙內(nèi)酰脲的水溶液，并通過RheodyneLoop注射器向柱頭上注射20^1樣品。使用250X4.6mmDiscoveryCyano柱(Supelco)，以lml/min的0.1%乙酸作為流動相。L-硒代甲硫氨酸乙內(nèi)酰脲顯示出占超過99.72%的檢測器響應(yīng)的單峰，滯留時間為5.94分。L-硒代甲硫氨酸在這一系統(tǒng)中的滯留時間為4.167分。這一系統(tǒng)可用于測定預(yù)混合物中的L-硒代甲硫氨酸乙內(nèi)酰脲。實施例5:比較亞硒酸鈉和N-琥珀酰L-硒代甲硫氨酸(化合物2)對泌乳奶牛的組織硒含量以及全血谷胱甘肽過氧化物酶活性的影響制備用于泌乳奶?，F(xiàn)場研究的三種預(yù)混料。其中一種預(yù)混料不含額外的硒來源，因此被用作安慰劑。第二種預(yù)混料含有亞硒酸鈉，以及第三種預(yù)混料含有N-琥珀酰L-硒代甲硫氨酸(化合物2)。通過混合一定量的硒來源和充足量的精制糖制備每種預(yù)混料，使其含有250ppm硒。每種預(yù)混料通過在制劑過程中摻入食用色素溶液進(jìn)行顏色鑒定，并用隨機選擇的字母命名。把預(yù)混料提供給不知情的動物營養(yǎng)學(xué)家，即他們不知道每種預(yù)混料中的硒來源。這樣就可以避免由于對飼養(yǎng)實驗結(jié)果的解讀所帶來的任何可能的偏差。每天給30只泌乳奶牛伺喂其中一種預(yù)混料。測定這些硒來源對組織硒含量和全血谷胱甘肽過氧化物酶活性的影響。在最初的8周消除期內(nèi)，給所有奶牛都詞喂未添加硒的全混合日糧。每日定量供應(yīng)一定量的預(yù)混料，以提供7.5mg硒。持續(xù)處理8周，然后經(jīng)過4周的消除期。在首個消除期(0周)前1周開始每周1天收集乳樣，持續(xù)試驗的整個20周。在給樣品脫脂后，測定所獲得的乳清中的硒含量。表1給出了0、8、12、16和20周時乳清中的硒濃度。在首個消除期(0周)前1周開始每周1天(4周的間隔期，持續(xù)整個試驗)收集血液樣品(表1中的8、12、16和20周)。將血液樣品抽到無微量元素的含抗凝劑的真空試管內(nèi)。分析全血等分試樣的硒含量以及谷胱甘肽過氧化物酶活性。離心剩余的血液等分試樣收獲血漿，并測定血漿樣品中的硒含量。在首個消除期(0周)前1周開始每周l天(4周的間隔期，持續(xù)整個試驗)通過活體解剖取得肝臟樣品(表1中的8、12、16和20周)。分析肝臟樣品中的硒含量。表1給出了試驗的結(jié)果。表1中的結(jié)果顯示在限制硒攝入8周(Wk8)后，乳清、血漿和肝臟中的硒濃度都要明顯低于消除期開始前(WkO)的硒濃度。給奶牛飼喂不含補充硒的混合日糧(安慰劑)造成硒濃度的輕微增高，但是沒有完全恢復(fù)到Wk0時的基礎(chǔ)水平。但是，飼喂補充了亞硒酸鈉或N-琥珀酰L-硒代甲硫氨酸(化合物2)的日糧造成這些組織中的硒濃度的進(jìn)行性和顯著提高(Wk12和Wk16)。在第2個消除期結(jié)束時(Wk20)，所有組織中的硒濃度都顯著降低。響應(yīng)日糧硒攝入的變化而發(fā)生的硒濃度的顯著變化說明這些組織是泌乳奶牛的日糧硒狀態(tài)的敏感指示物。值得注意的是，化合物2比亞硒酸鈉引起這3種組織中硒濃度在統(tǒng)計學(xué)意義上顯著更高的增加，說明N-琥珀酰L-硒代甲硫氨酸是比亞硒酸鈉具有更高生物利用率的日糧硒的來源。響應(yīng)日糧硒攝入的變化而發(fā)生的全血中硒濃度和谷胱甘肽過氧化物酶活性(GPX)的變化相對于乳清、血漿和肝臟中的改變更不靈敏。這說明這些參數(shù)不是泌乳奶牛的硒狀態(tài)的有用指示物。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>化合物lL-硒代甲硫氨酸異丙酯鹽酸化物化合物20(S)-4-(1-羧基-3-(甲基硒基)丙胺基)-4-丁酮酸N-琥珀酰-L-硒代甲硫氨酸化合物3亂一O<formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula>N-氨甲酰L-硒代甲硫氨酸化合物4<formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula>(S)-5-(2-(甲基硒基)乙基)四氫咪唑-2，4-二酮L-硒代甲硫氨酸乙內(nèi)酰脲本文所用術(shù)語"生物學(xué)活性衍生物"意指自基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)(例如L-硒代甲硫氨酸)制備的、保留了給動物提供富硒飲食的可生物利用的特性的有機共價結(jié)合化合物。從上面的描述和實施例1-5中可以看到，本發(fā)明實現(xiàn)了本發(fā)明人的主要目的。應(yīng)當(dāng)注意到，這些實施例都是用于舉例說明的，并不作為對本發(fā)明范圍的限制。權(quán)利要求書給出了本發(fā)明的范圍。權(quán)利要求1.硒代-α氨基酸的可生物利用的不可逆共價結(jié)合型衍生物。2.權(quán)利要求l的衍生物，其中硒代氨基酸是硒代甲硫氨酸。3.權(quán)利要求l的衍生物，其中硒代氨基酸是L-硒代甲硫氨酸。4.權(quán)利要求1或3的衍生物，其中所述衍生物是N-琥珀酰L-硒代甲硫氨酸。5.下式所示的L-硒代甲硫氨酸的酯<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>其中R是脂肪族垸基。6.權(quán)利要求5的酯，其中R是d到C3。7.權(quán)利要求5的酯，其中R是異丙基。8.權(quán)利要求5的酯，其是鹽酸化物形式。9.N-琥珀酰-L-硒代甲硫氨酸及其生物學(xué)活性衍生物。10.N-琥珀酰-L-硒代甲硫氨酸和/或其生物學(xué)活性衍生物的金屬鹽形式，所述金屬選自由鉀、鈉、鈣和鎂組成的組。11.N-氨甲酰L-硒代甲硫氨酸及其生物學(xué)活性衍生物。12.L-硒代甲硫氨酸乙內(nèi)酰脲及其生物學(xué)活性衍生物。13.給動物補充硒的方法，包括向動物飼料中添加硒代a氨基酸和/或其生物學(xué)活性衍生物的復(fù)合物。14.權(quán)利要求13的方法，其中所述硒代a氨基酸是L-硒代甲硫氨酸，所述生物學(xué)活性衍生物是Q到C3酯。15.權(quán)利要求14的方法，其中所述酯是異丙酯。16.權(quán)利要求13的方法，其中所述生物學(xué)活性衍生物是N-琥珀酰衍生物。17.權(quán)利要求13的方法，其中所述生物學(xué)活性衍生物是N-氨甲酰衍生物。18.權(quán)利要求13的方法，其中所述生物學(xué)活性衍生物是乙內(nèi)酰脲衍生物。19.權(quán)利要求13的方法，其中所述動物選自豬和家禽，所添加的量按0.05-20ppm水平的硒計。20.權(quán)利要求19的方法，其中所添加的量按0.1-0.3ppm水平的硒計。21.權(quán)利要求13的方法，其中所述動物是家養(yǎng)牛，所添加的量按每天每頭牛0.05-10mg硒計。22.權(quán)利要求21的方法，其中所添加的量按每天每頭牛2-7mg硒計。全文摘要本發(fā)明涉及用作動物日糧中生物利用率提高的硒來源的硒代α氨基酸的衍生物，特別是硒代甲硫氨酸的衍生物。文檔編號C07C391/00GK101223134SQ200680025742公開日2008年7月16日申請日期2006年7月6日優(yōu)先權(quán)日2005年7月14日發(fā)明者M(jìn)·D·安德森,M·M·阿卜杜勒-穆奈姆申請人:金寶公司