專利名稱：雷帕霉素的39-去甲氧基衍生物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及新型39-去甲氧基雷帕霉素衍生物(39-desmethoxyrapamycinderivatives)，它們的制備方法，及它們的用途。在另一方面，本發(fā)明提供39-去甲氧基雷帕霉素衍生物用于治療癌癥和/或B-細胞惡性腫瘤(B-cellmalignancies)，誘導或維持免疫抑制(immunosuppression)，治療移植排斥(transplantation rejection)、移植物抗宿主病(graft vs.host disease)、自體免疫性疾病(autoimmune disorders)、炎性疾病(diseases of inflammation)、血管疾病(vascular disease)和纖維化疾病(fibrotic diseases)，以及刺激神經(jīng)再生(neuronal regeneration)或治療真菌感染(fungal infections)。

背景技術：
雷帕霉素(西羅莫司)(

圖1)是由吸濕鏈霉菌NRRL 5491產(chǎn)生的親脂性的大環(huán)內(nèi)酯(Sehgal等，1975；Vézina等，1975；U.S.3,929,992；U.S.3,993，749)，其帶有與哌可酸內(nèi)酯相連的1，2，3-三羰基部分(Paiva等，1991)。對于本發(fā)明的目的來說，不使用Findlay等(1980)或化學文摘(第11累積索引，1982-1986 p60719CS)的編號方式規(guī)定，而通過McAlpine等(1991)的編號方式規(guī)定來描述雷帕霉素。
由于其廣譜生物活性，雷帕霉素具有顯著的治療價值。雷帕霉素表現(xiàn)出中等抗真菌活性，主要是抗念珠菌屬(Candida)的菌種，但還能抗絲狀真菌(Baker等，1978；Sehgal等，1975；Vezina等，1975；U.S.3,929,992；U.S.3,993,749)。雷帕霉素通過靶向多種細胞類型中的信號傳導途徑，例如，通過抑制使細胞周期從G1階段發(fā)展到S-階段的信號傳導途徑來抑制細胞增殖(Kuo等，1992)。在T細胞中，雷帕霉素抑制來自IL-2受體的信號傳導和隨后的導致免疫抑制的T細胞自發(fā)增殖。雷帕霉素的抑制作用并不局限于T細胞，因為雷帕霉素能抑制多種哺乳動物細胞類型的增殖(Brunn等，1996)。因此，雷帕霉素是有效的免疫抑制劑，在預防器官同種異體移植排斥和治療自身免疫疾病方面具有已經(jīng)確定的或推測的治療應用(Kahan等，1991)。40-O-(2-羥基)乙基-雷帕霉素(SDZ RAD，RAD 001，Certican，everolimus)是半合成的雷帕霉素類似物，它表現(xiàn)出免疫抑制藥理學作用且也作為抗癌劑受到研究(Sedrani，R.等，1998；Kirchner等，2000；Boulay等，2004，U.S.5,665,772)。該藥物作為免疫抑制劑于2003年在歐洲獲得批準。雷帕霉素酯衍生物CCI-779(Wyeth-Ayerst)在體外抑制細胞生長，并且在體內(nèi)抑制腫瘤生長(Yu等，2001)。CCI-779作為潛在的抗癌劑目前正處在第III階段臨床試驗。雷帕霉素在治療慢性斑塊性銀屑病方面的價值(Kirby和Griffiths，2001)，在諸如刺激PC12細胞的神經(jīng)突長出方面的潛在用途(Lyons等，1994)，在機械損傷之后通過血管和平滑肌細胞阻斷對細胞因子的增殖響應(Gregory等，1993)，以及它在預防同種異體移植纖維化方面的作用(Waller and Nicholson，2001)是強化研究的領域(Kahan and Camardo，2001)。最近的報導揭示雷帕霉素與進行長期免疫抑制治療的器官同種異體移植患者與進行其他免疫抑制方案的患者相比較低的癌癥發(fā)病率相關，并且這種降低的癌癥發(fā)病率歸因于抑制了血管生成(Guba等，2002)。已報導親免素(immunophilin)配體的神經(jīng)營養(yǎng)活性獨立于它們的免疫抑制活性(Steiner等，1997)，并且神經(jīng)生長刺激作用通過成熟類固醇受體復合物的破壞而得到促進，正如在專利申請WO 01/03692中所概括的。已經(jīng)報導了諸如高脂血癥和血小板減少癥以及潛在的致畸效應的副作用(Hentges等，2001；Kahan和Camardo，2001)。
雷帕霉素的聚酮化合物(polyketide)主鏈是通過一共七個丙酸酯和七個乙酸酯單元與莽草酸衍生的環(huán)己烷羧酸起始單元借助包含I型聚酮化合物合酶的非常大的多官能蛋白質(zhì)頭尾縮合(heat-to-tail condensation)而合成(rapPKS，Paiva等，1991)。L-賴氨酸衍生的氨基酸，哌可酸通過酰胺鍵縮合在聚酮化合物主鏈的最后一個乙酸酯上(Paiva等，1993)，然后通過內(nèi)酯化作用形成所述大環(huán)。
三種雷帕霉素PKS基因、NRPS-編碼基因和側(cè)翼晚期基因(flanking lategene)序列的每一種的核苷酸序列以及相應的多肽被Aparicio等，1996，和Schwecke等，1995鑒定，并且由NCBI以保藏號X86780保藏，對該序列的修正最近已經(jīng)在WO 04/007709中公開。
雷帕霉素生物合成基因簇的第一種無酶產(chǎn)物已經(jīng)被命名為前-雷帕霉素(WO 04/007709，Gregory等，2004)。全面加工過的雷帕霉素的生產(chǎn)需要通過由雷帕霉素晚期基因所編碼的酶，RapJ，RapN，RapO，RapM，RapQ和RapI對聚酮化合物/NRPS核心進行額外加工。
迄今為止所表征的雷帕霉素的藥理學作用據(jù)信是通過與被稱為FKBP的細胞液受體的相互作用介導的。真核T-細胞中的主要細胞內(nèi)雷帕霉素受體是FKBP12(DiLeIIa and Craig，1991)，并且所得到的復合物特異性地與靶蛋白相互作用，以抑制細胞的信號轉(zhuǎn)導級聯(lián)反應。
已經(jīng)在酵母中鑒定了雷帕霉素-FKBP12復合物的靶物，稱為TOR(雷帕霉素的靶物)(Alarcon等，1999)，并且將哺乳動物蛋白稱作FRAP(FKBP-雷帕霉素相關蛋白)或mTOR(雷帕霉素的哺乳動物靶物)(Brown等，1994)。
已經(jīng)描述了mTOR信號傳導和神經(jīng)元中的定位蛋白合成之間的聯(lián)系；它對參與翻譯控制的蛋白磷酸化狀態(tài)的影響；翻譯機構(gòu)(translationmachinery)的成分在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上的豐度；氨基酸透性酶活性的控制，以及參與代謝途徑的多種酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)(Raught等，2001)。雷帕霉素敏感型信號傳導途徑似乎還在胚胎大腦發(fā)育，學習和記憶形成方面發(fā)揮重要作用(Tang等，2002)。在酵母中對TOR蛋白的研究也已發(fā)現(xiàn)了它們在調(diào)節(jié)營養(yǎng)物敏感型信號傳導途徑中的作用(Hardwick等，1999)。類似地，已將mTOR鑒定為蛋白激酶B(akt)作用的直接靶物，并且在胰島素信號傳導中起著關鍵作用(Shepherd等，1998；Navé等，1999)。也已將哺乳動物TOR與肌動蛋白細胞骨骼的極化和翻譯起始的調(diào)控相關(Alarcon等，1999)。磷脂酰肌醇3-激酶，如mTOR，在腫瘤病理學的若干方面起作用，如細胞-周期進展，粘附，細胞存活和血管生成(Roymans和Siegers，2001)。
雷帕霉素和雷帕霉素類似物的藥物動力學研究已經(jīng)證實需要開發(fā)新型雷帕霉素化合物，該化合物在溶液中更穩(wěn)定，具有更高的對于代謝攻擊(metabolic attack)的抗性和/或具有改進的細胞膜穿透性和減少的流出，并因此具有改善的口腔生物利用度。
已經(jīng)報道利用分子上可化學利用的位點來合成一些雷帕霉素類似物。以下化合物的說明與圖1所述雷帕霉素分子的編號系統(tǒng)相適應。分子上用于衍生或取代的可化學利用的位點包括C40和C28羥基(如U.S.5,665,772；U.S.5,362,718)、C39和C16甲氧基(如WO 96/41807；U.S.5,728,710)、C32、C26和C9酮基(如U.S.5,378,836；U.S.5,138,051；U.S.5,665,772)。在C17、C19和/或C21上氫化，靶向于三烯，可保持抗真菌活性但相應損失了免疫抑制能力(如U.S.5,391,730；U.S.5,023,262)。通過衍生化，已經(jīng)顯著改善了分子的穩(wěn)定性(如在C32、C40和/或C28上形成肟，U.S.5,563,145,U.S.5,446,048)、對代謝攻擊的耐受性(如U.S.5,912,253)、生物利用度(如U.S.5,221,670；U.S.5,955,457；WO 98/04279)并產(chǎn)生前藥(如U.S.6,015,815；U.S.5,432,183)。
然而，仍需要大量具有改進的代謝穩(wěn)定性、增加的細胞膜穿透性和減少的流出率的雷帕霉素衍生物。這些雷帕霉素衍生物在大量病癥的治療中具有很大的效用。本發(fā)明提供了大量具有改進的代謝穩(wěn)定性、增加的細胞膜穿透性和減少的流出率的39-去甲氧基雷帕霉素衍生物，和/或?qū)着撩顾氐牟煌毎种茍D譜(profile)。這些化合物在醫(yī)藥中是有用的，特別用于治療癌癥和/或B-細胞惡性腫瘤，誘導或維持免疫抑制，治療移植排斥、移植物抗宿主病、自體免疫性疾病、炎性疾病、血管疾病和纖維化疾病，以及刺激神經(jīng)再生或治療真菌感染。
發(fā)明概述 本發(fā)明提供雷帕霉素的39-去甲氧基衍生物，制備這些化合物的方法，其中間體和這些化合物在醫(yī)藥中的用途。
在其最廣義方面，本發(fā)明提供了雷帕霉素的39-去甲氧基衍生物，該衍生物的特征在于，其40-羥基位點被衍生為羧酸酯、醚、磷酸酯、次膦酸酯(phosphinate)、縮醛或糖基。
如下所述，可以測試本發(fā)明化合物的代謝穩(wěn)定性、細胞膜穿透性、流出和生物利用度。
當39-去甲氧基雷帕霉素被衍生為羧酸酯、醚或縮醛時，衍生基團優(yōu)選含有不多于12個碳原子(特別為7個或更少，尤其為5個或更少的碳原子)。優(yōu)選它含有至少一個官能團(特別是至少兩個官能團)，該官能團選自-CF2PO(OH)2、-PO(OH)2、-COOH、-OH和-NH2，特別是選自-COOH和-OH，更特別為-OH。
當39-去甲氧基雷帕霉素衍生為由糖基衍生的縮醛時，優(yōu)選每個糖基由優(yōu)選含有不多于12個碳原子(特別為7個或更少，尤其為6個或更少的碳原子)的糖或糖苷形成。實例包括單糖和二糖，特別是形成5和6元環(huán)的單糖。優(yōu)選它含有至少一個官能團(特別是至少兩個官能團)，該官能團選自-COOH、-OH和-NH2，特別是選自-NH2和-OH，更特別為-OH。
當39-去甲氧基雷帕霉素被衍生為磷酸酯時，優(yōu)選烷基含有不多于4個碳原子。
當39-去甲氧基雷帕霉素被衍生為次膦酸酯時，優(yōu)選烷基含有不多于4個碳原子，實例為與膦酸形成的酯。
下面給出了衍生基團的具體實例。
在更具體的方面，本發(fā)明提供下式(I)的39-去甲氧基雷帕霉素衍生物，或其藥用鹽
(I) 其中 X表示鍵或CH2； R1表示酮基或(H，H)； R2表示OH或OMe； R3表示H、OH或OMe； R4和R5各自獨立地表示H或OH； R6表示-R7、-C(O)R7、-(CH2)2-O-[CR21R22-O]a-C(O)-R23；-CR21R22-O-C(O)-R23；-POR19R20，-PO(OR19)(OR20)或Y-R15； R7表示-(CR8R9)m(CR10R11)pCR12R13R14； R8和R9各自獨立地表示C1-C4烷基、C2-C4烯基或C2-C4炔基，上述任意基團可任選被-PO(OH)2、-CF2PO(OH)2、-OH、-COOH或-NH2取代；或者R8和R9各自獨立地表示H、三氟甲基或F； R10、R11、R12、R13和R14各自獨立地表示C1-C4烷基、C2-C4烯基或C2-C4炔基，上述任意基團可任選被-PO(OH)2、-CF2PO(OH)2、-OH、-COOH或-NH2取代；或者R10、R11、R12、R13和R14可獨立地選自H、-(CR8R9)qNH2、-(CR8R9)qOH、CF3、F、COOH；或者R10和R11或R12和R13或R13和R14可與它們連接的碳結(jié)合在一起形成C3-C6環(huán)烷基或3-6元雜烷基環(huán)，該雜烷基環(huán)含有一個或多個選自N、O和S的雜原子，并任選地被最多5個-(CR8R9)qOH、-(CR8R9)qNH2或COOH基團取代；Y＝鍵、-C(O)-O-；-(CH2)2-O-C(O)-O-； R15表示

或
R16各自獨立為H或OH； R17獨立地選自H、OH和NH2； R18獨立地選自H、-CH3、-CH2OH和-COOH； 但條件是選自R16、R17和R18的最多2個基團表示H或CH3； R19和R20各自獨立地表示H或C1-C4烷基或R19和R20一起表示＝CH2； R21獨立地選自H、CH3； R22獨立地選自H，-CH3、-CH＝CH2、-CH2Cl、-CHCl2、-CCl3、-CH(OH)Me、-CH2OH、-CH2CH3、-CH(Cl)Me； R23獨立地為R7、Y-R15或5或6元芳基或雜芳基環(huán)，任選被1-3個選自OH、F、Cl、Br、NO2和NH2的基團取代； a表示0或1； m、p和q各自獨立地表示0-4的整數(shù)； 但條件是，R7基團不含多于12個的碳原子，并且含有至少一個選自-PO(OH)2、-CF2PO(OH)2、-COOH、OH或NH2的官能團。
上述結(jié)構(gòu)顯示了代表性的互變異構(gòu)體，本發(fā)明包含式(I)化合物所有的互變異構(gòu)體，例如，顯示烯醇化合物時包括酮類化合物，反之亦然。
除非特別指出的特定立體異構(gòu)體(例如，通過在結(jié)構(gòu)式中相關立構(gòu)中心處的粗體鍵或虛線鍵，通過結(jié)構(gòu)式中將雙鍵描述為E或Z構(gòu)型，或者通過使用立體化學指定命名法)，所有立體異構(gòu)體作為純化合物及其混合物都包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。除非另有說明，單個對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體、幾何異構(gòu)體，及它們的組合和混合物都涵蓋于本發(fā)明中。同質(zhì)多晶型和溶劑化物及水合物也包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
在另一方面，本發(fā)明提供了39-去甲氧基雷帕霉素衍生物，例如式(I)的化合物或其藥用鹽，用作藥物。
定義 本文所用的冠詞“一”和“一個“指一個或一個以上(即至少一個)合乎語法的冠詞對象。例如，“類似物”指一個或一個以上類似物。
本文中使用的術語“類似物”表示結(jié)構(gòu)上與其他類似物相似但是在組成上略微不同的化合物(例如，一個原子被另一個原子取代或存在或不存在特定的官能團)。
特別是，術語“39-去甲氧基雷帕霉素類似物”指由WO 2004/007709的方法制備的和/或式(II)顯示的39-去甲氧基雷帕霉素化合物。這些化合物也稱為“母體化合物”，且這些術語在本申請中可互換使用。在本申請中，術語“39-去甲氧基雷帕霉素類似物”包括39-去甲氧基雷帕霉素本身。
本文中使用的術語“衍生物”指通過半合成有機化學由其母體化合物修飾而來的化合物。
特別是，術語“39-去甲氧基雷帕霉素衍生物”指根據(jù)上式(I)所示的化合物、或其藥用鹽，通過39-去甲氧基雷帕霉素類似物的半合成改變而制備。這些化合物也被稱為“本發(fā)明的化合物”或“雷帕霉素的39-去甲氧基衍生物”，且這些術語在本申請中可互換使用。
本文所用的術語“(多種)自體免疫性疾病”包括而不限于全身性紅斑狼瘡(SLE)，類風濕性關節(jié)炎，重癥肌無力和多發(fā)性硬化。
本文所用的術語“ 炎性疾病”包括而不限于牛皮癬，皮炎，濕疹，脂溢性皮炎，炎性腸病(包括但不限于潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩氏病)，肺部炎癥(包括哮喘、慢性梗阻性肺病、肺氣腫、急性呼吸窘迫綜合征和支氣管炎)，類風濕性關節(jié)炎和眼色素層炎。
本文所用的術語“癌癥”指細胞在皮膚或身體器官中惡性生長，例如但不限于在乳腺、前列腺、肺、腎、胰腺、胃或腸中。癌傾向于滲透到鄰近組織并擴散(轉(zhuǎn)移)到遠處器官上，如轉(zhuǎn)移到骨、肝、肺或腦中。本文所用的術語癌包括轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞類型(例如但不限于黑素瘤、淋巴瘤、白血病、纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤、和肥大細胞瘤)和組織癌類型(例如但不限于結(jié)腸直腸癌、前列腺癌、小細胞肺癌和非小細胞肺癌、乳腺癌、胰腺癌、膀胱癌、腎癌、胃癌、成神經(jīng)細胞瘤、原發(fā)性肝癌和卵巢癌。
本文所用的術語“B-細胞惡性腫瘤”包括疾病組，其包括慢性淋巴細胞白血病(CLL)、多發(fā)性骨髓瘤、和非何杰金氏淋巴瘤(NHL)。它們是血液和造血器官的瘤性疾病。它們造成骨髓和免疫系統(tǒng)障礙，其使宿主高度易受感染和出血影響。
本文所用的術語“血管疾病”包括而不限于超增殖性血管疾病(如再狹窄和血管閉塞)，移植物血管動脈硬化癥、心血管疾病、腦血管疾病和外周血管疾病(如冠狀動脈疾病、動脈硬化、動脈粥樣硬化、非動脈粥樣化的動脈硬化或血管壁損傷)。
本文所用的術語“神經(jīng)再生”指刺激神經(jīng)細胞生長，并包括神經(jīng)突長出和神經(jīng)細胞功能恢復。神經(jīng)再生對其是有顯著治療益處的疾病和病癥包括但不限于，阿耳茨海默氏病、帕金森氏癥疾病、亨廷頓氏舞蹈病、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥、三叉神經(jīng)痛、舌咽神經(jīng)痛、顏面神經(jīng)麻痹、肌肉萎縮癥、中風、進行性肌萎縮、進行性延髓遺傳性肌萎縮、頸部脊椎強硬癥、Gullain-Barre綜合癥、癡呆、外周神經(jīng)病和外周神經(jīng)損傷，其可以是物理損傷(如脊髓損傷或外傷、坐骨或臉神經(jīng)損傷或傷害)或疾病狀況(如糖尿病)造成的。
本文所用的術語“纖維化疾病”指與過量產(chǎn)生細胞外基質(zhì)相關的疾病，其包括(而不限于)肉樣瘤病、瘢痕瘤、腎小球性腎炎、末期腎病、肝纖維化(包括但不限于硬化、酒精肝病和脂肪肝炎)、慢性腎移植病(chronic graftnephropathy)、外科手術粘連、血管病癥、心纖維化、肺纖維化(包括但不限于先天肺纖維化和原因不明性纖維性肺泡炎)、黃斑變性、視網(wǎng)膜和虹膜視網(wǎng)膜病和化療或放射誘發(fā)的纖維化。
本文所用的術語“移植物抗宿主病”指異源干細胞/骨髓移植后觀察到的并發(fā)癥。它發(fā)生在供體的對抗感染的細胞將患者身體識別為不同或外來物的時候。然后這些對抗感染的細胞攻擊患者身體組織，就好像它們在攻擊感染。移植物抗宿主病被分成急性的和慢性的，在移植后前100天內(nèi)發(fā)生的是急性的，而移植后超過100天發(fā)生的是慢性的。組織典型地包括肝、胃腸道和皮膚。慢性移植物抗宿主病發(fā)生在干細胞/骨髓移植后約百分之10-40的患者中。
本文所用的術語“ 生物利用度”指給藥后藥物或其他物質(zhì)被吸收或變得在生物活性位點上可利用的程度或比率。該性質(zhì)依賴于許多因素，包括化合物的可溶性、腸中的吸收率、蛋白質(zhì)結(jié)合和代謝的程度等。各種生物利用度測試對本領域技術人員來說是熟悉的，其在本文中有描述(也可參見Trepanier等，1998，Gallant-Haidner等，2000)。
本申請所用的術語“ 水溶性”指在水介質(zhì)中的溶解度，例如pH7.4的磷酸鹽緩沖鹽水。
本發(fā)明化合物例如式(I)所示化合物的藥用鹽包括由藥用無機或有機酸或堿形成的常規(guī)鹽以及季銨酸式加成鹽。合適的酸式鹽的更具體的例子包括鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、硝酸、高氯酸、富馬酸、醋酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、甲酸、乳酸、馬來酸、酒石酸、檸檬酸、棕櫚酸、丙二酸、羥基馬來酸、苯乙酸、谷氨酸、安息香酸、水楊酸、反丁烯二酸、甲苯磺酸、甲基磺酸、萘-2-磺酸、苯磺酸、羥基萘酸、氫碘酸、蘋果酸、類固醇酸(steroic acid)、丹寧酸等的鹽。其他酸，如草酸，它們不是藥學上可接受的，可用作為中間體用于制備鹽以獲得本發(fā)明的化合物和它們的藥用鹽。合適的堿式鹽的更具體的例子包括鈉、鋰、鉀、鎂、鋁、鈣、鋅、N，N′-二芐基乙二胺、氯普魯卡因、膽堿、二乙醇胺、乙二胺、N-甲基葡萄糖胺和普魯卡因鹽。下文對于本發(fā)明化合物的表述包括式(I)的化合物及其藥用鹽。
烷基、烯基和炔基可以為直鏈或支化的。
C1-C4烷基的實例包括甲基、乙基、正丙基、異丙基和正丁基。
C2-C4烯基的實例包括乙烯基和2-丙烯基。
C2-4炔基的實例包括乙炔基。
C3-C6環(huán)烷基指可任選支化的包括3-6個碳原子的環(huán)烷基環(huán)。實例包括環(huán)丙基、環(huán)丁基、甲基-環(huán)丁基、環(huán)戊基和環(huán)己基。
包含1個或多個選自N、O和S雜原子的3-6元雜烷基環(huán)包括含有1個或2個雜原子，特別是1個雜原子的環(huán)。實例包括呋喃、吡喃、氧雜環(huán)丁烷、環(huán)氧乙烷、哌啶、吡咯烷、氮雜環(huán)丁烷、吖丙啶、硫雜環(huán)丙烷、thiethane、噻吩、噻喃和嗎啉。
3-6元雜烷基環(huán)的示例的任選取代基包括-OH、-CH2OH、NH2、CH2NH2和COOH。通常3-6元雜烷基環(huán)可以是未取代的或被1或2個取代基(例如，1個取代基)取代。
發(fā)明詳述 如上所述，本發(fā)明提供了39-去甲氧基雷帕霉素衍生物，制備這些化合物的方法，其中間體和這些化合物在醫(yī)藥中的用途。
優(yōu)選R7包含7個或更少的碳原子，特別是5個或更少的碳原子。
R7優(yōu)選含有選自-PO(OH)2、-OH、-COOH和-NH2的至少一個官能團，更優(yōu)選-OH、-COOH或-NH2，特別是-COOH和OH，最特別地為OH。優(yōu)選R7包含2個或更多個取代基，例如，2個-OH基團。
合適地X表示CH2； 合適地a表示0。
合適地p表示0或1。
合適地m表示0或1。
合適地q表示0、1或2。
合適地R11表示H。合適地R12表示H。
合適地R13表示H或OH。
當p表示1時，合適地R10表示Me、OH或CH2OH。
當p表示1時，合適地R11表示Me、H或CH2OH。
當m和p均表示0時，合適地R12和R13均表示H，R14表示-(CR8R9)q-OH，其中q＝0或1及R8和R9均表示H。
當p表示1且m表示0時，合適地R10和R11均表示H，R12表示H，R13表示H、OH或NH2，R14表示-(CR8R9)q-OH，其中q＝0或1及R8和R9均表示H。
當R6表示-POR15R16時，合適地R15和R16均表示CH3或均表示CH2CH3。
合適地R6表示通過與羥基乙酸、3-羥基-2，2-二甲基丙酸、2，3-二羥基丙酸、3-羥基-2-羥甲基丙酸或2，2-雙(羥甲基)丙酸形成酯而衍生的基團。
在一示例化合物組中，R6表示C(O)R7 優(yōu)選R7為通過大環(huán)類醇與酸縮合而形成的基團，所述酸選自羥基乙酸、3-羥基-2，2，二甲基丙酸、2，3-二羥基丙酸、3-羥基-2-羥甲基丙酸和2，2-雙(羥甲基)丙酸，特別是2，2-雙(羥甲基)丙酸。
當R15表示為
該基團的實例包括通過與(i)葡萄糖(即R18表示CH2OH且R16和R17各自表示OH)，例如D-葡萄糖形成縮醛而形成的基團；通過與(ii)葡糖胺(即R18表示CH2OH，R16各自表示OH且R17表示NH2)，例如D-葡糖胺形成縮醛而形成的基團；通過與(iii)葡糖醛酸(即R18表示COOH且R16和R17各自表示OH)，例如D-葡糖醛酸形成縮醛而形成的基團；及通過與(iv)阿拉伯糖(即R18表示H且R16和R17各自表示OH)，例如D-阿拉伯糖形成縮醛而形成的基團。
當R15表示為
該基團的實例包括通過與果糖(即R16各自表示OH)，例如D-果糖基團形成縮醛而形成的基團。
當R15表示為
該基團的實例包括通過與葡糖醛酸(即R16各自表示OH)，例如D-葡糖醛酸基團形成縮醛而形成的基團。
通常，本發(fā)明的化合物通過式(II)的39-去甲氧基雷帕霉素類似物的半合成衍生來制備。
由此，制備式(I)化合物或其藥用鹽的方法包括 (a)將式(II)的39-去甲氧基雷帕霉素類似物或其被保護的衍生物和式(III)的化合物或R6的活化衍生物進行反應
其中RA表示H或(CH2)2-OH HO-R6(III)； (b)將式(I)化合物或其鹽轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N式(I)化合物或其另一藥用鹽；或者 (c)將被保護的式(I)化合物脫去保護。
上述使用的術語“活化衍生物”指(例如，但非局限于)對于酯，為羧酸、酰鹵、混合酸酐、對稱酸酐或羧酸酯；對于醚，為烷基鹵、烷基甲磺酸酯(alkyl mesylate)、烷基三氟甲磺酸酯(alkyl triflate)、烷基甲苯磺酸酯或其他合適活化的烷基衍生物；對于磷酸酯和次膦酸酯，為氯代磷酸酯、氰基磷酸二烷基酯、二烷基氨基磷酸二烷基酯或氯代亞磷酸酯；對于衍生自糖基的縮醛，使用糖基給體，例如糖基鹵化物、硫代糖苷、1-O-?；擒铡⒃?、1-O或1-S碳酸酯、三氯亞氨酸酯(trichloroimidate)、4-戊烯基糖苷、糖基磷酸酯、1-O-磺?；?-O-硅烷化糖苷。
在方法(a)中，可以如WO 2004/007709所述及如本文實施例中進一步所示，制備式(II)的39-去甲氧基雷帕霉素類似物。
除了本文中提供的特定方法和參考，本領域技術人員還可以參考合成方法的標準教科書，包括但不限于，Vogel的實用有機化學課本(Furniss et al.，1989)和March的高等有機化學(Smith和March，2001)。
另外存在的羥基基團可以通過本領域技術人員可利用的許多標準羥基保護措施之一進行保護。羥基基團可以通過形成醚而得到保護，所述醚包括但不限于取代的烷基醚、取代的芐基醚和甲硅烷基醚。優(yōu)選甲硅烷基醚，其包括但不限于三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基和叔丁基二苯基甲硅烷基醚，醚是通過活化形式的硅烷(包括但不限于甲硅烷基氯或甲硅烷基三氟甲磺酸酯)和39-去甲氧基雷帕霉素在合適的堿存在下反應而形成的。然后，通過酸性水解或氟化物輔助裂解除去該保護基團。1，2-二醇可以被保護為丙酮化物，基于丙酮衍生物的縮合。這可以通過酸催化除去。
式(II)的39-去甲氧基雷帕霉素類似物可以用作進一步半合成(即方法(a))的模板。在C-40上的側(cè)羥基可以通過例如酰化、烷基化、糖基化或磷酸化經(jīng)由本領域技術人員已知的大量合成轉(zhuǎn)化法而進行官能化。
在方法(a)中，當R6表示為式-C(O)R7或Y-R15的基團，其中R15表示

且Y＝鍵時，通過式(II)化合物的羥基和相應的優(yōu)選為活化形式的羧酸或式(IIIB)的化合物反應可以介導羥基酯的形成或O-?；?，該羧酸為例如式(IIIAi)或(IIIAii)的化合物
其中W為將羧酸活化為親核攻擊性(nucleophilic attack)的基團。羧酸可以通過形成例如但不限于酰鹵(例如，W＝Cl)、混合酸酐(即W＝OC(O)R’)、對稱酸酐(W＝OC(O)R7)或羧酸酯(即W＝OR’)而進行活化。
式(IIIAi)、(IIIAii)或(IIIB)的化合物可以由它們的商購羧酸使用本領域技術人員已知的標準方法制備，在特定方面，(IIIAi)化合物(其中R7為-(CR8R9)m(CR10R11)pCR12R13R14))可以通過US 5,362,718、US 5,665,772或EP 0663916中描述的方法制備。
優(yōu)選39-去甲氧基雷帕霉素類似物在堿存在下于有機介質(zhì)中與酰氯或混合酸酐反應?？墒褂玫膲A包括但不限于，吡啶、4，4-二甲基氨基吡啶(DMAP)、2，6-lutidene、2，6-二叔丁基吡啶、三乙基胺、二異丙基乙基胺、其他三烷基胺、1，8-二氮雜雙環(huán)[5.4.0]十一-7-烯(DBU)或1，5-二氮雜雙環(huán)[4.3.0]壬-5-烯(DBN)。在本文所述的具體實例中，39-去甲氧基雷帕霉素與混合酸酐在DMAP存在下進行反應。
在方法(a)中，當R6表示式-C(O)R7或Y-R15的基團，其中R15表示

且Y＝-C(O)O-或-(CH2)2-OC(O)O-時，這些羥基酯的形成，需要式(II)化合物或40-O-(羥乙基)-式II化合物的羥基與將形成活化碳酸酯的試劑反應，例如式IV的化合物
其中T＝鍵或-O(CH2)2-，R24為烷基或芳基，優(yōu)選為芳基，特別是對-硝基苯基。
然后，將式IV化合物與式III化合物反應，得到R6連接在40-羥基基團上的化合物，或者R6經(jīng)由碳酸酯鍵連接在40-O-(羥乙基)基團上的化合物(WO 2004/101583)。
同樣，通過使39-去甲氧基雷帕霉素類似物與選擇的適當活化的烷基衍生物反應，可以用不同的羥基醚在C-40處衍生39-去甲氧基雷帕霉素類似物，形成40-O-烷基-39-去甲氧基雷帕霉素衍生物。活化烷基指通過包括但不限于形成烷基鹵(RCl，RI，RBr)、烷基甲磺酸酯(ROS(O)2CH3)、烷基三氟甲磺酸酯(ROS(O)2CF3)、烷基甲苯磺酸酯(ROS(O)2PhMe)已經(jīng)活化的烷基。然后，該活化烷基將和39-去甲氧基雷帕霉素類似物在合適的堿存在下于有機介質(zhì)中進行反應。本領域技術人員可以采用標準方法優(yōu)化反應條件以避免在其他反應位置發(fā)生烷基化。
同樣，通過本領域技術人員已知的方法，39-去甲氧基雷帕霉素類似物可以被磷酸化，然后將磷酸酯去保護，可以得到40-O-磷酸-39-去甲氧基雷帕霉素衍生物或40-O-二烷基磷酸-39-去甲氧基雷帕霉素，和這些衍生物的鹽。磷酸酯可以直接形成，或者經(jīng)由O-亞磷酸酯(即(R’O)2POR)間接形成，其中該三價亞磷酸酯被氧化(優(yōu)選通過過酸，例如但不限于mCPBA的作用)為五價磷酸酯。直接磷酸化方法包括但不限于，將39-去甲氧基雷帕霉素類似物與被保護的氯代磷酸酯(例如，(BnO)2P(O)Cl、(烷基O)2P(O)Cl)，優(yōu)選在DMAP存在下于有機介質(zhì)中反應，或者，將39-去甲氧基雷帕霉素類似物與三氯氧化磷(POCl3)在堿如三乙基胺存在下反應，接著將得到的O-二氯磷酸酯(即ROP(O)Cl2)酸解，或與氰基磷酸二烷基酯偶合(WO 01/81355)。通過二烷基或二芳基亞磷酸酯(即(RO)2P(O)H)和四氯化碳在堿存在下反應，可以原位產(chǎn)生二烷基或二芳基氯代磷酸酯。形成O-亞磷酸酯(用于氧化為O-磷酸酯)的方法包括但不限于，將39-去甲氧基雷帕霉素類似物與二烷基氨基磷酸二烷基酯(優(yōu)選二異丙基氨基磷酸二烷基酯)在堿(優(yōu)選四唑)存在下偶合，或者使用氯代亞磷酸酯在堿存在下偶合(Evans et al.，1992)。保護基團的選擇是重要的，因為在酸性或堿性條件下，磷酸的乙酯和甲酯是不容易水解。優(yōu)選保護基團包括但不限于芐基酯(經(jīng)由碘化鈉/氯代三甲基硅烷促進的水解而裂解，(WO 01/81355))或2-氰基乙酯(經(jīng)由弱堿催化裂解而裂解)。類似地，通過39-去甲氧基雷帕霉素類似物和合適的活化(如上所述)膦酸二烷基酯或亞磷酸二烷基酯反應，可以生成40-O-二烷基磷酸-39-去甲氧基雷帕霉素衍生物。
在方法(a)中，當R15表式

或

的基團時，糖苷鍵的形成，或O-糖基化可以通過羥基和相應糖基給體的反應來介導(參見Toshima和Tatsuta(1993))，優(yōu)選為活化形式，例如式(IIIC)的化合物或式(IIID)的化合物
使用“糖基給體”，包括但不限于，糖基鹵化物(Z＝F，Cl，Br)、硫代糖苷(Z＝SMe，Set，SPh，SPy，SCN)、1-O-?；擒?Z＝OC(O)R)、原酯(Z＝OC(Me)(R)(式(IIIC/IIID)的O-C2)、1-O或1-S碳酸酯(Z＝OC(S)SMe，Z＝OC(O)咪唑，Z＝OC(S)咪唑，Z＝SC(S)OEt)、三氯亞氨酸酯(Z＝OC(＝NH)CCl3)、4-戊烯基糖苷(Z＝OCH2CH2CH2CH＝CH2)、磷酸酯(例如，Z＝OP(O)(OPh)2)、1-O-磺酰(Z＝甲苯磺?；?或1-O-硅烷化糖苷(Z＝OTMS或OTBS)，39-去甲氧基雷帕霉素類似物可以在有機基質(zhì)中，優(yōu)選在活化劑(例如Lewis酸或重金屬鹽，參見Toshima和Tatsuta，1993))存在下糖基化。所用的具體糖基給體和反應條件將決定形成α或β糖苷。如前述對于酰化而言，在母體化合物中存在的任何羥基基團可以被保護或屏蔽，使得采用1當量糖基給體將導致40-O-酰化。在糖基給體上保留的羥基應被保護為例如O-乙酸酯，O-苯甲酸酯、1，2-丙酮化物，因此需要進一步去保護。此外，可以使用2-去氧基糖基給體例如烯糖(還需要還原步驟)來制備2’-去氧基-39-去甲氧基雷帕霉素糖苷和可以使用2，6-二去氧基糖基給體，例如2，6-酸酐基-2-硫糖制備2’，6’-二去氧基-39-去甲氧基雷帕霉素糖苷。
在方法(b)中，通過本領域技術人員已知的方法進行鹽的形成和交換。通過已知方法可以進行式(I)化合物的相互轉(zhuǎn)化，例如通過本文其他地方所述的氧化/還原可以將羥基和酮基相互轉(zhuǎn)化。通過將相應的其中R6表示OH的式(I)化合物磷酸化可以制備其中R6表示-PO(OH)2的式(I)化合物。本文其他地方提供了合適的條件。
在方法(a)和(c)中，保護基團的實例和它們的除去方法可以在T WGreene“Protective Groups in Organic Synthesis”(J Wiley and Sons，1991)中找到。合適的羥基保護基團包括可以通過水解除去的烷基(例如，甲基)，縮醛(例如，丙酮化物)和?；?例如，乙酰基或苯甲?；?；可以通過催化水解除去的芳烷基(例如，苯甲基)，或可以通過酸性水解或氟離子輔助裂解除去的甲硅烷基醚。
除了方法(a)，還可以通過脂肪酶催化酯交換反應合成其中R6表示R7的式(I)的39-去甲氧基雷帕霉素類似物。例如，但不限于，在脂肪酶PS-C“Amano”II存在下，在Gu等(2005)所述和如本文實施例進一步所示的反應條件下，可以將式(II)的39-去甲氧基雷帕霉素類似物與式(V)的乙烯基酯反應。此方法不局限于使用乙烯基酯，且所述酯交換反應可以通過其他脂肪酶或酯酶催化。

通過本來已知的方法或通過與上述方法類似的方法可以制備本發(fā)明的其他化合物。
所述新型雷帕霉素類似物是直接可用的，并且作為模板用于其他半合成或生物轉(zhuǎn)化，以產(chǎn)生化合物，該化合物可用作免疫抑制劑，抗真菌劑，抗癌劑，抗炎劑，神經(jīng)再生劑(neuroregenerative agents)，或用于治療移植排斥，移植物抗宿主病，自身免疫疾病，血管疾病和/或纖維變性疾病的試劑。用于雷帕霉素及其類似物的半合成衍生化的方法為本領域所熟知，并且包括(但不局限于)在以下文獻中描述的改進，例如，U.S.5,665,772；U.S.5,362,718，WO 96/41807；U.S.5,728,710，U.S.5,378,836；U.S.5,138,051；U.S.5,665,772，U.S.5,391,730；U.S.5,023,262，U.S.5,563,145，U.S.5,446,048，U.S.5,912,253，U.S.5,221,670；U.S.5,955,457；WO 98/04279，U.S.6,015,815和U.S.5,432,183)。
中間體(例如式(II)的化合物)的上述結(jié)構(gòu)可以進行互變異構(gòu)，且其中顯示代表性的互變異構(gòu)體，應理解，意圖涉及所有的互變異構(gòu)體，例如，顯示烯醇化合物時也指酮類化合物，反之亦然。
另一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的39-去甲基雷帕霉素衍生物在醫(yī)藥中的用途。另一方面，本發(fā)明提供了將本發(fā)明的39-去甲基雷帕霉素衍生物在制備用于如下方面的藥品誘導或維持免疫抑制作用，刺激神經(jīng)元再生或治療癌癥、B-細胞惡性腫瘤、真菌感染、移植排斥、移植物抗宿主病、自身免疫疾病、炎性疾病、血管疾病和纖維變性疾病或用于調(diào)控傷口愈合的藥物中的用途。
多藥物耐受性(MDR)是治療癌癥和B-細胞惡性腫瘤中的重要難題。它是許多癌癥中發(fā)展出藥物耐受性背后的根本原因(Persidis A，1999)。MDR與三磷酸腺苷結(jié)合的表達盒傳送蛋白(cassette transporters)(ABC傳送蛋白)的增加水平相關，特別是在編碼P-糖蛋白(P-gp)的MDR1基因或編碼MRP1的MRP1基因的表達中的增加相關。MDR1基因表達水平隨著不同癌衍生出的細胞系而廣泛變化著，它在一些細胞系中檢測不到，而在另一些中可以顯示出比標準對照增加表達多至10或100倍。
因此，本發(fā)明的另一方面提供了本發(fā)明的39-去甲氧基雷帕霉素衍生物在治療MDR癌癥或B-細胞惡性腫瘤中的用途。在特定的方面，本發(fā)明提供了39-去甲氧基雷帕霉素衍生物在治療表達P-gp的癌癥或B-細胞惡性腫瘤中的用途。在更優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了本發(fā)明的39-去甲氧基雷帕霉素衍生物在治療高表達P-gp的癌癥或B-細胞惡性腫瘤中的用途。特別地，高表達P-gp的癌癥或B-細胞惡性腫瘤可以相對對照水平增加表達2倍、5倍、10倍、20倍、25倍、50倍或100倍。合適的對照是不表達P-gp的細胞，其具有低表達水平的P-gp或其具有低MDR功能，本領域技術人員知道或能鑒定出這種細胞系；例如(但不限于)，合適的細胞系包括MDA435/LCC6，SBC-3/CDDP，MCF7，NCI-H23，NCI-H522，A549/ATCC，EKVX，NCI-H226，NCI-H322M，NCI-H460，HOP-18，HOP-92，LXFL 529，DMS 114，DMS 273，HT29，HCC-2998，HCT-116，COLO 205，KM12，KM20L2，MDA-MB-231/ATCC，MDA-MB-435，MDA-N，BT-549，T-47D，OVCAR-3，OVCAR-4，OVCAR-5，OVCAR-8，IGROV1，SK-OV-3，K-562，MOLT-4，HL-60(TB)，RPMI-8226，SR，SN12C，RXF-631，786-0，TK-10，LOX IMVI，MALME-3M，SK-MEL-2，SK-MEL-5，SK-MEL-28，M14，UACC-62，UACC-257，PC-3，DU-145，SNB-19，SNB-75，SNB-78，U251，SF-268，SF-539，XF 498。
在可選的方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的39-去甲氧基雷帕霉素衍生物在制備用于治療MDR癌癥或B-細胞惡性腫瘤的藥物中的用途。在特定的方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的39-去甲氧基雷帕霉素衍生物在制備用于治療表達P-gp的癌癥或B-細胞惡性腫瘤的藥物中的用途。在更優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了39-去甲氧基雷帕霉素衍生物在制備用于治療高表達P-gp的癌癥或B-細胞惡性腫瘤的藥物中的應用。特別地，高表達P-gp的癌癥或B-細胞惡性腫瘤可相對對照水平增加表達2倍、5倍、10倍、20倍、25倍、50倍或100倍。合適的對照如上所述。
在樣品中確定P-gp表達水平的方法在本文中另有描述。
所以，在另一個方面，本發(fā)明提供了用于治療表達P-gp的癌癥或B-細胞惡性腫瘤的方法，其包括給藥治療有效量的本發(fā)明的39-去甲氧基雷帕霉素衍生物。P-糖蛋白(P-gp)在特定癌癥類型中的表達水平可由本領域技術人員利用技術來確定，所述技術包括但不限于實時RT-PCR(Szakács等，2004；Stein等，2002；Langmann等，2003；Alvarez等，1995，Boyd等，1995)、通過免疫組織化學(Stein等，2002)或利用微陣列(Lee等，2003)，這些方法僅供示例，其他合適的方法也將會為本領域技術人員所想到。
本領域技術人員能夠通過常規(guī)試驗確定這些化合物抑制真菌生長的能力(例如，Baker，H.，等，1978；NCCLS Reference method for broth dilutionantifungal susceptibility testing for yeastsApproved standard M27-A，17(9)，1997)。另外，本領域技術人員能夠通過常規(guī)試驗確定這些化合物抑制腫瘤細胞生長的能力(參見Dudkin，L.，等，2001；Yu等2001)。另一方面，本發(fā)明的化合物可用于誘導免疫抑制，用于確定化合物在這些方面的效力的試驗是本領域技術人員所公知的，例如，但不局限于免疫抑制劑活性-Warner，L.M.，等，1992，Kahan等(1991)&Kahan&Camardo，2001)；同種異體移植-Fishbein，T.M.，等，2002，Kirchner等2000；自身免疫/炎癥/哮喘-Carlson，R.P.等，1993，Powell，N.等，2001；I型糖尿病-Rabinovitch，A.等，2002；牛皮癬-Reitamo，S.等，2001；類風濕性關節(jié)炎-Foey，A.，等，2002；纖維化-Zhu，J.等，1999，Jain，S.，等，2001，Gregory等1993。
可在用于此目的的標準試驗中驗證本發(fā)明的39-去甲氧基雷帕霉素衍生物誘導免疫抑制的能力。另一方面，本發(fā)明的39-去甲氧基雷帕霉素衍生物可用于和抗纖維變性，神經(jīng)再生和抗血管生成機制有關者，本領域技術人員可以通過常規(guī)試驗確定這些化合物抑制血管發(fā)生(angiogenesis)的能力(例如，Guba，M.，等，2002)。本領域技術人員能夠通過常規(guī)試驗確定這些化合物治療血管過度增殖性疾病例如，用于藥物釋放支架(drug-elutingstent)(例如，Morice，M.C，等，2002)的應用。另外，本領域技術人員可以通過常規(guī)試驗確定這些化合物的神經(jīng)再生能力(例如，Myckatyn，T.M.，等，2002，Steiner等1997)。
本發(fā)明還提供了藥物組合物，其包括本發(fā)明的39-去甲基雷帕霉素衍生物，連同可以藥用的載體。
雷帕霉素和在或正在臨床試驗中的相關化合物，如CCI-779和RAD001，具有差的藥理學分布，差的水溶性和差的生物利用度。本發(fā)明提供了具有改善的性質(zhì)如改進的穩(wěn)定性和/或改進的細胞膜穿透性的39-去甲氧基雷帕霉素衍生物。本領域技術人員使用標準方法能夠容易地確定本發(fā)明給定化合物的溶解度。在本文的實施例中示出了代表性的方法。
此外，利用本領域技術人員已知的體內(nèi)和體外方法，本領域技術人員將能確定本發(fā)明化合物的藥物動力學和生物利用度，所述方法包括但不限于下面所述的和Gallant-Haidner等，2000和Trepanier等，1998和其中的參考文獻中描述的那些。通過許多因素來確定化合物的生物利用度，(如水溶性、腸中的吸收速率、蛋白質(zhì)結(jié)合和代謝的程度)，其中每種都可通過本文實施例所述的體外測試來確定，本領域技術人員將能理解的是，改善這些因素中的一種或多種將能改善化合物的生物利用度?？蛇x地，化合物的生物利用度可利用以下更詳細描述的的體內(nèi)方法來測量。
Caco-2滲入試驗 可以使用在24孔Coming Costar Transwell板上的融合的Caco-2細胞(Li，A.P.，1992；Grass，G.M.，等，1992，Volpe，D.A.，等，2001)，例如由In VtroTechnologies Inc.(IVT Inc.，Baltimore，Maryland，美國)提供。頂上的腔室含有0.15mL pH 7.4的Hank氏平衡緩沖液(HBBS)、1％DMSO、0.1mM熒光黃(Lucifer Yellow)?；康那皇液?.6mL pH 7.4的HBBS、1％DMSO。對照和測試品在加濕孵育箱中于37℃孵育，以130rpm震蕩1h。熒光黃僅能通過薄壁纖維(在緊密接合處之間)途徑滲入，熒光黃的高表觀穿透性(ApparentPermeability，Papp)顯示出試驗期間細胞損傷了，并排除所有這些孔。普萘洛爾(有好的被動滲透性，而無已知的轉(zhuǎn)運蛋白效應)和醋丁酰心安(acebutalol)(有差的被動滲透性，其通過P-糖蛋白主動流出而減輕)被用作參照化合物。通過將化合物(以0.01mM)加入頂上或基部的腔室，在單和雙向板中測試化合物。通過HPLC-MS分析頂上或基部腔室中的化合物。結(jié)果表示成表觀穿透性(Papp)(nm/s)和流出率(A至B對B至A)。
Papp(nm/s)＝體積受體×Δ[受體] 面積×[供體]Δ時間 體積受體0.6ml(A＞B)和0.15ml(B＞A) 單層面積0.33cm2 Δ時間 60分鐘 流出率的正值表示從細胞的頂層表面主動流出。
人肝微粒體(HLM)穩(wěn)定性試驗 用肝勻漿液測量化合物對I階段(氧化)酶的內(nèi)在弱點，該酶包括CYP450(如CYP2C8、CYP2D6、CYP1A、CYP3A4、CYP2E1)、酯酶、酰胺酶和黃素單氧酶(FMO)。
通過LC-MS測量它們隨時間的消失情況，確定測試化合物暴露于人肝微粒體的半衰期(T1/2)。0.001mM化合物與0.25mg/mL人肝微粒體亞細胞級分蛋白于37℃在pH 7.4的0.1M Tris-HCl中孵育40分鐘，并將NADPH的飽和水平作為協(xié)同因子。以定時間隔，向測試樣品中加入乙腈來沉淀蛋白質(zhì)和終止代謝。離心樣品并用HPLC-MS分析母體化合物。
體內(nèi)生物利用度試驗 還可以使用體內(nèi)試驗測量化合物的生物利用度(參見，例如Crowe et al，1999)。通常，所述化合物向測試動物(如小鼠或大鼠)腹膜內(nèi)(i.p.)或靜脈內(nèi)(i.v.)并口服(p.o.)給藥，定期取血樣以檢測藥物的血漿濃度如何隨時間變化。血漿濃度隨時間的時程可用于將化合物的絕對生物利用度計算成利用標準模型的百分比。典型規(guī)程的實例如下所述。
向小鼠i.v.給藥3mg/kg本發(fā)明化合物或母體化合物或者p.o.給藥10mg/kg本發(fā)明化合物或母體化合物。在5分鐘、15分鐘、1h、4h和24h間隔時取血樣，通過HPLC確定樣品中本發(fā)明化合物或母體化合物的濃度。然后可用血漿濃度的時程來得出關鍵的參數(shù)，如血漿濃度-時間曲線下的面積(AUC-其直接與實現(xiàn)全身循環(huán)的未改變的藥物總量成比例)、最大(峰值)血漿藥物濃度、最大血漿藥物濃度產(chǎn)生的時間(峰值時間)、用于精確確定生物利用度的其他因素包括化合物的末半衰期、全身清除率、分布的穩(wěn)態(tài)體積和F％。然后通過非間隔或間隔方法分析這些參數(shù)以給出計算好的生物利用度百分比，這種方法的例子參見Gallant-Haidner等，2000和Trepanier等，1998和其中的參考文獻，以及本文的參考文獻。
前述本發(fā)明的39-去甲氧基雷帕霉素衍生物或其制劑可通過任何常規(guī)方法給藥，例如但不限于非腸道、口服、局部(包括口腔、舌下或透皮)、通過醫(yī)療設備(如移植片固定模)、通過吸入或通過注射(皮下或肌肉)給藥。治療可由一段時間的單劑量或多劑量構(gòu)成。
盡管本發(fā)明的化合物可以單獨給藥，但它優(yōu)選作為藥物制劑連同一種或多種可接受的載體存在。所述載體在與本發(fā)明的化合物兼容的意義上必須是“可接受的”，并且對它的受體是無害的。合適載體的例子在下文進行更詳細地描述。
本發(fā)明的39-去甲氧基雷帕霉素衍生物可以單獨或者與其他治療劑組合施用，兩種(或更多種)試劑的聯(lián)合用藥用于顯著降低待施用的每一種的劑量，從而減少出現(xiàn)的副作用。
在一種實施方案中，將39-去甲基雷帕霉素衍生物與另一種治療劑聯(lián)合用藥，用于誘導或維持免疫抑制，用于治療移植排斥，移植物抗宿主病，自身免疫疾病或炎性疾病，優(yōu)選的試劑包括，但不局限于，免疫調(diào)節(jié)劑，例如，硫唑嘌呤(azathioprine)，皮質(zhì)類固醇(corticosteroid)，環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)，環(huán)孢霉素A(cyclosporin A)，F(xiàn)K506，霉酚酸酯(Mycophenolate Mofetil)，OKT-3和ATG。
在另一種實施方案中，將39-去甲基雷帕霉素衍生物與另一種治療劑聯(lián)合用藥用于治療癌癥或B-細胞惡性腫瘤，優(yōu)選的試劑包括，但不局限于，甲氨喋呤(methotrexate)，亞葉酸(leukovorin)，阿霉素(adriamycin)，prenisone，博來霉素(bleomycin)，環(huán)磷酰胺，5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)，紫杉醇(paclitaxel)，多西紫杉醇(docetaxel)，長春新堿(vincristine)，長春堿(vinblastine)，維諾瑞濱(vinorelbine)，多柔比星(doxorubicin)，他莫昔芬(tamoxifen)，托若米芬(toremifene)，醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)，阿納托唑(anastrozole)，果絲瑞寧(goserelin)，抗-HER2單克隆抗體(例如，赫賽汀(HerceptinTM))，卡培他濱(capecitabine)，鹽酸雷洛昔芬(raloxifenehydrochloride)，EGFR抑制劑(例如，lressa，TarcevaTM，ErbituxTM)，VEGF抑制劑(例如，AvastinTM)，蛋白酶體抑制劑(例如，VelcadeTM)，Glivec或hsp90抑制劑(例如，17-AAG)。另外，39-去甲基雷帕霉素衍生物可以與其他治療組合施用，所述的其它治療包括，但不局限于，放射治療或手術。
在一種實施方案中，39-去甲氧基雷帕霉素衍生物與另一種治療劑聯(lián)合給藥，用于治療血管疾病，優(yōu)選的試劑包括但不限于，ACE抑制劑、血管緊張素II受體拮抗劑、神經(jīng)纖維酸衍生物、HMG-CoA還原酶抑制劑、β腎上腺素阻斷劑、鈣通道阻斷劑、抗氧化劑、抗凝血劑和血小板抑制劑(如PlavixTM)。
在一種實施方案中，39-去甲氧基雷帕霉素衍生物與另一種治療劑聯(lián)合給藥，用于刺激神經(jīng)再生，優(yōu)選的試劑包括但不限于，神經(jīng)營養(yǎng)因子，諸如神經(jīng)生長因子、神經(jīng)膠質(zhì)衍生的生長因子、腦衍生的生長因子、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子和神經(jīng)營養(yǎng)因子-3。
在一種實施方案中，39-去甲氧基雷帕霉素衍生物與另一種治療劑聯(lián)合給藥，用于治療真菌感染；優(yōu)選的試劑包括但不限于，兩性霉素B、氟胞嘧啶、棘白菌素(echinocandins)(如卡泊芬凈、阿尼芬凈或米卡芬凈(micafungin))、灰黃霉素、咪唑或三唑抗真菌劑(如克霉唑、密康唑、酮康唑、益康唑、布康唑、奧昔康唑、特康唑、伊曲康唑、氟康唑或伏立康唑)。
聯(lián)合給藥包括任何向患者遞送兩種或更多治療劑的方法作為同樣治療方案的部分，這對于普通技術人員來說是顯而易見的。兩種或更多試劑可在單一制劑中同時給藥，然而這不是必要的。試劑可用不同制劑并在不同時間給藥。
制劑可方便地表示為單位劑型，并可由任何現(xiàn)有公知制藥技術來制備。這些方法包括組合活性成分(本發(fā)明的化合物)和構(gòu)成一種或多種輔助成分的載體的步驟。通常，制劑通過均一并緊密地組合活性成分和液體載體或細分的固體載體或二者來制備，然后必要時，給產(chǎn)品賦形。
本發(fā)明的39-去甲氧基雷帕霉素衍生物通常以包括活性成分的藥物配制物形式口服或通過任何非腸道途徑給藥，任選是非毒性有機或無機酸、或堿、加成鹽的形式，以藥用劑型。根據(jù)要治療的疾病和患者、以及給藥途徑，組合物可以可變劑量給藥。
例如，本發(fā)明的化合物可以口服、口腔或舌下給藥，給藥形式有片劑、膠囊、丸、酏劑、溶液或混懸液，其中可含調(diào)味劑或著色劑，用于即時、延時或控釋使用。
適于口服給藥的39-去甲氧基雷帕霉素衍生物溶液或混懸液還可包含賦形劑(如N，N-二甲基乙酰胺)、分散劑(如聚山梨酸酯80)、表面活性劑、和助溶劑(如聚乙二醇、Phosal 50PG(其由卵磷脂、大豆脂肪酸、乙醇、單/二甘油酯、丙二醇和抗壞血酸棕櫚酸酯組成))。
這些片劑可包含賦形劑，如微晶纖維素、乳糖(如乳糖一水合物或乳糖酐)、檸檬酸鈉、碳酸鈣、磷酸氫鈣和甘氨酸、崩解劑(如淀粉(優(yōu)選玉米、馬鈴薯或木薯淀粉))、淀粉乙醇酸鹽、交聯(lián)羥甲基纖維素鈉、和某些復合硅酸鹽、和粒狀粘合劑(如聚乙烯吡咯烷酮、羥基丙甲基纖維素(HPMC)、羥基-丙基纖維素(HPC)、聚乙二醇8000、蔗糖、凝膠和阿拉伯樹膠。另外，可包括潤滑劑，如硬脂酸鎂、硬脂酸、甘油山崳酸鹽和滑石。
相似類型的固體組合物也可用作凝膠膠囊中的填充物。在這方面，優(yōu)選的賦形劑包括乳糖、淀粉、纖維素、牛乳糖或高分子量聚乙二醇。對于水混懸液和/或酏劑來說，本發(fā)明的化合物可與多種甜味劑或調(diào)味劑、著色物質(zhì)或染料組合，與乳化和/或懸浮劑并與稀釋劑(如水、乙醇、丙二醇和甘油、及其組合)組合。
片劑可通過壓縮或鑄模壓制而制造出，可任選與一種或多種輔助成分一起制造。壓制的片劑的制備是在合適的機器中壓縮自由流動形式(如粉或顆粒)的活性成分，可任選與粘合劑(如聚維酮、明膠、羥基丙甲基纖維素)、潤滑劑、惰性稀釋劑、防腐劑、崩解劑(如淀粉乙醇酸鈉、交聯(lián)的聚維酮、交聯(lián)的羧甲基纖維素鈉)、表面活性劑或分散劑混合在一起。鑄模壓制的片劑的制造是在合適的機器中鑄模壓制用惰性液體稀釋劑弄濕的粉狀化合物的混合物。任選將片劑涂覆或刻痕并制成制劑，從而緩釋或控釋其中所用的活性成分，例如，以各種比例的羥基丙基甲基纖維素來提供所需的釋放分布。
根據(jù)本發(fā)明所述的適于口服給藥的制劑可以離散單位來提供，如膠囊、扁膠劑或片劑，每種都包含預先確定量的活性成分；如粉末或顆粒；如水溶性液體或非水溶性液體的溶液或混懸液；或如水包油液體乳劑或油包水液體乳劑?；钚猿煞忠部梢酝杷?、藥糖劑或糊劑來提供。
適于口中局部給藥的制劑包括糖錠劑，其包含調(diào)味基質(zhì)中的活性成分，基質(zhì)通常是蔗糖和阿拉伯樹膠或黃芪膠；包括錠劑，其包含惰性基質(zhì)中的活性成分，基質(zhì)如明膠和甘油、或蔗糖和阿拉伯樹膠；并包括漱口水，其包含合適液體載體中的活性成分。
應該能理解除了上述特定成分，本發(fā)明的制劑可包括其他所述制劑類型得出的現(xiàn)有常規(guī)試劑，例如適于口服給藥的那些可包括調(diào)味劑。
適于局部給藥的藥物組合物可配成藥膏、乳劑、混懸液、洗液、粉、溶液、糊劑、凝膠、浸漬敷料劑、噴霧劑、氣霧劑或油、透皮設備、撲粉等。這些組合物可通過包含活性試劑的常規(guī)方法來制備。因此，它們也可包含相容的常規(guī)載體和添加劑，如防腐劑、輔助藥物滲透的溶劑、乳劑或藥膏中的潤膚劑和用于洗液的乙醇或油醇。這些載體可以占組合物約1％至約98％的形式來提供。更常用的是，它們將至多構(gòu)成組合物的約80％，僅作為示例，乳劑或藥膏的制備是混合足量的親水物質(zhì)和水，其包含占化合物約5-10％的量，該量足以產(chǎn)生具有所需粘稠度的乳劑或藥膏。
適于透皮給藥的藥物組合物可以離散的貼片來提供，從而長期保持與接收者表皮的密切接觸。例如，通過電離子滲透療法可將活性試劑從貼片上傳送出來。
為了用于外部組織，如口和皮膚，組合物優(yōu)選制成局部使用的乳劑或藥膏。當要配成藥膏時，活性試劑可與含蠟或易溶于水的藥膏基質(zhì)一起運用。
可選地，活性試劑可與水包油乳劑基質(zhì)或油包水基質(zhì)一起配成乳劑。
對于非腸道給藥，液體單位劑型的制備是利用活性成分和無菌載體，例如但不限于水，醇、多羥基醇、甘油和植物油，優(yōu)選是水。根據(jù)所用的載體和濃度，活性成分可溶解或懸浮在載體中。在制備溶液時，活性成分可溶于注射用水中并過濾除菌，然后裝入合適的小瓶或安瓿中并密封。
有益的是，試劑(如局部麻醉劑、防腐劑和緩沖劑)可溶于載體中。為了增強穩(wěn)定性，組合物可在裝入小瓶并真空脫水后冷凍。然后將凍干粉密封在小瓶內(nèi)，并提供注射用水的另一個相應的小瓶從而在使用前能重新形成液體。
用與溶液基本相同的方式制備非腸道混懸液，不同在于將活性成分懸浮于載體中而不是溶解其中，而且不能通過過濾來完成滅菌?？赏ㄟ^暴露于環(huán)氧乙烷而對活性成分滅菌，然后懸浮于無菌載體中。有益的是，表面活性劑或潤濕劑包括在組合物中以使活性成分更容易分布均勻。
本發(fā)明的化合物也可利用現(xiàn)有已知醫(yī)藥設備來給藥。例如，在一種實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物可用無針皮下注射設備來給藥，如公開于U.S.5,399,163；U.S.5,383,851；U.S.5,312,335；U.S.5,064,413；U.S.4,941,880；U.S.4,790,824；或U.S.4,596,556的設備。用于本發(fā)明的公知的植入和組件實例包括US 4,487,603，其公開了可植入的微輸注泵，用于以可控速率分發(fā)藥物；US 4,486,194，其公開了治療設備，用于通過皮膚來給藥藥物；US 4,447,233，其公開了藥物輸注泵，用于以精確輸注率遞送藥物；US 4,447,224，其公開了可變流量的可植入的輸注裝置，用于持續(xù)遞送藥物；US 4,439,196，其公開了滲透性藥物遞送系統(tǒng)，其具有多腔間隔小室；和US 4,475,196，其公開了滲透性藥物遞送系統(tǒng)。在特定的具體實施方式
中，39-去甲氧基雷帕霉素衍生物可以利用藥物-洗脫拉伸器來給藥，例如WO 01/87263及相關公開文獻所述的那些之一或Perin(Perin，EC，2005)所述的那些。許多其他這類植入、遞送系統(tǒng)和組件對本領域技術人員來說是已知的。
給藥本發(fā)明39-去甲氧基雷帕霉素衍生物的劑量將根據(jù)特定化合物、所涉及的疾病、個體、和疾病性質(zhì)和嚴重度以及個體的身體狀況、和所選擇的給藥途徑而變化。本領域技術人員能容易地確定合適的劑量。
根據(jù)給藥方法，組合物可包含超過0.1重量％、優(yōu)選5-60％、更優(yōu)選的10-30重量％的本發(fā)明化合物。
本領域技術人員將會認識到，通過要治療的病況性質(zhì)和范圍、給藥形式、途徑和位點、和要治療的特定個體的年齡和病況，將會確定出本發(fā)明化合物的個體劑量的最佳量和間隔，而且醫(yī)師會最終確定合適的用量。該劑量可以合適的頻率重復。如果副作用產(chǎn)生了，則可以根據(jù)常規(guī)臨床實踐，改變或減少給藥劑量和/或頻率。
附圖簡述 圖1顯示了雷帕霉素的結(jié)構(gòu) 圖2顯示了39-去甲氧基雷帕霉素的裂解途徑 圖3顯示了39-去甲氧基-40-O-[2，2-雙(羥甲基)丙酰基]雷帕霉素的裂解途徑 圖4顯示了39-去甲氧基-40-O-[2-羥乙基3-羥基-2-(羥甲基)-2-甲基丙酸酯]雷帕霉素的裂解途徑 圖5顯示了27-O-去甲基-39-去甲氧基-40-O-[2，2-雙(羥甲基)丙酰基]雷帕霉素的裂解途徑 圖6顯示了相比于雷帕霉素(實心方塊)，39-去甲氧基-40-O-[2，2-雙(羥甲基)丙?；鵠雷帕霉素(A-實心三角形)和39-去甲氧基-40-O-(2-羥基)乙基雷帕霉素的mTOR抑制活性(B-實心三角形) 實施例 通用方法和材料 材料 除非另外說明，所有試劑都得自商業(yè)渠道，并進行使用而沒有進一步純化。
培養(yǎng)物 吸濕鏈霉菌(S.hygroscopicus)MG2-10[IJMNOQLhis](WO 04/007709；Gregory等，2004)于28℃維持在培養(yǎng)基1瓊脂平板(見下)上。在培養(yǎng)基1上生長出后制備出孢子體，保存于20％w/v甘油含10％w/v乳糖的蒸餾水中并保存于-80℃。將0.1mL冷凍的孢子體接種到250 mL長頸瓶中的50mL培養(yǎng)基2(見下)中，制備出生長性培養(yǎng)物。培養(yǎng)物于28℃孵育36至48小時，300rpm。
生產(chǎn)方法 以2.5-5％v/v將生長性培養(yǎng)物接種入培養(yǎng)基3中。以26℃進行培養(yǎng)6-7天，300rpm。
補充過程 除非另外說明，接種后24-48小時補充/添加所選羧酸并以1-2mM補充。
培養(yǎng)基1 然后培養(yǎng)基于121℃高壓滅菌20分鐘。
培養(yǎng)基2RapV7種子培養(yǎng)基 然后培養(yǎng)基于121℃高壓滅菌20分鐘。
滅菌后每7mL培養(yǎng)基中加入0.16mL 40％葡萄糖。
培養(yǎng)基3MD6培養(yǎng)基(發(fā)酵培養(yǎng)基) 滅菌前將0.4mL Sigmaα-淀粉酶(BAN 250)加到1L培養(yǎng)基中。
培養(yǎng)基于121℃滅菌20分鐘。
滅菌后每7mL中加入0.35mL無菌40％果糖和0.10mL L-賴氨酸(140mg/mL，水中，過濾除菌)。
培養(yǎng)基4RapV7a種子培養(yǎng)基 然后培養(yǎng)基于121℃高壓滅菌20分鐘。
培養(yǎng)基5MD6/5-1培養(yǎng)基(發(fā)酵培養(yǎng)基) 培養(yǎng)基于121℃滅菌30分鐘。
滅菌后每L加入15g果糖。
48h后加入0.5g/L ofL-賴氨酸。
分析方法 方法A 注射體積0.005-0.1mL(根據(jù)靈敏度需要)。HPLC在Agilent″Spherisorb″″快速拆分″濾筒SB C8上進行，所述SB C8為3微米、30mm×2.1mm，其運行的流動相為 流動相A含0.01％蟻酸的純水 流動相B含0.01％蟻酸的乙腈 流速1mL/分鐘。
使用線性梯度，從第0分鐘的5％B到第2.5分鐘的95％B，保持95％B直到第4分鐘回到5％B，再進行下一輪。通過254nm處的UV吸收和/或通過利用Micromasss Quattro-Micro儀器進行質(zhì)譜電噴霧(陽或陰)離子化來檢測。
方法B 注射體積0.02mL。HPLC在3微米BDS C18 Hypersil(ThermoHypersil-Keystone Ltd)柱上進行，其為150×4.6mm，維持在50℃，其運行的流動相為 流動相A乙腈(100mL)，三氟醋酸(1mL)，1 M醋酸銨(10mL)，用去離子水加至1L。
流動相B去離子水(100mL)，三氟醋酸(1mL)，1M醋酸銨(10mL)，用乙腈加至1L。
流速1mL/分鐘。
利用55％B-95％B的線性梯度進行10分鐘，然后在95％B 2分鐘，0.5分鐘至55％B并在55％B再經(jīng)2.5分鐘。通過280nm處的UV吸收來檢測化合物。
方法C HPLC系統(tǒng)包括Agilent HP 1100并在3微米BDS C18 Hypersil(ThermoHypersil-Keystone Ltd)柱上進行，其為150×4.6mm，維持在40℃，其運行的流動相為 流動相A去離子水。
流動相B乙腈。
流速1mL/分鐘。
該系統(tǒng)與Bruker Daltonics Esquire3000電噴霧質(zhì)譜相連。使用陽性陰性轉(zhuǎn)換用以掃描500至1000道爾頓的范圍。
利用55％B-95％B的線性梯度進行10分鐘，然后在95％B 2分鐘，0.5分鐘至55％B并在55％B再經(jīng)2.5分鐘。
合成方法 除非另有說明，所用的合成都是使用市售無水溶劑在無水條件下進行的。在耦連至裝配有電噴霧源的Bruker Daltonics Esquire3000+質(zhì)譜儀的Agilent 1100 HPLC上通過LC-UV-MS監(jiān)測反應。通過PhenomenexHyperclone柱，BDS C18 3u(150×4.6mm)，以1mL/min，水∶乙腈v∶v 30∶70至100％乙腈進行線性梯度洗脫10分鐘，然后以100％乙腈同樣進行5分鐘，達到分離。
以CDCl3記錄NMR光譜，δH和δC化學位移參照溶劑的化學位移(分別為7.26ppm和77.0ppm)。由于39-去甲氧基雷帕霉素及其衍生物以構(gòu)象異構(gòu)體的混合物形式存在，因此所有指認僅對應于主要的構(gòu)象異構(gòu)體。
針對抗癌活性的體外生物試驗 在12種人腫瘤細胞系板上以單層增殖試驗用Oncotest測試工具(實驗腫瘤學研究所，Oncotest GmbH，F(xiàn)reiburg)進行體外評估化合物的抗癌活性。所選的12種細胞系的特征在表1中有簡述。
表1 測試細胞系 如Roth等1999所述，Oncotest細胞系從人腫瘤異種移植體中建立。供體異種移植體的來源如Fiebig等1999所述。其他細胞系得自NCI(H460，SF-268，OVCAR-3，DU145，MDA-MB-231，MDA-MB-468)或購自DSMZ(Braunschweig，德國)(LNCAP)。
所有細胞系，除非另外指明，均于37℃生長在空氣潮濕(95％空氣，5％CO2)的含RPMI 1640培養(yǎng)基、10％胎牛血清、和0.1mg/mL慶大霉素(PAA，Clbe，德國)的‘摻水即可用的’培養(yǎng)基中。
單層試驗-規(guī)程1的簡述 使用改進的亞丙基碘(propidium iodide)試驗評估測試化合物對12種人腫瘤細胞系生長的影響(Dengler等，1995)。
簡而言之，在指數(shù)生長階段的培養(yǎng)物中通過胰蛋白酶化來收獲細胞，計數(shù)并置于96孔平底微滴定板中，其中細胞密度取決于細胞系(5-10.000個活細胞/孔)。24h后回收以使細胞繼續(xù)指數(shù)生長，將0.01mL培養(yǎng)基(每個平板6個對照孔)或含macbecin的培養(yǎng)基加入到孔中。每種濃度重復加入3個孔?；衔镉脙煞N濃度(0.001μM和0.01μM)。持續(xù)暴露4天后，有或沒有測試化合物的細胞培養(yǎng)基用0.2mL亞丙基碘(PI)水溶液(7mg/L)替換。為了測量活細胞的比例，冷凍平板以滲出細胞。熔融平板后，用Cytofluor4000微板讀數(shù)儀測量熒光(530nm激發(fā)，620nm發(fā)射)，得出與活細胞總數(shù)的直接關系。
生長抑制被表示成處理/對照×100(％T/C)。繪制化合物濃度相對于細胞存活的圖，來評估活性化合物的IC50和IC70值。
實施例1.39-去甲氧基雷帕霉素的發(fā)酵和分離 如下所述，通過使吸濕鏈霉菌MG2-10[IJMNOQLhis]培養(yǎng)物生長并加入環(huán)己烷羧酸(CHCA)，來產(chǎn)生39-去甲氧基雷帕霉素。
液體培養(yǎng)物 如材料和方法中所述，培養(yǎng)吸濕鏈霉菌MG2-10[IJMNOQLhis]的生長培養(yǎng)物。生產(chǎn)培養(yǎng)物與生長培養(yǎng)物以0.5mL接種于50mL試管中的7mL培養(yǎng)基3中。于26℃培養(yǎng)7天，300rpm。取1毫升樣品以1∶1與乙腈混合，震蕩30分鐘，13000rpm離心10分鐘，并根據(jù)分析方法B(參見材料和方法)分析并定量。通過利用分析方法C(參見材料和方法)進行質(zhì)譜來確認產(chǎn)物。
根據(jù)以下表征中所討論的分析數(shù)據(jù)，觀察到的雷帕霉素類似物被認為是所希望的39-去甲氧基雷帕霉素。
發(fā)酵 基本如材料和方法中所述，用培養(yǎng)基4培養(yǎng)吸濕鏈霉菌MG2-10[IJMNOQLhis]的初級生長培養(yǎng)物。次級生長培養(yǎng)物被以10％v/v接種入培養(yǎng)基4中，于28℃培養(yǎng)24h，250rpm。生長培養(yǎng)物被以5％v/v接種入20 L發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基5中(參見材料和方法)。于26℃、0.5vvm培養(yǎng)6天。通過改變推進葉片速度來保持≥30％的溶解氧，其中最小葉片速度為1.18ms-1，最大葉片速度為2.75ms-1。孵育后第24和48小時加入環(huán)己胺羧酸，使最終濃度為2mM。
提取和純化 發(fā)酵肉湯(30L)與等體積甲醇一起攪拌2小時，然后離心聚集細胞(10分鐘、3500rpm)。上清液與DiaionHP20樹脂(43g/L)一起攪拌1小時，然后過濾。用丙酮分步洗滌樹脂以洗脫出雷帕霉素類似物，真空除去溶劑。然后用水將該含水濃縮物稀釋至2L，并用乙酸乙酯(3×2L)萃取。真空去除溶劑，得到棕色油狀物(20.5g)。
將萃取物溶于丙酮，在硅膠上干燥，施加于硅膠柱(6×6.5cm直徑)并用丙酮/己烷(20％-40％)逐步梯度洗脫。收集含雷帕霉素類似物的級分，真空除去溶劑。殘余物(2.6g)進一步過Sephadex LH20柱層析(分三次)，用10∶10∶1的氯仿/庚烷/乙醇洗脫。通過反相(C18)制備性HPLC，利用GilsonHPLC，用65％乙腈/水以21mL/分鐘洗脫Phenomenex 21.2×250mm Luna5μm C18 BDS柱，來純化半純化的雷帕霉素類似物(1.7g)。合并最純的級分(通過分析HPLC來鑒定，方法B)，真空除去溶劑，得到39-去甲氧基雷帕霉素(563mg)。
表征 39-去甲氧基雷帕霉素的1H NMR譜與標準(P.Lowden，Ph.D.Dissertation，University of Cambridge，1997)相同。13C-NMR(125MHz)，δC(ppm)215.75，208.27，169.19，166.71，140.13，135.94，133.61，130.10，129.62，126.80，126.33，98.42，84.77，84.37，75.85，70.91，67.10，59.44，55.82，51.21，46.50，44.17，41.39，40.70，40.16，38.74，38.37，35.44，35.26，35.08，33.78，33.64，33.04，32.37，31.22，30.41，27.24，27.02，25.27，21.48，20.58，16.24，15.95，15.78，13.74，13.00，10.12。
LCMS和LCMSn分析培養(yǎng)物的萃取物，顯示新型雷帕霉素類似物的m/z率低于雷帕霉素30個原子質(zhì)量單位，符合其缺少了甲氧基。觀察到的離子[M-H]- 882.3，[M+NH4]+ 901.4，[M+Na]+ 906.2，[M+K]+922.2。鈉加合物的裂解片段得到預測出的39-去甲氧基雷帕霉素的離子，符合以前鑒定出的裂解途徑(圖2)(J.A.Reather，Ph.D.Dissertation，University ofCambridge，2000)。該質(zhì)譜裂解數(shù)據(jù)收窄了該新型雷帕霉素類似物的區(qū)域，其中丟失甲氧基是發(fā)生在含環(huán)己基部分的片段C28-C42上。
這些質(zhì)譜裂解數(shù)據(jù)完全符合39-去甲氧基雷帕霉素的結(jié)構(gòu)。
實施例239-去甲氧基-40-O-[2，2-雙(羥甲基)丙?；鵠雷帕霉素 根據(jù)以下步驟由39-去甲氧基雷帕霉素合成39-去甲氧基-40-O-[2，2-雙(羥甲基)丙酰基]雷帕霉素。
2.139-去甲氧基-28-O-三甲基甲硅烷基雷帕霉素的合成 在0℃將39-去甲氧基雷帕霉素(170mg，0.17mmol)和咪唑(51mg，0.75mmol)溶于5mL乙酸乙酯中。在10分鐘內(nèi)向該冷溶液中滴加氯代三甲基硅烷(77mg，0.09mL，0.71mmol)。繼續(xù)攪拌60分鐘，完成28，39-二-O-三甲基甲硅烷基醚的形成。該階段之后在0℃添加0.4mL 0.5N硫酸水溶液，并將混合物攪拌2.5h。添加20mL乙酸乙酯，用鹽水、飽和碳酸氫鈉溶液和水洗滌有機層。在硫酸鈉上干燥并減壓濃縮，得到28-O-三甲基甲硅烷基醚，為無色固體，其用于后續(xù)反應而未進一步純化。
1H-NMR(400 MHz，CDCl3)，δ(ppm)4.07(d，1H，J＝6.5Hz，C(28)-H)，0.00(s，9H，28-O-TMS) MS(ESI)m/z 978[M+Na]+ 2.2. 2，4，6-三氯苯甲酸2’，2’，5’-三甲基-1’，3’-二噁烷-5’羧酸酐的合成 將2，2-二甲氧基丙烷(13.5g，130mmol)和對甲苯磺酸一水合物(100mg，0.53mmol，0.4mol％)添加至2，2-雙(羥甲基)丙酸(13.5g，100mmol)的丙酮(100mL)溶液中。將反應混合物在室溫攪拌2h。該階段之后，添加潮濕的碳酸氫鈉并將混合物再攪拌5分鐘。潷出上清液并減壓濃縮。用二乙醚(3×50mL)處理所得的固體，并將合并的有機萃取物減壓濃縮，得到白色固體，16.2g(93％)。
1H-NMR(400 MHz，CDCl3)，δ(ppm)4.19(d，1H，J＝12.0Hz)3.68(d，1H，J＝12.0Hz)1.45(s，1H)1.41(s，1H)1.20(s，1H)。
然后，通過US 5,362,718的方法將該物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨幕旌纤狒?。因此，將該丙酮化?1.04g，5.98mmol)溶解在冷卻至0℃的THF(20mL)中并用滴加的三乙基胺(0.83mL，5.98mmol)和2，4，6-三氯代苯甲酰氯(0.93mL，5.98mmol)處理。室溫攪拌該反應混合物5小時。將所得的固體過濾并用THF(10mL)洗滌。將合并的濾液真空減壓，得到白色非晶態(tài)固體，其(如下)進行使用而未進一步純化。
2.3.合成含有2，2，5-三甲基[1.3-二噁烷]-5-羧酸的39-去甲氧基雷帕霉素28-O-三甲基甲硅烷基醚，40-酯 將得自實施例2.1的粗制28-O-三甲基甲硅烷基-39-去甲氧基雷帕霉素(200mg，得自0.17mmol 39-去甲氧基雷帕霉素)溶于2mL二氯甲烷。將溶液冷卻至0℃并添加DMAP(102mg，0.84mmol)。然后，在10分鐘內(nèi)添加2，4，6-三氯苯甲酸2′，2′，5′-三甲基-1′，3′-二噁烷-5′羧酸酐(159mg，0.42mmol)在1mL二氯甲烷中的溶液。在0℃攪拌反應混合物5h并用LC/MS監(jiān)測轉(zhuǎn)化率。將反應混合物用7mL二氯甲烷稀釋并添加5mL水中止反應。分離有機層并用0.5N硫酸、碳酸氫鈉溶液和水連續(xù)洗滌。在硫酸鈉上干燥并減壓濃縮，得到標題化合物，為無色泡沫狀物，其立即使用而未進一步純化。
MS(ESI)m/z 1111[M-H]- 2.4.39-去甲氧基-40-O-[2，2-雙(羥甲基)丙?；鵠雷帕霉素 將得自實施例2.3的粗制39-去甲氧基雷帕霉素-28-O-三甲基甲硅烷基醚40-酯和2，2，5-三甲基[1.3-二噁烷]-5-羧酸溶于2mL丙酮并添加0.5mL0.5N硫酸。將反應混合物在室溫攪拌5h并接著添加5mL飽和碳酸氫鈉溶液和5mL水進行中和。用乙酸乙酯萃取含水混合物，并在硫酸鈉上干燥合并的有機萃取液。減壓濃縮，得到無色固體，其通過尺寸排除層析法(sizeexclusion chromatography)在Sephadex LH20上使用氯仿/庚烷/乙醇(v∶v∶v10∶10∶1)作為洗脫液進行純化。
1H-NMR(500 MHz，CDCl3)，δ(ppm)4.72(m，1H，C(40)-H)，3.87(m，2H)，3.69(m，2H)，1.03(s，3H)；13C-NMR(125MHz，CDCl3)，δ(ppm)175.52，74.04(C(40))，68.73(2C)，48.90，17.09。
MS(ESI)m/z 1023[M+Na]+ 實施例339-去甲氧基-40-O-(2-羥基)乙基雷帕霉素 3.1.2-(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧乙基三氟甲磺酸酯 將2-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-乙二醇(125mg，0.71mmol)和2，6-二甲基吡啶(0.08mL，0.69mmol)在6ml二氯甲烷中的溶液冷卻至-78℃。在5分鐘內(nèi)添加三氟甲磺酸酐(0.11mL，0.65mmol)并在-78℃繼續(xù)攪拌15分鐘，完成三氟甲磺酸酯的形成。將該三氟甲磺酸酯原位用于如下3.2所述的反應。
3.2.40-O-[2-(叔丁基二甲基甲硅烷基)]乙基-39-去甲氧基雷帕霉素 在室溫用2-(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧乙基三氟甲磺酸酯(0.65mmol，于6mL二氯甲烷中)處理39-去甲氧基雷帕霉素(300mg，0.34mmol)和2，6-二叔丁基吡啶(1.5mL，6.68mmol)。用溫和的氮氣流濃縮該溶液至其原來體積的三分之一，將所得的混懸液在室溫再攪拌72 h。該階段之后，添加飽和碳酸氫鈉溶液(5mL)和水(5mL)，攪拌混合物30分鐘。分離有機層并用乙酸乙酯(2×5mL)萃取水相。在硫酸鈉上干燥合并的有機萃取液并減壓濃縮，得到無色油狀物。通過柱層析在硅膠上使用己烷至己烷/丙酮(v∶v 1∶1)梯度洗脫純化，得到產(chǎn)物，為無色固體。
1H-NMR(500 MHz，CDCl3)，δ(ppm)4.16(d，1H，J＝6.5Hz，C(28)-H)，3.73(t，2H，J＝5.7Hz)，3.52(t，2H，J＝5.7Hz)，0.89(s，9H)，0.06(s，6H)；13C-NMR(125 MHz，CDCl3)，δ(ppm)76.61(C-40)，69.31(CH2)，63.03(CH2)，25.92(3C)，18.36，-5.23(2C). MS(ESI)m/z 1065[M+Na]+ 3.3.39-去甲氧基-40-O-(2-羥基)乙基雷帕霉素 在室溫用0.3mL的0.5N硫酸處理40-O-[2-(叔丁基二甲基甲硅烷基)]乙基-39-去甲氧基雷帕霉素(160mg，0.15mmol)在2mL丙酮中的溶液。使溶液在室溫靜置3h，接著加入5mL飽和碳酸氫鈉溶液和10mL水中止反應。用乙酸乙酯(3×10mL)萃取含水混合物并在硫酸鈉上干燥合并的有機萃取液。減壓濃縮，得到無色固體，其通過HPLC(水/乙腈v∶v 20/80)進一步純化。
1H-NMR(500 MHz，CDCl3)，δ(ppm)4.16(d，1H，J＝6 Hz)，3.70(m，2H)，3.57(m，2H)，3.20(m，1H，C(40)-H)；13C-NMR(125MHz，CDCl3)，δ(ppm)78.65(C-40)，77.20(C-28)，68.93(CH2O)，62.10(CH2O). MS(ESI)m/z 951[M+Na]+ 實施例4通過39-去甲氧基雷帕霉素的脂肪酶催化酯化得到39-去甲氧基-40-O-[2，2-雙(羥甲基)丙?；鵠雷帕霉素 將39-去甲氧基雷帕霉素(720mg，0.82mmol)，乙烯基2，2，5-三甲基[1.3-二噁烷]-5-羧酸酯(244mg，1.22mmol)，脂肪酶PS-C“Amano”II(720mg)和分子篩0.5nm(250mg)在無水叔丁基甲基醚(3.5mL)中的混合物在氬氣氛圍下加熱至43℃。48h之后LC/MS監(jiān)測顯示原料完全轉(zhuǎn)化。添加THF(10mL)并通過硅藻土墊過濾混合物。用THF(2×10mL)洗滌酶，并減壓濃縮合并的有機萃取液。將殘余物溶解在THF(50mL)中并添加H2SO4(15mL，0.5N)。使溶液在室溫靜置5h，隨后添加NaHCO3(50mL，5％)和鹽水(50mL)中止反應。用EtOAc(3×100mL)萃取含水混合物，在MgSO4上干燥合并的有機萃取液。除去溶劑，得到半固體態(tài)產(chǎn)物。通過急驟層析法(己烷/丙酮1∶1)進行純化，得到產(chǎn)物，為無色固體。
NMR數(shù)據(jù)與實施例2.4相同。
MS(ESI)m/z 1022[M+Na]+根據(jù)圖3所示的碎片圖譜，該鈉加合物的碎片在m/z 850，728，693，614，560，545，441和431處給出離子。
實施例5.39-去甲氧基-40-O-[2-羥乙基3-羥基-2-(羥甲基)-2-甲基丙酸酯]雷帕霉素 將39-去甲氧基-40-O-(2-羥基)乙基雷帕霉素(40mg，0.04mmol)，乙烯基2，2，5-三甲基[1.3-二噁烷]-5-羧酸酯(25mg，0.13mmol)，脂肪酶PS-C“Amano”II(40mg)和分子篩0.5nm(40mg)在無水叔丁基甲基醚(2mL)中的混合物在氬氣氛圍下加熱至43℃。72h之后LC/MS監(jiān)測顯示原料完全轉(zhuǎn)化。添加THF(10mL)并通過硅藻土墊過濾混合物。用THF(2×10mL)洗滌酶，并減壓濃縮合并的有機萃取液。將殘余物溶解在丙酮(7.5mL)中并添加H2SO4(2.5mL，0.5N)。使溶液在室溫靜置2h，隨后添加飽和NaHCO3(10mL)和水(10mL)中止反應。用EtOAc(3×10mL)萃取含水混合物，在MgSO4上干燥合并的有機萃取液。除去溶劑，得到產(chǎn)物，為黃色固體。通過制備性HPLC在Phenomenex 21.2×50mm Luna 5μm C18 BDS柱上使用70∶30MeCN/水至100％MeCN在15分鐘梯度洗脫進行純化，得到產(chǎn)物，為無色固體。
MS(ESI)m/z 1067[M+Na]+根據(jù)圖4所示的碎片圖譜，該鈉加合物的碎片在m/z 894，772，738，614，604，5 89，475和441處給出離子。
實施例6 27-O-去甲基-39-去甲氧基-40-O-[2，2-雙(羥甲基)丙?；鵠雷帕霉素 6.1含有2，2，5-三甲基[1.3-二噁烷]-5-羧酸的27-O-去甲基-39-去甲氧基雷帕霉素，40-酯 將27-O-去甲基-39-去甲氧基雷帕霉素(30mg，0.034mmol)，乙烯基2，2，5-三甲基[1.3-二噁烷]-5-羧酸酯(34mg，0.17mmol)，脂肪酶PS-C“Amano”II(30mg)和分子篩0.5nm(30mg)在無水叔丁基甲基醚(2mL)中的混合物在氬氣氛圍下加熱至43℃，持續(xù)72h。添加THF(10mL)并通過硅藻土墊過濾混合物。用THF(2×10mL)洗滌酶，并減壓濃縮合并的有機萃取液，得到微黃色半固體態(tài)產(chǎn)物。通過急驟層析法使用己烷∶丙酮(v∶v 2∶1)進行純化，得到產(chǎn)物，為淺黃色固體。
MS(ESI)m/z 1049[M+Na]++ 6.2 27-O-去甲基-39-去甲氧基-40-O-[2，2-雙(羥甲基)丙?；鵠雷帕霉素 將得自6.1的物質(zhì)溶解在丙酮(6mL)中并添加H2SO4(2mL，0.5N)。使溶液在室溫靜置2h，隨后添加飽和NaHCO3(10mL)和水(10mL)中止反應。用EtOAc(3×10mL)萃取含水混合物，在MgSO4上干燥合并的有機萃取液。除去溶劑，得到產(chǎn)物，為微黃色固體。通過制備性HPLC在Phenomenex 21.2×50mm Luna 5μm C18 BDS柱上使用70∶30 MeCN/水至100％MeCN在15分鐘梯度洗脫進行純化，得到產(chǎn)物，為無色固體。
MS(ESI)m/z 1009[M+Na]+根據(jù)圖5所示的碎片圖譜，該鈉加合物的碎片在m/z 836，679，600，560，531，431，427處給出離子。
1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ ppm 4.73(m，1H，C(40)-H)，4.32(d，J＝4.5Hz，1H，C(27)-H)，4.19(d，J＝4.5 Hz，1H，C(28)-H)，3.89(m，2 H)，3.70(m，2 H)1.03(s，3 H)。
實施例7.體外評估39-去甲氧基-40-O-(2-羥基)乙基雷帕霉素和39-去甲氧基-40-O-[2，2-雙(羥甲基)丙?；鵠雷帕霉素的抗癌活性 如以上利用改良的亞甲基碘試驗的通用方法中的規(guī)程1所述，用單層增殖試驗在12種人腫瘤細胞系板上進行體外評估39-去甲氧基-40-O-(2-羥基)乙基雷帕霉素和39-去甲氧基-40-O-[2，2-雙(羥甲基)丙?；鵠雷帕霉素的抗癌活性。
結(jié)果顯示在下表3中，每個結(jié)果代表兩次重復實驗的平均值。表4顯示了這些化合物和雷帕霉素對測試細胞系的IC50和IC70，用雷帕霉素作為參照物。
表3 表4 *-平均值是基于可獲得數(shù)據(jù)的9個細胞系 實施例8.體外結(jié)合實驗 FKBP12 FKBP12能在化學變性劑鹽酸胍(GdnHCl)中可逆展開(unfold)，而且能通過蛋白質(zhì)固有熒光的變化而監(jiān)測(Main等，1998)。特異結(jié)合并穩(wěn)定FKBP12天然狀態(tài)的配體可改變變性曲線，由此可使蛋白質(zhì)在較高化學變性劑濃度下才展開(Main等，1999)。通過穩(wěn)定性的差異，配體結(jié)合常數(shù)可用方程式1來確定。
其中ΔGapp是游離和配體結(jié)合形式間展開自由能的表觀差值，

是游離蛋白質(zhì)在水中的展開自由能，[L]是配體濃度，而Kd是蛋白質(zhì)-配體復合物的解離常數(shù)(Meiering等，1992)。利用以下方程式，展開自由能可與展開轉(zhuǎn)變的中點成比例 其中mD-N是針對給定蛋白質(zhì)和給定變性劑的常數(shù)，其與展開中殘基暴露程度的變化成比例(Tanford 1968和Tanford 1970)，而且[D]50％是對應展開中點的變性劑濃度。我們將ΔΔGD-NL——用雷帕霉素和未知配體(以相同配體濃度)對FKBP12穩(wěn)定性的差值，定義為 其中<mD-N>是展開轉(zhuǎn)化的平均m-值，而且Δ[D]50％是雷帕霉素-FKBP12展開轉(zhuǎn)化和未知配體-FKBP12復合物展開轉(zhuǎn)化中點的差值。在[L]＞Kd的條件下，通過方程式4，則ΔΔGD-N能與兩種化合物的相對Kd成比例 其中Kdrap是針對雷帕霉素的解離常數(shù)，而Kdx是針對未知配體的解離常數(shù)。所以， 擬合每條變性曲線來產(chǎn)生針對mD-N和[D]50％的值，用其可以計算平均m-值、<mD-N>、和Δ[D]50％，并由此計算Kdx。用0.2nM時的Kdrap的文獻值。
在一些情況中，由于測試化合物的低溶解度，使用比雷帕霉素對照實驗低的測試化合物濃度。在這些情況中，使用下面的方程式6考慮測試化合物濃度和雷帕霉素對照濃度之間的差異 表5-FKBP-12體外結(jié)合實驗結(jié)果 mTOR 通過測定mTOR途徑替代品標記物和p70S6激酶和S6的磷酸化水平，可間接進行抑制mTOR (Brunn等，1997；Mothe-Satney等，2000；Tee和Proud，2002；Huang和Houghton，2002)。
HEK293細胞與FLAG-標記的mTOR和myc-標記的調(diào)節(jié)性相關蛋白(raptor)共轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)24h，然后除血清過夜。用100nM胰島素刺激細胞，然后收獲并通過3次冷凍/熔融循環(huán)裂解。收集裂解產(chǎn)物并與等量針對mTOR/調(diào)節(jié)性相關蛋白復合物的FLAG抗體進行免疫沉淀。進行免疫沉淀用化合物(0.00001-0.003mM)處理的樣品與FKBP12/雷帕霉素、FKBP12/39-去甲氧基雷帕霉素衍生物或載體(DMSO)于30℃預孵育30分鐘，未處理的樣品在激酶緩沖液中孵育。然后免疫沉淀產(chǎn)物用于進行體外激酶試驗，其中存在3mM ATP、10mM Mn2+和GST-4E-BP1作為底物。用4x上樣緩沖液終止反應，然后加入15％SDS-PAGE，濕法轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，然后探測磷酸-4E-BP1(T37/46)。使用圖像J(Image J)(http://rsb.info.nih.gov/ij/)通過圖像分析定量分析蛋白質(zhì)印跡帶(Western blotband)。圖6A顯示了雷帕霉素(實心方塊)和39-去甲氧基-40-O-[2，2-雙(羥甲基)丙?；鵠雷帕霉素(實心三角形)的劑量-響應曲線。圖6B顯示了雷帕霉素(實心方塊)和39-去甲氧基-40-O-(2-羥基)乙基雷帕霉素(實心三角形)的劑量-響應曲線。
可選地，HEK293細胞加入到6孔板中并預孵育24h，然后除去血清過夜。用載體或化合物于30℃預處理細胞30分鐘，然后用100nM胰島素于30℃刺激30分鐘并通過3個冷凍/熔融循環(huán)裂解，并測定蛋白質(zhì)濃度。將等量蛋白質(zhì)上樣于SDS-PAGE膠上并分離。用濕法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上并探測磷酸-S6(S235/36)或磷酸-p70 S6K(T389)。使用圖像J(http://rsb.info.nih.gov/ij/)通過圖像分析定量分析蛋白質(zhì)印跡帶。
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權(quán)利要求
1.雷帕霉素的39-去甲氧基衍生物，其特征在于，40-羥基位點被衍生為羧酸酯、醚、磷酸酯、次膦酸酯、縮醛或糖基。
2.根據(jù)下式(I)的化合物，或其藥用鹽
其中
X表示鍵或CH2；
R1表示酮基或(H，H)；
R2表示OH或OMe；
R3表示H、OH或OMe；
R4和R5各自獨立地表示H或OH；
R6表示-R7、-C(O)R7、-(CH2)2-O-[CR21R22-O]a-C(O)-R23；-CR21R22-O-C(O)-R23；-POR19R20；-PO(OR19)(OR20)或Y-R15；
R7表示-(CR8R9)m(CR10R11)pCR12R13R14；
R8和R9各自獨立地表示C1-C4烷基、C2-C4烯基或C2-C4炔基，上述任意基團可任選被-PO(OH)2、-CF2PO(OH)2、-OH、-COOH或-NH2取代；或者R8和R9各自獨立地表示H、三氟甲基或F；
R10，R11，R12，R13和R14各自獨立地表示C1-C4烷基、C2-C4烯基或C2-C4炔基，上述任意基團可任選被-PO(OH)2、-CF2PO(OH)2、-OH、-COOH或-NH2取代；或者R10、R11、R12、R13和R14可獨立地選自H、-(CR8R9)qNH2、-(CR8R9)qOH、CF3、F、COOH；或者R10和R11或R12和R13或R13和R14可與它們連接的碳結(jié)合在一起形成C3-C6環(huán)烷基或3-6元雜烷基環(huán)，該雜烷基環(huán)含有一個或多個選自N、O和S的雜原子，并任選地被最多5個-(CR8R9)qOH、-(CR8R9)qNH2或COOH基團取代；Y＝鍵、-C(O)-O-；-(CH2)2-O-C(O)-O-；
R15代表
或
R16各自獨立地為H或OH；
R17獨立地選自H、OH和NH2；
R18獨立地選自H、-CH3、-CH2OH和-COOH；
但條件是選自R16、R17和R18的最多2個基團表示H或CH3；
R19和R20各自獨立地表示H或C1-C4烷基或者R19和R20一起表示＝CH2；
R21獨立地選自H、CH3；
R22獨立地選自H、-CH3、-CH＝CH2、-CH2Cl、-CHCl2、-CCl3、-CH(OH)Me、-CH2OH、-CH2CH3、-CH(Cl)Me；
R23獨立地為R7、Y-R15或5或6元芳基或雜芳基環(huán)，任選被1-3個選自OH、F、Cl、Br、NO2和NH2的基團取代；
a表示0或1；
m、p和q各自獨立地表示0-4的整數(shù)；
但條件是，R7基團不含多于12個的碳原子，并且含有至少一個選自-PO(OH)2、-CF2PO(OH)2、-COOH、OH或NH2的官能團。
3.權(quán)利要求2的化合物，其中R6表示-R7。
4.權(quán)利要求2的化合物，其中R6表示-C(O)R7。
5.權(quán)利要求2的化合物，其中R6表示-(CH2)2-O-[CR21R22-O]a-C(O)-R23。
6.權(quán)利要求5的化合物，其中R23表示R7。
7.權(quán)利要求5的化合物，其中R23表示Y-R15。
8.權(quán)利要求2-6任一項的化合物，其中R7含有7個或更少的碳原子。
9.權(quán)利要求8的化合物，其中R7含有5個或更少的碳原子。
10.權(quán)利要求2-6、8或9的化合物，其中R7含有選自-PO(OH)2，-CF2PO(OH)2、-OH、-COOH和-NH2的兩個基團。
11.權(quán)利要求2-6、8-10任一項的化合物，其中R7含有選自-COOH、-OH和-NH2的至少一個官能團。
12.權(quán)利要求2-6、8-11任一項的化合物，其中p表示0或1。
13.權(quán)利要求2-6、8-12任一項的化合物，其中m表示0或1。
14.權(quán)利要求2-6、8-13任一項的化合物，其中q表示0、1或2。
15.權(quán)利要求2-6、8-14任一項的化合物，其中R11表示H。
16.權(quán)利要求2-6、8-15任一項的化合物，其中R12表示H。
17.權(quán)利要求2-6、8-16任一項的化合物，其中R13表示H或OH。
18.權(quán)利要求2-6、8-17任一項的化合物，其中p表示1，R10表示Me、OH或CH2OH。
19.權(quán)利要求2-6、8-17任一項的化合物，其中p表示1，R11表示Me、OH或CH2OH。
20.權(quán)利要求2-6、8-11任一項的化合物，其中m和p均表示0，R12和R13均表示H，且R14表示-(CR8R9)q-OH，其中q＝0或1，R8和R9均表示H。
21.權(quán)利要求2-6、8-11任一項的化合物，其中p表示1，m表示0，R10和R11均表示H，R12表示H，R13表示H、OH或NH2，及R14表示-(CR8R9)q-OH，其中q＝0或1，R8和R9均表示H。
22.權(quán)利要求2-6、8-11任一項的化合物，其中R6表示通過和羥基乙酸，3-羥基-2，2-二甲基丙酸，2，3-二羥基丙酸，3-羥基-2-羥甲基丙酸或2，2-雙(羥甲基)丙酸形成酯而衍生的基團。
23.權(quán)利要求2-6、8-11任一項的化合物，其中R6表示通過和羥基乙酸，3-羥基-2，2-二甲基丙酸，2，3-二羥基丙酸，3-羥基-2-羥甲基丙酸或2，2-雙(羥甲基)丙酸形成醚而衍生的基團。
24.權(quán)利要求2的化合物，其為39-去甲氧基-40-O-[2，2-雙(羥甲基)丙酰基]雷帕霉素或其藥用鹽。
25.權(quán)利要求2的化合物，其為39-去甲氧基-40-O-(2-羥基)乙基雷帕霉素或其藥用鹽。
26.權(quán)利要求2的化合物，其為39-去甲氧基-40-O-[2-羥乙基3-羥基-2-(羥甲基)-2-甲基丙酸酯]雷帕霉素或其藥用鹽。
27.權(quán)利要求2的化合物，其為27-O-去甲基-39-去甲氧基-40-O-[2，2-雙(羥甲基)丙酰基]雷帕霉素或其藥用鹽。
28.權(quán)利要求2的化合物，其中R6表示-POR19R20。
29.權(quán)利要求2的化合物，其中R6表示-PO(OR19)(OR20)。
30.權(quán)利要求28或29的化合物，其中R19和R20均表示CH3或均表示CH2CH3。
31.權(quán)利要求2的化合物，其中R6表示Y-R15。
32.權(quán)利要求31的化合物，其中R15基團表示
33.權(quán)利要求32的化合物，其中R15為通過和葡萄糖、葡糖胺、葡糖醛酸或阿拉伯糖形成縮醛而形成的基團。
34.權(quán)利要求32的化合物，其中R15為通過和D-葡萄糖形成縮醛而形成的基團。
35.權(quán)利要求32的化合物，其中R15為通過和D-葡糖胺形成縮醛而形成的基團。
36.權(quán)利要求32的化合物，其中R15為通過和D-葡糖醛酸形成縮醛而形成的基團。
37.權(quán)利要求31的化合物，其中R15表示
38.權(quán)利要求37的化合物，其中R15是通過和果糖形成縮醛而形成的基團。
39.權(quán)利要求31的化合物，其中R15表示
40.權(quán)利要求39的化合物，其中R15為通過和葡糖醛酸形成酯而形成的基團。
41.權(quán)利要求31-40任一項的化合物，其中Y表示鍵。
42.權(quán)利要求31-40任一項的化合物，其中Y表示-(CH2)2-O-C(O)-O-。
43.權(quán)利要求31-40任一項的化合物，其中Y表示-C(O)-O-。
44.權(quán)利要求1-43任一項的化合物，其用作藥物。
45.權(quán)利要求1-43任一項的化合物，用于治療癌癥和/或B-細胞惡性腫瘤，誘導或維持免疫抑制，治療移植排斥、移植物抗宿主病、自體免疫性疾病、炎性疾病、血管疾病和纖維化疾病，以及刺激神經(jīng)再生或治療真菌感染。
46.權(quán)利要求1-43任一項的化合物，用于治療癌癥和/或B-細胞惡性腫瘤的藥物。
47.藥物組合物，包括權(quán)利要求1-43任一項的化合物和一種或多種藥用稀釋劑或載體。
48.用于治療癌癥和/或B-細胞惡性腫瘤，誘導或維持免疫抑制，治療移植排斥、移植物抗宿主病、自體免疫性疾病、炎性疾病、血管疾病和纖維化疾病，以及刺激神經(jīng)再生或治療真菌感染的方法，其包括給予患者有效量的權(quán)利要求1-43任一項的化合物。
49.用于治療癌癥和/或B-細胞惡性腫瘤的方法，其包括給予患者有效量的權(quán)利要求1-43任一項的化合物。
50.權(quán)利要求1-43任一項的化合物在制備治療癌癥和/或B-細胞惡性腫瘤，誘導或維持免疫抑制，治療移植排斥、移植物抗宿主病、自體免疫性疾病、炎性疾病、血管疾病和纖維化疾病，以及刺激神經(jīng)再生或治療真菌感染的藥物中的用途。
51.權(quán)利要求50的用途，其中所述藥物用于治療癌癥或B-細胞惡性腫瘤。
52.制備根據(jù)權(quán)利要求2-43任一項的式(I)化合物的方法，其包括
(a)將式(II)的化合物或其被保護的衍生物和式(III)的化合物或其活化衍生物進行反應
式(II)為
其中RA表示H或(CH2)2-OH
式(III)為
HO-R6(III)
其中R6如上述式(I)化合物或其被保護的衍生物所定義的；或者
(b)將式(I)化合物或其鹽轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N式(I)化合物或其另一種藥用鹽；或者
(c)將被保護的式(I)化合物脫去保護。
53.組合物或各部分的試劑盒，包括(i)權(quán)利要求1-43任一項的化合物和(ii)一種或多種其他有效治療劑。
54.權(quán)利要求53的組合物或各部分的試劑盒，其中一種或多種有效治療劑選自
甲氨喋呤、亞葉酸、阿霉素、prenisone，博來霉素、環(huán)磷酰胺、5-氟尿嘧啶、紫杉醇、多西紫杉醇、長春新堿、長春堿、維諾瑞濱、多柔比星、他莫昔芬、托若米芬、醋酸甲地孕酮、阿納托唑、果絲瑞寧、抗-HER2單克隆抗體(例如，HerceptinTM)、卡培他濱、鹽酸雷洛昔芬、EGFR抑制劑、VEGF抑制劑、蛋白酶體抑制劑、hsp90抑制劑、硫唑嘌呤、皮質(zhì)類固醇、環(huán)磷酰胺、環(huán)孢霉素A、FK506、霉酚酸酯、OKT-3、ATG、兩性霉素B、氟胞嘧啶、棘白菌素、灰黃霉素、咪唑或三唑抗真菌劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及新型39-去甲氧基雷帕霉素衍生物，它們的制備方法，及它們的用途。在另一方面，本發(fā)明提供39-去甲氧基雷帕霉素衍生物用于治療癌癥和/或B-細胞惡性腫瘤，誘導或維持免疫抑制，治療移植排斥、移植物抗宿主病、自體免疫性疾病、炎性疾病、血管疾病和纖維化疾病，以及刺激神經(jīng)再生或治療真菌感染。
文檔編號C07D498/18GK101175760SQ200680016325
公開日2008年5月7日 申請日期2006年3月10日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月11日
發(fā)明者克里斯托弗·H·貝克曼, 斯蒂芬·J·莫斯, 羅斯·M·謝里登, 張明強, 巴里·威爾金森 申請人:比奧蒂卡科技有限公司