專利名稱：一種四水合輔羧酶的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及四水合輔羧酶的制備方法。
背景技術(shù)：
四水合輔羧酶(Cocarboxylase Tetrahydrate)為維生素類藥，又名四水合硫胺焦 磷酸酯，在體內(nèi)參與糖代謝中丙酮酸和a-酮戊二酸的氧化脫羧反應(yīng)，是糖類代謝所必需， 缺乏時(shí)，氧化受阻形成丙酮酸，乳酸堆積，并影響機(jī)體能量供應(yīng)，其癥狀主要表現(xiàn)在神經(jīng)系 統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和消化系統(tǒng)方面等。臨床上常用于腳氣病或Wernicke腦病的治療。亦可用 于四水合輔羧酶缺乏引起的周圍神經(jīng)炎、消化不良等的輔助治療。四水合輔羧酶化學(xué)名為 4-甲基-3-[(2-甲基-4-氨基-5-嘧啶基)甲基]-5-(2-焦磷酸酰氧乙基)噻唑鎗四水合
物。結(jié)構(gòu)為 1937年，K. Lohmann和Ph. Sch皿ster從發(fā)酵粉中以氯化維生素焦磷酸酯的 形式分離出輔羧酶。同年，Stern和Hofer利用維生素B工和三氯氧磷反應(yīng)制備了氯化維 生素Bi焦磷酸酯[cf. Science, Vol. 85， p. 483 (1937) ] 。 1938年，文獻(xiàn)報(bào)道了利用維生素 B工與焦磷酸鈉與磷酸的混合溶液反應(yīng)制備硫胺焦磷酸酯[cf. Joural of the American ChemicalSociety, Vol. 60， p. 2263 (1938)]，通過利用磷鴇酸溶液與大量的有機(jī)溶劑處理 得到硫胺焦磷酸酯，收率10%左右。1940年，文獻(xiàn)報(bào)道了利用維生素B工類似物5-溴化乙 烯-噻唑和磷酸銀反應(yīng)制備了氯化維生素Bi焦磷酸酯[cf. Biochemical Journal, Vol. 34， p. 980 (1940)]，該方法中，硫胺焦磷酸酯以銀鹽的形式析出，用硫化氫除去銀離子，然后用 氯化氫處理得到氯化硫胺焦磷酸酯。 US2991284、US5047223公開了維生素Bi與磷酸和五氧化二磷混合反應(yīng)制備得到輔 羧酶粗品混合物并使混合物經(jīng)過弱堿性離子交換樹脂和陽離子交換樹脂純化得到四水合 輔羧酶的方法；CN1887891A公開了一種以磷酸與五氧化二磷在加熱條件下與維生素B工反 應(yīng)得到輔羧酶粗品，粗品再分別通過弱堿性陰離子交換樹脂、弱酸性陽離子交換樹脂純化， 再經(jīng)結(jié)晶處理制得高純度四水合輔羧酶(含量大于99% )的方法。 現(xiàn)有技術(shù)多以磷酸為起始原料，其純化工藝多需要大量有機(jī)溶劑處理或有毒氣 體，或反應(yīng)溫度高，不利于環(huán)境保護(hù)，技術(shù)本身生產(chǎn)可行性差，收率較低，產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定， 成本較高。 JP昭49-14751也公開了一種輔羧酶衍生物的制備方法，即通過維生素B工的鹽與 焦磷酸在脫水縮合劑無水金屬鹽，例如Zn、Al和Mg的鹽酸鹽，Mn和Na的硫酸鹽的作用下， 在10(TC以上攪拌15-10分鐘制備輔羧酶。但在實(shí)際操作過程中，發(fā)現(xiàn)該方法實(shí)用性不強(qiáng)，反應(yīng)幾乎無法正常進(jìn)行。因此尋找一種反應(yīng)迅速，可重復(fù)性強(qiáng)的方法十分必要。 本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)的不足，反應(yīng)由焦磷酸代替磷酸參與反應(yīng)，并且篩選出效
果較好的脫水劑，通過該方法的使用降低了反應(yīng)溫度，解決了反應(yīng)的不可行性，低效率、低
收率、產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定等，使反應(yīng)可控性更強(qiáng)，收率更高，純度更高，HPLC檢測(cè)含量99%以
上，單個(gè)雜質(zhì)0. 5 %以內(nèi)，總雜質(zhì)1. 0 %以內(nèi)。并有效降低了對(duì)環(huán)境的污染。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的提供了一種簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)和技術(shù)上操作性強(qiáng)、產(chǎn)率高、純度高的方法來制備 四水合輔羧酶。所述制備方法包括以下步驟 通過焦磷酸與脫水劑在加熱條件下與維生素B工反應(yīng)，脫水劑為五氧化二磷、三氯 氧磷、濃硫酸之一或其任意混合物，優(yōu)選是五氧化二磷。 該反應(yīng)中維生素B"脫水劑、焦磷酸的質(zhì)量比可以為1 : 0. 5 3 : 2 10，優(yōu) 選l : 1 3 : 3 10。在反應(yīng)過程中加熱條件可以控制在70°C 20(TC，優(yōu)選100°C 160°C。 為了得到純度比較高的產(chǎn)品，在得到四水合輔羧酶后可進(jìn)行精制，精制方法可以 為將四水合輔羧酶用水溶解，加入至與水不互溶的有機(jī)叔胺溶液，振搖，取水層，加至弱堿
性陰離子交換樹脂柱，純化水洗脫，接收洗脫液，洗脫液加至酸性陽離子交換樹脂柱，水洗 脫，接收洗脫液，合并紫外光檢測(cè)有熒光部分，濃縮，結(jié)晶，得到四水合輔羧酶。其中酸性陽 離子交換樹脂柱為強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂柱或弱酸性陽離子交換樹脂柱。有機(jī)叔胺可為 三丁胺、三戊胺、三辛胺之一或其任意混合物，優(yōu)選三辛胺。有機(jī)胺的溶液可為三丁胺、三戊 胺、三辛胺之一或其任意混合物與甲基異丁基甲醇的混合溶液，優(yōu)選三辛胺與甲基異丁基 甲醇的混合溶液。 其純化精制工藝可以為如CN1887891A所公開的純化精制工藝，即將反應(yīng)液得到
的粗品，先置于大孔弱堿性丙烯酸系陰離子交換樹脂中，用純化水洗脫，洗脫液置于弱酸性
陽離子交換樹脂中，用純化水洗脫，收集洗脫液，經(jīng)后處理結(jié)晶純化得到四水合輔羧酶。 其純化精制工藝可以為將反應(yīng)液加入至與水可互溶的非水溶劑-水溶劑系統(tǒng)中
使析出固體，取固體用水溶解，置于大孔弱堿性丙烯酸系陰離子交換樹脂中，用純化水洗
脫，洗脫液置于弱酸性陽離子交換樹脂中，用純化水洗脫，收集洗脫液，經(jīng)后處理結(jié)晶純化
得到四水合輔羧酶。 所述的弱堿性陰離子交換樹脂和酸性陽離子交換樹脂為市售的商品樹脂，其具 體型號(hào)可根據(jù)生產(chǎn)商的不同而不同，如弱堿性陰離子交換樹脂的D301、D303、 D315、D335、 D311、D85、WA10、 IRA_76、 IRA-400型號(hào)；酸性陽離子交換樹脂的732、 WK40、 HZD_2、 HD-8型 號(hào)。樹脂柱的填充、預(yù)處理等為現(xiàn)有技術(shù)，一般按生產(chǎn)商提供的樹脂使用說明書方法處理即 可。 為得到更高純度和質(zhì)量要求的四水合輔羧酶，尤其是滿足某些特定制藥的要求， 如注射劑與口服劑，即使對(duì)原料純度要求如99%以上，其對(duì)原料的有關(guān)物質(zhì)等質(zhì)量指標(biāo)有 不同的要求，其純化精制工藝可以重復(fù)其中一或多個(gè)純化工藝步驟，如"反應(yīng)液加入至與水 可互溶的非水溶劑_水溶劑系統(tǒng)中使析出固體"、"固體用水溶解，加入至與水不互溶的有機(jī) 叔胺溶液，振搖，取水層"、"結(jié)晶"等工藝步驟可以為重復(fù)2次以上或其純化工藝步驟互相結(jié)合多次以達(dá)到特定制劑對(duì)原料的要求。
所述的四水合輔羧酶的制備方法，如將焦磷酸加入到反應(yīng)器中，10(TC充分?jǐn)嚢?1 2小時(shí)，加入維生素B"反應(yīng)0. 5 1. 5小時(shí)，再加熱到120°C ，加入五氧化二磷或三氯氧 磷、濃硫酸等，攪拌反應(yīng)至薄層色譜法(TLC)檢測(cè)原料點(diǎn)完全消失(展開劑如甲醇水 乙酸=2 : 1 : 0. 5)，冷卻至5(TC以下，加入純化水形成透明溶液。攪拌下將此溶液滴入 5°C以下無水乙醇或甲醇、丙酮、乙腈、異丙醇、四氫呋喃等溶液中，大量類白色固體析出，過
濾，取固體，或取固體溶于純化水中按以上操作重復(fù)一次，將所得固體溶于純化水中，三辛
胺-甲基異丁基甲醇溶液或三丁胺、三戊胺溶液萃取1 2次，取水溶液，裝入弱堿性陰離 子交換樹脂(如D301)柱中，純化水洗脫，將洗脫液直接引入強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂(如 732)柱，純化水洗脫，紫外檢測(cè)洗脫液出現(xiàn)熒光時(shí)開始接收洗脫液，接收洗脫液至紫外檢測(cè) 洗脫液沒有熒光時(shí)停止接收洗脫液。洗脫液減壓濃縮(溫度不高于35°C )，向濃縮液中滴 入1 4倍量的無水乙醇或甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、異丙醇、四氫呋喃，大量白色固體析出， 過濾、干燥得類白色固體，即得，或濃縮液處理析出白色固體適量水溶解，再次加入無水乙 醇或甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、異丙醇、四氫呋喃使白色固體析出，過濾、干燥，即得。
本發(fā)明所述焦磷酸與脫水劑在加熱條件下與維生素B工反應(yīng)的反應(yīng)終點(diǎn)判斷，可以 為上述的TLC法，也可以為其他合適的方法，如可以為CN1887891A所述的反應(yīng)至無游離氯 離子方法(反應(yīng)液用0. 1M硝酸銀溶液檢測(cè)不再有白色渾濁產(chǎn)生)。 本發(fā)明所述的經(jīng)過弱堿性陰離子交換樹脂柱和酸性陽離子交換樹脂柱純化的純
化水洗脫液，其檢測(cè)方法可以為"紫外光檢測(cè)有熒光"、高效液相測(cè)定法(HPLC)、紫外-可見
分光光度法、薄層色譜法等，比較簡(jiǎn)單的如"紫外光檢測(cè)有熒光"方法將洗脫液適量直接點(diǎn)
于硅膠G薄層板上，揮干溶劑，紫外燈下觀察是否有熒光。 本發(fā)明所制得的四水合輔羧酶質(zhì)量控制方法及要求，可以為 (1)、含量測(cè)定按照高效液相色譜法(中國(guó)藥典2005年版二部附錄VD)測(cè)定。 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)用氨基硅烷鍵合硅膠為填充劑，O. lmol/L的磷酸氫二
鉀水溶液(用磷酸調(diào)pH至7.4)-甲醇(57 : 43)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)234nm。理論塔板數(shù)
按四水合輔羧酶峰計(jì)算，應(yīng)不低于1500。 測(cè)定法精密稱取本品適量，用流動(dòng)相制成每lml中約含四水合輔羧酶200 y g的溶 液，作為供試品溶液；精密量取20 iU注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取四水合輔羧酶對(duì) 照品，同法測(cè)定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，即得。 按無水物計(jì)算，本品含C12H18N407P2S應(yīng)為99. 0% 101. 0%。 (2)、有關(guān)物質(zhì)取本品，加流動(dòng)相溶解并稀釋制成每lml中約含四水合輔羧酶 1.0mg的溶液，搖勻，作為供試品溶液；精密量取供試品溶液lml，置100ml量瓶中，加流動(dòng)相 稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照溶液。照含量測(cè)定項(xiàng)下的色譜條件，取對(duì)照溶液20 iU注入液 相色譜儀，調(diào)節(jié)儀器靈敏度，使主成分峰高約為記錄儀滿量程的20% 30%。再分別精密 量取對(duì)照溶液與供試品溶液各20ia，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時(shí) 間的2倍。供試品溶液的色譜圖中如顯雜質(zhì)峰，最大雜質(zhì)的峰面積不得過對(duì)照溶液的主峰 面積的一半(0. 5% )，各雜質(zhì)峰面積的和不得大于對(duì)照溶液的主峰面積(1. 0% )。
(3)、氯化物取本品0.25g，依法檢查(中國(guó)藥典2005年版二部附錄Vin A)，與標(biāo) 準(zhǔn)氯化鈉溶液5. Oml制成的對(duì)照液比較，不得更濃(0. 02% )。
5
(4)、游離磷酸準(zhǔn)確稱取本品0. 20g，加丙酮10ml，強(qiáng)力振搖2分鐘，過濾，濾液置 于25ml量瓶中，濾渣用丙酮5ml洗滌，洗液并入上述量瓶中；另取標(biāo)準(zhǔn)磷酸鹽溶液[準(zhǔn)確 稱取經(jīng)105t:干燥2小時(shí)的磷酸二氫鉀0. 42g，置1000ml量瓶中，加硫酸溶液(取3ml濃硫 酸用水稀釋到10ml溶液)10ml與水適量使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，臨用時(shí)用丙酮再稀釋 10倍]10ml，置另一 25ml量瓶中，加丙酮5ml ;上述兩量瓶中各加鉬酸銨硫酸試液2. 5ml與 1-氨基_2-萘酚-4-磺酸溶液(取無水亞硫酸鈉5g、亞硫酸氫鈉94. 3g與1-氨基-2-萘 酚_4-磺酸0. 7g，充分混合，臨用時(shí)取此混合物1. 5g，加水10ml使溶解，必要時(shí)濾過)lml， 加水至刻度，搖勻，在2(TC放置30分鐘，照紫外-可見分光光度法(中國(guó)藥典2005年版二 部附錄IV A)，在740nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，供試品溶液的吸光度不得大于對(duì)照溶液的吸 光度(0. 15% )。 (5)、水分取本品，按照水分測(cè)定法(中國(guó)藥典2005年版二部附錄VI11 M第一法 A)測(cè)定，含水分應(yīng)為14. 0% 16. 0%。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例只是更具體地說明本發(fā)明，本發(fā)明并不僅限于以下實(shí)施例的內(nèi)容。
實(shí)施例1 將60g焦磷酸加入到反應(yīng)器中，10(TC攪拌1小時(shí)，加入20g維生素Bl，再加熱到 12(TC反應(yīng)30分鐘使固體完全溶解，加入五氧化二磷20g，攪拌反應(yīng)至TLC檢測(cè)原料點(diǎn)完
全消失(展開劑甲醇水乙酸=2:i: o. 5)，加水、乙醇溶液沉淀得到大量類白色
固體析出，過濾。檢測(cè)得到輔羧酶與維生素B工單磷酸酯、維生素B工三磷酸酯的混合物，取 此混合物固體或溶于50ml純化水中按以上操作重復(fù)一次，將固體溶于100ml純化水中， 2X100ml70X三辛胺甲基異丁基甲醇溶液萃取兩次，取水溶液，裝入100ml弱堿性陰離子 交換樹脂(D301)柱中，純化水洗脫，將洗脫液直接引入1000ml強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂 (732)中，純化水洗脫，紫外檢測(cè)洗脫液出現(xiàn)熒光時(shí)開始接收洗脫液，接收洗脫液至紫外檢 測(cè)洗脫液沒有熒光時(shí)停止，洗脫液35t:減壓濃縮，干燥得類白色固體14. 8g，HPLC檢測(cè)含量 99. 68% (按干品計(jì)算)，單個(gè)雜質(zhì)0. 23% ，總雜質(zhì)0. 67% ，水分15. 04% ，氯化物、游離磷酸 指標(biāo)符合質(zhì)量要求，總收率45% ，經(jīng)^-NMR,C-NMR等結(jié)構(gòu)確證與文獻(xiàn)報(bào)道一致。
"H-畫R(400MHz， D20) S 2. 52(s，3H) ，2. 58(s，3H) ，3. 29 (m， 2H) ，4. 16(m，2H)， 5.52(s，2H)，7.87(s，1H)9.61(s，1H)。 13C-NMR(400MHz， D20) S 10. 92， 20. 77， 27. 39， 49. 72， 64. 48， 106. 30， 135. 63， 143. 09， 144. 04， 154. 72， 162. 75， 163. 03， mp222 225°C 。
實(shí)施例2 將90g焦磷酸加入到反應(yīng)器中，10(TC充分?jǐn)嚢?小時(shí)，加入20g維生素Bp加熱 到12(TC反應(yīng)30分鐘，加入五氧化二磷40g，攪拌至TLC檢測(cè)原料點(diǎn)完全消失，冷卻，滴加入 純化水使形成透明溶液，加水、乙醇溶液沉淀得到大量類白色固體析出，過濾，取固體，所得 固體溶于純化水中，50%三辛胺異丙醚溶液萃取兩次，取水溶液裝入弱堿性陰離子交換樹 脂(D301)柱中，純化水洗脫，將洗脫液直接引入強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂(732)中，純化水 洗脫，紫外檢測(cè)洗脫液出現(xiàn)熒光時(shí)開始接收洗脫液，接收洗脫液至紫外檢測(cè)洗脫液沒有熒 光時(shí)停止，洗脫液3(TC減壓濃縮，析出固體，過濾、干燥得類白色固體12. 2g，HPLC檢測(cè)含量 99. 74% (按干品計(jì)算)，單個(gè)雜質(zhì)O. 34%，總雜質(zhì)0. 74%，水分15. 60%，氯化物、游離磷酸指標(biāo)符合質(zhì)量要求。
實(shí)施例3 將70g焦磷酸加入到反應(yīng)器中，13(TC充分?jǐn)嚢?小時(shí)，加入20g維生素Bp再加熱 到14(TC反應(yīng)30分鐘，加入三氯氧磷30g，攪拌反應(yīng)至TLC檢測(cè)原料點(diǎn)完全消失，冷卻，滴加 入純化水使形成透明溶液，加水、乙醇溶液沉淀得到大量類白色固體析出，過濾，取固體，所 得固體溶于純化水中，三辛胺溶液萃取兩次，取水溶液裝入弱堿性陰離子交換樹脂(D301) 柱中，純化水洗脫，將洗脫液直接引入強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂(732)中，純化水洗脫，紫外 檢測(cè)洗脫液出現(xiàn)熒光時(shí)開始接收洗脫液，接收洗脫液至紫外檢測(cè)洗脫液沒有熒光時(shí)停止， 洗脫液3(TC減壓濃縮，析出固體，過濾、干燥得類白色固體9. 2g， HPLC檢測(cè)含量99. 54% (按干品計(jì)算)，單個(gè)雜質(zhì)0. 44% ，總雜質(zhì)0. 94% ，水分16. 60 % ，氯化物、游離磷酸指標(biāo)符合 質(zhì)量要求。
實(shí)施例4 將60kg焦磷酸加入到反應(yīng)器中，13(TC充分?jǐn)嚢?小時(shí)，分批加入20kg維生素 再加熱到14(TC反應(yīng)1小時(shí)，加入五氧化二磷20kg，攪拌反應(yīng)至TLC檢測(cè)原料點(diǎn)完全消失， 冷卻，加入純化水使形成透明溶液，沉淀得到固體或溶于適量純化水中按以上操作重復(fù)一 次，將固體溶于純化水中，70 %三辛胺-甲基異丁基甲醇溶液萃取兩次，取水溶液，裝入弱 堿性陰離子交換樹脂(D301)柱中，純化水洗脫，將洗脫液直接引入強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂 (732)中，純化水洗脫，紫外檢測(cè)洗脫液出現(xiàn)熒光時(shí)開始接收洗脫液至紫外檢測(cè)洗脫液沒有 熒光時(shí)停止，洗脫液35t:減壓濃縮，析出固體，過濾、干燥得類白色固體9. 5kg，HPLC檢測(cè)含 量99. 22 % (按干品計(jì)算)，單個(gè)雜質(zhì)0. 45 % ，總雜質(zhì)0. 67 % ，水分16. 04% ，氯化物、游離磷
酸指標(biāo)符合質(zhì)量要求。
實(shí)施例5 將60g焦磷酸加入到反應(yīng)器中，14(TC充分?jǐn)嚢?小時(shí)，加入20g維生素Bp再加 熱到16(TC反應(yīng)30分鐘，加入三氯氧磷35g，攪拌反應(yīng)至TLC檢測(cè)原料點(diǎn)完全消失，冷卻， 滴加入純化水使形成透明溶液，加水、乙醇溶液沉淀得到固體，或溶于純化水中按以上操作 重復(fù)一次，所得固體溶于純化水中，80%三丁胺甲基異丁基甲醇溶液萃取1次，取水溶液裝 入弱堿性陰離子交換樹脂(D303)柱中，純化水洗脫，將洗脫液直接引入強(qiáng)酸性陽離子交換 樹脂(732)中，純化水洗脫，紫外檢測(cè)洗脫液出現(xiàn)熒光時(shí)開始接收洗脫液，接收洗脫液至 紫外檢測(cè)洗脫液沒有熒光時(shí)停止，洗脫液3(TC減壓濃縮，析出固體，過濾、干燥得類白色固 體7.2g， HPLC檢測(cè)含量99. 11% (按干品計(jì)算)，單個(gè)雜質(zhì)0.35%，總雜質(zhì)0.84%，水分 16.20%，氯化物、游離磷酸指標(biāo)符合質(zhì)量要求。
實(shí)施例6 將80g焦磷酸加入到反應(yīng)器中，13(TC充分?jǐn)嚢?小時(shí)，加入20g維生素Bp再加熱 到14(TC反應(yīng)30分鐘，加入五氧化二磷35g，攪拌反應(yīng)至TLC檢測(cè)原料點(diǎn)完全消失，冷卻，加 入純化水使形成透明溶液，加水、乙醇溶液沉淀得到固體。溶于純化水中，水溶液用70 %三 辛胺甲基異丁基甲醇溶液萃取兩次，取水溶液，裝入弱堿性陰離子交換樹脂(D301)柱中， 純化水洗脫，將洗脫液直接引入強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂(732)中，純化水洗脫，紫外檢測(cè)洗 脫液出現(xiàn)熒光時(shí)開始接收洗脫液，接收洗脫液至紫外檢測(cè)洗脫液沒有熒光時(shí)停止，洗脫液 35t:減壓濃縮，析出固體，過濾、干燥得類白色固體7.5g， HPLC檢測(cè)含量99. 12% (按干品
7計(jì)算)，單個(gè)雜質(zhì)0. 46% ，總雜質(zhì)0. 87% ，水分16. 22% ，氯化物、游離磷酸指標(biāo)符合質(zhì)量要 求。 實(shí)施例7 將650g焦磷酸加入到反應(yīng)器中，10(TC充分?jǐn)嚢?小時(shí)，分批加入200g維生素 Bp再加熱到12(TC反應(yīng)30分鐘，加入五氧化二磷230g，攪拌反應(yīng)至TLC檢測(cè)原料點(diǎn)完全消 失，冷卻，加入純化水使形成透明溶液，加水、乙醇溶液沉淀得到固體，產(chǎn)物溶于純化水中， 用75%三辛胺甲基異丁基甲醇溶液萃取，取水溶液，裝入弱堿性陰離子交換樹脂(D303)柱 中，純化水洗脫，將洗脫液直接引入1000ml強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂(WK40)中，純化水洗 脫，紫外檢測(cè)洗脫液出現(xiàn)熒光時(shí)開始接收洗脫液，洗脫液至紫外檢測(cè)洗脫液沒有熒光時(shí)停 止接收，洗脫液3(TC減壓濃縮，析出固體，過濾，干燥得類白色固體73. 6g， HPLC檢測(cè)含量 99. 11 % (按干品計(jì)算)，單個(gè)雜質(zhì)0. 43 % ，總雜質(zhì)0. 75 % ，水分15. 64% ，氯化物、游離磷酸 指標(biāo)符合質(zhì)量要求，經(jīng)結(jié)構(gòu)確證與文獻(xiàn)報(bào)道一致。
實(shí)施例8 將600g焦磷酸加入到反應(yīng)器中，10(TC充分?jǐn)嚢?小時(shí)，加入200g維生素Bp再加 熱到12(TC反應(yīng)30分鐘，加入五氧化二磷200g，攪拌反應(yīng)至TLC檢測(cè)原料點(diǎn)完全消失，冷卻 至40°C ，加入純化水使形成透明溶液，加水、乙醇溶液沉淀得到析出產(chǎn)物，過濾，取固體溶于 純化水中按以上操作重復(fù)一次，將所得固體溶于純化水中，水溶液裝入弱堿性陰離子交換 樹脂(D315)柱中，純化水洗脫，將洗脫液減壓濃縮后引入弱酸性陽離子交換樹脂(HZD-2) 中，純化水洗脫，紫外檢測(cè)洗脫液出現(xiàn)熒光時(shí)開始接收洗脫液至紫外檢測(cè)洗脫液沒有熒光 時(shí)停止，洗脫液35t:減壓濃縮，析出白色固體，過濾，干燥得類白色固體93. 7g，HPLC檢測(cè)含 量99. 18 % (按干品計(jì)算)，單個(gè)雜質(zhì)0. 53 % ，總雜質(zhì)0. 87 % ，水分15. 04% ，氯化物、游離磷 酸指標(biāo)符合質(zhì)量要求。
實(shí)施例9 將60g焦磷酸加入到反應(yīng)器中，10(TC充分?jǐn)嚢?小時(shí)，加入20g維生素Bp再加 熱到12(TC反應(yīng)30分鐘，加入三氯氧磷20g，攪拌反應(yīng)至TLC檢測(cè)原料點(diǎn)完全消失，冷卻 至30°C ，滴加入純化水使形成透明溶液，加水、乙醇溶液沉淀得到析出產(chǎn)物，過濾，取固體 溶于純化水中，按以上操作重復(fù)一次，所得固體溶于純化水中，裝入弱堿性陰離子交換樹脂 (D315)柱，純化水洗脫，將洗脫液直接引入弱酸性陽離子交換樹脂(HZD-2)，純化水洗脫， 紫外檢測(cè)洗脫液出現(xiàn)熒光時(shí)開始接收洗脫液至紫外檢測(cè)洗脫液沒有熒光時(shí)停止，洗脫液 35 °C減壓濃縮，析出固體，過濾，干燥得類白色固體11. 3g， HPLC檢測(cè)含量99. 01 % (按干品 計(jì)算)，單個(gè)雜質(zhì)0. 66 % ，總雜質(zhì)0. 85% ，水分15. 04% ，氯化物、游離磷酸指標(biāo)符合質(zhì)量要 求。
權(quán)利要求
一種四水合輔羧酶的制備方法，其特征在于所述制備方法包括以下步驟通過焦磷酸與脫水劑在加熱條件下與維生素B1反應(yīng)，所述的脫水劑為五氧化二磷、三氯氧磷、濃硫酸之一或其任意混合物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的四水合輔羧酶的制備方法，其特征在于所述的維生素Bp脫水劑、焦磷酸的質(zhì)量比為i : o.5 3 : 2 10，優(yōu)選i : i 3 : 3 io。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的四水合輔羧酶的制備方法，其特征在于所述的脫水劑為五氧化二磷。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的四水合輔羧酶的制備方法，其特征在于所述的加熱 條件為70°C 200。C，優(yōu)選100°C 160°C。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的四水合輔羧酶的制備方法，其特征在于所述制備方法還包括將四水合輔羧酶進(jìn)行精制的步驟，所述步驟為將四水合輔羧酶用水溶解，加入至與水不互溶的有機(jī)叔胺溶液，振搖，取水層，加至弱堿性陰離子交換樹脂柱，純化水洗脫，接收洗脫 液，洗脫液加至酸性陽離子交換樹脂柱，水洗脫，接收洗脫液，合并紫外光檢測(cè)有熒光部分， 濃縮，結(jié)晶，得到四水合輔羧酶。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的四水合輔羧酶的制備方法，其特征在于所述的有機(jī)叔胺為三丁胺、三戊胺、三辛胺之一或其任意混合物，優(yōu)選三辛胺。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的四水合輔羧酶的制備方法，其特征在于所述的與水不互溶的有機(jī)叔胺溶液為三丁胺、三戊胺、三辛胺之一或其任意混合物與甲基異丁基甲醇的混合 溶液，優(yōu)選三辛胺與甲基異丁基甲醇的混合溶液。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的四水合輔羧酶的制備方法，其特征在于所述的酸性陽離子交換樹脂柱為強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂柱或弱酸性陽離子交換樹脂柱。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種四水合輔羧酶的制備方法，主要特征為焦磷酸與脫水劑在加熱條件下與維生素B1進(jìn)行反應(yīng)，得到四水合輔羧酶。該方法具有提高產(chǎn)品收率、降低生產(chǎn)成本、提高產(chǎn)品質(zhì)量、降低環(huán)境污染等優(yōu)勢(shì)。
文檔編號(hào)C07F9/6558GK101787048SQ20101014495
公開日2010年7月28日 申請(qǐng)日期2010年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月23日
發(fā)明者劉烽, 常迪, 張勇, 曹志華, 胡軍 申請(qǐng)人:北京京衛(wèi)信康醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司