專利名稱：一種高純度四水合輔羧酶的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種四水合輔羧酶的制備方法，特別是高純度四水合輔羧酶的制備方法。
背景技術(shù)：
四水合輔羧酶(Cocarboxylase tetrahydrate)是一種輔酶，它的活性成份輔羧酶(Cocarboxylase)參與催化許多有機(jī)酸的脫羧反應(yīng)，可對細(xì)胞色素C的活性起到促進(jìn)作用。
1937年，K.Lohmann和Ph.Schuuster從發(fā)酵粉中以氯化維生素B1焦磷酸酯的形式分離出輔羧酶。輔羧酶是維生素B1焦磷酸酯的內(nèi)鹽。
同時，利用氯化維生素B1焦磷酸酯制備輔羧酶也就變成了一種經(jīng)典的方法。實(shí)際上，氯化維生素B1焦磷酸酯更應(yīng)該稱為氯化脫羧輔酶。輔羧酶是指維生素B1焦磷酸酯的內(nèi)鹽。
制備氯化脫羧輔酶的方法多種多樣。
Stern和Hofer利用維生素B1和POCl3反應(yīng)制備了氯化脫羧輔酶。J.Weijlard和H.Tauber利用維生素B1和焦磷酸鈉與磷酸的混合液制備了氯化脫羧輔酶。而H.Weil-Malherbe利用維生素B1的相似物5-溴化乙烯-噻唑和磷酸銀的反應(yīng)制備了氯化脫羧輔酶。在上述方法中，脫羧輔酶是以銀鹽的形式被分離出來的。J.Weijlard和H.Tauber首先用H2S處理了上述銀鹽，接著用鹽酸將氯化脫羧輔酶分離。Weil-Malherbe利用磷酸對氯化脫羧輔酶進(jìn)行了精制。在1946年，Karrer和Viscontini對J.Weijlard和H.Tauber的方法進(jìn)行了改進(jìn)。
此外，美國專利US2,991,284、US2,415,544、US5,047,223、US6,596,865 B1也都介紹了氯化脫羧輔酶的制備和純化。上述制備方法中，有的使用劇毒品如POCl3為原料，或者由于收率太低，有的跟本就沒有分離得到四水合輔羧酶純品，有的則結(jié)果重現(xiàn)差，而不能達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種簡單，經(jīng)濟(jì)和技術(shù)上操作性強(qiáng)，產(chǎn)率高、純度高的方法來制備輔羧酶。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下一種高純度四水合輔羧酶的制備方法，磷酸與五氧化二磷在加熱條件下與維生素B1充分反應(yīng)至無游離氯離子，冷卻得到輔羧酶粗品；再將所述的輔羧酶粗品純化先裝入大孔弱堿性丙烯酸系陰離子交換樹脂柱用純水洗脫并收集洗出液A，所述的洗出液A為用堿液檢測呈黃色的洗出液，將洗出液A濃縮后再置于弱酸性的陽離子交換樹脂柱，用純水洗脫并收集洗出液B，所述的洗出液B為用堿液檢測呈黃色的洗出液，經(jīng)后處理后結(jié)晶制得高純度四水合輔羧酶。
通常所用的純水是指去離子水或蒸餾水。檢測洗出液是否呈黃色的堿液指堿性溶液，可以使用NaOH溶液，優(yōu)選1.0mol/L的NaOH溶液。
其中所述的大孔弱堿性丙烯酸系陰離子交換樹脂為下列型號之一D315、D301、D335、D345，優(yōu)選型號D315；所述的弱酸性的陽離子交換樹脂為下列型號之一HZD-2、HZ016、JK006、JK008，優(yōu)選HZD-2。
所述的高純度四水合輔羧酶的制備方法，所述的維生素B1∶磷酸∶五氧化二磷的質(zhì)量比為1∶2～3∶1～3，具體步驟如下將磷酸加入到反應(yīng)容器中，130～175℃充分?jǐn)嚢?，加入五氧化二磷?65～175℃保溫反應(yīng)，130℃～145℃加入維生素B1發(fā)生酯化反應(yīng)，充分反應(yīng)至反應(yīng)液中無游離的氯離子，具體可取反應(yīng)液用0.1M的硝酸銀溶液進(jìn)行檢測，無白色渾濁時停止攪拌，冷卻至50℃以下，加入到冷水中，控制水溫在70℃以下，形成透明溶液，冷卻至室溫后滴入裝有95％乙醇的除酸反應(yīng)容器中-5～5℃靜置過夜，除去上清液后得所述的輔羧酶粗品，再將輔羧酶粗品純化。所述的冷卻可采用將所得不合游離氯離子的黃色粘稠狀反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到正在攪拌的裝有冰水的反應(yīng)容器中(外加冷凍鹽水冷卻罐體，使物料溫度不超過10℃)進(jìn)行。
進(jìn)一步，所述的輔羧酶粗品純化的步驟為將所述的輔羧酶粗品溶于水中，裝入所述的大孔弱堿性丙烯酸系陰離子交換樹脂柱，用純水洗脫，用氫氧化鈉溶液檢測洗出液顯黃色時，開始接收洗出液A，直至接收到氫氧化鈉溶液檢測洗出液不顯黃色，將洗出液A濃縮后再置于弱酸性的陽離子交換樹脂柱，當(dāng)用氫氧化鈉溶液檢測洗出液顯黃色時，開始接收洗出液B，直至接收到氫氧化鈉溶液檢測洗出液不顯黃色，經(jīng)后處理后結(jié)晶制得高純度四水合輔羧酶。
以上純化步驟中，在接受完洗出液B后，可再改用10％HCl溶液淋洗陽離子交換柱，接受洗出液C，同樣，當(dāng)用氫氧化鈉溶液檢測洗出液顯黃色時，開始接收，直至接收到氫氧化鈉溶液檢測洗出液不顯黃色，此洗出液C為反應(yīng)的副產(chǎn)物維生素B1磷酸酯。
所述的后處理為將洗出液B減壓蒸餾濃縮至原體積的1/8至1/5，再滴加95％的乙醇，過濾，得濕產(chǎn)物粗品，再將濕產(chǎn)物粗品干燥至恒重。
具體的，高純度四水合輔羧酶的制備方法中所述的大孔弱堿性丙烯酸系陰離子交換樹脂柱選用D315，該樹脂含有甲基化多胺基團(tuán)的交聯(lián)聚丙烯酰胺結(jié)構(gòu)，可以很好得吸附住副產(chǎn)物維生素B1三磷酸酯和維生素B1四磷酸酯，以及磷酸，并且可以減少甚至避免輔羧酶在柱分離時分解；所述的弱酸性的陽離子交換樹脂柱選用HZD-2型，利用該樹脂的吸附功能可以在水淋洗時牢牢吸附住維生素B1磷酸酯，而輔羧酶卻可以毫無保留的洗出，當(dāng)該樹脂柱用10％鹽酸淋洗時，又可以將維生素B1磷酸酯完全洗出。
更為具體的，所述的高純度四水合輔羧酶的制備方法為將所述的輔羧酶粗品溶于水中，裝入D315交換樹脂柱，用純水洗脫，用1.0mol/L氫氧化鈉溶液檢測洗出液顯黃色時，開始接收洗出液A，直至接收到1.0mol/L氫氧化鈉溶液檢測洗出液不顯黃色，將洗出液A濃縮后再置于HZD-2交換樹脂柱，用純水洗脫，當(dāng)用1.0mol/L氫氧化鈉溶液檢測洗出液顯黃色時，開始接收洗出液B，直至接收到1.0mol/L氫氧化鈉溶液檢測洗出液不顯黃色，將洗出液B減壓蒸餾濃縮至原體積的1/8至1/5，再滴加95％的乙醇，有白色粉末析出，滴加完乙醇后，室溫下靜置3小時左右，過濾，得濕產(chǎn)物粗品，再將濕產(chǎn)物粗品干燥至恒重，即得所述的高純度四水合輔羧酶。
具體的，所述的干燥可在25℃以下，真空度-0.098Mpa以上，烘至干燥失重小于0.2％結(jié)束。
本發(fā)明中的離子交換柱可利用超純水再生。具體的，陰離子交換樹脂用1mol/L氫氧化鈉溶液再生，再用超純水洗至中性；陽離子交換樹脂用10％鹽酸淋洗出維生素B1磷酸酯后，直接用超純水洗至中性。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其優(yōu)勢體現(xiàn)在原料易得，分離過程簡單容易控制，所使用的離子交換樹脂價(jià)廉易得，制得的輔羧酶純度高，含量大于99.0％(HPLC)，總收率較高，大于20％。
具體實(shí)施例方式以下以具體實(shí)施例來說明本發(fā)明的技術(shù)方案，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此實(shí)施例1稱量225.0g磷酸加入到反應(yīng)容器中，升溫至135℃，保溫?cái)嚢?小時。控制溫度175℃以下，加入稱量好的175.0g五氧化二磷。待加入完畢以后，控制溫度在165℃至175℃保溫?cái)嚢?小時。然后降溫至130℃，保持該溫度，在2小時內(nèi)分批加入完100.0g維生素B1，并保持該溫度反應(yīng)。當(dāng)取反應(yīng)液用0.1mol/L的硝酸銀溶液檢測不再有白色渾濁現(xiàn)象時，停止攪拌。趁熱將所得黃色粘稠狀反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到正在攪拌的裝有0.5Kg冰水的反應(yīng)容器中(外加冷凍鹽水冷卻罐體，使物料溫度不超過10℃)，待形成透明溶液以后，將所得溶液再緩慢滴入到正在攪拌的裝有5.0L95％乙醇的除酸反應(yīng)容器中，滴加完后保持在0℃下靜置過夜。
將過夜后的產(chǎn)物混合液除去上清液，加入0.5L水將下層糖漿狀產(chǎn)物溶解后，加入到裝有2.5KgD315弱堿型陰離子樹脂交換柱中，用超純水淋洗。當(dāng)用1.0mol/L氫氧化鈉溶液檢測洗出液顯黃色時，開始接收洗出液，直至接收到1.0mol/L氫氧化鈉溶液檢測洗出液不顯黃色。一共接得約3.8L洗出液。接收完畢后先用1.0mol/L氫氧化鈉溶液，再用超純水再生該離子樹脂柱。
將以上所得3.8L洗出液，35℃減壓蒸餾至約0.5L。然后將該溶液加入到裝有2.5KgHZD-2型弱酸性陽離子樹脂交換柱中，先用超純水淋洗。當(dāng)用1.0mol/L氫氧化鈉溶液檢測洗出液，顯黃色時，開始接收洗出液。直至接收到1.0mol/L氫氧化鈉溶液檢測洗出液不顯黃色，共接到約5.5L洗出液。再改用10％HCl溶液淋洗，接收洗出液，同樣，直至接收到1.0mol/L氫氧化鈉溶液檢測洗出液不顯黃色，共接到約3.7L洗出液。然后用超純水再生該離子樹脂柱。
將經(jīng)陽離子樹脂交換過后所得到的5.5L溶液加入至結(jié)晶罐，35℃以下減壓蒸餾至約75ml，然后邊攪拌，邊慢慢滴加入375ml95％乙醇，有白色粉末析出。乙醇滴加完畢后，室溫下靜置3小時，然后減壓過濾，得濕產(chǎn)物粗品。25℃以下，真空度-0.098Mpa以上，烘至干燥失重小于0.2％結(jié)束，得到高純度四水合輔羧酶29.7g，含量≥99.0％(HPLC)，總收率20.0％。
實(shí)施例245.0g磷酸加入到250ml四口燒瓶中，快速攪拌加熱到135℃～145℃，保溫3小時，然后控制溫度在不高于175℃的條件下加入五氧化二磷35.0g，加入完畢后在165～175℃保溫2.5～3小時。然后降溫至130℃，并維持該溫度分批加入維生素B120.0g。保溫反應(yīng)至取少許反應(yīng)液用0.1mol/1AgNO3檢測不再有白色沉淀生成為止。
待上述反應(yīng)液冷至溫度低于50℃以后，慢慢倒入到80～100ml水中，控制溫度在加入反應(yīng)液時溫度不超過70℃。待溶解后攪拌0.5～1小時，反應(yīng)液冷至室溫后，在攪拌的條件下加入到1000ml 95％乙醇中，靜置過夜。
傾倒出上清液，取水60ml溶解下層黃棕色糖漿狀物質(zhì)，加入到裝有200～250ml D315大孔弱堿丙烯酸系陰離子交換樹脂柱中，進(jìn)行離子交換，用純水淋洗，當(dāng)洗出液用氫氧化鈉檢測變黃時收集洗出液，直至到洗出液再次用氫氧化鈉檢測時不再變黃，共得洗出液200ml。
將所得洗出液加入到裝有200～250ml HZD-2弱酸性陽離子交換樹脂柱中，用純水淋洗。當(dāng)洗出液用氫氧化鈉檢測變黃時開始接收洗出液，當(dāng)洗出液再次用氫氧化鈉檢測不再變黃時，停止接收，共接得洗出液600ml，35℃以下，-0.096MPa旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至120ml。將所得濃縮液在攪拌條件下滴加入95％乙醇600ml，最終得白色固體粉末5.5g，四水合輔羧酶含量99.2％。此時，改用10％鹽酸淋洗，并收集洗出液，當(dāng)用氫氧化鈉檢測洗出液不再變黃時，停止接收。共接得洗出液450ml，45℃以下-0.096MPa，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至200ml，滴加95％乙醇，最終得微黃色固體粉末14.2g含量95.5％，該黃色粉末即為副產(chǎn)物維生素B1磷酸酯的鹽酸鹽。
權(quán)利要求
1.一種高純度四水合輔羧酶的制備方法，其特征在于所述的方法為磷酸與五氧化二磷在加熱條件下與維生素B1充分反應(yīng)至無游離氯離子，冷卻得到輔羧酶粗品；再將所述的輔羧酶粗品純化先置于大孔弱堿性丙烯酸系陰離子交換樹脂柱中，用純水洗脫并收集洗出液A，所述的洗出液A為用堿液檢測呈黃色的洗出液，將洗出液A濃縮后再置于弱酸性的陽離子交換樹脂柱，用純水洗脫并收集洗出液B，所述的洗出液B為用堿液檢測呈黃色的洗出液，經(jīng)后處理后結(jié)晶制得高純度四水合輔羧酶。
2.如權(quán)利要求1所述的高純度四水合輔羧酶的制備方法，其特征在于所述的大孔弱堿性丙烯酸系陰離子交換樹脂為下列型號之一D315、D301、D335、D345。
3.如權(quán)利要求2所述的高純度四水合輔羧酶的制備方法，其特征在于所述的大孔弱堿性丙烯酸系陰離子交換樹脂型號為D315。
4.如權(quán)利要求1所述的高純度四水合輔羧酶的制備方法，其特征在于所述的弱酸性的陽離子交換樹脂為下列型號之一HZD-2、HZ016、JK006、JK008。
5.如權(quán)利要求4所述的高純度四水合輔羧酶的制備方法，其特征在于所述的弱酸性的陽離子交換樹脂型號為HZD-2。
6.如權(quán)利要求1所述的高純度四水合輔羧酶的制備方法，其特征在于所述的制備方法中，所述的輔羧酶粗品純化的步驟為將所述的輔羧酶粗品溶于水中，裝入所述的大孔弱堿性丙烯酸系陰離子交換樹脂柱，用純水洗脫，用氫氧化鈉溶液檢測洗出液顯黃色時，開始接收洗出液A，直至接收到氫氧化鈉溶液檢測洗出液不顯黃色，將洗出液A濃縮后再置于弱酸性的陽離子交換樹脂柱，當(dāng)用氫氧化鈉溶液檢測洗出液顯黃色時，開始接收洗出液B，直至接收到氫氧化鈉溶液檢測洗出液不顯黃色，經(jīng)后處理后結(jié)晶制得高純度四水合輔羧酶。
7.如權(quán)利要求6所述的高純度四水合輔羧酶的制備方法，其特征在于所述的后處理為將洗出液B減壓蒸餾濃縮至原體積的1/8至1/5，再滴加95％的乙醇，過濾，得濕產(chǎn)物粗品，再將濕產(chǎn)物粗品干燥至恒重。
8.如權(quán)利要求6所述的高純度四水合輔羧酶的制備方法，其特征在于所述的大孔弱堿性丙烯酸系陰離子交換樹脂柱選用D315，所述的弱酸性的陽離子交換樹脂柱選用HZD-2型。
9.如權(quán)利要求1～8之一所述的高純度四水合輔羧酶的制備方法，其特征在于所述的維生素B1∶磷酸∶五氧化二磷的質(zhì)量比為1∶2～3∶1～3，具體步驟如下將磷酸加入到反應(yīng)容器中，130～175℃充分?jǐn)嚢?，加入五氧化二磷?65～175℃保溫反應(yīng)，130℃～145℃加入維生素B1，充分反應(yīng)至反應(yīng)液中無游離的氯離子，冷卻至50℃以下，加入到冷水中，控制水溫在70℃以下，形成透明溶液，冷卻至室溫后滴入裝有95％乙醇的除酸反應(yīng)容器中-5～5℃靜置過夜，除去上清液后得所述的輔羧酶粗品，再將輔羧酶粗品純化。
10.如權(quán)利要求9所述的高純度四水合輔羧酶的制備方法，其特征在于所述的方法為將所述的輔羧酶粗品溶于水中，裝入D315交換樹脂柱，用超純水洗脫，用1.0mol/l氫氧化鈉溶液檢測洗出液顯黃色時，開始接收洗出液A，直至接收到1.0mol/l氫氧化鈉溶液檢測洗出液不顯黃色，將洗出液A濃縮后再置于HZD-2交換樹脂柱，當(dāng)用1.0mol/l氫氧化鈉溶液檢測洗出液顯黃色時，開始接收洗出液B，直至接收到1.0mol/l氫氧化鈉溶液檢測洗出液不顯黃色，將洗出液B減壓蒸餾濃縮至原體積的1/8至1/5，再滴加95％的乙醇，過濾，得濕產(chǎn)物粗品，再將濕產(chǎn)物粗品干燥至恒重，即得所述的高純度四水合輔羧酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種高純度四水合輔羧酶的制備方法。所述的方法為磷酸與五氧化二磷在加熱條件下與維生素B
文檔編號C07F9/6539GK1887891SQ20061005259
公開日2007年1月3日 申請日期2006年7月21日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月21日
發(fā)明者王維, 蔣勇, 張曉東 申請人:杭州德默醫(yī)藥科技有限公司