專利名稱：：清蛋白融合蛋白的制作方法光盤中的序列表的介紹本申請涉及下文列出的“序列表”，它作為電子文件在標(biāo)有“拷貝1”、“拷貝2”和“拷貝3”的三張相同的光盤(CD-R)上提供。這些光盤每個都含有文件“PF612PCTSL.txt”(929,048個字節(jié)，建于2005年2月7日)，將其完整引入作為參考。
背景技術(shù)：
：本發(fā)明主要涉及與清蛋白或清蛋白的片段或變體融合的治療性蛋白質(zhì)(包括但不限于至少一種多肽、抗體、肽或其片段和變體)。本發(fā)明涵蓋編碼治療性清蛋白融合蛋白的多核苷酸、治療性清蛋白融合蛋白、組合物、藥物組合物、制劑和試劑盒。本發(fā)明還涵蓋經(jīng)過編碼治療性清蛋白融合蛋白的多核苷酸轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，以及使用這些多核苷酸和/或宿主細(xì)胞來生成本發(fā)明清蛋白融合蛋白的方法。人血清清蛋白(HSA或HA)，其成熟形式具有585個氨基酸的一種蛋白質(zhì)(如表1(SEQIDNO1)所示)，負(fù)責(zé)血清滲透壓的重大比例，而且還作為內(nèi)源和外源配體的載體而起作用。目前，臨床使用的HA是從人血中提取而生產(chǎn)的。在微生物中生產(chǎn)重組HA(rHA)已在EP330451和EP361991中公開。天然狀態(tài)或重組生成的治療性蛋白質(zhì)，諸如干擾素和生長激素，通常是呈現(xiàn)短暫保存期的不穩(wěn)定分子，特別是在水溶液中配制時。在配制用于施用時，這些分子的不穩(wěn)定性提示很多分子必須凍干并在貯藏時一直冷藏，因而使得這些分子難以運(yùn)輸和/或貯藏。當(dāng)藥學(xué)制劑必須在醫(yī)院環(huán)境以外貯藏和分配時，貯藏問題就顯得特別尖銳。對于不穩(wěn)定蛋白質(zhì)分子的貯藏問題的實(shí)用解決方案少有提出。因此，需要穩(wěn)定的、持久的、容易分配的蛋白質(zhì)治療性分子制劑，優(yōu)選需要最小限度貯藏后操作的簡單制劑。體內(nèi)施用后，天然狀態(tài)或重組生成的治療性蛋白質(zhì)，諸如干擾素和生長激素，由于從血流中迅速清除從而呈現(xiàn)短暫的血漿穩(wěn)定性。因此，這些蛋白質(zhì)提供的治療效果也是短期的。因此，為了維持它們的期望體內(nèi)治療效果，這些蛋白質(zhì)從血液中迅速清除提示必須以更高頻率或更高劑量施用治療性分子。然而，增加施用治療性蛋白質(zhì)的服藥方案常常導(dǎo)致患者的注射部位的反應(yīng)、副作用、和毒性增加。類似的，以更高劑量施用治療性蛋白質(zhì)也常常導(dǎo)致患者的毒性和副作用增加。已提議的提高治療性分子的血漿穩(wěn)定性的少數(shù)實(shí)用解決方案，包括化學(xué)綴合，為患者帶來有限的受益。通常，在多數(shù)情況中，這些化學(xué)修飾的治療性分子仍以頻繁的服藥方案施用，在患者中保持嚴(yán)重的注射部位反應(yīng)、副作用、和毒性。因此，需要穩(wěn)定形式的治療性分子，它能在體內(nèi)保持比單獨(dú)的天然狀態(tài)或重組生成的治療性蛋白質(zhì)更高的血漿穩(wěn)定性并可以較低頻率施用，從而降低對患者的潛在副作用。發(fā)明概述本發(fā)明涵蓋包含與清蛋白或清蛋白的片段(部分)或變體融合的治療性蛋白質(zhì)(如多肽、抗體、或肽或其片段或變體)的清蛋白融合蛋白。本發(fā)明還涵蓋包含編碼與清蛋白或清蛋白的片段(部分)或變體融合的治療性蛋白質(zhì)(如多肽、抗體、或肽或其片段或變體)的核酸分子或由其組成的多核苷酸。本發(fā)明還涵蓋包含編碼如下蛋白質(zhì)的核苷酸分子或由其組成的多核苷酸，該蛋白質(zhì)包含與清蛋白或清蛋白的片段(部分)或變體融合的治療性蛋白質(zhì)(如多肽、抗體、或肽或其片段或變體)，該清蛋白或清蛋白的片段(部分)或變體足以延長治療性蛋白質(zhì)的保存期，與其未融合狀態(tài)相比提高治療性蛋白質(zhì)的血漿穩(wěn)定性，和/或在體外和/或在體內(nèi)穩(wěn)定溶液中(或藥物組合物中)的治療性蛋白質(zhì)和/或其活性。本發(fā)明還涵蓋由本發(fā)明多核苷酸編碼的清蛋白融合蛋白，以及經(jīng)過本發(fā)明多核苷酸轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，及使用本發(fā)明的這些多核苷酸和/或宿主細(xì)胞和生成本發(fā)明的清蛋白融合蛋白的方法。在本發(fā)明的一個優(yōu)選方面，清蛋白融合蛋白包括但不限于表2中所描述的那些蛋白質(zhì)和編碼此類蛋白質(zhì)的多核苷酸。本發(fā)明還涵蓋包含本發(fā)明清蛋白融合蛋白和制藥學(xué)可接受稀釋劑或載體的藥學(xué)制劑。這些制劑可裝在試劑盒或容器中。該試劑盒或容器可與關(guān)于該治療性蛋白質(zhì)的延長保存期的說明書一起包裝。這些制劑可用于在患者中治療、預(yù)防、改善或診斷疾病或疾病癥狀的方法，包括對患者施用藥學(xué)制劑的步驟，其中患者優(yōu)選哺乳動物，最優(yōu)選人類。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明涵蓋預(yù)防、治療或改善疾病或紊亂的方法。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涵蓋治療表1“優(yōu)選適應(yīng)癥Y”列中所列出的疾病或紊亂的方法，包括以有效治療、預(yù)防或改善疾病或紊亂的數(shù)量對需要這種治療、預(yù)防或改善的患者施用本發(fā)明的清蛋白融合蛋白，該清蛋白融合蛋白包含與表1“治療性蛋白質(zhì)X”列(與表1“優(yōu)選適應(yīng)癥Y”列中所列出的待治療疾病或紊亂位于同一行)中所公開的治療性蛋白質(zhì)(或其片段或變體)對應(yīng)的治療性蛋白質(zhì)或其部分。在一個實(shí)施方案中，表1或2中所描述的清蛋白融合蛋白具有延長的保存期。在另一個實(shí)施方案中，表1或2中所描述的清蛋白融合蛋白比表1中所描述的相應(yīng)未融合治療性分子更加穩(wěn)定。本發(fā)明還包括修飾后含有本發(fā)明核酸分子(包括但不限于表1和2中所描述的多核苷酸)的轉(zhuǎn)基因生物體，優(yōu)選修飾后表達(dá)本發(fā)明清蛋白融合蛋白的轉(zhuǎn)基因生物體。附圖簡述圖1A-D顯示了人清蛋白的成熟形式的氨基酸序列(SEQIDNO1)和編碼它的多核苷酸(SEQIDNO2)。SEQIDNO2的核苷酸1-1755編碼人清蛋白的成熟形式(SEQIDNO1)。圖2顯示了pPPC0005克隆載體ATCC保藏物PTA-3278的限制性圖譜。圖3顯示了pSAC35釀酒酵母表達(dá)載體的限制性圖譜(Sleep等人，BioTechnology842，1990)。圖4顯示了由CID2011和2053中包含的DNA所編碼的IFNb清蛋白融合蛋白的各種稀釋度在ISRE-SEAP/293F報道細(xì)胞中對SEAP活性的影響(見實(shí)施例76)。將蛋白質(zhì)在DMEM/10％FBS中連續(xù)稀釋，從5e-7到1e-14g/ml，并用于處理ISRE-SEAP/293F報道細(xì)胞。24小時后由報道細(xì)胞取出上清液并測定SEAP活性。從三個穩(wěn)定克隆293F/#2011、CHO/#2011和NSO/#2053純化IFNb清蛋白融合蛋白。哺乳動物衍生的IFNb，Avonex來自Biogen且據(jù)報道有2.0e5IU/μg的比活。圖5比較了由CID3165編碼的IFN清蛋白融合蛋白(CID3165蛋白質(zhì))和重組蛋白IFNa(rIFNa)對Hs294T黑素瘤細(xì)胞的抗增殖活性。將細(xì)胞在含不同濃度CID3165蛋白質(zhì)或rIFNa的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，并在培養(yǎng)3天后通過BrdU摻入來測量增殖情況。CID3165蛋白質(zhì)在濃度高于10ng/ml時對細(xì)胞增殖引起了可測量的抑制作用，在約200ng/ml時達(dá)到了50％抑制。(■)＝CID3165蛋白質(zhì)，(◆)＝rIFNa。圖6顯示了IFNa清蛋白融合蛋白的各種稀釋度在ISRE-SEAP/293F報道細(xì)胞中對SEAP活性的影響。測試了在清蛋白的上游融合IFNa的一種制備物(◆)以及在清蛋白的下游融合IFNa的兩種不同制備物(●)和(◆)。圖7顯示了由構(gòu)建物2249中包含的DNA所編碼的IFNa清蛋白融合蛋白(CID2249蛋白質(zhì))的時間和劑量在經(jīng)過處理的猴子中對OAS(p41)mRNA水平的影響(見實(shí)施例78)。每個時間點(diǎn)第一條為賦形劑對照，第二條為第一天靜脈內(nèi)注射30μg/kgCID2249蛋白質(zhì)，第三條為第一天皮下注射30μg/kgCID2249蛋白質(zhì)，第四條為第一天皮下注射300μg/kgCID2249蛋白質(zhì)，第五條為第一、三、五天皮下注射40μg/kg重組IFNa。圖8顯示了由構(gòu)建物CID3691和3618中包含的DNA所編碼的BNP清蛋白融合蛋白(CID3691和3618蛋白質(zhì))在NPR-A/293F報道細(xì)胞中對激活cGMP形成的劑量-應(yīng)答關(guān)系(見實(shí)施例80和81)。測試了重組BNP(■)以及在清蛋白的上游融合BNP的兩種不同制備物(□)和(●)。圖9顯示了BNP清蛋白融合蛋白在自發(fā)性高血壓大鼠中對平均動脈壓的影響(見實(shí)施例80)。賦形劑(□)、重組BNP蛋白(●)、或BNP清蛋白融合蛋白(○)通過尾部靜脈注射進(jìn)行投遞。收縮壓和舒張壓通過套尾法(cuff-tail)進(jìn)行記錄。圖10顯示了11-12周齡的雄性C57/BL6小鼠在靜脈內(nèi)注射重組BNP蛋白質(zhì)(●)或BNP清蛋白融合蛋白(○)后的血漿cGMP水平(見實(shí)施例80)。在靜脈內(nèi)注射后的幾個時間點(diǎn)收集尾部血液制備血漿來測定cGMP水平。圖11顯示了禁食的約8周齡糖尿病db/db小鼠中在單次施用串聯(lián)GLP-1(7-36A8G)2x-HSA融合物(CID3610)(◇)、單體GLP-1(7-36A8G)-HSA融合物(Δ)、或單獨(dú)的HSA(●)后24小時的血糖水平。血糖水平通過口服葡萄糖耐受測試法進(jìn)行測量。在禁食的約8周齡糖尿病db/db小鼠中，在單次施用后24小時，串聯(lián)GLP-1(7-36A8G)2x-HAS融合物(CID3610)(◇)比單體GLP-1(7-36A8G)-HSA融合物(Δ)具有意想不到的更有效的使葡萄糖正?；幕钚?glucose-normalizingactivity)。發(fā)明詳述定義提供下面的定義是為了便于理解貫穿本說明書所使用的某些術(shù)語。在用于本文時，“多核苷酸”指具有編碼如下融合蛋白的核苷酸序列的核酸分子，該融合蛋白包含以相同讀碼框與至少一個治療性蛋白質(zhì)X(或其片段或變體)連接的至少一個清蛋白(或其片段或變體)分子或由其組成；具有編碼如下融合蛋白的核苷酸序列的核酸分子，該融合蛋白包含SEQIDNOY(如表2第6列所述)的氨基酸序列或其片段或變體或由其組成；具有包含SEQIDNOX所示序列或由其組成的核苷酸序列的核酸分子；具有編碼如下融合蛋白的核苷酸序列的核酸分子，該融合蛋白包含SEQIDNOZ的氨基酸序列或由其組成；具有編碼如表2或?qū)嵤├兴錾傻谋景l(fā)明清蛋白融合蛋白的核苷酸序列的核酸分子；具有編碼本發(fā)明治療性清蛋白融合蛋白的核苷酸序列的核酸分子；具有表2中描述的清蛋白融合構(gòu)建物所含有的核苷酸序列的核酸分子；或者具有于ATCC保藏的清蛋白融合構(gòu)建物(如表3所述)所含有的核苷酸序列的核酸分子。在用于本文時，“清蛋白融合構(gòu)建物”指包含以相同讀碼框與編碼至少一個分子的治療性蛋白質(zhì)(或其片段或變體)的至少一段多核苷酸連接的編碼至少一個分子的清蛋白(或其片段或變體)的多核苷酸或由其組成的核酸分子；包含以相同讀碼框與編碼至少一個分子的如表2或?qū)嵤├兴霎a(chǎn)生的治療性蛋白質(zhì)(或其片段或變體)的至少一段多核苷酸連接的編碼至少一個分子的清蛋白(或其片段或變體)的多核苷酸或由其組成的核酸分子；或者包含以相同讀碼框與編碼至少一個分子的治療性蛋白質(zhì)(或其片段或變體)的至少一段多核苷酸連接的編碼至少一個分子的清蛋白(或其片段或變體)的多核苷酸或由其組成的核苷酸分子，它還包含例如一種或多種下列元件(1)功能性自主復(fù)制載體(包括但并不限于穿梭載體、表達(dá)載體、整合載體、和/或復(fù)制系統(tǒng))，(2)轉(zhuǎn)錄起始區(qū)(例如啟動子區(qū)，諸如例如可調(diào)節(jié)或可誘導(dǎo)的啟動子、組成型啟動子)，(3)轉(zhuǎn)錄終止區(qū)，(4)前導(dǎo)序列，和(5)選擇標(biāo)記。編碼治療性蛋白質(zhì)和清蛋白的多核苷酸，一旦成為清蛋白融合構(gòu)建物的一部分，每個可稱為該清蛋白融合構(gòu)建物的“部分”、“區(qū)域”或“模塊”。本發(fā)明主要涉及編碼清蛋白融合蛋白的多核苷酸；清蛋白融合蛋白；以及使用清蛋白融合蛋白或編碼清蛋白融合蛋白的多核苷酸來治療、預(yù)防或改善疾病或紊亂的方法。在用于本文時，“清蛋白融合蛋白”指通過將至少一個清蛋白(或其片段或變體)分子與至少一個治療性蛋白質(zhì)(或其片段或變體)分子融合而形成的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白包含治療性蛋白質(zhì)的至少一個片段或變體以及人血清清蛋白的至少一個片段或變體，它們是通過基因融合相連的(即清蛋白融合蛋白是通過翻譯如下核酸產(chǎn)生的，其中編碼完整或部分治療性蛋白質(zhì)的多核苷酸以相同讀碼框與編碼完整或部分清蛋白的多核苷酸相連接)。治療性蛋白質(zhì)和清蛋白蛋白質(zhì)，一旦成為清蛋白融合蛋白的一部分，每個可稱為該清蛋白融合蛋白的“部分”、“區(qū)域”或“模塊”(例如“治療性蛋白質(zhì)部分”或“清蛋白蛋白質(zhì)部分”)。在高度優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白包含治療性蛋白質(zhì)X或其片段或變體(包括但不限于治療性蛋白質(zhì)X的成熟形式)的至少一個分子以及清蛋白或其片段或變體(包括但不限于清蛋白的成熟形式)的至少一個分子。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白由宿主細(xì)胞加工并分泌到周圍的培養(yǎng)基中。在用于表達(dá)的宿主的分泌途徑中發(fā)生的對新生清蛋白融合蛋白的加工可包括但不限于信號肽切割、二硫鍵形成、正確折疊、碳水化合物的添加和加工(諸如例如N-和O-連接的糖基化)、特異性蛋白水解切割、和組裝成多聚體蛋白質(zhì)。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白優(yōu)選是經(jīng)過加工形式的。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，“清蛋白融合蛋白的經(jīng)過加工形式”指經(jīng)過N-末端信號肽切割的清蛋白融合蛋白產(chǎn)物，本文還稱為“成熟的清蛋白融合蛋白”。在幾種情況中，具有代表性的含有本發(fā)明清蛋白融合構(gòu)建物的克隆保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(本文稱為“ATCC_”)。此外，通過本領(lǐng)域已知的和本文其它地方描述的技術(shù)有可能從保藏物重新得到指定的清蛋白融合構(gòu)建物。ATCC_位于美國維吉尼亞州20110-2209馬納薩斯鎮(zhèn)大學(xué)路10801號(10801UniversityBoulevard，Manassas，Virginia20110-2209，USA)。ATCC_保藏物是根據(jù)布達(dá)佩斯條約關(guān)于用于專利程序的國際公認(rèn)的微生物保藏條款生成的。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了編碼包含治療性蛋白質(zhì)和血清清蛋白蛋白質(zhì)或由其組成的清蛋白融合蛋白的多核苷酸。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含治療性蛋白質(zhì)和血清清蛋白蛋白質(zhì)或由其組成的清蛋白融合蛋白。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了由表2中描述的多核苷酸所編碼的包含治療性蛋白質(zhì)和血清清蛋白蛋白質(zhì)或由其組成的清蛋白融合蛋白。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了編碼其序列顯示于表2中SEQIDNOY的清蛋白融合蛋白的多核苷酸。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含治療性蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性和/或治療性活性片段和血清清蛋白蛋白質(zhì)或由其組成的清蛋白融合蛋白。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含治療性蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性和/或治療性活性變體和血清清蛋白蛋白質(zhì)或由其組成的清蛋白融合蛋白。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，清蛋白融合蛋白的血清清蛋白蛋白質(zhì)成分是血清清蛋白的成熟部分。本發(fā)明還涵蓋編碼這些清蛋白融合蛋白的多核苷酸。在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含治療性蛋白質(zhì)和血清清蛋白的生物學(xué)活性和/或治療性活性片段或由其組成的清蛋白融合蛋白。在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含治療性蛋白質(zhì)和血清清蛋白的生物學(xué)活性和/或治療性活性變體或由其組成的清蛋白融合蛋白。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分是治療性蛋白質(zhì)的成熟部分。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分是治療性蛋白質(zhì)的胞外可溶性結(jié)構(gòu)域。在候選實(shí)施方案中，清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分是治療性蛋白質(zhì)的活性形式。本發(fā)明還涵蓋編碼這些清蛋白融合蛋白的多核苷酸。在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含治療性蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性和/或治療性活性片段或變體和血清清蛋白的生物學(xué)活性和/或治療性活性片段或變體或由其組成的清蛋白融合蛋白。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含治療性蛋白質(zhì)的成熟部分和血清清蛋白的成熟部分或由其組成的清蛋白融合蛋白。本發(fā)明還涵蓋編碼這些清蛋白融合蛋白的多核苷酸。治療性蛋白質(zhì)如上所述，本發(fā)明的多核苷酸編碼包含治療性蛋白質(zhì)的至少一個片段或變體和人血清清蛋白的至少一個片段或變體或由其組成的蛋白質(zhì)，所述片段或變體是優(yōu)選通過基因融合而彼此相連的。另一個實(shí)施方案包括編碼包含治療性蛋白質(zhì)的至少一個片段或變體和人血清清蛋白的至少一個片段或變體或由其組成的蛋白質(zhì)的多核苷酸，所述片段或變體是通過化學(xué)綴合而彼此相連的。在用于本文時，“治療性蛋白質(zhì)”指具有一種或多種治療性和/或生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)、多肽、抗體、肽或其片段或變體。本發(fā)明所涵蓋的治療性蛋白質(zhì)包括但不限于蛋白質(zhì)、多肽、肽、抗體、和生物制品。(術(shù)語肽、蛋白質(zhì)、和多肽在本文中可互換使用)。明確設(shè)想了術(shù)語“治療性蛋白質(zhì)”涵蓋抗體及其片段和變體。因此，本發(fā)明的蛋白質(zhì)可含有治療性蛋白質(zhì)的至少一個片段或變體和/或抗體的至少一個片段或變體。此外，術(shù)語“治療性蛋白質(zhì)”可指治療性蛋白質(zhì)的內(nèi)源性或天然存在的關(guān)聯(lián)物。呈現(xiàn)“治療性活性”的多肽或具有“治療性活性”的蛋白質(zhì)是指擁有與治療性蛋白質(zhì)諸如本文描述的或本領(lǐng)域其它途徑已知的一種或多種治療性蛋白質(zhì)有關(guān)的一種或多種已知生物學(xué)和/或治療性活性的多肽。作為非限制性實(shí)例，“治療性蛋白質(zhì)”指可用于治療、預(yù)防或改善疾病、狀況或紊亂的蛋白質(zhì)。作為非限制性實(shí)例，“治療性蛋白質(zhì)”可以是與特定細(xì)胞類型(正常的(如淋巴細(xì)胞)或異常的(如癌細(xì)胞))特異結(jié)合并因此可用于將化合物(藥物或胞毒劑)特異靶向該細(xì)胞類型的蛋白質(zhì)。例如，可由本發(fā)明的清蛋白融合蛋白包含的“治療性蛋白質(zhì)”部分的不完全列表包括但并不限于GLP-1、GLP-2、PACAP-27、PACAP-28、VIP、CD4M33、分泌素、胰高血糖素樣肽、泌酸調(diào)節(jié)素、PHM、IFNα、IFNβ、ANP、BNP、NGF、BDNF、GDNF、和促生長素抑制素。干擾素雜化物(hybrid)也可融合于清蛋白的氨基或羧基末端以形成干擾素雜化物清蛋白融合蛋白。干擾素雜化物清蛋白融合蛋白可具有得到增強(qiáng)或者抑制的干擾素活性，諸如抗病毒應(yīng)答、細(xì)胞生長的調(diào)控、和免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)(Lebleu等人，PNASUSA733107-3111，1976；Gresser等人，Nature251543-545，1974；及Johnson，TexasReportsBiolMed35357-369，1977)。每種干擾素雜化物清蛋白融合蛋白可用于治療、預(yù)防、或改善病毒感染(如肝炎(如HCV)；或HIV)、多發(fā)性硬化癥、或癌癥。在一個實(shí)施方案中，干擾素雜化物清蛋白融合蛋白的干擾素雜化物部分包含干擾素α-干擾素α雜化物(在本文中稱為α-α雜化物)。例如，干擾素雜化物清蛋白融合蛋白的α-α雜化物部分包含與干擾素αD融合的干擾素αA或由其組成。在另一個實(shí)施方案中，A/D雜化物在共有的BglII限制性位點(diǎn)處與干擾素αD融合，其中A/D雜化物的N-末端部分與干擾素αA的氨基酸1-62對應(yīng)而C-末端部分與干擾素αD的氨基酸64-166對應(yīng)。例如，此A/D雜化物將包含氨基酸序列CDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRX1ISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLHEMIQQIFNLFTTKDSSAAWDEDLLDKFCTELYQQLNDLEACVMQEERVGETPLMNX2DSILAVKKYFRRITLYLTEKKYSPCAWEVVRAEIMRSLSLSTNLQERLRRKE(SEQIDNO99)，其中X1是R或K而X2是A或V(例如見構(gòu)建物ID#2875)。在另一個實(shí)施方案中，A/D雜化物在共有的PvuIII限制性位點(diǎn)處融合，其中A/D雜化物的N-末端部分與干擾素αA的氨基酸1-91對應(yīng)而C-末端部分與干擾素αD氨基酸93-166對應(yīng)。例如，此A/D雜化物將包含氨基酸序列CDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRX1ISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLHEMIQQIFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACVMQEERVGETPLMNX2DSILAVKKYFRRITLYLTEKKYSPCAWEVVRAEIMRSLSLSTNLQERLRRKE(SEQIDNO100)，其中X1是R或K而第二個X2是A或V(例如見構(gòu)建物ID#2872)。這些雜化物在美國專利號4,414,510中有進(jìn)一步的描述，將其完整引入本文作為參考。在另一個實(shí)施方案中，干擾素雜化物清蛋白融合蛋白的α-α雜化物部分包含與干擾素αF融合的干擾素αA或由其組成。在另一個實(shí)施方案中，A/F雜化物在共有的PvuIII限制性位點(diǎn)處融合，其中A/F雜化物的N-末端部分與干擾素αA的氨基酸1-91對應(yīng)而C-末端部分與干擾素αF的氨基酸93-166對應(yīng)。例如，此A/F雜化物將包含氨基酸序列CDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRXISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLHEMIQQIFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDMEACVIQEVGVEETPLMNVDSILAVKKYFQRITLYLTEKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSLSKIFQERLRRKE(SEQIDNO101)，其中X或是R或是K(例如見構(gòu)建物ID#2874)。這些雜化物在美國專利號4,414,510中有進(jìn)一步的描述，將其完整引入本文作為參考。在另一個實(shí)施方案中，干擾素雜化物清蛋白融合蛋白的α-α雜化物部分包含與干擾素αB融合的干擾素αA或由其組成。在另一個實(shí)施方案中，A/B雜化物在共有的PvuIII限制性位點(diǎn)處融合，其中A/B雜化物的N-末端部分與干擾素αA的氨基酸1-91對應(yīng)而C-末端部分與干擾素αB的氨基酸93-166對應(yīng)。例如，此A/B雜化物將包含氨基酸序列CDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRX1ISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLHEMIQQIFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEX2X3X4X5QEVGVIESPLMYEDSILAVRKYFQRITLYLTEKKYSSCAWEVVRAEIMRSFSLSINLQKRLKSKE(SEQIDNO102)，其中X1是R或K而X2到X5是SCVM或VLCD(例如見構(gòu)建物ID#2873)。這些雜化物在美國專利號4,414,510中有進(jìn)一步的描述，將其完整引入本文作為參考。在另一個實(shí)施方案中，干擾素雜化物清蛋白融合蛋白的干擾素雜化物部分包含干擾素β-干擾素α雜化物(在本文中稱為β-α雜化物)。例如，干擾素雜化物清蛋白融合蛋白的β-α雜化物部分包含與干擾素αD(在本文中稱為干擾素α-1)融合的干擾素β-1或由其組成。在另一個實(shí)施方案中，β-1/αD雜化物是這樣融合的，其中N-末端部分與干擾素β-1的氨基酸1-73對應(yīng)而C-末端部分與干擾素αD的氨基酸74-167對應(yīng)。例如，此β-1/αD雜化物將包含氨基酸序列MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSAAWDEDLLDKFCTELYQQLNDLEACVMQEERVGETPLMNXDSILAVKKYFRRITLYLTEKKYSPCAWEVVRAEIMRSLSLSTNLQERLRRKE(SEQIDNO103)，其中X是A或V。這些雜化物在美國專利號4,758,428中有進(jìn)一步的描述，將其完整引入本文作為參考。在另一個實(shí)施方案中，干擾素雜化物清蛋白融合蛋白的干擾素雜化物部分包含干擾素α-干擾素β雜化物(在本文中稱為α-β雜化物)。例如，干擾素雜化物清蛋白融合蛋白的α-β雜化物部分包含與干擾素β-1融合的干擾素αD(也稱為干擾素α-1)或由其組成。在另一個實(shí)施方案中，αD/β-1雜化物是這樣融合的，其中N-末端部分與干擾素αD的氨基酸1-73對應(yīng)而C-末端部分與干擾素β-1的氨基酸74-166對應(yīng)。例如，此αD/β-1雜化物將包含氨基酸序列MCDLPETHSLDNRRTLMLLAQMSRISPSSCLMDRHDFGFPQEEFDGNQFQKAPAISVLHELIQQIFNLFTTKDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDFTRGKLMSSLHLKRYYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLRN(SEQIDNO104)。這些雜化物在美國專利號4,758,428中有進(jìn)一步的描述，將其完整引入本文作為參考。在另外的實(shí)施方案中，干擾素雜化物清蛋白融合蛋白的干擾素雜化物部分可包含α-α干擾素雜化物、α-β干擾素雜化物、和β-α干擾素雜化物的其它組合物。在另外的實(shí)施方案中，干擾素雜化物清蛋白融合蛋白的干擾素雜化物部分可進(jìn)行修飾以包括對干擾素雜化物氨基酸序列的突變、替代、刪除、或添加。這些對干擾素雜化物清蛋白融合蛋白的修飾可用于例如提高產(chǎn)量水平、提高穩(wěn)定性、提高或降低活性、或賦予新的生物學(xué)特性。本發(fā)明涵蓋上文所述干擾素雜化物清蛋白融合蛋白，以及含有編碼這些多肽的多核苷酸的宿主細(xì)胞和包載體。在一個實(shí)施方案中，由上述多核苷酸編碼的干擾素雜化物清蛋白融合蛋白具有延長的保存期。在另一個實(shí)施方案中，由上述多核苷酸編碼的干擾素雜化物清蛋白融合蛋白與相應(yīng)的未融合干擾素雜化物分子相比在體外和/或在體內(nèi)在溶液中(或在藥物組合物中)具有更長的血清半衰期和/或更穩(wěn)定的活性。在另一個非限制性實(shí)例中，“治療性蛋白質(zhì)”指具有生物學(xué)活性特別是可用于治療、預(yù)防或改善疾病的生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)。治療性蛋白質(zhì)可具有的生物學(xué)活性的不完全列表包括抑制細(xì)胞的HIV-1感染、刺激腸上皮細(xì)胞增殖、降低腸上皮細(xì)胞通透性、刺激胰島素分泌、誘導(dǎo)支氣管擴(kuò)張和血管舒張、抑制醛固酮和腎素分泌、調(diào)節(jié)血壓、促進(jìn)神經(jīng)生長、增強(qiáng)免疫應(yīng)答、增強(qiáng)炎癥、抑制食欲、或者下丈“生物學(xué)活性”部分所描述的和/或表1(第二列)對指定治療性蛋白質(zhì)所公開的任何一種或多種生物學(xué)活性。在一個實(shí)施方案中，將IFN-β-HSA融合物用于抑制埃博拉病毒(Ebolavirus)和SARS病毒(多倫多-2毒株，Toronto-2strain)。例如，在Vero細(xì)胞中評估了融合于成熟HSA上游的IFN-β(CID2053蛋白)針對埃博拉病毒和SARS病毒的體外抗病毒活性。以細(xì)胞病理效應(yīng)(CPE)的抑制作用和細(xì)胞存活力的中性紅測定法為基礎(chǔ)，將這些細(xì)胞用于評估CID2053蛋白質(zhì)的保護(hù)作用。體外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通過基因表達(dá)分析進(jìn)行評估。另外，CID2053蛋白質(zhì)的藥動學(xué)和藥效學(xué)在恒河猴中進(jìn)行評估。結(jié)果顯示以有利的安全指數(shù)實(shí)現(xiàn)了有力的體外抗病毒活性。CID2053蛋白質(zhì)針對埃博拉病毒的IC50為0.4ng/ml而針對SARS病毒的IC50為2ng/ml。陣列分析(arrayanalysis)顯示CID2053蛋白質(zhì)和IFN-β誘導(dǎo)一組相似基因的表達(dá)并引發(fā)IFN激發(fā)的應(yīng)答元件(ISRE)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。在以靜脈內(nèi)50μg/kg或皮下300μg/kg的劑量施用CID2053蛋白質(zhì)的恒河猴中，末端半衰期(terminalhalf-life)是36-40小時。施用CID2053蛋白質(zhì)引起血清新喋呤(neopterin)水平及OAS1mRNA的表達(dá)的持續(xù)升高。在另一個實(shí)施方案中，將IFN-α-HSA融合物用于抑制歸類于A類-纖絲病毒(Filo)(埃博拉)、沙粒病毒(Arena)(Pichende)、B類-披膜病毒(Toga)(VEE)或C類-布尼亞病毒(Bunya)(龐塔托魯(Puntotoro))、黃病毒(Flavi)(黃熱病、西尼羅(WestNile))的病毒因子。例如，采用CPE抑制、中性紅染色和病毒產(chǎn)率測定法來評估融合于HSA下游的IFN-α(CID3165蛋白質(zhì))的抗病毒活性。CID3165蛋白質(zhì)的藥動學(xué)和藥效學(xué)在恒河猴及人類受試者中進(jìn)行評估。結(jié)果顯示以有利的安全指數(shù)實(shí)現(xiàn)了針對所有RNA病毒的抗病毒活性。在CPE測定法中IC50值的范圍為＜0.1ng/ml(龐塔托魯A)到19ng/ml(VEE)。在恒河猴中，CID3165蛋白質(zhì)的半衰期為90小時并在長達(dá)服藥后14天仍能檢測到。在人類受試者中，CID3165蛋白質(zhì)是安全的并且耐受性良好。單次注射服藥后的Cmax與劑量成比例。在500μg組中平均Cmax為22ng/ml，而平均t1/2為150小時。每2-4周或更長時間服藥一次得到了藥動學(xué)的支持。在單次注射組(120-500μg)中在多數(shù)受試者中觀察到針對丙型肝炎的抗病毒反應(yīng)。在另一個實(shí)施方案中，將IFN-α-HSA融合物用于治療慢性丙型肝炎感染(HCV)的患者。干擾素α，也稱為干擾素alfa或白細(xì)胞干擾素，是治療感染HCV患者的護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)。術(shù)語“干擾素α”指具有抗病毒活性的高度同源的相關(guān)多肽的家族。IFN-α-HAS融合物的干擾素α部分包含本領(lǐng)域已知的任何干擾素α或其片段或由其組成。本發(fā)明所涵蓋的干擾素α的非限制性實(shí)例包括但不限于表1治療性蛋白質(zhì)一列中所公開的干擾素α蛋白質(zhì)。在具體的實(shí)施方案中，干擾素α部分包含干擾素α-2a、干擾素α-2b、干擾素α-2c、共有干擾素、干擾素alfacon-1、干擾素α-n1、干擾素α-n3、干擾素α的任何商品化形式諸如例如INTRON_A(ScheringCorp.，Kenilworth，N.J.)、ROFERON_(Hoffman-LaRoche，Nutley，N.J.)、Beroforα干擾素(BoehringerIngelheimPharmaceutical，Inc.，Ridgefied，Conn.)、OMNIFERONTM(Viragen，Inc.，Plantation，F(xiàn)L)、MULTIFERONTM(Viragen，Inc.，Plantation，F(xiàn)L)、WELLFERON_(GlaxoSmithKline，London，GreatBritian)、INFERGEN_(Amgen，Inc.，ThousandsOaks，CA)、SUMIFERON_(Sumitomo，Japan)、BELEROFON_(NautilusBiotech，F(xiàn)rance)或任何純化的干擾素α產(chǎn)品或其片段或由其組成。在另外的實(shí)施方案中，IFN-α-HSA融合蛋白的干擾素α部分可通過附著化學(xué)模塊而得以修飾。例如，干擾素α部分可通過聚乙二醇化得以修飾。因此，在另外的實(shí)施方案中，IFN-α-HSA融合蛋白的干擾素α部分包含干擾素α-2a、2b、或共有干擾素的聚乙二醇化形式或由其組成，并且包含但不限于商品化聚乙二醇化干擾素α，諸如例如PEG-INTRON_(ScheringCorp.，Kenilworth，N.J.)、PEGASYS_(Hoffman-LaRoche，Nutley，N.J.)、PEG-OMNIFERONTM(Viragen，Inc.，Plantation，F(xiàn)L)或其片段。然而，在用于本文時，“IFN-α-HSA”融合物指與本領(lǐng)域已知的任何干擾素α蛋白質(zhì)或其片段融合的HSA。根據(jù)先前是否接受過用于治療HCV感染的干擾素治療方案，可將感染HCV的患者分為兩類。“首次接受治療的患者”指那些從未接受過干擾素治療方案治療的患者?！霸?jīng)接受治療的患者”指那些曾經(jīng)接受過或者正在接受干擾素治療方案治療的患者?！安粦?yīng)答者”指這樣的曾經(jīng)接受治療的患者，他們先前接受過干擾素治療方案治療但未達(dá)到治療的主要目的諸如早期病毒載量減少(EVR)或治療終末應(yīng)答(ETR)。然而，在用于本言文時，“HCV患者”指感染了HCV的患者并且不論他是首次接受治療的、曾經(jīng)接受治療的、或是不應(yīng)答者。另外，丙型肝炎病毒可分為四種基因型，基因型1、2、3、或4。通常，感染HCV患者的丙型肝炎病毒包含單一基因型。然而，肝炎病毒可包含兩種或多種基因型的組合。另外，丙型肝炎病毒的基因型還可以是已知HCV基因型之一的變體。在另一個實(shí)施方案中，HCV患者的丙型肝炎病毒是基因型1或其變體。然而，在用于本文時，“HCV”指任何基因型的丙型肝炎病毒，或其組合或變體。對攜帶HCV的患者的標(biāo)準(zhǔn)治療牽涉用干擾素α聯(lián)合抗病毒劑諸如利巴韋林(病毒唑)進(jìn)行治療。通常，每日一次，每周兩次，或每周一次施用干擾素α而每日一次施用利巴韋林。然而，最近的研究也使用了干擾素α并聯(lián)合本領(lǐng)域已知的用于治療HCV的其它抗病毒劑。因此，在另一個實(shí)施方案中，可將IFN-α-HSA融合物單獨(dú)或聯(lián)合抗病毒劑諸如例如利巴韋林施用于HCV患者。如上所述，CID3165蛋白質(zhì)的藥動學(xué)支持每2-4周或更長時間一次的服藥方案。因此，在另一個實(shí)施方案中，通過每2-4周一次單獨(dú)或聯(lián)合有效量的抗病毒劑施用IFN-α-HSA融合物來治療HCV患者。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過每2-4周一次聯(lián)合有效量的抗病毒劑施用IFN-α-HSA融合物來治療HCV患者。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，每4周一次對HCV患者施用IFN-α-HSA融合物。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，每4周超過一次對HCV患者施用IFN-α-HSA融合物。在另外的實(shí)施方案中，每4周或更長時間一次對HCV患者施用IFN-α-HSA融合物，其中治療還包括施用有效量的抗病毒劑。在另一個實(shí)施方案中，IFN-α-HSA融合物可作為低劑量的單一療法用于HCV的維持療法。在另一個實(shí)施方案中，IFN-α-HSA融合物可聯(lián)合利巴韋林和一種或多種其它抗病毒劑用于HCV的治療?；蛘?，在另一個實(shí)施方案中，IFN-α-HSA融合物可聯(lián)合除利巴韋林以外的一種或多種抗病毒劑用于HCV的治療。在另一個實(shí)施方案中，IFN-α-HSA融合物可用于治療其它病毒感染。例如，在一個實(shí)施方案中，IFN-α-HSA融合物可用于治療乙型肝炎(HBV)。在另一個實(shí)施方案中，IFN-α-HSA融合物可用于治療人乳頭狀瘤病毒(HPV)。在另一個實(shí)施方案中，IFN-α-HSA融合物可用于治療癌癥，包括但不限于毛細(xì)胞性白血病、惡性黑素瘤、濾泡性淋巴瘤、慢性髓細(xì)胞性白血病、AIDS相關(guān)卡波西肉瘤、多發(fā)性骨髓瘤、或腎細(xì)胞癌。在另一個實(shí)施方案中，將GLP-1-HAS融合物用于調(diào)節(jié)糖尿病患者的血糖水平。在另一個實(shí)施方案中，將野生型或突變型GLP-1的串聯(lián)融合物用于調(diào)節(jié)糖尿病患者的血糖水平。例如，在給約8周齡的糖尿病db/db小鼠皮下注射GLP-1-HAS蛋白后，通過口服葡萄糖耐量測試(通過口服管飼法每kg體重給予1g葡萄糖)評估了單體GLP-1(7-36A8G)-HAS和串聯(lián)GLP-1(7-36A8G)-HSA(CID3610)融合物調(diào)節(jié)血糖水平的能力。此葡萄糖耐量試驗(yàn)包括皮下注射GLP-1-HSA融合物，隨后通過口服管飼法每kg體重給予1g葡萄糖。給禁食的糖尿病db/db小鼠施用等摩爾劑量(100和171nmol/kg)的單體或串聯(lián)GLP-1-HSA融合蛋白，并在單次施藥后6或24小時進(jìn)行口服葡萄糖耐量測試。相當(dāng)令人驚訝和出乎意料的是，與單體GLP-1(7-36A8G)-HSA融合物相比，串聯(lián)GLP-1(7-36A8G)-HAS融合物(CID3610)在注射后6小時顯著降低血糖。另外，在注射后24小時對糖尿病db/db小鼠進(jìn)行評估時，單體GLP-1(7-36A8G)-HSA和串聯(lián)GLP-1(7-36A8G)-HAS(CID3610)融合物之間的差異甚至更加顯著。如圖11所示，串聯(lián)GLP-1(7-36A8G)-HAS融合物(CID3610)(◇)擁有出乎意料有力的血糖正常化活性，然而單個GLP-1(7-36A8G)-HAS(Δ)融合物的禁食血糖水平與本質(zhì)上顯然是糖尿病且單獨(dú)施用HSA(●)的動物相似。在用于本文時，“治療活性”或“活性”可指其在人體中的作用符合期望治療成果的活性，或指在非人哺乳動物或其它物種或生物體中的期望效果。治療活性可在體內(nèi)或在體外測量。例如，可在細(xì)胞培養(yǎng)物中測定期望效果。這些體外或細(xì)胞培養(yǎng)物測定法對于所述治療性蛋白質(zhì)在本領(lǐng)域通常是可獲得的。測定法的實(shí)例包括但不限于本文實(shí)施例部分或表1“例示性活性測定法”一列(第3列)中所描述的。與本發(fā)明的清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分對應(yīng)的治療性蛋白質(zhì)，諸如細(xì)胞表面和分泌性蛋白質(zhì)，通常通過附著一個或多個寡糖基團(tuán)進(jìn)行修飾。這種修飾，稱為糖基化，可顯著影響蛋白質(zhì)的物理特性，而且對于蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、分泌、和定位可能是重要的。糖基化發(fā)生于沿著多肽主鏈的特定位置。通常有兩種主要的糖基化類型附著于絲氨酸或蘇氨酸殘基的特征為O-連接寡糖的糖基化；附著于Asn-X-Ser或Asn-X-Thr序列中的天冬酰胺殘基的特征為N-連接寡糖的糖基化，其中X可以是除脯氨酸外的任何氨基酸。N-乙酰神經(jīng)氨酸(也稱為唾液酸)通常是N-連接和O-連接寡糖的末端殘基。諸如蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和細(xì)胞類型等變數(shù)影響不同糖基化位點(diǎn)處鏈內(nèi)碳水化合物單位的數(shù)量和本質(zhì)。糖基化異構(gòu)體也常常存在于指定細(xì)胞類型中的相同位點(diǎn)處。與本發(fā)明的清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分對應(yīng)的治療性蛋白質(zhì)及其類似物和變體可進(jìn)行修飾，因此由于對其核酸序列的操作，由表達(dá)它們的宿主細(xì)胞改變一個或多個位點(diǎn)處的糖基化，或者由于它們的其它表達(dá)條件。例如，可通過消除或引入糖基化位點(diǎn)來產(chǎn)生糖基化異構(gòu)體，例如通過氨基酸殘基的替代或刪除，諸如用谷氨酰胺替代天冬酰胺，或者可通過在不會將其糖基化的宿主細(xì)胞中表達(dá)蛋白質(zhì)來產(chǎn)生未糖基化的重組蛋白，例如在大腸桿菌或糖基化缺陷的酵母中。這些方法在下文中有更詳細(xì)的描述且在本領(lǐng)域是已知的。治療性蛋白質(zhì)，特別是表1中所公開的那些，和它們的核酸和氨基酸序列在本領(lǐng)域是眾所周知的，并且可從公共數(shù)據(jù)庫諸如化學(xué)文摘社數(shù)據(jù)庫(如CAS注冊號)、GenBank、和提供訂閱的數(shù)據(jù)庫諸如GenSeq(如Derwent)獲得?？捎糜谘苌景l(fā)明多核苷酸的例示性治療性蛋白質(zhì)核苷酸序列顯示于表2的第7列“SEQIDNOX”。SEQIDNOX所示序列可以是編碼指定治療性蛋白質(zhì)(如全長的或成熟的)的野生型多核苷酸序列，或在一些情況中該序列可以是所述野生型多核苷酸序列的變體(如編碼野生型治療性蛋白質(zhì)的多核苷酸，其中所述多核苷酸的DNA序列已經(jīng)優(yōu)化，例如用于在特定物種中進(jìn)行表達(dá)；或編碼野生型治療性蛋白質(zhì)的變體的多核苷酸(即定點(diǎn)突變體；等位基因變體))。利用SEQIDNOX所示序列衍生同一行中所描述的構(gòu)建物完全在熟練技術(shù)人員的能力之內(nèi)。例如，如果SEQIDNOX對應(yīng)于全長蛋白質(zhì)，但是該蛋白質(zhì)只有一部分用于生成特定CID，那么根據(jù)分子生物學(xué)技術(shù)諸如PCR來擴(kuò)增特定片段并將其克隆到合適載體中在本領(lǐng)域技術(shù)之內(nèi)。與本發(fā)明的清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分對應(yīng)的其它治療性蛋白質(zhì)包括但不限于表1“治療性蛋白質(zhì)X”一列(第1列)中所公開的一種或多種治療性蛋白質(zhì)或多肽或其片段或變體。表1提供了與本發(fā)明的清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分對應(yīng)的治療性蛋白質(zhì)或由本發(fā)明的多核苷酸編碼的清蛋白融合蛋白的不完全列表。第一列“治療性蛋白質(zhì)X”公開了治療性蛋白質(zhì)分子，隨后可能的圓括號中包括包含該治療性蛋白質(zhì)分子或其片段或變體或由其組成的蛋白質(zhì)的學(xué)名和品牌。在用于本文時，“治療性蛋白質(zhì)X”可指個別治療性蛋白質(zhì)分子，或指與此列中所公開的指定治療性蛋白質(zhì)分子相關(guān)的整組治療性蛋白質(zhì)?！吧飳W(xué)活性”列(第2列)描述了與治療性蛋白質(zhì)分子相關(guān)的生物學(xué)活性。第3列“例示性活性測定法”提供了描述可用于測試治療性蛋白質(zhì)X或包含治療性蛋白質(zhì)X(或其片段)部分的清蛋白融合蛋白的治療性和/或生物學(xué)活性的測定法的參考文獻(xiàn)。將“生物學(xué)活性”列中所引用的每篇參考文獻(xiàn)完整引入本文作為參考，特別是在參考文獻(xiàn)中所描述的用于測定表1“生物學(xué)活性”列所示相應(yīng)生物學(xué)活性的各自活性測定法的描述方面(例如見其中的方法部分)。第四列“優(yōu)選的適應(yīng)癥Y”描述了可通過治療性蛋白質(zhì)X或包含治療性蛋白質(zhì)X(或其片段)部分的清蛋白融合蛋白來治療、預(yù)防、診斷、和/或改善的疾病、紊亂、和/或狀況。“構(gòu)建物ID”列(第5列)提供了與表2中所公開的編碼包含所提到的治療性蛋白質(zhì)X(或其片段)部分或由其組成的清蛋白融合蛋白的例示性清蛋白融合構(gòu)建物的鏈接。表1表2表2提供了本發(fā)明中包含編碼清蛋白融合蛋白的核酸分子或者由其組成的多核苷酸的非詳盡清單。第一列“融合No.”給出了每種多核苷酸的融合編號。第2列“構(gòu)建物ID”為本發(fā)明的每種多核苷酸提供了唯一的數(shù)字標(biāo)識符。構(gòu)建物ID可以用來鑒別編碼清蛋白融合蛋白的多核苷酸，其中清蛋白融合蛋白包含與給定的治療性生蛋白質(zhì)X對應(yīng)的治療性蛋白質(zhì)部分或者由其組成，給定的治療性蛋白質(zhì)X列在表1的對應(yīng)列，其中構(gòu)建物ID列在第5列?！皹?gòu)建物名稱”列(第3列)為給定的清蛋白融合構(gòu)建物或多核苷酸提供了名稱。表2的第四列“描述”為給定的清蛋白融合構(gòu)建物提供了概括描述，而第五列“表達(dá)載體”列出了包含編碼給定清蛋白融合蛋白的核酸分子或者由其組成的多核苷酸克隆其中的載體。載體是本領(lǐng)域已知的，且可通過商業(yè)途徑或其它地方所述途徑獲得。例如，如實(shí)施例所述，可以在方便的克隆載體中裝配包含(1)編碼給定清蛋白融合蛋白的多核苷酸，(2)前導(dǎo)序列，(3)啟動子區(qū)，和(4)翻譯終止子其中一項(xiàng)或多項(xiàng)或者由其組成的“表達(dá)盒”，然后將其轉(zhuǎn)移到其它載體中，諸如例如包括例如酵母表達(dá)載體或哺乳動物表達(dá)載體在內(nèi)的表達(dá)載體。在一個實(shí)施方案中，為了在釀酒酵母中進(jìn)行表達(dá)，將包含編碼清蛋白融合蛋白的核酸分子或者由其組成的表達(dá)盒克隆到pSAC35中。在另一個實(shí)施方案中，為了在CHO細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，將包含編碼清蛋白融合蛋白的核酸分子或者由其組成的表達(dá)盒克隆到pC4中。在又一個實(shí)施方案中，將包含編碼清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分的核酸分子或者由其組成的多核苷酸克隆到pC4:HSA中。在又一個實(shí)施方案中，為了在NSO細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，將包含編碼清蛋白融合蛋白的核酸分子或者由其組成的表達(dá)盒克隆到pEE12中。熟練技術(shù)人員還知道其它有用的克隆和/或表達(dá)載體，而它們也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。第6列“SEQIDNOY”提供了本發(fā)明的清蛋白融合蛋白的全長氨基酸序列。在多數(shù)情況中，SEQIDNOY顯示所編碼清蛋白融合蛋白的未加工形式，換句話說，SEQIDNOY顯示全部由特定構(gòu)建物編碼的信號序列、HSA部分、和治療性部分。本發(fā)明明確涵蓋編碼SEQIDNOY的所有多核苷酸。在利用這些多核苷酸由細(xì)胞表達(dá)所編碼蛋白質(zhì)時，細(xì)胞的天然分泌和加工步驟產(chǎn)生缺少表2的第4列和/或第11列中列出的信號序列的蛋白質(zhì)。所列信號序列的具體氨基酸序列顯示在后面的說明書中，或者已經(jīng)為本領(lǐng)域所熟知。因此，本發(fā)明的最優(yōu)選實(shí)施方案包括由細(xì)胞產(chǎn)生的清蛋白融合蛋白(它將缺少表2的第4列和/或第11列中所顯示的前導(dǎo)序列)。同樣最優(yōu)選的還有包含SEQIDNOY但不具有表2的第4列和/或第11列中列出的具體前導(dǎo)序列的多肽。包含這兩個優(yōu)選實(shí)施方案的組合物，包括藥物組合物，也是優(yōu)選的。而且，用不同的信號序列諸如后面的說明書中描述的有助于經(jīng)加工的清蛋白融合蛋白分泌的信號序列替換表2的第4列和/或第11列中列出的信號序列也完全在熟練技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)。第七列“SEQIDNOX”提供了可衍生編碼給定清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分的多核苷酸的親本核酸序列。在一個實(shí)施方案中，可衍生編碼清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分的多核苷酸的親本核酸序列包括編碼表1中顯示的治療性蛋白質(zhì)的野生型基因序列。在候選實(shí)施方案中，可衍生編碼清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分的多核苷酸的親本核酸序列包括編碼表1中顯示的治療性蛋白質(zhì)的野生型基因序列的變體或衍生物，諸如例如編碼治療性蛋白質(zhì)的野生型基因序列的合成密碼子優(yōu)化變體。第八列“SEQIDNOZ”提供了親本核酸序列(SEQIDNOX)的預(yù)測翻譯結(jié)果。此親本序列可以是用來衍生特定構(gòu)建物的全長親本蛋白質(zhì)、親本蛋白質(zhì)的成熟部分、野生型蛋白質(zhì)的變體或片段、或者可用于產(chǎn)生所述構(gòu)建物的人工序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以利用SEQIDNOZ中顯示的此氨基酸序列來確定給定構(gòu)建物編碼的清蛋白融合蛋白的哪些氨基酸殘基是由治療性蛋白質(zhì)提供的。而且，利用SEQIDNOZ顯示的序列衍生同一行中描述的構(gòu)建物也完全在熟練技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)。例如，如果SEQIDNOZ對應(yīng)于全長蛋白質(zhì)，而只利用該蛋白質(zhì)的一部分來產(chǎn)生特定CID，那么依靠分子生物學(xué)技術(shù)諸如PCR擴(kuò)增特定片段并將它克隆到適當(dāng)?shù)妮d體中，這在本領(lǐng)域的技術(shù)范圍之內(nèi)。第9和10列分別提供的擴(kuò)增引物“SEQIDNOA”和“SEQIDNOB”是用來產(chǎn)生包含編碼給定清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分的核酸分子或者由其組成的多核苷酸的示范引物。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，具有第9和/或第10列所示序列(SEQIDNOA和/或B)的寡核苷酸引物用于PCR擴(kuò)增編碼清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分的多核苷酸，其中利用包含對應(yīng)行的第7列提供的核苷酸序列(SEQIDNOX)或者由其組成的核酸分子作為模板DNA。本領(lǐng)域已經(jīng)很好地建立了PCR方法。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可容易的設(shè)想和使用其它有用的引物序列。在候選實(shí)施方案中，寡核苷酸可以在重疊PCR反應(yīng)用于在模板DNA序列中產(chǎn)生突變。PCR方法是本領(lǐng)域已知的。如表3所示，本申請中公開的某些清蛋白融合構(gòu)建物已經(jīng)保藏于ATCC。表3通過本領(lǐng)域已知的技術(shù)從保藏處重新得到給定的清蛋白融合構(gòu)建物是可能的，在本申請的其它地方也進(jìn)行了描述(參見實(shí)施例10)。ATCC位于美國弗吉尼亞20110-2209的Manassas的大學(xué)路10801號(10801UniversityBoulevard，Manassas，Virginia20110-2209，USA)。按照布達(dá)佩斯條約關(guān)于用于專利程序的國際認(rèn)可的微生物保藏條款進(jìn)行了ATCC保藏。在本發(fā)明又一個實(shí)施方案中，包含(1)編碼給定清蛋白融合蛋白的多核苷酸，(2)前導(dǎo)序列，(3)啟動子區(qū)，和(4)翻譯終止子其中一項(xiàng)或多項(xiàng)或者由其組成的“表達(dá)盒”可以從一種載體移動或“亞克隆”到另一種載體中。通過本領(lǐng)域眾所周知的方法，諸如例如PCR擴(kuò)增(例如利用具有SEQIDNOA或B所示序列的寡核苷酸引物)和/或限制酶消化，可以產(chǎn)生用于亞克隆的片段。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白具有與治療性蛋白質(zhì)的治療活性和/或生物學(xué)活性對應(yīng)的治療活性和/或生物學(xué)活性，其中治療性蛋白質(zhì)對應(yīng)于表1的對應(yīng)行所列出的清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分。在又一個優(yōu)選方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白的治療活性蛋白質(zhì)部分是由表2的SEQIDNOX列顯示的序列編碼的蛋白質(zhì)的片段或變體，且具有對應(yīng)的治療性蛋白質(zhì)的治療活性和/或生物學(xué)活性。多肽和多核苷酸片段和變體片段本發(fā)明還涉及表1中描述的治療性蛋白質(zhì)的片段、清蛋白蛋白質(zhì)、和/或本發(fā)明的清蛋白融合蛋白。本發(fā)明還涉及編碼表1中描述的治療性蛋白質(zhì)的片段、清蛋白蛋白質(zhì)、和/或本發(fā)明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸。即使從蛋白質(zhì)的N-末端刪除一個或多個氨基酸會導(dǎo)致治療性蛋白質(zhì)、清蛋白蛋白質(zhì)、和/或本發(fā)明的清蛋白融合蛋白的一種或多種生物功能的修飾或喪失，但仍然可保留其它治療活性和/或功能活性(如生物學(xué)活性、多聚化的能力、結(jié)合配體的能力)。例如，在從N-末端除去少于完整多肽的多數(shù)殘基時，通常能保留具有N-末端刪除的多肽誘導(dǎo)和/或結(jié)合識別這種多肽的完整或成熟形式的抗體的能力。通過本申請所描述的和本領(lǐng)域其它途徑知道的常規(guī)方法，可以容易的確定缺乏完整多肽N-末端殘基的特定多肽是否保留了這種免疫學(xué)活性。N-末端氨基酸殘基遭到大量刪除的突變蛋白保留一些生物學(xué)或免疫學(xué)活性并不是不可能的。事實(shí)上，由少至六個氨基酸殘基構(gòu)成的肽經(jīng)?？梢砸l(fā)免疫應(yīng)答。因此，與本發(fā)明的清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分對應(yīng)的治療性蛋白質(zhì)的片段包括全長蛋白質(zhì)，以及從參考多肽(即表1中提到的治療性蛋白質(zhì)，或者由表2中描述的多核苷酸或清蛋白融合構(gòu)建物編碼的清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分)的氨基酸序列的氨基末端刪除了一個或多個殘基的多肽。具體而言，N-末端刪除可以用m至q的通式來描述，其中q是代表參考多肽(例如表1中提到的治療性蛋白質(zhì)，或者本發(fā)明的清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分，或者由表2中描述的多核苷酸或清蛋白融合構(gòu)建物編碼的清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分)中氨基酸殘基總數(shù)的完整整數(shù)，而m定義為范圍為2到q減6的任何整數(shù)。本發(fā)明還涵蓋編碼這些多肽的多核苷酸。另外，與本發(fā)明的清蛋白融合蛋白的清蛋白蛋白質(zhì)部分對應(yīng)的血清清蛋白多肽的片段包括全長蛋白質(zhì)，以及從參考多肽(即血清清蛋白，或者由表2中描述的多核苷酸或清蛋白融合構(gòu)建物編碼的清蛋白融合蛋白的血清清蛋白部分)的氨基酸序列的氨基末端刪除了一個或多個殘基的多肽。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，N-末端刪除可以用m至585的通式來描述，其中585是代表成熟人血清清蛋白(SEQIDNO1)的氨基酸殘基總數(shù)的完整整數(shù)，而m定義為范圍為2到579的任何整數(shù)。本發(fā)明還涵蓋編碼這些多肽的多核苷酸。在另外的實(shí)施方案中，N-末端刪除可以用m至609的通式來描述，其中609是代表全長人血清清蛋白(SEQIDNO3)的氨基酸殘基總數(shù)的完整整數(shù)，而m定義為范圍為2到603的任何整數(shù)。本發(fā)明還涵蓋編碼這些多肽的多核苷酸。而且，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白的片段包括全長清蛋白融合蛋白，以及從清蛋白融合蛋白(即由表2中描述的多核苷酸或清蛋白融合構(gòu)建物編碼的清蛋白融合蛋白，或者具有表2的第6列公開的氨基酸序列的清蛋白融合蛋白)的氨基末端刪除了一個或多個殘基的多肽。具體而言，N-末端刪除可以用m至q的通式來描述，其中q是代表清蛋白融合蛋白的氨基酸殘基總數(shù)的完整整數(shù)，而m定義為范圍為2到q減6的任何整數(shù)。本發(fā)明還涵蓋編碼這些多肽的多核苷酸。同樣如上所述，即使從參考多肽(例如治療性蛋白質(zhì)、血清清蛋白蛋白質(zhì)、或本發(fā)明的清蛋白融合蛋白)的N-末端或C-末端刪除一個或多個氨基酸會導(dǎo)致蛋白質(zhì)的一種或多種生物功能的修飾或喪失，但仍然可以保留其它功能活性(例如生物學(xué)活性、多聚化的能力、結(jié)合配體的能力)和/或治療活性。例如，在從C-末端除去少于完整或成熟多肽的多數(shù)殘基時，通常能保留具有C-末端刪除多肽誘導(dǎo)和/或結(jié)合識別這種多肽的完整或成熟形式的抗體的能力。通過本申請所描述的和/或本領(lǐng)域其它途徑知道的常規(guī)方法，可以容易的確定缺乏參考多肽N-末端和/或C-末端殘基的特定多肽是否保留了治療活性。本發(fā)明還提供了從與本發(fā)明的清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分對應(yīng)的治療性蛋白質(zhì)(例如表1中提到的治療性蛋白質(zhì)，或者由表2中描述的多核苷酸或清蛋白融合構(gòu)建物編碼的清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分)的氨基酸序列的羧基末端刪除了一個或多個殘基的多肽。具體而言，C末端刪除可以用1至n的通式來描述，其中n是范圍為6到q減1的任何完整整數(shù)，而q是代表參考多肽(例如表1中提到的治療性蛋白質(zhì)，或者由表2中描述的多核苷酸或清蛋白融合構(gòu)建物編碼的清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分)中氨基酸殘基總數(shù)的完整整數(shù)。本發(fā)明還涵蓋編碼這些多肽的多核苷酸。另外，本發(fā)明提供了從與本發(fā)明的清蛋白融合蛋白的清蛋白蛋白質(zhì)部分對應(yīng)的清蛋白蛋白質(zhì)(例如血清清蛋白，或者由表2中描述的多核苷酸或清蛋白融合構(gòu)建物編碼的清蛋白融合蛋白的清蛋白蛋白質(zhì)部分)的氨基酸序列的羧基末端刪除了一個或多個殘基的多肽。具體而言，C-末端刪除可以用1至n的通式來描述，其中n是范圍為6到584的任何完整整數(shù)，而584是代表成熟人血清清蛋白(SEQIDNO1)的氨基酸殘基總數(shù)減1的完整整數(shù)。本發(fā)明還涵蓋編碼這些多肽的多核苷酸。具體而言，C-末端刪除可以用1至n的通式來描述，其中n是范圍為6到608的任何完整整數(shù)，而608是代表血清清蛋白(SEQIDNO3)的氨基酸殘基總數(shù)減1的完整整數(shù)。本發(fā)明還涵蓋編碼這些多肽的多核苷酸。而且，本發(fā)明提供了從本發(fā)明的清蛋白融合蛋白的羧基末端刪除了一個或多個殘基的多肽。具體而言，C-末端刪除可以用1到n的通式來描述，其中n是范圍為6到q減1的任何完整整數(shù)，而q是代表本發(fā)明的清蛋白融合蛋白的氨基酸殘基總數(shù)的完整整數(shù)。本發(fā)明還涵蓋編碼這些多肽的多核苷酸。另外，可以組合上述任何N-或C-末端刪除以產(chǎn)生N-和C-末端刪除的參考多肽。本發(fā)明還提供了從氨基和羧基兩個末端刪除了一個或多個氨基酸的多肽，這通常可描述為具有參考多肽(例如表1中提到的治療性蛋白質(zhì)、或者本發(fā)明的清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分、或者由表2中描述的多核苷酸或清蛋白融合構(gòu)建物編碼的治療性蛋白質(zhì)部分、或者血清清蛋白(例如SEQIDNO1)、或者本發(fā)明的清蛋白融合蛋白的清蛋白蛋白質(zhì)部分、或者由表2中描述的多核苷酸或清蛋白融合構(gòu)建物編碼的清蛋白蛋白質(zhì)部分、或者清蛋白融合蛋白、或者由本發(fā)明的多核苷酸或清蛋白融合構(gòu)建物編碼的清蛋白融合蛋白)的殘基m至n，其中n和m是上文所述的整數(shù)。本發(fā)明還涵蓋編碼這些多肽的多核苷酸。本申請還涉及包含與本文所列參考多肽序列(例如表1中提到的治療性蛋白質(zhì)、或者本發(fā)明的清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分、或者由表2中描述的多核苷酸或清蛋白融合構(gòu)建物編碼的治療性蛋白質(zhì)部分、或者血清清蛋白(例如SEQIDNO1)、或者本發(fā)明的清蛋白融合蛋白的清蛋白蛋白質(zhì)部分、或者由表2中描述的多核苷酸或清蛋白融合構(gòu)建物編碼的清蛋白蛋白質(zhì)部分、或者清蛋白融合蛋白、或者由本發(fā)明的多核苷酸或清蛋白融合構(gòu)建物編碼的清蛋白融合蛋白)或其片段具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的多肽的蛋白質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本申請涉及包含與參考多肽具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性且具有上文所述N-和C-末端刪除的氨基酸序列的多肽的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還涵蓋編碼這些多肽的多核苷酸。本發(fā)明的優(yōu)選多肽片段是包含表現(xiàn)出治療性蛋白質(zhì)或血清清蛋白蛋白質(zhì)多肽序列的治療活性和/或功能活性(例如生物學(xué)活性)的氨基酸序列或者由其組成的片段，其中所述氨基酸序列是所述治療性蛋白質(zhì)或血清清蛋白蛋白質(zhì)的多肽序列的片段。其它優(yōu)選的多肽片段有生物學(xué)活性片段。生物學(xué)活性片段是那些顯示出與本發(fā)明的多肽的活性相似但不必相同的活性的片段。片段的生物學(xué)活性可包括改進(jìn)的期望活性，或者減弱的不良活性。變體“變體”指與參考核酸或多肽不同但保留其本質(zhì)特性的多核苷酸或核酸。通常，變體與參考核酸或多肽在總體上緊密相似且在許多區(qū)域相同。在用于本文時，“變體”指序列分別與治療性蛋白質(zhì)(例如參見表1的“治療性”列)、清蛋白蛋白質(zhì)、和/或清蛋白融合蛋白不同但保留其本文中其它地方描述的或本領(lǐng)域其它途徑知道的至少一種功能和/或治療特性的本發(fā)明的清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分、本發(fā)明的清蛋白融合蛋白的清蛋白部分、或本發(fā)明的清蛋白融合蛋白。通常，變體與對應(yīng)于清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分的治療性蛋白質(zhì)、對應(yīng)于清蛋白融合蛋白的清蛋白蛋白質(zhì)部分的清蛋白蛋白質(zhì)、和/或清蛋白融合蛋白的氨基酸序列在總體上非常相似且在許多區(qū)域與其相同。本發(fā)明還涵蓋編碼這些變體的核酸。本發(fā)明還涉及包含與例如對應(yīng)于本發(fā)明的清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分的治療性蛋白質(zhì)(例如表1中公開的治療性蛋白質(zhì)X的氨基酸序列；或者由表1和表2中描述的多核苷酸或清蛋白融合構(gòu)建物編碼的清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分的氨基酸序列；或其片段或變體)、對應(yīng)于本發(fā)明的清蛋白融合蛋白的清蛋白蛋白質(zhì)部分的清蛋白蛋白質(zhì)(例如由表1和表2中描述的多核苷酸或清蛋白融合構(gòu)建物編碼的清蛋白融合蛋白的清蛋白蛋白質(zhì)部分的氨基酸序列；SEQIDNO1中顯示的氨基酸序列；或其片段或變體的氨基酸序列)、和/或清蛋白融合蛋白的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列或者由其組成的蛋白質(zhì)。還提供了這些多肽的片段(例如本文描述的片段)。本發(fā)明還包括由這樣的多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下(例如在約45攝氏度，在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中與濾膜結(jié)合的DNA雜交，然后在約50-65攝氏度，在0.2XSSC、0.1％SDS中洗滌一次或多次)、在高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下(例如在約45攝氏度，在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中與濾膜結(jié)合的DNA雜交，然后在約68攝氏度，在0.1XSSC、0.2％SDS中洗滌一次或多次)、或在本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的其它嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下(例如參見Ausubel，F(xiàn).M.等人，編，1989，《CurrentprotocolinMolecularBiology》，Greenpublishingassociates，Inc.及JohnWiley&SonsInc.，NewYork，6.3.1-6.3.6和2.10.3)下與編碼本發(fā)明的清蛋白融合蛋白的核酸分子的互補(bǔ)鏈發(fā)生雜交。本發(fā)明還涵蓋編碼這些多肽的多核苷酸。具有與查詢氨基酸序列具有至少例如95％“同一性”的氨基酸序列的多肽指目的多肽的氨基酸序列與查詢序列相同，只是目的多肽序列在查詢氨基酸序列的每100個氨基酸中可包括多達(dá)五個氨基酸改變。換句話說，要獲得具有與查詢氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列的多肽，可以插入、刪除、或用另一種氨基酸替代目的序列中多達(dá)5％的氨基酸殘基。參考序列的這些改變可以發(fā)生在參考氨基酸序列的氨基或羧基末端位置，或那些末端位置之間的任何地方，可以個別地散布在參考序列的殘基之間或散布在參考序列內(nèi)的一個或多個鄰近組中。實(shí)際上，可以利用已知的計(jì)算機(jī)程序照慣例確定任何特定多肽與本發(fā)明的清蛋白融合蛋白或其片段(例如清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分或清蛋白融合蛋白的清蛋白部分)的氨基酸序列是否具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。利用以Brutlag等人(Comp.App.Biosci.6237-245，1990)的算法為基礎(chǔ)的FASTDB計(jì)算機(jī)程序可以確定用于測定查詢序列(本發(fā)明的序列)與目的序列之間的最佳整體匹配的優(yōu)選方法，也稱為全局序列比對。在序列比對中，查詢和目的序列可以都是核苷酸序列或者都是氨基酸序列。所述全局序列比對的結(jié)果用同一性百分比表示。用于FASTDB氨基酸比對的優(yōu)選參數(shù)為矩陣＝PAM0，k-tuple＝2，錯配罰分＝1，連接罰分＝20，隨機(jī)化組長＝0，截止得分＝1，窗口尺度＝序列長度，缺口罰分＝5，缺口大小罰分＝0.05，窗口尺度＝500或目的氨基酸序列的長度中的較短者。如果目的序列因?yàn)镹-或C-末端刪除而非內(nèi)部刪除比查詢序列短，那么必須對結(jié)果進(jìn)行人工修正。這是因?yàn)镕ASTDB程序在計(jì)算全局同一性百分比時不會考慮目的序列的N-和C-末端截短。對于相對于查詢序列在N-和C-末端截短的目的序列，如下修正同一性百分比，計(jì)算查詢序列中位于目的序列的N-和C-末端、不與對應(yīng)的目的序列匹配/比對的殘基數(shù)目，作為查詢序列堿基總數(shù)的百分比。殘基是否匹配/比對是由FASTDB序列比對的結(jié)果確定的。然后從通過上述FASTDB程序利用特定參數(shù)計(jì)算得出的同一性百分比減去這一百分比，得出最終同一性百分比得分。此最終同一性百分比得分就是用于本發(fā)明的得分。人工調(diào)整同一性百分比得分時只考慮位于目的序列的N-和C-末端、與查詢序列不匹配/比對的殘基。也就是說，只考慮位于目的序列最遠(yuǎn)N-和C-末端殘基以外的查詢殘基殘基。例如，將90個氨基酸殘基的目的序列與100個殘基的查詢序列進(jìn)行比對以測定同一性百分比。刪除發(fā)生在目的序列的N-末端，因此FASTDB比對不顯示N-末端最初10個殘基的匹配/比對結(jié)果。10個不配對的殘基占到序列的10％(N-和C-末端不匹配的殘基數(shù)/查詢序列的殘基總數(shù))，因此從通過FASTDB程序計(jì)算得出的同一性百分比得分中減去10％。如果剩余的90個殘基是完全匹配的，則最終的同一性百分比將是90％。在另一個實(shí)例中，將90個殘基的目的序列與100個殘基的查詢序列進(jìn)行比較。這次刪除是內(nèi)部刪除，因此目的序列的N-或C-末端沒有不與查詢序列匹配/比對的殘基。在這種情況中，通過FASTDB計(jì)算得出的同一性百分比無需進(jìn)行手工修正。再次申明，只有根據(jù)FASTDB比對的顯示位于目的序列的N-和C-末端以外、不與查詢序列匹配/比對的殘基位置需要手工矯正。在本發(fā)明中沒有進(jìn)行其它形式的人工修正。變體通常與長度與其相同的正常HA或治療性蛋白質(zhì)具有至少75％(優(yōu)選至少約80％、90％、95％或99％)的序列同一性。利用為了序列相似性搜索而修改的程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx(Karlin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA872264-2268，1990；及Altschul，J.Mol.Evol.36290-300，1993，完整引入作為參考)所采用的算法，通過BLAST(BasicLocalAlignmentSearchTool即基本局部比對搜索工具)分析測定核苷酸或氨基酸序列水平的同源性或同一性。BLAST程序所利用的方法首先考慮查詢序列與數(shù)據(jù)庫序列之間的相似區(qū)段，然后對鑒定得出的所有匹配評估統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，最后只總結(jié)那些滿足預(yù)定顯著性閾值的匹配。關(guān)于序列數(shù)據(jù)庫的相似性搜索中的基本問題的討論，參見Altschul等人，NatureGenetics6119-129，1994，將其完整引入作為參考。直方圖、描述、比對、期望值(即報告針對數(shù)據(jù)庫序列的配對的序列的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性閾值)、截止值、矩陣和過濾器的搜索參數(shù)都采用默認(rèn)設(shè)置。blastp、blastx、tblastn、和tblastx所采用的默認(rèn)評分矩陣是BLOSUM62矩陣(Henikoff等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA8910915-10919，1992，完整引入作為參考)。對于blastn，由M(即匹配殘基的獎分)和N(不匹配殘基的罰分)的比值來設(shè)置評分矩陣，其中M和N的缺省值分別是5和-4?？梢匀缦抡{(diào)整四個blastn參數(shù)Q＝10(缺口產(chǎn)生罰分)；R＝10(缺口延伸罰分)；wink＝1(沿著查詢序列在每一個winkth位置產(chǎn)生詞采樣數(shù))；gapw＝16(設(shè)定窗口寬度，其中產(chǎn)生含缺口比對)。同等的biastp參數(shù)設(shè)置為Q＝9；R＝2；wink＝1和gapw＝32?？蓮腉CG軟件包版本10.0中獲得的序列間比較程序Bestfit使用的DNA參數(shù)為GAP＝50(缺口產(chǎn)生罰分)和LEN＝3(缺口延伸罰分)，而蛋白質(zhì)比較的同等設(shè)置為GAP＝8和LEN＝2。本發(fā)明的多核苷酸變體可在編碼區(qū)、非編碼區(qū)、或二者中含有改變。尤其優(yōu)選含有產(chǎn)生沉默替代、添加、或刪除但不改變所編碼多肽的特性或活性的改變的多核苷酸變體。優(yōu)選由遺傳密碼簡并性引起的沉默替代產(chǎn)生的核苷酸變體。而且，還優(yōu)選任意組合的小于50、小于40、小于30、小于20、小于10、或5-50、5-25、5-10、1-5或1-2個氨基酸遭到替代、刪除、或添加的多肽變體?？梢詾榱硕喾N原因來產(chǎn)生多核苷酸變體，例如為了針對特定宿主優(yōu)化密碼子表達(dá)(將人mRNA中的密碼子改變?yōu)榧?xì)菌宿主諸如酵母或大腸桿菌偏愛的密碼子)。在一個優(yōu)選方案中，為了在酵母或哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)，對編碼清蛋白融合蛋白的清蛋白部分的本發(fā)明多核苷酸進(jìn)行了優(yōu)化。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，為了在酵母或哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)，對編碼清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分的本發(fā)明多核苷酸進(jìn)行了優(yōu)化。在又一個優(yōu)選實(shí)施方案中，為了在酵母或哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)，對編碼本發(fā)明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸進(jìn)行了優(yōu)化。在一個候選實(shí)施方案中，經(jīng)過密碼子優(yōu)化的編碼清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分的多核苷酸在本文描述的嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下不與編碼治療性蛋白質(zhì)的野生型多核苷酸發(fā)生雜交。在又一個實(shí)施方案中，經(jīng)過密碼子優(yōu)化的編碼清蛋白融合蛋白的清蛋白部分的多核苷酸在本文描述的嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下不與編碼清蛋白蛋白質(zhì)的野生型多核苷酸發(fā)生雜交。在另一個實(shí)施方案中，經(jīng)過密碼子優(yōu)化的編碼清蛋白融合蛋白的多核苷酸在本文描述的嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下不與編碼治療性蛋白質(zhì)部分或清蛋白蛋白質(zhì)部分的野生型多核苷酸發(fā)生雜交。在另外的實(shí)施方案中，編碼清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分的多核苷酸不包含治療性蛋白質(zhì)的天然存在序列或者不由其組成。在又一個實(shí)施方案中，編碼清蛋白融合蛋白的清蛋白蛋白質(zhì)部分的多核苷酸不包含清蛋白蛋白質(zhì)的天然存在序列或者不由其組成。在候選實(shí)施方案中，編碼清蛋白融合蛋白的多核苷酸不包含治療性蛋白質(zhì)部分或清蛋白蛋白質(zhì)部分的天然存在序列或者不由其組成。天然存在變體稱為“等位基因變體”，指占據(jù)生物體染色體上給定基因座的基因的幾種可替換形式之一(Genesll，Lewin，B.編，JohnWiley&Sons，NewYork，1985)。這些等位基因變體可以在多核苷酸和/或多肽水平有所不同，而且包括在本發(fā)明中?；蛘?，可通過誘變技術(shù)或直接合成技術(shù)制備非天然存在的變體。利用已知的蛋白質(zhì)工程和重組DNA技術(shù)的方法，可以產(chǎn)生變體以改進(jìn)或改變本發(fā)明多肽的特征。例如，可以從本發(fā)明多肽的N-末端或C-末端刪除一個或多個氨基酸而不導(dǎo)致生物學(xué)功能的實(shí)質(zhì)性喪失。例如，Ron等人(J.Biol.Chem.2682984-2988，1993)報道了甚至在刪除3、8、或27個氨基末端氨基酸殘基后仍具有肝素結(jié)合活性的變體KGF蛋白質(zhì)。類似地，γ干擾素在從此蛋白質(zhì)的羧基末端刪除8-10個氨基酸殘基后表現(xiàn)出更高的可達(dá)十倍的活性(Dobeli等人，J.Biotechnology7199-216，1988)。而且，有充足的證據(jù)證明，變體通常會保留與天然存在蛋白質(zhì)相似的生物學(xué)活性。例如，Gayle及其同事(J.Biol.Chem.26822105-22111，1993)對人細(xì)胞因子IL-1a進(jìn)行了廣泛的突變分析。他們利用隨機(jī)誘變產(chǎn)生了超過3,500種獨(dú)特IL-1a突變體，即在分子的全長上每種變體平均有2.5個氨基酸改變。在每個可能的氨基酸位置對多種突變進(jìn)行了檢查。研究人員發(fā)現(xiàn)“多數(shù)分子可在遭到改變的同時對[結(jié)合或生物學(xué)活性]影響很小”。事實(shí)上，在檢查的超過3,500種核苷酸序列中，只有23種獨(dú)特氨基酸序列產(chǎn)生了活性與野生型顯著不同的蛋白質(zhì)。而且，即使從多肽的N-末端或C-末端刪除一個或多個氨基酸會導(dǎo)致一種或多種生物學(xué)功能的修飾或喪失，但仍可保留其它生物學(xué)活性。例如，在從N-末端或C-末端除去少于分泌形式的多數(shù)殘基時，將有可能保留刪除變體誘導(dǎo)和/或結(jié)合識別分泌形式的抗體的能力。通過本文描述的和本領(lǐng)域其它途徑知道的常規(guī)方法可以容易的確定缺乏蛋白質(zhì)的N-末端或C-末端殘基的特定多肽是否保留了這種免疫原性活性。因此，本發(fā)明還包括具有功能活性(例如生物學(xué)活性和/或治療活性)的多肽變體。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了具有與治療性蛋白質(zhì)的一種或多種生物學(xué)和/或治療活性對應(yīng)的功能活性(例如生物學(xué)活性和/或治療活性)的清蛋白融合蛋白變體，其中治療性蛋白質(zhì)對應(yīng)于清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了具有與治療性蛋白質(zhì)的一種或多種生物學(xué)和/或治療活性對應(yīng)的功能活性(例如生物學(xué)活性/或治療活性)的清蛋白融合蛋白變體，其中治療性蛋白質(zhì)對應(yīng)于清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分。這種變體包括依照本領(lǐng)域已知的一般規(guī)則選擇的對活性影響很小的刪除、插入、倒位、重復(fù)、和替代。本發(fā)明還涵蓋編碼這種變體的多核苷酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的變體具有保守替代?！氨Ｊ靥娲敝冈诮M內(nèi)交換，諸如脂肪族或疏水性氨基酸Ala、Val、Leu和Ile的替換；羥基殘基Ser和Thr的替換；酸性殘基Asp和Glu的替換；酰胺殘基Asn和Gln的替換；堿性殘基Lys、Arg、和His的替換；芳香族殘基Phe、Tvr、和Trp的替換；及小型氨基酸Ala、Ser、Thr、Met、和Gly的替換。例如，Bowie等人，“DecipheringtheMessageinProteinSequencesTolerancetoAminoAcidSubstitutions”，Science2471306-1310，1990中提供了關(guān)于如何進(jìn)行表型沉默氨基酸替代的指導(dǎo)，其中作者指出研究氨基酸序列對變化的耐受性有兩種主要的策略。第一種策略利用了進(jìn)化過程中自然選擇的氨基酸替代的耐受性。通過比較不同物種的氨基酸序列可以鑒定保守氨基酸。這些保守氨基酸對蛋白質(zhì)的功能可能是重要的。相反，自然選擇已經(jīng)耐受的替換的氨基酸位置表明這些位置對蛋白質(zhì)功能不是至關(guān)重要的。因此，可以修飾耐受氨基酸替代的位置，同時仍保持該蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性。第二種策略利用遺傳工程在克隆基因的特定位置引入氨基酸變化，以鑒定對蛋白質(zhì)功能至關(guān)重要的區(qū)域。例如，可以使用定點(diǎn)誘變或丙氨酸掃描誘變(在分子中的每個殘基處引入單一丙氨酸突變)。參見Cunningham和Wells，Science2441081-1085，1989。然后可測試如此產(chǎn)生的突變分子的生物學(xué)活性。如作者所述，這兩種策略已經(jīng)揭示了蛋白質(zhì)能令人驚訝的耐受氨基酸替代。作者還指出了哪些氨基酸變化是蛋白質(zhì)中某些氨基酸位置有可能容許的。例如，大多數(shù)埋藏(在蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)內(nèi))的氨基酸殘基需要非極性側(cè)鏈，而表面?zhèn)孺湹暮苌偬厣ǔＪ潜Ｊ氐?。而且，耐受的保守氨基酸替代涉及脂肪族或疏水性氨基酸Ala、Val、Leu和Ile的替換；羥基殘基Ser和Thr的替換；酸性殘基Asp和Glu的替換；酰胺殘基Asn和Gln的替換；堿性殘基Lys、Arg和His的替換；芳香族殘基Phe、Tvr和Trp的替換；及小型氨基酸Ala、Ser、Thr、Met和Gly的替換。除保守氨基酸替代之外，本發(fā)明的變體包括(i)含有一個或多個非保守氨基酸殘基的提到的多肽，其中替代的氨基酸殘基可以是或不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)含有一個或多個具有取代基的氨基酸殘基的替代的多肽，或(iii)已經(jīng)與另一化合物諸如提高多肽穩(wěn)定性和/或溶解度的化合物(例如聚乙二醇)融合或化學(xué)綴合的多肽，或(iv)含有另外的氨基酸諸如例如IgGFc區(qū)融合肽的多肽。依據(jù)本文的教導(dǎo)，認(rèn)為這種變體多肽在本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員的范圍之內(nèi)。例如，含有用其它帶電荷或中性氨基酸替代帶電荷氨基酸的氨基酸替代的多肽變體可產(chǎn)生具有改良特性的蛋白質(zhì)，諸如聚集更少。藥學(xué)制劑的聚集不但降低活性，而且還提高因聚集物的免疫原性引起的清除。參見Pinckard等人，Clin.Exp.Immunol.2331-340，1967；Robbins等人，Diabetes36838-845，1987；Cleland等人，Crit.Rev.TherapeuticDrugCarrierSystems10307-377，1993。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽包含清蛋白融合蛋白的氨基酸序列、治療性蛋白質(zhì)和/或人血清清蛋白的氨基酸序列的片段或變體或者由其組成，其中片段或變體與參考氨基酸序列相比具有1-5、5-10、5-25、5-50、10-50或50-150個氨基酸殘基添加、替代、和/或刪除。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，氨基酸替代是保守的。本發(fā)明還涵蓋編碼這些多肽的核酸。本發(fā)明的多肽可以由彼此通過肽鍵或修飾肽鍵即肽電子等排體連接在一起的氨基酸構(gòu)成，而且可包含20種基因編碼的氨基酸以外的氨基酸。可以通過天然過程，諸如翻譯后加工，或者通過本領(lǐng)域眾所周知的化學(xué)修飾技術(shù)來修飾多肽。基礎(chǔ)教科書和更為詳細(xì)的專著，以及長篇研究文獻(xiàn)中對這種修飾進(jìn)行了很好的描述。修飾可發(fā)生在多肽中的任何地方，包括肽骨架、氨基酸側(cè)鏈、及氨基或羧基末端。應(yīng)理解，相同類型的修飾可以相同或不同程度存在于給定多肽的幾個位點(diǎn)處。而且，給定多肽可含有多種類型的修飾。多肽可以是分支的，例如由于泛蛋白化作用，而且它們也可以是具有或沒有分支的環(huán)狀?？梢杂煞g后天然加工產(chǎn)生環(huán)狀的、分支的、和分支環(huán)狀的多肽，或者可以通過合成方法來生成。修飾包括乙?；?、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黃素的共價附著、血紅素部分的共價附著、核苷酸或核苷酸衍生物的共價附著、脂質(zhì)或脂質(zhì)衍生物的共價附著、磷脂酰肌醇的共價附著、交聯(lián)、環(huán)化、二硫鍵形成、脫甲基、共價交聯(lián)的形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、γ羧化、糖基化、GPI錨形成、羥化、碘化、甲基化、肉豆蔻基化、氧化、PEG化、蛋白水解加工、磷酸化、異戊二烯基化、外消旋化、硒化(selenoylation)、硫酸化、轉(zhuǎn)移RNA介導(dǎo)的向蛋白質(zhì)上添加氨基酸諸如精氨?；?arginylation)、和泛蛋白化。(參見例如《PROTEINS-STRUCTUREANDMOLECULARPROPERTIES》，第2版，T.E.Creighton、W.H.FreemanandCompany，NewYork，1993；《POST-TRANSLATIONALCOVALENTMODIFICATIONOFPROTEINS》，B.C.Johnson編，AcademicPress，NewYork，第1-12頁，1983；Seifer等人，Meth.Enzymol.182626-646，1990；Rattan等人，Ann.N.YAcad.Sci.66348-62，1992)。功能活性“具有功能活性的多肽”指能夠表現(xiàn)出與治療性蛋白質(zhì)的全長、前蛋白、和/或成熟形式有關(guān)的一種或多種已知功能活性的多肽。這種功能活性包括但不限于生物學(xué)活性、抗原性[結(jié)合(或與多肽競爭結(jié)合)抗多肽抗體的能力]、免疫原性(產(chǎn)生與本發(fā)明的特定多肽結(jié)合的抗體的能力)、與本發(fā)明的多肽形成多聚體的能力、和與多肽的受體或配體結(jié)合的能力?！熬哂猩飳W(xué)活性的多肽”指根據(jù)具有或沒有劑量依賴性的特定生物學(xué)測定法的測量，顯示出與本發(fā)明的治療性蛋白質(zhì)包括成熟形式的活性相似但不必相同的活性的多肽。在確實(shí)存在劑量依賴性的情況中，與本發(fā)明的多肽相比，給定活性的劑量依賴性不必與多肽相同，只需基本相似(即相對于本發(fā)明的多肽，候選多肽將顯示出更大的活性或不超過約25倍的更小活性，優(yōu)選不超過約10倍的更小活性，最優(yōu)選不超過約3倍的更小活性)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白具有至少一種與治療性蛋白質(zhì)部分(或其片段或變體)未與清蛋白融合時有關(guān)的生物學(xué)和/或治療活性。在另外的優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白具有與融合狀態(tài)的治療性蛋白質(zhì)部分(或其片段或變體)相比升高的血漿穩(wěn)定性。可利用或常規(guī)修改本領(lǐng)域已知的測定法來測定本發(fā)明的清蛋白融合蛋白或未融合的治療性蛋白質(zhì)部分(或其片段或變體)的血漿穩(wěn)定性。可利用或常規(guī)修改本領(lǐng)域已知的測定法以及本文描述的測定法來測定本發(fā)明的清蛋白融合蛋白的功能活性(例如生物學(xué)活性)。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員利用其在表1的對應(yīng)行(例如表1的第3列)中參考的測定法可常規(guī)測定與清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分對應(yīng)的治療性蛋白質(zhì)的片段的活性。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員利用本領(lǐng)域已知的和/或下文實(shí)施例部分描述的測定法可常規(guī)測定與清蛋白融合蛋白的清蛋白蛋白質(zhì)部分對應(yīng)的清蛋白蛋白質(zhì)的片段的活性。例如，在測定清蛋白融合蛋白結(jié)合或與治療性蛋白質(zhì)競爭結(jié)合抗治療性多肽抗體和/或抗清蛋白抗體的能力的一個實(shí)施方案中，可以使用本領(lǐng)域已知的各種免疫測定法，包括但不限于利用諸如放射免疫測定法、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定法)、“三明治免疫測定法”、免疫放射測定法、凝膠擴(kuò)散沉淀反應(yīng)、免疫擴(kuò)散測定法、原位免疫測定法(例如利用膠體金、酶或放射性同位素標(biāo)記物)、蛋白質(zhì)印跡、沉淀反應(yīng)、凝集測定法(例如凝膠凝集測定法、血凝集測定法)、補(bǔ)體結(jié)合測定法、免疫熒光測定法、蛋白質(zhì)A測定法和免疫電泳測定法等技術(shù)的競爭性和非競爭性測定系統(tǒng)。在一個實(shí)施方案中，通過檢測一抗上的標(biāo)記物來檢測抗體結(jié)合。在另一個實(shí)施方案中，通過檢測二抗或試劑與一抗的結(jié)合來檢測一抗。在又一個實(shí)施方案中，二抗經(jīng)過標(biāo)記。本領(lǐng)域知道用于在免疫測定法中檢測結(jié)合的許多方法，而且它們在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。在鑒定治療性蛋白質(zhì)的結(jié)合配偶體(例如受體或配體)的一個優(yōu)選實(shí)施例中，例如通過本領(lǐng)域眾所周知的方法諸如例如還原性和非還原性凝膠層析、蛋白質(zhì)親和層析和親和印跡可以測定包含該治療性蛋白質(zhì)作為融合物的治療性蛋白質(zhì)部分的清蛋白融合蛋白與該結(jié)合配偶體的結(jié)合。通常參見Phizicky等人，Microbiol.Rev.5994-123，1995。在另一個實(shí)施方案中，利用本領(lǐng)域已知的技術(shù)可以常規(guī)測定清蛋白融合蛋白結(jié)合與融合物的治療性蛋白質(zhì)部分對應(yīng)的治療性多肽的底物的生理學(xué)關(guān)聯(lián)能力。在評估清蛋白融合蛋白的多聚化能力的候選實(shí)施方案中，例如通過本領(lǐng)域眾所周知的方法諸如例如還原性和非還原性凝膠層析、蛋白質(zhì)親和層析和親和印跡可以測定多聚體與其它組分的締合。通常參見Phizicky等人，見上文。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，包含結(jié)合治療性蛋白質(zhì)的抗體的整個或部分的清蛋白融合蛋白具有至少一種與結(jié)合治療性蛋白質(zhì)的抗體(或其片段或變體)未與清蛋白融合時有關(guān)的生物學(xué)和/或治療活性(例如特異結(jié)合多肽或表位)。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，包含結(jié)合治療性蛋白質(zhì)的抗體的整個或部分的清蛋白融合蛋白的生物學(xué)活性和/或治療活性是對與受到結(jié)合治療性蛋白質(zhì)的抗體特異結(jié)合的多肽有關(guān)的一種或多種生物學(xué)活性和/或治療活性的抑制(即拮抗作用)或激活(即激動作用)。可以以多種方式表征包含結(jié)合治療性蛋白質(zhì)的抗體的至少一個片段或變體的清蛋白融合蛋白。具體而言，利用本文描述的技術(shù)或常規(guī)修改本領(lǐng)域已知的技術(shù)，可以對包含結(jié)合治療性蛋白質(zhì)的抗體的至少一個片段或變體的清蛋白融合蛋白測定清蛋白融合蛋白特異性結(jié)合受到結(jié)合治療性蛋白質(zhì)的抗體特異結(jié)合的相同抗原的能力，其中所述治療性蛋白質(zhì)對應(yīng)于清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分。針對清蛋白融合蛋白(例如包含結(jié)合治療性蛋白質(zhì)的抗體的至少一個片段或變體)(特異)結(jié)合特定蛋白質(zhì)或表位的能力的測定法可以在溶液中(例如Houghten，Bio/Techniques13412-421，1992)、在珠子上(例如Lam，Nature35482-84，1991)、在芯片上(例如Fodor，Nature364555-556，1993)、在細(xì)菌上(例如美國專利號5,223,409)、在孢子上(例如專利號5,571,698；5,403,484；和5,223,409)、在質(zhì)粒上(例如Cull等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA891865-1869，1992)、或在噬菌體上(例如Scott和Smith，Science249386-390，1990；Devlin，Science249404-406，1990；Cwirla等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA876378-6382，1990；及Felici，J.Mol.Biol.222301-310，1991)進(jìn)行。(將這些參考文獻(xiàn)全部完整引入本文作為參考)。利用或常規(guī)修改本文描述的或本領(lǐng)域其它途徑知道的技術(shù)，也可以對包含治療性抗體的至少一個片段或變體的清蛋白融合蛋白測定其對特定蛋白質(zhì)或表位的特異性和親和力。利用本領(lǐng)域已知的任何方法，可以對包含結(jié)合治療性蛋白質(zhì)的抗體的至少一個片段或變體的清蛋白融合蛋白測定與其它抗原(例如與受到抗體特異結(jié)合的分子具有序列/結(jié)構(gòu)保守性的分子，其中抗體結(jié)合與本發(fā)明的清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分對應(yīng)的治療性蛋白質(zhì)(或其片段或變體))的交叉反應(yīng)性。可用于分析(免疫特異性)結(jié)合和交叉反應(yīng)性的免疫測定法包括但不限于利用諸如蛋白質(zhì)印跡、放射免疫測定法、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定法)、“三明治”免疫測定法、免測沉淀測定法、沉淀素反應(yīng)、凝膠擴(kuò)散沉淀素反應(yīng)、免疫擴(kuò)散測定法、凝集測定法、補(bǔ)體結(jié)合測定法、免疫放射測定法、熒光免疫測定法、和蛋白質(zhì)A免疫測定法等技術(shù)的競爭性和非競爭性測定系統(tǒng)，這里只提到了一些。這種測定法是常規(guī)的，而且是本領(lǐng)域眾所周知的(例如參見Ausubel等人，編，1994，《CurrentProtocolsinMolecularBiology》，第1卷，JohnWiley&Sons，Inc.，NewYork，將其完整引入本文作為參考)。下文簡述了示例性的免疫測定法(但無意限制)。免測沉淀方案通常包括在溶解緩沖液諸如補(bǔ)充有蛋白質(zhì)磷酸酶和/或蛋白酶抑制劑(例如EDTA、PMSF、抑酶肽、釩酸鈉)的RIPA緩沖液(1％NP-40或TFritonX-100，1％脫氧膽酸鈉，0.1％SDS，0.15MNaCl，pH7.2的0.01M磷酸鈉，1％Trasylol)中溶解細(xì)胞群，向細(xì)胞溶解物中添加本發(fā)明的清蛋白融合蛋白(例如包含結(jié)合治療性蛋白質(zhì)的抗體的至少一個片段或變體)，于40攝氏度溫育一段時間(例如1到4小時)，向細(xì)胞溶解物中添加例如與抗清蛋白抗體偶聯(lián)的sepharose珠，于40攝氏度溫育約一小時或更長時間，在溶解緩沖液中洗滌珠子，并將珠子重懸于SDS/樣品緩沖液。利用例如蛋白質(zhì)印跡分析可以評估清蛋白融合蛋白免疫沉淀特定抗原的能力。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解可以通過修改參數(shù)來增加清蛋白融合蛋白與抗原的結(jié)合并降低背景(例如用sepharose珠預(yù)先澄清細(xì)胞溶解物)。關(guān)于免測沉淀方案的更多討論參見例如Ausubel等人，編，1994，《CurrentProtocolsinMolecularBiology》，第1卷，JohnWiley&Sons，Inc.，NewYork，頁碼10.16.1。蛋白質(zhì)印跡分析通常包括制備蛋白質(zhì)樣品，在聚丙烯酰胺凝膠(例如依據(jù)抗原分子量選擇8％-20％的SDS-PAGE)中電泳蛋白質(zhì)樣品，將蛋白質(zhì)樣品從聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移至薄膜諸如硝酸纖維素、PVDF或尼龍，在封閉液(例如含有3％BSA或脫脂奶的PBS)中封閉薄膜，在洗滌緩沖液(例如PBS-吐溫20)中洗滌薄膜，將本發(fā)明的清蛋白融合蛋白(在封閉緩沖液中稀釋)施加到薄膜上，在洗滌緩沖液中洗滌薄膜，施加在封閉緩沖液中稀釋的與酶底物(例如辣根過氧化酶或堿性磷酸酶)或放射性分子(例如32p或125I)綴合的二抗(它識別清蛋白融合蛋白，例如抗人血清清蛋白抗體)，在洗滌緩沖液中洗滌薄膜，并檢測抗原的存在。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解可以通過修改參數(shù)來增加檢測的信號并降低背景噪聲。關(guān)于蛋白質(zhì)印跡方案的更多討論參見例如Ausubel等人，編，1994，《CurrentProtocolsinMolecularBiology》，第1卷，JohnWiley&Sons，Inc.，NewYork，頁碼10.8.1。ELISA包括制備抗原，用抗原包被96孔微量滴定板的孔，洗去未與孔結(jié)合的抗原，向孔中添加與可檢測化合物諸如酶底物(例如辣根過氧化酶或堿性磷酸酶)綴合的本發(fā)明的清蛋白融合蛋白(例如包含結(jié)合治療性蛋白質(zhì)的抗體的至少一個片段或變體)并溫育一段時間，洗去未結(jié)合的或非特異結(jié)合的清蛋白融合蛋白，并檢測與包被孔的抗原特異性結(jié)合的清蛋白融合蛋白的存在。在ELISA中，清蛋白融合蛋白不必與可檢測化合物綴合；而是可將與可檢測化合物綴合的二抗(它識別清蛋白融合蛋白)添加到孔中。另外，可用清蛋白融合蛋白包被孔代替用抗原包被孔。在這種情況中，可檢測分子可以是與可檢測化合物諸如酶底物(例如辣根過氧化酶或堿性磷酸酶)綴合的抗原。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解可以通過修改參數(shù)來增加檢測信號，以及本領(lǐng)域知道的的其它ELISA變化。關(guān)于ELISA的更多討論參見Ausubel等人，編，1994，《CurrentProtocolsinMolecularBiology》，第1卷，JohnWiley&Sons，Inc.，NewYork，頁碼11.2.1。通過競爭性結(jié)合測定法可以測定清蛋白融合蛋白與蛋白質(zhì)、抗原、或表位的結(jié)合親和力及清蛋白融合蛋白-蛋白質(zhì)/抗原/表位相互作用的解離速率(off-rate)。競爭性結(jié)合測定法的一個實(shí)例是放射免疫測定法，它包括在存在數(shù)量漸增的未標(biāo)記抗原的條件下，將經(jīng)標(biāo)記抗原(例如3H或125I)與本發(fā)明的清蛋白融合蛋白一起溫育，并檢測與經(jīng)標(biāo)記抗原結(jié)合的抗體?？梢杂蒘catchard繪圖分析的數(shù)據(jù)測定清蛋白融合蛋白對特定蛋白質(zhì)、抗原、或表位的親和力和結(jié)合解離速率。利用放射免疫測定法還可以測定與第二蛋白質(zhì)的競爭，所述第二蛋白質(zhì)與清蛋白融合蛋白結(jié)合相同的蛋白質(zhì)、抗原、或表位。在這種情況中，將蛋白質(zhì)、抗原、或表位與綴合了標(biāo)記化合物(例如3H或125I)的清蛋白融合蛋白在存在數(shù)量漸增的未標(biāo)記第二蛋白質(zhì)的條件下一起溫育，所述第二蛋白質(zhì)與本發(fā)明的清蛋白融合蛋白結(jié)合相同的蛋白質(zhì)、抗原、或表位。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，利用BIAcore動力學(xué)分析來測定本發(fā)明的清蛋白融合蛋白與蛋白質(zhì)、抗原、或表位的結(jié)合和解離速率(bindingonandoffrate)。BIAcore動力學(xué)分析包括分析清蛋白融合蛋白或者特定多肽、抗原或表位與其表面上分別固定了特定多肽、抗原或表位或者清蛋白融合蛋白的芯片的結(jié)合和解離。結(jié)合與清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分對應(yīng)的治療性蛋白質(zhì)的抗體也可在其對給定蛋白質(zhì)或抗原優(yōu)選它們特異結(jié)合的抗原的結(jié)合親和力方面進(jìn)行描述或說明。優(yōu)選的結(jié)合親和力包括解離常數(shù)或Kd小于5×10-2M、10-2M、5×10-3M、10-3M、5×10-4M、10-4的結(jié)合親和力。更優(yōu)選的結(jié)合親和力包括解離常數(shù)或Kd小于5×10-5M、10-5M、5×10-6M、10-6M、5×10-7M、107M、5×10-8M或10-8M的結(jié)合親和力。甚至更優(yōu)選的結(jié)合親和力包括解離常數(shù)或Kd小于5×10-9M、10-9M、5×10-10M、10-10M、5×10-11M、10-11M、5×10-12M、10-12M、5×10-13M、10-13M、5×10-14M、10-14M、5×10-15M或10-15M的結(jié)合親和力。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，考慮到清蛋白融合蛋白(包含結(jié)合治療性蛋白質(zhì)的抗體的至少一個片段或變體)的效價和對應(yīng)抗體的效價，包含結(jié)合治療性蛋白質(zhì)的抗體的至少一個片段或變體的清蛋白融合蛋白對給定蛋白質(zhì)或表位的親和力與對應(yīng)的結(jié)合治療性蛋白質(zhì)的抗體(未與清蛋白融合)的親和力相似。另外，可以常規(guī)利用本文描述的(參見實(shí)施例和表1)和本領(lǐng)域其它途徑知道的測定法來測量清蛋白融合蛋白及其片段、變體和衍生物引發(fā)與清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分和/或清蛋白部分有關(guān)的生物學(xué)活性和/或治療活性(或在體外或在體內(nèi))的能力。熟練技術(shù)人員還知道其它方法，而且它們在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。清蛋白如上所述，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白包含治療性蛋白質(zhì)的至少一個片段或變體及人血清清蛋白的至少一個片段或變體，兩者彼此相連，優(yōu)選通過基因融合。另外的實(shí)施方案包含治療性蛋白質(zhì)的至少一個片段或變體及人血清清蛋白的至少一個片段或變體，兩者通過化學(xué)綴合彼此相連。術(shù)語人血清清蛋白(HSA)和人清蛋白(HA)在本文中可互換使用。術(shù)語“清蛋白”和“血清清蛋白”范圍更寬，涵蓋人血清清蛋白(及其片段和變體)以及來自其它的物種的清蛋白(及其片段和變體)。在用于本文時，“清蛋白”指清蛋白蛋白質(zhì)或氨基酸序列，或者具有清蛋白的一種或多種功能活性(例如生物學(xué)活性)的清蛋白片段或變體的總體。具體而言，“清蛋白”指人清蛋白或其片段(例如參見EP201239、EP322094、WO97/24445、WO95/23857)，尤其是如圖1和SEQIDNO1所示的人清蛋白的成熟形式，或者來自其它脊椎動物的清蛋白或其片段，或者這些分子或其片段的類似物或變體。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于本發(fā)明的清蛋白融合蛋白的人血清清蛋白蛋白質(zhì)含有下列兩組點(diǎn)突變組合中的一組或兩組編號參考SEQIDNO1，Leu-407突變?yōu)锳la、Leu-408突變?yōu)閂al、Val-409突變?yōu)锳la且Arg-410突變?yōu)锳la；或者Arg-410突變?yōu)锳、Lys-413突變?yōu)镚ln且Lys-414突變?yōu)镚ln(例如參見國際公開號WO95/23857，完整引入本文作為參考)。在甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案中，含有上述兩組點(diǎn)突變中的一組或兩組的本發(fā)明的清蛋白融合蛋白具有改進(jìn)的穩(wěn)定性/對酵母Yap3p蛋白水解切割的抵抗性，允許在酵母宿主細(xì)胞中表達(dá)的重組清蛋白融合蛋白的產(chǎn)量升高。在用于本文時，足以延長治療性蛋白質(zhì)的治療活性、血漿穩(wěn)定性或保存期的部分清蛋白指在長度或結(jié)構(gòu)上足以穩(wěn)定或延長蛋白質(zhì)的治療活性或血漿穩(wěn)定性，因此清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分的保存期或血漿穩(wěn)定性與非融合狀態(tài)的保存期或血漿穩(wěn)定性相比得到了延長或延伸的部分清蛋白。清蛋白融合蛋白的清蛋白部分可以包含如上所述的全長HA序列，或者可以包括其能夠穩(wěn)定或延長治療活性的一個或多個片段。這種片段的長度可以是10個或更多氨基酸，或者可以包括大約15、20、25、30、50或更多的來自HA序列的連續(xù)氨基酸，或者可以包括HA的特定結(jié)構(gòu)域的部分或整個。例如，可以利用跨越最初兩個免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域的一個或多個HA片段。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，HA片段是成熟形式的HA。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白的清蛋白部分可以是正常HA的變體。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分也可以是本文描述的治療性蛋白質(zhì)的變體。術(shù)語“變體”包括保守或非保守的插入、刪除和替代，其中這種變化基本上不改變清蛋白的滲透(oncotic)、有用的配體結(jié)合和非免疫原性特性中的一種或多種，或者賦予治療性蛋白質(zhì)以治療活性的活性位點(diǎn)或活性結(jié)構(gòu)域。具體而言，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白可以包括人清蛋白的天然存在多態(tài)變體和人清蛋白的片段，例如EP322094中公開的片段(即HA(Pn)，其中n是369到419)。清蛋白可以衍生自任何脊椎動物，尤其是任何哺乳動物，例如人、牛、綿羊或豬。非哺乳動物清蛋白包括但不限于雞和鮭魚。清蛋白融合蛋白的清蛋白部分可來自與治療性蛋白質(zhì)部分不同的動物。一般而言，HA片段或變體至少長100個氨基酸，優(yōu)選至少長150個氨基酸。HA變體可以由HA的至少一個完整結(jié)構(gòu)域組成或者包含它，例如結(jié)構(gòu)域1(SEQIDNO1的氨基酸1-194)、結(jié)構(gòu)域2(SEQIDNO1的氨基酸195-387)、結(jié)構(gòu)域3(SEQIDNO1的氨基酸388-585)、結(jié)構(gòu)域1和2(SEQIDNO1的1-387)，結(jié)構(gòu)域2和3(SEQIDNO1的195-585)、或者結(jié)構(gòu)域1和3(SEQIDNO1的氨基酸1-194和SEQIDNO1的氨基酸388-585)。每個結(jié)構(gòu)域自身由兩個同源子結(jié)構(gòu)域組成，即1-105、120-194、195-291、316-387、388-491和512-585，而子結(jié)構(gòu)域間柔性接頭區(qū)包含殘基Lys106到Glu119、Glu292到Val315和G1u492到Ala511。優(yōu)選的是，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白的清蛋白部分包含至少一個HA的子結(jié)構(gòu)域或結(jié)構(gòu)域或其保守修飾。如果融合物以子結(jié)構(gòu)域?yàn)榛A(chǔ)，優(yōu)選用一些或所有相鄰接頭來連接治療性蛋白質(zhì)部分。特異結(jié)合治療性蛋白質(zhì)的抗體也是治療性蛋白質(zhì)本發(fā)明還涵蓋包含特異結(jié)合表1中公開的治療性蛋白質(zhì)的抗體的至少一個片段或變體的清蛋白融合蛋白。明確考慮了術(shù)語“治療性蛋白質(zhì)”涵蓋結(jié)合治療性蛋白質(zhì)(例如表1的第1列中所述)及其片段和變體的抗體。因此，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白可以含有治療性蛋白質(zhì)的至少一個片段或變體和/或結(jié)合治療性蛋白質(zhì)的抗體的至少一個片段或變體。抗體結(jié)構(gòu)和背景已知基本的抗體結(jié)構(gòu)單位包含四聚體。每個四聚體由兩對相同的多肽鏈構(gòu)成，每一對具有一條“輕鏈”(大約25kDa)和一條“重鏈”(大約50-70kDa)。每條鏈的氨基末端部分包括大約100到110個或更多個氨基酸的可變區(qū)，它主要負(fù)責(zé)抗原識別。每條鏈的羧基末端部分定義為恒定區(qū)，它主要負(fù)責(zé)效應(yīng)物功能。人輕鏈分為κ和λ輕鏈。重鏈分為μδ、γα或ε，并分別將抗體同種型定義為IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。一般參見《FundamentalImmunology》，第3-5章(Paul，W.，編，第4版，RavenPress，N.Y.，1998)(將其完整引入本文用于所有目的)。每對輕鏈/重鏈的可變區(qū)形成抗體結(jié)合位點(diǎn)。因此，完整的IgG抗體具有兩個結(jié)合位點(diǎn)。除雙功能或雙特異性抗體外，這兩個結(jié)合位點(diǎn)是相同的。所有鏈都顯示出相同的整體結(jié)構(gòu)，即由三個高變區(qū)，也稱為互補(bǔ)決定區(qū)或CDR，連接起來的相對保守的框架區(qū)(FR)。CDR區(qū)通常是抗體中與抗原接觸并決定其特異性的部分。來自每一對的重鏈和輕鏈的CDR通過框架區(qū)而對齊，從而能夠與特異表位結(jié)合。從N-末端到C-末端，輕鏈和重鏈可變區(qū)都包含結(jié)構(gòu)域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。可變區(qū)與重鏈或輕鏈恒定區(qū)相連。每個結(jié)構(gòu)域的氨基酸分配符合Kabat，《SequencesofProteinsofImmunologicalInterest》，NationalInstitutesofHealth，Bethesda，Md.，1987和1991；Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196901-917，1987；Chothia等人，Nature342878-883，1989的定義。在用于本文時，“抗體”指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有特異結(jié)合抗原的抗原結(jié)合位點(diǎn)的分子(例如含有抗體的一個或多個CDR區(qū)的分子)。可對應(yīng)于清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分的抗體包括但不限于單克隆的、多特異性的、人的、人源化的或嵌合的抗體、單鏈抗體(例如單鏈Fv)、Fab片段、F(ab′)片段、由Fab表達(dá)庫產(chǎn)生的片段、抗獨(dú)特型(抗Id)抗體(包括例如對本發(fā)明的抗體特異的抗Id抗體)、和任何上述的表位結(jié)合片段(例如VH結(jié)構(gòu)域、VL結(jié)構(gòu)域、或者一個或多個CDR區(qū))。結(jié)合治療性蛋白質(zhì)的抗體本發(fā)明涵蓋包含結(jié)合治療性蛋白質(zhì)(例如表1中所公開的)或其片段或變體的抗體的至少一個片段或變體的清蛋白融合蛋白。結(jié)合治療性蛋白質(zhì)(或其片段或變體)的抗體可以來自任何動物起源，包括鳥和哺乳動物。優(yōu)選的是，抗體是人、鼠(例如小鼠和大鼠)、驢、綿羊、兔、山羊、豚鼠、駱駝、馬或雞的抗體。最優(yōu)選的是，抗體是人的抗體。在用于本文時，“人的”抗體包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗體，而且包括從人免疫球蛋白庫和經(jīng)過遺傳工程改造而產(chǎn)生人抗體的轉(zhuǎn)基因小鼠(xenomice)或其它生物體分離得到的抗體。結(jié)合治療性蛋白質(zhì)且可對應(yīng)于本發(fā)明的清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分的抗體分子可以是免疫球蛋白分子的任何型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、類(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亞類。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)合治療性蛋白質(zhì)且可對應(yīng)于清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分的抗體分子是IgG1。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)合治療性蛋白質(zhì)且可對應(yīng)于清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分的免疫球蛋白分子是IgG2。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)合治療性蛋白質(zhì)且可對應(yīng)于清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分的免疫球蛋白分子是IgG4。最優(yōu)選的是，結(jié)合治療性蛋白質(zhì)且可對應(yīng)于清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分的抗體是本發(fā)明的人抗原結(jié)合抗體片段，包括但不限于Fab、Fab′和F(ab′)2、Fd、單鏈Fv(scFv)、單鏈抗體、二硫鍵連接的Fv(sdfv)和包含VL或VH結(jié)構(gòu)域的片段?？乖Y(jié)合抗體片段，包括單鏈抗體，可只包含可變區(qū)，或者連同下列的整個或部分絞鏈區(qū)、CH1、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。結(jié)合治療性蛋白質(zhì)且可對應(yīng)于清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分的抗體可以是單特異性的、雙特異性的、三特異性的或更高多特異性的抗體。多特異性抗體可以是對治療性蛋白質(zhì)的不同表位具有特異性，或者可以是對治療性蛋白質(zhì)以及以及異源表位諸如異源多肽或固相支持物二者都具有特異性。參見例如PCT出版物WO93/17715；WO92/08802；WO91/00360；WO92/05793；Tutt等人，J.Immunol.14760-69，1991；美國專利號4,474,893；4,714,681；4,925,648；5,573,920；5,601,819；Kostelny等人，J.Immunol.1481547-1553，1992。結(jié)合治療性蛋白質(zhì)(或其片段或變體)的抗體可以是雙特異性或雙功能性的，這意味著抗體是具有兩對不同的重鏈/輕鏈和兩個不同的結(jié)合位點(diǎn)的人工雜合抗體。可以利用多種方法，包括雜交瘤融合或Fab′片段的連接來生成雙特異性抗體。參見例如Songsivilai和Lachmann，Clin.Exp.Immunol.79315-321，1990；Kostelny等人，J.Immunol.1481547-1553，1992。另外，雙特異性抗體可以以“雙抗體”(Holliger等人，“′Diabodies′smallbivalentandbispecificantibodyfragments”，PNASUSA906444-6448，1993)或“Janusins”(Traunecker等人，“Bispecificsinglechainmolecules(Janusins)targetcytotoxiclymphocytesonHIVinfectedcells”，EMBOJ103655-3659，1991；及Traunecker等人，“Janusinnewmoleculardesignforbispecificreagents”，Int.J.Cancer增刊751-52，1992)的形式形成。本發(fā)明還提供包含本文描述的或本領(lǐng)域其它途徑知道的抗體的片段或變體(包括衍生物)的清蛋白融合蛋白?？梢岳帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員知道的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，包括例如導(dǎo)致氨基酸替代的定點(diǎn)誘變和PCR介導(dǎo)的誘變，將突變引入編碼本發(fā)明分子的核苷酸序列中。優(yōu)選的是，變體(包括衍生物)相對于參考VH結(jié)構(gòu)域、VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VL結(jié)構(gòu)域、VLCDR1、VLCDR2、或VLCDR3編碼少于50個氨基酸替代、少于40個氨基酸替代、少于30個氨基酸替代、少于25個氨基酸替代、少于20個氨基酸替代、少于15個氨基酸替代、少于10個氨基酸替代、少于5個氨基酸替代、少于4個氨基酸替代、少于3個氨基酸替代、或少于2個氨基酸替換。在具體的實(shí)施方案中，變體編碼VHCDR3的替代。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，變體在一個或多個預(yù)測的非關(guān)鍵氨基酸殘基處具有保守氨基酸替代。結(jié)合治療性蛋白質(zhì)且可對應(yīng)于清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分的抗體可在其識別或特異結(jié)合的治療性蛋白質(zhì)的表位或部分方面進(jìn)行描述或說明。還可以排除特異結(jié)合治療性蛋白質(zhì)或治療性蛋白質(zhì)的特定表位的抗體。因此，本發(fā)明涵蓋特異結(jié)合治療性蛋白質(zhì)的抗體，并容許排除所述抗體。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，包含結(jié)合治療性蛋白質(zhì)的抗體的至少一個片段或變體的清蛋白融合蛋白與該抗體自身的未融合片段或變體結(jié)合相同的表位。結(jié)合治療性蛋白質(zhì)且可對應(yīng)于清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分的抗體也可在其交叉反應(yīng)性方面進(jìn)行描述或說明。不結(jié)合治療性蛋白質(zhì)的任何其它類似物、直向同源物(ortholog)或同系物的抗體也包括在內(nèi)。結(jié)合與治療性蛋白質(zhì)具有至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少65％、至少60％、至少55％、和至少50％序列同一性(利用本領(lǐng)域已知的和本文描述的方法計(jì)算)的多肽的抗體也包括在本發(fā)明中。在具體的實(shí)施方案中，結(jié)合治療性蛋白質(zhì)且可對應(yīng)于清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分的抗體與人蛋白質(zhì)的鼠、大鼠/或兔同系物及其對應(yīng)的表位發(fā)生交叉反應(yīng)。不結(jié)合與治療性蛋白質(zhì)具有小于95％、小于90％、小于85％、小于80％、小于75％、小于70％、小于65％、小于60％、小于55％、和小于50％序列同一性(利用本領(lǐng)域已知的和本文描述的方法計(jì)算)的多肽的抗體也包括在本發(fā)明中。在一個具體的實(shí)施方案中，上文所述交叉反應(yīng)性涉及任何本文公開的單一的特定抗原性或免疫原性多肽，或者2、3、4、5或更多種特定抗原性和/或免疫原性多肽的組合。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，包含結(jié)合治療性蛋白質(zhì)的抗體的至少一個片段或變體的清蛋白融合蛋白具有與該特定抗體自身的片段或變體相似或基本相同的交叉反應(yīng)性特征。本發(fā)明還包括結(jié)合由在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下(如本文所述)與編碼治療性蛋白質(zhì)的多核苷酸發(fā)生雜交的多核苷酸編碼的多肽的抗體。結(jié)合治療性蛋白質(zhì)且可對應(yīng)于本發(fā)明的清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分結(jié)合的抗體也可在其對本發(fā)明的多肽的結(jié)合親和力方面進(jìn)行描述或說明。優(yōu)選的結(jié)合親和力包括解離常數(shù)或Kd小于5×10-2M、10-2M、5×10-3M、10-3M、5×10-4M、10-4的結(jié)合親和力。更優(yōu)選的結(jié)合親和力包括解離常數(shù)或Kd小于5×10-5M、10-5M、5×10-6M、10-6M、5×10-7M、107M、5×10-8M或10-8M的結(jié)合親和力。甚至更優(yōu)選的結(jié)合親和力包括解離常數(shù)或Kd小于5×10-9M、10-9M、5×10-10M、10-10M、5×10-11M、10-11M、5×10-12M、10-12M、5×10-13M、10-13M、5×10-14M、10-14M、5×10-15M或10-15M的結(jié)合親和力。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，考慮到清蛋白融合蛋白(包含結(jié)合治療性蛋白質(zhì)的抗體的至少一個片段或變體)的效價和對應(yīng)抗體的效價，包含結(jié)合治療性蛋白質(zhì)的抗體的至少一個片段或變體的清蛋白融合蛋白對給定蛋白質(zhì)或表位的親和力與對應(yīng)的結(jié)合治療性蛋白質(zhì)的抗體(未與清蛋白融合)的親和力相似。本發(fā)明還提供了根據(jù)本領(lǐng)域已知的用于測定競爭性結(jié)合的任何方法例如本文描述的免疫測定法的測定，競爭性抑制抗體對治療性蛋白質(zhì)的表位的結(jié)合的抗體。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗體競爭性抑制了至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少60％、或至少50％對表位的結(jié)合。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，包含結(jié)合治療性蛋白質(zhì)的抗體的至少一個片段或變體的清蛋白融合蛋白競爭性抑制二抗對治療性蛋白質(zhì)的表位的結(jié)合。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，包含結(jié)合治療性蛋白質(zhì)的抗體的至少一個片段或變體的清蛋白融合蛋白競爭性抑制至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少60％、或至少50％二抗對治療性蛋白質(zhì)的表位的結(jié)合。結(jié)合治療性蛋白質(zhì)且可對應(yīng)于本發(fā)明的清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分的抗體可以作為治療性蛋白質(zhì)的激動劑或拮抗劑起作用。例如，本發(fā)明包括部分或完全中斷受體/配體與本發(fā)明的多肽相互作用的抗體。本發(fā)明的特色不但有受體特異性抗體，而且有配體特異性抗體。本發(fā)明的特色還有不阻止配體結(jié)合但阻止受體活化的受體特異性抗體?？梢岳帽疚拿枋龅幕虮绢I(lǐng)域其它途徑知道的技術(shù)來確定受體活化(即信號傳導(dǎo))。例如，通過免疫沉淀和隨后的蛋白質(zhì)印跡分析(例如上文所述)檢測受體或其底物的磷酸化(例如酪氨酸或絲氨酸/蘇氨酸)可以確定受體活化。在具體的實(shí)施方案中，提供了將配體活性或受體活性相對于不存在抗體時的活性抑制了至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少60％、或至少50％的抗體。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，包含結(jié)合治療性蛋白質(zhì)的抗體的至少一個片段或變體的清蛋白融合蛋白在阻止配體結(jié)合和/受體活化方面性具有與結(jié)合治療性蛋白質(zhì)的抗體的未融合片段或變體相似或基本相似的特征。本發(fā)明的特色還有阻止配體結(jié)合和受體活化二者的受體特異性抗體，以及識別受體-配體復(fù)合物的抗體，且優(yōu)選不特異性識別未結(jié)合的受體或未結(jié)合的配體。同樣地，本發(fā)明包括結(jié)合配體且阻止配體與受體結(jié)合的中和性抗體，以及結(jié)合配體由此阻止受體活化但不阻止配體與受體結(jié)合的抗體。本發(fā)明還包括活化受體的抗體。這些抗體可以作為受體激動劑，即強(qiáng)化或活化配體介導(dǎo)的受體活化的生物學(xué)活性的全部或子集，例如通過誘導(dǎo)受體的二聚化?？梢灾付贵w是生物學(xué)活性包括治療性蛋白質(zhì)(例如表1中所公開的)的特定生物學(xué)活性的激動劑、拮抗劑或反相激動劑。利用本領(lǐng)域已知的方法可以生成上述抗體激動劑。例如參見PCT出版物WO96/40281；美國專利號5,811,097；Deng等人，Blood92(6)1981-1988，1988；Chen等人，CancerRes.58(16)3668-3678，1998；Harrop等人，J.Immunol.161(4)1786-1794，1998；Zhu等人，CancerRes.58(15)3209-3214，1998；Yoon等人，J.Immunol.160(7)3170-3179，1998；Prat等人，J.Cell.Sci.111(Pt2)237-147，1998；Pitard等人，J.Immunol.Methods205(2)177-190，1997；Liautard等人，Cytokine9(4)233-241，1997；Carlson等人，J.Biol.Chem.271(17)11295-11301，1997；Taryman等人，Neuron14(4)755-762，1995；Muller等人，Structure6(9)1153-1167，1998；Bartunek等人，Cytokine8(1)14-20，1996(將它們都完整引入本文作為參考)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，包含結(jié)合治療性蛋白質(zhì)的抗體的至少一個片段或變體的清蛋白融合蛋白具有與結(jié)合治療性蛋白質(zhì)的抗體的未融合片段或變體相似或基本相同的激動劑或拮抗劑特性。例如，可以利用結(jié)合治療性蛋白質(zhì)且可對應(yīng)于本發(fā)明的清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分的抗體來純化、檢測、和靶向治療性蛋白質(zhì)，包括體外和體內(nèi)的診斷和治療方法。例如，抗體可用于定性和定量測量生物學(xué)樣本中治療性蛋白質(zhì)的水平的免疫測定法。例如參見Harlow等人，《AntibodiesALaboratoryManual》，ColdSpringHarborLaboratoryPress，第2版，1988，將其完整引入本文作為參考。同樣地，例如，可以利用包含結(jié)合治療性蛋白質(zhì)的抗體的至少一個片段或變體的清蛋白融合蛋白來純化、檢測、和靶向治療性蛋白質(zhì)，包括體外和體內(nèi)的診斷和治療方法。結(jié)合治療性蛋白質(zhì)且可對應(yīng)于清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分的抗體包括經(jīng)過修飾的衍生物，即通過將任何類型的分子共價附著于抗體。例如而非限制，抗體衍生物包括例如通過糖基化、乙酰化、PEG化、磷酸化、酰胺化、已知的保護(hù)/阻斷基團(tuán)的衍生化、蛋白水解切割、與細(xì)胞配體或其它蛋白質(zhì)的連接等經(jīng)過修飾的抗體?？梢岳靡阎募夹g(shù)來進(jìn)行多種化學(xué)修飾中的任何一種，包括但不限于特異性化學(xué)切割、乙酰化、甲?；?、衣霉素的代謝合成等。另外，衍生物可以含有一個或多個非經(jīng)典氨基酸。也可以如上所述修飾本發(fā)明的清蛋白融合蛋白。生成結(jié)合治療性蛋白質(zhì)的抗體的方法可以通過本領(lǐng)域已知的任何適當(dāng)?shù)姆椒▉砩山Y(jié)合治療性蛋白質(zhì)且可對應(yīng)于本發(fā)明的清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分的抗體?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域眾所周知的各種程序來生成針對目的抗原的多克隆抗體。例如，可以給各種宿主動物，包括但不限于兔、小鼠、大鼠等，施用治療性蛋白質(zhì)以誘導(dǎo)產(chǎn)生含有對抗原特異的多克隆抗體的血清。根據(jù)宿主物種，可以利用各種佐劑來提高免疫應(yīng)答，包括但不限于弗氏(完全和不完全)佐劑、礦物凝膠劑諸如氫氧化鋁、表面活性物質(zhì)諸如溶血卵磷脂、Pluronic多元醇、多聚陰離子、肽、油乳狀液、鑰孔_血藍(lán)蛋白、二硝基酚、和潛在有用的人佐劑諸如BCG(卡介苗)和小棒桿菌。這種佐劑也是本領(lǐng)域眾所周知的?？梢岳帽绢I(lǐng)域已知的多種技術(shù)，包括利用雜交瘤、重組體、和噬菌體展示技術(shù)或其組合，來制備單克隆抗體。例如，可以利用雜交瘤技術(shù)，包括本領(lǐng)域已知的和例如Harlow等人，《AntibodiesALaboratoryManual》，ColdSpringHarborLaboratoryPress，第2版，1988；Hammering等人，在《MonoclonalAntibodiesandT-CellHybridomas》中，頁碼563-681，Elsevier，N.Y.，1981(將所述參考文獻(xiàn)完整引入作為參考)中教導(dǎo)的雜交瘤技術(shù)，來生成單克隆抗體。術(shù)語“單克隆抗體”在用于本文時并不限于通過雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生的抗體。術(shù)語“單克隆抗體”指衍生自單個克隆的抗體，包括任何真核、原核、或噬菌體克隆，而不是指生成它的方法。利用雜交瘤技術(shù)生成和篩選特異抗體的方法在本領(lǐng)域是常規(guī)的且眾所周知的。在非限制性實(shí)例中，可以用治療性蛋白質(zhì)或其片段或變體、清蛋白融合蛋白、表達(dá)這種治療性蛋白質(zhì)或其片段或變體或者清蛋白融合蛋白的細(xì)胞免疫小鼠。一旦檢測出免疫應(yīng)答，例如在小鼠血清中檢測到對抗原特異的抗體，就收獲小鼠的脾臟并分離脾細(xì)胞。然后通過眾所周知的技術(shù)將脾細(xì)胞與任何適當(dāng)?shù)墓撬枇黾?xì)胞，例如來自可從ATCC獲得的細(xì)胞系SP20的細(xì)胞，進(jìn)行融合。通過有限稀釋選擇并克隆雜交瘤。然后通過本領(lǐng)域已知的方法測定雜交瘤克隆，以選擇出分泌能結(jié)合本發(fā)明多肽的抗體的細(xì)胞。用陽性雜交瘤克隆免疫小鼠可以產(chǎn)生通常含有高水平抗體的腹水。因此，本發(fā)明提供了生成單克隆抗體的方法，以及通過包括下列步驟的方法生成的抗體，即培養(yǎng)分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞，其中優(yōu)選的是，雜交瘤是通過將由經(jīng)本發(fā)明抗原免疫的小鼠分離的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合而生成的，然后對融合產(chǎn)生的雜交瘤篩選分泌能結(jié)合本發(fā)明多肽的抗體的雜交瘤克隆。用于生成多克隆和單克隆兩種人B細(xì)胞系的另一種眾所周知的方法是利用埃巴二氏病毒(EBV)進(jìn)行的轉(zhuǎn)化。用于生成EBV轉(zhuǎn)化B細(xì)胞系的方案是本領(lǐng)域普遍知道的，諸如例如Coligan等人，編，《CurrentProtocolsinImmunology》，1994，JohnWiley&Sons，NY，7.22章概述的方案，將其完整引入本文作為參考。轉(zhuǎn)化用B細(xì)胞的來源一般是人外周血，但轉(zhuǎn)化用B細(xì)胞也可衍生自其它來源，包括但不限于淋巴結(jié)、扁桃體、脾臟、腫瘤組織、和受感染組織。在EBV轉(zhuǎn)化前，通常先將組織制成單細(xì)胞懸浮液。另外，在含有B細(xì)胞的樣品中可以采取一些步驟物理清除或滅活T細(xì)胞(例如用環(huán)孢菌素A處理)，因?yàn)閬碜匝蹇笶BV抗體呈陽性的個體的T細(xì)胞可抑制EBV引起的B細(xì)胞永生化。通常，用EBV接種含有人B細(xì)胞的樣品，并培養(yǎng)3-4周。EBV的典型來源是B95-8細(xì)胞系(ATCC編號VR-1492)的培養(yǎng)物上清液。3-4周培養(yǎng)期接近結(jié)束時，通?？梢钥匆奅BV轉(zhuǎn)化的物理跡象。通過相差顯徽鏡觀察，轉(zhuǎn)化細(xì)胞可表現(xiàn)為大、清晰、毛狀、且傾向于在緊密細(xì)胞群中聚集。最初，EBV系通常是多克隆的。然而，在延長細(xì)胞培養(yǎng)時間后，EBV系可由于特定B細(xì)胞克隆的選擇性生長而變成單克隆或多克隆的?；蛘撸梢詫Χ嗫寺〉腅BV轉(zhuǎn)化系進(jìn)行亞克隆(例如通過有限稀釋培養(yǎng))，或者與適當(dāng)?shù)娜诤吓渑俭w融合并以有限稀釋進(jìn)行涂布以獲得單克隆的B細(xì)胞系。EBV轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的適當(dāng)融合配偶體包括小鼠骨髓瘤細(xì)胞系(例如SP2/0、X63-Ag8.653)、雜骨髓瘤(heteromyeloma)細(xì)胞系(人×小鼠；例如SPAM-8、SBC-H20和CB-F7)和人細(xì)胞系(例如GM1500、SKO-007、RPMI8226和KR4)。因此，本發(fā)明還提供了生成針對本發(fā)明的多肽或其片段的多克隆或單克隆人抗體的方法，包括人B細(xì)胞的EBV轉(zhuǎn)化?？梢酝ㄟ^已知的技術(shù)來制備識別特定表位的抗體片段。例如，可以利用酶，諸如木瓜蛋白酶(產(chǎn)生Fab片段)或胃蛋白酶(產(chǎn)生F(ab′)2片段)，通過免疫球蛋白分子的蛋白水解切割來生成本發(fā)明的Fab和F(ab′)2片段。F(ab′)2片段含有可變區(qū)、輕鏈恒定區(qū)和重鏈的CH1結(jié)構(gòu)域。例如，還可以利用本領(lǐng)域已知的各種噬菌體展示方法來生成結(jié)合治療性蛋白質(zhì)的抗體。在噬菌體展示方法中，將功能性抗體結(jié)構(gòu)域展示在攜帶編碼它們的多核苷酸序列的噬菌體顆粒的表面上。在一個具體的實(shí)施方案中，這種噬菌體可以用來展示由全集或組合抗體庫(例如人或鼠的)表達(dá)的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域?？梢杂每乖?，例如標(biāo)記抗原或者結(jié)合或捕獲在固體表面或珠子上的抗原來選擇或鑒定表達(dá)結(jié)合目的抗原的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的噬菌體。這些方法中使用的噬菌體典型的是包括fd和M13在內(nèi)的絲狀噬菌體，其中由具有Fab、Fv或二硫鍵穩(wěn)定的Fv抗體結(jié)構(gòu)域的噬菌體表達(dá)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域與噬菌體基因III或基因VIII蛋白質(zhì)重組融合?？捎糜谏山Y(jié)合治療性蛋白質(zhì)的抗體的噬菌體展示方法的實(shí)例包括Brinkman等人，J.Immunol.Methods18241-50，1995；Ames等人，J.Immunol.Methods184177-186，1995；Kettleborough等人，Eur.J.Immunol.24952-958，1994；Persic等人，Gene1879-18，1997；Burton等人，AdvancesinImmunology57191-280，1994；PCT申請?zhí)朠CT/GB91/01134；PCT出版物WO90/02809；WO91/10737；WO92/01047；WO92/18619；WO93/11236；WO95/15982；WO95/20401；和美國專利號5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743和5,969,108中公開的方法，將每一篇完整引入本文作為參考。如上述參考文獻(xiàn)中所述，在噬菌體選擇后，可以從噬菌體分離抗體編碼區(qū)，并用來生成完整的抗體，包括人抗體或任何其它想要的抗原結(jié)合片段，而且可以在任何期望宿主中進(jìn)行表達(dá)，包括哺乳動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞、酵母、和細(xì)菌，例如下文所詳細(xì)描述的。例如，利用本領(lǐng)域已知的方法，諸如PCT出版物WO92/22324；Mullinax等人，BioTechniques12(6)864-869，1992；Sawai等人，AJRI3426-34，1995；及Better等人，Science2401041-1043，1988中所公開的，也可以采用重組生成Fab、Fab′和F(ab′)2片段的技術(shù)(將所述參考文獻(xiàn)完整引入作為參考)?？捎糜谏蓡捂淔v和抗體的技術(shù)的實(shí)例包括美國專利4,946,778和5,258,498；Huston等人，MethodsinEnzymology20346-88，1991；Shu等人，PNAS907995-7999，1993；及Skerra等人，Science2401038-1040，1988中所描述的。對于有些用途，包括抗體在人體中的體內(nèi)用途和體外檢測測定法，可能優(yōu)選使用嵌合的、人源化的或人的抗體。嵌合抗體是抗體的不同部分衍生自不同動物物種的分子，諸如具有衍生自鼠單克隆抗體的可變區(qū)和人免疫球蛋白恒定區(qū)的抗體。用于生成嵌合抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。例如參見Morrison，Science2291202，1985；Oi等人，BioTechniques4214，1986；Gillies等人，J.Immunol.Methods125191-202，1989；美國專利號5,807,715；4,816,567和4,816397，將它們完整引入本文作為參考。人源化抗體是來自結(jié)合期望抗原的非人物種抗體、具有一個或多個來自非人物種的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)和來自人免疫球蛋白分子的框架區(qū)的抗體分子。經(jīng)常用來自CDR供體抗體的相應(yīng)殘基替代人框架區(qū)中的框架殘基，以改變，優(yōu)選改善與抗原的結(jié)合。利用本領(lǐng)域眾所周知的方法可以鑒定這些框架替代，例如建立CDR和框架殘基相互作用的模型以鑒定對抗原結(jié)合重要的框架殘基，以及比較序列以鑒定特定位置處不常見的框架殘基。(例如參見Queen等人，美國專利號5,585,089；Riechmann等人，Nature332323，1988，將它們完整引入本文作為參考)?？梢岳帽绢I(lǐng)域已知的多種方法將抗體人源化，包括例如CDR嫁接(EP239,400；PCT出版物WO91/09967；美國專利號5,225,539；5,530,101和5,585,089)、飾面(veneering)或重修表面(resurfacing)(EP592,106；EP519,596；Padlan，MolecularImmunology28(4/5)489-498，1991；Studnicka等人，ProteinEngineering7(6)805-814，1994；Roguska等人，PNAS91969-973，1994)和鏈改組(美國專利號5,565,332)。完全人的抗體是治療人類患者特別想要的?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的多種方法，包括如上所述的利用衍生自人免疫球蛋白序列的抗體庫的噬菌體展示方法來生成人抗體。也可參見美國專利號4,444,887和4,716,111；PCT出版物WO98/46645、WO98/50433、WO98/24893、WO98/16654、WO96/34096、WO96/33735和WO91/10741，將每一篇完整引入本文作為參考。也可以利用不能表達(dá)功能性內(nèi)源免疫球蛋白但能表達(dá)人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠來生成人抗體。例如，可以隨機(jī)的或通過同源重組將人免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因復(fù)合物導(dǎo)入小鼠胚胎干細(xì)胞。或者，除人重鏈和輕鏈基因之外，還可將人可變區(qū)、恒定區(qū)和多樣性區(qū)域?qū)胄∈笈咛ジ杉?xì)胞中。通過同源重組導(dǎo)入人免疫球蛋白基因座，可分別或同時使小鼠免疫球蛋白重鏈和輕鏈無功能。具體而言，JH區(qū)的純合缺失阻止生成內(nèi)源抗體。擴(kuò)增經(jīng)過修飾的胚胎干細(xì)胞，并顯微注射到胚泡中以產(chǎn)生嵌合小鼠。然后繁殖嵌合小鼠以產(chǎn)生表達(dá)人抗體的純合后代。以正常方式，用選擇的抗原，例如本發(fā)明的多肽的整個或部分免疫轉(zhuǎn)基因小鼠。利用常規(guī)的雜交瘤技術(shù)可從經(jīng)過免疫的轉(zhuǎn)基因小鼠獲得針對抗原的單克隆抗體。轉(zhuǎn)基因小鼠包含的人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因在B細(xì)胞分化過程中重排，隨后經(jīng)歷類別轉(zhuǎn)換和體細(xì)胞突變。因此，利用這一技術(shù)，有可能生成在治療上有用的IgG、IgA、IgM和IgE抗體。用于生成人抗體的這種技術(shù)的概述可參見Lonberg和Huszar，Int.Rev.Immunol.1365-93，1995。用于生成人抗體和人單克隆抗體的這種技術(shù)的詳細(xì)討論，以及用于生成這種抗體的方案可參見PCT出版物WO98/24893；WO92/01047；WO96/34096；WO96/33735；歐洲專利號0598877；美國專利號5,413,923；5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318；5,885,793；5,916,771；5,939,598；6,075,181和6,114,598，將它們完整引入本文作為參考。另外，可以雇傭諸如Abgenix(Freemont，CA)和Genpharm(SanJose，CA)等公司利用與上文所述相似的技術(shù)來提供針對選定抗原的人抗體。利用稱為“導(dǎo)向選擇”的技術(shù)可以生成識別選定表位的完全人的抗體。在該方法中，利用選定的非人單克隆抗體，例如小鼠抗體，來引導(dǎo)選擇識別相同表位的完全人的抗體(Jespers等人，Bio/technology12899-903，1988)。編碼抗體的多核苷酸本發(fā)明還提供了包含編碼抗體及其片段的核苷酸序列的多核苷酸。本發(fā)明還涵蓋在例如上文定義的嚴(yán)謹(jǐn)或低嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下與編碼抗體的多核苷酸發(fā)生雜交的多核苷酸，其中優(yōu)選特異性結(jié)合治療性蛋白質(zhì)的抗體，更優(yōu)選結(jié)合具有表2的“SEQIDNOZ”列中公開的“治療性蛋白質(zhì)X”的氨基酸序列的多肽的抗體?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的任何方法獲得多核苷酸和測定多核苷酸的核苷酸序列。例如，如果抗體的核苷酸序列是已知的，那么可以從化學(xué)合成的寡核苷酸裝配編碼該抗體的多核苷酸(例如如Kutmeier等人，BioTechniques17242，1994中所述)，簡單說來，它涉及合成含有編碼抗體的部分序列的交疊寡核苷酸，退火并連接這些寡核苷酸，然后通過PCR擴(kuò)增連接后的寡核苷酸?；蛘撸梢詮膩碜赃m當(dāng)來源的核酸生成編碼抗體的多核苷酸。如果不能得到含有編碼特定抗體的核酸的克隆，但該抗體分子的序列是已知的，那么可以化學(xué)合成編碼免疫球蛋白的核酸，或者利用與序列的3′和5′端發(fā)生雜交的合成引物通過PCR擴(kuò)增而從適當(dāng)來源(例如抗體cDNA庫，或者從表達(dá)該抗體的任何組織或細(xì)胞，諸如選擇表達(dá)抗體的雜交瘤細(xì)胞生成的cDNA庫或由其分離的核酸，優(yōu)選polyA+RNA)獲得或利用對特定基因序列特異的寡核苷酸探針進(jìn)行的克隆來鑒定，例如來自編碼抗體的cDNA庫的cDNA克隆。然后可利用本領(lǐng)域眾所周知的任何方法將通過PCR生成的擴(kuò)增核酸克隆到可復(fù)制的克隆載體中(參見實(shí)施例65)。一旦測定了抗體的核苷酸序列和對應(yīng)的氨基酸序列，可以利用本領(lǐng)域眾所周知的用于操作核苷酸序列的方法來操作抗體的核苷酸，例如重組DNA技術(shù)、定點(diǎn)誘變、PCR等等(例如參見Sambrook等人，1990，《MolecularCloning，ALaboratoryManual》，第2版，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，NY和Ausubel等人，編，1998，《CurrentProtocolsinMolecularBiology》，JohnWiley&Sons，NY中描述的技術(shù)，將它們完整引入本文作為參考)，以產(chǎn)生具有不同氨基酸序列的抗體，例如產(chǎn)生氨基酸替代、刪除/或插入。在一個具體的實(shí)施方案中，通過本領(lǐng)域眾所周知的方法，例如通過與其它重鏈和輕鏈可變區(qū)的已知氨基酸序列進(jìn)行比較以確定序列高變區(qū)，可以檢查重鏈和/或輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列以鑒定互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的序列。利用常規(guī)的重組DNA技術(shù)，可以將一個或多個CDR插入到框架區(qū)內(nèi)，例如人的框架區(qū)，使非人抗體人源化，正如上文所述?？蚣軈^(qū)可以是天然存在的或共有的框架區(qū)，優(yōu)選人的框架區(qū)(例如參見Chothia等人，J.Mol.Biol.278457-479，1998列出的人框架區(qū))。優(yōu)選的是，通過組合框架區(qū)和CDR產(chǎn)生的多核苷酸編碼特異結(jié)合本發(fā)明多肽的抗體。優(yōu)選的是，如上所述，可以在框架區(qū)內(nèi)產(chǎn)生一個或多個氨基酸替代，優(yōu)選的是，氨基酸替代改進(jìn)了抗體對其抗原的結(jié)合。另外，可以用這種方法對參與鏈內(nèi)二硫鍵的一個或多個可變區(qū)半胱氨酸殘基進(jìn)行氨基酸替代或刪除以產(chǎn)生缺少一個或多個鏈內(nèi)二硫鍵的抗體分子。本發(fā)明涵蓋對多核苷酸的其它改變，而且它們也在本領(lǐng)域的技術(shù)范圍內(nèi)。另外，可以利用為了生成“嵌合抗體”而開發(fā)的技術(shù)(Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.81851-855，1984；Neuberger等人，Nature312604-608，1984；Takeda等人，Nature314452-454，1985)，即將來自具有合適抗原特異性的小鼠抗體分子的基因與來自具有適當(dāng)生物學(xué)活性的人抗體分子的基因剪接在一起。如上所述，嵌合抗體是不同部分衍生自不同動物物種的分子，諸如那些具有衍生自鼠mAb的可變區(qū)和人免疫球蛋白恒定區(qū)的抗體，例如人源化抗體。或者，可以使描述用于制備單鏈抗體的技術(shù)(美國專利號4,946,778；Bird，Science242423-42，1988；Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA855879-5883，1988；及Ward等人，Nature334544-54，1989)適于生成單鏈抗體。通過氨基酸橋?qū)v區(qū)的重鏈和輕鏈片段連接起來，產(chǎn)生單鏈多肽，由此形成單鏈抗體。也可以使用在大腸桿菌中裝配功能性Fv片段的技術(shù)(Skerra等人，Science2421038-1041，1988)?？贵w的重組體表達(dá)抗體或其片段、衍生物或類似物(例如抗體的重鏈或輕鏈或者單鏈抗體)的重組表達(dá)需要構(gòu)建含有編碼抗體的多核苷酸的表達(dá)載體。一旦得到編碼本發(fā)明的抗體分子或者抗體重鏈或輕鏈或其部分(優(yōu)選含有重鏈或輕鏈可變區(qū))的多核苷酸，就可利用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)通過重組DNA技術(shù)生成用于生產(chǎn)抗體分子的載體。因此，本文描述了通過表達(dá)含有編碼抗體的核苷酸序列的多核苷酸來制備蛋白質(zhì)的方法。可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法來構(gòu)建含有抗體編碼序列及合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制信號的表達(dá)載體。這些方法包括例如體外重組DNA技術(shù)、合成技術(shù)和體內(nèi)遺傳重組。因此，本發(fā)明提供了包含與啟動子可操作連接的編碼本發(fā)明的抗體分子或其重鏈或輕鏈或者重鏈或輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列的可復(fù)制載體。這種載體可包括編碼抗體分子恒定區(qū)的核苷酸序列(例如參見PCT出版物WO86/05807；PCT出版物WO89/01036；和美國專利號5,122,464)，而且為了表達(dá)整個重鏈或輕鏈，可以將抗體的可變區(qū)克隆到這一載體中。通過常規(guī)技術(shù)將表達(dá)載體轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中，然后通過常規(guī)方法培養(yǎng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞以產(chǎn)生抗體。因此，本發(fā)明包括含有與異源啟動子可操作連接的編碼本發(fā)明的抗體分子或其重鏈或輕鏈或者單鏈抗體的多核苷酸的宿主細(xì)胞。在表達(dá)雙鏈抗體的優(yōu)選實(shí)施方案中，可以在宿主細(xì)胞中共表達(dá)編碼重鏈和輕鏈二者的載體以表達(dá)整個免疫球蛋白分子，正如下文所詳述的。可以利用多種宿主-表達(dá)載體系統(tǒng)來表達(dá)本發(fā)明的抗體分子。這種宿主-表達(dá)系統(tǒng)代表了可以生成并隨后純化目的編碼序列的媒介，也代表了在用合適的核苷酸編碼序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染后可原位表達(dá)本發(fā)明的抗體分子的細(xì)胞。它們包括但不限于經(jīng)含有抗體編碼序列的重組噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA或粘粒DNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的微生物諸如細(xì)菌(例如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌)；經(jīng)含有抗體編碼序列的重組酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的酵母(例如糖酵母屬、畢赤酵母屬)；經(jīng)含有抗體編碼序列的重組病毒表達(dá)載體(例如桿狀病毒)感染的昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)；經(jīng)含有抗體編碼序列的重組病毒表達(dá)載體(例如花椰菜花葉病毒，CaMV；煙草花葉病毒，TMV)感染或經(jīng)含有抗體編碼序列的重組質(zhì)粒表達(dá)載體(例如Ti質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞系統(tǒng)；或包含含有衍生自哺乳動物細(xì)胞基因組(例如金屬硫蛋白啟動子)或哺乳動物病毒(例如腺病毒晚期啟動子、牛痘病毒7.5K啟動子)的啟動子的重組表達(dá)構(gòu)建物的哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)(例如COS、CHO、BHK、293、3T3細(xì)胞)。優(yōu)選的是，使用細(xì)菌細(xì)胞，諸如大腸桿菌，更優(yōu)選真核細(xì)胞，尤其為了表達(dá)整個重組抗體分子時，來表達(dá)重組抗體分子。例如，諸如中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)等哺乳動物細(xì)胞連同諸如來自人細(xì)胞巨化病毒的主要中間早期基因啟動子元件等載體是有效的抗體表達(dá)系統(tǒng)(Foecking等人，Gene45101，1986；Cockett等人，Bio/Technology82，1990)。在細(xì)菌系統(tǒng)中，根據(jù)所表達(dá)抗體分子的預(yù)期用途，可以方便的選擇多種表達(dá)載體。例如，在制備大量的這種蛋白質(zhì)以生成抗體分子的藥物組合物時，可能想要指導(dǎo)容易純化的融合蛋白產(chǎn)物高水平表達(dá)的載體。這種載體包括但不限于大腸桿菌表達(dá)載體pUR278(Ruther等人，EMBOJ.21791，1983)，其中可將抗體編碼序列個別連接到載體中且讀碼框與lacZ編碼區(qū)相同從而生成融合蛋白；pIN載體(Inouye和Inouye，NucleicAcidsRes.133101-3109，1985；VanHeeke和Schuster，J.Biol.Chem.245503-5509，1989)等等。也可以用pGEX載體來表達(dá)與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)形成融合蛋白的外源多肽。一般說來，這種融合蛋白是可溶的，而且通過與基質(zhì)谷胱甘肽-瓊脂糖珠子的吸附和結(jié)合以及隨后在存在游離谷胱甘肽時的洗脫可容易的從溶解細(xì)胞中純化出來。將pGEX載體設(shè)計(jì)成包括凝血酶或因子Xa蛋白酶切割位點(diǎn)，使得克隆的靶基因產(chǎn)物可以從GST部分釋放出來。在昆蟲系統(tǒng)中，利用苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographacalifomicanuclearpolyhedrosisvirus)(AcNPV)作為載體來表達(dá)外源基因。病毒在草地夜蛾(Spondopterafrugiperda)細(xì)胞中生長。可以將抗體編碼序列個別克隆到病毒的非必需區(qū)(例如多角體蛋白基因)中，并置于AcNPV啟動子(例如多角體蛋白啟動子)的控制下。在哺乳動物宿主細(xì)胞中，可以使用許多基于病毒的表達(dá)系統(tǒng)。如果使用腺病毒作為表達(dá)載體，可以將目的抗體編碼序列與腺病毒轉(zhuǎn)錄/翻譯控制復(fù)合物例如晚期啟動子和三聯(lián)前導(dǎo)序列連接。然后通過體外或體內(nèi)重組可以將嵌合基因插入腺病毒基因組中。病毒基因組非必需區(qū)(例如E1或E3區(qū))中的插入將產(chǎn)生能存活且能夠在受感染宿主中表達(dá)抗體分子的重組病毒。(例如參見Logan和Shenk，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81355-359，1984)。為了有效翻譯插入的抗體編碼序列還可能需要特定起始信號。這些信號包括ATG起始密碼子和鄰接的序列。而且，起始密碼子必須與期望編碼序列的讀碼框同相以保證整個插入物的翻譯。這些外源翻譯控制信號和起始密碼子可以具有多種來源，天然的和合成的二者皆可。通過包含合適的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)元件、轉(zhuǎn)錄終止子等可以增強(qiáng)表達(dá)效率(參見Bittner等人，MethodsinEnzymol.15351-544，1987)。另外，可以選擇以想要的特定方式調(diào)控插入序列的表達(dá)，或者修飾和加工基因產(chǎn)物的宿主細(xì)胞株。蛋白質(zhì)產(chǎn)物的這種修飾(例如糖基化)和加工(例如切割)對于蛋白質(zhì)的功能可能是重要的。不同的宿主細(xì)胞具有特征性的和特異的蛋白質(zhì)和基因產(chǎn)物翻譯后加工和修飾機(jī)制?？梢赃x擇合適的細(xì)胞系或宿主系統(tǒng)以保證所表達(dá)外源蛋白的正確修飾和加工。為此，可以使用具有正確加工初始轉(zhuǎn)錄物、糖基化和磷酸化基因產(chǎn)物的細(xì)胞機(jī)構(gòu)的真核宿主細(xì)胞。這種哺乳動物宿主細(xì)胞包括但不限于CHO、VERY、BHK、Hela、COS、MDCK、293、3T3、W138，特別是乳癌細(xì)胞系，諸如例如BT483、Hs578T、HTB2、BT20和T47D，以及正常乳腺細(xì)胞系，諸如例如CRL7030和Hs578Bst。為了長期、高產(chǎn)量的生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)，優(yōu)選穩(wěn)定的表達(dá)。例如，可以改造穩(wěn)定表達(dá)抗體分子的細(xì)胞系。與其利用含有病毒復(fù)制起源的表達(dá)載體，還不如用受到合適表達(dá)控制元件(例如啟動子、增強(qiáng)子、序列、轉(zhuǎn)錄終止子、多聚腺苷酸化位點(diǎn)等等)控制的DNA和選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。在導(dǎo)入外源DNA后，可以允許經(jīng)過改造的細(xì)胞在滋養(yǎng)培養(yǎng)基中生長1-2天，然后換成選擇培養(yǎng)基。重組質(zhì)粒中的選擇標(biāo)記賦予選擇以抗性，而且允許細(xì)胞將質(zhì)粒穩(wěn)定的整合到它們的染色體中并生長形成焦點(diǎn)(foci)，繼而可以克隆并擴(kuò)增為細(xì)胞系?？梢苑奖愕睦迷摲椒▉砀脑毂磉_(dá)抗體分子的細(xì)胞系。這種經(jīng)過改造的細(xì)胞系在篩選和評估直接或間接與抗體分子相互作用的化合物方面特別有用?？梢岳迷S多選擇系統(tǒng)，包括但不限于可以分別在tk-、hgprt-或aprt-細(xì)胞中使用的單純皰疹病毒胸苷激酶(Wigler等人，Cell11223，1977)、次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(Szybalska和Szybalski，Proc.Natl.Acad.Sci.USA48202，1992)和腺嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(Lowy等人，Cell22817，1980)基因。而且，抗代謝物抗性也可以作為選擇下列基因的基礎(chǔ)賦予氨甲蝶呤抗性的dhfr(Wigler等人，Natl.Acad.Sci.USA77357，1980；O′Hare等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA781527，1981)；賦予霉酚酸抗性的gpt(Mulligan和Berg，Proc.Natl.Acad.Sci.USA782072，1981)；賦予氨基葡糖苷G-41抗性的neo(ClinicalPharmacy12488-505；Wu和Wu，Biotherapy387-95，1991；Tolstoshev，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32573-596，1993；Mulligan，Science260926-932，1993；及Morgan和Anderson，Ann.Rev.Biochem.62191-217，1993；May，TIBTECH11(5)155-215，1993)；及賦予潮霉素抗性的hygro(Santerre等人，Gene30147，1984)。本領(lǐng)域普遍知道的重組DNA技術(shù)的方法可常規(guī)用于選擇想得到的重組克隆，這些方法描述于例如Ausubel等人，編，《CurrentProtocolsinMolecularBiology》，JohnWiley&Sons，NY，1993；Kriegler，《GeneTransferandExpression，ALaboratoryManual》，StocktonPress，NY，1990；及Dracopoli等人，編，《CurrentProtocolsinHumanGenetics》，第12和13章，JohnWiley&Sons，NY，1994；Colberre-Garapin等人，J.Mol.Biol.1501，1981，將它們完整引入本文作為參考?？梢酝ㄟ^載體擴(kuò)增來提高抗體分子的表達(dá)水平(綜述參見Bebbington和Hentschel，TheuseofvectorsbasedongeneamplificationfortheexpressionofclonedgenesinmammaliancellsinDNAcloning，第3卷，AcademicPress，NewYork，1987)。當(dāng)表達(dá)抗體的載體系統(tǒng)中的標(biāo)記是可擴(kuò)增的時，提高宿主細(xì)胞培養(yǎng)基中抑制劑的水平將增加標(biāo)記基因的拷貝數(shù)。因?yàn)閿U(kuò)增的區(qū)域與抗體基因有關(guān)，因此抗體的產(chǎn)量也將提高(Crouse等人，Mol.Cell.Biol.3257，1983)?？梢栽诖嬖谒幬锪虼琢虬彼?methioninesulphoximine)或氨甲蝶呤時分別擴(kuò)增利用谷氨酰胺合酶(GS)或DHFR作為選擇標(biāo)記的載體?；诠劝滨０泛厦傅妮d體的優(yōu)點(diǎn)是可利用谷氨酰胺合酶陰性細(xì)胞系(例如鼠骨髓瘤細(xì)胞系，NS0)。谷氨酰胺合酶表達(dá)系統(tǒng)還可以通過提供防止內(nèi)源基因發(fā)揮功能的額外抑制劑在谷氨酰胺合酶表達(dá)細(xì)胞(例如中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞)中起作用。在PCT出版物WO87/04462；WO86/05807；WO89/01036；WO89/10404和WO91/06657中詳述了谷氨酰胺合酶表達(dá)系統(tǒng)及其成分，將它們完整引入本文作為參考。另外，可依照本發(fā)明使用的谷氨酰胺合酶表達(dá)載體可從包括LonzaBiologics公司(Portsmouth，NH)在內(nèi)的供應(yīng)商處購買。Bebbington等人，Bioltechnology10169，1992及Biblia和Robinson，Biolechnol.Prog.111，1995中描述了利用GS表達(dá)系統(tǒng)在鼠骨髓瘤細(xì)胞中表達(dá)和生產(chǎn)單克隆抗體，在此將它們完整引入本文作為參考?？梢杂帽景l(fā)明的兩種表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，其中第一種載體編碼重鏈衍生的多肽，而第二種載體編碼輕鏈衍生的多肽。這兩種載體可以含有使得重鏈和輕鏈多肽等量表達(dá)的相同選擇標(biāo)記?；蛘?，也可以使用編碼且能夠重鏈和輕鏈多肽二者的單一載體。在這些情形中，輕鏈應(yīng)置于重鏈之前，以避免有毒游離重鏈過量(Proudfoot，Nature32252，1986；Kohler，Proc.Natl.Acad.Sci.USA772197，1980)。重鏈和輕鏈的編碼序列可包含cDNA或基因組DNA。一旦通過動物、化學(xué)合成或重組表達(dá)生成了本發(fā)明的抗體分子，就可以利用本領(lǐng)域已知的用于純化免疫球蛋白分子的任何方法進(jìn)行純化，例如通過層析(例如離子交換、親和力特別是在蛋白質(zhì)A之后對特定抗原的親和力、和排阻(sizing)柱層析)、離心、差別可溶性、或用于純化蛋白質(zhì)的任何其它標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。另外，可以將結(jié)合治療性蛋白質(zhì)且可對應(yīng)于本發(fā)明的清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分的抗體或其片段與本文描述的或本領(lǐng)域其它途徑知道的異源多肽序列融合以促進(jìn)純化?？贵w的修飾可以將結(jié)合治療性蛋白質(zhì)或其片段或變體的抗體與標(biāo)記序列諸如肽融合以促進(jìn)純化。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，標(biāo)記氨基酸序列是六聚組氨酸肽，諸如pQE載體(QIAGEN，Inc.，9259EtonAvenue，Chatsworth，CA91311)等中提供的標(biāo)簽，其中許多可以通過商業(yè)途徑獲得。正如例如Gentz等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86821-824，1989中所述，六聚組氨酸為融合蛋白提供了方便的純化。其它對純化有用的肽標(biāo)簽包括但不限于對應(yīng)于衍生自流感血凝素蛋白質(zhì)的表位的血凝素標(biāo)簽(也稱為“HA標(biāo)簽”)(Wilson等人，Cell37767，1984)和“flag”標(biāo)簽。本發(fā)明還涵蓋與診斷劑或治療劑綴合的抗體或其片段?？贵w可在診斷上用于例如作為臨床檢驗(yàn)程序的一部分監(jiān)測腫瘤的發(fā)展或進(jìn)展，從而例如測定給定治療方案的效力。通過將抗體與可檢測物質(zhì)偶聯(lián)可促進(jìn)檢測?？蓹z測物質(zhì)的實(shí)例包括各種酶、輔基、熒光材料、發(fā)光材料、生物發(fā)光材料、放射性物質(zhì)、利用各種正電子發(fā)射斷層成像術(shù)的正電子發(fā)射金屬、和非放射性的順磁性金屬離子。利用本領(lǐng)域已知的技術(shù)，可以將可檢測物質(zhì)直接的或通過中間物(諸如例如本領(lǐng)域已知的接頭)間接的與抗體(或其片段)偶聯(lián)或綴合。可與抗體綴合從而依照本發(fā)明用作診斷劑的金屬離子可參見例如美國專利號4,741,900。適當(dāng)?shù)拿傅膶?shí)例包括辣根過氧化酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、或乙酰膽堿酯酶；適當(dāng)?shù)妮o基復(fù)合物的實(shí)例包括鏈霉親和素/生物素和親和素/生物素；適當(dāng)?shù)臒晒獠牧系膶?shí)例包括傘形酮、熒光素、異硫氰酸熒光素、若丹明、二氯三嗪胺熒光素(dichlorotriazinylaminefluorescein)、丹磺酰氯或藻紅蛋白；發(fā)光材料的實(shí)例包括魯米諾；生物發(fā)光材料的實(shí)例包括螢光素酶、螢光素和水母發(fā)光蛋白；而適當(dāng)?shù)姆派湫晕镔|(zhì)的實(shí)例包括125I、131I、111I或99Tc。本文其它地方還描述了可檢測物質(zhì)的其它實(shí)例。另外，可將本發(fā)明的抗體與治療性模塊綴合，諸如細(xì)胞毒素，例如抑制細(xì)胞劑或殺細(xì)胞劑，治療劑或放射性金屬離子，例如α-發(fā)射體，諸如例如213Bi。細(xì)胞毒素或胞毒劑包括對細(xì)胞有害的任何試劑。實(shí)例包括紫杉醇、松胞菌素B、短桿菌肽D、溴化乙錠、吐根堿、絲裂霉素、依托泊苷(鬼臼乙叉苷，etoposide)、替尼泊苷(鬼臼噻吩苷，tenoposide)、長春新堿、長春花堿、秋水仙堿、阿霉素、柔紅霉素、二羥基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光輝霉素、放線菌素D、1-去氫睪酮、糖皮質(zhì)激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾、和嘌呤霉素及其類似物或同系物。治療劑包括但不限于抗代謝物(例如氨甲喋呤、6-巰基嘌呤、6-硫代鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶氨烯咪胺)、烷化劑(例如二氯甲基二乙胺(氮芥)、塞替派、苯丁酸氮芥、美法侖、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、環(huán)磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、鏈脲菌素、絲裂霉素C和順二氯二氨絡(luò)鉑(II)(DDP)順鉑)、蒽環(huán)類抗生素(例如柔紅霉素(以前稱為道諾霉素)和阿霉素)、抗生素(例如更生霉素(以前稱為放線菌素)，博來霉素、光輝霉素和氨茴霉素(AMC))和抗有絲分裂劑(例如長春新堿和長春花堿)。本發(fā)明的綴合物可用于修飾給定的生物學(xué)應(yīng)答，并不認(rèn)為治療劑或藥物模塊限于經(jīng)典的化學(xué)治療劑。例如，藥物模塊可以是具有期望生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)或多肽。這種蛋白質(zhì)可包括例如毒素，諸如相思豆毒素、篦麻毒素A、假單胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白質(zhì)，諸如腫瘤壞死因子、α-干擾素、β-干擾素、神經(jīng)生長因子、血小板衍生生長因子、組織纖溶酶原激活物、凋亡劑、例如TNF-α、TNF-β、AIMI(參見國際公布號WO97/33899)、AIMII(參見國際公布號WO97/34911)、Fas配體(Takahashi等人，Int.Immunol.61567-1574，1994)、VEGI(參見國際公布號WO99/23105)、血栓形成劑或抗血管發(fā)生劑，例如血管他丁或內(nèi)皮他??；或生物學(xué)應(yīng)答修飾劑，諸如例如淋巴因子、白介素-1(“IL-1”)、白介素-2(“IL-2”)、白介素-6(“IL-6”)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒細(xì)胞集落刺激因子(“G-CSF”)或其它生長因子。還可以將抗體附著于固相支持物，這對靶抗原的免疫測定法或純化是特別有用的。這種固相支持物包括但不限于玻璃、纖維素、聚丙烯酰胺、尼龍、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。用于將治療性模塊與抗體綴合的技術(shù)是眾所周知的。例如參見Amon等人，“MonoclonalAntibodiesForImmunotargetingOfDrugsInCancerTherapy”，在《MonoclonalAntibodiesAndCancerTherapy》中，Reisfeld等人，編，頁碼243-56，AlanR.Liss，Inc.，1985；Hellstrom等人，“AntibodiesForDrugDelivery”，在《ControlledDrugDelivery》中，第2版，Robinson等人，編，頁碼623-53，MarcelDekker，Inc.，1987；Thorpe，“AntibodyCarriersOfCytotoxicAgentsInCancerTherapyAReview”，在《MonoclonalAntibodies′84BiologicalAndClinicalApplications》中，Pinchera等人，編，頁碼475-506，1985；“Analysis，Results，AndFutureProspectiveOfTheTherapeuticUseOfRadiolabeledAntibodyInCancerTherapy”，在《MonoclonalAntibodiesForCancerDetectionAndTherapy》，Baldwin等人，編，頁碼303-16，AcademicPress，1985；及Thorpe等人，“ThePreparationAndCytotoxicPropertiesOfAntibody-ToxinConjugates”，Immunol.Rev.62119-58，1982。或者，如Segal在美國專利號4,676,980中所述，可將抗體與二抗綴合以形成抗體異源綴合物，將其完整引入本文作為參考。單獨(dú)或者連同細(xì)胞毒性因子和/或細(xì)胞因子施用的、綴合或未綴合治療性模塊的抗體可用作治療劑?？贵w-清蛋白融合物結(jié)合治療性蛋白質(zhì)并可對應(yīng)于本發(fā)明清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分的抗體包括但不限于結(jié)合表1“治療性蛋白質(zhì)X”列中公開的治療性蛋白質(zhì)的抗體，或其片段或變體。在具體的實(shí)施方案中，所述免疫特異性結(jié)合治療性蛋白質(zhì)并對應(yīng)于清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分的抗體的片段或變體包含VH結(jié)構(gòu)域或由其組成。在其它實(shí)施方案中，所述免疫特異性結(jié)合治療性蛋白質(zhì)并對應(yīng)于清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分的抗體的片段或變體包含1、2或3個VHCDR或由其組成。在其它實(shí)施方案中，所述免疫特異性結(jié)合治療性蛋白質(zhì)并對應(yīng)于清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分的抗體的片段或變體包含VHCDR1或由其組成。在其它實(shí)施方案中，所述免疫特異性結(jié)合治療性蛋白質(zhì)并對應(yīng)于清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分的抗體的片段或變體包含VHCDR2或由其組成。在其它實(shí)施方案中，所述免疫特異性結(jié)合治療性蛋白質(zhì)并對應(yīng)于清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分的抗體的片段或變體包含VHCDR3或由其組成。在具體的實(shí)施方案中，所述免疫特異性結(jié)合治療性蛋白質(zhì)并對應(yīng)于清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分的抗體的片段或變體包含VL結(jié)構(gòu)域或由其組成。在其它實(shí)施方案中，所述免疫特異性結(jié)合治療性蛋白質(zhì)并對應(yīng)于清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分的抗體的片段或變體包含1、2或3個VLCDR或由其組成。在其它實(shí)施方案中，所述免疫特異性結(jié)合治療性蛋白質(zhì)并對應(yīng)于清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分的抗體的片段或變體包含VLCDR1或由其組成。在其它實(shí)施方案中，所述免疫特異性結(jié)合治療性蛋白質(zhì)并對應(yīng)于清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分的抗體的片段或變體包含VLCDR2或由其組成。在其它實(shí)施方案中，所述免疫特異性結(jié)合治療性蛋白質(zhì)并對應(yīng)于清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分的抗體的片段或變體包含VLCDR3或由其組成。在其它實(shí)施方案中，所述免疫特異性結(jié)合治療性蛋白質(zhì)并對應(yīng)于清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分的抗體的片段或變體包含1、2、3、4、5或6個VH和/或VLCDR或由其組成。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述免疫特異性結(jié)合治療性蛋白質(zhì)并對應(yīng)于清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分的抗體的片段或變體包含scFv或由其組成，所述scFv包含通過諸如(Gly4Ser)3(SEQIDNO4)等肽接頭連接的治療性抗體VL結(jié)構(gòu)域和治療性抗體VH結(jié)構(gòu)域。免疫分型至少包含結(jié)合治療性蛋白質(zhì)(或其片段或變體)的抗體的片段或變體的本發(fā)明抗體或本發(fā)明清蛋白融合蛋白可用于細(xì)胞系和生物學(xué)樣品的免疫分型。本發(fā)明的治療性蛋白質(zhì)可用作細(xì)胞特異標(biāo)志物，或更具體的說就是在特定細(xì)胞類型的不同分化和/或成熟階段差異表達(dá)的細(xì)胞標(biāo)志物。針對特定表位或表位組合的單克隆抗體(或至少包含結(jié)合治療性蛋白質(zhì)的抗體的片段或變體的清蛋白融合蛋白)將容許篩選表達(dá)標(biāo)志物的細(xì)胞群?？衫枚喾N技術(shù)使用單克隆抗體(或至少包含結(jié)合治療性蛋白質(zhì)的抗體的片段或變體的清蛋白融合蛋白)來篩選表達(dá)標(biāo)志物的細(xì)胞群，包括使用抗體包被的磁珠的磁分離、用附著于固體基質(zhì)(即板)上的抗體的“淘選”、及流式細(xì)胞術(shù)(參見例如美國專利5,985,660；及Morrison等人，Cell96737-49，1999)。這些技術(shù)容許篩選特定細(xì)胞群，諸如可發(fā)現(xiàn)血液學(xué)惡性腫瘤(即急性白血病患者中的輕微后遺癥(MRD))和移植中“非自身”細(xì)胞以預(yù)防移植物抗宿主病(GVHD)?；蛘?，這些技術(shù)容許篩選能夠進(jìn)行增殖和/或分化的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞，如可在人臍帶血中發(fā)現(xiàn)。鑒定結(jié)合治療性蛋白質(zhì)的抗體和包含結(jié)合治療性蛋白質(zhì)的抗體的片段或變體的清蛋白融合蛋白本發(fā)明的抗體或至少包含結(jié)合治療性蛋白質(zhì)(或其片段或變體)的抗體的片段或變體的本發(fā)明清蛋白融合蛋白可以多種方式進(jìn)行鑒定。具體而言，可使用本文描述的技術(shù)或常規(guī)修改本領(lǐng)域已知的技術(shù)，對至少包含結(jié)合治療性蛋白質(zhì)的抗體的片段或變體的本發(fā)明清蛋白融合蛋白測定特異性結(jié)合由如下抗體特異結(jié)合的相同抗原的能力，所述抗體結(jié)合與結(jié)合清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分的抗體對應(yīng)的治療性蛋白質(zhì)。用于本發(fā)明的抗體或至少包含結(jié)合治療性蛋白質(zhì)(或其片段或變體)的抗體的片段或變體的本發(fā)明清蛋白融合蛋白(特異性)結(jié)合特定蛋白質(zhì)或表位的能力的測定可在溶液中(如Houghten，Bio/Techniques13412-421，1992)、在珠上(如Lam，Nature35482-84，1991)、在芯片上(如Fodor，Nature364555-556，1993)、在細(xì)菌上(如美國專利號5,223,409)、在孢子上(如專利號5,571,698；5,403,484；和5,223,409)、在質(zhì)粒上(如Cull等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA891865-1869，1992)、或在噬菌體上(如Scott和Smith，Science249386-390，1990；Devlin，Science249404-406，1990；Cwirla等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA876378-6382，1990；及Felici，J.Mol.Biol.222301-310，1991)進(jìn)行(將這些參考文獻(xiàn)的每一篇完整引入本文作為參考)。使用或常規(guī)修改本文描述的或本領(lǐng)域其它途徑知道的技術(shù)，也可對本發(fā)明的抗體或至少包含結(jié)合治療性蛋白質(zhì)(或其片段或變體)的抗體的片段或變體的本發(fā)明清蛋白融合蛋白測定它們對特定蛋白質(zhì)或表位的特異性和親和力。可通過本領(lǐng)域知道的任何方法，對至少包含結(jié)合治療性蛋白質(zhì)的抗體的片段或變體的本發(fā)明清蛋白融合蛋白測定與其它抗原(例如與由如下抗體特異性結(jié)合的分子具有序列/結(jié)構(gòu)保守性的分子，所述抗體結(jié)合與本發(fā)明清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分對應(yīng)的治療性蛋白質(zhì)(或其片段或變體))的交叉反應(yīng)性?？捎糜诜治?免疫特異性)結(jié)合和交叉反應(yīng)性的免疫測定法包括但不限于，使用諸如蛋白質(zhì)印跡、放射免疫測定法、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定法)、“三明治”免疫測定法、免疫沉淀測定法、沉淀素反應(yīng)、凝膠擴(kuò)散沉淀素反應(yīng)、免疫擴(kuò)散測定法、凝集測定法、補(bǔ)體結(jié)合測定法、免疫放射測定法、熒光免疫測定法和蛋白A免疫測定法等技術(shù)的競爭性和非競爭性測定系統(tǒng)，僅舉了幾個例子。這樣的測定法是常規(guī)的且在本領(lǐng)域是眾所周知(參見例如Ausubel等人編，1994，《CurrentProtocolsinMolecularBiology》，第1卷，JohnWiley&Sons，Inc.，NewYork，將其完整引入本文作為參考)。例示性免疫測定法簡述于下文(但并不旨在作為限制)。免疫沉淀方案通常包括在諸如補(bǔ)充有蛋白質(zhì)磷酸酶和/或蛋白酶抑制劑(如EDTA、PMSF、抑酶肽、釩酸鈉)的RIPA緩沖液(1％NP-40或TritonX-100、1％去氧膽酸鈉、0.1％SDS、0.15MNaCl、0.01M磷酸鈉pH7.2、1％Trasylol)等裂解緩沖液中裂解細(xì)胞群，向細(xì)胞裂解液中添加本發(fā)明的抗體或至少包含結(jié)合治療性蛋白質(zhì)(或其片段或變體)的抗體的片段或變體的本發(fā)明清蛋白融合蛋白，于40℃保溫一段時間(例如1-4小時)，向細(xì)胞裂解液中添加蛋白A和/或蛋白G瓊脂糖珠(或在至少包含結(jié)合治療性蛋白質(zhì)的抗體的片段或變體的清蛋白融合蛋白的情況中，經(jīng)合適抗獨(dú)特型抗體或抗清蛋白抗體包被的珠)，于40℃保溫約1小時或更久，在裂解緩沖液中清洗珠子并將珠子重懸于SDS/樣品緩沖液中。可通過例如蛋白質(zhì)印跡分析來評估本發(fā)明抗體或清蛋白融合蛋白免疫沉淀特定抗原的能力。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道能進(jìn)行修改以增加抗體或清蛋白融合蛋白與抗原結(jié)合并降低背景的參數(shù)(如用瓊脂糖珠預(yù)清除細(xì)胞裂解液)。關(guān)于免疫沉淀方案的進(jìn)一步討論參見例如Ausubel等人編，1994，《CurrentProtocolsinMolecularBiology》，第1卷，JohnWiley&Sons，Inc.，NewYork，10.16.1。蛋白質(zhì)印跡分析通常包括制備蛋白質(zhì)樣品，在聚丙烯酰胺凝膠(例如8％-20％SDS-PAGE，取決于抗原的分子量)中對蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行電泳，將蛋白質(zhì)樣品從聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移到諸如消化纖維、PVDF或尼龍等膜上，在封閉液(例如含3％BSA或脫脂奶的PBS)中封閉膜，在清洗緩沖液(例如PBS-Tween20)中清洗膜，將本發(fā)明的抗體或清蛋白融合蛋白(在封閉緩沖液中稀釋)施加到膜上，在清洗緩沖液中清洗膜，施加在封閉緩沖液中稀釋的綴合有酶底物(例如辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶)或放射性分子(例如32p或125I)的二抗(它識別清蛋白融合蛋白，例如抗人血清清蛋白抗體)，在清洗緩沖液中清洗膜，并檢測抗原的存在。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道能進(jìn)行修改以提高檢測的信號并降低背景噪聲的參數(shù)。關(guān)于蛋白質(zhì)印跡方案的進(jìn)一步討論參見例如Ausubel等人編，1994，《CurrentProtocolsinMolecularBiology》，第1卷，JohnWiley&Sons，Inc.，NewYork，10.8.1。ELISA包括制備抗原，用抗原包被96孔微量滴定板的孔，洗去未結(jié)合到孔上的抗原，向孔中添加綴合有諸如酶底物(例如辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶)等可檢測化合物的本發(fā)明抗體或清蛋白融合蛋白(至少包含結(jié)合治療性蛋白質(zhì)的抗體的片段或變體)并保溫一段時間，洗去未結(jié)合或非特異性結(jié)合的清蛋白融合蛋白，并檢測特異性結(jié)合包被孔的抗原的抗體或清蛋白融合蛋白的存在。在ELISA中，抗體或清蛋白融合蛋白并非一定要綴合可檢測化合物；相反，可向孔中添加將綴合有可檢測化合物的二抗(它分別識別抗體或清蛋白融合蛋白)。此外，可用抗體或清蛋白融合蛋白包被到孔上以代替用抗原包被孔。在此情況中，可檢測分子可以是綴合有諸如酶底物(例如辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶)等可檢測化合物的抗原。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道能進(jìn)行修改以提高檢測的信號的參數(shù)，以及本領(lǐng)域知道的ELISA的其它變型。關(guān)于ELISA的進(jìn)一步討論參見例如Ausubel等人編，1994，《CurrentProtocolsinMolecularBiology》，第1卷，JohnWiley&Sons，Inc.，NewYork，11.2.1?？赏ㄟ^競爭性結(jié)合測定法來測定清蛋白融合蛋白與蛋白質(zhì)、抗原或表位的結(jié)合親和力以及抗體或清蛋白融合蛋白-蛋白質(zhì)/抗原/表位相互作用的解離速率(off-rate)。競爭性結(jié)合測定法的一個例子是放射免疫測定法，包括在存在漸增量的未標(biāo)記抗原時將經(jīng)標(biāo)記抗原(如3H或125I)和本發(fā)明的抗體或清蛋白融合蛋白一起保溫，并檢測與經(jīng)標(biāo)記抗原結(jié)合的抗體?？赏ㄟ^斯卡恰特作圖分析的數(shù)據(jù)來測定本發(fā)明抗體或清蛋白融合蛋白與特定蛋白質(zhì)、抗原或表位的親和力及結(jié)合解離速率。也可使用放射免疫測定法來測定與所述抗體或清蛋白融合蛋白結(jié)合相同蛋白質(zhì)、抗原或表位的第二蛋白質(zhì)的競爭。在此情況中，在存在漸增量的與本發(fā)明清蛋白融合蛋白結(jié)合相同蛋白質(zhì)、抗原或表位的未標(biāo)記第二蛋白質(zhì)時，將蛋白質(zhì)、抗原或表位與綴合有已標(biāo)記化合物(如3H或125I)的本發(fā)明抗體或清蛋白融合蛋白一起保溫。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用BIAcore動力學(xué)分析來測定本發(fā)明抗體或清蛋白融合蛋白與蛋白質(zhì)、抗原或表位結(jié)合的結(jié)合和解離速率。BIAcore動力學(xué)分析包括分析抗體、清蛋白融合蛋白或特定多肽、抗原或表位與芯片的結(jié)合和解離，其中芯片的表面上分別固定有特定多肽、抗原或表位、抗體或清蛋白融合蛋白。治療性用途本發(fā)明還致力于基于抗體的療法，它包括將本發(fā)明的抗體或至少包含結(jié)合治療性蛋白質(zhì)的抗體的片段或變體的本發(fā)明清蛋白融合蛋白施用于動物，優(yōu)選哺乳動物，最優(yōu)選人患者，用于治療一種或多種公開的疾病、紊亂或狀況。本發(fā)明的治療性化合物包括但不限于本發(fā)明的抗體(包括本文描述的其片段、類似物和衍生物)、編碼本發(fā)明抗體(包括本文描述的其片段、類似物和衍生物及抗獨(dú)特型抗體)的核酸、至少包含結(jié)合治療性蛋白質(zhì)的抗體的片段或變體的本發(fā)明清蛋白融合蛋白及編碼這樣的清蛋白融合蛋白的核酸。本發(fā)明的抗體或至少包含結(jié)合治療性蛋白質(zhì)的抗體的片段或變體的本發(fā)明清蛋白融合蛋白可用于治療、抑制或預(yù)防與治療性蛋白質(zhì)的異常表達(dá)和/或活性有關(guān)的疾病、紊亂或狀況，包括但不限于任何一種或多種本文描述的疾病、紊亂或狀況。與治療性蛋白質(zhì)的異常表達(dá)和/或活性有關(guān)的疾病、紊亂或狀況的治療和/或預(yù)防包括但不限于減輕與那些疾病、紊亂或狀況有關(guān)的癥狀。本發(fā)明的抗體或至少包含結(jié)合治療性蛋白質(zhì)的抗體的片段或變體的本發(fā)明清蛋白融合蛋白可在本領(lǐng)域知道的或本文描述的制藥學(xué)可接受組合物中提供。一個具體且優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明致力于基于抗體的療法，它包括將本發(fā)明的抗體或至少包含結(jié)合治療性蛋白質(zhì)的抗體的片段或變體的本發(fā)明清蛋白融合蛋白施用于動物，優(yōu)選哺乳動物，最優(yōu)選人患者，用于治療一種或多種疾病、紊亂或狀況，包括但不限于神經(jīng)紊亂、免疫系統(tǒng)紊亂、肌肉紊亂、生殖紊亂、胃腸紊亂、肺紊亂、心血管紊亂、腎紊亂、增殖性紊亂、和/或癌性疾病和狀況，和/或本文其它地方所描述的。本發(fā)明的治療性化合物包括但不限于本發(fā)明的抗體(例如針對在哺乳動物細(xì)胞表面上表達(dá)的全長蛋白質(zhì)的抗體；針對治療性蛋白質(zhì)表位的抗體)及編碼本發(fā)明抗體(包括本文描述的其片段、類似物和衍生物及抗獨(dú)特性抗體)的核酸。本發(fā)明的抗體可用于治療、抑制或預(yù)防與治療性蛋白質(zhì)的異常表達(dá)和/或活性有關(guān)的疾病、紊亂或狀況，包括但不限于任何一種或多種本文描述的疾病、紊亂或狀況。所述與治療性蛋白質(zhì)的異常表達(dá)和/或活性有關(guān)的疾病、紊亂或狀況的治療和/或預(yù)防包括但不限于減輕與那些疾病、紊亂或狀況有關(guān)的癥狀。本發(fā)明的抗體或至少包含結(jié)合治療性蛋白質(zhì)的抗體的片段或變體的本發(fā)明清蛋白融合蛋白可在本領(lǐng)域知道的或本文描述的制藥學(xué)可接受組合物中提供。其中本發(fā)明的抗體或至少包含結(jié)合治療性蛋白質(zhì)的抗體的片段或變體的本發(fā)明清蛋白融合蛋白可在治療上使用的方式的概要包括在體內(nèi)局部或系統(tǒng)性結(jié)合治療性蛋白質(zhì)，或通過抗體的直接細(xì)胞毒性，如由補(bǔ)體(CDC)或效應(yīng)細(xì)胞(ADCC)介導(dǎo)的。這些方法中的某些詳述于下文。利用本文提供的教導(dǎo)，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道如何將本發(fā)明的抗體或至少包含結(jié)合治療性蛋白質(zhì)的抗體的片段或變體的本發(fā)明清蛋白融合蛋白用于診斷、監(jiān)測或治療目的，而無需過度實(shí)驗(yàn)。本發(fā)明的抗體或至少包含結(jié)合治療性蛋白質(zhì)的抗體的片段或變體的本發(fā)明清蛋白融合蛋白可有利的與其它單克隆或嵌合抗體、或與淋巴因子或造血生長因子(諸如IL-2、IL-3和IL-7)聯(lián)合使用，例如有助于增加與抗體相互作用的效應(yīng)細(xì)胞的數(shù)量或活性的。本發(fā)明的抗體或至少包含結(jié)合治療性蛋白質(zhì)的抗體的片段或變體的本發(fā)明清蛋白融合蛋白可單獨(dú)施用或與其它類型的治療(例如放療、化療、激素療法、免疫療法和抗腫瘤劑)聯(lián)合施用。一般而言，優(yōu)選施用與患者屬于相同物種的物種起源或物種反應(yīng)性(就抗體來說)的產(chǎn)品。因此，在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，將人抗體、片段、衍生物、類似物或核酸施用于人患者用于治療或預(yù)防。優(yōu)選將針對治療性蛋白質(zhì)的高親和力的和/或在體內(nèi)有效抑制和/或中和的抗體、其片段或區(qū)域(或與這樣的抗體相關(guān)的清蛋白融合蛋白)用于針對本發(fā)明多核苷酸或多肽包括其片段的免疫測定法和與其有關(guān)的紊亂的治療。這樣的抗體、片段或區(qū)域優(yōu)選對本發(fā)明的多核苷酸或多肽包括其片段具有親和力。優(yōu)選的結(jié)合親和力包括小于5×10-2M、10-2M、5×10-3M、10-3M、5×10-4M、10-4M的解離常數(shù)或Kd。更優(yōu)選的結(jié)合親和力包括解離常數(shù)或Kd小于5×10-5M、10-5M、5×10-6M、10-6M、5×10-7M、10-7M、5×10-8M或10-8M的那些。甚至更優(yōu)選的結(jié)合親和力包括解離常數(shù)或Kd小于5×10-9M、10-9M、5×10-10M、10-10M、5×10-11M、10-11M、5×10-12M、10-12M、5×10-13M、10-13M、5×10-14M、10-14M、5×10-15M或10-15M的那些。基因療法在一個具體的實(shí)施方案中，通過基因療法的方式，施用包含編碼結(jié)合治療性蛋白質(zhì)的抗體或至少包括結(jié)合治療性蛋白質(zhì)的抗體的片段或變體的清蛋白融合蛋白的序列的核酸來治療、抑制或預(yù)防與治療性蛋白質(zhì)的異常表達(dá)和/或活性有關(guān)的疾病或紊亂。基因療法指通過對受試者施用表達(dá)的或可表達(dá)的核酸而進(jìn)行的治療。在本發(fā)明的此實(shí)施方案中，所述核酸產(chǎn)生介導(dǎo)治療效果的其編碼的蛋白質(zhì)。本領(lǐng)域可利用的基因療法的任何方法都可根據(jù)本發(fā)明使用。例示性的方法更為詳細(xì)的描述于本申請的其它地方。治療或預(yù)防活性的實(shí)證在用于人之前，本發(fā)明的化合物或藥物組合物優(yōu)選先在體外測試，然后在體內(nèi)測試所需治療或預(yù)防活性。例如，用于證實(shí)化合物或藥物組合物的治療或預(yù)防效用的體外測定法包括化合物對細(xì)胞系或患者組織樣品的效果?？衫帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員知道的技術(shù)來測定化合物或組合物對細(xì)胞系和/或組織樣品的效果，包括但不限于玫瑰花結(jié)形成測定法和細(xì)胞溶解測定法。依照本發(fā)明，簡述了可用于決定是否施用特定化合物的體外測定法，包括體外細(xì)胞培養(yǎng)測定法，其中培養(yǎng)患者的組織樣品并暴露于或以其它方式施用化合物，并觀察到這樣的化合物對組織樣品的效果。治療性/預(yù)防性施用和組合物本發(fā)明提供了通過對受試者施用有效量的本發(fā)明化合物或藥物組合物的治療、抑制和預(yù)防方法。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，化合物是基本上純化的(例如基本上不含限制其效果或產(chǎn)生不想要的副作用的物質(zhì))。受試者優(yōu)選動物，包括但不限于諸如牛、豬、馬、雞、貓、犬等動物，且優(yōu)選哺乳動物，最優(yōu)選人。當(dāng)化合物包含核酸或免疫球蛋白時，可使用的制劑和施用方法如上所述；其它合適的制劑和施用途徑可選自下文所描述的那些。已知多種投遞系統(tǒng)且可用于施用本發(fā)明的化合物，例如包囊在脂質(zhì)體、微粒、微膠囊內(nèi)、能夠表達(dá)該化合物的重組細(xì)胞、受體介導(dǎo)的胞吞作用(參見例如Wu和Wu，J.Biol.Chem.2624429-4432，1987)、作為逆轉(zhuǎn)錄病毒或其它載體一部分的核酸的構(gòu)建等。導(dǎo)入的方法包括但不限于皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、硬膜外和口服途徑?；衔锘蚪M合物可通過任何方便的途徑施用，例如通過輸注或推注、通過經(jīng)上皮或粘膜皮膚內(nèi)襯(如口腔粘膜、直腸和腸粘膜等)的吸收，且可與其它生物學(xué)活性試劑聯(lián)合施用?？上到y(tǒng)或局部施用。此外，可能希望通過任何合適的途徑將本發(fā)明的藥物化合物或組合物導(dǎo)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，包括腦室內(nèi)和鞘內(nèi)注射；通過腦室內(nèi)導(dǎo)管可便于腦室內(nèi)注射，例如連接貯器，諸如奧馬耶(Ommaya)貯器。也可采用肺部施藥，例如通過使用吸入器或噴霧器，以及含霧化劑的劑型。在一個具體的實(shí)施方案中，可能希望將本發(fā)明的藥物化合物或組合物局部施用至需要治療的區(qū)域；這可通過例如但不限于手術(shù)期間的局部輸注、局部應(yīng)用如結(jié)合手術(shù)后的傷口敷料、通過注射、經(jīng)由導(dǎo)管、借助栓劑、或通過植入物來實(shí)現(xiàn)，所述植入物是多孔的、非多孔的或凝膠狀物質(zhì)，包括膜，例如sialastic膜或纖維。優(yōu)選的是，在施用本發(fā)明的蛋白質(zhì)時，包括抗體，必須注意所使用的材料應(yīng)當(dāng)是不吸收蛋白質(zhì)的。在另一個實(shí)施方案中，化合物或組合物可在囊泡中投遞，特別是在脂質(zhì)體中(參見Langer，Science2491527-1533，1990；Treat等人，在《LiposomesintheTherapyofInfectiousDiseaseandCancer》中，Lopez-Berestein和Fidler編，Liss，NewYork，pp.353-365，1989；Lopez-Berestein，同前，pp.317-327；主要參見同前)。在又一個實(shí)施方案中，化合物或組合物可在受控釋放系統(tǒng)中投遞。在一個實(shí)施方案中，可使用泵(參見Langer，見前；Seflon，CRCCrit.Ref.Biomed.Eng.14201，1987；Buchwald等人，Surgery88507，1980；Saudek等人，N.Engl.J.Med.321574，1989)。在另一個實(shí)施方案中，可使用聚合材料(參見《MedicalApplicationsofControlledRelease》，Langer和Wise編，CRCPres.，BocaRaton，F(xiàn)lorida，1974；《ControlledDrugBioavailability，DrugProductDesignandPerformance》，Smolen和Ball編，Wiley，NewYork，1984；Ranger和Peppas，J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.2361，1983；也參見Levy等人，Science228190，1985；During等人，Ann.Neurol.25351，1989；Howard等人，J.Neurosurg.71105，1989)。在又一個實(shí)施方案中，受控釋放系統(tǒng)可置于治療靶如腦的附近，因此僅需要系統(tǒng)劑量的一部分(參見例如Goodson，在《MedicalApplicationsofControlledRelease》中，同前，第2卷，PP.115-138，1984)。其它受控釋放系統(tǒng)的討論見Langer的評論(Science2491527-1533，1990)。在本發(fā)明的化合物是編碼蛋白質(zhì)的核酸的一個具體實(shí)施方案中，可在體內(nèi)施用核酸以促進(jìn)其所編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)，可通過將其構(gòu)建作為合適核酸表達(dá)載體的一部分并施用它使其進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，例如通過利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(參見美國專利號4,980,286)，或通過直接注射，或通過利用微粒轟擊(例如基因槍；Biolistic，Dupont)，或用脂質(zhì)或細(xì)胞表面受體或轉(zhuǎn)染劑包被，或通過連接已知進(jìn)入細(xì)胞核的同源框樣肽來施用它(參見例如Joliot等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA881864-1868，1991)等。或者，可將核酸導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)并通過同源重組摻入宿主細(xì)胞DNA以表達(dá)。本發(fā)明還提供了藥物組合物。這樣的組合物包含治療有效量的化合物，和制藥學(xué)可接受載體。在一個具體的實(shí)施方案中，術(shù)語“制藥學(xué)可接受的”指得到聯(lián)邦或州政府管理機(jī)構(gòu)的批準(zhǔn)或列于美國藥典或其它公認(rèn)的藥典中供動物使用，更具體的說是人。術(shù)語“載體”指與治療劑一起施用的稀釋劑、佐劑、賦形劑或媒介。這樣的制藥學(xué)載體可以是無菌液體，諸如水和油，包括石油、動物、植物或合成來源的那些，諸如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等等。在靜脈內(nèi)施用藥物組合物時，水是優(yōu)選的載體。鹽水溶液和含水右旋糖及甘油溶液也可用作液體載體，特別是用于注射液。合適的制藥學(xué)賦形劑包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、米、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等等。如果需要，組合物還可含有少量的潤濕劑或乳化劑、或pH緩沖劑。這些組合物可采取溶液、懸浮液、乳狀液、片劑、丸劑、膠囊、粉劑、持續(xù)釋放劑型等形式。組合物可配制成栓劑，含有傳統(tǒng)的粘合劑和諸如甘油三酯等載體。口服劑型可包括標(biāo)準(zhǔn)載體，諸如藥用級甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。合適的制藥學(xué)載體的例子描述于E.W.Martin的《Remington′sPharmaceuticalSciences》。這樣的組合物將含有治療有效量的化合物，優(yōu)選純化的形式，以及合適量的載體以提供適于對患者施用的形式。劑型應(yīng)當(dāng)適合施用方式。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，按照常規(guī)流程將組合物配制成適于人靜脈內(nèi)施用的藥物組合物。通常，用于靜脈內(nèi)施用的組合物是在無菌等滲水性緩沖液中的溶液。需要時，組合物還可包括增溶劑和諸如利多卡因等局部麻醉劑以在注射部位減輕疼痛。一般而言，成分是分開提供的或以單位劑量形式混合的，像熔封容器中的凍干粉末或無水濃縮物，諸如標(biāo)示有活性劑數(shù)量的安瓿或小袋(sachette)。當(dāng)組合物將通過輸注施用時，可用裝有無菌藥用級水或鹽水的輸液瓶分配。當(dāng)組合物通過注射施用時，可提供一安瓿注射用無菌水或鹽水以便成分可在施用前混合。本發(fā)明的化合物可配制成中性或鹽形式。制藥學(xué)可接受的鹽包括與陰離子形成的那些，諸如衍生自鹽酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的那些，以及與陽離子形成的那些，諸如衍生自氫氧化鈉、鉀、銨、鈣、鐵、異丙胺、三乙胺、3-乙胺基乙醇、組氨酸、普魯卡因等的那些?？赏ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)臨床技術(shù)來測定在與治療性蛋白質(zhì)的異常表達(dá)和/或活性有關(guān)的疾病或紊亂的治療、抑制和預(yù)防中有效的本發(fā)明化合物的量。此外，可任選采用體外測定法來幫助確定最佳劑量范圍。制劑中將要采用的精確劑量還取決于施用途徑、和疾病或紊亂的嚴(yán)重程度，而且應(yīng)根據(jù)開業(yè)醫(yī)生的判斷和每位患者的情況來決定。根據(jù)體外或動物模型測試系統(tǒng)的劑量-應(yīng)答曲線可外推有效劑量。對于抗體而言，對患者施用的劑量通常是0.1mg/kg-100mg/kg患者體重。優(yōu)選的是，對患者施用的劑量是0.1mg/kg-20mg/kg患者體重，更優(yōu)選1mg/kg-10mg/kg患者體重。一般而言，由于對外來多肽的免疫反應(yīng)，人抗體在人體中較來自其它物種的抗體具有更長的半衰期。因此，較低劑量的人抗體和較低頻率的施藥常常是可能的。此外，可通過諸如例如脂化等修飾增強(qiáng)抗體的攝取和組織穿透(如進(jìn)入腦)來降低本發(fā)明抗體的施用劑量和頻率。診斷和成像經(jīng)過標(biāo)記的結(jié)合治療性蛋白質(zhì)(或其片段或變體)的抗體及其衍生物和類似物(包括至少包含結(jié)合治療性蛋白質(zhì)的抗體的片段或變體的清蛋白融合蛋白)可用于診斷目的以檢測、診斷或監(jiān)測與治療性蛋白質(zhì)的異常表達(dá)和/或活性有關(guān)的疾病、紊亂和/或狀況。本發(fā)明提供了治療性蛋白質(zhì)的異常表達(dá)的檢測方法，包括(a)使用一種或多種對目的多肽特異的抗體測定個體細(xì)胞或體液中治療性蛋白質(zhì)的表達(dá)，并(b)將基因表達(dá)水平與標(biāo)準(zhǔn)基因表達(dá)水平進(jìn)行比較，由此測得的治療性蛋白質(zhì)表達(dá)水平較之標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)水平的升高或降低指示異常表達(dá)。本發(fā)明提供了用于診斷紊亂的診斷性測定法，包括(a)使用一種或多種對治療性蛋白質(zhì)特異的抗體或至少包含對治療性蛋白質(zhì)特異的抗體的片段或變體的清蛋白融合蛋白測定個體細(xì)胞或體液中治療性蛋白質(zhì)的表達(dá)，并(b)將基因表達(dá)水平與標(biāo)準(zhǔn)基因表達(dá)水平進(jìn)行比較，由此測得的治療性蛋白質(zhì)表達(dá)水平較之標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)水平的升高或降低指示特定紊亂。就癌癥而言，在個體活檢組織中存在相對較高數(shù)量的轉(zhuǎn)錄本可指示形成疾病的易患病體質(zhì)，或者可提供用于在實(shí)際臨床癥狀出現(xiàn)前檢測疾病的方法。這種類型的更確切診斷可容許醫(yī)務(wù)人員更早采取預(yù)防措施或攻擊治療，由此阻止癌癥的發(fā)展或進(jìn)一步的進(jìn)展。本發(fā)明的抗體或至少包含對治療性蛋白質(zhì)特異的抗體的片段或變體的清蛋白融合蛋白可用于測定生物學(xué)樣品中的蛋白質(zhì)水平，使用了本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的經(jīng)典免疫組織學(xué)方法(例如參見Jalkanen等人，J.Cell.Biol.101976-985，1985；Jalkanen等人，J.Cell.Biol.1053087-3096，1987)?？捎糜跈z測蛋白質(zhì)基因表達(dá)的其它基于抗體的方法包括免疫測定法，諸如酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)和放射免疫測定法(RIA)。合適的抗體測定標(biāo)記物是本領(lǐng)域知道的，包括酶標(biāo)記物，諸如葡萄糖氧化酶；放射性同位素，諸如碘(125I、121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、銦(121In)和锝(99Tc)；發(fā)光標(biāo)記物，諸如魯米諾；熒光標(biāo)記物，諸如熒光素和羅丹明；以及生物素。本發(fā)明的一個方面是動物，優(yōu)選哺乳動物，最優(yōu)選人中與治療性蛋白質(zhì)的異常表達(dá)有關(guān)的疾病或紊亂的檢測和診斷。在一個實(shí)施方案中，診斷包括a)對受試者施用(例如腸胃外、皮下或腹膜內(nèi))有效量的經(jīng)過標(biāo)記的特異性結(jié)合目的多肽的分子；b)在施藥后等待一段時間以容許標(biāo)記分子在受試者中表達(dá)治療性蛋白質(zhì)的部位優(yōu)先集中(且未結(jié)合的標(biāo)記分子清除至背景水平)；c)測定背景水平；并d)檢測受試者中的標(biāo)記分子，標(biāo)記分子超過背景水平的檢測結(jié)果指示受試者患有與治療性蛋白質(zhì)的異常表達(dá)有關(guān)的特定疾病或紊亂?？赏ㄟ^多種方法來測定背景水平，包括將檢測得到的標(biāo)記分子的量與先前對特定系統(tǒng)測定的標(biāo)準(zhǔn)值進(jìn)行比較。本領(lǐng)域?qū)⒗斫?，受試者的大小和所用的成像系統(tǒng)將決定產(chǎn)生診斷影像所需的成像模塊的量。在放射性同位素模塊的例子中，對于人類受試者，注射放射性的量通常在約5到20毫居里99mTc的范圍內(nèi)。然后經(jīng)過標(biāo)記的抗體、抗體片段或至少包含結(jié)合治療性蛋白質(zhì)的抗體的片段或變體的清蛋白融合蛋白將優(yōu)先在含有特定治療性蛋白質(zhì)的細(xì)胞部位積累。體內(nèi)腫瘤成像的描述可參見S.W.Burchiel等人，“ImmunopharmacokineticsofRadiolabeledAntibodiesandTheirFragments”，第13章，《TumorImagingTheRadiochemicalDetectionofCancer》，S.W.Burchiel和B.A.Rhodes編，MassonPublishingInc.，1982。根據(jù)一些變數(shù)，包括使用的標(biāo)記物類型和施藥模式，施藥后容許標(biāo)記分子在受試者中的部位優(yōu)先集中且未結(jié)合標(biāo)記分子清除至背景水平的時間間隔是6-48小時或6-24小時或6-12小時。在另一個實(shí)施方案中，施藥后的時間間隔是5-20天或5-10天。在一個實(shí)施方案中，通過重復(fù)用于診斷疾病或紊亂的方法來進(jìn)行疾病或紊亂的監(jiān)測，例如在初次診斷后1個月、在初次診斷后6個月、在初次診斷后1年等?？墒褂帽绢I(lǐng)域知道的用于體內(nèi)掃描的方法來檢測患者中標(biāo)記分子的存在。這些方法取決于所使用的標(biāo)記物類型。技術(shù)人員將能夠確定用于檢測特定標(biāo)記物的合適方法?？捎糜诒景l(fā)明的診斷方法的方法和裝置包括但不限于計(jì)算機(jī)斷層攝影術(shù)(CT)、全身掃描諸如正電子發(fā)射體層攝影術(shù)(PET)的、磁共振成像(MRI)和超聲檢查。在一個具體的實(shí)施方案中，分子用放射性同位素標(biāo)記并在患者中使用放射響應(yīng)的外科器械檢測(Thurston等人，美國專利號5,441,050)。在另一個實(shí)施方案中，分子用熒光化合物標(biāo)記并在患者中使用熒光響應(yīng)的掃描器械檢測。在另一個實(shí)施方案中，分子用正電子發(fā)射金屬標(biāo)記并在患者中使用正電子發(fā)射斷層攝影術(shù)檢測。在又一個實(shí)施方案中，分子用順磁標(biāo)記物標(biāo)記并在患者中使用磁共振成像(MRI)檢測。特異性檢測清蛋白融合蛋白而非單獨(dú)的清蛋白或治療性蛋白質(zhì)的抗體是優(yōu)選的實(shí)施方案。這些可用于檢測說明書全文中描述的清蛋白融合蛋白。試劑盒本發(fā)明提供了可用于上述方法的試劑盒。在一個實(shí)施方案中，試劑盒包含抗體，優(yōu)選純化的抗體，裝在一個或多個容器中。在一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的試劑盒含有基本上分離的多肽，它包含與試劑盒中所包括的抗體起特異性免疫反應(yīng)的表位。優(yōu)選的是，本發(fā)明的試劑盒還包含對照抗體，它不與目的多肽起反應(yīng)。在另一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的試劑盒含有用于檢測抗體與目的多肽結(jié)合的手段(例如抗體可綴合有可檢測底物，例如熒光化合物、酶底物、放射性化合物或發(fā)光化合物，或識別一抗的二抗可綴合到可檢測底物上)。在本發(fā)明另一個具體的實(shí)施方案中，試劑盒是用于篩選含有特異性針對增殖性和/或癌性多核苷酸和多肽的抗體的血清的診斷試劑盒。這樣的試劑盒可包括不與目的多肽起反應(yīng)的對照抗體。這樣的試劑盒可包括基本上分離的多肽抗原，它包含與至少一種抗多肽抗原抗體起特異性免疫反應(yīng)的表位。此外，這樣的試劑盒包括用于檢測所述抗體與抗原結(jié)合的手段(例如抗體可綴合有諸如熒光素或羅丹明等熒光化合物，可通過流式細(xì)胞術(shù)檢測)。在具體的實(shí)施方案中，試劑盒可包括重組生產(chǎn)的或化學(xué)合成的多肽抗原。試劑盒的多肽抗原還可附著在固體支持物上。在一個更具體的實(shí)施方案中，上述試劑盒的檢測手段包括附著有所述多肽抗原的固體支持物。這樣的試劑盒還可包括未附著報道分子標(biāo)記的抗人抗體。在此實(shí)施方案中，可通過所述報道分子標(biāo)記的抗體來檢測抗體和多肽抗原的結(jié)合。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明包括用于篩選含有本發(fā)明多肽的抗原的血清的診斷試劑盒。診斷試劑盒包括與多肽或多核苷酸抗原起特異性免疫反應(yīng)的基本上分離的抗體，以及用于檢測多核苷酸或多肽抗原與抗體結(jié)合的手段。在一個實(shí)施方案中，抗體附著在固體支持物上。在一個具體的實(shí)施方案中，抗體可以是單克隆抗體。試劑盒的檢測手段可包括第二種經(jīng)過標(biāo)記的單克隆抗體。或者/另外，檢測手段可包括經(jīng)過標(biāo)記的競爭性抗原。在一種診斷形式中，使測試血清與通過本發(fā)明方法獲得的具有表面結(jié)合抗原的固相試劑進(jìn)行反應(yīng)。在特異性抗原抗體與試劑結(jié)合并通過清洗除去未結(jié)合的血清成分后，使試劑與報道分子標(biāo)記的抗人抗體進(jìn)行反應(yīng)以使報道分子以與固體支持物上結(jié)合的抗抗原抗體量的一定比例結(jié)合試劑。再次清洗試劑以除去未結(jié)合的標(biāo)記抗體，并測定與試劑締合的報道分子的量。通常，報道分子是酶，它通過在存在合適的熒光、發(fā)光或比色底物(Sigma，St.Louis，MO)時將固相保溫來檢測。通過用于將蛋白質(zhì)物質(zhì)附著于固體支持物物質(zhì)諸如聚合物珠、浸量尺、96孔板或?yàn)V器物質(zhì)的已知技術(shù)來制備上述測定法中的固體表面試劑。這些附著方法通常包括蛋白質(zhì)與支持物的非特異性吸附，或蛋白質(zhì)通常通過游離胺基共價附著于固體支持物上的化學(xué)反應(yīng)基團(tuán)，諸如活化的羧基、羥基或醛基?；蛘?，可連同生物素化的抗原使用鏈霉親合素包被的板。如此，本發(fā)明提供了用于執(zhí)行此診斷方法的測定系統(tǒng)或試劑盒。試劑盒通常包括具有表面結(jié)合的重組抗原的載體和用于檢測表面結(jié)合的抗抗原抗體的報道分子標(biāo)記的抗人抗體。清蛋白融合蛋白本發(fā)明主要涉及清蛋白融合蛋白及治療、預(yù)防或改善疾病或紊亂的方法。在用于本文時，“清蛋白融合蛋白”指通過至少一個分子的清蛋白(或其片段或變體)與至少一個分子的治療性蛋白質(zhì)(或其片段或變體)融合而形成的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白包含至少治療性蛋白質(zhì)的片段或變體和至少人血清清蛋白的片段或變體，它們優(yōu)選通過基因融合(即清蛋白融合蛋白是由其中編碼完整或部分治療性蛋白質(zhì)的多核苷酸以相同讀碼框與編碼完整或部分清蛋白的多核苷酸連接的核酸翻譯生成的)彼此相互連接。治療性蛋白質(zhì)和清蛋白，一旦成為清蛋白融合蛋白的一部分，可稱為清蛋白融合蛋白的“部份”、“區(qū)域”或“模塊”。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了由表1或表2中描述的多核苷酸或清蛋白融合構(gòu)建體編碼的清蛋白融合蛋白。本發(fā)明還涵蓋編碼這些清蛋白融合蛋白的多核苷酸。本發(fā)明優(yōu)選的清蛋白融合蛋白包括但不限于由如下核酸分子編碼的清蛋白融合蛋白，所述核酸分子包含以相同讀碼框與編碼至少一個分子的治療性蛋白質(zhì)(或其片段或變體)的至少一段多核苷酸連接的編碼至少一個分子的清蛋白(或其片段或變體)的多核苷酸或由其組成；所述核素分子包含以相同讀碼框與編碼至少一個分子的如表1、表2或?qū)嵤├兴霎a(chǎn)生的治療性蛋白質(zhì)(或其片段或變體)的至少一段多核苷酸連接的編碼至少一個分子的清蛋白(或其片段或變體)的多核苷酸或由其組成；或者所述核酸分子包含以相同讀碼框與編碼至少一個分子的治療性蛋白質(zhì)(或其片段或變體)的至少一段多核苷酸連接的編碼至少一個分子的清蛋白(或其片段或變體)的多核苷酸或由其組成，還包含例如一種或多種下列元件(1)功能性自主復(fù)制載體(包括但并不限于穿梭載體、表達(dá)載體、整合載體、和/或復(fù)制系統(tǒng))，(2)轉(zhuǎn)錄起始區(qū)(例如啟動子區(qū)，諸如例如可調(diào)節(jié)或可誘導(dǎo)的啟動子、組成型啟動子)，(3)轉(zhuǎn)錄終止區(qū)，(4)前導(dǎo)序列，和(5)選擇標(biāo)記。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含治療性蛋白質(zhì)(例如表1中所描述的)和血清清蛋白蛋白質(zhì)或由其組成的清蛋白融合蛋白。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含治療性蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性和/或治療活性片段和血清清蛋白蛋白質(zhì)或由其組成的清蛋白融合蛋白。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含治療性蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性和/或治療活性變體和血清清蛋白蛋白質(zhì)或由其組成的清蛋白融合蛋白。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，清蛋白融合蛋白的血清清蛋白蛋白質(zhì)成分是血清清蛋白的成熟部分。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含治療性蛋白質(zhì)和血清清蛋白的生物學(xué)活性和/或治療活性片段或由其組成的清蛋白融合蛋白。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含治療性蛋白質(zhì)和血清清蛋白的生物學(xué)活性和/或治療活性變體或由其組成的清蛋白融合蛋白。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分是治療性蛋白質(zhì)的成熟部分。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含治療性蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性和/或治療活性片段或變體和血清清蛋白的生物學(xué)活性和/或治療活性片段或變體或由其組成的清蛋白融合蛋白。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含治療性蛋白質(zhì)的成熟部分和血清清蛋白的成熟部分或由其組成的清蛋白融合蛋白。優(yōu)選的是，清蛋白融合蛋白包含HA作為N端部分，且包含治療性蛋白質(zhì)作為C端部分。或者，也可使用包含HA作為C端部分且包含治療性蛋白質(zhì)作為N端部分的清蛋白融合蛋白。在其它實(shí)施方案中，清蛋白融合蛋白在清蛋白的N末端和C末端都融合有治療性蛋白質(zhì)。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，在N末端和C末端融合的治療性蛋白質(zhì)是相同的治療性蛋白質(zhì)。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，在N末端和C末端融合的治療性蛋白質(zhì)是不同的治療性蛋白質(zhì)。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，在N末端和C末端融合的治療性蛋白質(zhì)是可用于治療或預(yù)防相同或相關(guān)疾病、紊亂或狀況(例如表1“優(yōu)選適應(yīng)癥Y”列中所列舉的)的不同治療性蛋白質(zhì)。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，在N末端和C末端融合的治療性蛋白質(zhì)是可用于治療、改善或預(yù)防本領(lǐng)域知道的通常在患者中同時、并發(fā)或連續(xù)存在或通常在患者中彼此關(guān)聯(lián)存在的疾病或紊亂(例如表1“優(yōu)選適應(yīng)癥Y”列中所列舉的)的不同治療性蛋白質(zhì)。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白涵蓋含有融合在本發(fā)明清蛋白融合蛋白的N-或C-末端和/或融合在清蛋白或其變體的N-和/或C-末端的1、2、3、4或更多個分子的指定治療性蛋白質(zhì)X或其變體的蛋白質(zhì)。指定治療性蛋白質(zhì)X或其變體的分子可以是任何數(shù)目的取向，包括但不限于“頭對頭”取向(例如其中一個治療性蛋白質(zhì)X分子的N-末端融合到另一個治療性蛋白質(zhì)X分子的N-末端)，或“頭對尾”取向(例如其中一個治療性蛋白質(zhì)X分子的C-末端融合到另一個治療性蛋白質(zhì)X分子的N-末端)。在一個實(shí)施方案中，1、2、3或更多個串聯(lián)取向的治療性蛋白質(zhì)X多肽(或其片段或變體)融合到本發(fā)明清蛋白融合蛋白的N-或C-末端，和/或融合到清蛋白或其變體的N-和/或C-末端。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白還涵蓋含有融合在本發(fā)明清蛋白融合蛋白的N-或C-末端和/或融合在清蛋白或其變體的N-和/或C-末端的1、2、3、4或更多個分子的指定治療性蛋白質(zhì)X或其變體的蛋白質(zhì)，其中所述分子通過肽接頭連接。例子包括美國專利號5,073,627(引入本文作為參考)中描述的那些肽接頭。可使用常規(guī)重組DNA技術(shù)來生成包含通過肽接頭分開的多個治療性蛋白質(zhì)X多肽的清蛋白融合蛋白。在將小肽融合到大HAS分子上時，接頭是特別重要的。肽自身可通過串聯(lián)拷貝的肽的融合而作為接頭，或者可施用其它已知接頭。摻入接頭的構(gòu)建體描述于表2或在檢查SEQIDNOY時是顯而易見的。此外，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白還可通過以這樣的一種容許形成分子內(nèi)和/或分子間多聚體形式的方式將治療性蛋白質(zhì)X或其變體融合到清蛋白或其變體的N-末端和/或C-末端而產(chǎn)生。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，清蛋白融合蛋白可以是單體或多聚體的形式(即二聚體、三聚體、四聚體和更高聚合體)。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分可以是單體或多聚體的形式(即二聚體、三聚體、四聚體和更高聚合體)。在一個具體的實(shí)施方案中，清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分是多聚體的形式(即二聚體、三聚體、四聚體和更高聚合體)，而清蛋白蛋白質(zhì)部分是單體的形式。除了其中清蛋白部分融合治療性蛋白質(zhì)部分的N-末端和/或C-末端的清蛋白融合蛋白之外，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白還可通過將治療性蛋白質(zhì)或目的肽(例如表1中公開的治療性蛋白質(zhì)X，或結(jié)合治療性蛋白質(zhì)或其片段或變體的抗體)插入HA的內(nèi)部區(qū)域而產(chǎn)生。例如，在HA分子的蛋白質(zhì)序列中在α-螺旋的終點(diǎn)和起點(diǎn)之間存在通過二硫鍵穩(wěn)定的許多環(huán)或轉(zhuǎn)角。根據(jù)HA的晶體結(jié)構(gòu)(PDB標(biāo)示符1AO6、1BJ5、1BKE、1BM0、1E7E至1E71和1UOR)，這些環(huán)大部分遠(yuǎn)離分子主體。這些環(huán)可用于治療活性肽的插入或內(nèi)部融合，特別是需要二級結(jié)構(gòu)才有功能的那些，或治療性蛋白質(zhì)，以本質(zhì)上產(chǎn)生具有特定生物學(xué)活性的清蛋白分子。人清蛋白結(jié)構(gòu)中可插入肽或多肽以產(chǎn)生本發(fā)明清蛋白融合蛋白的環(huán)包括Val54-Asn61、Thr76-Asp89、A1a92-Glu100、Gin170-Ala176、His247-Glu252、Glu266-Glu277、Glu280-His288、Ala362-Glu368、Lys439-Pro447、Val462-Lys475、Thr478-Pro486和Lys560-Thr566。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，肽或多肽插入成熟人清蛋白(SEQIDNO1)的環(huán)Val54-Asn61、Gln170-Ala176和/或Lys560-Thr566。待插入的肽可衍生自對特定生物學(xué)活性進(jìn)行篩選的噬菌體展示或合成肽文庫或來自具有期望功能的分子的活性部分。此外，可在特定環(huán)內(nèi)產(chǎn)生隨機(jī)肽文庫，或通過將隨機(jī)肽插入HA分子的特定環(huán)中，其中展現(xiàn)了所有可能的氨基酸組合。這樣的文庫可通過下列方法之一在HA或HA結(jié)構(gòu)域片段上產(chǎn)生(a)將HA或HA結(jié)構(gòu)域片段的一個或多個肽環(huán)中的氨基酸進(jìn)行隨機(jī)突變?？梢赃@種方式突變環(huán)內(nèi)的一個、多個或所有殘基；(b)在HA或HA結(jié)構(gòu)域片段(即內(nèi)部融合)的一個或多個環(huán)中進(jìn)行長度為Xn(其中X是氨基酸，n是殘基數(shù)目)的隨機(jī)肽的置換或插入；(c)除(a)和/或(b)以外的N末端、C末端、或N和C末端肽/蛋白質(zhì)融合。還可通過將針對不同靶對不同環(huán)進(jìn)行的不同篩選衍生的肽移植到相同的HA或HA結(jié)構(gòu)域片段中，使HA或HA結(jié)構(gòu)域片段成為多功能的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，插入人血清清蛋白的環(huán)中的肽是表1中所公開的治療性蛋白質(zhì)的肽片段或肽變體。更具體的說，本發(fā)明涵蓋包含在人血清清蛋白的環(huán)中插入了長度為至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、或至少40個氨基酸的肽片段或肽變體的清蛋白融合蛋白。本發(fā)明還涵蓋包含在人血清清蛋白的N末端融合了長度為至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、或至少40個氨基酸的肽片段或肽變體的清蛋白融合蛋白。本發(fā)明還涵蓋包含在人血清清蛋白的C末端融合了長度為至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、或至少40個氨基酸的肽片段或肽變體的清蛋白融合蛋白。例如，表1和2(例如治療劑Y)中描述的短肽可插入到清蛋白的環(huán)中。一般而言，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白可具有一個HA衍生區(qū)域和一個治療性蛋白質(zhì)衍生區(qū)域。然而，每種蛋白質(zhì)的多個區(qū)域可用于構(gòu)建本發(fā)明的清蛋白融合蛋白。相似的，超過一種治療性蛋白質(zhì)可用于構(gòu)建本發(fā)明的清蛋白融合蛋白。例如，可將治療性蛋白質(zhì)融合到HA的N-和C-兩個末端。在這樣一種構(gòu)造中，治療性蛋白質(zhì)部分可以是相同或不同的治療性蛋白質(zhì)分子。雙功能清蛋白融合蛋白的結(jié)構(gòu)可表示為X-HA-Y或Y-HA-X。例如，可制備抗BLySTMscFv-HA-IFNα-2b融合物以通過抗BLySTMscFv調(diào)節(jié)對IFNα-2b的免疫應(yīng)答?；蛘撸芍苽銱A-融合物的雙(或甚至多)功能藥劑，例如HA-IFNα-2b融合物，并根據(jù)功能、半衰期等以不同比例混合HA-抗BLySTMscFv融合物或其它HA-融合物。還可通過位于HA另一端的蛋白質(zhì)或肽制備將融合物的治療性蛋白質(zhì)部分靶向靶器官或細(xì)胞類型的雙或多功能清蛋白融合蛋白。作為已知治療性分子的融合物的替代方法，可通過篩選作為HA或HA結(jié)構(gòu)域片段N末端、C末端、或N和C末端融合物而構(gòu)建的文庫來獲得肽，它們通常是6個、8個、12個、20個或25個或Xn個(其中X是氨基酸(aa)，n是殘基數(shù)目)隨機(jī)氨基酸，其中展現(xiàn)了所有可能的氨基酸組合。這種方法的特殊優(yōu)點(diǎn)是可在HA分子上原位選擇肽，因此肽的特性就像選擇的那樣，而不會像由任何其它方法衍生肽然后附著到HA上的情況那樣發(fā)生潛在改變。另外，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白可在融合部分之間包含接頭肽，從而在模塊之間提供更大物理間隔，并由此使治療性蛋白質(zhì)部分的可達(dá)性最大化，例如與其相關(guān)受體結(jié)合。接頭肽可由氨基酸組成，使其具柔性或更具剛性。接頭序列可通過蛋白酶或化學(xué)切除以產(chǎn)生生長激素相關(guān)部分。優(yōu)選的是，蛋白酶是宿主天然產(chǎn)生的，例如釀酒酵母蛋白酶kex2或等效的蛋白酶。因此，如上所述，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白可具有如下通式R1-L-R2；R2-L-R1或R1-L-R2-L-R1，其中R1是至少一種治療性蛋白質(zhì)、肽或多肽序列，且不必是相同的治療性蛋白質(zhì)，L是接頭，而R2是血清清蛋白序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，包含治療性蛋白質(zhì)的本發(fā)明清蛋白融合蛋白具有與未與清蛋白融合的相同治療性蛋白質(zhì)的血漿穩(wěn)定性相比更高的血漿穩(wěn)定性。血漿穩(wěn)定性通常指在體內(nèi)施用治療性蛋白質(zhì)并進(jìn)入血流時和在治療性蛋白質(zhì)降解并從血流中清除進(jìn)入諸如腎或肝等器官，最終從體內(nèi)清除時之間的時間間隔。根據(jù)血流中治療性蛋白質(zhì)的半衰期計(jì)算血漿穩(wěn)定性。血流中治療性蛋白質(zhì)的半衰期可通過本領(lǐng)域知道的常用測定法容易的測定。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，包含治療性蛋白質(zhì)的本發(fā)明清蛋白融合蛋白具有與未與清蛋白融合的相同治療性蛋白質(zhì)的保質(zhì)期相比延長的保質(zhì)期。保質(zhì)期通常指溶液中的或有些其它貯存制劑中的治療性蛋白質(zhì)的治療活性保持穩(wěn)定而無治療活性過度喪失的時間期限。許多治療性蛋白質(zhì)在其未融合狀態(tài)下高度易變。如下所述，這些治療性蛋白質(zhì)在引入本發(fā)明清蛋白融合蛋白后其保質(zhì)期通常顯著延長。保質(zhì)期“延長的”本發(fā)明清蛋白融合蛋白相對于接受相同貯存和處理?xiàng)l件的標(biāo)準(zhǔn)品表現(xiàn)出更大的治療活性。標(biāo)準(zhǔn)品可以是未融合的全長治療性蛋白質(zhì)。當(dāng)清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分是該蛋白質(zhì)的類似物、變體、或有其它改變或不包含完整序列時，治療活性的延長或者可與該類似物、變體、改變的肽或不完整序列的未融合等同物進(jìn)行比較。作為實(shí)例，在給定時間點(diǎn)進(jìn)行比較時，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白可保留接受相同貯存及處理?xiàng)l件的標(biāo)準(zhǔn)品的治療活性的大于約100％或大于治療活性的約105％、110％、120％、130％、150％或200％。保質(zhì)期也可根據(jù)貯存后殘余的治療活性來評估，針對貯存開始時的治療活性進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。保質(zhì)期延長的本發(fā)明清蛋白融合蛋白表現(xiàn)出治療活性延長，可保留接受相同條件的等價未融合治療性蛋白質(zhì)的治療活性的大于約50％、治療活性的約60％、70％、80％、或90％或更多。融合蛋白的表達(dá)本發(fā)明的清蛋白融合蛋白可作為重組分子由酵母、微生物諸如細(xì)菌、或人或動物細(xì)胞系分泌而產(chǎn)生。任選的是，多肽由宿主細(xì)胞分泌。本發(fā)明的一個具體實(shí)施方案包括編碼對于在酵母中指導(dǎo)分泌有效的信號序列的DNA構(gòu)建體，特別是酵母衍生的信號序列(尤其是與酵母宿主同源的)，和本發(fā)明第一方面的融合分子，在信號和成熟多肽之間沒有酵母衍生的原(pro)序列。釀酒酵母轉(zhuǎn)化酶信號是酵母衍生的信號序列的優(yōu)選例子。并未設(shè)想Poznansky等人(FEBSLett.23918，1988)制備的那類綴合物，其中分開制備的多肽通過化學(xué)交聯(lián)得以連接。本發(fā)明還包括經(jīng)轉(zhuǎn)化表達(dá)本發(fā)明清蛋白融合蛋白的細(xì)胞，優(yōu)選酵母細(xì)胞。除了經(jīng)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞本身外，本發(fā)明還涵蓋那些細(xì)胞在營養(yǎng)培養(yǎng)基中的培養(yǎng)物，優(yōu)選單克隆(克隆上同質(zhì)的)培養(yǎng)物或由單克隆培養(yǎng)物衍生的培養(yǎng)物。如果多肽是分泌的，則培養(yǎng)基將含有多肽，帶有細(xì)胞，或如果細(xì)胞已被過濾或離心去除則不帶有細(xì)胞。許多表達(dá)系統(tǒng)是已知的且可使用的，包括細(xì)菌(例如大腸埃希氏菌(E.coli)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis))、酵母(例如釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis)和巴斯德畢赤氏酵母(Pichiapastoris))、絲狀真菌(例如曲霉屬)、植物細(xì)胞、動物細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞。優(yōu)選用于生產(chǎn)清蛋白融合蛋白的酵母菌株是D88、DXY1和BXP10。D88[leu2-3，leu2-122，can1，pra1，ubc4]是親本菌株AH22his+(也稱為DB1；參見例如Sleep等人，Biotechnology842-46，1990)的衍生物。該菌株含有l(wèi)eu2突變，它容許對含有LEU2基因的基于2μm的質(zhì)粒進(jìn)行營養(yǎng)缺陷型選擇。D88在葡萄糖過量時還表現(xiàn)出PRB1的去阻遏。PRB1啟動子通常受到監(jiān)測葡萄糖水平和生長階段的兩種檢查點(diǎn)的控制。在野生型酵母中，該啟動子在葡萄糖耗盡并進(jìn)入靜止期后激活。菌株D88表現(xiàn)出受葡萄糖的阻遏，但在進(jìn)入靜止期后保持誘導(dǎo)。PRA1基因編碼酵母液泡蛋白酶，YscA內(nèi)切蛋白酶A，它定位于ER。UBC4基因處于泛蛋白化途徑中并參與使短命和異常的蛋白質(zhì)靶向泛蛋白依賴性降解。發(fā)現(xiàn)此ubc4突變的分離增加細(xì)胞中表達(dá)質(zhì)粒的拷貝數(shù)并引起由質(zhì)粒表達(dá)的期望蛋白質(zhì)的表達(dá)水平升高(參見例如國際發(fā)布號WO99/00504，將其完整引入本文作為參考)。DXY1，D88的一種衍生物，具有如下基因型[leu2-3，leu2-122，can1，pra1，ubc4，ura3∷yap3]。除D88中分離的突變之外，此菌株還具有YAP3蛋白酶的敲除。此蛋白酶主要引起蛋白質(zhì)中兩個堿性殘基(RR、RK、KR、KK)的切割，但是也能促進(jìn)單個堿性殘基處的切割。此yap3突變的分離導(dǎo)致高水平的全長HAS產(chǎn)物(參見例如美國專利號5,965,386及Kerry-Williams等人，Yast14161-169，1998，將其完整引入本文作為參考)。BXP10具有如下基因型leu2-3，leu2-122，can1，pral，ubc4，ura3，yap3∷URA3，ly2，hsp150∷LYS2，pmt1∷URA3。除DXY1中分離的突變之外，此菌株還具有PMT1基因和HSP150基因的敲除。PMT1基因是多萜醇-磷酸-D-甘露糖蛋白質(zhì)O-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶(Pmt)進(jìn)化保守家族的成員。Pmtlp的跨膜拓?fù)鋵W(xué)表明它是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的膜內(nèi)在蛋白質(zhì)，在O-連接糖基化中起作用。此突變有助于減少/消除HAS融合物的O-連接糖基化(參見例如國際發(fā)布號WO00/44772，將其完整引入本文作為參考)。研究揭示了通過離子交換層析不能自rHA中有效分離Hsp150蛋白質(zhì)。HSP150基因中的突變消除了已證實(shí)難以通過標(biāo)準(zhǔn)純化技術(shù)清除的潛在污染物。參見例如美國專利號5,783,423，將其完整引入本文作為參考。以常規(guī)方法產(chǎn)生所需蛋白質(zhì)，例如由插入宿主染色體中或游離質(zhì)粒上的編碼序列產(chǎn)生。以任何常用方法例如電穿孔用所需蛋白質(zhì)的編碼序列轉(zhuǎn)化酵母。通過電穿孔轉(zhuǎn)化酵母的方法公開于Becker和Guarente，MethodsEnzymol.194182，1990。成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，即含有本發(fā)明DNA構(gòu)建體的細(xì)胞可通過眾所周知的技術(shù)進(jìn)行鑒定。例如，可培養(yǎng)由導(dǎo)入表達(dá)構(gòu)建體產(chǎn)生的細(xì)胞以產(chǎn)生所需多肽?？墒斋@細(xì)胞，裂解，并使用諸如Southern，J.Mol.Biol.98503，1975或Berent等人，Biotech.3208，1985描述的方法對DNA內(nèi)容物檢驗(yàn)DNA的存在?；蛘撸墒褂每贵w來檢測上清液中蛋白質(zhì)的存在。有用的酵母質(zhì)粒載體包括pRS403-406和pRS413-416，且一般可從StratageneCloningSystems，LaJolla，CA92037，USA獲得。質(zhì)粒pRS403、pRS404、pRS405和pRS406是酵母整合質(zhì)粒(YIp)，且摻入了酵母選擇標(biāo)記HIS3、7RP1、LEU2和URA3。質(zhì)粒pRS413-416是酵母著絲粒質(zhì)粒(YCp)。優(yōu)選用于在酵母中表達(dá)以制備清蛋白融合蛋白的載體包括pPPC0005、pScCHSA、pScNHSA、和pC4HAS，它們詳述于實(shí)施例1中。圖2顯示了可用作基本載體的pPPC0005質(zhì)粒圖譜，可向其中克隆編碼治療性蛋白質(zhì)的多核苷酸以形成HA-融合物。它含有PRB1釀酒酵母啟動子(PRB1p)、融合前導(dǎo)序列(FL)、編碼HA的DNA(rHA)和ADH1釀酒酵母終止序列。融合前導(dǎo)序列的序列由人血清清蛋白(SEQIDNO3)信號肽的前19個氨基酸和交配因子α1啟動子的最后5個氨基酸(SLDKR，參見EP-A-387319，將其完整引入本文作為參考)組成。質(zhì)粒pPPC0005、pScCHSA、pScNHSA和pC4Has于2001年4月11日保藏于美國典型培養(yǎng)物收藏中心，10801UniversityBoulevard，Manassas，Virginia20110-2209，并分別給予了保藏號ATCCPTA-3278、PTA-3276、PTA-3279和PTA-3277。可用于在酵母中表達(dá)清蛋白融合蛋白的另一種載體pSAC35載體描述于Sleep等人，BioTechnology842，1990，將其完整引入本文作為參考?？捎糜诒磉_(dá)清蛋白融合蛋白的酵母啟動子有MET25啟動子。參見例如DominikMumburg、RolfMuller和MartinFunk，NucleicAcidsResearch22(25)5767-5768，1994。Met25啟動子的長度是383個堿基(堿基-382至-1)，且通過此啟動子表達(dá)的基因也稱為Met15、Met17和YLR303W。一個優(yōu)選的實(shí)施方案使用如下序列，其中如下序列中位于5’末端的用于克隆的NotI位點(diǎn)標(biāo)有下劃線，且位于3’末端的ATG起始密碼子標(biāo)有下劃線GCGGCCGCCGGATGCAAGGGTTCGAATCCCTTAGCTCTCATTATTTTTTGCTTTTTCTCTTGAGGTCACATGATCGCAAAATGGCAAATGGCACGTGAAGCTGTCGATATTGGGGAACTGTGGTGGTTGGCAAATGACTAATTAAGTTAGTCAAGGCGCCATCCTCATGAAAACTGTGTAACATAATAACCGAAGTGTCGAAAAGGTGGCACCTTGTCCAATTGAACACGCTCGATGAAAAAAATAAGATATATATAAGGTTAAGTAAAGCGTCTGTTAGAAAGGAAGTTTTTCCTTTTTCTTGCTCTCTTGTCTTTTCATCTACTATTTCCTTCGTGTAATACAGGGTCGTCAGATACATAGATACAATTCTATTACCCCCATCCATACAATG(SEQIDNO5)可用于在酵母中表達(dá)清蛋白融合蛋白的其它啟動子包括如下a)cbh1啟動子TCTAGAGTTGTGAAGTCGGTAATCCCGCTGTATAGTAATACGAGTCGCATCTAAATACTCCGAAGCTGCTGCGAACCCGGAGAATCGAGATGTGCTGGAAAGCTTCTAGCGAGCGGCTAAATTAGCATGAAAGGCTATGAGAAATTCTGGAGACGGCTTGTTGAATCATGGCGTTCCATTCTTCGACAAGCAAAGCGTTCCGTCGCAGTAGCAGGCACTCATTCCCGAAAAAACTCGGAGATTCCTAAGTAGCGATGGAACCGGAATAATATAATAGGCAATACATTGAGTTGCCTCGACGGTTGCAATGCAGGGGTACTGAGCTTGGACATAACTGTTCCGTACCCCACCTCTTCTCAACCTTTGGCGTTTCCCTGATTCAGCGTACCCGTACAAGTCGTAATCACTATTAACCCAGACTGACCGGACGTGTTTTGCCCTTCATTTGGAGAAATAATGTCATTGCGATGTGTAATTTGCCTGCTTGACCGACTGGGGCTGTTCGAAGCCCGAATGTAGGATTGTTATCCGAACTCTGCTCGTAGAGGCATGTTGTGAATCTGTGTCGGGCAGGACACGCCTCGAAGGTTCACGGCAAGGGAAACCACCGATAGCAGTGTCTAGTAGCAACCTGTAAAGCCGCAATGCAGCATCACTGGAAAATACAAACCAATGGCTAAAAGTACATAAGTTAATGCCTAAAGAAGTCATATACCAGCGGCTAATAATTGTACAATCAAGTGGCTAAACGTACCGTAATTTGCCAACGGCTTGTGGGGTTGCAGAAGCAACGGCAAAGCCCCACTTCCCCACGTTTGTTTCTTCACTCAGTCCAATCTCAGCTGGTGATCCCCCAATTGGGTCGCTTGTTTGTTCCGGTGAAGTGAAAGAAGACAGAGGTAAGAATGTCTGACTCGGAGCGTTTTGCATACAACCAAGGGCAGTGATGGAAGACAGTGAAATGTTGACATTCAAGGAGTATTTAGCCAGGGATGCTTGAGTGTATCGTGTAAGGAGGTTTGTCTGCCGATACGACGAATACTGTATAGTCACTTCTGGTGAAGTGGTCCATATTGAAATGTAAGTCGGCACTGAACAGGCAAAAGATTGAGTTGAAACTGCCTAAGATCTCGGGCCCTCGGGCCTTCGGCCTTTGGGTGTACATGTTTGTGCTCCGGGCAAATGCAAAGTGTGGTAGGATCGAACACACTGCTGCCTTTACCAAGCAGCTGAGGGTATGTGATAGGCAAATGTTCAGGGGCCACTGCATGGTTTCGAATAGAAAGAGAAGCTTAGCCAAGAACAATAGCCGATAAAGATAGCCTCATTAAACGGAATGAGCTAGTAGGCAAAGTCAGCGAATGTGTATATATAAAGGTTCGAGGTCCGTGCCTCCCTCATGCTCTCCCCATCTACTCATCAACTCAGATCCTCCAGGAGACTTGTACACCATCTTTTGAGGCACAGAAACCCAATAGTCAACCGCGGACTGGCATC(SEQIDNO113)b)構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)的cysD啟動子AGATCTGGTTCCTGAGTACATCTACCGATGCGCCTCGATCCCCCTCTTAGCCGCATGAGATTCCTACCATTTATGTCCTATCGTTCAGGGTCCTATTTGGACCGCTAGAAATAGACTCTGCTCGATTTGTTTCCATTATTCACGCAATTACGATAGTATTTGGCTCTTTTCGTTTGGCCCAGGTCAATTCGGGTAAGACGCGATCACGCCATTGTGGCCGCCGGCGTTGTGCTGCTGCTATTCCCCGCATATAAACAACCCCTCCACCAGTTCGTTGGGCTTTGCGAATGCTGTACTCTATTTCAAGTTGTCAAAAGAGAGGATTCAAAAAATTATACCCCAGATATCAAAGATATCAAAGCCATC(SEQIDNO114)c)經(jīng)修飾cbh1啟動子，具有序列TCTAGAGTTGTGAAGTCGGTAATCCCGCTGTATAGTAATACGAGTCGCATCTAAATACTCCGAAGCTGCTGCGAACCCGGAGAATCGAGATGTGCTGGAAAGCTTCTAGCGAGCGGCTAAATTAGCATGAAAGGCTATGAGAAATTCTGGAGACGGCTTGTTGAATCATGGCGTTCCATTCTTCGACAAGCAAAGCGTTCCGTCGCAGTAGCAGGCACTCATTCCCGAAAAAACTCGGAGATTCCTAAGTAGCGATGGAACCGGAATAATATAATAGGCAATACATTGAGTTGCCTCGACGGTTGCAATGCAGGGGTACTGAGCTTGGACATAACTGTTCCGTACCCCACCTCTTCTCAACCTTTGGCGTTTCCCTGATTCAGCGTACCCGTACAAGTCGTAATCACTATTAACCCAGACTGACCGGACGTGTTTTGCCCTTCATTTGGAGAAATAATGTCATTGCGATGTGTAATTTGCCTGCTTGACCGACTGGGGCTGTTCGAAGCCCGAATGTAGGATTGTTATCCGAACTCTGCTCGTAGAGGCATGTTGTGAATCTGTGTCGGGCAGGACACGCCTCGAAGGTTCACGGCAAGGGAAACCACCGATAGCAGTGTCTAGTAGCAACCTGTAAAGCCGCAATGCAGCATCACTGGAAAATACAAACCAATGGCTAAAAGTACATAAGTTAATGCCTAAAGAAGTCATATACCAGCGGCTAATAATTGTACAATCAAGTGGCTAAACGTACCGTAATTTGCCAACGGCTTGTGGGGTTGCAGAAGCAACGGCAAAGCCCCACTTCCCCACGTTTGTTTCTTCACTCAGTCCAATCTCAGCTGGTGATCCCCCAATTGGGTCGCTTGTTTGTTCCGGTGAAGTGAAAGAAGACAGAGGTAAGAATGTCTGACTCGGAGCGTTTTGCATACAACCAAGGGCAGTGATGGAAGACAGTGAAATGTTGACATTCAAGGAGTATTTAGCCAGGGATGCTTGAGTGTATCGTGTAAGGAGGTTTGTCTGCCGATACGACGAATACTGTATAGTCACTTCTGGTGAAGTGGTCCATATTGAAATGTAAGTCGGCACTGAACAGGCAAAAGATTGAGTTGAAACTGCCTAAGATCTCGGGCCCTCGGGCCTTCGGCCTTTGGGTGTACATGTTTGTGCTCCGGGCAAATGCAAAGTGTGGTAGGATCGAACACACTGCTGCCTTTACCAAGCAGCTGAGGGTATGTGATAGGCAAATGTTCAGGGGCCACTGCATGGTTTCGAATAGAAAGAGAAGCTTAGCCTGCAGCCTCTTATCGAGAAAGAAATTACCGTCGCTCGTGATTTGTTTGCAAAAAGAACAAAACTGAAAAAACCCAGACACGCTCGACTTCCTGTCTTCCTATTGATTGCAGCTTCCAATTTCGTCACACAACAAGGTCCTAGCTTAGCCAAGAACAATAGCCGATAAAGATAGCCTCATTAAACGGAATGAGCTAGTAGGCAAAGTCAGCGAATGTGTATATAAAGGTTCGAGGTCCGTGCCTCCCTCATGCTCTCCCCATCTACTCATCAACTCAGATCCTCCAGGAGACTTGTACACCATCTTTTGAGGCACAGAAACCCAATAGTCAACCGCGGACTGGCATC(SEQIDNO115)d)構(gòu)巢曲霉的cysD啟動子，具有序列AGATCTGGTTCCTGAGTACATCTACCGATGCGCCTCGATCCCCCTCTTAGCCGCATGAGATTCCTACCATTTATGTCCTATCGTTCAGGGTCCTATTTGGACCGCTAGAAATAGACTCTGCTCGATTTGTTTCCATTATTCACGCAATTACGATAGTATTTGGCTCTTTTCGTTTGGCCCAGGTCAATTCGGGTAAGACGCGATCACGCCATTGTGGCCGCCGGCGCTGCAGCCTCTTATCGAGAAAGAAATTACCGTCGCTCGTGATTTGTTTGCAAAAAGAACAAAACTGAAAAAACCCAGACACGCTCGACTTCCTGTCTTCCTATTGATTGCAGCTTCCAATTTCGTCACACAACAAGGTCCTACGCCGGCGTTGTGCTGCTGCTATTCCCCGCATATAAACAACCCCTCCACCAGTTCGTTGGGCTTTGCGAATGCTGTACTCTATTTCAAGTTGTCAAAAGAGAGGATTCAAAAAATTATACCCCAGATATCAAAGATATCAAAGCCATC(SEQIDNO116)已開發(fā)了多種方法用于經(jīng)互補(bǔ)粘端將DNA與載體可操作連接。例如，可以將互補(bǔ)同聚物束添加至待插入載體DNA中的DNA區(qū)段。然后，將載體和DNA區(qū)段通過互補(bǔ)同聚物尾之間氫鍵連接以形成重組DNA分子。含有一種或多種限制性位點(diǎn)的合成接頭提供了連接DNA區(qū)段和載體的另一種方法。將通過內(nèi)切核酸酶限制性消化產(chǎn)生的DNA區(qū)段用噬菌體T4DNA聚合酶或大腸桿菌DNA聚合酶I進(jìn)行處理，這些酶以其3′-5′外切核酸水解活性消除凸出的γ單鏈末端，并以其聚合活性填平凹進(jìn)的3′末端。因此，這些活性的結(jié)合產(chǎn)生末端補(bǔ)平的DNA區(qū)段。然后，在存在能夠催化平端DNA分子連接的酶諸如噬菌體T4DNA連接酶時將末端補(bǔ)平的區(qū)段與摩爾數(shù)大大過量的接頭分子一起保溫。由此，反應(yīng)產(chǎn)物是在其末端攜帶多聚接頭序列的DNA區(qū)段。然后，用合適的限制酶切割這些DNA區(qū)段，并與已用產(chǎn)生與DNA區(qū)段末端相容的末端的酶切割過的表達(dá)載體進(jìn)行連接。含有多種限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)的合成接頭可從許多來源購得，包括InternationalBiotechnologiesInc，NewHaven，CT，USA。如果例如要制備HA變體的話，根據(jù)本發(fā)明修飾DNA的一種理想方法是使用Saiki等人，Science239487-491，1988公開的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。在此方法中，將要酶促擴(kuò)增的DNA的側(cè)翼為兩種特異寡核苷酸引物，它們本身摻入擴(kuò)增的DNA中。特異引物可含有限制性內(nèi)切核酸酶識別位點(diǎn)，可用于通過本領(lǐng)域知道的方法克隆到表達(dá)載體中。設(shè)想可作為表達(dá)清蛋白融合蛋白的宿主用于本發(fā)明實(shí)踐的酵母的例示屬有畢赤酵母屬(Pichia)(漢遜酵母屬Hansenula)、糖酵母屬(Saccharomyces)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、假絲酵母屬(Candida)、球擬酵母屬(Torulopsis)、有孢圓酵母屬(Torulaspora)、裂殖糖酵母屬(Schizosaccharomyces)、固囊酵母屬(Citeromyces)、管囊酵母屬(Pachysolen)、德巴利酵母屬(Debaryomyces)、梅奇酵母屬(Metschunikowia)、紅冬孢屬(Rhodosporidium)、白冬孢酵母(Leucosporidium)、葡狀子囊菌屬(Botryoascus)、鎖擲酵母屬(Sporidiobolus)、擬內(nèi)孢霉屬(Endomycopsis)等等。優(yōu)選的屬是選自下組的屬糖酵母屬、裂殖糖酵母屬、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、和有孢圓酵母屬。糖酵母屬的實(shí)例有啤酒糖酵母(S.cerevisiae)、意大利糖酵母(S.italicus)和魯式糖酵母(S.rouxii)?？唆斁S酵母屬的例子有壁脆克魯維酵母(K.fragilis)、乳酸克魯維酵母(K.lactis)和馬克斯克魯維酵母(K.marxianus)。合適的有孢圓酵母物種有戴爾有孢圓酵母T.delbrueckii)。畢赤酵母(漢遜酵母)的例子有P.angusta(以前是多形漢遜酵母H.polymorpha)、異常畢赤氏酵母P.anomala)(以前是異常漢遜氏酵母H.anomala)和巴斯德畢赤氏酵母(P.pastoris)。用于釀酒酵母轉(zhuǎn)化的方法通常教導(dǎo)自EP251744、EP258067和WO90/01063，都引入本文作為參考。優(yōu)選的釀酒酵母示例種包括啤酒糖酵母(S.cerevisiae)、意大利糖酵母(S.italicus)、糖化糖酵母(S.diastaticus)和魯氏接合糖酵母(Zygosaccharomycesrouxii)。優(yōu)選的克魯維酵母示例種包括壁脆克魯維酵母(K.fragilis)和乳酸克魯維酵母(K.lactis)。優(yōu)選的漢遜酵母示例種包括多形漢遜酵母(Hpolymorpha)(現(xiàn)在是P.angusta)、異常漢遜酵母(H.anomala)(現(xiàn)在是異常畢赤酵母P.anomala)、和碎囊畢赤酵母(Pichiacapsulata)。另外優(yōu)選的畢赤酵母示例種包括巴斯德畢赤氏酵母(P.pastoris)。優(yōu)選的曲霉示例種包括黑曲霉(A.niger)和構(gòu)巢曲霉(A.nidulans)。優(yōu)選的亞羅酵母(Yarrowia)示例種包括解脂亞羅酵母(Y.lipolytica)。許多優(yōu)選的酵母物種可從ATCC獲得。例如，下列優(yōu)選的酵母物種可從ATCC獲得且可用于表達(dá)清蛋白融合蛋白SaccharomycescerevisiaeHansen，teleomorph株BY4743yap3突變體(ATCC登錄號4022731)；SaccharomycescerevisiaeHansen，teleomorph株BY4743hsp150突變體(ATCC登錄號4021266)；SaccharomycescerevisiaeHansen，teleomorph株BY4743pmtl突變體(ATCC登錄號4023792)；SaccharomycescerevisiaeHansen，teleomorph(ATCC登錄號20626；44773；44774和62995)；SaccharomycesdiastaticusAndrewsetGillilandexvanderWalt，teleomorph(ATCC登錄號62987)；Kluyveromyceslactis(Dombrowski)vanderWalt，teleomorph(ATCC登錄號76492)；Pichiaangusta(Teunissonetal.)Kurtzman，teleomorph作為HansenulapolymorphadeMoraisetMaia，teleomorph保藏(ATCC登錄號26012)；AspergillusnigervanTieghem，anamorph(ATCC登錄號9029)；AspergillusnigervanTieghem，anamorph(ATCC登錄號16404)；Aspergillusnidulans(Eidam)Winter，anamorph(ATCC登錄號48756)；和Yarrowialipolytica(Wickerhametal.)vanderWaltetvonArx，teleomorph(ATCC登錄號201847)。適用于釀酒酵母的啟動子包括與PGK1基因、GAL1或GAL10基因、CYC1、PHO5、TRP1、ADH1、ADH2、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、磷酸葡糖異構(gòu)酶、葡糖激酶的基因、α-交配因子信息素、(a交配因子信息素)有關(guān)的啟動子、PRB1啟動子、GUT2啟動子、GPD1啟動子、及牽涉部分5’調(diào)控區(qū)與其它啟動子部分5’調(diào)控區(qū)或與上游激活位點(diǎn)的雜合體的雜合啟動子(例如EP-A-258067的啟動子)。用于粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomycespombe)的便于調(diào)節(jié)的啟動于是如Maundrell，J.Biol.Chem.26510857-10864，1990描述的來自nmt基因的硫胺素可抑制啟動子，以及如Hoffman和Winston，Genetics124807-816，1990描述的葡萄糖可抑制jbp1基因啟動子。轉(zhuǎn)化畢赤酵母以表達(dá)外源基因的方法的教導(dǎo)見例如Cregg等人，1993及多項(xiàng)Philips專利(例如US4857467，引入本文作為參考)，而畢赤酵母表達(dá)試劑盒可購自InvitrogenBV，Leek，Netherlands和InvitrogenCorp.，SanDiego，California。合適的啟動子包括AOX1和AOX2。Gleeson等人，J.Gen.Microbiol.1323459-3465，1986包括關(guān)于漢遜酵母載體及轉(zhuǎn)化的信息，合適的啟動子是MOX1和FMD1；而EP361991，F(xiàn)leer等人，1991及來自Rhone-PoulencRorer的其它出版物教導(dǎo)了如何在克魯維酵母(Kluyveromycesspp.)中表達(dá)外源蛋白，合適的啟動子是PGK1。轉(zhuǎn)錄終止信號優(yōu)選真核基因的3’側(cè)翼序列，它包含用于轉(zhuǎn)錄終止和多腺苷酸化的正確信號。合適的3’側(cè)翼序列可以是例如基因中與所用表達(dá)調(diào)控序列天然連接的那些，即可對應(yīng)于啟動子?；蛘?，它們可以是不同的，在這種情況中優(yōu)選釀酒酵母ADH1基因的終止信號。所需清蛋白融合蛋白可最初用分泌前導(dǎo)序列表達(dá)，它可以是在選定酵母中有效的任何前導(dǎo)序列。在酵母中有用的前導(dǎo)序列包括任何如下a)MPIF-1信號序列(例如GenBank登記號AAB51134的氨基酸1-21)，MKVSVAALSCLMLVTALGSQA(SEQIDNO6)b)司腺鈣蛋白信號序列(MLQNSAVLLLLVISASA，SEQIDNO7)c)HAS信號序列的pre-pro區(qū)(例如MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRR，SEQIDNO8)d)HAS信號序列的pre區(qū)(例如MKWVTFISLLFLFSSAYS，SEQIDNO9)或其變體，諸如例如MKWVSFISLLFLFSSAYS(SEQIDNO10)e)轉(zhuǎn)化酶信號序列(例如MLLQAFLFLLAGFAAKISA，SEQIDNO11)f)酵母交配因子α信號序列(例如MRFPSIFTAVLAFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKR，SEQIDNO12或MRFPSIFTAVLAFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLDKR，SEQIDNO12)g)乳酸克魯維酵母(K.Lactis)殺傷毒素前導(dǎo)序列h)雜合信號序列(例如MKWVSFISLLFLFSSAYSRSLEKR，SEQIDNO13)i)HSA/MFa-1雜合信號序列(也稱為HSA/kex2)(例如MKWVSFISLLFLFSSAYSRSLDKR，SEQIDNO14)j)乳酸克魯維酵母殺傷/MFα-1融合前導(dǎo)序列(例如MNIFYIFLFLLSFVQGSLDKR，SEQIDNO15)k)免疫球蛋白Ig信號序列(例如MGWSCIILFLVATATGVHS，SEQIDNO16)l)纖蛋白B前體信號序列(例如MERAAPSRRVPLPLLLLGGLALLAAGVDA，SEQIDNO17)m)簇蛋白前體信號序列(例如MMKTLLLFVGLLTWESGQVLG，SEQIDNO18)n)胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白4信號序列(例如MLPLCLVAALLLAAGPGPSLG，SEQIDNO19)o)HAS信號序列pre-pro區(qū)的變體，例如MKWVSFISLLFLFSSAYSRGVFRR(SEQIDNO20)，MKWVTFISLLFLFAGVLG(SEQIDNO21)，MKWVTFISLLFLFSGVLG(SEQIDNO22)，MKWVTFISLLFLFGGVLG(SEQIDNO23)，經(jīng)修飾HAS前導(dǎo)HSA#64-MKWVTFISLLFLFAGVSG(SEQIDNO24)；經(jīng)修飾HAS前導(dǎo)HSA#66-MKWVTFISLLFLFGGVSG(SEQIDNO25)；經(jīng)修飾HAS(A14)前導(dǎo)-MKWVTFISLLFLFAGVSG(SEQIDNO26)；經(jīng)修飾HAS(S14)前導(dǎo)(也稱作經(jīng)修飾HAS#65)-MKWVTFISLLFLFSGVSG(SEQIDNO27)，經(jīng)修飾HAS(G14)前導(dǎo)-MKWVTFISLLFLFGGVSG(SEQIDNO28)，或MKWVTFISLLFLFGGVLGDLHKS(SEQIDNO29)p)共有信號序列(MPTWAWWLFLVLLLALWAPARG，SEQIDNO30)q)酸性磷酸酶(PH05)前導(dǎo)(例如MFKSVVYSILAASLANA，SEQIDNO31)r)MFoz-1的pre序列s)0葡聚糖酶(BGL2)的pre序列t)殺傷毒素前導(dǎo)u)殺傷毒素的pre序列v)乳酸克魯維酵母殺傷毒素prepro(29個氨基酸；16個pre氨基酸和13個pro氨基酸)MNIFYIFLFLLSFVQGLEHTHRRGSLDKR(SEQIDNO32)w)糖化酵母(S.diastaticus)萄糖淀粉酶II分泌前導(dǎo)序列x)卡爾酵母(S.carlsbergensis)α-半乳糖苷酶(MEL1)分泌前導(dǎo)序列y)假絲酵母葡糖淀粉酶前導(dǎo)序列z)EP-A-387319中公開的雜合前導(dǎo)(引入本文作為參考)aa)gp67信號序列(與桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)聯(lián)合)(例如GenBank登記號AAA72759的氨基酸1-19)或bb)治療性蛋白質(zhì)X的天然前導(dǎo)；cc)釀酒酵母轉(zhuǎn)化酶(SUC2)前導(dǎo)，公開于JP62-096086(授權(quán)號911036516，引入本文作為參考)；或dd)復(fù)旋花粉酶-MKLAYSLLLPLAGVSASVINYKR(SEQIDNO33)ee)經(jīng)修飾TA57原肽前導(dǎo)變體#1-MKLKTVRSAVLSSLFASQVLGQPIDDTESQTTSVNLMADDTESAFATQTNSGGLDVVGLISMAKR(SEQIDNO34)ff)經(jīng)修飾TA57原肽前導(dǎo)變體#2-MKLKTVRSAVLSSLFASQVLGQPIDDTESQTTSVNLMADDTESAFATQTNSGGLDVVGLISMAEEGEPKR(SEQIDNO35)gg)共有信號肽-MWWRLWWLLLLLLLLWPMVWA(SEQIDNO111)jj)經(jīng)修飾HSA/kex2信號序列-MKWVSFISLLFLFSSAYSGSLDKR(SEQIDNO112)kk)共有信號肽#2-MRPTWAWWLFLVLLLALWAPARG(SEQIDNO105)重組和合成生產(chǎn)清蛋白融合蛋白的其它方法本發(fā)明還涉及含有編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸的載體、宿主細(xì)胞、以及通過合成和重組技術(shù)來生產(chǎn)清蛋白融合蛋白。載體可以是例如噬菌體、質(zhì)粒、病毒、或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以是復(fù)制勝任的或復(fù)制缺陷的。在后一種情況中，病毒的繁殖通常只能在互補(bǔ)的宿主細(xì)胞中發(fā)生。編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可以與含有用于在宿主中復(fù)制的選擇標(biāo)記的載體連接。通常，將質(zhì)粒載體引入沉淀物，諸如磷酸鈣沉淀物，或者是與帶電荷脂質(zhì)的復(fù)合物。如果載體是病毒，那么它可用適當(dāng)?shù)陌b細(xì)胞系進(jìn)行體外包裝，然后轉(zhuǎn)導(dǎo)到宿主細(xì)胞中。多核苷酸插入物應(yīng)當(dāng)與適當(dāng)?shù)膯幼涌刹僮鬟B接，諸如λ噬菌體PL啟動子、大腸桿菌lac、trp、phoA和tac啟動子、SV40早期和晚期啟動子及逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR等。其它合適的啟動子是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知道的。表達(dá)構(gòu)建體中還將包含用于轉(zhuǎn)錄起始和終止的位點(diǎn)，以及轉(zhuǎn)錄區(qū)中用于翻譯的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。由構(gòu)建體表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本的編碼區(qū)優(yōu)選在待翻譯多肽的起點(diǎn)包括翻譯起始密碼子，在終點(diǎn)的適當(dāng)位置包含終止密碼子(UAA、UGA或UAG)。如上所述，表達(dá)載體優(yōu)選包含至少一種選擇標(biāo)記。這樣的標(biāo)記包括二氫葉酸還原酶、G418、谷氨酰胺合酶、或用于真核細(xì)胞培養(yǎng)的新霉素抗性、以及用于在大腸桿菌或其它細(xì)菌中培養(yǎng)的四環(huán)素、卡那霉素或氨芐青霉素抗性。適當(dāng)宿主的代表性例子包括但不限于細(xì)菌細(xì)胞，諸如大腸桿菌、鏈霉屬和鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)細(xì)胞；真菌細(xì)胞，諸如酵母細(xì)胞(例如釀酒酵母或巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris，ATCC登記號201178))；昆蟲細(xì)胞，諸如果蠅S2細(xì)胞和夜蛾Sf9細(xì)胞；動物細(xì)胞，諸如CHO、COS、NSO、293、和鮑斯黑素瘤細(xì)胞；及植物細(xì)胞。上述宿主細(xì)胞的合適培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件在本領(lǐng)域是知道的。用于細(xì)菌的優(yōu)選載體包括pQE70、pQE60和pQE-9，可從QIAGEN公司購買；pBluescript載體、Phagescript載體、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46，可從StratageneCloningSystems公司購買；及ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5，可從PharmaciaBiotech公司購買。優(yōu)選的真核載體有pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1和pSG，可從Stratagene公司購買；及pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL，可從Pharmacia公司購買。用于酵母系統(tǒng)的優(yōu)選表達(dá)載體包括但不限于pYES2、pYD1、pTEF1/Zeo、pYES2/GS、pPICZ、pGAPZ、pGAPZalph、pPIC9、pPIC3.5、pHIL-D2、pHIL-S1、pPIC3.5K、pPIC9K、和PAO815(均可從Invitrogen，Carlbad，CA購買)。其它合適載體對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。在一個實(shí)施方案中，編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可以與信號序列融合，該信號序列將引導(dǎo)本發(fā)明的蛋白質(zhì)定位于原核或真核細(xì)胞的特定區(qū)室和/或引導(dǎo)本發(fā)明的蛋白質(zhì)從原核或真核細(xì)胞分泌。例如，在大腸桿菌中，可能希望將蛋白質(zhì)的表達(dá)引導(dǎo)到周質(zhì)空間。為了引導(dǎo)多肽表達(dá)到細(xì)菌的周質(zhì)空間而與本發(fā)明的清蛋白融合蛋白融合的信號序列或蛋白質(zhì)(或其片段)的例子包括但不限于pelB信號序列、麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)信號序列、MBP、ompA信號序列、周質(zhì)大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素B亞基的信號序列、和堿性磷酸酶的信號序列。用于構(gòu)建將引導(dǎo)蛋白質(zhì)定位的融合蛋白的一些載體可通過商業(yè)途徑獲得，諸如pMAL系列載體(特別是pMAL-p系列)可從NewEnglandBiolabs公司購買。在一個具體的實(shí)施方案中，可將編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸與pelB果膠裂解酶信號序列融合以提高該多肽在革蘭氏陰性細(xì)菌中表達(dá)和純化的效率。參見美國專利號5,576,195和5,846,818，將其內(nèi)容完整引入本文作為參考。為了引導(dǎo)本發(fā)明的清蛋白融合蛋白在哺乳動物細(xì)胞中分泌，可與其融合的信號肽的例子包括但不限于a)MPIF-1信號序列(例如GenBank登記號AAB51134的氨基酸1-21)，MKVSVAALSCLMLVTALGSQA(SEQIDNO6)b)司腺鈣蛋白信號序列(MLQNSAVLLLLVISASA，SEQIDNO7)c)HAS信號序列的pre-pro區(qū)(例如MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRR，SEQIDNO8)d)HAS信號序列的pre區(qū)(例如MKWVTFISLLFLFSSAYS，SEQIDNO9)或其變體，諸如例如MKWVSFISLLFLFSSAYS(SEQIDNO10)e)轉(zhuǎn)化酶信號序列(例如MLLQAFLFLLAGFAAKISA，SEQIDNO11)f)酵母交配因子α信號序列(例如MRFPSIFTAVLAFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKR，SEQIDNO12或MRFPSIFTAVLAFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLDKR，SEQIDNO12)g)乳酸克魯維酵母(K.Lactis)殺傷毒素前導(dǎo)序列h)雜合信號序列(例如MKWVSFISLLFLFSSAYSRSLEKR，SEQIDNO13)i)HSA/MFa-1雜合信號序列(也稱為HSA/kex2)(例如MKWVSFISLLFLFSSAYSRSLDKR，SEQIDNO14)j)乳酸克魯維酵母殺傷/MFα-1融合前導(dǎo)序列(例如MNIFYIFLFLLSFVQGSLDKR，SEQIDNO15)k)免疫球蛋白Ig信號序列(例如MGWSCIILFLVATATGVHS，SEQIDNO16)l)纖蛋白B前體信號序列(例如MERAAPSRRVPLPLLLLGGLALLAAGVDA，SEQIDNO17)m)簇蛋白前體信號序列(例如MMKTLLLFVGLLLTWESGQVLG，SEQIDNQ18)n)胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白4信號序列(例如MLPLCLVAALLLAAGPGPSLG，SEQIDNO19)o)HAS信號序列pre-pro區(qū)的變體，例如MKWVSFISLLFLFSSAYSRGVFRR(SEQIDNO20)，MKWVTFISLLFLFAGVLG(SEQIDNO21)，MKWVTFISLLFLFSGVLG(SEQIDNO22)，MKWVTFISLLFLFGGVLG(SEQIDNO23)，經(jīng)修飾HAS前導(dǎo)HSA#64-MKWVTFISLLFLFAGVSG(SEQIDNO24)；經(jīng)修飾HAS前導(dǎo)HSA#66-MKWVTFISLLFLFGGVSG(SEQIDNO25)；經(jīng)修飾HAS(A14)前導(dǎo)-MKWVTFISLLFLFAGVSG(SEQIDNO26)；經(jīng)修飾HAS(S14)前導(dǎo)(也稱作經(jīng)修飾HAS#65)-MKWVTFISLLFLFSGVSG(SEQIDNO27)，經(jīng)修飾HAS(G14)前導(dǎo)-MKWVTFISLLFLFGGVSG(SEQIDNO28)，或MKWVTFISLLFLFGGVLGDLHKS(SEQIDNO29)p)共有信號序列(MPTWAWWLFLVLLLALWAPARG，SEQIDNO30)q)酸性磷酸酶(PH05)前導(dǎo)(例如MFKSVVYSILAASLANA，SEQIDNO31)r)MFoz-1的pre序列s)0葡聚糖酶(BGL2)的pre序列t)殺傷毒素前導(dǎo)u)殺傷毒素的pre序列v)乳酸克魯維酵母殺傷毒素prepro(29個氨基酸；16個pre氨基酸和13個pro氨基酸)MNIFYIFLFLLSFVQGLEHTHRRGSLDKR(SEQIDNO32)w)糖化酵母(S.diastaticus)萄糖淀粉酶II分泌前導(dǎo)序列x)卡爾酵母(S.carlsbergensis)α-半乳糖苷酶(MEL1)分泌前導(dǎo)序列y)假絲酵母葡糖淀粉酶前導(dǎo)序列z)EP-A-387319中公開的雜合前導(dǎo)(引入本文作為參考)aa)gp67信號序列(與桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)聯(lián)合)(例如GenBank登記號AAA72759的氨基酸1-19)或bb)治療性蛋白質(zhì)X的天然前導(dǎo)；cc)釀酒酵母轉(zhuǎn)化酶(SUC2)前導(dǎo)，公開于JP62-096086(授權(quán)號911036516，引入本文作為參考)；或dd)復(fù)旋花粉酶-MKLAYSLLLPLAGVSASVINYKR(SEQIDNO33)ee)經(jīng)修飾TA57原肽前導(dǎo)變體#1-MKLKTVRSAVLSSLFASQVLGQPIDDTESQTTSVNLMADDTESAFATQTNSGGLDVVGLISMAKR(SEQIDNO34)ff)經(jīng)修飾TA57原肽前導(dǎo)變體#2-MKLKTVRSAVLSSLFASQVLGQPIDDTESQTTSVNLMADDTESAFATQTNSGGLDVVGLISMAEEGEPKR(SEQIDNO35)gg)共有信號肽-MWWRLWWLLLLLLLLWPMVWA(SEQIDNO111)jj)經(jīng)修飾HSA/kex2信號序列-MKWVSFISLLFLFSSAYSGSLDKR(SEQIDNO112)kk)共有信號肽#2-MRPTWAWWLFLVLLLALWAPARG(SEQIDNO105)在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，將經(jīng)修飾HAS/kex2信號序列(SEQIDNO112)融合到清蛋白融合蛋白的氨基末端，包括本文描述的包含清蛋白和治療性蛋白質(zhì)的融合蛋白，以及WO93/15199、WO97/24445、WO03/60071、WO03/59934、和PCT/US04/01369中公開的清蛋白融合蛋白，將每一篇完整引入本文作為參考。經(jīng)修飾HSA/kex2信號序列是以HSA/kex2信號序列(SEQIDNO14)為基礎(chǔ)的，它公開于例如Sleep等人，Biotechnology842-46，1990；和美國專利5,302,697，將這兩篇完整引入本文作為參考。本文中公開的經(jīng)修飾HSA/kex2前導(dǎo)序列在親本信號肽的第19位殘基處含有非保守氨基酸替代(Arg變成Gly)。發(fā)現(xiàn)在酵母中表達(dá)時，經(jīng)修飾HSA/kex2信號序列與未修飾HSA/kex2信號序列相比，使清蛋白融合蛋白產(chǎn)生預(yù)料不到的更好表達(dá)產(chǎn)率和/或更好切割效率。本發(fā)明還涵蓋經(jīng)修飾HSA/kex2信號肽的變體。具體而言，SEQIDNO112的第19位Gly殘基可用Pro殘基替代。還設(shè)想了經(jīng)修飾HSA/kex2信號序列的其它保守替代變體。本發(fā)明還涵蓋編碼SEQIDNO112的經(jīng)修飾HSA/kex2信號序列的核酸及其保守替代變體。利用谷氨酰胺合酶(GS)或DHFR作為選擇標(biāo)記的載體可分別在存在藥物硫代甲硫氨酸(methioninesulphoximine)或氨甲碟呤時擴(kuò)增?；诠劝滨０泛厦傅妮d體的優(yōu)點(diǎn)是谷氨酰胺合酶陰性的細(xì)胞系(例如鼠骨髓瘤細(xì)胞系，NSO)易于獲得。谷氨酰胺合酶表達(dá)系統(tǒng)還可通過提供阻止內(nèi)源基因發(fā)揮功能的額外抑制劑而在谷氨酰胺合酶表達(dá)細(xì)胞(例如中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞)中發(fā)揮功能。谷氨酰胺合酶表達(dá)系統(tǒng)及其組分詳見PCT公開WO87/04462；WO86/05807；WO89/01036；WO89/10404；和WO91/06657，將其完整引入本文作為參考。另外，谷氨酰胺合酶表達(dá)載體可從LonzaBiologics公司(Portsmouth，NH)購買。利用GS表達(dá)系統(tǒng)在鼠骨髓瘤細(xì)胞中表達(dá)和生成單克隆抗體見Bebbington等人，Bio/technology10169，1992；及Biblia和Robinson，Biotechnol.Prog.111，1995，將其引入本文作為參考。本發(fā)明還涉及含有本文描述的上述載體構(gòu)建體的宿主細(xì)胞，另外還涵蓋含有通過本領(lǐng)域已知的技術(shù)與一種或多種異源控制區(qū)(例如啟動子和/或增強(qiáng)子)可操作連接的本發(fā)明核苷酸序列的宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是高等真核細(xì)胞，諸如哺乳動物細(xì)胞(例如人衍生細(xì)胞)，或低等真核細(xì)胞，諸如酵母細(xì)胞，或者宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，諸如細(xì)菌細(xì)胞?？蛇x擇能夠調(diào)控所插入基因序列的表達(dá)，或者以期望的特定模式修飾和加工基因產(chǎn)物的宿主株。某些誘導(dǎo)物的存在可提高來自某些啟動子的表達(dá)；如此可控制基因工程多肽的表達(dá)。另外，不同的宿主細(xì)胞對蛋白質(zhì)的翻譯、翻譯后加工和修飾(例如磷酸化、切割)具有特點(diǎn)和特定機(jī)制。選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞系可保證所表達(dá)的外源蛋白質(zhì)受到期望的修飾和加工。將本發(fā)明的核酸和核酸構(gòu)建體導(dǎo)入宿主細(xì)胞可通過磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-右旋糖苷介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、陽離子脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)染、或其它方法來實(shí)現(xiàn)。這些方法描述于許多標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室手冊，諸如Davis等人，《BasicMethodsInMolecularBiology》，1986。具體設(shè)想了事實(shí)上可通過缺乏重組載體的宿主細(xì)胞來表達(dá)本發(fā)明的多肽。除了涵蓋含有本文所述載體構(gòu)建體的宿主細(xì)胞外，本發(fā)明還涵蓋經(jīng)改造刪除或替換了內(nèi)源遺傳物質(zhì)(例如可用與治療性蛋白質(zhì)對應(yīng)的清蛋白融合蛋白替換與治療性蛋白質(zhì)對應(yīng)的編碼序列)和/或引入了遺傳物質(zhì)(例如可引入異源多核苷酸序列，諸如例如與治療性蛋白質(zhì)對應(yīng)的本發(fā)明清蛋白融合蛋白)的脊椎動物起源，特別是哺乳動物起源的原代細(xì)胞、繼代細(xì)胞、和永生化細(xì)胞。與內(nèi)源多核苷酸可操作相連的遺傳物質(zhì)可激活、改變、和/或擴(kuò)增內(nèi)源多核苷酸。另外，可用本領(lǐng)域已知的技術(shù)通過同源重組使異源多核苷酸(例如編碼清蛋白蛋白質(zhì)或其片段或變體的多核苷酸)和/或異源控制區(qū)(例如啟動子和/或增強(qiáng)子)與編碼治療性蛋白質(zhì)的內(nèi)源多核苷酸可操作相連(參見例如1997年6月24日發(fā)布的美國專利號5,641,670；國際公布號WO96/29411；國際公布號WO94/12650；Koller等人，Proc.Natl.Acad.SciUSA868932-8935，1989；及Zijlstra等人，Nature，342435-438，1989，將每一篇的公開內(nèi)容完整引入本文作為參考)。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白可通過眾所周知的方法從重組細(xì)胞培養(yǎng)物回收和純化，包括硫酸銨或乙醇沉淀、酸提取、陰離子或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水相互作用層析、親和層析、羥磷灰石層析、疏水電荷相互作用層析、和凝集素層析。最優(yōu)選的是，采用高效液相層析(“HPLC”)進(jìn)行純化。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白用陰離子交換層析進(jìn)行純化，包括但不限于在Q-Sepharose、DEAESepharose、porosHQ、porosDEAE、ToyopearlQ、ToyopearlQAE、ToyopearlDEAE、Resource/SourceQ和DEAE、FractogelQ和DEAE柱上進(jìn)行層析。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白用陽離子交換層析進(jìn)行純化，包括但不限于SP-Sepharose、CMSepharose、porosHS、porosCM、ToyopearlSP、ToyopearlCM、Resource/SourceS和CM、FractogelS和CM柱及其等效物和可比物。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白用疏水相互作用層析進(jìn)行純化，包括但不限于苯基、丁基、甲基、辛基、己基-Sepharose，poros苯基、丁基、甲基、辛基、己基，Toyopearl苯基、丁基、甲基、辛基、己基，Resource/Source苯基、丁基、甲基、辛基、己基，F(xiàn)ractogel苯基、丁基、甲基、辛基、己基柱及其等效物和可比物。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白用大小排阻層析進(jìn)行純化，包括但不限于SepharoseS100、S200、S300、superdex樹脂柱及其等效物和可比物。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白用親和層析進(jìn)行純化，包括但不限于對HAS或“融合靶”分子有選擇性的類染料親和柱、肽親和柱和抗體親和柱。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白用上述一種或多種層析方法進(jìn)行純化。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白用下列一種或多種層析柱進(jìn)行純化QSepharoseFF柱、SPSepharoseFF柱、QSepharose高效柱、BlueSepharoseFF柱、Blue柱、苯基SepharoseFF柱、DEAESepharoseFF、或甲基柱。另外，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白可用PCT國際公開WO00/44772中描述的方法進(jìn)行純化，將其完整引入本文作為參考。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易的修改其中描述的方法以用于純化本發(fā)明的清蛋白融合蛋白。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白可從化學(xué)合成流程的產(chǎn)物和通過重組技術(shù)從原核或真核宿主生成的產(chǎn)物回收，所述宿主包括例如細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲、和哺乳動物細(xì)胞。根據(jù)重組生產(chǎn)流程中所采用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的或未糖基化的。另外，在有些情況中作為宿主介導(dǎo)的加工的結(jié)果，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白還可包括最初修飾的甲硫氨酸殘基。因此，本領(lǐng)域眾所周知，由翻譯起始密碼子編碼的N-末端甲硫氨酸通常在所有真核細(xì)胞中在翻譯后從任何蛋白質(zhì)高效消除。雖然多數(shù)蛋白質(zhì)的N-末端甲硫氨酸在多數(shù)原核細(xì)胞中也有效清除，但對于有些蛋白質(zhì)來說，此原核清除加工是無效的，這取決于與N-末端甲硫氨酸共價連接的氨基酸的性質(zhì)。在一個實(shí)施方案中，使用巴斯德畢赤酵母在真核系統(tǒng)中表達(dá)本發(fā)明的清蛋白融合蛋白。巴斯德畢赤酵母是能將甲醇作為唯一碳源進(jìn)行代謝的甲基營養(yǎng)酵母。甲醇代謝途徑中的主要步驟是利用O2把甲醇氧化成甲醛。此反應(yīng)由乙醇氧化酶催化。為了以甲醇作為唯一碳源進(jìn)行代謝，巴斯德畢赤酵母必須生成高水平的乙醇氧化酶，部分原因是乙醇氧化酶對O2的親和力相對較低。所以，在依賴甲醇作為主要碳源的生長培養(yǎng)基中，兩種乙醇氧化酶基因之一(AOX1)的啟動子區(qū)域高度有活性。在存在甲醇時，從AOX1基因產(chǎn)生的乙醇氧化酶占巴斯德畢赤酵母全部可溶性蛋白質(zhì)的約30％。參見Ellis，S.B.等人，Mol.Cell.Biol.51111-21，1985；Koutz，P.J.等人，Yeast5167-77，1989；Tschopp，J.F.等人，Nucl.AcidsRes.153859-76，1987。如此，異源編碼序列，諸如例如本發(fā)明的多核苷酸，在整個或部分AOX1調(diào)控序列的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)下，在存在甲醇時培養(yǎng)的畢赤酵母中以特別高的水平表達(dá)。在一個實(shí)施例中，本質(zhì)上如“PichiaProtocolsMethodsinMolecularBiology”，D.R.Higgins和J.Cregg編，TheHumanaPress，Totowa，NJ，1998中描述的方法，使用質(zhì)粒載體pPIC9K在畢赤酵母系統(tǒng)中表達(dá)本文所列編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的DNA。通過與位于多克隆位點(diǎn)上游的巴斯德畢赤酵母堿性磷酸酶(PHO)分泌信號肽(即前導(dǎo))連接的強(qiáng)AOX1啟動子，此表達(dá)質(zhì)粒容許表達(dá)和分泌本發(fā)明的多肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易的領(lǐng)會，可使用許多其它酵母載體來替換pPIC9K，諸如pYES2、pYD1、pTEF1/Zeo、pYES2/GS、pPICZ、pGAPZ、pGAPZalpha、pPIC9、pPIC3.5、pHIL-D2、pHIL-S1、pPIC3.5K、和PAO815，只要建議的表達(dá)構(gòu)建體提供適當(dāng)定位的轉(zhuǎn)錄、翻譯、分泌(如果需要的話)等信號，包括相同讀碼框內(nèi)的所需AUG。在另一個實(shí)施方案中，異源編碼序列，諸如例如編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸的高水平表達(dá)可通過將本發(fā)明的異源多核苷酸克隆到表達(dá)載體諸如例如pGAPZ或pGAPZalpha中并在不存在甲醇時培養(yǎng)酵母培養(yǎng)物而實(shí)現(xiàn)。另外，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白可利用本領(lǐng)域已知技術(shù)化學(xué)合成(例如參見Creighton，1983，ProteinsStructuresandMolecularPrinciples，W.H.Freeman&Co.，N.Y.；及Hunkapiller等人，Nature，310105-111，1984)。例如，相當(dāng)于多肽之片段的多肽可使用多肽合成儀來合成。另外，如果需要的話，非經(jīng)典氨基酸或化學(xué)氨基酸類似物可作為替代或添加而引入到多肽序列中。非經(jīng)典氨基酸包括但不限于普通氨基酸的D-異構(gòu)體、2，4-二氨基丁酸、α-氨基異丁酸、4-氨基丁酸、Abu、2-氨基丁酸、g-Abu、e-Ahx、6-氨基己酸、Aib、2-氨基異丁酸、3-氨基丙酸、鳥氨酸、正亮氨酸、正纈氨酸、羥脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、高瓜氨酸、磺基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、環(huán)己基丙氨酸、b-丙氨酸、氟代氨基酸、帶標(biāo)簽氨基酸諸如b-甲基氨基酸、Ca-甲基氨基酸、Na-甲基氨基酸、及一般的氨基酸類似物。另外，氨基酸可以是D型(右旋的)或L型(左旋的)。本發(fā)明涵蓋在翻譯中或翻譯后進(jìn)行不同修飾的本發(fā)明清蛋白融合蛋白，例如糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、由已知的保護(hù)/封閉基團(tuán)衍生、蛋白水解切割、與抗體分子或其它細(xì)胞配體的連接等?？赏ㄟ^已知技術(shù)進(jìn)行任何眾多化學(xué)修飾，包括但不限于溴化氰、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、V8蛋白酶、NaBH4的特異化學(xué)切割；乙?；?、甲?；⒀趸?、還原；在存在衣霉素時的代謝合成；等等。本發(fā)明所涵蓋的其它翻譯后修飾包括例如N-連接或O-連接的碳水化合物鏈、N-末端或C-末端的加工、在氨基酸主鏈上附著化學(xué)模塊、N-連接或O-連接的碳水化合物鏈的化學(xué)修飾、及添加或刪除由于原核宿主細(xì)胞表達(dá)而產(chǎn)生的N-末端甲硫氨酸殘基。清蛋白融合蛋白還可用可檢測標(biāo)記物進(jìn)行修飾，諸如酶、熒光素、同位素或親和標(biāo)記物，從而能夠檢測和分離蛋白質(zhì)。合適的酶的例子包括辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、或乙酰膽堿脂酶；合適的輔基復(fù)合物的例子包括鏈霉親合素/生物素和親合素/生物素；合適的熒光物質(zhì)的例子包括傘形酮、熒光素、異硫氰酸熒光素、羅丹明、二氯三嗪胺熒光素、丹磺酰氯、或藻紅蛋白；發(fā)光物質(zhì)的例子包括魯米諾；生物發(fā)光物質(zhì)的例子包括螢光素酶、熒光素、和水母發(fā)光蛋白；而合適的放射性物質(zhì)的例子包括碘(121I、123I、125I、131I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、銦(111In、112In、113In、115mIn)、锝(99Tc、99mTc)、鉈(201Ti)、鎵(68Ga、67Ga)、鈀(103Pd)、鉬(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、和97Ru。在具體的實(shí)施方案中，將本發(fā)明的清蛋白融合蛋白或其片段或其變體附著于與射電金屬離子締合的大環(huán)螯合劑，所述射電金屬離子包括但不限于177Lu、90Y、166Ho、和153Sm。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，與大環(huán)螯合劑締合的射電金屬離子是111In。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，與大環(huán)螯合劑締合的射電金屬離子是90Y。在具體的實(shí)施方案中，大環(huán)螯合劑是1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-N，N′，N″，N_-四乙酸(DOTA)。在其它具體的實(shí)施方案中，DOTA通過接頭分子附著于本發(fā)明的抗體或其片段?？捎糜趯OTA與多肽綴合的接頭分子的例子在本領(lǐng)域是普遍知道的，參見例如DeNardo等人，Clin.CancerRes.4(10)2483-90，1998；Peterson等人，Bioconjug.Chem.10(4)553-7，1999；及Zimmerman等人，Nucl.Med.Biol.26(8)943-50，1999；將其完整引入本文作為參考。如上所述，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白可通過天然過程進(jìn)行修飾，諸如翻譯后加工，或者通過本領(lǐng)域眾所周知的化學(xué)修飾技術(shù)進(jìn)行修飾。應(yīng)領(lǐng)會，在給定的多肽中，相同類型的修飾可在幾個位點(diǎn)處以相同或不同程度存在。本發(fā)明的多肽可以是分枝的，例如由于泛蛋白化作用導(dǎo)致的分枝，而且它們也可以是環(huán)狀的，有或沒有分枝。環(huán)狀的、分枝的、和分枝環(huán)狀的多肽可以是由翻譯后天然加工造成的，也可以是由合成方法造成的。修飾包括乙?；?、?；?、ADP-核糖基化、酰胺化、黃素的共價附著、血紅素模塊的共價附著、核苷酸或核苷酸衍生物的共價附著、脂質(zhì)或脂質(zhì)衍生物的共價附著、磷脂酰肌醇的共價附著、交聯(lián)、環(huán)化、二硫鍵形成、脫甲基化、共價交聯(lián)的形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲?；ⅵ?羧化、糖基化、GPI錨的形成、羥化、碘化、甲基化、肉豆蔻基化、氧化、PEG化、蛋白水解加工、磷酸化、異戊二烯化、外消旋、硒酰化、硫酸化、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA介導(dǎo)的向蛋白質(zhì)上添加氨基酸諸如精氨酰化、和泛蛋白化(參見例如PROTEINS-STRUCTUREANDMOLECULARPROPERTIES，第2版，T.E.Creighton，W.H.FreemanandCompany，NewYork，1993；POST-TRANSLATIONALCOVALENTMODIFICATIONOFPROTEINS，B.C.Johnson編，AcademicPress，NewYork，pg.1-12，1983；Seifter等人，Meth.Enzymol.182626-646，1990；Rattan等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.66348-62，1992)可將結(jié)合治療性蛋白質(zhì)或其片段或變體的本發(fā)明清蛋白融合蛋白和抗體與標(biāo)志物序列融合，諸如便于純化的肽。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，標(biāo)志物氨基酸序列是六組氨酸肽，諸如在pQE載體中提供的標(biāo)簽(QIAGEN公司，9259EtonAvenue，Chatsworth，CA，91311)等，它們中的許多可通過商業(yè)途徑獲得。例如，如Gentz等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86821-824，1989中所述，六組氨酸為融合蛋白的純化提供便利?？捎糜诩兓钠渌臉?biāo)簽包括但不限于“HA”標(biāo)簽，它對應(yīng)于衍生自流感血凝素蛋白質(zhì)的表位(Wilson等人，Cell37767，1984)，還有“flag”標(biāo)簽。另外，可將本發(fā)明的清蛋白融合蛋白與治療性模塊綴合，諸如細(xì)胞毒素，例如抑制細(xì)胞劑或殺細(xì)胞劑，治療劑或放射性金屬離子，例如α-發(fā)射體，諸如例如213Bi。細(xì)胞毒素或胞毒劑包括對細(xì)胞有害的任何試劑。例子包括紫杉醇、松胞菌素B、短桿菌肽D、溴化乙錠、吐根堿、絲裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、長春新堿、長春花堿、秋水仙堿、阿霉素、柔紅霉素、二羥基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光輝霉素、放線菌素D、1-去氫睪酮、糖皮質(zhì)激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾、和嘌呤霉素及其類似物或同系物。治療劑包括但不限于抗代謝物(例如氨甲喋呤、6-巰基嘌呤、6-硫代鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶氨烯咪胺)、烷化劑(例如二氯甲基二乙胺(氮芥)、塞替派、苯丁酸氮芥、美法侖、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、環(huán)磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、鏈脲菌素、絲裂霉素C和順二氯二氨絡(luò)鉑(II)(DDP)順鉑)、蒽環(huán)類(例如柔紅霉素(以前稱為道諾霉素)和阿霉素)、抗生素(例如更生霉素(以前稱為放線菌素)，博來霉素、光輝霉素和氨茴霉素(AMC))和抗有絲分裂劑(例如長春新堿和長春花堿)。本發(fā)明的綴合物可用于修飾給定的生物學(xué)應(yīng)答，并不認(rèn)為治療劑或藥物模塊限于經(jīng)典的化學(xué)治療劑。例如，藥物模塊可以是具有期望生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)或多肽。這種蛋白質(zhì)可包括例如毒素，諸如相思豆毒素、篦麻毒素A、假單胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白質(zhì)，諸如腫瘤壞死因子、α-干擾素、β-干擾素、神經(jīng)生長因子、血小板衍生生長因子、組織纖溶酶原激活物、凋亡劑例如TNF-α、TNF-β、AIMI(參見國際公布號WO97/33899)、AIMII(參見國際公布號WO97/34911)、Fas配體(Takahashi等人，Int.Immunol.61567-1574，1994)、VEGI(參見國際公布號WO99/23105)、血栓形成劑或抗血管發(fā)生劑，例如血管他丁或內(nèi)皮他??；或生物學(xué)應(yīng)答修飾劑，諸如例如淋巴因子、白介素-1(“IL-1”)、白介素-2(“IL-2”)、白介素-6(“IL-6”)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒細(xì)胞集落刺激因子(“G-CSF”)或其它生長因子。用于將這些治療性模塊綴合到蛋白質(zhì)(例如清蛋白融合蛋白)上的技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的。還可以將清蛋白融合蛋白附著于固相支持物，這對本發(fā)明清蛋白融合蛋白所結(jié)合的、與其結(jié)合的、或與之締合的多肽的免疫測定法或純化是特別有用的。這種固相支持物包括但不限于玻璃、纖維素、聚丙烯酰胺、尼龍、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。清蛋白融合蛋白，有或沒有與治療性模塊綴合，可單獨(dú)施用或與可用作治療劑的細(xì)胞毒性因子和/或細(xì)胞因子聯(lián)合施用。在本發(fā)明的清蛋白融合蛋白只包含結(jié)合治療性蛋白質(zhì)的抗體的VH結(jié)構(gòu)域的實(shí)施方案中，可能必須和/或希望共表達(dá)結(jié)合治療性蛋白質(zhì)的相同抗體的VL結(jié)構(gòu)域的融合蛋白，使得所述VH-清蛋白融合蛋白和VL蛋白質(zhì)在翻譯后(共價或非共價)結(jié)合。在本發(fā)明的清蛋白融合蛋白只包含結(jié)合治療性蛋白質(zhì)的抗體的VL結(jié)構(gòu)域的實(shí)施方案中，可能必須和/或希望共表達(dá)結(jié)合治療性蛋白質(zhì)的相同抗體的VH結(jié)構(gòu)域的融合蛋白，使得所述VL-清蛋白融合蛋白和VH蛋白質(zhì)在翻譯后(共價或非共價)結(jié)合。有些治療性抗體是雙特異性抗體，這意味著結(jié)合治療性蛋白質(zhì)的抗體是人工雜合抗體，它具有兩對不同的重鏈/輕鏈和兩個不同的結(jié)合位點(diǎn)。為了產(chǎn)生與該治療性蛋白質(zhì)對應(yīng)的清蛋白融合蛋白，有可能創(chuàng)建這樣的清蛋白融合蛋白，即它在清蛋白蛋白質(zhì)模塊的N-和C-兩個末端都融合有scFv片段。更具體的說，融合于清蛋白N末端的scFv將對應(yīng)于結(jié)合治療性蛋白質(zhì)的原始抗體的一對重鏈/輕鏈(VH/VL)，而融合于清蛋白C末端的scFv將對應(yīng)于結(jié)合治療性蛋白質(zhì)的原始抗體的另一對重鏈/輕鏈(VH/VL)。本發(fā)明還提供了本發(fā)明清蛋白融合蛋白的化學(xué)修飾衍生物，它可提供額外的優(yōu)點(diǎn)，諸如多肽的可溶性、穩(wěn)定性和循環(huán)時間增加或免疫原性降低(參見美國專利號4,179,337)。用于衍生物的化學(xué)模塊可選自水溶性聚合物，諸如聚乙二醇、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、右旋糖苷、聚乙烯醇等。清蛋白融合蛋白可在分子內(nèi)的隨機(jī)位置或在分子內(nèi)的預(yù)定位置進(jìn)行修飾，且可包含一個、兩個、三個或更多附著的化學(xué)模塊。聚合物可以是任何分子量的，且可以是分枝的或不分枝的。對于聚乙二醇，為了易于操作和制造，優(yōu)選的分子量在約1kDa和約100kDa之間(術(shù)語“約”指的是在聚乙二醇制品中，一些分子可能比規(guī)定的分子量大或小)。也可采用其它分子量，這取決于期望的治療特性(例如期望的緩釋時間、如果有的話對生物學(xué)活性的影響、操作的容易程度、抗原性的程度或缺乏、及聚乙二醇對治療性蛋白質(zhì)或類似物的其它已知效果)。例如，聚乙二醇的平均分子量可以是約200、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10,000、10,500、11,000、11,500、12,000、12,500、13,000、13,500、14,000、14,500、15,000、15,500、16,000、16,500、17,000、17,500、18,000、18,500、19,000、19,500、20,000、25,000、30,000、35,000、40,000、45,000、50,000、55,000、60,000、65,000、70,000、75,000、80,000、85,000、90,000、95,000或100,000kDa。如上所述，聚乙二醇可具有分枝結(jié)構(gòu)。分枝的聚乙二醇描述于例如美國專利號5,643,575；Morpurgo等人，Appl.Biochem.Biotechnol.5659-72，1996；Vorobjev等人，NucleosidesNucleotides182745-2750，1999；及Caliceti等人，Bioeonjug.Chem.10638-646，1999，將每一篇的公開內(nèi)容引入本文作為參考。在將聚乙二醇分子(或其它化學(xué)模塊)附著于蛋白質(zhì)時應(yīng)考慮對蛋白質(zhì)功能性或抗原性區(qū)域的影響。本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用多種附著方法，諸如例如EP0401384中公開的方法(將PEG偶聯(lián)到G-CSF上)，引入本文作為參考；也可參見Malik等人，Exp.Hematol.201028-1035，1992，其中報道了用三氟乙烷磺酸(tresyl)氯化物將GM-GSF進(jìn)行PEG化。例如，聚乙二醇可經(jīng)由氨基酸殘基通過反應(yīng)基諸如游離氨基或羧基共價附著。反應(yīng)基是可結(jié)合活化聚乙二醇分子的基團(tuán)。具有游離氨基的氨基酸殘基可包括賴氨酸殘基和N末端氨基酸殘基；具有游離羧基的氨基酸可包括天冬氨酸殘基、谷氨酸殘基和C末端氨基酸殘基。巰基也可用作用于附著聚乙二醇分子的反應(yīng)基。為了治療目的而優(yōu)選的是附著于氨基，諸如附著于N末端或賴氨酸基團(tuán)上。如上所述，聚乙二醇可通過與任何多種氨基酸殘基的連接而附著在蛋白質(zhì)上。例如，聚乙二醇可通過與賴氨酸、組氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或半胱氨酸殘基的共價鍵而與蛋白質(zhì)連接?？刹捎靡环N或多種反應(yīng)化學(xué)將聚乙二醇附著于蛋白質(zhì)的特定氨基酸殘基(例如賴氨酸、組氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或半胱氨酸)或蛋白質(zhì)的超過一種類型的氨基酸殘基(例如賴氨酸、組氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸及其組合)?？赡芴貏e希望在N末端化學(xué)修飾蛋白質(zhì)。以聚乙二醇作為組合物的例子，可在多種聚乙二醇分子(根據(jù)分子量、分枝情況、等)、反應(yīng)混合物中聚乙二醇分子和蛋白質(zhì)(多肽)分子之間的比例、待進(jìn)行PEG化反應(yīng)的類型、及獲得選定N末端PEG化蛋白質(zhì)的方法中進(jìn)行選擇。獲得選定N末端PEG化制品的方法(即在必要時將此模塊與其它單PEG化模塊分離)可以是通過從PEG化蛋白質(zhì)分子群體中純化N末端PEG化物質(zhì)。在N末端選擇性化學(xué)修飾蛋白質(zhì)可通過還原性烷化來實(shí)現(xiàn)，還原性烷化利用特定蛋白質(zhì)可用于衍生的不同類型伯氨基(賴氨酸對N末端)的差異反應(yīng)性。在適當(dāng)反應(yīng)條件下，用含羧基聚合物在N端實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的基本上選擇性衍生。如上所述，本發(fā)明清蛋白融合蛋白的PEG化可通過多種方法來實(shí)現(xiàn)。例如，可將聚乙二醇直接或通過中間接頭附著于清蛋白融合蛋白。用于將聚乙二醇附著于蛋白質(zhì)的無接頭系統(tǒng)描述于Delgado等人，Crit.Rev.Thera.DrugCarrierSys.9249-304，1992；Francis等人，Intern.J.ofHematol.681-18，1998；美國專利號4,002,531；美國專利號5,349,052；WO95/06058；及WO98/32466，將每一篇的公開內(nèi)容引入本文作為參考。用于將聚乙二醇直接附著于蛋白質(zhì)的氨基酸殘基而沒有中間接頭的一種系統(tǒng)采用三氟乙烷磺酸化MPEG，它是用三氟乙烷磺酸的氯化物(ClSO2CH2CF3)對單甲氧聚乙二醇(MPEG)進(jìn)行修飾而生成的。在蛋白質(zhì)與三氟乙烷磺酸化MPEG反應(yīng)后，將聚乙二醇直接附著于蛋白質(zhì)的氨基。如此，本發(fā)明包括通過使本發(fā)明的蛋白質(zhì)與具有2，2，2-三氟乙烷磺酸基的聚乙二醇分子發(fā)生反應(yīng)而生成的蛋白質(zhì)-聚乙二醇綴合物。還可用多種不同中間接頭將聚乙二醇附著于蛋白質(zhì)。例如，美國專利號5,612,460公開了用于將聚乙二醇連接到蛋白質(zhì)上的尿烷接頭，將其完整公開書引入本文作為參考。其中聚乙二醇通過接頭附著于蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)-聚乙二醇綴合物還可通過使蛋白質(zhì)與下列化合物發(fā)生反應(yīng)來生成，諸如MPEG-琥珀酰亞胺基琥珀酸鹽/酯、用1，1′-羰基二咪唑活化的MPEG、MPEG-2，4，5-三氯戊基碳酸鹽/酯、MPEG-對硝基苯酚碳酸鹽/酯、及各種MPEG-琥珀酸鹽/酯衍生物。國際公開號WO98/32466中描述了用于將聚乙二醇附著于蛋白質(zhì)的許多其它聚乙二醇衍生物和反應(yīng)化學(xué)，將其完整公開書引入本文作為參考。利用本文記載的反應(yīng)化學(xué)生成的PEG化蛋白質(zhì)產(chǎn)物包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。每個本發(fā)明清蛋白融合蛋白上附著的聚乙二醇模塊的數(shù)目(即取代程度)也可以有所變化。例如，本發(fā)明的PEG化蛋白質(zhì)可以連接有平均1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、17、20或更多聚乙二醇分子。類似的，平均取代程度的范圍是每個蛋白質(zhì)分子連接有1-3、2-4、3-5、4-6、5-7、6-8、7-9、8-10、9-11、10-12、11-13、12-14、13-15、14-16、15-17、16-18、17-19或18-20個聚乙二醇模塊。用于測定取代程度的方法在文獻(xiàn)中有討論，例如參見Delgado等人，Crit.Rev.Thera.DrugCarrierSys.9249-304，1992。本發(fā)明的多肽可通過標(biāo)準(zhǔn)方法從化學(xué)合成和重組細(xì)胞培養(yǎng)物回收和純化，包括但不限于硫酸銨或乙醇沉淀、酸提取、陰離子或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水相互作用層析、親和層析、羥磷灰石層析、和凝集素層析。最優(yōu)選的是，采用高效液相層析(“HPLC”)進(jìn)行純化。當(dāng)多肽在分離和/或純化過程中變性時，可采用眾所周知的使蛋白質(zhì)重折疊的技術(shù)來恢復(fù)活性構(gòu)象。本發(fā)明清蛋白融合蛋白的存在和數(shù)量可用本領(lǐng)域眾所周知的免疫測定法即ELISA測定。在可用于檢測/定量本發(fā)明清蛋白融合蛋白的一種ELISA方案中，包括以下步驟用抗人血清清蛋白抗體包被ELISA板，將板封閉以阻止非特異性結(jié)合，清洗ELISA板，(以一種或多種不同濃度)加入含有本發(fā)明清蛋白融合蛋白的溶液，加入綴合有可檢測標(biāo)記物(如本文所述或本領(lǐng)域其它途徑知道的)的抗治療性蛋白質(zhì)的特異性二抗，并檢測二抗的存在。在此方案的可選形式中，ELISA板可用抗治療性蛋白質(zhì)的特異性抗體包被且經(jīng)標(biāo)記二抗可以是抗人清蛋白特異性抗體。多核苷酸的用途本發(fā)明鑒定的每一種多核苷酸都可以多種方式用作試劑。下面的說明應(yīng)認(rèn)為是示范性的且利用了已知技術(shù)。本發(fā)明的多核苷酸可用于生成本發(fā)明的清蛋白融合蛋白。正如下文更詳細(xì)的說明，(編碼清蛋白融合蛋白的)本發(fā)明的多核苷酸可在重組DNA方法中用于通過基因工程產(chǎn)生表達(dá)由編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸所編碼的清蛋白融合蛋白的細(xì)胞、細(xì)胞系或組織。本發(fā)明的多核苷酸還可用于基因療法?；虔煼ǖ囊粋€目的是向具有缺陷基因的生物體中插入正?；?，以校正遺傳缺陷。本發(fā)明公開的多核苷酸提供了以高度精確的方式靶向這些遺傳缺陷的方法。另一個目的是插入宿主基因組中不存在的新基因，從而使宿主細(xì)胞產(chǎn)生新特征。本文其它地方更詳盡的描述了本發(fā)明所涵蓋的基因療法的其它非限制性例子(參見例如標(biāo)題為“基因療法”的部分，以及實(shí)施例61和62)。多肽的用途本發(fā)明鑒定的每一種多肽都可以多種方式應(yīng)用。下面的說明應(yīng)認(rèn)為是示范性的且利用了已知技術(shù)。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白可用于提供免疫學(xué)探針，用于差示鑒別組織(利如免疫組織化學(xué)測定法，諸如例如ABC免疫過氧化物酶(Hsu等人，J.Histochem.Cytochem.29577-580，1981)或細(xì)胞類型(例如免疫細(xì)胞化學(xué)測定法)。清蛋白融合蛋白可用于使用本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的經(jīng)典免疫組織學(xué)方法測定生物學(xué)樣品中的多肽水平(例如參見Jalkanen等人，J.Cell.Biol.101976-985，1985；Jalkanen等人，J.Cell.Biol.1053087-3096，1987)?？捎糜跈z測蛋白質(zhì)基因表達(dá)的其它方法包括免疫測定法，諸如酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)和放射免疫測定法(RIA)。合適的測定標(biāo)記物是本領(lǐng)域所知道的，包括酶標(biāo)記物，諸如葡萄糖氧化酶；放射性同位素，諸如碘(131I、125I、123I、121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、銦(115mIn、113In、112In、111In)、锝(99Tc、99mTc)、鉈(201Ti)、鎵(68Ga、67Ga)、鈀(103Pd)、鉬(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、和97Ru；發(fā)光標(biāo)記物，諸如魯米諾；熒光標(biāo)記物，諸如熒光素和羅丹明；以及生物素。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白還可通過成像在體內(nèi)檢測。用于蛋白質(zhì)體內(nèi)成像的標(biāo)記物或標(biāo)志物包括可通過X-射線照相術(shù)、核磁共振(NMR)或電子自旋共振(electronspinrelaxtion，ESR)檢測的物質(zhì)。對于X-射線照相術(shù)，合適的標(biāo)記物包括放射性同位素，諸如鋇或銫，它們發(fā)出可檢測的輻射但對受試者沒有明顯的傷害。NMR和ESR的合適標(biāo)志物包括具有可檢測的特征性自旋的物質(zhì)，諸如氘，它可通過標(biāo)記對提供給表達(dá)本發(fā)明清蛋白融合蛋白的細(xì)胞系的營養(yǎng)物而摻入清蛋白融合蛋白。將經(jīng)適當(dāng)可檢測成像模塊，諸如放射性同位素(例如131I、112In、99mTc、碘(131I、125I、123I、121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、銦(115mIn、113mIn、112In、111In)、锝(99Tc、99mTc)、鉈(201Ti)、鎵(68Ga、67Ga)、鈀(103Pd)、鉬(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru)、射線不通透物質(zhì)、或可通過核磁共振檢測的物質(zhì)標(biāo)記的清蛋白融合蛋白導(dǎo)入(例如腸胃外、皮下、或腹膜內(nèi))有待檢查免疫系統(tǒng)紊亂的哺乳動物。本領(lǐng)域?qū)⒗斫?，受試者的大小和所用的成像系統(tǒng)將決定產(chǎn)生診斷影像所需的成影模塊的量。在放射性同位素模塊的例子中，對于人類受試者，注射放射性的量通常在約5至20毫居里99mTc的范圍內(nèi)。然后將標(biāo)記清蛋白融合蛋白將優(yōu)先在體內(nèi)存在一種或多種報道分子、配體或底物(與用于生成本發(fā)明清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)的報道分子、配體或底物對應(yīng))的部位(例如器官、細(xì)胞、細(xì)胞外空間或基質(zhì))積累。或者，在清蛋白融合蛋白至少包含治療性抗體的片段或變體的情況中，經(jīng)標(biāo)記清蛋白融合蛋白將優(yōu)先在身體中存在與(用于生成本發(fā)明清蛋白融合蛋白的)治療性抗體所結(jié)合的多肽/表位對應(yīng)的多肽/表位的部位(例如器官、細(xì)胞、細(xì)胞外空間或基質(zhì))積累。體內(nèi)腫瘤成像的描述可參見S.W.Burchiel等人，“ImmunopharmacokineticsofRadiolabeledAntibodiesandTheirFragments”，第13章，《TumorImagingTheRadiochemicalDetectionofCancer》，S.W.Burchiel和B.A.Thodes編，MassonPublishingInc.，1982。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易的修改其中描述的方案以用于本發(fā)明的清蛋白融合蛋白。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通過施用與異源多肽或核酸分子締合的本發(fā)明清蛋白融合蛋白(例如由編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白和/或抗體的多核苷酸所編碼的多肽)而將本發(fā)明的清蛋白融合蛋白特異投遞至細(xì)胞的方法。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明提供了將治療性蛋白質(zhì)投遞到靶細(xì)胞中的方法。在另一個實(shí)施例中，本發(fā)明提供了將單鏈核酸(例如反義或核酶)或雙鏈核酸(例如可整合到細(xì)胞基因組中或作為游離體復(fù)制并能轉(zhuǎn)錄的DNA)投遞到靶細(xì)胞中的方法。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通過施用與毒素或細(xì)胞毒性藥物前體締合的本發(fā)明清蛋白融合蛋白而特異性破壞細(xì)胞(例如破壞腫瘤細(xì)胞)的方法?！岸舅亍敝附Y(jié)合并活化內(nèi)源細(xì)胞毒效應(yīng)系統(tǒng)的一種或多種化合物、放射性同位素、全毒素、改良毒素、毒素的催化亞基、或細(xì)胞中或表面上通常不存在的、在特定條件下引起細(xì)胞死亡的任何分子或酶?？梢勒毡景l(fā)明的方法使用的毒素包括但不限于本領(lǐng)域已知的放射性同位素、化合物諸如例如結(jié)合固有的或誘導(dǎo)的內(nèi)源細(xì)胞毒效應(yīng)系統(tǒng)的抗體(或其含補(bǔ)體固定部分)、胸苷激酶、內(nèi)切核酸酶、α-毒素、蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、假單胞菌外毒素A、白喉毒素、肥皂草毒蛋白、苦瓜毒蛋白、多花白樹毒蛋白、美洲商陸抗病毒蛋白、α-帚曲霉素和霍亂毒素?！岸舅亍边€包括抑制細(xì)胞劑或殺細(xì)胞劑、治療劑或放射性金屬離子，例如α-發(fā)射體，諸如例如213Bi，或其它放射性同位素，諸如例如103Pd、133Xe、131I、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、35S、90Y、153Sm、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、113Sn、90釔、117錫、186錸、166鈥、和188錸；發(fā)光標(biāo)記物，諸如魯米諾；熒光標(biāo)記物，諸如熒光素和羅丹明；以及生物素。在一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通過施用與放射性同位素90Y締合的本發(fā)明多肽或抗體而特異性破壞細(xì)胞(例如破壞腫瘤細(xì)胞)的方法。在另一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通過施用與放射性同位素111In締合的本發(fā)明多肽或抗體而特異性破壞細(xì)胞(例如破壞腫瘤細(xì)胞)的方法。在另一個具體的的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通過施用與放射性同位素131I締合的本發(fā)明多肽或抗體而特異性破壞細(xì)胞(例如破壞腫瘤細(xì)胞)的方法?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的技術(shù)來標(biāo)記本發(fā)明的多肽。這些技術(shù)包括但不限于雙功能綴合劑的應(yīng)用(參見例如美國專利號5,756,065；5,714,631；5,696,239；5,652,361；5,505,931；5,489,425；5,435,990；5,428,139；5,342,604；5,274,119；4,994,560；和5,808,003；將每一篇的內(nèi)容完整引入本文作為參考)。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白可用于診斷、治療、預(yù)防和/或預(yù)測哺乳動物優(yōu)選人的各種紊亂。這樣的紊亂包括但不限于本文中下文標(biāo)題為“生物學(xué)活性”部分所記載的。如此，本發(fā)明提供了診斷紊亂的方法，包括(a)用本發(fā)明的清蛋白融合蛋白測定個體的細(xì)胞或體液中某種多肽的表達(dá)水平；并(b)將測得的多肽表達(dá)水平與標(biāo)準(zhǔn)多肽表達(dá)水平相比較，測得的多肽表達(dá)水平相對于標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)水平的升高或降低作為紊亂的指標(biāo)。對于癌癥而言，個體活檢組織中出現(xiàn)相對大量的轉(zhuǎn)錄物可能指示疾病發(fā)展的傾向，或者可提供在實(shí)際臨床癥狀出現(xiàn)前檢測疾病的方法。這種類型的更確切診斷可以使醫(yī)務(wù)人員更早采用預(yù)防措施或攻擊治療以阻止癌癥的發(fā)展或進(jìn)一步加重。另外，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白可用于治療或預(yù)防下列疾病或狀況，諸如例如神經(jīng)紊亂、免疫系統(tǒng)紊亂、肌肉紊亂、生殖紊亂、胃腸紊亂、肺紊亂、心血管紊亂、腎紊亂、增殖性紊亂、和/或癌性疾病和狀況。例如，可給患者施用本發(fā)明的多肽，以替代缺失或水平下降的多肽(例如胰島素)、補(bǔ)充缺失或水平較低的不同多肽(例如血紅蛋白S以補(bǔ)充血紅蛋白B、SOD、過氧化氫酶、DNA修復(fù)蛋白)、抑制多肽的活性(例如癌基因或腫瘤抑制基因)、活化多肽的活性(例如結(jié)合到受體上)、通過與膜結(jié)合受體競爭游離配體來降低膜結(jié)合受體的活性(例如在降低炎癥時使用可溶性TNF受體)、或引起期望應(yīng)答(例如抑制血管生長、增強(qiáng)對增殖細(xì)胞或組織的免疫應(yīng)答)。具體而言，至少包含治療性抗體的片段或變體的清蛋白融合蛋白可用于治療疾病(正如上文和本文其它地方所述)。例如，施用至少包含治療性抗體的片段或變體的清蛋白融合蛋白可結(jié)合和/或中和用于生成清蛋白融合蛋白的治療性抗體所特異結(jié)合的多肽，和/或減少用于生成清蛋白融合蛋白的治療性抗體所特異結(jié)合的多肽的過量產(chǎn)生。類似的，施用至少包含治療性抗體的片段或變體的清蛋白融合蛋白可活化用于生成清蛋白融合蛋白的治療性抗體所特異結(jié)合的多肽，其通過結(jié)合膜(受體)上結(jié)合的多肽而實(shí)現(xiàn)。至少，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白可在SDS-PAGE凝膠上或分子篩凝膠過濾柱中用作分子量標(biāo)志物。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白還可用于產(chǎn)生抗體，抗體繼而可用于測量來自重組細(xì)胞的治療性蛋白質(zhì)、清蛋白蛋白質(zhì)、和/或本發(fā)明清蛋白融合蛋白的蛋白質(zhì)表達(dá)，作為評估宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化或生物學(xué)樣品的方法。另外，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白可用于測試本文描述的生物學(xué)活性。診斷性測定法本發(fā)明的化合物可用于診斷、治療、預(yù)防和/或預(yù)測哺乳動物特別是人的各種紊亂。這樣的紊亂包括但不限于表1對應(yīng)行中及本文中標(biāo)題為“免疫活性”、“血液相關(guān)紊亂”、“過度增殖性紊亂”、“腎紊亂”、“心血管紊亂”、“呼吸紊亂”、“抗血管發(fā)生活性”、“細(xì)胞水平疾病”、“傷口愈合和上皮細(xì)胞增殖”、“神經(jīng)活性和神經(jīng)學(xué)疾病”、“內(nèi)分泌紊亂”、“生殖系統(tǒng)紊亂”、“傳染病”、“再生”、和/或“胃腸紊亂”的部分中為每種治療性蛋白質(zhì)所記載的紊亂。對于許多紊亂來說，可在取自患有這樣一種紊亂的個體的組織、細(xì)胞或體液(例如血清、血漿、尿液、精液、滑液或脊髓液)中檢測到基因表達(dá)水平相對于“標(biāo)準(zhǔn)”基因表達(dá)水平即取自沒有該紊亂的個體的組織或體液中的表達(dá)水平的實(shí)質(zhì)性改變(上升或下降)。因此，本發(fā)明提供了在紊亂的診斷過程中有用的診斷方法，包括測量取自個體的組織、細(xì)胞或體液中編碼多肽的基因的表達(dá)水平，并將測得的基因表達(dá)水平與標(biāo)準(zhǔn)基因表達(dá)水平比較，基因表達(dá)水平相對于標(biāo)準(zhǔn)的上升或降低為紊亂的指示。這些診斷性測定法可在體內(nèi)或在體外進(jìn)行，諸如例如在血樣、活檢組織或尸檢組織上進(jìn)行。本發(fā)明還可用作預(yù)測指示，由此顯示出基因表達(dá)增強(qiáng)或降低的患者將遭受糟糕的臨床結(jié)果。“測定編碼多肽的基因的表達(dá)水平”意圖定性或定量測量或估計(jì)第一生物學(xué)樣品中本發(fā)明特定多肽(例如與表1中所公開的治療性蛋白質(zhì)對應(yīng)的多肽)的水平或編碼多肽的mRNA的水平，或是直接的(例如通過測定或估計(jì)蛋白質(zhì)或mRNA的絕對水平)或是相對的(例如通過與第二生物學(xué)樣品中多肽或mRNA水平相比較)。優(yōu)選的是，測量或估計(jì)第一生物學(xué)樣品中的多肽表達(dá)水平或mRNA水平，并與標(biāo)準(zhǔn)的多肽水平或mRNA水平進(jìn)行對比，標(biāo)準(zhǔn)來自沒有該紊亂的個體的第二生物學(xué)樣品，或者由沒有該紊亂的個體人群的平均水平?jīng)Q定。本領(lǐng)域技術(shù)人員將領(lǐng)會，一旦知道了標(biāo)準(zhǔn)多肽水平或mRNA水平，它可以重復(fù)用作比較的標(biāo)準(zhǔn)?！吧飳W(xué)樣品”意指取自個體、細(xì)胞系、組織培養(yǎng)物、或含有本發(fā)明多肽(包括其部分)或mRNA的其它來源的任何生物學(xué)樣品。正如上文所指出的，生物學(xué)樣品包括體液(諸如血清、血漿、尿液、精液、滑液和脊髓液)和發(fā)現(xiàn)表達(dá)多肽或mRNA的全長或其片段的組織來源。從哺乳動物取得活檢組織和體液的方法在本領(lǐng)域是眾所周知的。在生物學(xué)樣品包括mRNA時，活檢組織是優(yōu)選的來源?？梢杂萌魏芜m當(dāng)?shù)募夹g(shù)從生物學(xué)樣品分離總細(xì)胞RNA，諸如Chomczynski和Sacchi，Anal.Biochem.162156-159，1987中記載的一步硫氰酸胍-苯酚-氯仿法。然后可采用任何適當(dāng)?shù)姆椒y定編碼本發(fā)明多肽的mRNA的水平。這些包括Northern印跡分析、S1核酸酶作圖、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、逆轉(zhuǎn)錄聯(lián)合聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)、和逆轉(zhuǎn)錄聯(lián)合連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-LCR)。本發(fā)明還涉及用于檢測生物學(xué)樣品(例如細(xì)胞和組織)中與本發(fā)明清蛋白融合蛋白結(jié)合的、或由其結(jié)合的、或與其締合的多肽的水平的診斷性方法法，諸如定量的和診斷性的測定法，包括測定多肽的正常和異常水平。如此，例如，依照本發(fā)明的用于檢測與清蛋白融合蛋白結(jié)合的、或由其結(jié)合的、或與其締合的多肽相對于正常對照組織樣品的異常水平的診斷性測定法可用于檢測腫瘤的存在?？捎糜跍y定衍生自宿主的樣品中與本發(fā)明清蛋白融合蛋白結(jié)合的、或由其結(jié)合的、或與其締合的多肽的水平的測定技術(shù)對本領(lǐng)域技術(shù)人員是熟知的。這樣的測定方法包括放射免疫測定法、競爭性結(jié)合測定法、Western印跡分析和ELISA測定法?？捎帽绢I(lǐng)域已知的任何方法來測定生物學(xué)樣品中的多肽水平?？梢杂枚喾N技術(shù)來測定生物學(xué)樣品中的多肽水平。例如，可以用經(jīng)典的免疫組織學(xué)方法(Jalkanen等人，J.Cell.Biol.101976-985，1985；Jalkanen，M.等人，J.Cell.Biol.1053087-3096，1987)來研究組織中的多肽表達(dá)?？捎糜跈z測多肽基因表達(dá)的其它方法包括免疫測定法，諸如酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)和放射免疫測定法(RIA)。合適的抗體測定標(biāo)記物是本領(lǐng)域所知道的，包括酶標(biāo)記物，諸如葡萄糖氧化酶，和放射性同位素，諸如碘(125I、121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、銦(112In)和锝(99mTc)，和熒光標(biāo)記物，諸如熒光素和羅丹明，及生物素。待分析的組織或細(xì)胞類型通常包括那些已知或懷疑表達(dá)目的基因的那些(諸如例如癌)。本發(fā)明中采用的蛋白質(zhì)分離方法可以是例如諸如Harlow和Lane(Harlow，E.和Lane，D.，1988，“AntibodiesALaboratoryManual”，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NewYork)中所記載的，將其完整引入本文作為參考。分離的細(xì)胞可衍生自細(xì)胞培養(yǎng)物或來自患者。對來自培養(yǎng)物的細(xì)胞進(jìn)行分析可能是對可用作基于細(xì)胞的基因治療技術(shù)的一部分的細(xì)胞進(jìn)行評估或者測試化合物對基因表達(dá)的影響的必要步驟。例如，清蛋白融合蛋白可用于定量或定性檢測與本發(fā)明清蛋白融合蛋白結(jié)合的、或由其結(jié)合的、或與其締合的多肽的存在。這可通過例如免疫熒光技術(shù)來實(shí)現(xiàn)，它使用熒光標(biāo)記的清蛋白融合蛋白，并與光學(xué)顯微鏡檢查、流式細(xì)胞術(shù)或熒光分析法檢測相偶聯(lián)。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，至少包含特異結(jié)合至少一種本發(fā)明中公開的或本領(lǐng)域其它途徑知道的治療性蛋白質(zhì)(例如表1中公開的治療性蛋白質(zhì))的抗體的片段或變體的清蛋白融合蛋白可用于定量或定性檢測基因產(chǎn)物或其保守變體或肽片段的存在。這可通過例如免疫熒光技術(shù)來實(shí)現(xiàn)，它采用熒光標(biāo)記的抗體，并與光學(xué)顯微鏡檢查、流式細(xì)胞術(shù)或熒光分析法檢測相偶聯(lián)。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白還可在細(xì)織學(xué)上用于像在免疫熒光、免疫電子顯微鏡或非免疫學(xué)測定法中用于原位檢測與本發(fā)明清蛋白融合蛋白結(jié)合的、或由其結(jié)合的、或與其締合的多肽。原位檢測可通過從患者取出組織學(xué)標(biāo)本，并對其應(yīng)用經(jīng)過標(biāo)記的抗體或本發(fā)明多肽來實(shí)現(xiàn)。優(yōu)選通過將經(jīng)過標(biāo)記的清蛋白融合蛋白覆蓋在生物學(xué)樣品上來應(yīng)用清蛋白融合蛋白。通過這樣一種程序，不僅有可能確定與清蛋白融合蛋白結(jié)合的、或由其結(jié)合的、或與其締合的多肽的存在，還可能確定其在受檢組織中的分布。利用本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易的察覺可修改極其多種組織學(xué)方法中的任何一種(諸如染色程序)來實(shí)現(xiàn)原位檢測。檢測與清蛋白融合蛋白結(jié)合的、或由其結(jié)合的、或與其締合的多肽的免疫測定法和非免疫測定法通常包括將樣品，諸如生物學(xué)液體、組織提取物、新收集的細(xì)胞、或已在細(xì)胞培養(yǎng)中保溫過的細(xì)胞的裂解物，在存在能夠結(jié)合基因產(chǎn)物或其保守變體或肽片段的可檢測經(jīng)標(biāo)記抗體時保溫，并通過本領(lǐng)域眾所周知的多種技術(shù)中的任何一種來檢測結(jié)合的抗體。可以使生物學(xué)樣品與固相支持物或載體接觸并固定在上面，諸如硝酸纖維素或能夠固定細(xì)胞、細(xì)胞顆?；蚩扇苄缘鞍踪|(zhì)的其它固相支持物其。然后可以用合適的緩沖液清洗支持物，隨后用可檢測經(jīng)標(biāo)記的本發(fā)明清蛋白融合蛋白進(jìn)行處理。然后可用緩沖液再次清洗固相支持物以除去未結(jié)合的抗體或多肽。任選隨后標(biāo)記抗體。然后可通過常規(guī)方法檢測固相支持物上結(jié)合的標(biāo)記物的數(shù)量?！肮滔嘀С治锘蜉d體”意指能夠結(jié)合多肽(例如清蛋白融合蛋白，或與本發(fā)明清蛋白融合蛋白結(jié)合的、或由其結(jié)合的、或與其締合的多肽)的任何支持物。眾所周知的支持物或載體包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、右旋糖苷、尼龍、淀粉酶、天然的和改良的纖維素、聚丙烯酰胺、輝長巖、和磁鐵礦。為了本發(fā)明的目的，載體的性質(zhì)可以是一定程度可溶的或者不溶的。事實(shí)上支持物可具有任何可能的結(jié)構(gòu)外形，只要偶聯(lián)的分子能夠結(jié)合多肽。因此，支持物的外形可以是球形的，如珠子，或圓柱形的，如試管的內(nèi)壁，或桿的外表面。或者，表面可以是平的，諸如薄片、試紙條等。優(yōu)選的支持物包括聚苯乙烯珠。本領(lǐng)域技術(shù)人員還知道適于結(jié)合抗體或抗原的許多其它載體，或者能夠通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)確定合適的載體。給定批次的多種清蛋白融合蛋白的結(jié)合活性可依照眾所周知的方法來測定。本領(lǐng)域技術(shù)人員通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)將能夠確定每種測定的操作和最佳測定條件。除了測定取自個體的生物學(xué)樣品中的多肽水平以外，還可通過成像在體內(nèi)檢測多肽。例如，在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，使用本發(fā)明的清蛋白融合蛋白來對患病的細(xì)胞或贅生物細(xì)胞成像。用于本發(fā)明清蛋白融合蛋白體內(nèi)成像的標(biāo)記物或標(biāo)志物包括可用X-射線照相術(shù)、NMR、MRI、CAT-掃描或ESR檢測的物質(zhì)。對于X-射線照相術(shù)，合適的標(biāo)記物包括放射性同位素，諸如鋇或銫，它們發(fā)出可檢測的輻射但對受試者沒有明顯的傷害。適用于NMR和ESR的標(biāo)志物包括具有可檢測的特征性自旋的物質(zhì)，諸如氘，它可通過標(biāo)記經(jīng)改造細(xì)胞系(或者細(xì)菌或酵母菌株)的營養(yǎng)物而摻入清蛋白融合蛋白。另外，可施用其存在可檢測的本發(fā)明清蛋白融合蛋白。例如，可施用經(jīng)射線不透性化合物或其它適當(dāng)化合物標(biāo)記的本發(fā)明清蛋白融合蛋白并在體內(nèi)成像，正如上文關(guān)于標(biāo)記抗體所討論的。另外，這樣的多肽還可用于體外診斷程序。將經(jīng)適當(dāng)可檢測成像模塊諸如放射性同位素(例如131I、112In、99mTc)、射線不透性物質(zhì)、或可通過核磁共振檢測的物質(zhì)標(biāo)記的多肽特異性抗體或抗體片段導(dǎo)入(例如腸胃外、皮下或腹膜內(nèi))有待檢查紊亂的哺乳動物。本領(lǐng)域?qū)⒗斫猓茉囌叩拇笮『退玫某上裣到y(tǒng)將決定產(chǎn)生診斷影像所需的成像模塊的量。在放射性同位素模塊的例子中，對于人類受試者，注射放射性同位素的量通常在約5到20毫居里99mTc的范圍內(nèi)。然后經(jīng)標(biāo)記清蛋白融合蛋白將優(yōu)先在體內(nèi)含有與本發(fā)明清蛋白融合蛋白結(jié)合的、或由其結(jié)合的、或與其締合的多肽或其它物質(zhì)的部位積累。體內(nèi)腫瘤成像的描述可參見S.W.Burchiel等人，“ImmunopharmacokineticsofRadiolabeledAntibodiesandTheirFragments”，第13章，《TumorImagingTheRadiochemicalDetectionofCancer》，S.W.Burchiel和B.A.Rhodes編，MassonPublishingInc.，1982。對本發(fā)明的清蛋白融合蛋白進(jìn)行可檢測標(biāo)記的一種方法是將它與報道酶連接，并將連接產(chǎn)物用于酶免疫測定法(EIA)(Voller，A.，“TheenzymeLinkedImmunosorbentAssay(ELISA)”，1978，DiagnosticHorizons21-7，MicrobiologicalAssociatesQuarterlyPublication，Walkersville，MD)；Voller等人，J.Clin.Pathol.31507-520，1978；Butler，J.E.，Meth.Enzymol.73482-523，1981；Maggio，E.編，1980，EnzymeImmunoassay，CRCPress，BocaRaton，F(xiàn)L；Ishikawa，E.等人編，1981，EnzymeImmunoassay，KgakuShoin，Tokyo。與抗體結(jié)合的報道酶將與適當(dāng)?shù)牡孜飪?yōu)選顯色底物以這樣一種方式發(fā)生反應(yīng)，即產(chǎn)生可檢測的化學(xué)模塊，例如通過分光光度法、熒光測定術(shù)或目測方式。可用于可檢測標(biāo)記抗體的報道酶包括但不限于蘋果酸脫氫酶、葡萄球菌核酸酶、δ-5-類固醇異構(gòu)酶、酵母乙醇脫氫酶、α-甘油磷酸脫氫酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、過氧化氫酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、葡糖淀粉酶和乙酰膽堿酯酶。另外，可通過比色法來進(jìn)行檢測，它采用報道酶的顯色底物。還可通過將底物的酶促反應(yīng)程度與類似制備的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行目測比較而進(jìn)行檢測。清蛋白融合蛋白還可進(jìn)行放射性標(biāo)記并用于多種其它免疫測定法。例如，通過放射性標(biāo)記清蛋白融合蛋白，有可能將清蛋白融合蛋白用于放射免疫測定法(RIA)(參見例如Weintraub，B.，Principlesofradioimmunoassay，SeventhtrainingCourseonRadioligandAssayTechniques，TheEndocrineSociety，1986年3月，引入本文作為參考)?？赏ㄟ^下列手段來檢測放射性同位素，包括但不限于伽馬計(jì)數(shù)器、閃爍計(jì)數(shù)器、或放射自顯影。另外，本領(lǐng)域知道螯合分子且它們可用于標(biāo)記清蛋白融合蛋白。螯合分子可附著于本發(fā)明的清蛋白融合蛋白以便用金屬離子標(biāo)記所述蛋白質(zhì)，金屬離子包括放射性核素或熒光標(biāo)記物。例如，參見Subramanian，R.和Meares，C.F.，“BifunctionalChelatingAgentsbforRadiometal-labeledmonoclonalAntibodies”，在《CancerImagingwithRadiolabeledAntibodies》中，D.M.Goldenberg編，KluwerAcademicPublications，Boston；Saji，H.，“Targeteddeliveryofradiolabeledimagingandtherapeuticagentsbifunctionalradiopharmaceuticals”，Crit.Rev.Ther.DrugCarrierSyst.16209-244，1999；Srivastava，S.C.和Mease，R.C.，“Progressinresearchonligands，nuclidesandtechniquesforlabelingmonoclonalantibodies”，Int.J.Rad.Appl.Instrum.B18589-603，1991；及Liu.S.和Edwards，D.S.，“Bifunctionalchelatorsfortherapeuticlanthanideradiopharmaceuticals”，Bioconjug.Chem.127-34，2001?？膳c所述清蛋白融合共價結(jié)合的任何螯合劑都可用于本發(fā)明。螯合劑還可包括連將螯合模塊與清蛋白融合蛋白連接起來的接頭模塊。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白附著于無環(huán)螯合劑，諸如二亞乙基三胺-N，N，N’，N”，N”-五乙酸(DPTA)、DPTA的類似物、及DPTA的衍生物。作為非限制性的例子，螯合劑可以是2-(對-異硫氰酸根合芐基)-6-甲基二亞乙基三胺五乙酸(IB4M-DPTA，也稱作MX-DTPA)、2-甲基-6-(ρ-硝基芐基)-1，4，7-三氮雜庚烷-N，N，N’，N”，N”-五乙酸(硝基-IB4M-DTPA或硝基-MX-DTPA)；2-(對-異硫氰酸根合芐基)-環(huán)已基二亞乙基三胺五乙酸(CHX-DTPA)，或N-[2-氨基-3-(p-硝基苯基)丙基]-反式-環(huán)已烷-1，2-二胺-N，N’，N”-五乙酸(硝基-CHX-A-DTPA)。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白附著于無環(huán)的三聯(lián)吡啶螯合劑，諸如6，6″-二[[N，N，N″，N″-四(羧甲基)氨基]甲基]-4′-(3-氨基-4-甲氧苯基)-2，2′6′，2″-三聯(lián)吡啶(TMT-胺)。在一個具體的實(shí)施方案中，附著于本發(fā)明清蛋白融合蛋白上的大環(huán)螯合劑是1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-N，N′，N″，N_-四乙酸(DOTA)。在其它具體的實(shí)施方案中，DOTA是通過接頭分子附著于本發(fā)明清蛋白融合蛋白的?？捎糜趯OTA綴合到多肽上的接頭分子的例子是本領(lǐng)域普遍知道的，參見例如DeNardo等人，Clin.CancerRes.4(10)2483-90，1998；Peterson等人，Bioconjug.Chem.10(4)553-7，1999；及Zimmerman等人，Nucl.Med.Biol.26(8)943-50，1999，將其完整引入本文作為參考。另外，美國專利5,652,361和5,756,065，其中公開了可綴合到抗體上的螯合劑及其生產(chǎn)和使用方法，將其完整引入本文作為參考。盡管美國專利5,652,361和5,756,065著重于將螯合劑綴合到抗體上，但本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易的將其中公開的方法進(jìn)行修改從而將螯合劑綴合到其它多肽上?？砂凑誐.Moi等人，J.Amer.Chem.Soc.492639，1989(2-對-硝基芐基-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-N，N′，N″，_-四乙酸)；S.VDeshpande等人，J.Nucl.Med.31473，1990；G.Ruser等人，Bioconj.Chem.1345，1990；C.J.Broan等人，J.C.S.Chem.Comm.231739，1990；及C.J.Anderson等人，J.Nucl.Med.36850，1995所述采用基于大環(huán)配體的雙功能螯合劑，它是通過活化臂或官能基附著到配體碳骨架上而實(shí)現(xiàn)綴合的。在一個實(shí)施方案中，將大環(huán)螯合劑諸如多氮雜大環(huán)螯合劑，任選含有一個或多個羧基、氨基、異羥肟酸、膦酸、或磷酸基團(tuán)，附著于本發(fā)明的清蛋白融合蛋白。在另一個實(shí)施方案中，螯合劑是選自DOTA、DOTA類似物、和DOTA衍生物的螯合劑。在一個實(shí)施方案中，可附著于本發(fā)明清蛋白融合蛋白的合適螯合劑分子包括DOXA(1-氧-4，7，10-三氮雜環(huán)十二烷三乙酸)、NOTA(1，4，7-三氮雜環(huán)壬烷三乙酸)、TETA(1，4，8，11-四氮雜環(huán)十四烷四乙酸)、和THT(4′-(3-氨基-4-甲氧-苯基)-6，6″-二(N′，N′-二羧甲基-N-甲肼)-2，2′6′，2″-三聯(lián)吡啶)及其類似物和衍生物。參見例如Ohmono等人，J.Med.Chem.35157-162，1992；Kung等人，J.Nucl.Med.25326-332，1984；Jurisson等人，Chem.Rev.931137-1156，1993；及美國專利號5,367,080。其它合適螯合劑包括美國專利號4,647,447；4,687,659；4,885,363；EP-A-71564；WO89/00557；及EP-A-232751中公開的螯合劑。在另一個實(shí)施方案中，可用于本發(fā)明的合適大環(huán)羧酸螯合劑包括1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-N，N′，N″，N_-四乙酸(DOTA)；1，4，8，12-四氮雜環(huán)十五烷-N，N′，N″，N_-四乙酸(15N4)；1，4，7-三氮雜環(huán)壬烷-N，N′，N″-三乙酸(9N3)；1，5，9-三氮雜環(huán)十二烷-N，N′，N″-三乙酸(12N3)；及6-溴乙酰氨基-芐基-1，4，8，11-四氮雜環(huán)十四烷-N，N′，N″，N_-四乙酸(BAT)?？筛街诒景l(fā)明清蛋白融合蛋白的優(yōu)選螯合劑是α-(5-異硫氰酸根合-2-甲氧苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，也稱作MeO-DOTA-NCS。也可使用α-(5-異硫氰酸根合-2-甲氧苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸的鹽或酯。共價附著了上述螯合劑的本發(fā)明清蛋白融合蛋白可以(通過螯合劑的配位位點(diǎn))用適于治療、診斷、或治療兼診斷目的的放射性核素標(biāo)記。合適金屬的例子包括Ag、At、Au、Bi、Cu、Ga、Ho、In、Lu、Pb、Pd、Pm、Pr、Rb、Re、Rh、Sc、Sr、Tc、Tl、Y和Yb。用于診斷目的的放射性核素的例子有Fe、Gd、111In、67Ga或68Ga。在另一個實(shí)施方案中，用于診斷目的的放射性核素是111In或67Ga。用于治療目的的放射性核素的例子有166Ho、165Dy、90Y、115mIn、52Fe或72Ga。在一個實(shí)施方案中，用于診斷目的的放射性核素是166Ho或90Y。用于治療兼診斷目的的放射性核素的例子包括153Sm、177Lu、159Gd、175Yb或47Sc。在一個實(shí)施方案中，放射性核素是153Sm、177Lu、175Yb或159Gd。優(yōu)選的金屬放射性核素包括90Y、99mTe、111In、47Sc、67Ga、51Cr、177mSn、67Cu、167Tm、97Ru、188Re、177Lu、199Au、47Sc、67Ga、51Cr、177mSn、67Cu、167Tm、95Ru、188Re、177Lu、199Au、203Pb及141Ce。在一個具體的實(shí)施方案中，共價附著了螯合劑的本發(fā)明清蛋白融合蛋白可以用選自90Y、111In、177Lu、166Ho、215Bi和225Ac的金屬離子進(jìn)行標(biāo)記。另外，發(fā)射γ的放射性核素，諸如99mTc、111In、67Ga和169Yb已經(jīng)批準(zhǔn)用于診斷成像或正在調(diào)查中，而β發(fā)射體，諸如67Cu、111Ag、186Re和90Y可用于腫瘤治療中的應(yīng)用。其它有用的放射性核素包括γ發(fā)射體，諸如99mTc、111In、67Ga及169Yb，而β發(fā)射體，諸如67Cu、111Ag、186Re、188Re和90Y，以及其它感興趣的放射性核素，諸如211At、212Bi、177Lu、86Rb、105Rh、153Sm、198Au、149Pm、85Sr、142Pr、214Pb、109Pd、166Ho、203Tl和44Sc。共價附著了螯合劑的本發(fā)明清蛋白融合蛋白可用上述放射性核素進(jìn)行標(biāo)記。在另一個實(shí)施方案中，共價附著了螯合劑的本發(fā)明清蛋白融合蛋白可用順磁性金屬離子進(jìn)行標(biāo)記，包括過渡金屬和鑭系金屬的離子，諸如原子序數(shù)為21-29、42、43、44、或57-71的金屬，特別是Cr、V、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、La、Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb和Lu的離子。用于磁共振成像組合物的順磁性金屬包括原子序號為22至29、42、44和58-70的元素。在另一個實(shí)施方案中，共價附著了螯合劑的本發(fā)明清蛋白融合蛋白可用熒光金屬離子進(jìn)行標(biāo)記，包括鑭系金屬，特別是La、Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu(例如152Eu)、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb和Lu。在另一個實(shí)施方案中，共價附著了螯合劑的本發(fā)明清蛋白融合蛋白可用含重金屬的報道物進(jìn)行標(biāo)記，可包括Mo、Bi、Si和W的原子。有可能用熒光化合物標(biāo)記清蛋白融合蛋白。在將熒光標(biāo)記的抗體暴露于適當(dāng)波長的光時，由于熒光，可檢測到它的存在。最常用的熒光標(biāo)記化合物有異硫氰酸熒光素、羅丹明、藻紅蛋白、藻藍(lán)蛋白、別藻藍(lán)蛋白、苯二醛(ophthaldehyde)和熒胺。清蛋白融合蛋白還可用發(fā)射熒光的金屬進(jìn)行可檢測標(biāo)記，諸如152Eu或其它鑭系金屬。這些金屬可用諸如二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)等金屬螯合基團(tuán)附著到抗體上。清蛋白融合蛋白還可通過與化學(xué)發(fā)光化合物的偶聯(lián)而進(jìn)行可檢測標(biāo)記。然后可通過檢測化學(xué)反應(yīng)過程中產(chǎn)生的冷光而確定化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的清蛋白融合蛋白的存在。特別有用的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記化合物的例子有魯米諾、異魯米諾、theromatic吖啶酯、咪唑、吖啶鹽和草酸酯。同樣，生物發(fā)光化合物也可用于標(biāo)記本發(fā)明的清蛋白融合蛋白。生物發(fā)光是在生物學(xué)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的一類化學(xué)發(fā)光，在該系統(tǒng)中催化性蛋白質(zhì)提高化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的效率。生物發(fā)光蛋白的存在通過檢測冷光的存在而確定。用于標(biāo)記目的的重要生物發(fā)光化合物有螢光素、螢光素酶和水母發(fā)光蛋白。轉(zhuǎn)基因生物體本發(fā)明還包括表達(dá)本發(fā)明清蛋白融合蛋白的轉(zhuǎn)基因生物體。轉(zhuǎn)基因生物體指其中轉(zhuǎn)移有重組、外源或克隆遺傳物質(zhì)的遺傳修飾生物體。這樣的遺傳物質(zhì)常稱為轉(zhuǎn)基因。轉(zhuǎn)基因的核酸序列可包含一種或多種轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列及其它核酸序列諸如內(nèi)含子，它們可能是所編碼蛋白質(zhì)的最佳表達(dá)和分泌所必需的。轉(zhuǎn)基因可設(shè)計(jì)成指導(dǎo)所編碼蛋白質(zhì)以這樣的方式表達(dá)，即有利于由生物體或由生物體產(chǎn)生的產(chǎn)物如生物體的乳汁、血液、尿液、卵、毛發(fā)或種子回收該蛋白質(zhì)。轉(zhuǎn)基因可由自與靶動物物種相同的物種或不同的物種的基因組衍生的核酸序列組成。轉(zhuǎn)基因可整合至基因組中該特定核酸序列在其它情況下通常未發(fā)現(xiàn)的基因座或該轉(zhuǎn)基因的正常基因座。術(shù)語“種系細(xì)胞系轉(zhuǎn)基因生物體”指這樣的轉(zhuǎn)基因生物體，其中將遺傳改變或遺傳信息導(dǎo)入種系細(xì)胞，從而賦予轉(zhuǎn)基因生物體將遺傳信息傳遞給后代的能力。如果這樣的后代實(shí)際上具有一些或所有該改變或遺傳信息，那么它們也是轉(zhuǎn)基因生物體。該改變或遺傳信息對于接受者所屬的生物物種可以是外源的，外源僅就特定個體接受者而言，或者可以是接受者已具有的遺傳信息。在后一種情況中，改變的或引入的基因的表達(dá)可與天然基因有所不同。轉(zhuǎn)基因生物體可以是轉(zhuǎn)基因動物或轉(zhuǎn)基因植物。轉(zhuǎn)基因動物可通過多種不同方法產(chǎn)生，包括轉(zhuǎn)染、電穿孔、顯微注射、胚胎干細(xì)胞中的基因打靶及重組病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒感染(參見例如美國專利號4,736,866；美國專利號5,602,307；Mullins等人，Hypertension22(4)630-633，1993；Brenin等人，Surg.Oncol.6(2)99-110，1997；Tuan編，RecombinantGeneExpressionProtocols，《MethodsinMolecularBiology》，No.62，HumanaPress，1997)。將核酸片段導(dǎo)入重組勝任哺乳動物細(xì)胞的方法可以是有利于多種核酸分子共轉(zhuǎn)化的任何方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易獲得用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物的詳細(xì)流程，包括美國專利號5,489,743和美國專利號5,602,307中公開的方法。已經(jīng)產(chǎn)生了許多重組或轉(zhuǎn)基因小鼠，包括表達(dá)活化癌基因的(美國專利號4,736,866)；表達(dá)猿SV40T-抗原的(美國專利號5,728,915)；不表達(dá)干擾素調(diào)控因子1(IRF-1)的(美國專利號5,731,490)；表現(xiàn)出多巴胺能功能障礙的(美國專利號5,723,719)；表達(dá)至少一種參與血壓控制的人基因的(美國專利號5,731,489)；表現(xiàn)出與天然發(fā)生阿爾茨海默氏病展示的癥狀高度相似性的(美國專利號5,720,936)；介導(dǎo)細(xì)胞粘附能力下降的(美國專利號5,602,307)；擁有牛生長激素基因的(Clutter等人，Genetics143(4)1753-1760，1996)；或者，能夠產(chǎn)生完全人抗體應(yīng)答的(McCarthy，TheLancet349(9049)405，1997)小鼠。雖然大多數(shù)轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)仍然選擇小鼠和大鼠，但在有些情況中優(yōu)選或甚至必須使用其它動物物種。轉(zhuǎn)基因過程已經(jīng)成功應(yīng)用于多種非鼠動物，包括綿羊、山羊、豬、犬、貓、猴、黑猩猩、倉鼠、兔、牛和豚鼠(參見例如Kim等人，Mol.Reprod.Dev.46(4)515-526，1997；Houdebine，Reprod.Nutr.Dev.35(6)609-617，1995；Petters，Reprod.Fertil.Dev.6(5)643-645，1994；Schnieke等人，Science278(5346)2130-2133，1997；及Amoah，J.AnimaiScience75(2)578-585，1997)。為了引導(dǎo)轉(zhuǎn)基因編碼的本發(fā)明蛋白質(zhì)分泌進(jìn)入轉(zhuǎn)基因動物的乳汁，可以使其處于啟動子的控制之下，該啟動子優(yōu)先在乳腺上皮細(xì)胞中激活。優(yōu)選控制編碼乳汁蛋白質(zhì)的基因的啟動子，例如酪蛋白、β-乳球蛋白、乳清酸蛋白、或乳清蛋白的啟動子(參見例如DiTullio，BioTechnology1074-77，1992；Clark等人，BioTechnology7487-492，1989；Gorton等人，BioTechnology51183-1187，1987；及Soulier等人，F(xiàn)EBSLetts.29713，1992)。選擇的轉(zhuǎn)基因哺乳動物將產(chǎn)生大量的乳汁并具有很長的泌乳期，例如山羊、牛、駱駝或綿羊。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白還可以在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)，例如將DNA轉(zhuǎn)基因插入到細(xì)胞核或質(zhì)體基因組中的植物。用于將外來核酸導(dǎo)入植物細(xì)胞或原生質(zhì)體的植物轉(zhuǎn)化流程在本領(lǐng)域是知道的。參加例如MethodsinEnzymologyVol.153，“RecombinantDNAPartD”，1987，Wu和Grossman編，AcademicPress及歐洲專利申請EP693554。美國專利號5,283,184、美國專利號5,482,852及歐洲專利申請EP693554中還描述了用于產(chǎn)生遺傳工程植物的方法，將它們都引入本文作為參考。藥物或治療性組合物可以通過任何常規(guī)方法來施用本發(fā)的清蛋白融合蛋白或其制劑，包括腸胃外(例如皮下或肌肉內(nèi))注射或靜脈內(nèi)灌輸。治療可以由單一服藥或一段時期內(nèi)的多次服藥構(gòu)成。盡管有可能單獨(dú)施用本發(fā)明的清蛋白融合蛋白，但是優(yōu)選以藥學(xué)制劑的形式與一種或多種可接受載體一起提供。就與清蛋白融合蛋白相容且對其接受者無害而言，載體必須是“可接受的”。通常，載體將是無菌且無熱原的水或鹽水。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白特別適合于在水性載體諸如無菌無熱原的水、鹽水或其它等張溶液中配制，因?yàn)樗鼈冊谌芤褐械谋Ｙ|(zhì)期延長了。例如，本發(fā)明的藥物組合物可以在例如分發(fā)前數(shù)周或數(shù)月或更長時期之前以水性形式預(yù)先配制好。例如，可以在考慮到清蛋白融合蛋白在水性制劑中的保質(zhì)期延長了而制備含有清蛋白融合蛋白的制劑。正如上文所討論的，這些治療性蛋白質(zhì)中的許多的保質(zhì)期在與HA融合后顯著增加或延長了。在適于以氣霧劑施用的情況中，可使用表征程序?qū)⒈景l(fā)明的清蛋白融合蛋白配制成氣霧劑。術(shù)語“氣霧劑”包括能夠吸入到細(xì)支氣管或鼻道中的本發(fā)明清蛋白融合蛋白的任何氣媒懸浮相。具體而言，氣霧劑包括本發(fā)明清蛋白融合蛋白的小滴的氣媒懸浮物，它可以在計(jì)量劑量的吸入器或霧化器中或在噴霧器中生成。氣霧劑還包括本發(fā)明化合物懸浮在空氣或其它載體氣體中的干粉組合物，它可以例如用吸入裝置通過吹入來投遞。參見Ganderton和Jones，《DrugDeliverytotheRespiratoryTract》，EllisHorwood，1987；Gonda，CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems6273-313，1990；及Raeburn等人，Pharmacol.Toxicol.Methods27143-159，1992。部分由于所使用的清蛋白融合蛋白的成分衍生自合適物種，本發(fā)明的制劑通常還是無免疫原性的。例如，用于人時，清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)和清蛋白部分二者通常都是人的。在其中兩種成分任一不是衍生自人的一些情況中，可以通過替代關(guān)鍵氨基酸使得特定表位對于人免疫系統(tǒng)顯示出本質(zhì)上是人的而不是外源的，由此將該成分人源化。制劑可以單位劑量形式方便的呈現(xiàn)，且可通過制藥領(lǐng)域眾所周知的任何方法來制備。這樣的方法包括將清蛋白融合蛋白與構(gòu)成一種或多種附加成分的載體相結(jié)合的步驟。通常，通過將活性成分與液態(tài)載體或細(xì)分固體載體或兩者均一且緊密相結(jié)合，然后根據(jù)需要使產(chǎn)品成形，如此制備所述制劑。適于腸胃外施用的制劑包括水性或非水下無菌注射液，可含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和使得所述制劑適于預(yù)定接收者的溶質(zhì)；及水性或非水性無菌懸浮液，可含有懸浮劑和增稠劑。制劑可以在單位劑量或多劑量容器中呈現(xiàn)，例如密封的安瓿瓶、小藥瓶或注射器，且可以存儲于冷凍-干燥(凍干)條件下，只需在臨使用前加入無菌液態(tài)載體例如水即可用于注射?，F(xiàn)配注射液和懸浮液可以由無菌粉末制備。由于許多本發(fā)明清蛋白融合蛋白顯示出延長的血清半衰期，劑量制劑可含有與指定治療性蛋白質(zhì)的未融合標(biāo)準(zhǔn)制劑相比較低摩爾濃度或較低劑量的治療性蛋白質(zhì)部分。作為例子，當(dāng)本發(fā)明清蛋白融合蛋白包含表I“治療性蛋白質(zhì)X”列所列蛋白質(zhì)之一作為一個或多個治療性蛋白質(zhì)區(qū)時，可以以清蛋白融合蛋白的效力相對于單獨(dú)的治療性蛋白質(zhì)的效力為基礎(chǔ)計(jì)算劑量形式，同時考慮清蛋白融合蛋白與天然治療性蛋白質(zhì)相比延長的血清半衰期和保質(zhì)期。例如，如果治療性蛋白質(zhì)通常以0.3至30.0IU/kg/周或0.9至12.0IU/kg/周施用，那么一年或更長時間分三次或七次服用。在由全長HA與治療性蛋白質(zhì)融合而組成的清蛋白融合蛋白中，單位上的等價劑量將呈現(xiàn)更大重量的試劑，但服藥頻率可減少至例如每周兩次、每周一次或更少。本發(fā)明的制劑或組合物可與關(guān)于清蛋白融合蛋白成分保質(zhì)期延長的說明書或包裝插頁一起包裝或包括在試劑盒中。例如，這樣的說明書或包裝插頁可給出考慮到本發(fā)明清蛋白融合蛋白延長的或擴(kuò)展的保質(zhì)期而推薦的貯存條件，諸如時間、溫度和光照。這樣的說明書或包裝插頁還可給出本發(fā)明清蛋白融合蛋白的具體優(yōu)點(diǎn)，諸如易于貯存可能需要在野外、受控醫(yī)院、臨床或診所條件以外使用的制劑。如上所述，本發(fā)明的制劑可以是水性形式，且可在不太理想的環(huán)境下貯存而治療活性沒有明顯喪失。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白也可以包含在保健品(nutraceuticals)中。例如，本發(fā)明的某些清蛋白融合蛋白可在天然產(chǎn)品中施用，包括由表達(dá)清蛋白融合蛋白的轉(zhuǎn)基因哺乳動物獲得的乳或乳制品。這樣的組合物還可以包括由表達(dá)清蛋白融合蛋白的轉(zhuǎn)基因植物獲得的植物或植物產(chǎn)品。還可以以含有或不含其它已知添加劑、載體、填充劑和稀釋劑的藥粉或藥片形式提供清蛋白融合蛋白。保健品描述于ScottHegenhart，《FoodProductDesign》，1993年12月。本發(fā)明還提供了通過在制藥學(xué)可接受載體中對受試者施用有效量的本發(fā)明清蛋白融合蛋白或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸(“清蛋白融合物多核苷酸”)來治療和/或預(yù)防疾病或紊亂(諸如例如本文公開的任何一種或多種疾病或紊亂)的方法?？紤]到個別患者的臨床狀況(尤其是單獨(dú)使用清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸進(jìn)行治療的副作用)、投遞部位、施藥方法、施藥方案、和從業(yè)人員知道的其它因素，按照與優(yōu)良醫(yī)療實(shí)踐一致的方式配制并施用清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸。因此，用于本發(fā)明的“有效量”將由此類考慮因素而決定。作為一般性建議，每次服藥時腸胃外施用清蛋白融合蛋白的總制藥學(xué)有效量將在約1μg/kg/天至10mg/kg/天患者體重的范圍內(nèi)，盡管如上所述這將進(jìn)行治療判斷。更優(yōu)選的是，此劑量是至少0.01mg/kg/天，且對人而言最優(yōu)選的是激素在約0.01和1mg/kg/天之間。如果連續(xù)服藥，通常以約1μg/kg/小時至約50μg/kg/小時的劑量速率施用清蛋白融合蛋白，或是通過每天注射1-4次或是通過例如使用微型泵的連續(xù)皮下灌輸。還可以使用靜脈內(nèi)袋裝溶液。觀察到變化所需要的治療長度和治療后發(fā)生應(yīng)答的間隔依據(jù)所需效果而變化。如上所述，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白與單獨(dú)的治療性蛋白質(zhì)部分(或其片段或變體)相比具有更高的血漿穩(wěn)定性。在決定每次服藥施用清蛋白融合蛋白的有效量及服藥施用方案時應(yīng)當(dāng)考慮到此血漿穩(wěn)定性的增加。具體而言，較高的血漿穩(wěn)定性可允許在相同的施用頻率以較低的劑量施用清蛋白融合蛋白，或者可允許以較少次數(shù)施用清蛋白融合蛋白。優(yōu)選的是，較高的穩(wěn)定性允許以較少的次數(shù)不太頻繁的施用本發(fā)明的清蛋白融合蛋白。更優(yōu)選的是，可以每兩周施用一次清蛋白融合蛋白。仍然更優(yōu)選的是，可以每三、四、五或更多周施用一次清蛋白融合蛋白，這取決于清蛋白融合蛋白的藥代學(xué)。例如，正如上文所討論的，IFN-α-HAS融合蛋白的藥代學(xué)支持每2-4周或更長時間一次的服藥方案，甚至以4周或4周以上的間隔服藥。清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸可通過口服、直腸、腸胃外、腦池內(nèi)、陰道內(nèi)、腹膜內(nèi)、局部(通過粉劑、軟膏、凝膠劑、滴劑或透皮貼劑)、口含、或口或鼻噴霧來施用。“制藥學(xué)可接受載體”指任何無毒固體、半固體或液體填充劑、稀釋劑、包囊材料或制劑輔料。術(shù)語“腸胃外”在用于本文時指包括靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、胸骨內(nèi)、皮下和關(guān)節(jié)內(nèi)注射和灌注在內(nèi)的施用模式。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸還適于通過緩釋系統(tǒng)來施用。緩釋清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸的例子有口服、直腸、腸胃外、腦池內(nèi)、陰道內(nèi)、腹膜內(nèi)、局部(通過粉劑、軟膏、凝膠劑、滴劑或透皮貼劑)、口含、或口或鼻噴霧施用?！爸扑帉W(xué)可接受載體”指任何類型的無毒固體、半固體或液體填充劑、稀釋劑、包囊材料或制劑輔料。術(shù)語“腸胃外”在用于本文時指包括靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、胸骨內(nèi)、皮下和關(guān)節(jié)內(nèi)注射和灌注在內(nèi)的施用模式。緩釋清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸的其它例子包括合適的聚合材料(諸如例如成形產(chǎn)品形式的半透性聚合基質(zhì)，例如薄膜或微囊)、合適的疏水材料(例如可接受油中的乳狀液)或離子交換樹脂、和少量可溶衍生物(諸如例如少量可溶鹽)。緩釋基質(zhì)包括聚交酯(美國專利號3,773,919、EP58,481)、L-谷氨酸與L-谷氨酸-γ-乙酯的共聚物(Sidman等人，Biopolymers22547-556，1983)、聚(2-羥乙基甲基丙烯酸酯)(Langer等人，J.Biomed.Mater.Res.15167-277，1981；及Langer，Chem.Tech.1298-105，1982)、乙烯乙酸乙烯(Langer等人，同上)或聚-D-(-)-3-羥基丁酸(EP133,988)。緩釋清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸還包括脂質(zhì)體捕獲的本發(fā)明清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸(一般參見Langer，Science2491527-1533，1990；Treat等人，在《LiposomesintheTherapyofInfectiousDiseaseandCancer》中，Lopez-Berestein和Fidler編，Liss，NewYork，pp.317-327和353-365，1989)。含有清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸的脂質(zhì)體通過本質(zhì)上已知的方法來制備DE3,218,121；Epstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)823688-3692，1985；Hwang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)774030-4034，1980；EP52,322；EP36,676；EP88,046；EP143,949；EP142,641；日本專利申請83-118008；美國專利號4,485,045和4,544,545；及EP102,324)。通常，脂質(zhì)體是小(約200-800埃)單層類型，其中脂質(zhì)成分大于約30mol％膽固醇，并為最佳療效調(diào)整所選比例。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸通過泵投遞(參見Langer，同上；Sefton，CRCCrit.Ref.Biomed.Eng.14201，1987；Buchwald等人，Surgery88507，1980；Saudek等人，N.Engl.J.Med.321574，1989)。Langer，Science2491527-1533，1990的綜述中討論了其它受控釋放系統(tǒng)。關(guān)于腸胃外施用，在一個實(shí)施方案中，清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸一般通過以所需程度的純度在單位劑量可注射形式(溶液、懸浮液、或乳狀液)中與制藥學(xué)可接受載體即在所采用的劑量和濃度對接受者無毒且與制劑的其它成分相容的載體一起混和來配制。例如，制劑優(yōu)選不含氧化劑和已知對療效有害的其它化合物。通常，通過將清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸與液態(tài)載體或細(xì)分固態(tài)載體或兩者均一且緊密接觸來制備制劑。然后，根據(jù)需要，將產(chǎn)品定形成所需劑型。優(yōu)選的是，載體是腸胃外載體，更優(yōu)選與接受者的血液等滲的溶液。這樣的載體媒介的例子包括水、鹽水、Ringer氏液、和右旋糖溶液。本發(fā)明也可以使用非水性媒介，諸如不揮發(fā)性油和油酸乙酯，以及脂質(zhì)體。載體適當(dāng)含有少量的添加劑，諸如增強(qiáng)等滲性和化學(xué)穩(wěn)定性的物質(zhì)。這樣的材料在所采用的劑量和濃度對接受者無毒，包括緩沖劑諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽、琥珀酸鹽、乙酸、和其它有機(jī)酸或其鹽；抗氧化劑，諸如抗壞血酸；低分子量(少于約10個殘基)多肽，例如多精氨酸或三肽；蛋白質(zhì)，諸如血清清蛋白、明膠、或免疫球蛋白；親水聚合物，諸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，諸如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或精氨酸；單糖、二糖、和其它碳水化合物，包括纖維素或其衍生物、葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖醇，諸如甘露醇或山梨醇；抗衡離子，諸如鈉；和/或非離子表面活性劑，諸如聚山梨醇酯(包括例如Tween-20)、poloxamer、或PEG。清蛋白融合蛋白通常在這樣的媒介中以約0.1mg/ml至100mg/ml的濃度，優(yōu)選1-10mg/ml，以約3至8的pH配制。可以理解，使用某些前述賦形劑、載體、或穩(wěn)定劑將導(dǎo)致多肽鹽的形成。用于治療性施用的任何藥物可以是無菌的。無菌易于通過無菌濾膜(例如0.2微米膜)過濾來實(shí)現(xiàn)。通常將清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸置于具有無菌存取口的容器中，例如具有皮下注射針可刺穿的塞子的靜脈內(nèi)溶液袋或小藥瓶。清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸通常作為水溶液或用于復(fù)水的凍干制劑貯存在單位劑量或多劑量容器中，例如密封的安瓿瓶或小藥瓶中。作為凍干制劑的例子，將5ml經(jīng)過無菌過濾的1％(w/v)清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸水溶液裝入小藥瓶中，并將所得混合物凍干。用注射用抑菌水使凍干的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸復(fù)水以制備灌注液。在一個具體且優(yōu)選的實(shí)施方案中，清蛋白融合蛋白制劑包含0.01M磷酸鈉、0.15mM氯化鈉、0.16微摩爾辛酸鈉/毫克融合蛋白、15微克/毫升聚山梨醇酯80pH7.2。在另一個具體且優(yōu)選的實(shí)施方案中，清蛋白融合蛋白制劑由0.01M磷酸鈉、0.15mM氯化鈉、0.16微摩爾辛酸鈉/毫克融合蛋白、15微克/毫升聚山梨醇酯80pH7.2組成。選擇與生理學(xué)條件匹配的pH和緩沖劑，并加入鹽作為增滲劑(tonicfier)。選擇辛酸鈉是因?yàn)樗鶊髮?dǎo)的其增加蛋白質(zhì)在溶液中的熱穩(wěn)定性的能力。最后，加入聚山梨醇酯作為通用表面活性劑，它降低溶液的表面張力并降低清蛋白融合蛋白對容器封閉系統(tǒng)的非特異吸附。本發(fā)明還提供了包括一個或多個容器的制藥學(xué)包裝或試劑盒，所述容器中裝有一種或多種包含本發(fā)明清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸的一種或多種成分?？梢耘c這樣的容器一起提供由政府行政機(jī)構(gòu)頒布的規(guī)范藥品或生物學(xué)產(chǎn)品的生產(chǎn)、使用或銷售的通告，該通告反映了行政機(jī)構(gòu)對人體施藥的生產(chǎn)、使用或銷售的批準(zhǔn)。此外，清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸可以與其它治療性化合物聯(lián)合使用。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸可以單獨(dú)施用或聯(lián)合佐劑施用。可與本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸一起施用的佐劑包括但不限于明礬、明礬加脫氧膽酸鹽(ImmunoAg)、MTP-PE(BiocineCorp.)、QS21(Genentech，Inc.)、BCG(例如THERACYS_)、MPL和小棒桿菌(Corynebacteriumparvum)的非活體制品。在一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸與明礬聯(lián)合施用。在另一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸與QS-21聯(lián)合施用?？膳c本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸聯(lián)合施用的其它佐劑包括但不限于單磷酰脂質(zhì)免疫調(diào)節(jié)劑、AfiuVax100a、QS-21、QS-18、CRL1005、鋁鹽、MF-59、和病毒體(Virosomal)佐劑技術(shù)。可與本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸聯(lián)合施用的疫苗包括但不限于致力于針對MMR(麻疹、腮腺炎、風(fēng)疹)、小兒麻痹癥(polio)、水痘、破傷風(fēng)/白喉、甲肝、乙肝、流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)B、百日咳(whoopingcough)、肺炎、流感、萊姆氏病、輪狀病毒、霍亂、黃熱病、日本腦炎、脊髓灰質(zhì)炎(poliomyelitis)、狂犬病、傷寒、和百日咳(pertussis)提供保護(hù)的疫苗。聯(lián)合施用既可以是伴隨施用，例如作為混合物、分開但同時或并行施用；也可以是順序施用。這包括其中聯(lián)合藥劑作為治療性混合物一起施用的呈現(xiàn)，也包括其中聯(lián)合藥劑分開但同時施用的程序，例如經(jīng)由分開的靜脈內(nèi)線路進(jìn)入同一個體?！奥?lián)合”施用還包括這樣的分開施用，即先給予化合物或藥劑中的一種，然后給予第二種。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸可以單獨(dú)施用或聯(lián)合其它治療劑施用?？膳c本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸聯(lián)合施用的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸試劑包括但不限于化療劑、抗生素、甾族和非甾族抗炎藥、常規(guī)免疫治療劑、和/或下文描述的治療性處理。聯(lián)合施用既可以是伴隨施用，例如作為混合物、分開但同時或并行施用；也可以是順序施用。這包括其中聯(lián)合藥劑作為治療下混合物一起施用的呈現(xiàn)，也包括其中聯(lián)合藥劑分開但同時施用的程序，例如經(jīng)由分開的靜脈內(nèi)線路進(jìn)入同一個體。“聯(lián)合”施用還包括這樣的分開施用，即先給予化合物或藥劑中的一種，然后給予第二種。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸與抗凝劑聯(lián)合施用?？膳c本發(fā)明的組合物聯(lián)合施用的抗凝劑包括但不限于肝素、低分子量肝素、華法林(warfarin)鈉(例如COUMADIN_)、雙香豆素、4-羥基香豆素、茴茚二酮(例如MIRADONTM)、醋硝香豆素(acenocoumarol)(例如醋硝香豆素(nicoumalone)，SINTHROMETM)、1，3-茚二酮、苯丙香豆素(例如MARCUMARTM)、雙香豆素乙酸乙酯(例如TROMEXATM)、及阿斯匹林。在一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物與肝素和/或華法林聯(lián)合施用。在另一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物與華法林聯(lián)合施用。在另一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物與華法林和阿斯匹林聯(lián)合施用。在另一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物與肝素聯(lián)合施用。在另一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物與肝素和阿斯匹林聯(lián)合施用。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸與溶栓藥聯(lián)合施用?？膳c本發(fā)明的組合物一起施用的溶栓藥包括但不限于纖溶酶原、lys-纖溶酶原、α2-抗纖溶酶、鏈激酶(例如KABIKINASETM)、antiresplace(例如EMINASETM)、組織型纖溶酶原激活劑(t-PA，altevase，ACTIVASETM)、尿激酶(例如ABBOKINASETM)、sauruplase、(尿激酶原，單鏈尿激酶)、及氨基己酸(例如AMICARTM)。在一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物與組織型纖溶酶原激活劑和阿斯匹林聯(lián)合施用。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸與抗血小板藥聯(lián)合施用。可與本發(fā)明的組合物一起施用的抗血小板藥包括但不限于阿斯匹林、雙嘧達(dá)莫(dipyridamole)(例如PERSANTINETM)、和噻氯匹定(ticlopidine)(例如TICLIDTM)。在一個具體的實(shí)施方案中，設(shè)想通過抗凝劑、溶栓藥和/或抗血小板藥與本發(fā)明清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸的聯(lián)合使用來預(yù)防、診斷和/或治療血栓形成、動脈血栓形成、靜脈血栓形成、血栓栓塞、肺部栓塞、動脈粥樣硬化、心肌梗死、短暫性腦缺血發(fā)作、不穩(wěn)定性心絞痛。在一個具體的實(shí)施方案中，設(shè)想通過抗凝血劑、溶栓藥和/或抗血小板藥物與本發(fā)明清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸的聯(lián)合使用來預(yù)防隱靜脈移植物閉塞(occulsionofsaphenousgrafts)、降低可能與血管成形術(shù)伴隨的圍手術(shù)期血栓形成風(fēng)險、降低心房纖維顫動包括非風(fēng)濕性心房纖維顫動患者的中風(fēng)風(fēng)險、降低與人工心臟瓣膜和/或二尖瓣疾病有關(guān)的栓塞風(fēng)險。本發(fā)明的治療劑單獨(dú)或與抗血小板、抗凝、和/或溶栓藥物聯(lián)合的其它用途包括但不限于預(yù)防身體外裝置(例如血管內(nèi)套管、血液透析患者中的血管通路分流裝置、血液透析裝置、和心肺旁路裝置)中的阻塞。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸與抗逆轉(zhuǎn)錄病毒試劑、核苷/核苷酸逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NRTI)、非核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NNRTI)、和/或蛋白酶抑制劑(PI)聯(lián)合施用。可與本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸聯(lián)合施用的NRTI包括但不限于RETROVIRTM(齊多夫定，zidovudine/AZT)、VIDEXTM(地達(dá)諾新，didanosine/ddI)、HIVIDTM(扎西他濱，zalcitabine/ddC)、ZERITTM(司他夫定，stavudine/d4T)、EPIVIRTM(拉米夫定，lamivudine/3TC)、及COMBIVIRTM(齊多夫定/拉米夫定)?？膳c本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸聯(lián)合施用的NNRTI包括但不限于VIRAMUNETM(奈韋拉平，nevirapine)、RESCRIPTORTM(地拉韋啶，delavirdine)、和SUSTIVATM(依法韋倫，efavirenz)。可與本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸聯(lián)合施用的蛋白酶抑制劑包括但不限于CRIXIVANTM(茚地那韋，indinavir)、NORVIRTM(利托那韋，ritonavir)、INVIRASETM(沙喹那韋，saquinavir)、和VIRACEPTTM(奈非那韋，nelfinavir)。在一個具體的實(shí)施方案中，可以將抗逆轉(zhuǎn)錄病毒劑、核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、非核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、和/或蛋白酶抑制劑與本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸的任意組合用于治療AIDS和/或預(yù)防或治療HIV感染。其它NRTI包括LODENOSINETM(F-ddA；一種酸穩(wěn)定性腺苷NRTI；Triangle/Abbott)；COVIRACILTM(恩曲他濱，emtricitabine/FTC；與拉米夫定(3TC)結(jié)構(gòu)上相關(guān)但體外活性大3至10倍；Triangle/Abbott)；dOTC(BCH-10652，也與拉米夫定結(jié)構(gòu)上相關(guān)但保留了針對拉米夫定抗性分離物的實(shí)質(zhì)比例的活性；BiochemPharma)；阿德福韋(Adefovir)(FDA拒絕批準(zhǔn)用于抗HIV治療；GileadSciences)；PREVEON_(阿德福韋二匹伏酯，阿德福韋的活性原藥；其活性形式是PMEA-pp)；TENOFOVIRTM(bis-POCPMPA，PMPA原藥；Gilead)；DAPD/DXG(DAPD的活性代謝物；Triangle/Abbott)；D-D4FC(與3TC相關(guān)，具有針對AZT/3TC抗性病毒的活性)；GW420867X(GlaxoWellcome)；ZIAGENETM(阿巴卡韋，abacavir/159U89；GlaxoWellcomeInc.)；CS-87(3’-疊氮-2’，3’-二脫氧尿苷；WO99/66936)；和β-L-FD4C和β-L-FddC的攜帶S-?；?2-乙硫酯(SATE)的原藥形式(WO98/17281)。其它NNRTI包括COACTINONTM(乙米韋林，Emivirine/MKC-442，HEPT類的有效NNRTI；Triangle/Abbott)；CAPRAVIRINETM(AG-1549/S-1153，具有針對含K130N突變的病毒的下一代NNRTI；Agouron)；PNU-142721(具有比其前身地拉韋啶高20至50倍的活性且對K130N突變體有活性；Pharmacia&Upjohn)；DPC-961和DPC-963(依非韋侖的第二代衍生物，設(shè)計(jì)對具有K103N突變的病毒有活性；DuPont)；GW-420867X(具有比HBY097高25倍的活性且對K103N突變體有活性；GlaxoWellcome)；CALANOLIDEA(來自橡膠樹的天然存在藥物；對含有Y181C和K103N突變中的一種或兩種的病毒有活性)；和Propolis(WO99/49830)。其它蛋白酶抑制劑包括LOPINAVIRTM(ABT378/r；AbbottLaboratories)；BMS-232632(一種氮雜肽；Bristol-MyresSquibb)；TIPRANAVIRTM(PNU-140690，一種非肽二羥吡喃酮；Pharmacia&Upjohn)；PD-178390(一種非肽二羥吡喃酮；Parke-Davis)；BMS232632(一種氮雜肽；Bristol-MyresSquibb)；L-756，423(茚地那韋類似物；Merck)；DMP-450(環(huán)化尿素化合物；Avid&DuPont)；AG-1776(在體外具有針對蛋白酶抑制劑抗性病毒的活性的肽模擬物；Agouron)；VX-175/GW-433908(安瑞那韋，amprenavir的磷酸鹽原藥；Vertex&GlaxoWelcome)；CGP61755(Ciba)；和AGENERASETM(安瑞那韋；GlaxoWelcomeInc.)。其它抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥包括融合抑制劑/gp41粘合劑。融合抑制劑/gp41粘合劑包括T-20(來自HIVgp41跨膜蛋白胞外域殘基643-678的肽，該胞外域在休眠狀態(tài)結(jié)合gp41并阻止向融合狀態(tài)轉(zhuǎn)化；Trimeris)和T-1249(第二代融合抑制劑；Trimeris)。其它抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥包括融合抑制劑/趨化因子受體拮抗劑。融合抑制劑/趨化因子受體拮抗劑包括CXCR4拮抗劑，諸如AMD3100(bicyclam)、SDF-1及其類似物、和ALX40-4C(陽離子肽)、T22(18氨基酸肽；Trimeris)和T22類似物T134和T140；CCR5拮抗劑，諸如RANTES(9-68)、AOP-RANTES、NNY-RANTES、和TAK-779；及CCR5/CXCR4拮抗劑，諸如NSC651016(偏端霉素類似物)。還包括CCR2B、CCR3、和CCR6拮抗劑。趨化因子受體激動劑諸如RANTES、SDF-1、MIP-1α、MIP-1β等也可抑制融合。其它抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥包括整合酶抑制劑。整合酶抑制劑包括二咖啡?？鼘?DFQA)酸；L-菊苣酸(二咖啡酰酒石(DFQA)酸)；醌茜素(QLC)及相關(guān)蒽醌；ZINTEVIRTM(AR177，可能作用于細(xì)胞表面而非真正整合酶抑制劑的寡核苷酸；Arondex)；及萘酚，諸如WO98/50347中所公開的。其它抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥包括羥脲樣化合物，諸如BCX-34(嘌呤核苷磷酸酶抑制劑；Biocryst)；核糖核苷酸還原酶抑制劑，諸如DIDOXTM(MoleculesforHealth)；次黃苷單磷酸脫氫酶(IMPDH)抑制劑，諸如VX-497(Vertex)；及霉酚酸(mycopholicacid)，諸如CellCept(霉酚酸嗎乙酯；Roche)。其它抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥包括病毒整合酶的抑制劑、病毒基因組核轉(zhuǎn)位的抑制劑諸如芳撐二甲酮(arylenebis(methylketone))化合物；HIV侵入的抑制劑，諸如AOP-RANTES、NNY-RANTES、RANTES-IgG融合蛋白、RANTES和糖胺聚糖(GAG)的可溶性復(fù)合物、及AMD-3100；核衣殼鋅指抑制劑，諸如二噻烷化合物；HIVTat和Rev的靶；以及藥效增強(qiáng)劑(pharmacoenhancer)，諸如ABT-378。其它抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法和輔助療法包括細(xì)胞因子和淋巴因子，諸如MIP-1α、MIP-1β、SDF-1α、IL-2、PROLEUKINTM(阿地白介素，aldesleukin/L2-7001；Chiron)、IL-4、IL-10、IL-12和IL-13；干擾素，諸如IFN-α2a、IFN-α2b、或IFN-β；TNF、NFκB、GM-CSF、M-CSF、和IL-10的拮抗劑；調(diào)節(jié)免疫激活的藥劑，諸如環(huán)孢霉素和強(qiáng)的松；疫苗，諸如RemuneTM(HIVImmunogen)、APL400-003(Apollon)、重組gp120及片段、二價(B/E)重組包膜糖蛋白、rgp120CM235、MNrgp120、SF-2rgp120、gp120/可溶性CD4復(fù)合物、DeltaJR-FL蛋白、衍生自不連續(xù)gp120C3/C4結(jié)構(gòu)域的分支合成肽、融合勝任免疫原、及Gag、Pol、Nef和Tat疫苗；基于基因的療法，諸如基因抑制物元件(GSE；WO98/54366)，和胞內(nèi)因子(ntrakine)(經(jīng)過遺傳修飾的CC趨化因子靶向ER以阻斷新合成的CCR5的表面表達(dá)(Yang等人，PNAS9411567-72，1997；Chen等人，Nat.Med.31110-16，1997))；抗體，諸如抗CXCR4抗體12G5，抗CCR5抗體2D7、5C7、PA8、PA9、PA10、PA11、PA12和PA14，抗CD4抗體Q4120和RPA-T4，抗CCR3抗體7B11，抗gp120抗體17b、48d、447-52D、257-D、268-D和50.1，抗Tat抗體，抗TNF-α抗體，和單克隆抗體33A；芳烴(AH)受體激動劑和拮抗劑，諸如TCDD、3，3′，4，4′，5-五氯聯(lián)苯、3，3′，4，4′-四氯聯(lián)苯、和α-萘黃酮(WO98/30213)；及抗氧化劑，諸如γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸乙酯(γ-GCE；WO99/56764)。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸與抗病毒藥聯(lián)合施用?？膳c本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸聯(lián)合施用的抗病毒藥包括但不限于阿昔洛韋(acyclovir)、利巴韋林(ribavirin)、金剛烷胺(amantadine)、remantidine、maxamine、或胸腺法新(thymalfasin)。具體而言，干擾素清蛋白融合蛋白可以與任何這些藥劑聯(lián)合施用。另外，干擾素α清蛋白融合蛋白也可以與任何這些藥劑聯(lián)合施用，優(yōu)選的是，干擾素α-2a或2b清蛋白融合蛋白可以與任何這些藥劑聯(lián)合施用。此外，干擾素β清蛋白融合蛋白也可以與任何這些藥劑聯(lián)合施用。另外，任何IFN雜化物清蛋白融合蛋白都可以與任何這些藥劑聯(lián)合施用。在一個最優(yōu)選的實(shí)施方案中，干擾素清蛋白融合蛋白與利巴韋林聯(lián)合施用。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，干擾素α清蛋白融合蛋白與利巴韋林聯(lián)合施用。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，干擾素α2a清蛋白融合蛋白與利巴韋林聯(lián)合施用。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，干擾素α2b清蛋白融合蛋白與利巴韋林聯(lián)合施用。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，干擾素β清蛋白融合蛋白與利巴韋林聯(lián)合施用。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，雜化干擾素清蛋白融合蛋白與利巴韋林聯(lián)合施用。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸可與抗機(jī)會性感染藥聯(lián)合施用。可與本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸聯(lián)合施用的抗機(jī)會藥包括但不限于TRIMETHOPRIM-SULFAMETHOXAZOLETM、DAPSONETM、PENTAMIDINETM、ATOVAQUONETM、ISONIAZIDTM、RIFAMPINTM、PYRAZINAMIDETM、ETHAMBUTOLTM、RIFABUTINTM、CLARITHROMYCINTM、AZITHROMYCINTM、GANCICLOVIRTM、FOSCARNETTM、CIDOFOVIRTM、FLUCONAZOLETM、ITRACONAZOLETM、KETOCONAZOLETM、ACYCLOVIRTM、FAMCICOLVIRTM、PYRIMETHAMINETM、LEUCOVORINTM、NEUPOGENTM(非格司亭，filgrastim/G-CSF)、和LEUKINETM(沙格司亭，sargramostim/GM-CSF)。在一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸與TRIMETHOPRIM-SULFAMETHOXAZOLETM、DAPSONETM、PENTAMIDINETM、和/或ATOVAQUONETM以任意組合預(yù)防性用于治療或預(yù)防機(jī)會性卡氏肺囊蟲(Pneumocystiscarinii)肺炎感染。在另一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸與ISONIAZIDTM、RIFAMPINTM、PYRAZINAMIDETM、和/或ETHAMBUTOLTM以任意組合預(yù)防性用于治療或預(yù)防機(jī)會性鳥分枝桿菌(Mycobacteriumavium)復(fù)合感染。在另一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸與RIFABUTINTM、CLARITHROMYCINTM、和/或AZITHROMYCINTM以任意組合預(yù)防性用于治療或預(yù)防機(jī)會性結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)感染。在另一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸與GANCICLOVIRTM、FOSCARNETTM、和/或CIDOFOVIRTM以任意組合預(yù)防性用于治療或預(yù)防機(jī)會性細(xì)胞巨化病毒感染。在另一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸與FLUCONAZOLETM、ITRACONAZOLETM、和/或KETOCONAZOLETM以任意組合預(yù)防性用于治療或預(yù)防機(jī)會性真菌感染。在另一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸與ACYCLOVIRTM和/或FAMCICOLVIRTM以任意組合預(yù)防性用于治療或預(yù)防機(jī)會性I型和/或II型單純皰疹病毒感染。在另一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸與PYRIMETHAMINETM和/或LEUCOVORINTM以任意組合預(yù)防性用于治療或預(yù)防機(jī)會性鼠弓形蟲(Toxoplasmagondii)感染。在另一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸與LEUCOVORINTM和/或NEUPOGENTM以任意組合預(yù)防性用于治療或預(yù)防機(jī)會性細(xì)菌感染。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸與抗生藥聯(lián)合施用?？梢耘c本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸聯(lián)合施用的抗生藥包括但不限于阿莫西林、β-內(nèi)酰胺酶、氨基糖苷、β-內(nèi)酰胺(糖肽)、β-內(nèi)酰胺酶、氯林肯霉素、氯霉素、頭孢菌素、環(huán)丙沙星、紅霉素、氟喹諾酮、大環(huán)內(nèi)酯、甲硝唑、青霉素、喹諾酮、雷帕霉素、利福平、鏈霉素、磺胺、四環(huán)素、甲氧芐啶、甲氧芐啶-磺胺甲_唑、和萬古霉素。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸與免疫刺激物聯(lián)合施用。可與本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸聯(lián)合施用的免疫刺激物包括但不限于左旋咪唑(例如ERGAMISOLTM)、異丙肌酐(例如INOSIPLEXTM)、干擾素(例如干擾素α)、和白介素(例如IL-2)。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸與免疫抑制劑聯(lián)合施用?？膳c本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸聯(lián)合施用的免疫抑制劑包括但不限于類固醇、環(huán)孢菌素、環(huán)孢菌素類似物、環(huán)磷酰胺甲基強(qiáng)的松、強(qiáng)的松、咪唑硫嘌呤、FK-506、15-脫氧精胍菌素、和通過抑制響應(yīng)性T細(xì)胞的功能而起作用的其它免疫抑制劑?？膳c本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸聯(lián)合施用的其它免疫抑制劑包括但不限于強(qiáng)的松龍、氨甲蝶呤、沙立度胺(thalidomide)、甲氧沙林(methoxsalen)、雷帕霉素、來氟米特(leflunomide)、咪唑立賓(mizoribine)(BREDININTM)、布喹那(brequinar)、脫氧精胍菌素、和氮雜螺烷(azaspirane)(SKF105685)、ORTHOCLONEOKT_3(muromonab-CD3)、SANDIMMUNETM、NEORALTM、SANGDYATM(環(huán)孢菌素)、PROGRAF_(FK506，他克莫司)、CELLCEPT_(霉酚酸嗎乙酯，其中的活性代謝物是霉酚酸)、IMURANTM(咪唑硫嘌呤)、糖皮質(zhì)類固醇、腎上腺皮質(zhì)類固醇諸如DELTASONETM(強(qiáng)的松)和HYDELTRASOLTM(強(qiáng)的松龍)、FOLEXTM和MEXATETM(氨甲喋呤)、OXSORALEN-ULTRATM(甲氧沙林)和RAPAMUNETM(西羅莫司)。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸單獨(dú)施用或與一種或多種靜脈內(nèi)免疫球蛋白制品聯(lián)合施用?？膳c本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸聯(lián)合施用的靜脈內(nèi)免疫球蛋白制品包括但不限于GAMMARTM、IVEEGAMTM、SANDOGLOBULINTM、GAMMAGARDS/DTM、ATGAMTM(抗胸腺細(xì)胞球蛋白)、和GAMIMUNETM。在一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸與靜脈內(nèi)免疫球蛋白制品在移植療法(例如骨髓移植)中聯(lián)合施用。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸單獨(dú)施用或作為組合療法的一部分施用，或是在體內(nèi)施用于患者或是在體外施用于細(xì)胞，以治療癌癥。在一個具體的實(shí)施方案中，清蛋白融合蛋白，特別是IL-2-清蛋白融合蛋白在癌癥的被動免疫治療期間反復(fù)施用，諸如轉(zhuǎn)移性黑素瘤的過繼性細(xì)胞轉(zhuǎn)移療法，正如Dudley等人(ScienceExpress，2002年9月19日，www.scienceexpress.org，完整引入本文作為參考)所述。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸單獨(dú)施用或與抗炎藥聯(lián)合施用?？膳c本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸聯(lián)合施用的抗炎藥包括但不限于皮質(zhì)類固醇(例如倍他米松、布地奈德、可的松、地塞米松、氫化可的松、甲基強(qiáng)的松龍、強(qiáng)的松龍、強(qiáng)的松、和曲安西龍)、非固醇類抗炎藥(例如雙氯芬酸、二氟尼柳、依托度酸、非諾洛芬、夫洛非寧、氟比洛芬、布洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、甲氯芬那酸酯、甲芬那酸、美洛昔康、萘丁美酮、萘普生、奧沙普秦、保泰松(苯丁唑酮)、吡羅昔康、舒林酸、替諾昔康、噻洛芬酸、和托美丁)，以及抗組胺藥、氨基芳基羧酸衍生物、芳基乙酸衍生物、芳基丁酸衍生物、芳基羧酸、芳基丙酸衍生物、吡唑、吡唑啉酮、水楊酸衍生物、噻嗪甲酰胺(thiazinecarboxamide)、e-乙酰氨基己酸(acetamidocaproicacid)、S-腺苷甲硫氨酸、3-氨基-4-羥基丁酸、阿米西群、芐達(dá)酸、芐達(dá)明、布可隆、聯(lián)苯吡胺、地他唑、依莫法宗、愈創(chuàng)藍(lán)油烴、萘丁美酮、尼美舒利、奧古蛋白、奧沙西羅、瑞尼托林、哌立索唑、哌福肟、普魯喹宗、普羅沙唑、和替尼達(dá)普。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物單獨(dú)施用或與抗血管發(fā)生藥聯(lián)合施用?？膳c本發(fā)明的組合物聯(lián)合施用的抗血管發(fā)生藥包括但不限于制管張素(Entremed，Rockville，MD)、肌鈣蛋白-1(BostonLifeSciences，Boston，MA)、抗侵襲因子、視黃酸及其衍生物、紫杉醇(Taxol)、蘇拉明、金屬蛋白酶-1組織抑制物、金屬蛋白酶-2組織抑制物、VEGI、纖溶酶原激活劑抑制物-1、纖溶酶原激活劑抑制物-2、和各種形式的較輕“d組”過渡金屬。較輕“d組”過渡金屬包括例如釩、鉬、鎢、鈦、鈮和鉭類。這些過渡金屬類可形成過渡金屬復(fù)合物。上述過渡金屬類的合適復(fù)合物包括氧絡(luò)過渡金屬復(fù)合物。釩復(fù)合物的代表性例子包括氧絡(luò)釩復(fù)合物，諸如釩酸鹽和氧釩基復(fù)合物。合適的釩酸鹽復(fù)合物包括偏釩酸鹽和原釩酸鹽復(fù)合物，諸如例如偏釩酸銨、偏釩酸鈉、和原釩酸鈉。合適的氧釩基復(fù)合物包括例如乙酰丙酮氧釩和硫酸氧釩，包括硫酸氧釩水合物，如一和三水合硫酸氧釩。鎢和鉬復(fù)合物的代表性例子也包括氧絡(luò)復(fù)合物。合適的氧絡(luò)鎢復(fù)合物包括鎢酸鹽和氧化鎢復(fù)合物。合適的鎢酸鹽復(fù)合物包括鎢酸銨、鎢酸鈣、二水合鎢酸鈉、和鎢酸。合適的氧化鎢包括氧化鎢(IV)和氧化鎢(VI)。合適的氧絡(luò)鉬復(fù)合物包括鉬酸鹽、氧化鉬和氧鉬基復(fù)合物。合適的鉬酸鹽復(fù)合物包括鉬酸銨及其水合物、鉬酸鈉及其水合物、和鉬酸鉀及其水合物。合適的氧化鉬包括氧化鉬(VI)、氧化鉬(VI)、和鉬酸。合適的氧鉬基復(fù)合物包括例如乙酰丙酮氧鉬。其它合適的鎢和鉬復(fù)合物包括衍生自例如甘油、酒石酸和糖的羥衍生物。極其多種其它抗血管發(fā)生因子也可用于本發(fā)明的內(nèi)容。代表性例子包括但不限于血小板因子4；硫酸魚精蛋白；硫酸化幾丁質(zhì)衍生物(由雪花蟹殼制得)(Murata等人，CancerRes.5122-26，1991)；硫酸化聚糖肽聚糖復(fù)合物(SP-PG)(類固醇諸如雌激素和檸檬酸他莫西芬的存在可增強(qiáng)此化合物的功能)；星形孢菌素；基質(zhì)代謝調(diào)節(jié)劑，包括例如脯氨酸類似物、順式羥脯氨酸、d，L-3，4-脫氫脯氨酸、Thiaproline、α，α-二吡啶、延胡索酸氨基丙腈；4-丙基-5-(4-吡啶基)-2(3H)-_唑酮；氨甲蝶呤；米托蒽醌；肝素；干擾素；2巨球蛋白-血清；ChIMP-3(Pavloff等人，J.Bio.Chem.26717321-17326，1992)；胰凝乳蛋白酶抑制劑(Tomkinson等人，BiochemJ.286475-480，1992)；十四烷基硫酸環(huán)糊精；Eponemycin；喜樹堿；煙曲霉素(Ingber等人，Nature348555-557，1990)；硫代蘋果酸金鈉(“GST”；Matsubara和Ziff，J.Clin.Invest.791440-1446，1987)；抗膠原酶-血清；α2-抗纖溶酶(Holmes等人，J.Biol.Chem.262(4)1659-1664，1987)；比生群(NationalCancerInstitute)；氯苯扎利二鈉(N-(2)-羧苯基-4-氯蒽茴酸(anthronilicacid)二鈉或“CCA”；Takeuchi等人，AgentsActions36312-316，1992)；和金屬蛋白酶抑制劑，諸如BB94?？捎糜诒?br/>發(fā)明內(nèi)容的其它抗血管發(fā)生因子包括沙利度胺(Celgene，Warren，NJ)；抑制血管的類固醇；AGM-1470(H.Brem和J.Folkman，J.Pediatr.Surg.28445-51，1993)；整合素αvβ3拮抗劑(C.Storgard等人，J.Clin.Invest.10347-54，1999)；羧基氨基咪唑；羧基氨基三唑(CAI)(NationalCancerInstitute，Bethesda，MD)；ConbretastatinA-4(CA4P)(OXiGENE，Boston，MA)；角鯊胺(MagaininPharmaceuticals，PlymouthMeeting，PA)；TNP-470(TapPharmaceuticals，Deerfield，IL)；ZD-0101AstraZeneca(London，UK)；APRA(CT2584)；Benefin、Byrostatin-1(SC339555)；CGP-41251(PKC412)；CM101；右雷佐生(ICRF187)；DMXAA；內(nèi)皮抑制素；Flavopridiol；Genestein；GTE；ImmTher；Iressa(ZD1839)；奧曲肽(生長激素抑制素)；Panretin；Penacillamine；Photopoint；PI-88；普啉司他(AG-3340)；Purlytin；Suradista(FCE26644)；他莫昔芬(Nolvadex)；他扎羅?。凰牧蜚f酸鹽；希羅達(dá)(卡培他濱)；和5-氟尿嘧啶?？膳c本發(fā)明的組合物聯(lián)合施用的抗血管發(fā)生藥可通過多種機(jī)制起作用，包括但不限于抑制胞外基質(zhì)的蛋白水解、阻斷內(nèi)皮細(xì)胞-胞外基質(zhì)粘附分子的功能、拮抗血管發(fā)生誘導(dǎo)物諸如生長因子的功能、及抑制在增殖內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)的整合素受體。干擾胞外基質(zhì)蛋白水解且可與本發(fā)明的組合物聯(lián)合施用的抗血管發(fā)生抑制劑的例子包括但不限于AG-3340(Agouron，LaJolla，CA)、BAY-12-9566(Bayer，WestHaven，CT)、BMS-275291(BristolMyersSquibb，Princeton，NJ)、CGS-27032A(Novartis，EastHanover，NJ)、馬立馬司他(BritishBiotech，Oxford，UK)和美他司他(Metastat)(Aetema，St-Foy，Quebec)。通過阻斷內(nèi)皮細(xì)胞-胞外基質(zhì)粘附分子的功能而起作用且可與本發(fā)明的組合物聯(lián)合施用的抗血管發(fā)生抑制劑的例子包括但不限于EMD-121974(MerckKcgaADarmstadt，Germany)和Vitaxin(Ixsys，LaJolla，CA/Medimmune，Gaithersburg，MD)。通過直接拮抗或抑制血管發(fā)生誘導(dǎo)物而起作用且可與本發(fā)明的組合物聯(lián)合施用的抗血管發(fā)生劑的例子包括但不限于Angiozyme(Ribozyme，Boulder，CO)、抗VEGF抗體(Genentech，S.SanFrancisco，CA)、PTK-787/ZK-225846(Novartis，Basel，Switzerland)、SU-101(Sugen，S.SanFrancisco，CA)、SU-5416(Sugen/PharmaciaUpjohn，Bridgewater，NJ)、和SU-6668(Sugen)。其它抗血管發(fā)生劑通過間接抑制血管發(fā)生而起作用。可與本發(fā)明的組合物聯(lián)合施用的血管發(fā)生間接抑制劑的例子包括但不限于IM-862(Cytran，Kirkland，WA)、干擾素α、IL-12(Roche，Nutley，NJ)、和多硫酸戊聚糖(GeorgetownUniversity，Washington，DC)。在具體的實(shí)施方案中，設(shè)想通過本發(fā)明的組合物與抗血管發(fā)生劑的聯(lián)合使用來治療、預(yù)防和/或改善自身免疫病，諸如例如本文描述的自身免疫病。在具體的實(shí)施方案中，設(shè)想通過本發(fā)明的組合物與抗血管發(fā)生劑的聯(lián)合使用來治療、預(yù)防和/或改善關(guān)節(jié)炎。在一個更具體的實(shí)施方案中，設(shè)想通過本發(fā)明的組合物與抗血管發(fā)生劑的聯(lián)合使用來治療、預(yù)防和/或改善類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。在另一個實(shí)施方案中，編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸與血管發(fā)生性蛋白質(zhì)或編碼血管發(fā)生性蛋白質(zhì)的多核苷酸聯(lián)合施用?？膳c本發(fā)明的組合物聯(lián)合施用的血管發(fā)生性蛋白質(zhì)的例子包括但不限于酸性和堿性成纖維細(xì)胞生長因子、VEGF-1、VEGF-2、VEGF-3、表皮生長因子α和β、血小板衍生內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、血小板衍生生長因子、腫瘤壞死因子α、肝細(xì)胞生長因子、胰島素樣生長因子、集落刺激因子、巨噬細(xì)胞集落刺激因子、粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子、和氧化一氮合酶。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物與化療劑聯(lián)合施用?？膳c本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸聯(lián)合施用的化療劑包括但不限于烷化劑，諸如氮芥(例如雙氯乙基甲胺、環(huán)磷酰胺、環(huán)磷酰胺異環(huán)磷酰胺、美法侖(L-溶肉瘤素)、和苯丁酸氮芥)、乙撐亞胺和甲基蜜胺(例如六甲蜜胺和噻替哌)、烷基磺酸鹽(例如白消安)、亞硝基脲(例如卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、司莫司汀(甲基-CCNU)、和鏈佐星(streptozotocin))、三氮烯(例如達(dá)卡巴嗪(DTIC；二甲三氮咪唑酰胺))、葉酸類似物(例如甲氨蝶呤(氨甲蝶呤))、嘧啶類似物(例如氟尿嘧啶(5-氟尿嘧啶；5-FU)、氟尿苷(氟脫氧尿苷；FudR)、及阿糖胞苷(胞嘧啶阿拉伯糖苷))、嘌呤類似物及相關(guān)抑制劑(例如巰嘌呤(6-巰基嘌呤；6-MP)、硫鳥嘌呤(6-硫鳥嘌呤；TG)、及噴司他丁(2′-脫氧助間型霉素))、長春花生物堿(例如長春堿(VLB，硫酸長春堿))和長春新堿(硫酸長春新堿))、表鬼臼毒素(例如依托泊苷和替尼泊苷)、抗生素(例如更生霉素(放線菌素D)、道諾紅霉素(道諾霉素；柔紅霉素)、阿霉素、博來霉素、普卡霉素(光神霉素)、及絲裂霉素(絲裂霉素C)、酶(例如L-天冬酰胺酶)、生物學(xué)反應(yīng)修飾劑(例如干擾素-α和干擾素-α-2b)、鉑配位化合物(例如順鉑(順式-DDP)和卡鉑)、蒽二酮(anthracenedione)(米托蒽醌)、取代脲(例如羥脲)、甲肼衍生物(例如丙卡巴肼(N-甲肼；MIH))、腎上腺皮質(zhì)類固醇(例如強(qiáng)的松)、孕酮(例如己酸羥基孕激素、甲羥孕酮、醋酸甲羥孕酮、和醋酸甲地孕酮)、雌激素(例如己烯雌酚(DES)、二磷酸己烯雌酚、雌二醇、和乙炔雌二醇)、抗雌激素(例如他莫西芬)、雄激素(丙酸睪酮和氟甲睪酮)、抗雄激素(例如氟他胺)、促性腺激素釋放激素類似物(例如亮丙瑞林)、其它激素和激素類似物(例如甲睪酮、雌莫司汀、雌莫司汀磷酸鈉、氯烯雌醚、和睪內(nèi)酯)、以及其它藥劑(例如達(dá)卡巴嗪、谷氨酸、和米托坦)。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物與一種或多種下列藥物聯(lián)合施用infliximab(也稱為RemicadeTMCentocor，Inc.)、托卡特(Roche，RO-32-3555)、來氟米特(也稱為AravaTM，來自HoechstMarionRoussel)、KineretTM(IL-1受體拮抗劑，也稱為Anakinra，來自Amgen，Inc.)。在一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物與CHOP(環(huán)磷酰胺、阿霉素、長春新堿、和強(qiáng)的松)或與CHOP一種或多種成分的組合聯(lián)合施用。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物與抗CD20抗體、人單克隆抗CD20抗體聯(lián)合施用。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物與抗CD20抗體和CHOP、或抗CD20抗體和CHOP一種或多種成分特別是環(huán)磷酰胺和/或強(qiáng)的松的任意組合聯(lián)合施用。在一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物與Rituximab聯(lián)合施用。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物與Rituximab和CHOP，或與Rituximab和CHOP一種或多種成分特別是環(huán)磷酰胺和/或強(qiáng)的松的任意組合一起施用。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物與tositumomab和CHOP、或tositumomab和CHOP一種或多種成分特別是環(huán)磷酰胺和/或強(qiáng)的松的任意組合一起施用。抗CD20抗體可任選與放射性同位素、毒素或胞毒性原藥相關(guān)聯(lián)。在另一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物與ZevalinTM聯(lián)合施用。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物與ZevalinTM和CHOP、或ZevalinTM和CHOP一種或多種成分特別是環(huán)磷酰胺和/或強(qiáng)的松的任意組合一起施用。ZevalinTM可與一種或多種放射性同位素相關(guān)聯(lián)。特別優(yōu)選的同位素是90Y和111In。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸與細(xì)胞因子聯(lián)合施用。可與本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸聯(lián)合施用的細(xì)胞因子包括但不限于IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL10、IL12、IL13、IL15、抗CD40、CD40L、IFN-γ和TNF-α。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸可與任何白介素一起施用，包括但不限于IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、L-17、IL-18、IL-19、IL-20和IL-21。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸與TNF家族成員聯(lián)合施用?？膳c本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸聯(lián)合施用的TNF、TNF相關(guān)分子或TNF樣分子包括但不限于可溶性形式的TNF-α、淋巴毒素-α(LT-α，也稱為TNF-β)、LT-β(發(fā)現(xiàn)于復(fù)合異源三聚物L(fēng)T-α2-β)、OPGL、FasL、CD27L、CD30L、CD40L、4-1BBL、DcR3、OX40L、TNF-γ(國際公布號WO96/14328)、AIM-I(國際公布號WO97/33899)、endokine-α(國際公布號WO98/07880)、OPG、和neutrokine-α(國際公布號WO98/18921)、OX40、和神經(jīng)生長因子(NGF)、和可溶性形式的Fas、CD30、CD27、CD40和4-IBB、TR2-(國際公布號WO96/34095)、DR3(國際公布號WO97/33904)、DR4(國際公布號WO98/32856)、TR5(國際公布號WO98/30693)、TRANK、TR9(國際公布號WO98/56892)、TR10(國際公布號WO98/54202)、312C2(國際公布號WO98/06842)、和TR12、及可溶性形式的CD154、CD70、和CD153。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸與血管發(fā)生性蛋白質(zhì)聯(lián)合施用?？膳c本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸聯(lián)合施用的血管發(fā)生性蛋白質(zhì)包括但不限于神經(jīng)膠質(zhì)衍生生長因子(GDGF)，公開于歐洲專利號EP-399816；血小板衍生生長因子(PDGF-A)，公開于歐洲專利號EP-682110；血小板衍生生長因子-B(PDGF-B)，公開于歐洲專利號EP-282317；胎盤生長因子(PIGF)，公開于國際公布號WO92/06194；胎盤生長因子-2(PIGF-2)，公開于Hauser等人，GrowthFactors4259-268，1993)；血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，公開于國際公布號WO90/13649；血管內(nèi)皮生長因子-A(VEGF-A)，公開于歐洲專利號EP-506477；血管內(nèi)皮生長因子-2(VEGF-2)，公開于國際公布號WO96/39515；血管內(nèi)皮生長因子B(VEGF-3)；血管內(nèi)皮生長因子B-186(VEGF-B186)，公開于國際公布號WO96/26736；血管內(nèi)皮生長因子-D(VEGF-D)，公開于國際公布號WO98/02543；血管內(nèi)皮生長因子-D(VEGF-D)，公開于國際公布號WO98/07832；和血管內(nèi)皮生長因子-E(VEGF-E)，公開于德國專利號DE19639601。將上述參考文獻(xiàn)完整引入本文作為參考。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸與成纖維細(xì)胞生長因子聯(lián)合施用?？膳c本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸聯(lián)合施用的成纖維細(xì)胞生長因子包括但不限于FGF-1、FGF-2、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6、FGF-7、FGF-8、FGF-9、FGF-10、FGF-11、FGF-12、FGF-13、FGF-14和FGF-15。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸與造血生長因子聯(lián)合施用?？膳c本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸聯(lián)合施用的造血生長因子包括但不限于粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)(沙格司亭，sargramostim，LEUKINETM，PROKINETM)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)(非格司亭，filgrastim，NEUPOGENTM)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF、CSF-1)、紅細(xì)胞生成素(阿法依泊汀，epoetinalfa，EPOGENTM，PROSCRITTM)、干細(xì)胞因子(SCF、c-kit配體、青灰因子)、巨核細(xì)胞集落刺激因子、PIXY321(GMCSF/IL-3融合蛋白)、白介素尤其是IL-1至IL-12任意一種或多種、干擾素γ、或血小板生成素。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸與腎上腺素能阻斷劑聯(lián)合施用，諸如例如醋丁洛爾(acebutolol)、阿替洛爾(atenolol)、倍他洛爾(betaxolol)、比索洛爾(bisoprolol)、卡替洛爾(carteolol)、拉貝洛爾(labetalol)、美托洛爾(metoprolol)、納多洛爾(nadolol)、氧烯洛爾(oxprenolol)、噴布洛爾(penbutolol)、吲哚洛爾(pindolol)、普萘洛爾(propranolol)、索他洛爾(sotalol)和噻嗎洛爾(timolol)。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸與抗心律不齊藥聯(lián)合施用(例如腺苷、amidoarone、溴卞銨(bretylium)、洋地黃(digitalis)、地高辛(digoxin)、洋地黃毒苷(digitoxin)、diliazem、雙異丙吡胺、艾司洛爾(esmolol)、氟卡尼(flecainide)、利多卡因(lidocaine)、美西律(mexiletine)、莫雷西嗪(moricizine)、苯妥英(phenytoin)、普魯卡因酰胺(procainamide)、N-乙酰普魯卡因酰胺、普羅帕酮(propafenone)、普萘洛爾、奎尼丁(quinidine)、索他洛爾、妥卡尼(tocainide)、和維拉帕米(verapamil))。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸與利尿劑聯(lián)合施用，諸如碳酸酐酶抑制劑(例如乙酰唑胺、二氯磺胺(dichlorphenamide)、和醋甲唑胺)、滲透壓性利尿劑(例如甘油、異山梨醇、甘露醇、和尿素)、抑制Na+-K+-2Cl-同向轉(zhuǎn)運(yùn)的利尿劑(例如呋塞米、布美他尼、阿佐塞米、吡咯他尼、曲帕胺、依他尼酸、莫唑胺、和托塞米)、噻嗪和噻嗪樣利尿劑(例如芐氟噻嗪、芐噻嗪、氯噻嗪、氫氯噻嗪、氫氟噻嗪、甲氯噻嗪、多噻嗪、三氯噻嗪、氯噻酮、吲達(dá)帕胺、美托拉宗、和喹乙宗)、保鉀利尿劑(例如阿米洛利和氨苯蝶啶)、和鹽皮質(zhì)素受體拮抗劑(例如螺內(nèi)酯、坎利酮、和坎利酸鉀)。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸與內(nèi)分泌和/或激素失衡紊亂的治療聯(lián)合施用。內(nèi)分泌和/或激素失衡紊亂的治療包括但不限于127I、碘的放射性同位素諸如131I和123I；重組生長激素，諸如HUMATROPETM(重組促生長素)；生長激素類似物，諸如PROTROPINTM(人蛋氨生長素)；多巴胺激動劑，諸如PARLODELTM(溴隱亭)；生長激素抑制素類似物，諸如SANDOSTATINTM(奧曲肽)；促性腺激素制品，諸如PREGNYLTM、A.P.L.TM和PROFASITM(絨毛膜促性腺激素(CG))、PERGONALTM(絕經(jīng)促性素)、和METRODINTM(尿促卵泡素(uFSH))；合成人促性腺激素釋放激素制品，諸如FACTRELTM和LUTREPULSETM(鹽酸戈那瑞林)；合成促性腺激素激動劑，諸如LUPRONTM(醋酸亮丙瑞林)、SUPPRELINTM(醋酸組氨瑞林)、SYNARELTM(醋酸那法瑞林)、和ZOLADEXTM(醋酸戈舍瑞林)；促甲狀腺激素釋放激素合成制品，諸如RELEFACTTRHTM和THYPINONETM(普羅瑞林)；重組人TSH，諸如THYROGENTM；甲狀腺激素天然異構(gòu)體鈉鹽合成制品，諸如L-T4TM、SYNTHROIDTM和LEVOTHROIDTM(左旋甲狀腺素鈉，levothyroxine)、L-T3TM、CYTOMELTM和TRIOSTATTM(碘甲腺氨酸鈉，liothyroinesodium)、及THYROLARTM(復(fù)方甲狀腺素，liotrix)；抗甲狀腺化合物，諸如6-n-丙基硫尿嘧啶(丙基硫尿嘧啶)、1-甲基-2-疏基咪唑和TAPAZOLETM(甲硫咪唑)、NEO-MERCAZOLETM(卡比馬唑)；β-腎上腺素能受體拮抗劑，諸如普萘洛爾(Propranolol)和艾司洛爾(esmolol)；Ca2+通道阻斷劑；地塞米松和碘化放射學(xué)對比劑，諸如TELEPAQUETM(碘番酸)和ORAGRAFINTM(碘泊酸鈉)。內(nèi)分泌和/或激素失衡紊亂的其它治療包括但不限于雌激素或綴合雌激素，諸如ESTRACETM(雌二醇)、ESTINYLTM(乙炔雌二醇)、PREMARINTM、ESTRATABTM、ORTHO-ESTM、OGENTM和哌嗪雌酮硫酯(雌酮)、ESTROVISTM(炔雌醚)、ESTRADERMTM(雌二醇)、DELESTROGENTM和VALERGENTM(戊酸雌二醇)、DEPO-ESTRADIOLCYPIONATETM和ESTROJECTLATM(環(huán)戊丙酸雌二醇)；抗雌激素，諸如NOLVADEXTM(他莫西芬)、SEROPHENETM和CLOMIDTM(克羅米酚)；孕酮，諸如DURALUTINTM(己酸羥基孕酮)、MPATM和DEPO-PROVERATM(醋酸甲孕酮)、PROVERATM和CYCRINTM(MPA)、MEGACETM(醋酸甲地孕酮)、NORLUTINTM(炔諾酮)、及NORLUTATETM和AYGESTINTM(醋酸炔諾酮)；孕酮植入物，諸如NORPLANTSYSTEMTM(炔諾孕酮的皮下植入物)；抗孕酮，諸如RU486TM(米非司酮)；激素避孕藥，諸如ENOVIDTM(異炔諾酮加美雌醇)、PROGESTASERTTM(釋放孕酮的子宮內(nèi)避孕裝置)、LOESTRINTM、BREVICONTM、MODICONTM、GENORATM、NELONATM、NORINYLTM、OVACON-35TM和OVACON-50TM(乙炔雌二醇/炔諾酮)、LEVLENTM、NORDETTETM、TRI-LEVLENTM和TRIPHASIL-21TM(乙炔雌二醇/左炔諾孕酮)、LO/OVRALTM和OVRALTM(乙炔雌二醇/炔諾孕酮)、DEMULENTM(乙炔雌二醇/雙醋炔諾醇)、NORINYLTM、ORTHO-NOVUMTM、NORETHINTM、GENORATM、和NELOVATM(炔諾酮/美雌醇)、DESOGENTM和ORTHO-CEPTTM(乙炔雌二醇/去氧孕烯)、ORTHO-CYCLENTM和ORTHO-TRICYCLENTM(乙炔雌二醇/諾孕酯)、MICRONORTM和NOR-QDTM(炔諾酮)、和OVRETTETM(炔諾孕酮)。內(nèi)分泌和/或激素失衡紊亂的其它治療包括但不限于睪酮酯，諸如醋酸美替諾龍和十一酸睪酮；腸胃外和口服雄激素，諸如TESTOJECT-50TM(睪酮)、TESTEXTM(丙酸睪酮)、DELATESTRYLTM(庚酸睪酮)、DEPO-TESTOSTERONETM(環(huán)戊丙酸睪酮)、DAQNOCRINETM(丹那唑)、HALOTETINTM(氟甲睪酮)、ORETONMETHYLTM、TESTREDTM和VIRILONTM(甲睪酮)、和OXANDRINTM(氧雄龍)；睪酮透皮系統(tǒng)，諸如TESTODERMTM；雄激素受體拮抗劑和5-α-還原酶抑制劑，諸如ANDROCURTM(醋酸環(huán)丙孕酮)、EULEXINTM(氟他胺)、和PROSCARTM(非那雄胺)；促腎上腺皮質(zhì)激素制品，諸如CORTROSYNTM(cosyntropin)；腎上腺皮質(zhì)類固醇及其合成類似物，諸如ACLOVATETM(二丙酸阿氯米松)、CYCLOCORTTM(安西奈德)、BECLOVENTM和VANCERILTM(二丙酸倍氯米松)、CELESTONETM(倍他米松)、BENISONETM和UTICORTM(苯甲酸倍他米松)、DDIPROSONETM(二丙酸倍他米松)、CELESTONEPHOSPHATETM(倍他米松磷酸鈉)、CELESTONESOLUSPANTM(倍他米松磷酸和醋酸鈉)、BETA-VALTM和VALISONETM(戊酸倍他米松)、TEMOVATETM(丙酸氯倍他索)、CLODERMTM(三甲基乙酸氯可托龍)、CORTEFTM和HYDROCORTONETM(皮質(zhì)醇(氫化可的松))、HYDROCORTONEACETATETM(醋酸皮質(zhì)醇(氫化可的松))、LOCOIDTM(丁酸皮質(zhì)醇(氫化可的松))、HYDROCORTONEPHOSPHATETM(皮質(zhì)醇(氫化可的松)磷酸鈉)、A-HYDROCORTTM和SOLUCORTEFTM(皮質(zhì)醇(氫化可的松)琥珀酸鈉)、WESTCORTTM(戊酸皮質(zhì)醇(氫化可的松))、CORTISONEACETATETM(醋酸可的松)、DESOWENTM和TRIDESILONTM(地奈德)、TOPICORTTM(去羥米松)、DECADRONTM(地塞米松)、DECADRONLATM(醋酸地塞米松)、DECADRONPHOSPHATETM和HEXADROLPHOSPHATETM(地塞米松磷酸鈉)、FLORONETM和MAXIFLORTM(二乙酸二氟拉松)、FLORINEFACETATETM(醋酸氟氫可的松)、AEROBIDTM和NASALIDETM(氟尼縮松)、FLUONIDTM和SYNALARTM(氟輕松)、LIDEXTM(醋酸氟輕松)、FLUOR-OPTM和FMLTM(氟米龍)、CORDRANTM(氟氫縮松)、HALOGTM(哈西奈德)、HMSLIZUIFILMTM(甲羥松)、MEDROLTM(甲潑尼龍)、DEPO-MEDROLTM和MEDROLACETATETM(醋酸甲潑尼龍)、A-METHAPREDTM和SOLUMEDROLTM(甲潑尼龍琥珀酸鈉)、ELOCONTM(糠酸莫米松)、HALDRONETM(醋酸帕拉米松)、DELTA-COITEFTM(潑尼松龍)、ECONOPREDTM(醋酸潑尼松龍)、HYDELTRASOLTM(潑尼松龍磷酸鈉)、HYDELTRA-T.B.ATM(叔丁基醋酸潑尼松龍)、DELTASONETM(潑尼松)、ARISTOCORTTM和KENACORTTM(曲安西龍)、KENALOGTM(曲安奈德)、ARISTOCORTTM和KENACORTDIACETATETM(雙醋酸曲安西龍)、和ARISTOSPANTM(己曲安奈德)；腎上腺皮質(zhì)類固醇生物合成與作用的抑制劑，諸如CYTADRENTM(氨魯米特)、NIZORALTM(酮康唑)、MODRASTANETM(曲洛司坦)、和METOPIRONETM(美替拉酮)；牛、豬、或人胰島素或其混合物；胰島素類似物；重組人胰島素，諸如HUMULINTM和NOVOLINTM；口服降血糖藥，諸如ORAMIDETM和ORINASETM(甲苯磺丁脲)、DIABINESETM(氯磺丙脲)、TOLAMIDETM和TOLINASETM(妥拉磺脲)、DYMELORTM(醋酸己脲)、格列本脲、MICRONASETM、DIBETATM和GLYNASETM(格列苯脲)、GLUCOTROLTM(格列吡嗪)、和DIAMICRONTM(格列齊特)、GLUCOPHAGETM(甲福明)、環(huán)格列酮、吡格列酮、和α-葡萄糖苷酶抑制劑；?；蜇i胰高血糖素；促生長素抑制素，諸如SANDOSTATINTM(奧曲肽)；和二氮嗪，諸如PROGLYCEMTM(二氮嗪)。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸與子宮活動性紊亂的治療聯(lián)合施用。子宮活動性紊亂的治療包括但不限于雌激素藥物，諸如綴合雌激素(例如PREMARIN_和ESTRATAB_)、雌二醇(例如CLIMARA_和ALORA_)、哌嗪雌酮硫酯、和氯烯雌醚；孕酮藥物(例如AMEN_(甲羥孕酮)、MICRONOR_(醋酸炔諾酮)、PROMETRIUM_孕酮、和醋酸甲地孕酮)；以及雌激素/孕酮聯(lián)合療法，諸如例如綴合雌激素/甲羥孕酮(例如PREMPROTM和PREMPHASE_)和醋酸炔諾酮/乙炔雌二醇(例如FEMHRTTM)。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸與治療缺鐵性和低血色素性貧血有效的藥物聯(lián)合施用，包括但不限于硫酸亞鐵(鐵硫酸鹽，F(xiàn)EOSOLTM)、富馬酸亞鐵(例如FEOSTATTM)、葡萄糖酸亞鐵(例如FERGONTM)、多糖-鐵復(fù)合物(例如NIFEREXTM)、鐵右旋糖苷注射液(例如INFEDTM)、硫酸酮、吡哆醇(pyroxidine)、核黃素、維生素B12、氰鈷胺注射液(例如REDISOLTM、RUBRAMINPCTM)、羥鈷胺素、葉酸(例如FOLVITETM)、甲酰四氫葉酸(亞葉酸，5-CHOH4PteGlu，亞葉酸鈣)或WELLCOVORIN(甲酰四氫葉酸的鈣鹽)、轉(zhuǎn)鐵蛋白或鐵蛋白。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸與用于治療精神紊亂的藥劑聯(lián)合施用?？膳c本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸聯(lián)合施用的精神病藥物包括但不限于安定藥(例如氯丙嗪、氯普噻噸、氯氮平、氟奮乃靜、氟哌啶醇、洛沙平、美索達(dá)嗪、嗎茚酮、奧氮平、奮乃靜、匹莫齊特、奎硫平、利培酮、硫利達(dá)嗪、替奧噻噸、三氟拉嗪、和三氟丙嗪)、抗狂躁藥(例如卡馬西平、雙丙戊酸鈉、碳酸鋰、和檸檬酸鋰)、抗抑郁藥(例如阿米替林、阿莫沙平、丁氨苯丙酮、西酞普蘭、氯米帕明、地昔帕明、多塞平、氟伏沙明、氟西汀、丙米嗪、異卡波肼、馬普替林、米氮平、萘法唑酮、去甲替林、帕羅西汀、苯乙肼、普羅替林、舍曲林、反苯環(huán)丙胺、曲唑酮、曲米帕明、和丈拉法辛)、抗焦慮藥(例如阿普唑侖、丁螺環(huán)酮、氯地庚波、氯氮卓、地西泮、哈拉西泮、勞拉西泮、奧沙西泮、和普拉西泮)、和興奮劑(例如d-苯丙胺、哌甲酯、和匹莫林)。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸與用于治療神經(jīng)學(xué)紊亂的藥劑聯(lián)合施用?？膳c本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸聯(lián)合施用的神經(jīng)學(xué)藥劑包括但不限于抗癲癇藥(例如卡馬西平、氯硝西泮、乙琥胺、苯巴比妥、苯妥英、撲米酮、丙戊酸、雙丙戊酸鈉、非爾氨酯、加巴噴丁、拉莫三嗪、左乙拉西坦、奧卡西平、噻加賓、托吡酯、唑尼沙胺、地西泮、勞拉西泮、和氯硝西泮)、抗帕金森病藥(例如左旋多巴/卡比多巴、司來吉蘭、金剛烷胺、溴隱亭、培高利特、羅匹尼羅、普拉克索、苯扎托品；比哌立登；愛普巴嗪；丙環(huán)定；苯海索、托卡朋)、和ALS治療劑(例如利魯唑)。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸與血管舒張劑和/或鈣通道阻斷劑聯(lián)合施用?？膳c本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸聯(lián)合施用的血管舒張劑包括但不限于血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)抑制劑(例如罌粟堿、異克舒令、貝那普利、卡托普利、西拉普利、依那普利、依那普利拉、福辛普利、賴諾普利、莫昔普利、培哚普利、喹那普利、雷米普利、螺普利、群多普利、和布酚寧)、和硝酸酯(例如二硝酸異山梨酯、單硝酸異山梨酯、和硝酸甘油)?？膳c本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸聯(lián)合施用的鈣通道阻斷劑的例子包括但不限于氨氯地平、芐普地爾、地爾卓爾、非洛地平、氟桂利嗪、伊拉地平、尼卡地平、硝苯地平、尼莫地平、和維拉帕米。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸與胃腸紊亂的治療劑聯(lián)合施用?？膳c本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸聯(lián)合施用的胃腸紊亂的治療劑包括但不限于H2組胺受體拮抗劑(例如TAGAMETTM(西米替丁)、ZANTACTM(雷尼替丁)、PEPCTDTM(法莫替丁)、和AXIDTM(尼扎替丁))；H+、K+ATP酶抑制劑(例如PREVACIDTM(蘭索拉唑)和PRILOSECTM(奧美拉唑))；鉍化合物(例如PEPTO-BISMOLTM(堿式水楊酸鉍)和DE-NOLTM(堿式檸檬酸鉍))；各種抗酸藥；硫糖鋁；前列腺素類似物(例如，CYTOTECTM(米索前列醇))；毒蕈堿膽堿能拮抗劑；輕瀉藥(例如表面活性劑輕瀉藥、刺激性輕瀉藥、鹽水和滲透性輕瀉藥)；止瀉藥(例如LOMOTILTM(地芬諾酯)、MOTOFENTM(diphenoxin)、和IMODIUMTM(鹽酸洛哌丁胺))、促生長素抑制素的合成類似物，諸如SANDOSTATINTM(奧曲肽)、止吐藥(例如ZOFRANTM(昂丹司瓊)、KYTRILTM(鹽酸格拉司瓊)、托烷司瓊、多拉司瓊、甲氧氯普胺、氯丙嗪、奮乃靜、丙氯拉嗪、異丙嗪、硫乙拉嗪、三氟丙嗪、多潘立酮、氟哌啶醇、氟哌利多、曲美芐胺、地塞米松、甲潑尼龍、屈大麻酚、和大麻龍)；D2拮抗劑(例如甲氧氯普胺、曲美芐胺和氯丙嗪)；膽鹽；鵝去氧膽酸；熊去氧膽酸；和胰腺酶制品，諸如胰酶和胰脂肪酶。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸與其它治療性或預(yù)防性方案諸如例如放療聯(lián)合施用。本發(fā)明還提供了包括一個或多個容器的制藥學(xué)包裝或試劑盒，所述容器中裝有一種或多種包含本發(fā)明清蛋白融合蛋白的藥物組合物的成分。任選的是，與這樣的容器一起提供由政府行政機(jī)構(gòu)頒布的規(guī)范藥品或生物學(xué)產(chǎn)品的生產(chǎn)、使用或銷售的通告，該通告反映了行政機(jī)構(gòu)對人體施藥的生產(chǎn)、使用或銷售的批準(zhǔn)?；虔煼ň幋a本發(fā)明清蛋白融合蛋白的構(gòu)建體可作為基因治療方案的一部分用于投遞治療有效劑量的清蛋白融合蛋白。用于在體內(nèi)將核酸導(dǎo)入細(xì)胞的優(yōu)選方法是通過使用包含編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的核酸的病毒載體。用病毒載體感染細(xì)胞的優(yōu)勢是大部分靶細(xì)胞都能夠獲得所述核酸。另外，病毒載體內(nèi)例如由病毒載體所含cDNA編碼的分子在攝取病毒載體核酸的細(xì)胞中有效表達(dá)。逆轉(zhuǎn)錄病毒和腺伴隨病毒載體可作為重組基因投遞系統(tǒng)用于在體內(nèi)轉(zhuǎn)移編碼清蛋白融合蛋白的外源核酸分子。這些載體將核酸有效投遞到細(xì)胞中，且轉(zhuǎn)染核酸穩(wěn)定整合到宿主染色體DNA中。只產(chǎn)生復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒的專用細(xì)胞系(稱為“包裝細(xì)胞”)的開發(fā)增加了逆轉(zhuǎn)錄病毒在基因療法中的效用，而所鑒定的缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒用于基因療法目的的基因轉(zhuǎn)移(綜述參見Miller，A.D.，Blood76271，1990)。通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒可包裝成病毒粒子，它可通過輔助病毒的使用而用于感染靶細(xì)胞。用于生成重組逆轉(zhuǎn)錄病毒和用于在體外或體內(nèi)用這種病毒感染細(xì)胞的方案可參見《CurrentProtocolsinMolecularBiology》，Ausubel，F(xiàn).M.等人編，GreenePublishingAssociates，1989，Sections9.10-9.14及其它標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)指南。可用于本發(fā)明的另一種病毒基因投遞系統(tǒng)使用腺病毒衍生的載體?？梢赃@樣操作腺病毒的基因組使之編碼并表達(dá)目的基因產(chǎn)物，但滅活其在正常溶胞性病毒生命周期中復(fù)制的能力。參見例如Berkner等人，BioTechniques6616，1988；Rosenfeld等人，Science252431-434，1991；及Rosenfeld等人，Cell68143-155，1992。衍生自腺病毒株Ad5型d1324或其它腺病毒株(例如Ad2、Ad3、Ad7等)的合適腺病毒載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知道的。在某些情況中重組腺病毒是有優(yōu)勢的，因?yàn)樗鼈儾荒芨腥静环至鸭?xì)胞，且可用于感染多種多樣的細(xì)胞類型，包括上皮細(xì)胞(Rosenfeld等人，1992，引用同上)。此外，病毒顆粒相對穩(wěn)定，且易于純化和濃縮，且如上所述，可將改造以影響其感染譜。另外，導(dǎo)入的腺病毒DNA(及其中所含的外源DNA)不整合到宿主細(xì)胞基因組中，仍然作為附加體，從而避免了在導(dǎo)入的DNA整合到宿主基因組中(例如逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA)的情況中因插入誘變而發(fā)生的潛在問題。另外，腺病毒基因組攜帶外來DNA的能力相對于其它基因投遞載體是大的(可達(dá)8千堿基)(Berkner等人，引用同上；Haj-Ahmand等人，J.Virol.57267，1986)。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的非病毒基因投遞系統(tǒng)依賴于靶細(xì)胞攝取主題核苷酸分子的細(xì)胞內(nèi)吞途徑。這種類型的例示性基因投遞系統(tǒng)包括脂質(zhì)體衍生系統(tǒng)、多賴氨酸綴合物、及人工病毒包膜。在一個代表性實(shí)施方案中，可將編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的核酸分子捕獲到其表面帶正電荷且(任選)用針對靶組織細(xì)胞表面抗原的抗體加標(biāo)簽的脂質(zhì)體中(例如Iipofectin)(Mizuno等人，NoShinkeiGeka20547-551，1992；PCT公布WO91/06309；日本專利申請1047381；及歐洲專利公布EP-A-43075)?？梢酝ㄟ^多種方法將編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的基因的基因投遞系統(tǒng)導(dǎo)入到患者。例如，可以通過例如靜脈內(nèi)注射系統(tǒng)導(dǎo)入基因投遞系統(tǒng)的藥學(xué)制備物，而靶細(xì)胞中蛋白質(zhì)的特異轉(zhuǎn)導(dǎo)主要由基因投遞媒介提供的轉(zhuǎn)染特異性、可歸于控制受體基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列的細(xì)胞類型或組織類型表達(dá)或其組合而發(fā)生。在其它實(shí)施方案中，重組基因的最初投遞更多限制于相當(dāng)局部的導(dǎo)入動物。例如，可通過導(dǎo)管(參見美國專利5,328,470)或通過定向注射(例如Chen等人，PNAS913054-3057，1994)來導(dǎo)入基因投遞媒介。基因治療構(gòu)建體的藥學(xué)制備物可本質(zhì)上由可接受稀釋劑中的基因投遞系統(tǒng)組成，或者可包含其中埋有基因投遞媒介的緩釋基質(zhì)。在可以由重組細(xì)胞生成完整清蛋白融合蛋白時，例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，藥學(xué)制備物可包含生成清蛋白融合蛋白的一種或多種細(xì)胞。其它基因療法本發(fā)明還涵蓋用于治療或預(yù)防紊亂、疾病和狀況的基因療法。基因療法涉及將核酸(DNA、RNA和反義DNA或RNA)序列導(dǎo)入動物以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明清蛋白融合蛋白的表達(dá)。此方法要求編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸與啟動子和靶組織表達(dá)融合蛋白所必需的任何其它基因元件可操作連接。這樣的基因治療和投遞技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，參見例如WO90/11092，將其引入本文作為參考。因此，例如，可以用包含與編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可操作連接的啟動子的多核苷酸(DNA或RNA)離體改造來自患者的細(xì)胞，然后將經(jīng)過改造的細(xì)胞提供給將用本發(fā)明清蛋白融合蛋白治療的患者。這樣的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。例如，參見Belldegrun，A.等人，J.Natl.CancerInst.85207-216，1993；Ferrantini，M.等人，CancerResearch531107-1112，1993；Ferrantini，M.等人，J.Immunology1534604-4615，1994；Kaido，T.等人，Int.J.Cancer60221-229，1995；Ogura，H.等人，CancerResearch505102-5106，1990；Santodonato，L.等人，HumanGeneTherapy71-10，1996；Santodonato，L.等人，GeneTherapy41246-1255，1997；及Zhang，J.-F.等人，CancerGeneTherapy331-38，1996，將其引入本文作為參考。在一個實(shí)施方案中，進(jìn)行改造的細(xì)胞是動脈細(xì)胞?？梢酝ㄟ^直接注射到動脈中、動脈周圍的組織中或者通過導(dǎo)管注射將動脈細(xì)胞重新導(dǎo)入患者。正如下文更詳細(xì)的討論，可以通過投遞可注射材料的任何方法將多核苷酸構(gòu)建體投遞給動物細(xì)胞，諸如注射到組織(心、肌肉、皮膚、肺、肝等等)胞間隙。多核苷酸構(gòu)建體可以在制藥學(xué)可接受液體或水性載體中投遞。在一個實(shí)施方案中，編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸作為裸露的多核苷酸投遞。術(shù)語“裸露”的多核苷酸、DNA或RNA指序列游離于輔助、促進(jìn)或加速進(jìn)入細(xì)胞的任何投遞媒介，包括病毒序列、病毒顆粒、脂質(zhì)體制劑、脂轉(zhuǎn)染或沉淀試劑等。然而，編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸也可以在可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法制備的脂質(zhì)體制劑和脂轉(zhuǎn)染制劑等中投遞。例如美國專利號5,593,972、5,589,466、和5,580,859中描述了這樣的方法，將其引入本文作為參考。用于基因療法的多核苷酸載體構(gòu)建物優(yōu)選既不會整合到宿主基因組中也不含允許復(fù)制的序列的構(gòu)建體。合適的載體包括可從Stratagene獲得的pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1和pSG；可從Pharmacia獲得的pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL；及可從Invitrogen獲得的pEF1/V5、pcDNA3.1和pRc/CMV2。其它合適的載體對于熟練技術(shù)人員而言是顯而易見的。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的任何強(qiáng)啟動子均可用于驅(qū)動多核苷酸序列的表達(dá)。合適的啟動子包括腺病毒啟動子，諸如腺病毒主要晚期啟動子；或異源啟動子，諸如細(xì)胞巨化病毒(CMV)啟動子；呼吸道合胞病毒(RSV)啟動子；誘導(dǎo)型啟動子，諸如MMT啟動子、金屬硫蛋白啟動子；熱休克啟動子；清蛋白啟動子；ApoAI啟動子；人球蛋白啟動子；病毒胸苷激酶啟動子，諸如單純皰疹胸苷激酶啟動子；逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR；b-肌動蛋白啟動子；及人生長激素啟動子。啟動子對于與本發(fā)明清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分對應(yīng)的基因來說也可以是天然的啟動子。與其它基因治療技術(shù)不同，將裸落的核酸序列導(dǎo)入靶細(xì)胞的一個主要優(yōu)點(diǎn)是細(xì)胞中多核苷酸合成的短暫性質(zhì)。研究表明可以將非復(fù)制DNA序列導(dǎo)入細(xì)胞，從而在可長達(dá)6個月的期間提供期望多肽的生成?？梢詫⒍嗪塑账針?gòu)建物投遞至動物的組織胞間隙，包括肌肉、皮膚、腦、肺、肝、脾、骨髓、胸腺、心、淋巴、血液、骨、軟骨、胰、腎、膽囊、胃、腸、睪丸、卵巢、子宮、直腸、神經(jīng)系統(tǒng)、眼、腺、和結(jié)締組織。組織胞間隙包括細(xì)胞間、液體、器官組織的網(wǎng)狀纖維間的粘多糖層、管壁或室壁中的彈性纖維、纖維組織的膠原纖維、或者納入肌細(xì)胞的結(jié)締組織或骨隙中的相同基質(zhì)。由循環(huán)血漿和淋巴管道的淋巴液占據(jù)的空間也類似。由于下面討論的原因優(yōu)選投遞至肌肉組織胞間隙。它們可以通過注射方便的投遞至包含這些細(xì)胞的組織。它們優(yōu)選投遞至持久的、不分裂的已分化細(xì)胞并在其中表達(dá)，盡管投遞和表達(dá)可以在未分化或者分化較不完全的細(xì)胞，諸如例如血液的干細(xì)胞或皮膚成纖維細(xì)胞中完成。在體內(nèi)肌肉細(xì)胞在它們攝取和表達(dá)多核苷酸的能力方面特別勝任有效。對于裸露核酸序列注射，DNA或RNA的有效劑量將在約0.05g/kg體重至約50mg/kg體重的范圍內(nèi)。優(yōu)選的是，劑量將是約0.005mg/kg至約20mg/kg且更優(yōu)選約0.05mg/kg至約5mg/kg。當(dāng)然，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將領(lǐng)會，這個劑量將隨著注射的組織部位而變化。核酸序列的適當(dāng)且有效的劑量可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易的確定，而且可能取決于治療的狀況和施藥途徑。優(yōu)選的施藥途徑是通過腸胃外注射途徑至組織胞間隙中。然而，也可以使用其它腸胃外途徑，諸如氣霧劑吸入，特別適用于投遞至肺或支氣管組織、喉或鼻粘膜。此外，裸露DNA構(gòu)建物可在血管成形術(shù)過程中通過程序中使用的導(dǎo)管投遞至動脈。通過本領(lǐng)域知道的任何方法投遞裸露的多核苷酸，包括不限于投遞部位的直接針注射、靜脈內(nèi)注射、局部施用、導(dǎo)管灌輸、及所謂的“基因槍”。這些投遞方法是本領(lǐng)域已知的。也可以用投遞媒介諸如病毒序列、病毒顆粒、脂質(zhì)體制劑、脂轉(zhuǎn)染、沉淀試劑等投遞構(gòu)建體。這些投遞方法是本領(lǐng)域已知的。在某些實(shí)施方案中，將多核苷酸構(gòu)建體復(fù)合到脂質(zhì)體制備物中。用于本發(fā)明的脂質(zhì)體制備物包括陽離子(帶正電荷的)、陰離子(帶負(fù)電荷的)和中性制備物。然而，特別優(yōu)選陽離子脂質(zhì)體，因?yàn)榭梢栽陉栯x子脂質(zhì)體和多陰離子核酸之間形成緊密的電荷復(fù)合體。已經(jīng)顯示了陽離子脂質(zhì)體以功能性形式介導(dǎo)質(zhì)粒DNA(Feigner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA847413-7416，1987，將其引入本文作為參考)；mRNA(Malone等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA866077-6081，1989，將其引入本文作為參考)；和純化的轉(zhuǎn)錄因子(Debs等人，J.Biol.Chem.26510189-10192，1990，將其引入本文作為參考)的細(xì)胞內(nèi)投遞。陽離子脂質(zhì)體易于獲得。例如，N[1-2，3-二油基氧]丙基]-N，N，N-三乙基銨(DOTMA)脂質(zhì)體特別有用，且可從GIBCOBRL，GrandIsland，N.Y.獲得，商標(biāo)為Lipofectin(也可參見Felgner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA847413-7416，1987，將其引入本文作為參考)。其它商品化脂質(zhì)體包括transfectace(DDAB/DOPE)和DOTAP/DOPE(Boehringer)。其它陽離子脂質(zhì)體可以使用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)由易于獲得的材料制備。參見例如PCT公布號WO90/11092(將其引入本文作為參考)所描述的DOTAP(1，2-二(油酰氧)-3-(三甲銨)丙烷)脂質(zhì)體的合成。文獻(xiàn)中描述了DOTMA脂質(zhì)體的制備，參見例如P.Felgner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA847413-7417，將其引入本文作為參考。類似方法可用于由其它陽離子脂質(zhì)材料制備脂質(zhì)體。類似的，陰離子和中性脂質(zhì)體也易于獲得，諸如從AvantiPolarLipids(Birmingham，Ala.)獲得，或者可以用易于獲得的材料容易的制備。這樣的材料包括磷脂酰膽堿、膽固醇、磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰膽堿(DOPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)等。這些材料還可與DOTMA和DOTAP起始材料以適當(dāng)比例混合。用這些材料制備脂質(zhì)體的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。例如，在商業(yè)上二油酰磷脂酰膽堿(DOPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)和二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)可以不同組合用于制備常規(guī)脂質(zhì)體，可以添加或不添加膽固醇。因此，例如，可以通過將各50mgDOPG和DOPC在氮?dú)饬飨略诔曁幚砥恐懈稍飦碇苽銬OPG/DOPC脂質(zhì)體。將樣品置于真空泵下過夜，第二天用去離子水水合。然后將樣品在蓋蓋的瓶中用配備有倒置杯(水浴型)探針的350型HeatSystems超聲儀以最大設(shè)置超聲處理2小時，同時水浴以15℃循環(huán)?；蛘?，可以不用超聲處理產(chǎn)生多層囊泡或者通過擠出核孔膜產(chǎn)生大小各異的單層囊泡來制備帶負(fù)電荷的囊泡。本領(lǐng)域技術(shù)人員還知道且可利用其它方法。脂質(zhì)體可包含多層囊泡(MLV)、小單層囊泡(SUV)、或大單層囊泡(LUV)，優(yōu)選SUV。使用本領(lǐng)域眾所周知的方法制備各種脂質(zhì)體-核酸復(fù)合物。參見例如Straubinger等人，MethodsofImmunology101512-527，1983，將其引入本文作為參考。例如，可以通過將磷脂薄膜沉積在玻璃試管壁上，隨后用將要裝囊的材料的溶液水化來制備含核酸的MLV。SUV通過延長超聲處理MLV而產(chǎn)生均質(zhì)的單層脂質(zhì)體群來制備。將欲捕獲的材料加到經(jīng)過處理的MLV懸浮液中然后超聲處理。在使用含陽離子脂質(zhì)的脂質(zhì)體時，將干燥的脂質(zhì)膜重懸于適當(dāng)溶液諸如無菌水或等張緩沖液諸如10mMTris/NaCl，超聲處理，然后將經(jīng)過處理的脂質(zhì)體直接與DNA混合。由于帶正電荷的脂質(zhì)體與陽離子DNA的結(jié)合，因而脂質(zhì)體和DNA形成非常穩(wěn)定的復(fù)合物。SUV可用于核酸小片段。LUV通過本領(lǐng)域知道的許多方法制備。常用的方法包括Ca2+-EDTA螯合(Papahadiopoulos等人，Biochim.Biophys.Acta394483，1975；Wilson等人，Cell1777，1979)；醚注射(Deamer，D.和Bangham，A.，Biochim.Biophys.Acta443629，1976；Ostro等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.76836，1977；Fraley等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA763348，1979)；洗滌劑透析(Enoch，H.和Strittmatter，P，Proc.Natl.Acad.Sci.USA76145，1979)；和反相蒸餾(REV)(Fraley等人，J.Biol.Chem.25510431，1980；Szoka，F(xiàn).和Papahadjopoulos，D.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA75145，1978；Schaefer-Ridder等人，Science215166，1982)，將其引入本文作為參考。一般而言，DNA與脂質(zhì)體的比例為約10∶1至約1∶10。優(yōu)選的是，比例為約5∶1至約1∶5。更優(yōu)選的是，比例為約3∶1至約1∶3。仍然更優(yōu)選的是，比例為約1∶1。美國專利號5,676,954(將其引入本文作為參考)報導(dǎo)了為小鼠注射與陽離子脂質(zhì)體載體復(fù)合的遺傳材料。美國專利號4,897,355、4,946,787、5,049,386、5,459,127、5,589,466、5,693,622、5,580,859、5,703,055和國際公布號WO94/9469(將其引入本文作為參考)提供了用于將DNA轉(zhuǎn)染到細(xì)胞和哺乳動物中的陽離子脂質(zhì)。美國專利號5,589,466、5,693,622、5,580,859、5,703,055和國際公布號WO94/9469提供了將DNA-陽離子脂質(zhì)復(fù)合物投遞至哺乳動物的方法。在某些實(shí)施方案中，離體或在體內(nèi)用含有包含編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的序列的RNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒改造細(xì)胞?？捎善溲苌孓D(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體的逆轉(zhuǎn)錄病毒包括但不限于莫羅尼鼠白血病病毒、脾壞死病毒、勞氏肉瘤病毒、哈維肉瘤病毒、禽白血病病毒、長臂猿白血病病毒、人免疫缺陷病毒、骨髓增殖性肉瘤病毒、和乳腺腫瘤病毒。使用逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝細(xì)胞系以形成生產(chǎn)者細(xì)胞系。可轉(zhuǎn)染的包裝細(xì)胞的例子包括但不限于Miller，HumanGeneTherapy15-14，1990中描述的PE501、PA317、R-2、R-AM、PA12、T19-14X、VT-19-17-H2、RCRE、RCRIP、GP+E-86、GP+envAm12和DAN細(xì)胞系，將其完整引入本文作為參考?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域知道的任何方法用載體轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝細(xì)胞。這樣的方法包括但不限于電穿孔、利用脂質(zhì)體、和CaPO4沉淀。在一個可選方案中，可將逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體包裹在脂質(zhì)體中，或者與脂質(zhì)偶聯(lián)，然后施用于宿主。生產(chǎn)者細(xì)胞系產(chǎn)生包含編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸的感染性逆轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒。然后可以用這樣的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒在體外或在體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)真核細(xì)胞。經(jīng)過轉(zhuǎn)導(dǎo)的真核細(xì)胞將表達(dá)本發(fā)明的融合蛋白。在某些其它實(shí)施方案中，離體或在體內(nèi)用包含在腺病毒載體中的多核苷酸改造細(xì)胞?？梢赃@樣操作腺病毒使之編碼并表達(dá)本發(fā)明的融合蛋白，同時滅活其在正常溶胞性病毒生命周期中復(fù)制的能力。不需要將病毒DNA整合到宿主細(xì)胞染色體中就實(shí)現(xiàn)腺病毒表達(dá)，由此減輕了對插入誘變的擔(dān)心。此外，腺病毒用作活體腸道疫苗已經(jīng)多年，具有極好的安全特性(Schwartz等人，Am.Rev.Respir.Dis.109233-238，1974)。最后，已經(jīng)演示了腺病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移的許多實(shí)例，包括將α-1-抗胰蛋白酶和CFTR轉(zhuǎn)移至棉鼠的肺(Rosenfeld，M.A.等人，Science252431-434，1991；Rosenfeld等人，Cell68143-155，1992)。另外，試圖將腺病毒確定為人癌癥致病因子的廣泛研究一律都是否定的(Green，M.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA766606，1979)。可用于本發(fā)明的合適腺病毒載體描述于例如Kozarsky和Wilson，Curr.Opin.Genet.Devel.3499-503，1993；Rosenfeld等人，Cell68143-155，1992；Engelhardt等人，HumanGenet.Ther.4759-769，1993；Yang等人，NatureGenet.7362-369，1994；Wilson等人，Nature365691-692，1993；及美國專利號5,652,224，將其引入本文作為參考。例如，腺病毒載體Ad2是有用的，且可以在人293細(xì)胞中培養(yǎng)。這些細(xì)胞含有腺病毒的E1區(qū)，且組成性表達(dá)E1a和E1b，它們通過提供載體中刪除的基因的產(chǎn)物而彌補(bǔ)缺陷型腺病毒。除Ad2以外，其它多種腺病毒(例如Ad3、Ad5和Ad7)也可用于本發(fā)明。優(yōu)選的是，用于本發(fā)明的腺病毒是復(fù)制缺陷型的。復(fù)制缺陷型腺病毒需要輔助病毒和/或包裝細(xì)胞系的幫助來形成感染性顆粒。如此得到的病毒能夠感染細(xì)胞，并能夠表達(dá)與啟動子可操作連接的目的多核苷酸，但在大多數(shù)細(xì)胞中不能復(fù)制。復(fù)制缺陷型腺病毒可刪除了一種或多種下列基因的整個或部分E1a、E1b、E3、E4、E2a或L1至L5。在某些其它實(shí)施方案中，離體或在體內(nèi)用腺伴隨病毒(AAV)改造細(xì)胞。AAV是需要輔助病毒來產(chǎn)生感染性顆粒的天然存在缺陷型病毒(Muzyczka，N.，Curr.TopicsinMicrobiol.Immunol.15897，1992)。它還是可將其DNA整合到非分裂細(xì)胞中的少數(shù)病毒之一。含有AAV的少至300個堿基對的載體就可包裝和整合，但是供外源DNA的空間限制在約4.5kb。用于產(chǎn)生并使用這樣的AAV的方法是本領(lǐng)域知道的。參見例如美國專利號5,139,941、5,173,414、5,354,678、5,436,146、5,474,935、5,478,745和5,589,377。例如，用于本發(fā)明的合適AAV載體將包括DNA復(fù)制、殼體化、及宿主細(xì)胞整合所必需的所有序列。使用標(biāo)準(zhǔn)克隆方法將多核苷酸構(gòu)建體插入AAV載體，諸如在Sambrook等人，《MolecularCloningALaboratoryManual》，ColdSpringHarborPress，1989中所找到的。然后使用任何標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，包括脂轉(zhuǎn)染、電穿孔、磷酸鈣沉淀等，將重組AAV載體轉(zhuǎn)染到用輔助病毒感染的包裝細(xì)胞系中。合適的輔助病毒包括腺病毒、細(xì)胞巨化病毒、牛痘病毒、或皰疹病毒。一旦包裝細(xì)胞受到轉(zhuǎn)染或感染，它們將產(chǎn)生包含多核苷酸構(gòu)建體的感染性AAV病毒顆粒。然后用這些病毒顆粒離體或在體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)真核細(xì)胞。經(jīng)過轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞將含有整合到其基因組中的多核苷酸構(gòu)建體，且將表達(dá)本發(fā)明的融合蛋白。另一種基因治療方法涉及通過同源重組使異源控制區(qū)和內(nèi)源多核苷酸序列(例如編碼本發(fā)明的多肽)可操作相連(參見例如1997年6月24日發(fā)表的美國專利號5,641,670；1996年9月26日出版的國際公開號WO96/29411；1994年8月4日出版的國際公開號WO94/12650；Koller等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA868932-8935，1989；及Zijlstra等人，Nature342435-438，1989，將其引入本文作為參考)。此方法涉及靶細(xì)胞中存在的但正常情況下不在細(xì)胞中表達(dá)或以低于期望水平表達(dá)的基因的激活。用本領(lǐng)域知道的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備多核苷酸構(gòu)建體，它包含啟動子且該啟動子側(cè)翼為靶向序列。本文描述了合適的啟動子。靶向序列與內(nèi)源序列充分互補(bǔ)以允許啟動子-靶向序列與內(nèi)源序列的同源重組。靶向序列將充分接近期望內(nèi)源多核苷酸序列的5’端，使得啟動子將通過同源重組與內(nèi)源序列可操作連接?？梢訮CR擴(kuò)增啟動子和靶向序列。優(yōu)選的是，擴(kuò)增的啟動子在5’和3’端含有截然不同的限制酶位點(diǎn)。優(yōu)選的是，第一靶向序列的3’端含有與擴(kuò)增啟動子的5’端相同的限制酶位點(diǎn)，而第二靶向序列的5’端含有與擴(kuò)增啟動子的3’端相同的限制酶位點(diǎn)。消化擴(kuò)增的啟動子和靶向序列并連接到一起。將啟動子-靶向序列構(gòu)建體投遞至細(xì)胞，或者作為裸露的多核苷酸，或者與上文更詳細(xì)描述的促轉(zhuǎn)染劑諸如脂質(zhì)體、病毒序列、病毒顆粒、全病毒、脂轉(zhuǎn)染、沉淀劑等聯(lián)合。可通過任何方法投遞P啟動子-靶向序列，包括直接針注射、靜脈內(nèi)注射、局部施用、導(dǎo)管灌輸、粒子加速器等。下文更詳細(xì)的描述了這些方法。啟動子-靶向序列構(gòu)建體由細(xì)胞攝取。構(gòu)建體與內(nèi)源序列之間發(fā)生同源重組，使得內(nèi)源序列置于啟動子的控制之下。然后啟動子驅(qū)動內(nèi)源序列的表達(dá)。編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可含有促進(jìn)蛋白質(zhì)分泌的分泌信號序列。典型的，信號序列在待表達(dá)多核苷酸編碼區(qū)中朝向或位于編碼區(qū)的5’端。信號序列對于目的多核苷酸可以是同源的或異源的，且對于待轉(zhuǎn)染細(xì)胞可以是同源的或異源的。另外，信號序列可以使用本領(lǐng)域知道的方法化學(xué)合成?？梢允褂萌魏文Ｊ絹硎┯萌魏紊鲜龆嗪塑账針?gòu)建體，只要該模式導(dǎo)致一種或多種分子以足以提供治療效果的數(shù)量表達(dá)。這包括直接針注射、系統(tǒng)注射、導(dǎo)管灌輸、生物射彈注射、粒子加速器(即“基因槍”)、gelfoam海綿儲庫(depot)、其它商品化儲庫材料、滲透泵(例如Alza微型泵)、口服或栓劑固體(藥片或藥丸)藥學(xué)制劑、及手術(shù)期間傾注或局部應(yīng)用。例如，將裸露的磷酸鈣沉淀質(zhì)粒直接注射到大鼠肝和大鼠脾中或者將蛋白質(zhì)包被的質(zhì)粒直接注射到門靜脈中導(dǎo)致外源基因在大鼠肝中的基因表達(dá)(Kaneda等人，Science243375，1989)。局部施用的一種優(yōu)選方法是通過直接注射。優(yōu)選的是，將與投遞媒介復(fù)合的本發(fā)明清蛋白融合蛋白通過直接注射施用到動脈中或局部施用到動脈區(qū)域內(nèi)。將組合物局部施用到動脈區(qū)域內(nèi)指將組合物注射到動脈內(nèi)幾厘米優(yōu)選幾毫米。局部施用的另一種方法是將本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體置于手術(shù)傷口之中或周圍。例如，可給患者施行手術(shù)，并可將多核苷酸構(gòu)建體覆蓋在傷口內(nèi)的組織表面上，或者可將構(gòu)建體注射到傷口內(nèi)的組織區(qū)域中。可用于系統(tǒng)施用的治療性組合物包括與本發(fā)明靶向投遞媒介復(fù)合的本發(fā)明融合蛋白。適用于系統(tǒng)施用的投遞媒介包括包含將媒介靶向特定部位的配體的脂質(zhì)體。在具體的實(shí)施方案中，適用于系統(tǒng)施用的投遞媒介包括包含將媒介靶向特定部位的本發(fā)明清蛋白融合蛋白的脂質(zhì)體。系統(tǒng)施用的優(yōu)選方法包括靜脈內(nèi)注射、氣霧劑、口服和經(jīng)皮(局部)投遞。靜脈內(nèi)注射可用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。氣霧劑投遞也可用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行(參見例如Stribling等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA18911277-11281，1992，將其引入本文作為參考)。口服投遞可通過將本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體與能夠抵擋動物腸道中消化酶的降解的載體復(fù)合來進(jìn)行。這樣的載體的例子包括塑料膠囊或藥片，諸如本領(lǐng)域縮知道的。局部投遞可通過將本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體與能夠穿過皮膚的親脂性藥劑(例如DMSO)混合來進(jìn)行。決定物質(zhì)投遞的有效量可取決于多種因素，包括例如這些物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性、動物的年齡和體重、需要治療的確切狀況及其嚴(yán)重程度、及施藥途徑。治療的頻率取決于多種因素，諸如每次服藥施用的多核苷酸構(gòu)建物的數(shù)量、以及受試者的健康狀況和病史。主治醫(yī)師或獸醫(yī)將決定確切的用量、服藥次數(shù)、和服藥時間。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白可以施用于任何動物，優(yōu)選哺乳動物和鳥類。優(yōu)選的哺乳動物包括人、犬、貓、小鼠、大鼠、兔、綿羊、牛、馬和豬，人是特別優(yōu)選的。生物學(xué)活性本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于測試一種或多種生物學(xué)活性的測定法。如果清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸在特定測定法中顯示出活性，那些與融合蛋白對應(yīng)的治療性蛋白質(zhì)很可能涉及與該生物學(xué)活性有關(guān)的疾病。因此，所述融合蛋白可用于治療相關(guān)疾病。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涵蓋治療表1“優(yōu)選適應(yīng)癥Y”列中所列出的疾病或紊亂的方法，包括以有效治療、預(yù)防或改善所述疾病或紊亂的數(shù)量對需要這種治療、預(yù)防或改善的患者施用本發(fā)明的清蛋白融合蛋白，該清蛋白融合蛋白包含與表1“治療性蛋白質(zhì)X”列所公開的治療性蛋白質(zhì)(與表1“優(yōu)選適應(yīng)癥Y”列所列出的疾病或紊亂位于同一行)對應(yīng)的治療性蛋白質(zhì)部分。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涵蓋治療表1“優(yōu)選適應(yīng)癥Y”列對特定治療性蛋白質(zhì)所列出的疾病或紊亂的方法，包括以有效治療、預(yù)防或改善所述疾病或紊亂的數(shù)量對需要這種治療、預(yù)防或改善的患者施用本發(fā)明的清蛋白融合蛋白，該清蛋白融合蛋白包含與實(shí)施例中的適應(yīng)癥有關(guān)的治療性蛋白質(zhì)對應(yīng)的治療性蛋白質(zhì)部分。本發(fā)明明確考慮了在由編碼SEQIDNOY的多核苷酸編碼時由細(xì)胞所生成的清蛋白融合蛋白。在使用這些多核苷酸由細(xì)胞表達(dá)所編碼蛋白質(zhì)時，細(xì)胞的自然分泌和加工步驟生成了缺少表2第4和/或11列明確列出的信號序列的蛋白質(zhì)。所列信號序列的具體氨基酸序列在說明書中有顯示或是本領(lǐng)域眾所周知的。如此，本發(fā)明最優(yōu)選的實(shí)施方案包括由細(xì)胞生成的清蛋白融合蛋白(它缺少表2第4和/或11列所列出的前導(dǎo)序列)。最優(yōu)選的還有包含SEQIDNOY但不具有表2第4和/或11列所列出的前導(dǎo)序列的多肽。包含這兩個優(yōu)選實(shí)施方案的組合物，包括藥物組合物，也是優(yōu)選的。明確考慮了使用這些清蛋白融合蛋白來治療、預(yù)防或改善表1“優(yōu)選適應(yīng)癥Y”列為特定治療性蛋白質(zhì)所列出的疾病或紊亂。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的融合蛋白可用于診斷、預(yù)測、預(yù)防和/或治療與內(nèi)分泌系統(tǒng)(參見例如下文“內(nèi)分泌紊亂”部分)、神經(jīng)系統(tǒng)(參見例如下文“神經(jīng)學(xué)紊亂”部分)、免疫系統(tǒng)(參見例如下文“免疫活性”部分)、呼吸系統(tǒng)(參見例如下文“呼吸紊亂”部分)、心血管系統(tǒng)(參見例如下文“心血管紊亂”部分)、生殖系統(tǒng)(參見例如下文“生殖系統(tǒng)紊亂”部分)、消化系統(tǒng)(參見例如下文“胃腸紊亂”部分)的疾病和紊亂有關(guān)的疾病和/或紊亂、與細(xì)胞增殖有關(guān)的疾病和/或紊亂(參見例如下文“過度增殖性紊亂”部分)、和/或與血液有關(guān)的疾病或紊亂(參見例如下文“血液相關(guān)紊亂”部分)。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白可用于診斷和/或預(yù)測與其中與本發(fā)明融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分對應(yīng)的基因進(jìn)行表達(dá)的組織有關(guān)的疾病和/或紊亂。因此，本發(fā)明的融合蛋白和編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于診斷、檢測和/或治療與包括但不限于激素原激活、神經(jīng)遞質(zhì)活性、細(xì)胞信號、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、和細(xì)胞遷移的活性有關(guān)的疾病和/或紊亂。更普遍的，本發(fā)明的融合蛋白和編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于診斷、預(yù)測、預(yù)防和/或治療與下列系統(tǒng)有關(guān)的疾病和/或紊亂。免疫活性本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于通過例如激活或抑制免疫細(xì)胞的增殖、分化、或活動性(趨化性)來治療、預(yù)防、診斷和/或預(yù)測免疫系統(tǒng)的疾病、紊亂和/或狀況。免疫細(xì)胞在稱為造血作用的過程中發(fā)育，從多能干細(xì)胞產(chǎn)生骨髓(血小板、紅細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、和巨噬細(xì)胞)和淋巴(B和T淋巴細(xì)胞)細(xì)胞。這些免疫疾病、紊亂和/或狀況的病因可能是遺傳的、體細(xì)胞的(諸如癌癥和一些自身免疫病)、獲得性的(例如由化療或毒素獲得)、或傳染的。另外，本發(fā)明的融合蛋白和編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用作特定免疫系統(tǒng)疾病或紊亂的標(biāo)志物或檢測物。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治療免疫系統(tǒng)的疾病和紊亂和/或抑制或增強(qiáng)由與其中本發(fā)明多肽進(jìn)行表達(dá)的組織有關(guān)的細(xì)胞產(chǎn)生的免疫應(yīng)答。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治療、預(yù)防、診斷和/或預(yù)測免疫缺陷，包括先天性的和獲得性的兩種免疫缺陷。其中免疫球蛋白水平B細(xì)胞功能和/或B細(xì)胞數(shù)目降低的B細(xì)胞免疫缺陷的例子包括X-連鎖的無丙種球蛋白血癥(布魯頓氏病)、X-連鎖的嬰兒無丙種球蛋白血癥、X-連鎖的高IgM免疫缺陷、非X-連鎖的高IgM免疫缺陷、X-連鎖的淋巴細(xì)胞增殖綜合癥(XLP)、無丙種球蛋白血癥包括先天性和獲得性無丙種球蛋白血癥、成人期發(fā)作的無丙種球蛋白血癥、遲發(fā)性無丙種球蛋白血癥、異常丙種球蛋白血癥、低丙種球蛋白血癥、未定性的低丙種球蛋白血癥、隱性無丙種球蛋白血癥(瑞士型)、選擇性IgM缺陷、選擇性IgA缺陷、選擇性IgG亞類缺陷、IgG亞類缺陷(具有或沒有IgA缺陷)、Ig缺陷同時IgM增多、IgG和IgA缺陷同時IgM增多、抗體缺陷同時Ig正?；蛏摺g重鏈缺失、κ鏈缺陷、B細(xì)胞淋巴細(xì)胞增殖紊亂(BLPD)、常見變異型免疫缺陷(CVID)、常見變異型免疫缺陷(CVI)(獲得性)、和嬰幼兒短暫性低丙種球蛋白血癥。在具體的實(shí)施方案中，使用本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸來治療、預(yù)防、診斷和/或預(yù)測共濟(jì)失調(diào)-毛細(xì)管擴(kuò)張或與共濟(jì)失調(diào)-毛細(xì)管擴(kuò)張有關(guān)的狀況。其中T細(xì)胞和/或B細(xì)胞功能和/或數(shù)目降低的先天性免疫缺陷的例子包括但不限于迪格奧爾格異常、嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷(SCID)(包括但不限于X-連鎖的SCID、常染色體隱性SCID、腺苷脫氨酶缺陷、嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)缺陷、II類MHC缺陷(裸淋巴細(xì)胞綜合癥)、維-奧二氏綜合癥、共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)管擴(kuò)張)、胸腺發(fā)育不全、第三和第四咽囊綜合癥、22q11.2缺失、慢性粘膜皮膚假絲酵母病、天然殺傷細(xì)胞缺陷(NK)、特發(fā)性CD4+T-淋巴細(xì)胞減少、顯性T細(xì)胞缺陷(未定性)的免疫缺陷、和未定性的細(xì)胞介導(dǎo)免疫性的免疫缺陷。在具體的實(shí)施方案中，使用本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸來治療、預(yù)防、診斷和/或預(yù)測迪格奧爾格異常或與迪格奧爾格異常有關(guān)的狀況?？捎帽景l(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸治療、預(yù)防、診斷和/或預(yù)測的其它免疫缺陷包括但不限于慢性肉芽腫病、切-希二氏綜合癥、髓過氧化物酶缺陷、白細(xì)胞葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺陷、X-連鎖的淋巴細(xì)胞增殖綜合癥(XLP)、白細(xì)胞粘附缺陷、補(bǔ)體成分缺陷(包括C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8和/或C9缺陷)、網(wǎng)狀細(xì)胞發(fā)育不全、胸腺淋巴發(fā)育不全-不發(fā)育、伴有胸腺瘤的免疫缺陷、嚴(yán)重先天性白細(xì)胞減少、伴有免疫缺陷的發(fā)育異常、新生兒嗜中性白細(xì)胞減少、四肢短小性侏儒癥、及內(nèi)茲羅夫綜合癥-合并Ig免疫缺陷。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，用本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸來治療、預(yù)防、診斷和/或預(yù)測與上述免疫缺陷有關(guān)的免疫缺陷和/或狀況。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用作在免疫缺陷個體中增強(qiáng)免疫響應(yīng)性的藥劑。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用作在B細(xì)胞和/或T細(xì)胞免疫缺陷個體中增強(qiáng)免疫響應(yīng)性的藥劑。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治療、預(yù)防、診斷和/或預(yù)測自身免疫性紊亂。許多自身免疫性紊亂都是由于免疫細(xì)胞錯誤的將自身識別為外來物質(zhì)。這種錯誤識別引起導(dǎo)致宿主組織遭到破壞的免疫應(yīng)答。因此，施用能夠抑制免疫應(yīng)答特別是T細(xì)胞的增殖、分化、或趨化性的本發(fā)明融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可能是預(yù)防自身免疫性紊亂的有效治療方法?？梢杂帽景l(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸來治療、預(yù)防、診斷和/或預(yù)測的自身免疫性疾病和紊亂包括但不限于下述的一種或多種系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、多發(fā)性硬化癥、自身免疫性甲狀腺炎、橋本氏甲狀腺炎、自身免疫性溶血性貧血、溶血性貧血、血小板減少、自身免疫性血小板減少性紫癜、自身免疫性新生兒血小板減少、特發(fā)性血小板減少性紫癜、紫癜(例如亨-許二氏紫癜)、自身免疫性血細(xì)胞減少、古德帕斯丘氏綜合癥、尋常天皰瘡、重癥肌無力、格雷夫斯氏病(甲狀腺機(jī)能亢進(jìn))、和胰島素抗性糖尿病?？赡芫哂凶陨砻庖咭蛩氐目捎帽景l(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸治療、預(yù)防和/或診斷的其它紊亂包括但不限于II型膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎、抗磷脂綜合癥、皮炎、變應(yīng)性腦脊髓炎、心肌炎、復(fù)發(fā)性多軟骨炎、風(fēng)濕性心臟病、神經(jīng)炎、葡萄膜炎眼炎、多內(nèi)分泌病、萊特氏病、僵人綜合癥、自身免疫性肺部炎癥、孤獨(dú)癥、格-巴二氏綜合癥、胰島素依賴性糖尿病、和自身免疫性炎性眼病。可能具有自身免疫因素的可用本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸治療、預(yù)防、診斷和/或預(yù)測的其它紊亂包括但不限于具有抗膠原抗體的硬皮癥(通常特征為例如核仁和其它核抗體)、混合性結(jié)締組織疾病(通常特征為例如針對可提取核抗原(例如核蛋白)的抗體)、多肌炎(通常特征為例如非組蛋白ANA)、惡性貧血(通常特征為例如抗壁細(xì)胞、微粒體和內(nèi)在因子抗體)、特發(fā)性阿狄森氏病(通常特征為例如體液和細(xì)胞介導(dǎo)的腎上腺細(xì)胞毒性)、不育癥(通常特征為例如抗精子抗體)、腎小球腎炎(通常特征為例如腎小球基底膜抗體或免疫復(fù)合物)、大泡性類天皰瘡(通常特征為例如基底膜中的IgG和補(bǔ)體)、斯耶格倫氏綜合癥(通常特征為例如多組織抗體、和/或特異性非組蛋白ANA(SS-B))、糖尿病(通常特征為例如細(xì)胞介導(dǎo)的和體液胰島細(xì)胞抗體)、和腎上腺素能藥物抗性(包括伴隨哮喘或囊性纖維化病的腎上腺素能藥物抗性)(通常特征為例如β-腎上腺素能受體抗體)?？赡芫哂凶陨砻庖咭蛩氐目捎帽景l(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸治療、預(yù)防、診斷和/或預(yù)測的其它紊亂包括但不限于慢性活動性肝炎(通常特征為例如平滑肌抗體)、原發(fā)性膽囊硬化(通常特征為例如線粒體抗體)、其它內(nèi)分泌腺衰竭(在一些病例中通常特征為例如特定組織抗體)、白癜風(fēng)(通常特征為例如黑色素細(xì)胞抗體)、脈管炎(通常特征為例如管壁中的Ig和補(bǔ)體和/或低血清補(bǔ)體)、后MI(通常特征為例如心肌抗體)、心臟切開術(shù)綜合癥(通常特征為例如心肌抗體)、蕁麻疹(通常特征為例如針對IgE的IgG和IgM抗體)、遺傳過敏性皮炎(通常特征為例如針對IgE的IgG和IgM抗體)、哮喘(通常特征為例如針對IgE的IgG和IgM抗體)、和許多其它炎性、肉芽腫性、退化性和萎縮性紊亂。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用例如本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸來治療、預(yù)防、診斷和/或預(yù)測與上述疾病和紊亂有關(guān)的自身免疫性疾病和紊亂和/或狀況。在一個具體的優(yōu)選實(shí)施方案中，使用本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸來治療、預(yù)防和/診斷類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。在另一個具體的優(yōu)選實(shí)施方案中，使用本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸來治療、預(yù)防和/診斷系統(tǒng)性紅斑狼瘡。在另一個具體的優(yōu)選實(shí)施方案中，使用本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸來治療、預(yù)防和/診斷特發(fā)性血小板減少性紫癜。在另一個具體的優(yōu)選實(shí)施方案中，使用本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸來治療、預(yù)防和/診斷IgA腎病。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸來治療、預(yù)防、診斷和/或預(yù)測與上述疾病和紊亂有關(guān)的自身免疫性疾病和紊亂和/或狀況。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用作免疫抑制劑。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治療、預(yù)防、預(yù)測和/或診斷造血細(xì)胞的疾病、紊亂和/或狀況。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于在治療或預(yù)防與某些(或許多)類型造血細(xì)胞減少有關(guān)的那些疾病、紊亂和/或狀況，包括但不限于白細(xì)胞減少、嗜中性粒細(xì)胞減少、貧血和血小板減少的努力中，增強(qiáng)造血細(xì)胞包括多能干細(xì)胞的分化和增殖?；蛘?，本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于在治療或預(yù)防與某些(或許多)類型造血細(xì)胞增多有關(guān)的那些疾病、紊亂和/或狀況，包括但不限于組織細(xì)胞增多的努力中，增強(qiáng)造血細(xì)胞包括多能干細(xì)胞的分化和增殖。還可用本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸來治療、預(yù)防、診斷和/或預(yù)測變態(tài)反應(yīng)和狀況，諸如哮喘(特別是變應(yīng)性哮喘)或其它呼吸道問題。另外，這些分子可用于治療、預(yù)防、預(yù)測和/或診斷過敏性、對抗原性分子的超敏性、或血型不相容。此外，本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治療、預(yù)防、診斷和/或預(yù)測IgE介導(dǎo)的變態(tài)反應(yīng)。這樣的變態(tài)反應(yīng)包括但不限于哮喘、鼻炎、和濕疹。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于在體外或在體內(nèi)調(diào)節(jié)IgE濃度。另外，本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于診斷、預(yù)測、預(yù)防和/或治療炎性狀況。例如，由于本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可抑制涉及炎性應(yīng)答的細(xì)胞的激活、增殖和/或分化，因而這些分子可用于預(yù)防和/或治療慢性和急性炎性狀況。這些炎性狀況包括但不限于例如與感染有關(guān)的炎癥(例如感染性休克、敗血癥、或全身炎癥反應(yīng)綜合癥)、局部缺血-再灌注損傷、內(nèi)毒素致死性、補(bǔ)體介導(dǎo)的超急性排斥、腎炎、細(xì)胞因子或趨化因子誘導(dǎo)的肺部損傷、炎性腸病、克羅恩氏病、細(xì)胞因子(例如TNF或IL-1)過度生成、呼吸紊亂(例如哮喘和變態(tài)反應(yīng))；胃腸紊亂(例如炎性腸病)；癌癥(例如胃、卵巢、肺、膀胱、肝、和乳房)；CNS紊亂(例如多發(fā)性硬化癥；缺血性腦損傷和/或中風(fēng)、外傷性腦損傷、神經(jīng)退行性疾病(例如帕金森氏病和阿爾茨海默氏病)；AIDS相關(guān)癡呆；和朊病毒病)；心血管紊亂(例如動脈粥樣硬化、心肌炎、心血管病、和心肺旁路并發(fā)癥)；以及以炎癥為特征的許多其它疾病、狀況和紊亂(例如肝炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)、外傷、胰腺炎、結(jié)節(jié)病、皮炎、腎缺血-再灌注損傷、格雷夫斯氏病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、糖尿病、和同種異體移植排斥)。因?yàn)檠装Y是基礎(chǔ)防御機(jī)制，所以炎性紊亂事實(shí)上能夠影響機(jī)體的任何組織。因此，本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治療組織特異性炎性紊亂，包括但不限于腎上腺炎、肺泡炎(alveolitis)、膽管膽囊炎、闌尾炎、龜頭炎、瞼炎、支氣管炎、粘液囊炎、心臟炎、蜂窩織炎、宮頸炎、膽囊炎、聲帶炎、耳蝸炎、結(jié)腸炎、結(jié)膜炎、膀胱炎、皮炎、憩室炎、腦炎、心內(nèi)膜炎、食道炎、咽鼓管炎、纖維組織炎、毛囊炎、胃炎、胃腸炎、齦炎、舌炎、肝脾炎、角膜炎、內(nèi)耳炎、喉炎、淋巴管炎、乳腺炎、中耳炎、腦膜炎、子宮炎、粘膜炎、心肌炎、肌炎、鼓膜炎、腎炎、神經(jīng)炎、睪丸炎、骨軟骨炎、耳炎、心包炎、腱鞘炎、腹膜炎、咽炎、靜脈炎、脊髓灰質(zhì)炎、前列腺炎、牙髓炎、視網(wǎng)膜炎、鼻炎、輸卵管炎、鞏膜炎、鞏膜脈絡(luò)膜炎、陰囊炎、竇炎、脊椎炎、脂肪組織炎、口腔炎、關(guān)節(jié)膜炎、咽鼓管炎、腱炎、扁桃體炎、尿道炎、和陰道炎。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于診斷、預(yù)測、預(yù)防和/或治療器官移植排斥和移植物抗宿主病。器官排斥通過宿主免疫細(xì)胞經(jīng)免疫反應(yīng)破壞移植組織而發(fā)生。類似的，GVHD也涉及免疫反應(yīng)，但在此情況下，外來的移植免疫細(xì)胞破壞宿主組織。抑制免疫反應(yīng)，特別是T細(xì)胞的激活、增殖、分化或趨化性的本發(fā)明多肽、抗體或多核苷酸和/或其激動劑或拮抗劑可能是預(yù)防器官排斥或GVHD的有效治療方法。在具體的實(shí)施方案中，抑制免疫反應(yīng)，特別是T細(xì)胞的激活、增殖、分化或趨化性的本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可能是預(yù)防試驗(yàn)性變應(yīng)性和超急性異種移植物排斥的有效治療方法。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于診斷、預(yù)測、預(yù)防和/或治療免疫復(fù)合物疾病，包括但不限于血清病、鏈球菌感染后腎小球腎炎、節(jié)結(jié)性多動脈炎、和免疫復(fù)合物誘導(dǎo)的脈管炎。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治療、檢測和/或預(yù)防傳染因子。例如，通過增強(qiáng)免疫反應(yīng)，特別是增強(qiáng)B和/或T細(xì)胞的增殖、激活和/或分化，可以治療、檢測和/或預(yù)防傳染病。免疫反應(yīng)可通過增強(qiáng)現(xiàn)有的免疫反應(yīng)或通過啟動新的免疫反應(yīng)而增強(qiáng)?；蛘?，本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸也可直接抑制傳染因子(參考申請書中列出傳染因子的部分等)，而無需引發(fā)免疫反應(yīng)。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸作為疫苗佐劑用于增強(qiáng)針對抗原的免疫響應(yīng)性。在一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸作為佐劑用于增強(qiáng)腫瘤特異性免疫反應(yīng)。在另一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋自和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸作為佐劑用于增強(qiáng)抗病毒免疫反應(yīng)?？墒褂帽景l(fā)明的組合物作為佐劑而增強(qiáng)的抗病毒免疫反應(yīng)包括本文描述的或本領(lǐng)域其它途徑知道的病毒和病毒相關(guān)疾病或癥狀。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物作為佐劑用于增強(qiáng)針對選自下組的病毒、疾病或癥狀的免疫反應(yīng)AIDS、腦膜炎、登革熱、EBV、和肝炎(例如乙肝)。在另一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物作為佐劑用于增強(qiáng)針對選自下組的病毒、疾病或癥狀的免疫反應(yīng)HIV/AIDS、呼吸道合胞病毒、登革熱病毒、輪狀病毒、B型日本腦炎、A和B型流感、副流感、麻疹、細(xì)胞巨化病毒、狂犬病、胡寧病毒、基孔肯雅病、立夫特山谷熱、單純皰疹、和黃熱病。在另一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸作為佐劑用于增強(qiáng)抗細(xì)菌或抗真菌免疫反應(yīng)?？捎帽景l(fā)明的組合物作為佐劑而增強(qiáng)的抗細(xì)菌或抗真菌免疫反應(yīng)包括本文描述的或本領(lǐng)域其它途徑知道的細(xì)菌或真菌或細(xì)菌及真菌細(xì)菌或真菌相關(guān)疾病或癥狀。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物作為佐劑用于增強(qiáng)針對選自下組的細(xì)菌或真菌、疾病或癥狀的免疫反應(yīng)破傷風(fēng)、白喉、肉毒中毒、和B型腦膜炎。在另一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物作為佐劑用于增強(qiáng)針對選自下組的細(xì)菌或真菌、疾病或癥狀的免疫反應(yīng)霍亂弧菌(Vibriocholerae)、麻風(fēng)分枝桿菌(Mycobacteriumleprae)、傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphi)、副傷寒沙門氏菌(Salmonellaparatyphi)、腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)、肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)、B組鏈球菌、志賀氏菌(Shigellaspp.)、產(chǎn)腸毒素的埃希氏大腸桿菌(Escherichiacoli)、腸出血性大腸桿菌、和布氏疏螺旋體(Borreliaburgdorferi)。在另一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸作為佐劑用于增強(qiáng)抗寄生蟲免疫反應(yīng)?？捎帽景l(fā)明的組合物作為佐劑而增強(qiáng)的抗寄生蟲免疫反應(yīng)包括本文描述的或本領(lǐng)域其它途徑知道的寄生蟲和寄生蟲相關(guān)疾病或癥狀。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物作為佐劑用于增強(qiáng)針對寄生蟲的免疫反應(yīng)。在另一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物作為佐劑用于增強(qiáng)針對瘧原蟲(瘧疾)或利什曼蟲的免疫反應(yīng)。在另一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸還可用于治療傳染病，包括硅肺病、結(jié)節(jié)病、和特發(fā)性肺纖維化，例如通過阻止單核吞噬細(xì)胞的募集和激活。在另一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸作為抗原用于生成抗體，以抑制或增強(qiáng)針對本發(fā)明多肽的免疫介導(dǎo)反應(yīng)。在一個實(shí)施方案中，將本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸施用于動物(例如小鼠、大鼠、兔、倉鼠、豚鼠、豬、微型豬、雞、駱駝、山羊、馬、牛、綿羊、犬、貓、非人靈長類、和人，最優(yōu)選人)以增強(qiáng)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生更多數(shù)量的一種或多種抗體(例如IgG、IgA、IgM和IgE)，誘導(dǎo)產(chǎn)生更高親和力的抗體和免疫球蛋白類型轉(zhuǎn)換(例如IgG、IgA、IgM和IgE)，和/或增強(qiáng)免疫反應(yīng)。在另一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用作針對病原體的B細(xì)胞響應(yīng)性的刺激物。在另一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用作T細(xì)胞的激活物。在另一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用作在個體接受免疫抑制治療前提升其免疫狀況的藥劑。在另一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用作誘導(dǎo)更高親和力抗體的藥劑。在另一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用作提高血清免疫球蛋白濃度的藥劑。在另一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用作加快免疫受損個體恢復(fù)的藥劑。在另一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用作增強(qiáng)老年群體和/或新生兒免疫反應(yīng)的藥劑。在另一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用作骨髓移植和/或其它移植(例如同種異體或異種器官移植)之前、期間、或之后的免疫系統(tǒng)增強(qiáng)劑。對于移植，本發(fā)明的組合物可以在移植之前、同時、和/或之后施用。在一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物在移植后、T細(xì)胞群體開始恢復(fù)前施用。在另一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物首先在移植后T細(xì)胞群體開始恢復(fù)后，但在B細(xì)胞群體完全恢復(fù)前施用。在另一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸在具有獲得性B細(xì)胞功能喪失的個體中用作增強(qiáng)免疫響應(yīng)性的藥劑。導(dǎo)致可通過施用本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸而改善或治療的獲得性B細(xì)胞功能喪失的狀況包括但不限于HIV感染、AIDS、骨髓移植、和B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)。在另一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸在具有暫時性免疫缺陷的個體中用作增強(qiáng)免疫響應(yīng)性的藥劑。導(dǎo)致可通過施用本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸而改善或治療的暫時性免疫缺陷的狀況包括但不限于從病毒感染(例如流感)恢復(fù)、與營養(yǎng)不良有關(guān)的狀況、從傳染性單核細(xì)胞增多恢復(fù)、與壓力有關(guān)的狀況、從麻疹恢復(fù)、從輸血恢復(fù)、及從手術(shù)恢復(fù)。在另一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用作單核細(xì)胞、樹突細(xì)胞、和/或B細(xì)胞抗原呈遞的調(diào)節(jié)劑。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸在體外或在體內(nèi)增強(qiáng)抗原呈遞或拮抗抗原呈遞。另外，在相關(guān)實(shí)施方案中，此抗原呈遞的增強(qiáng)或拮抗可用作抗腫瘤治療或用于調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)。在另一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用作引導(dǎo)個體免疫系統(tǒng)向體液反應(yīng)(即TH2)而非TH1細(xì)胞反應(yīng)發(fā)展的藥劑。在另一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用作誘導(dǎo)腫瘤增殖的手段，從而使之更易受抗贅生藥的影響。例如，多發(fā)性骨髓瘤是緩慢分裂的疾病，因此事實(shí)上所有抗贅生治療方案都難以控制。如果迫使這些細(xì)胞更快增殖，那么它們的易感譜很可能改變。在另一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用作諸如AIDS、慢性淋巴細(xì)胞紊亂和/或常見變異型免疫缺陷等病理中B細(xì)胞生成的刺激劑。在另一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用作手術(shù)、外傷或遺傳缺陷后淋巴組織產(chǎn)生和/或再生的治療方法。在另一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用于移植前骨髓樣品的預(yù)處理。在另一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用作導(dǎo)致諸如SCID患者中所觀察到的免疫無能/免疫缺陷的先天遺傳性紊亂的基于基因的治療方法。在另一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用作激活單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞抵御影響單核細(xì)胞的寄生蟲病諸如利什曼原蟲的手段。在另一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用作調(diào)節(jié)由本發(fā)明多肽引發(fā)的分泌性細(xì)胞因子的手段。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用于本文描述的一種或多種應(yīng)用，正如它們可用于獸用。在另一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用作阻斷針對外來因子或自身的免疫反應(yīng)不同方面的手段。可能希望阻斷其中的免疫反應(yīng)某些方面的疾病或狀況的例子包括自身免疫性紊亂諸如狼瘡、和關(guān)節(jié)炎、以及對皮膚變態(tài)反應(yīng)的免疫響應(yīng)性、炎癥、腸病、損傷和與病原體有關(guān)的疾病/紊亂。在另一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用作阻止與自身免疫病諸如特發(fā)性血小板減少性紫癜、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和多發(fā)性硬化癥有關(guān)的B細(xì)胞增殖和Ig分泌的治療方法。在另一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸的多肽、抗體、多核苷酸和/或激動劑或拮抗劑用作內(nèi)皮細(xì)胞中B和/或T細(xì)胞遷移的抑制劑。此活性破壞組織架構(gòu)或同類反應(yīng)，且可用于例如破壞免疫反應(yīng)，和阻止敗血癥。在另一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用作諸如未定性單克隆丙種球蛋白病(MGUS)、瓦爾登斯特倫氏病、相關(guān)特發(fā)性單克隆丙種球蛋白病、和漿細(xì)胞瘤等疾病中明顯的慢性高丙種球蛋白血癥的治療方法。在另一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于例如在某些自身免疫性和慢性炎性和傳染性疾病中抑制多肽趨化性和巨噬細(xì)胞及其前體、嗜中性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和一些T細(xì)胞子集如活化的和CD8細(xì)胞毒性T細(xì)胞和天然殺傷細(xì)胞的激活。本文描述了自身免疫病的例子，包括多發(fā)性硬化癥和胰島素依賴性糖尿病。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸還可以通過例如阻止嗜曙紅粒細(xì)胞的生成和遷移來治療特發(fā)性高嗜曙紅粒細(xì)胞綜合癥。在另一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用于增強(qiáng)或抑制補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞溶解。在另一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用于增強(qiáng)或抑制抗體依賴性細(xì)胞毒性。在另一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸還可用于治療動脈粥樣硬化，例如通過阻止動脈壁中的單核細(xì)胞滲透。在另一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治療成人呼吸窘迫綜合癥(ARDS)。在另一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于刺激傷口和組織修復(fù)、刺激血管發(fā)生、和/或刺激血管或淋巴管疾病或紊亂的修復(fù)。此外，本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸還可用于刺激粘膜表面的再生。在一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用于診斷、預(yù)測、治療和/或預(yù)防特征為原發(fā)性或獲得性免疫缺陷、血清免疫球蛋白生成不足、復(fù)發(fā)性感染、和/或免疫系統(tǒng)功能障礙的紊亂。另外，本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治療或預(yù)防關(guān)節(jié)、骨、皮膚、和/或腮腺的感染、血媒感染(例如敗血癥、腦膜炎、膿毒性關(guān)節(jié)炎、和/或骨髓炎)、自身免疫病(例如本文所公開的)、炎性紊亂、和惡性腫瘤、和/或與這些感染、疾病、紊亂和/或惡性腫瘤有關(guān)的任何疾病或紊亂或狀況，包括但不限于CVID、其它原發(fā)性免疫缺陷、HIV病、CLL、復(fù)發(fā)性支氣管炎、竇炎、中耳炎、結(jié)膜炎、肺炎、肝炎、腦膜炎、帶狀皰疹(例如嚴(yán)重帶狀皰疹)、和/或卡氏肺囊蟲(Pneumocystiscarnii)?？捎帽景l(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸預(yù)防、診斷、預(yù)測和/或治療的其它疾病和紊亂包括但不限于HIV感染、HTLV-BLV感染、淋巴細(xì)胞減少、吞噬細(xì)胞殺菌功能障礙性貧血、血小板減少、和血紅蛋白尿。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用于治療和/或診斷具有常見變異型免疫缺陷病(“CVID”；也稱為“獲得性無丙種球蛋白血癥”和“獲得性低丙種球蛋白血癥”)或此疾病的亞類的個體。在一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于診斷、預(yù)測、預(yù)防和/或治療癌癥或贅生物，包括免疫細(xì)胞或免疫組織相關(guān)癌癥或贅生物?？捎帽景l(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸預(yù)防、診斷或治療的癌癥或贅生物的例子包括但不限于急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、霍奇金氏病、非霍奇金氏淋巴瘤、急性淋巴細(xì)胞性貧血(ALL)、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、漿細(xì)胞瘤、多發(fā)性骨髓瘤、伯基特氏淋巴瘤、EBV轉(zhuǎn)化的疾病、和/或本文其它地方標(biāo)題為“過度增殖性紊亂”部分描述的疾病和紊亂。在另一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用作降低大型B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞增殖的治療方法。在另一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用作減少與慢性骨髓性白血病有關(guān)的B細(xì)胞和Ig的牽連的手段。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物用作在B細(xì)胞免疫缺陷個體諸如例如接受了部分或全部脾切除的個體中增強(qiáng)免疫響應(yīng)性的藥劑。血液相關(guān)紊亂本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于調(diào)節(jié)止血(停止出血)或溶栓(凝塊溶解)活性。例如，通過增強(qiáng)止血或溶栓活性，本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治療或預(yù)防血液凝結(jié)疾病、紊亂和/或狀況(例如纖維蛋白原缺乏血癥、因子缺乏、血友病)、血小板疾病、紊亂和/或狀況(例如血小板減少)、或源于外傷、手術(shù)或其它原因的損傷?；蛘?，能夠降低止血或溶栓活性的本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于抑制或溶解凝塊。這些分子可在心臟病發(fā)作(梗死)、中風(fēng)、或結(jié)疤的治療或預(yù)防中起重要作用。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于預(yù)防、診斷、預(yù)測和/或治療血栓形成、動脈血栓形成、靜脈血栓形成、血栓栓塞、肺部栓塞、動脈粥樣硬化、心肌梗死、短暫性腦缺血發(fā)作、不穩(wěn)定性心絞痛。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于預(yù)防隱靜脈移植物閉塞(occulsionofsaphenousgrafts)、降低可能與血管成形術(shù)伴隨的圍手術(shù)期血栓形成風(fēng)險、降低心房纖維顫動包括非風(fēng)濕性心房纖維顫動患者的中風(fēng)風(fēng)險、降低與人工心臟瓣膜和/或二尖瓣疾病有關(guān)的栓塞風(fēng)險。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸的其它用途包括但不限于預(yù)防身體外裝置(例如血管內(nèi)套管、血液透析患者中的血管通路分流裝置、血液透析裝置、和心肺旁路裝置)中的阻塞。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于預(yù)防、診斷、預(yù)測和/或治療與其中本發(fā)明多肽進(jìn)行表達(dá)的組織有關(guān)的血液和/或血液形成器官的疾病和紊亂。本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于調(diào)節(jié)造血活性(血細(xì)胞的形成)。例如，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于增加所有血細(xì)胞或血細(xì)胞子集諸如例如紅細(xì)胞、淋巴細(xì)胞(B或T細(xì)胞)、骨髓細(xì)胞(例如嗜堿性細(xì)胞、嗜曙紅細(xì)胞、嗜中性細(xì)胞、肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞)和血小板的數(shù)量。降低血細(xì)胞或血細(xì)胞子集數(shù)量的能力可用于預(yù)防、檢測、診斷和/或治療下文描述的貧血和白細(xì)胞減少。或者，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于減少所有血細(xì)胞或血細(xì)胞子集諸如例如紅細(xì)胞、淋巴細(xì)胞(B或T細(xì)胞)、骨髓細(xì)胞(例如嗜堿性細(xì)胞、嗜曙紅細(xì)胞、嗜中性細(xì)胞、肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞)和血小板的數(shù)量。降低血細(xì)胞或血細(xì)胞子集數(shù)量的能力可用于預(yù)防、檢測、診斷和/或治療白細(xì)胞增多諸如例如嗜曙紅細(xì)胞增多。本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于預(yù)防、治療或診斷血液惡液質(zhì)。貧血是紅細(xì)胞數(shù)目或其中的血紅蛋白(攜帶氧的蛋白質(zhì))數(shù)量低于正常水平的狀況。貧血可能由過度出血、紅細(xì)胞生成減少、或紅細(xì)胞破壞(溶血)增加而引起。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治療、預(yù)防和/診斷貧血?？捎帽景l(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸治療、預(yù)防或診斷的貧血包括缺鐵性貧血、低血色素性貧血、小紅細(xì)胞性貧血、缺綠癥(chlorosis)、遺傳鐵粒幼紅細(xì)胞性貧血、特發(fā)性獲得性鐵粒幼細(xì)胞貧血、紅細(xì)胞發(fā)育不全、巨紅細(xì)胞性貧血(例如惡性貧血、(維生素B12缺乏)和葉酸缺乏性貧血)、再生障礙性貧血、溶血性貧血(例如自身免疫性溶血性貧血、微血管病性溶血性貧血、和陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿)。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治療、預(yù)防和/或診斷與下列疾病有關(guān)的貧血，所述疾病包括但不限于與系統(tǒng)性紅斑狼瘡、癌癥、淋巴瘤、慢性腎病、和脾增大有關(guān)的貧血。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治療、預(yù)防和/或診斷由藥物治療引起的貧血，諸如與甲基多巴、氨苯砜、和/或磺胺藥有關(guān)的貧血。此外，本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治療、預(yù)防和/或診斷與異常紅細(xì)胞架構(gòu)有關(guān)的貧血，包括但不限于遺傳性球形細(xì)胞增多、遺傳性橢圓形紅細(xì)胞增多、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺陷、和鐮狀細(xì)胞貧血。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治療、預(yù)防和/或診斷血紅蛋白異常(例如與鐮狀細(xì)胞貧血、血紅蛋白C病、血紅蛋白S-C病、和血紅蛋白E病有關(guān)的)。此外，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于診斷、預(yù)測、預(yù)防和/或治療珠蛋白生成障礙性貧血(地中海貧血)，包括但不限于重型和輕型α-地中海貧血和β-地中海貧血。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于診斷、預(yù)測、預(yù)防和/或治療出血性紊亂，包括但不限于血小板減少(例如特發(fā)性血小板減少性紫癜、和血栓性血小板減少性紫瘢)、馮維勒布蘭德氏病、遺傳性血小板紊亂(例如儲存池病，諸如切-希二氏綜合癥和赫-普二氏綜合癥、血栓烷A2功能障礙、血小板無力、和伯-蘇二氏綜合癥)、溶血性尿毒癥綜合癥、血友病諸如血友病A或因子VII缺乏以及基氏病(血友病B)或因子IX缺乏、遺傳性出血性毛細(xì)管擴(kuò)張、也稱為朗-奧-韋三氏綜合癥、變應(yīng)性紫癜(亨-許二氏紫癜)和散布性血管內(nèi)凝結(jié)。可以使用本領(lǐng)域已知的任何凝血測試法來監(jiān)測本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸對血液凝結(jié)時間的影響，包括但不限于全血部分促凝血酶原激酶時間(PTT)、活化部分促凝血酶原激酶時間(aPTT)、活化凝血時間(ACT)、復(fù)鈣化活化凝血時間、或李-懷二氏凝血時間。幾種疾病和多種藥物能夠引起血小板功能障礙。因此，在一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于診斷、預(yù)測、預(yù)防和/或治療獲得性血小板功能障礙，諸如伴隨腎衰竭、自血病、多發(fā)性骨髓瘤、肝硬化、和系統(tǒng)性紅斑狼瘡的血小板功能障礙以及與藥物治療有關(guān)的血小板功能障礙，包括用高劑量的阿斯匹林、噻氯匹定、非固醇類抗炎藥(用于關(guān)節(jié)炎、疼痛、和扭傷)、和青霉素進(jìn)行的治療。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于診斷、預(yù)測、預(yù)防和/或治療特征為白細(xì)胞數(shù)目增加或減少或與之有關(guān)的疾病和紊亂。當(dāng)白細(xì)胞數(shù)目減少至低于正常水平時發(fā)生白細(xì)胞減少癥。白細(xì)胞減少包括但不限于嗜中性白細(xì)胞減少和淋巴細(xì)胞減少。白細(xì)胞數(shù)目相對于正常水平的增加稱為白細(xì)胞增多。機(jī)體在感染期間產(chǎn)生數(shù)目增多的白細(xì)胞。因此，白細(xì)胞增多可能僅僅是反映感染的正常生理學(xué)參數(shù)?；蛘撸准?xì)胞增多可能是損傷或其它疾病諸如癌癥的指標(biāo)。白細(xì)胞增多癥包括但不限于嗜曙紅細(xì)胞增多癥和巨噬細(xì)胞積累。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于診斷、預(yù)測、預(yù)防和/或治療白細(xì)胞減少。在其它具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于診斷、預(yù)測、預(yù)防和/或治療白細(xì)胞增多。白細(xì)胞減少可以是所有類型白細(xì)胞的普遍減少，或者可以是特定類型白細(xì)胞的特異損耗。因此，在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于診斷、預(yù)測、預(yù)防和/或治療稱為嗜中性白細(xì)胞減少的嗜中性粒細(xì)胞數(shù)目減少。可用本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸診斷、預(yù)測、預(yù)防和/或治療的嗜中性白細(xì)胞減少包括但不限于嬰幼兒遺傳性粒細(xì)胞缺乏、家族性嗜中性白細(xì)胞減少、周期性嗜中性白細(xì)胞減少、源于飲食缺乏(例如維生素B12缺乏或葉酸缺乏)或與之有關(guān)的嗜中性白細(xì)胞減少、源于藥物治療(例如抗生素治療方案，諸如青霉素治療、磺胺藥物治療、抗凝血劑治療、抗驚厥藥物、抗甲狀腺藥物和癌癥化療)或與之有關(guān)的嗜中性白細(xì)胞減少、和源于嗜中性粒細(xì)胞破壞增加的嗜中性白細(xì)胞減少癥，嗜中性粒細(xì)胞破壞增加可能與一些細(xì)菌或病毒感染、變應(yīng)性紊亂、自身免疫病、脾腫大(例如費(fèi)爾蒂綜合癥、瘧疾和結(jié)節(jié)病)個體的狀況、和一些藥物治療方案有關(guān)。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于診斷、預(yù)測、預(yù)防和/或治療淋巴細(xì)胞減少(B和/或T淋巴細(xì)胞數(shù)目減少)，包括但不限于源于壓力、藥物治療(例如皮質(zhì)類固醇藥物治療、癌癥化療、和/或放療)、AIDS感染和/或其它疾病諸如例如癌癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、慢性感染、一些病毒感染和/或遺傳性紊亂(例如迪格奧爾格綜合癥、成-奧二氏綜合癥、嚴(yán)重合并性免疫缺陷、共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)管擴(kuò)張)的或與之有關(guān)的淋巴細(xì)胞減少。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于診斷、預(yù)測、預(yù)防和/或治療與巨噬細(xì)胞數(shù)目和/或巨噬細(xì)胞功能有關(guān)的疾病和紊亂，包括但不限于高歇氏病、尼-皮二氏病、萊-西二氏病、和漢-許-克三氏病。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于診斷、預(yù)測、預(yù)防和/或治療與嗜曙紅粒細(xì)胞數(shù)目和/嗜曙紅粒細(xì)胞功能有關(guān)的疾病和紊亂，包括但不限于特發(fā)性嗜曙紅粒細(xì)胞增多綜合癥(idiopathichypereosinophilicsyndrome)、嗜曙紅粒細(xì)胞-肌痛綜合癥、和漢-許-克三氏病。在又一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于診斷、預(yù)測、預(yù)防和/或治療白血病和淋巴瘤，包括但不限于急性淋巴細(xì)胞性(成淋巴細(xì)胞性)白血病(ALL)、急性髓細(xì)胞樣(髓細(xì)胞性、骨髓性、成髓細(xì)胞性、或骨髓單核細(xì)胞性)白血病、慢性淋巴細(xì)胞性白血病(例如B細(xì)胞白血病、T細(xì)胞白血病、塞扎里綜合癥、及毛細(xì)胞性白血病)、慢性髓細(xì)胞性(髓細(xì)胞樣、骨髓性、或粒細(xì)胞性)白血病、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、和蕈樣肉芽腫。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于診斷、預(yù)測、預(yù)防和/或治療漿細(xì)胞的疾病和紊亂，包括但不限于漿細(xì)胞惡液質(zhì)、單克隆丙種球蛋白病、未定性的單克隆丙種球蛋白病、多發(fā)性骨髓瘤、巨球蛋白血癥、瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血癥、冷球蛋白血癥、和雷諾氏現(xiàn)象。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治療、預(yù)防和/或診斷骨髓增殖性紊亂，包括但不限于真性紅細(xì)胞增多、相對紅細(xì)胞增多、繼發(fā)性紅細(xì)胞增多、骨髓纖維化、急性骨髓纖維化、原因不明的骨髓化生、血小板增多(包括原發(fā)性和繼發(fā)性血小板增多)和慢性髓細(xì)胞性白血病。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于手術(shù)前的處理以增加血細(xì)胞生成。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用作增強(qiáng)嗜中性粒細(xì)胞、嗜曙紅粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的遷移、吞噬作用、超氧化物生成、抗體依賴性細(xì)胞毒性的藥劑。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用作干細(xì)胞提取前增加循環(huán)中干細(xì)胞數(shù)目的藥劑。在另一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用作血小板提取前增加循環(huán)中干細(xì)胞數(shù)目的藥劑。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用作增加細(xì)胞因子生成的藥劑。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于預(yù)防、診斷和/或治療原發(fā)性造血紊亂。過度增殖性紊亂在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的融合蛋白和/或本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治療或檢測過度增殖性紊亂，包括贅生物。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可通過直接或間接相互作用而抑制紊亂的擴(kuò)散(proliferation)?；蛘撸景l(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可使能抑制過度增殖性紊亂的其它細(xì)胞增殖。例如，可通過提高免疫應(yīng)答，特別是提高過度增殖性紊亂的抗原質(zhì)量，或者通過使T細(xì)胞增殖、分化、或動員，來治療過度增殖性紊亂?；蚴峭ㄟ^增強(qiáng)現(xiàn)有的免疫應(yīng)答，或是通過發(fā)動新的免疫應(yīng)答，可提高這種免疫應(yīng)答?；蛘?，降低免疫應(yīng)答也可是治療過度增殖性紊亂的方法，諸如化療劑?？捎帽景l(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸治療或檢測的過度增殖性紊亂的實(shí)例包括但不限于位于下列部位的贅生物結(jié)腸、腹部、骨、乳房、消化系統(tǒng)、肝、胰、腹膜、內(nèi)分泌腺(腎上腺、副甲狀腺、垂體、睪丸、卵巢、胸腺、甲狀腺)、眼、頭和頸、神經(jīng)(中樞和周圍)、淋巴系統(tǒng)、骨盆、皮膚、軟組織、脾、胸腔、和泌尿生殖道。類似的，其它過度增殖性紊亂也可用本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸來治療或檢測。這些過度增殖性紊亂的實(shí)例包括但不限于急性兒童期成淋巴細(xì)胞性白血病、急性成淋巴細(xì)胞性白血病、急性淋巴細(xì)胞性白血病、急性髓細(xì)胞樣白血病、腎上腺皮質(zhì)癌、成人(原發(fā)性)肝細(xì)胞癌、成人(原發(fā)性)肝癌、成人急性淋巴細(xì)胞性白血病、成人急性髓細(xì)胞樣白血病、成人霍奇金氏病、成人霍奇金氏淋巴瘤、成人淋巴細(xì)胞性白血病、成人非霍奇金氏淋巴瘤、成人原發(fā)性肝癌、成人軟組織肉瘤、AIDS相關(guān)淋巴瘤、AIDS相關(guān)惡性腫瘤、肛門癌、星形細(xì)胞瘤、膽管癌、膀胱癌、骨癌、腦干神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腦瘤、乳癌、腎盂和輸尿管癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(原發(fā)性)淋巴瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤、小腦星形細(xì)胞瘤、大腦星形細(xì)胞瘤、宮頸癌、兒童期(原發(fā)性)肝細(xì)胞癌、兒童期(原發(fā)性)肝癌、兒童期急性成淋巴細(xì)胞性白血病、兒童期急性髓細(xì)胞樣白血病、兒童期腦干神經(jīng)膠質(zhì)瘤、兒童期小腦星形細(xì)胞瘤、兒童期大腦星形細(xì)胞瘤、兒童期顱外生殖細(xì)胞瘤、兒童期霍奇金氏病、兒童期霍奇金氏淋巴瘤、兒童期下丘腦和視路神經(jīng)膠質(zhì)瘤、兒童期成淋巴細(xì)胞白血病、兒童期成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、兒童期非霍奇金氏淋巴瘤、兒童期松果體和幕上原始神經(jīng)外胚層瘤、兒童期原發(fā)性肝癌、兒童期橫紋肌肉瘤、兒童期軟組織肉瘤、兒童期視路和下丘腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、慢性髓細(xì)胞性白血病、結(jié)腸癌、皮膚T細(xì)胞淋巴瘤、內(nèi)分泌胰島細(xì)胞癌、子宮內(nèi)膜癌、室鼓膜瘤、上皮癌、食管癌、尤文氏肉瘤及相關(guān)腫瘤、外分泌胰腺癌、顱外生殖細(xì)胞瘤、性腺外生殖細(xì)胞瘤、肝外膽管癌、眼癌、女性乳癌、高歇氏病、膽囊癌、胃癌、胃腸類癌瘤、胃腸瘤、生殖細(xì)胞瘤、妊娠性滋養(yǎng)層細(xì)胞瘤、毛細(xì)胞性白血病、頭和頸癌、肝細(xì)胞癌、霍奇金氏病、霍奇金氏淋巴瘤、高丙種球蛋白血癥、下咽癌、腸癌、眼內(nèi)黑素瘤、胰島細(xì)胞癌、胰島細(xì)胞性胰腺癌、卡波西氏肉瘤、腎癌、喉癌、唇和口腔癌、肝癌、肺癌、淋巴增殖性紊亂、巨球蛋白血癥、女性乳癌、惡性間皮瘤、惡性胸腺瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、黑素瘤、間皮瘤、轉(zhuǎn)移性隱蔽性原發(fā)性鱗狀細(xì)胞頸癌、轉(zhuǎn)移性原發(fā)性鱗狀細(xì)胞頸癌、轉(zhuǎn)移性鱗狀細(xì)胞頸癌、多發(fā)性骨髓瘤、多發(fā)性骨髓瘤/漿細(xì)胞贅生物、骨髓增生異常綜合癥、髓細(xì)胞性白血病、髓細(xì)胞樣白血病、骨髓增殖性紊亂、鼻腔和鼻旁竇癌、鼻咽癌、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、妊娠期非霍奇金氏淋巴瘤、非黑素瘤皮膚癌、非小細(xì)胞肺癌、隱蔽性原發(fā)性轉(zhuǎn)移性鱗狀細(xì)胞頸癌、口咽癌、骨-/惡性纖維肉瘤、骨肉瘤/惡性纖維組織細(xì)胞瘤、骨肉瘤/骨的惡性纖維組織細(xì)胞瘤、卵巢上皮癌、卵巢生殖細(xì)胞瘤、卵巢低級惡性潛在腫瘤、胰腺癌、副蛋白血癥、紫癜、副甲狀腺癌、陰莖癌、嗜鉻細(xì)胞瘤、垂體瘤、漿細(xì)胞贅生物/多發(fā)性骨髓瘤、原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤、原發(fā)性肝癌、前列腺癌、直腸癌、腎細(xì)胞癌、腎盂和輸尿管癌、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤、橫紋肌肉瘤、唾液腺癌、結(jié)節(jié)病肉瘤、塞扎里綜合癥、皮膚癌、小細(xì)胞肺癌、小腸癌、軟組織肉瘤、鱗狀細(xì)胞頸癌、胃癌、幕上原始神經(jīng)外胚層和松果體瘤、T細(xì)胞淋巴瘤、睪丸癌、胸腺瘤、甲狀腺癌、腎盂和輸尿管的移行細(xì)胞癌、過渡型腎盂和輸尿管癌、滋養(yǎng)層瘤、輸尿管和腎盂細(xì)胞癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉瘤、陰道癌、視路和下丘腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤、陰門癌、瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血癥、維爾姆斯氏腫瘤、以及位于上文所列器官系統(tǒng)中除贅生物之外的任何其它過度增殖性疾病。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用于診斷、預(yù)測、預(yù)防、和/或治療惡化前狀況，以及用于預(yù)防發(fā)展成贅生物或惡性狀態(tài)，包括但不限于上文描述的那些紊亂。這些用途是已知或懷疑發(fā)生了前述向贅生物或癌的發(fā)展的狀況所需要的(indicated)，特別是由非贅生性細(xì)胞生長構(gòu)成的增生、化生，或最特別的是發(fā)育異常(關(guān)于這些異常生長狀況的綜述可參閱Robbins和Angell，1976，BasicPathology》，第2版，W.B.Saunders公司，Philadelphia，pp.68-79)。增生是受控細(xì)胞增殖的一種形式，牽涉組織或器官中細(xì)胞數(shù)目的增加，但結(jié)構(gòu)或功能沒有重大改變。可用本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸診斷、預(yù)測、預(yù)防、和/或治療的增生性紊亂包括但不限于血管濾泡縱隔淋巴結(jié)增生、伴有嗜曙紅細(xì)胞增多的血管淋巴增生、非典型性黑素細(xì)胞增生、基底細(xì)胞增生、良性大淋巴結(jié)增生、牙骨質(zhì)增生、先天性腎上腺增生、先天性皮脂腺增生、囊性增生、乳房的囊性增生、義齒性增生、導(dǎo)管增生、子宮內(nèi)膜增生、纖維肌性增生、局灶性上皮增生、牙齦增生、炎性纖維增生、炎性乳頭狀增生、血管內(nèi)乳頭狀內(nèi)皮增生、前列腺的節(jié)結(jié)性增生、節(jié)結(jié)性再生性增生、假上皮瘤性增生、老年皮脂腺增生、和疣狀增生?；鞘芸丶?xì)胞生長的一種形式，其中一類成熟的或完全分化的細(xì)胞替代另一類成熟的細(xì)胞?？捎帽景l(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸診斷、預(yù)測、預(yù)防、和/或治療的化生性紊亂包括但不限于特發(fā)性髓樣化生、頂泌化生、非典型性化生、自身實(shí)質(zhì)化生(autoparenchymatousmetaplasia)、結(jié)締組織化生、上皮化生、腸化生、化生性貧血、化生性骨化、化生性息肉、髓樣化生、原發(fā)性髓樣化生、繼發(fā)性髓樣化生、鱗狀細(xì)胞化生、羊膜的鱗狀細(xì)胞化生、和有癥狀的髓樣化生。發(fā)育異常常常是癌的預(yù)兆，且主要在上皮中發(fā)現(xiàn)；它是非贅生性細(xì)胞生長的大多數(shù)紊亂形式，牽涉細(xì)胞個體一致性和細(xì)胞構(gòu)造取向的喪失。發(fā)育異常細(xì)胞常常具有異常大型的、濃重染色的核，且表現(xiàn)出復(fù)型現(xiàn)象。發(fā)育異常特征性的發(fā)生在存在慢性刺激(irritation)或炎癥的情況中?？捎帽景l(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸診斷、預(yù)測、預(yù)防、和/或治療的發(fā)育異常性紊亂包括但不限于無汗性外胚層發(fā)育異常、anterofacialdysplasia、窒息性胸廓發(fā)育異常、心房手指發(fā)育異常、支氣管肺發(fā)育異常、腦發(fā)育異常、宮頸發(fā)育異常、軟骨外胚層發(fā)育異常、鎖骨顱骨發(fā)育異常、先天性外胚層發(fā)育異常、顱骨干發(fā)育異常、顱腕跗發(fā)育異常、顱干骺端發(fā)育異常、牙本質(zhì)發(fā)育異常、骨干發(fā)育異常、外胚層發(fā)育異常、牙釉質(zhì)發(fā)育異常、腦性眼球發(fā)育異常、偏側(cè)骨骺發(fā)育異常、多發(fā)性骨骺發(fā)育異常、點(diǎn)狀骨骺發(fā)育異常、上皮發(fā)育異常、面指(趾)生殖器發(fā)育異常、頜(顎)的家族性纖維發(fā)育異常、家族性白色皺折發(fā)育異常、纖維肌性發(fā)育異常、骨的纖維發(fā)育異常、旺盛骨性發(fā)育異常、遺傳性腎視網(wǎng)膜發(fā)育異常、有汗性外胚層發(fā)育異常、少汗性外胚層發(fā)育異常、淋巴細(xì)胞減少性胸腺發(fā)育異常、乳腺發(fā)育異常、下頜顏面發(fā)育異常、干骺端發(fā)育異常、蒙迪尼發(fā)育異常、單骨性纖維發(fā)育異常、粘膜上皮發(fā)育異常、多發(fā)性骨骺發(fā)育異常、眼耳椎骨發(fā)育異常、眼椎骨發(fā)育異常、牙源性發(fā)育異常、眼下頜支發(fā)育異常、尖周牙本質(zhì)發(fā)育異常、多骨纖維發(fā)育異常、假性軟骨形成脊柱骨骺發(fā)育異常(pseudoachondroplasticspondyloepiphysialdysplasia)、視網(wǎng)膜發(fā)育異常、隔眼發(fā)育異常、脊柱骨骺發(fā)育異常、和腦室橈骨發(fā)育異常。可用本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸診斷、預(yù)測、預(yù)防、和/或治療的其它贅生前紊亂包括但不限于良性異常增殖性紊亂(如良性腫瘤、纖維囊性狀況、組織肥大、腸息肉、結(jié)腸息肉、和食道發(fā)育異常)、粘膜白斑病、角化病、博溫氏病、農(nóng)民皮膚、日光性唇炎、和日光性角化病。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于診斷和/或預(yù)測與本發(fā)明多肽在其中表達(dá)的組織有關(guān)的紊亂。在另一個實(shí)施方案中，如本文所述與毒素或放射性同位素綴合的本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治療癌和贅生物，包括但不限于本文所描述的。在又一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，如本文所述與毒素或放射性同位素綴合的本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治療急性骨髓性白血病。另外，本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可影響凋亡，因此可用于治療與細(xì)胞存活增強(qiáng)或凋亡抑制有關(guān)的許多疾病。例如，可用本發(fā)明的多核苷酸、多肽、和/或激動劑或拮抗劑診斷、預(yù)測、預(yù)防、和/或治療的與細(xì)胞存活增強(qiáng)或凋亡抑制有關(guān)的疾病包括癌(諸如濾泡性淋巴瘤、具有p53突變的癌、和激素依賴性腫瘤，包括但不限于結(jié)腸癌、心臟腫瘤、胰腺癌、黑素瘤、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤、成神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤、肺癌、腸癌、睪丸癌、胃癌、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、粘液瘤、肌瘤、淋巴瘤、內(nèi)皮瘤、成骨細(xì)胞瘤、破骨細(xì)胞瘤、骨肉瘤、軟骨肉瘤、腺瘤、乳癌、前列腺癌、卡波西氏肉瘤、和卵巢癌)、自身免疫性紊亂(諸如多發(fā)性硬化癥、斯耶格倫氏綜合癥、橋本氏甲狀腺炎、膽汁性肝硬化、貝切特氏病、克羅恩氏病、多肌炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和免疫相關(guān)腎小球腎炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)和病毒感染(諸如皰疹病毒、痘病毒、和腺病毒)、炎癥、移植物抗宿主病、急性移植排除、和慢性移植排斥。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用于抑制癌的生長、發(fā)展、和/或轉(zhuǎn)移，特別是上文所列舉的。可用本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸診斷、預(yù)測、預(yù)防、和/或治療的與細(xì)胞存活增強(qiáng)有關(guān)的其它疾病或狀況包括但不限于惡性腫瘤和相關(guān)紊亂的發(fā)展和/或轉(zhuǎn)移，諸如白血病(包括急性白血病(如急性淋巴細(xì)胞性白血病、急性髓細(xì)胞性白血病(包括成髓細(xì)胞、前髓細(xì)胞(早幼粒細(xì)胞)、骨髓單核細(xì)胞、單核細(xì)胞和紅白血病))和慢性白血病(如慢性髓細(xì)胞性(粒細(xì)胞性)白血病和慢性淋巴細(xì)胞性白血病))、真性紅細(xì)胞增多、淋巴瘤(如霍奇金氏病和非霍奇金氏病)、多發(fā)性骨髓瘤、瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血癥、重鏈病、和實(shí)體瘤，包括但不限于肉瘤和癌，諸如纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內(nèi)皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤文氏腫瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌、胰腺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細(xì)胞癌、肝癌、膽管癌、絨毛膜癌、精原細(xì)胞瘤、胚胎性癌、維爾姆斯氏瘤、宮頸癌、睪丸瘤、肺癌、小細(xì)胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、星形細(xì)胞瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、顱咽管瘤、室鼓膜瘤、松果體瘤、成血管細(xì)胞瘤、聽神經(jīng)瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腦膜瘤、黑素瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、和成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤?？捎帽景l(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸診斷、預(yù)測、預(yù)防、和/或治療的與凋亡增強(qiáng)有關(guān)的疾病包括AIDS；神經(jīng)變性紊亂(諸如阿爾茨海默氏病、帕金森氏病、肌萎縮性側(cè)索硬化、色素性視網(wǎng)膜炎、小腦變性和腦瘤或前述相關(guān)疾病)；自身免疫性紊亂(諸如多發(fā)性硬化癥、斯耶格倫氏綜合癥、橋本氏甲狀腺炎、膽汁性肝硬化、貝切特氏病、克羅恩氏病、多肌炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和免疫相關(guān)腎小球腎炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)；骨髓發(fā)育異常綜合癥(諸如再生障礙性貧血)、移植物抗宿主病、缺血性損傷(諸如由心肌梗死、中風(fēng)、和再灌注損傷引起的)、肝損傷(如肝炎相關(guān)肝損傷、缺血性/再灌注損傷、膽汁淤積(膽管損傷)和肝癌)；毒素誘導(dǎo)的肝病(諸如由酒精引起的)、感染性休克、惡病體質(zhì)和食欲缺乏?？捎帽景l(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸診斷、預(yù)測、預(yù)防、和/或治療的過度增殖性疾病和/或紊亂包括但不限于位于下列部位的贅生物肝、腹部、骨、乳房、消化系統(tǒng)、胰、腹膜、內(nèi)分泌腺(腎上腺、副甲狀腺、垂體、睪丸、卵巢、胸腺、甲狀腺)、眼、頭和頸、神經(jīng)系統(tǒng)(中樞和周圍)、淋巴系統(tǒng)、骨盆、皮膚、軟組織、脾、胸腔、和泌尿生殖道。類似的，其它過度增殖性紊亂也可用本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸來診斷、預(yù)測、預(yù)防、和/或治療。這些過度增殖性紊亂的實(shí)例包括但不限于高丙種球蛋白血癥、淋巴增殖性紊亂、副蛋白血癥、紫癜、結(jié)節(jié)病、塞扎里氏綜合癥、瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血癥、高歇氏病、組織細(xì)胞增多、以及位于上文所列器官系統(tǒng)中除贅生物之外的任何其它過度增殖性疾病。另一個優(yōu)選的實(shí)施方案利用編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸來抑制異常細(xì)胞分裂，它通過使用本發(fā)明的基因療法和/或蛋白質(zhì)融合物或其片段。由此，通過將編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸插入異常增殖的細(xì)胞，其中所述多核苷酸壓制所述表達(dá)，本發(fā)明提供了用于治療細(xì)胞增殖性紊亂的方法。本發(fā)明的另一個實(shí)施方案提供了用于在個體中治療細(xì)胞增殖性紊亂的方法，包括對異常增殖的細(xì)胞施用一個或多個本發(fā)明的活性基因拷貝。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核苷酸是包含重組表達(dá)載體的DNA構(gòu)建物，該重組表達(dá)載體有效表達(dá)編碼所述多核苷酸的DNA序列。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，利用逆轉(zhuǎn)錄病毒或更優(yōu)選的腺病毒載體將編碼本發(fā)明融合蛋白的DNA構(gòu)建物插入待治療的細(xì)胞(參閱G.J.Nabel等人，PNAS，1999，96324-326，將其引入本文作為參考)。在一個最優(yōu)選的實(shí)施方案中，病毒載體是缺陷型的，且不會轉(zhuǎn)化非增殖細(xì)胞，只轉(zhuǎn)化增殖細(xì)胞。此外，在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，將本發(fā)明的多核苷酸或是單獨(dú)或是聯(lián)合或融合其它多核苷酸插入增殖細(xì)胞，然后可經(jīng)由作用于所述多核苷酸上游的啟動子以誘導(dǎo)所編碼蛋白質(zhì)產(chǎn)物表達(dá)的外部刺激(即磁性、特定小分子、化學(xué)制品、或藥物施用等)進(jìn)行調(diào)控。如此，可根據(jù)所述外部刺激明確調(diào)控本發(fā)明的有益治療效果(即提高、降低、或抑制本發(fā)明的表達(dá))。本發(fā)明的多核苷酸可用于壓制致癌基因或抗原的表達(dá)?！皦褐浦掳┗虻谋磉_(dá)”意指遏制基因轉(zhuǎn)錄、降解基因轉(zhuǎn)錄物(前信使RNA)、抑制剪接、破壞信使RNA、阻止蛋白質(zhì)翻譯后加工、破壞蛋白質(zhì)、或抑制蛋白質(zhì)正常功能。對于局部施用于異常增殖細(xì)胞，可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的任何方法來施用本發(fā)明的多核苷酸，包括但不限于細(xì)胞的轉(zhuǎn)染、電穿孔、顯微注射、或在諸如脂質(zhì)體等媒介中、脂轉(zhuǎn)染、或作為裸露的多核苷酸、或說明書全文描述的任何其它方法?？赏ㄟ^已知的基因投遞系統(tǒng)來投遞本發(fā)明的多核苷酸，諸如但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒(Gilboa，J.，Virology，44845，1982；Hocke，Nature，320275，1986；Wilson等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，853014)、牛痘病毒系統(tǒng)(Chakrabarty等人，Mol.CellBiol.，53403，1985)或本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的其它高效DNA投遞系統(tǒng)(Yates等人，Nature，313812，1985)。這些參考文獻(xiàn)只是例示性的，且引入本文作為參考。為了特異投遞或轉(zhuǎn)染異常增殖的細(xì)胞而避免不分裂的細(xì)胞，優(yōu)選采用本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的逆轉(zhuǎn)錄病毒或腺病毒(正如本領(lǐng)域和本文別處所描述的)投遞系統(tǒng)。由于逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA的整合需要宿主DNA復(fù)制，且逆轉(zhuǎn)錄病毒因缺乏其生活周期所需要的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因而不能自我復(fù)制，因此為本發(fā)明的多核苷酸采用這種逆轉(zhuǎn)錄病毒投遞系統(tǒng)將使所述基因和構(gòu)建物靶向異常增殖的細(xì)胞，且避免不分裂的正常細(xì)胞。通過使用用于指導(dǎo)注射針恰好到達(dá)疾病部位的成像裝置，可將本發(fā)明的多核苷酸直接投遞至內(nèi)臟、體腔等等中的細(xì)胞增殖性紊亂/疾病部位。本發(fā)明的多核苷酸還可在手術(shù)干預(yù)時施用至疾病部位?！凹?xì)胞增殖性疾病”意指侵襲任何一種器官、腔、或身體部分或其任意組合，特征為細(xì)胞、細(xì)胞群、或組織的單一或多重局部異常增殖(無論是良性的或是惡性的)的任何人或動物疾病或紊亂?？墒┯萌魏螖?shù)量的本發(fā)明多核苷酸，只要它對所治療細(xì)胞的增殖具有生物學(xué)抑制效果。此外，有可能將超過一種本發(fā)明多核苷酸同時施用至相同部位?！吧飳W(xué)抑制”意指部分的或完全的生長抑制，以及細(xì)胞增殖或生長速率的降低。生物學(xué)抑制劑量可通過評估本發(fā)明多核苷酸對組織培養(yǎng)中目標(biāo)惡性或異常細(xì)胞生長、動物中腫瘤生長、和細(xì)胞培養(yǎng)的效果，或者本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道的任何其它方法來確定。此外，本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于抑制增殖細(xì)胞或組織的血管發(fā)生，或是單獨(dú)作為蛋白質(zhì)融合物，或是直接或間接聯(lián)合其它多肽，正如本文別處所描述的。在一個最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗血管發(fā)生效果可間接通過例如抑制造血的、腫瘤特異細(xì)胞諸如腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)(參閱Joseph，I.B.等人，J.Natl.CancerInst.，90(21)1648-53，1998，將其引入本文作為參考)。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于通過誘導(dǎo)凋亡來抑制增殖性細(xì)胞或組織。這些融合蛋白和/或多核苷酸可或直接或間接的作用于誘導(dǎo)增殖性細(xì)胞和組織的凋亡，例如在死亡域受體的激活在，諸如腫瘤壞死因子(TNF)受體-1、CD95(Fas/APO-1)、TNF受體相關(guān)凋亡介導(dǎo)的蛋白質(zhì)(TRAMP)、及TNF相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)受體-1和-2(參閱Schulze-Osthoff，K.等人，Eur.J.Biochem.，254(3)439-59，1998，將其引入本文作為參考)。此外，在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，這些融合蛋白和/或多核苷酸可通過其它機(jī)制來誘導(dǎo)凋亡，諸如在激活凋亡的其它蛋白質(zhì)的激活中，或者通過刺激這些蛋白質(zhì)的表達(dá)，或是單獨(dú)的或是聯(lián)合小分子藥物或佐劑，諸如apoptonin、半乳凝集素、硫氧還蛋白、抗炎蛋白(參閱例如Mutat.Res.，400(1-2)447-55，1998；Med.Hypotheses，50(5)423-33，1998；Chem.Biol.Interact.，4月24日，111-11223-34，1998；J.Mol.Med.，76(6)402-12，1998；Int.J.TissueReact.，20(1)3-15，1998，將其都引入本文作為參考)。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于抑制增殖性細(xì)胞或組織的轉(zhuǎn)移。抑制可作為施用這些清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸的直接結(jié)果而發(fā)生，或者間接的，諸如激活已知抑制轉(zhuǎn)移的蛋白質(zhì)的表達(dá)，例如α4整聯(lián)蛋白(參閱例如Curr.Top.Microbiol.Immunol.，231125-41，1998，將其引入本文作為參考)。本發(fā)明的這種治療效果可或單獨(dú)或聯(lián)合小分子藥物或佐劑來實(shí)現(xiàn)。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了將含有本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸的組合物投遞至表達(dá)本發(fā)明清蛋白融合蛋白所結(jié)合的、其結(jié)合或締合的多肽的靶細(xì)胞的方法。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白可經(jīng)由疏水性、親水性、離子、和/或共價相互作用與異源多肽、異源核酸、毒素、或前體藥物締合。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白可用于增強(qiáng)增殖細(xì)胞或組織的免疫原性和/或抗原性，或是直接的，諸如如果本發(fā)明的清蛋白融合蛋白的“種痘”引起針對增殖性抗原和免疫原時將發(fā)生的，或是間接的，諸如在激活已知增強(qiáng)針對所述抗原和免疫原的免疫應(yīng)答的蛋白質(zhì)(如趨化因子)的表達(dá)中。腎紊亂本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治療、預(yù)防、診斷、和/或預(yù)測腎系統(tǒng)的紊亂?？捎帽景l(fā)明的組合物診斷、預(yù)測、預(yù)防、和/或治療的腎紊亂包括但不限于腎衰竭、腎炎、腎的血管紊亂、代謝的和先天性腎紊亂、腎的泌尿紊亂、自身免疫性紊亂、硬化和壞死、電解質(zhì)失衡、和腎癌?？捎帽景l(fā)明的組合物診斷、預(yù)測、預(yù)防、和/或治療的腎病包括但不限于急性腎衰竭、慢性腎衰竭、粥樣栓塞性腎衰竭、晚期腎病、腎的炎性疾病(如急性腎小球腎炎、感染后腎小球腎炎、快速發(fā)展的腎小球腎炎、腎病綜合癥、膜性腎小球腎炎、家族性腎病綜合癥、I和II型膜增殖性腎小球腎炎、系膜增殖性腎小球腎炎、慢性腎小球腎炎、急性腎小管間質(zhì)性腎炎、慢性腎小管間質(zhì)性腎炎、急性鏈球菌感染后腎小球腎炎(PSGN)、腎盂腎炎、狼瘡性腎炎、慢性腎炎、間質(zhì)性腎炎、和鏈球菌感染后腎小球腎炎)、腎的血管紊亂(如腎梗死、粥樣栓塞性腎病、皮質(zhì)壞死、惡性腎硬化、腎靜脈血栓形成、腎低灌注、腎性視網(wǎng)膜病、腎缺血-再灌注、腎動脈栓塞、和腎動脈狹窄)、和由泌尿道疾病引起的腎紊亂(如腎盂腎炎、腎盂積水、尿石病(腎結(jié)石、腎石病)、反流性腎病、泌尿道感染、尿滯留、和急性或慢性單側(cè)阻塞性尿路病)。另外，本發(fā)明的組合物可用于診斷、預(yù)測、預(yù)防、和/或治療腎的代謝和先天性紊亂(如尿毒癥、腎淀粉樣變性、腎性骨營養(yǎng)不良、腎小管性酸中毒、腎性糖尿、腎原性尿崩癥、胱氨酸尿癥、范康尼氏綜合癥、腎性纖維囊性骨質(zhì)生成(腎性佝僂病)、哈特納普氏病、巴特氏綜合癥、李德爾氏綜合癥、多囊性腎病、髓質(zhì)囊性病、髓質(zhì)海綿腎、阿爾波特氏綜合癥、指甲髕骨綜合癥、先天性腎病綜合癥、擠壓綜合癥、馬蹄腎、糖尿病性腎病、腎原性尿崩癥、鎮(zhèn)痛劑腎病、腎結(jié)石、和膜性腎病)、和腎的自身免疫性紊亂(如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、古德帕斯丘氏綜合癥、IgA腎病、和IgM系膜增殖性腎小球腎炎)。本發(fā)明的組合物可用于診斷、預(yù)測、預(yù)防、和/或治療腎的硬化或壞死紊亂(如腎小球硬化癥、糖尿病性腎病、局灶性節(jié)段性腎小球硬化癥(FSGS)、壞死性腎小球腎炎、和腎乳頭壞死)、腎癌(如腎瘤、腎上腺樣瘤、腎母細(xì)胞瘤、腎細(xì)胞癌、移行細(xì)胞癌、腎腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、和維爾姆斯氏瘤)、和電解質(zhì)失衡(如腎鈣沉著癥、膿尿、水腫、腎盂積水、蛋白尿癥、低鈉血癥、高鈉血癥、低鉀血癥、高鉀血癥、低鈣血癥、高鈣血癥、低磷血癥、和高磷血癥)。本發(fā)明的組合物可使用本領(lǐng)域知道的任何方法來施用，包括但不限于投遞部位的直接針注射、靜脈內(nèi)注射、局部施用、導(dǎo)管灌輸、生物射彈噴射器、粒子加速器、明膠海綿貯存物、其它商品化貯存材料、滲透泵、口服或栓劑的固態(tài)藥學(xué)制劑、手術(shù)過程中的傾倒或局部應(yīng)用、氣霧劑投遞。這些方法是本領(lǐng)域所知道的。本發(fā)明的組合物可作為治療劑的一部分來施用，下文有更為詳細(xì)的描述。投遞本發(fā)明多核苷酸的方法在本文中有更為詳細(xì)的描述。心血管紊亂本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治療、預(yù)防、診斷、和/或預(yù)測心血管紊亂，包括但不限于周圍動脈病，諸如肢體缺血。心血管紊亂包括但不限于心血管異常，諸如動脈-動脈瘺、動脈-靜脈瘺、腦動脈畸形、先天性心臟缺損、肺動脈瓣閉鎖、和彎刀綜合癥。先天性心臟缺陷包括但不限于主動脈狹窄、三房心、冠狀血管異常、十字心、右位心、動脈導(dǎo)管未閉、埃布斯坦氏畸形、艾森曼格爾氏復(fù)合癥、左心發(fā)育不全綜合癥、左位心、法洛氏四聯(lián)癥、主動脈肺動脈錯位、右心室雙出口、三尖瓣閉鎖、永存動脈干、心間隔缺損諸如主動脈肺動脈間隔缺損、心內(nèi)膜墊缺損、魯騰巴赫綜合癥、法洛氏三聯(lián)癥、心室心間隔缺損。心血管紊亂還包括但不限于心臟病，諸如心律失常、類癌心臟病、高心排血量、低心排血量、心臟壓塞、心內(nèi)膜炎(包括細(xì)菌性的)、心動脈瘤、心臟停搏、充血性心力衰竭、充血性心肌病、陣發(fā)性呼吸困難、心源性水腫、心臟肥大、充血性心肌病、左心室肥大、右心室肥大、梗死后心臟破裂、室間隔破裂、心臟瓣膜疾病、心肌疾病、心肌缺血、心包積液、心包炎(包括縮窄性和結(jié)核性)、心包積氣、心包切開術(shù)后綜合癥、肺原性心臟病、風(fēng)濕性心臟病、心室機(jī)能障礙、充血、心血管妊娠并發(fā)癥、彎刀綜合癥、心血管梅毒、和心血管結(jié)核病。心律失常包括但不限于竇性心律不齊、心房纖顫、心房撲動、心動過緩、期外收縮、亞當(dāng)姆-斯托克司綜合癥、束支傳導(dǎo)阻滯、竇房傳導(dǎo)阻滯、長QT綜合癥、并行收縮、朗-甘-萊三氏綜合癥、馬海姆型預(yù)激綜合癥、沃-帕-懷綜合癥、病竇綜合癥、心動過速、和心室纖顫。心動過速包括陣發(fā)性心動過速、室上性心動過速、加速性心室自主心律、房室結(jié)內(nèi)折返性心動過速、異位性房性心動過速、異位性交接區(qū)性心動過速、竇房結(jié)內(nèi)折返性心動過速、竇性心動過速、尖端扭轉(zhuǎn)型室性心動過速、和室性心動過速。心臟瓣膜疾病包括但不限于主動脈瓣閉鎖不全、主動脈瓣狹窄、心雜音、主動脈瓣脫垂、二尖瓣脫垂、三尖瓣脫垂、二尖瓣閉鎖不全、二尖瓣狹窄、肺動脈瓣閉鎖、肺動脈瓣閉鎖不全、肺動脈瓣狹窄、三尖瓣閉鎖、三尖瓣閉鎖不全、和三尖瓣狹窄。心肌疾病包括但不限于酒精中毒性心肌病、充血性心肌病、肥厚型心肌病、主動脈瓣下狹窄、肺動脈瓣下狹窄、限制型心肌病、查格斯氏心肌病、心內(nèi)膜彈力纖維增生癥、心肌內(nèi)膜纖維化、卡爾恩斯氏綜合癥、心肌再灌注損傷、和心肌炎。心肌缺血包括但不限于冠狀動脈疾病，諸如心絞痛、冠狀動脈瘤、冠狀動脈硬化、冠狀動脈血栓形成、冠狀動脈痙攣、心肌梗死、和心肌頓抑。心血管疾病還包括血管疾病，諸如動脈瘤、血管發(fā)育不良、血管瘤、桿菌性血管瘤、希-林二氏病、克-特-韋三氏綜合癥、斯德奇-韋伯綜合癥、血管神經(jīng)性水腫、主動脈疾病、高安氏動脈炎、主動脈炎、勒里施氏綜合癥、動脈閉塞性疾病、動脈炎、enarteritis、結(jié)節(jié)性多動脈炎、腦血管紊亂、糖尿病性血管病、糖尿病性視網(wǎng)膜病、栓塞、血栓形成、紅斑性肢痛癥、痔瘡、肝靜脈閉塞性疾病、高血壓、低血壓、局部缺血、周圍血管疾病、靜脈炎、肺靜脈閉塞性疾病、雷諾氏病、CREST綜合癥、視網(wǎng)膜靜脈閉塞、彎刀綜合癥、上腔靜脈綜合癥、毛細(xì)管擴(kuò)張、共濟(jì)失調(diào)性毛細(xì)管擴(kuò)張、遺傳性出血性毛細(xì)血管擴(kuò)張癥、精索靜脈曲張、靜脈曲張、靜脈曲張性潰瘍、血管炎、和靜脈機(jī)能不全。動脈瘤包括但不限于分割性動脈瘤、假性動脈瘤、感染性動脈瘤、破裂性動脈瘤、主動脈瘤、腦動脈瘤、冠狀動脈動脈瘤、心臟動脈瘤、和髂動脈瘤。動脈閉塞性疾病包括但不限于動脈硬化、間歇性跛行、頸動脈狹窄、纖維肌性發(fā)育異常、腸系膜血管閉塞、煙霧病、腎動脈閉塞、視網(wǎng)膜動脈閉塞、和血栓閉塞性血管炎。腦血管紊亂包括但不限于頸動脈疾病、大腦淀粉樣血管病、腦動脈瘤、腦缺氧、腦動脈硬化、腦動靜脈畸形、腦動脈疾病、腦栓塞和血栓形成、頸動脈血栓形成、靜脈竇血栓形成、瓦倫伯格氏綜合癥、腦出血、硬腦膜外血腫、硬腦膜下血腫、蛛網(wǎng)膜下出血、腦梗死、腦缺血(包括暫時性)、鎖骨下動脈盜血綜合癥、腦室周圍白質(zhì)軟化、血管性頭痛、叢集性頭痛、偏頭痛、和脊椎基底動脈機(jī)能不全。栓塞包括但不限于空氣栓塞、羊水栓塞、膽固醇栓塞、藍(lán)趾綜合癥、脂肪栓塞、肺栓塞、和血栓栓塞。血栓形成包括但不限于冠狀動脈血栓形成、肝靜脈血栓形成、視網(wǎng)膜靜脈閉塞、頸動脈血栓形成、靜脈竇血栓形成、瓦倫伯格氏綜合癥、和血栓性靜脈炎。局部缺血性紊亂包括但不限于腦缺血、缺血性結(jié)腸炎、間隔綜合癥(compartmentsyndrome)、脛前肌綜合癥(anteriorcompartmentsyndrome)、心肌缺血、再灌注損傷、和四肢缺血(peripherallimbischemia)。血管炎包括但不限于主動脈炎、動脈炎、貝切特氏綜合癥、丘-斯二氏綜合癥、粘膜皮膚淋巴結(jié)綜合癥、血栓閉塞性血管炎、超敏性血管炎、許蘭-亨諾二氏紫癜、變應(yīng)性皮膚血管炎、和瓦格納氏肉芽腫。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可使用本領(lǐng)域知道的任何方法來施用，包括但不限于投遞部位的直接針注射、靜脈內(nèi)注射、局部施用、導(dǎo)管灌輸、生物射彈噴射器、粒子加速器、明膠海綿貯存物、其它商品化貯存材料、滲透泵、口服或栓劑的固態(tài)藥學(xué)制劑、手術(shù)過程中的傾倒或局部應(yīng)用、氣霧劑投遞。這些方法是本領(lǐng)域所知道的。投遞多核苷酸的方法在本文中有更為詳細(xì)的描述。呼吸紊亂本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治療、預(yù)防、診斷、和/或預(yù)測呼吸系統(tǒng)的疾病和/或紊亂。呼吸系統(tǒng)的疾病和紊亂包括但不限于鼻前庭炎、非變應(yīng)性鼻炎(如急性鼻炎、慢性鼻炎、萎縮性鼻炎、血管運(yùn)動性鼻炎)、鼻息肉和鼻竇炎、幼年型血管纖維瘤、鼻癌和幼年型乳頭狀瘤、聲帶息肉、小結(jié)(歌手小結(jié))、接觸性潰瘍、聲帶麻痹、喉膨出、咽炎(如病毒性和細(xì)菌性)、扁桃體炎、扁桃體蜂窩織炎、咽旁膿腫、喉炎、喉膨出、和咽喉癌(如鼻咽癌、扁桃體癌、喉癌)、肺癌(如鱗狀細(xì)胞癌、小細(xì)胞(燕麥形細(xì)胞)癌、大細(xì)胞癌、和腺癌)、變應(yīng)性紊亂(嗜曙紅細(xì)胞性肺炎、超敏性肺炎(如外源性變應(yīng)性肺泡炎、變應(yīng)性間質(zhì)性肺炎、有機(jī)粉塵塵肺病、變應(yīng)性支氣管肺曲霉病、哮喘、瓦格納氏肉芽腫(肉芽腫脈管炎)、古德帕斯丘氏綜合癥))、肺炎(如細(xì)菌性肺炎(如肺炎鏈球菌Streptococcuspneumoniae(肺炎球菌肺炎)、金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus(葡萄球菌肺炎)、革蘭氏陰性細(xì)菌性肺炎(由例如克雷伯氏菌屬Klebsiella和假單胞菌屬Pseudomonas引起)、肺炎枝原體Mycoplasmapneumoniae肺炎、流感嗜血菌Hemophilusinfluenzae肺炎、軍團(tuán)菌Legionella肺炎(軍團(tuán)病)、和鸚鵡熱衣原體Chlamydiapsittaci(鸚鵡熱))、和病毒性肺炎(如流感、禽痘(水痘))。其它呼吸系統(tǒng)疾病和紊亂包括但不限于細(xì)支氣管炎、脊髓灰質(zhì)炎、哮吼、呼吸道合胞體病毒感染、腮腺炎、傳染性紅斑(第五病)、幼兒急疹、進(jìn)行性風(fēng)疹全腦炎、德國麻疹(風(fēng)疹)、和亞急性硬化性全腦炎、真菌性肺炎(如組織胞漿菌病、球孢子菌病、芽生菌病、免疫系統(tǒng)受到嚴(yán)重遏制的人中的真菌感染(如由新型隱球酵母Cryptococcusneoformans引起的隱球菌??；由曲霉屬Aspergillus引起的曲霉?。挥杉俳z酵母屬Candida引起的假絲酵母?。缓兔共?)、卡氏肺囊蟲Pneumocystiscarinii(肺囊蟲性肺炎)、非典型性肺炎(如枝原體屬和衣原體屬)、機(jī)會性感染肺炎、醫(yī)院性肺炎、化學(xué)性肺炎、和吸入性肺炎、胸膜紊亂(如胸膜炎、胸腔積液、和氣胸(如簡單自發(fā)性氣胸、復(fù)雜自發(fā)性氣胸、張力性氣胸))、阻塞性呼吸道疾病(如哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、肺氣腫、慢性或急性支氣管炎)、職業(yè)性肺病(如硅沉著病、黑肺病(煤工肺塵埃沉著病)、石棉沉著病、鈹中毒、職業(yè)性哮喘、棉屑沉著病、和良性肺塵埃沉著病)、浸潤性肺病(如肺纖維化(如纖維化肺泡炎、常見間質(zhì)性肺炎)、特發(fā)性肺纖維化、脫屑性間質(zhì)性肺炎、淋巴樣間質(zhì)性肺炎、組織細(xì)胞增多癥X(如萊特勒-西韋病、漢-許-克病、嗜曙紅細(xì)胞肉芽腫)、特發(fā)性肺含鐵血黃素沉著癥、結(jié)節(jié)病和肺泡蛋白沉著癥)、急性呼吸窘迫綜合癥(也成為例如成人呼吸窘迫綜合癥)、水腫、肺栓塞、支氣管炎(如病毒性、細(xì)菌性)、支氣管擴(kuò)張、肺不張、肺膿腫(由例如金黃色葡萄球菌或侵肺軍團(tuán)菌Legionellapneumophila引起)、和囊性纖維化?？寡馨l(fā)生活性在血管發(fā)生的內(nèi)源刺激物和抑制物之間的天然存在平衡中抑制的影響占優(yōu)勢。Rastinejad等人，Cell，56345-355，1989。在正常生理學(xué)狀況下發(fā)生新血管形成的罕見的情況中，諸如傷口愈合、器官再生、胚胎發(fā)育、和女性生殖過程，血管發(fā)生受到嚴(yán)格的調(diào)控且限定了空間和時間。在病理性血管發(fā)生的狀況下，諸如表現(xiàn)出實(shí)體瘤生長，這些調(diào)控控制失敗了。不受調(diào)控的血管發(fā)生成為病態(tài)并支持許多贅生和非贅生疾病的發(fā)展。許多嚴(yán)重的疾病受到異常新血管形成的支配，包括實(shí)體瘤生長和轉(zhuǎn)移、關(guān)節(jié)炎、有些類型的眼科紊亂、和銀屑病。參閱例如下列綜述Moses等人，Biotech.，9630-634，1991；Folkman等人，N.Engl.J.Med.，3331757-1763，1995；Auerbach等人，J.Microvasc.Res.，29401-411，1985；Folkman，《AdvancesinCancerResearch》，Klein和Weinhouse編，AcademicPress，NewYork，pp.175-203，1985；Patz，Am.J.Opthalmol.，94715-743，1982；及Folkman等人，Science，221719-725，1983。在許多病理性狀況中，血管發(fā)生過程有助于疾病狀態(tài)。例如，已經(jīng)積累了大量的證據(jù)表明實(shí)體瘤的生長依賴于血管發(fā)生。Folkman和Klagsbrun，Science，235442-447，1987。本發(fā)明提供了通過施用本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸對與新血管形成有關(guān)的疾病或紊亂的治療?？捎帽景l(fā)明的多核苷酸和多肽或者激動劑或拮抗劑治療的惡性和轉(zhuǎn)移狀況包括但不限于惡性腫瘤、實(shí)體瘤、及本文描述的和本領(lǐng)域其它途徑知道的癌(關(guān)于這些紊亂的綜述參閱Fishman等人，《Medicine》，第2版，J.B.LippincottCo.，Philadelphia，1985)。由此，本發(fā)明提供了治療血管發(fā)生相關(guān)疾病和/或紊亂的方法，包括對有所需要的個體施用治療有效量的本發(fā)明清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸。例如，本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于多種其它方法，從而在治療上治療癌或治療?？捎帽景l(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸治療的癌包括但不限于實(shí)體瘤，包括前列腺、肺、乳房、卵巢、胃、胰、喉、食道、睪丸、肝、腮腺、膽管、結(jié)腸、直腸、宮頸、子宮、子宮內(nèi)膜、腎、膀胱、甲狀腺癌；原發(fā)性腫瘤和轉(zhuǎn)移；黑素瘤；成神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤；卡波西氏肉瘤；平滑肌肉瘤；非小細(xì)胞非癌；結(jié)腸直腸癌；高級惡性腫瘤；和血液傳播腫瘤，諸如白血病。例如，本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可局部投遞以治療癌，諸如皮膚癌、頭和頸腫瘤、乳瘤、和卡波西氏肉瘤。在其它方面，本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可通過例如膀胱內(nèi)施用用于治療淺表形式的膀胱癌。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可通過注射或?qū)Ч苤苯油哆f到腫瘤內(nèi)或腫瘤部位附近。當(dāng)然，正如普通技術(shù)人員將領(lǐng)會的，適當(dāng)?shù)氖┯媚Ｊ綄⒏鶕?jù)待治療的癌而變化。本文還討論了其它投遞模式。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治療除癌以外的牽涉血管發(fā)生的其它紊亂。這些紊亂包括但不限于良性腫瘤，例如血管瘤、聽神經(jīng)瘤、神經(jīng)纖維瘤、沙眼、和膿性肉芽腫；動脈粥樣硬化斑塊；眼的血管發(fā)生性疾病，例如糖尿病性視網(wǎng)膜病、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病、黃斑變性、角膜移植排斥、新生血管性青光眼、晶狀體后纖維組織增生、發(fā)紅、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤、眼的葡萄膜炎和翼狀胬肉(異常血管生長)；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；銀屑病；傷口愈合遲緩；子宮內(nèi)膜異位；血管新生(vasculogenesis)；肉芽形成；肥厚性瘢痕(瘢痕疙瘩)；不連接骨折；硬皮?。簧逞?；血管粘附；心肌血管發(fā)生；冠狀動脈側(cè)枝；腦側(cè)枝；動靜脈畸形；缺血性四肢血管發(fā)生(ischemiclimbangiogenesis)；奧-韋二氏綜合癥；斑塊新血管形成；毛細(xì)管擴(kuò)張；血友病性關(guān)節(jié)；血管纖維瘤；纖維肌肉發(fā)育異常；傷口肉芽形成；克羅恩氏??；和動脈粥樣硬化。例如，在本發(fā)明的一個方面，提供了用于治療肥厚性瘢痕和瘢痕疙瘩的方法，包括對肥厚性瘢痕或瘢痕疙瘩施用本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸的步驟。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸直接注射到肥厚性瘢痕或瘢痕疙瘩中以預(yù)防這些損傷的發(fā)展。該療法在已知導(dǎo)致肥厚性瘢痕和瘢痕疙瘩(如燒傷)發(fā)展的狀況的預(yù)防性治療中特別有價值，且優(yōu)選在增殖期有時間發(fā)展后(最初損傷后約14天)但在肥厚性瘢痕或瘢痕疙瘩發(fā)展前啟動。如上所述，本發(fā)明還提供了用于治療眼的新血管疾病的方法，包括例如角膜新血管形成、新生血管性青光眼、增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病、晶狀體后纖維組織增生、和黃斑變性。此外，可用本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸治療的與新血管形成有關(guān)的眼科紊亂包括但不限于新生血管性青光眼、糖尿病性視網(wǎng)膜病、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤、晶狀體后纖維組織增生、葡萄膜炎、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病、黃斑變性、角膜移植新血管形成、以及與脈絡(luò)膜或虹膜新血管形成有關(guān)的眼科炎性疾病、眼瘤、和疾病。參閱例如下列綜述Waltman等人，Am.J.Ophthal.，85704-710，1978；及Gartner等人，Surv.Ophthal.，22291-312，1978。由此，在本發(fā)明的一個方面，提供了用于治療眼的新血管疾病的方法，諸如角膜新血管形成(包括角膜移植新血管形成)，包括對患者對角膜施用治療有效量的化合物(如本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸)的步驟，使得血管的形成受到抑制。簡而言之，角膜是在正常情況下缺乏血管的組織。然而，在某些病理狀況中，毛細(xì)管可由角膜和鞏膜連接處的角膜周圍血管叢延伸進(jìn)入角膜。當(dāng)角膜成為血管化后，它也就變得模糊，導(dǎo)致患者的視力下降。如果角膜變得完全不透明了，則可完全喪失視力。極其多種紊亂可導(dǎo)致角膜新血管形成，包括例如角膜感染(如沙眼、單純皰疹性角膜炎、利什曼病、和盤尾絲蟲病)、免疫學(xué)過程(如移植排斥和斯-約二氏綜合癥)、堿燒傷、創(chuàng)傷、炎癥(任何原因)、中毒和營養(yǎng)缺乏狀態(tài)、及作為佩戴隱形眼鏡的并發(fā)癥。在本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，可在鹽水中(聯(lián)合常用于眼科制備物的任何防腐劑和抗微生物劑)制備用于局部施用，并以滴眼液的形式施用。溶液或懸浮液可以其純的形式制備，并每天施用數(shù)次?；蛘?，如上所述制備的抗血管發(fā)生組合物還可直接施用于角膜。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗血管發(fā)生組合物與結(jié)合角膜的粘膜粘合聚合物一起制備。在其它實(shí)施方案中，抗血管發(fā)生因子或抗血管發(fā)生組合物可用作常規(guī)類固醇療法的輔助療法。局部療法還可在預(yù)防上用于已知具有誘導(dǎo)血管發(fā)生應(yīng)答(諸如化學(xué)燒傷)的高概率的角膜損傷。在這些情況中，可立即開始治療，有可能聯(lián)合類固醇，以幫助預(yù)防后續(xù)并發(fā)癥。在其它實(shí)施方案中，上文所述化合物可由眼科醫(yī)師在顯微鏡指導(dǎo)下直接注射到角膜基質(zhì)中。優(yōu)選的注射部位可隨個別損傷的形態(tài)學(xué)而變化，但是施用的目標(biāo)將是將組合物置于血管結(jié)構(gòu)的前沿(即散布于血管和正常角膜之間)。在大多數(shù)情況中，這將牽涉角膜和鞏膜連接處周圍的角膜注射以“保護(hù)”角膜免于推進(jìn)的血管。該方法還可在角膜損傷后不僅使用，從而預(yù)防性的預(yù)防角膜新血管形成。在這種情況中，可將物質(zhì)注射到角膜和鞏膜連接處周圍的角膜中，散布于角膜損傷及其不想要的潛在角膜和鞏膜連接處血液供應(yīng)之間。這種方法還可以類似方式用于預(yù)防移植角膜的毛細(xì)管入侵。在持續(xù)釋放形式中，每年可能只需要2-3次注射。還可向注射液中添加類固醇以減少由注射本身引起的炎癥。在本發(fā)明的另一個方面，提供了用于治療新生血管性青光眼的方法，包括對患者對眼施用治療有效量的本發(fā)明清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸的步驟，使得血管的形成受到抑制。在一個實(shí)施方案中，化合物可局部施用至眼以治療早期形式的新生血管性青光眼。在其它實(shí)施方案中，化合物可通過注射灌輸?shù)角胺拷菂^(qū)域中。在其它實(shí)施方案中，化合物還可置于任何部位，使得化合物連續(xù)釋放到房水中。在本發(fā)明的另一個方面，提供了用于治療增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病的方法，包括對患者對眼施用治療有效量的本發(fā)明清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸的步驟，使得血管的形成受到抑制。在本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，可通過注射到房水或玻璃體中以提高多核苷酸、多肽、拮抗劑、和/或激動劑在視網(wǎng)膜中的局部濃度來治療增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病。優(yōu)選的是，這種治療應(yīng)當(dāng)在獲得需要光凝固術(shù)的嚴(yán)重疾病前啟動。在本發(fā)明的另一個方面，提供了用于治療晶狀體后纖維組織增生的方法，包括對患者對眼施用治療有效量的本發(fā)明清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸的步驟，使得血管的形成受到抑制?；衔锟赏ㄟ^玻璃體內(nèi)注射和/或眼內(nèi)植入局部施用。另外，可用本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸治療的紊亂包括但不限于血管瘤、關(guān)節(jié)炎、銀屑病、血管纖維瘤、動脈粥樣硬化斑塊、傷口愈合遲緩、肉芽形成、血友病性關(guān)節(jié)、肥厚性瘢痕、不連接骨折、奧-韋二氏綜合癥、膿性肉芽腫、硬皮病、沙眼、和血管粘附。此外，可用本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸治療、預(yù)防、診斷、和/或預(yù)測的紊亂和/或狀態(tài)包括但不限于實(shí)體瘤、血液傳播腫瘤諸如白血病、腫瘤轉(zhuǎn)移、卡波西氏肉瘤、良性腫瘤例如血管瘤、聽神經(jīng)瘤、神經(jīng)纖維瘤、沙眼、和膿性肉芽腫、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病、眼科血管發(fā)生疾病例如糖尿病性視網(wǎng)膜病、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病、黃斑變性、角膜移植排斥、新生血管性青光眼、晶狀體后纖維組織增生、發(fā)紅、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤、和葡萄膜炎、傷口愈合遲緩、子宮內(nèi)膜異位、血管新生、肉芽形成、肥厚性瘢痕(瘢痕疙瘩)、不連接骨折、硬皮病、沙眼、血管粘附、心肌血管發(fā)生、冠狀動脈側(cè)枝、腦側(cè)枝、動靜脈畸形、缺血性四肢血管發(fā)生、奧-韋二氏綜合癥、斑塊新血管形成、毛細(xì)管擴(kuò)張、血友病性關(guān)節(jié)、血管纖維瘤、纖維肌肉發(fā)育異常、傷口肉芽形成、克羅恩氏病、動脈粥樣硬化、通過防止胚胎植入控制月經(jīng)所需要的血管形成的避孕藥、具有血管發(fā)生作為病理后果的疾病諸如貓抓病(Rocheleminaliaquintosa)、潰瘍(幽門螺桿菌Helicobacterpylori)、巴爾通體病、和桿菌性血管瘤病。在節(jié)育方法的一個方面，在性交和受精發(fā)生之前或之后施用數(shù)量足以阻斷胚胎植入的化合物，由此提供有效的節(jié)育方法，可能是“宿醉”方法。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸還可用于控制月經(jīng)，或者在子宮內(nèi)膜異位的治療中或是作為腹腔灌洗液或是用于腹腔植入而施用。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可摻入外科縫合線以預(yù)防針腳肉芽腫。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于極其多種外科程序。例如，在本發(fā)明的一個方面，組合物(例如噴霧劑或薄膜的形式)可用于在切除腫瘤前對特定區(qū)域的涂抹或噴灑，從而將正常的周圍組織與惡性組織分開，和/或預(yù)防疾病擴(kuò)散至周圍組織。在本發(fā)明的其它方面，組合物(例如噴霧劑的形式)可通過內(nèi)窺鏡檢查程序投遞，從而覆蓋腫瘤或移植所需部位的血管發(fā)生。在本發(fā)明的另一些方面，經(jīng)本發(fā)明抗血管發(fā)生組合物包被的外科網(wǎng)狀織物可用于可利用外科網(wǎng)狀織物的任何程序。例如，在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，裝載了本發(fā)明抗血管發(fā)生組合物的外科網(wǎng)狀織物可用于腹癌切除術(shù)過程(例如結(jié)腸切除術(shù)后)，從而提供對結(jié)構(gòu)的支持并釋放一定量的抗血管發(fā)生因子。在本發(fā)明的其它方面，提供了用于治療腫瘤切除部位的方法，包括在切除術(shù)后對腫瘤的切除邊緣施用本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸，使得癌的原地(local)復(fù)發(fā)和該部位新血管的形成受到抑制。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，抗血管發(fā)生組合物直接施用至腫瘤切除部位(例如通過用抗血管發(fā)生化合物抹、刷、或其它方式覆蓋腫瘤的切除邊緣來應(yīng)用)?；蛘?，抗血管發(fā)生化合物可在施用前摻入已知的外科貼劑。在本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗血管發(fā)生化合物在惡性腫瘤的肝切除術(shù)后和在神經(jīng)外科手術(shù)后應(yīng)用。在本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可施用于極其多種腫瘤的切除邊緣，包括例如乳房、結(jié)腸、腦、和肝腫瘤。例如，在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，抗血管發(fā)生化合物可在切除術(shù)后施用于神經(jīng)學(xué)腫瘤部位，使得該部位新血管的形成受到抑制。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸還可與其它抗血管發(fā)生因子一起施用。其它抗血管發(fā)生因子的代表性實(shí)例包括抗侵入因子、視黃酸及其衍生物、紫杉醇(Paclitaxel)、蘇拉明、金屬蛋白酶-1的組織抑制物、金屬蛋白酶-2的組織抑制物、纖溶酶原激活物抑制劑-1、纖溶酶原激活物抑制劑-2、和各種形式的較輕“d組”過渡金屬。較輕“d組”過渡金屬包括例如釩、鉬、鎢、鈦、鈮、和鉭核素。這些過渡金屬核素可形成過渡金屬復(fù)合物。上述過渡金屬核素的合適復(fù)合物包括氧絡(luò)過渡金屬復(fù)合物。釩復(fù)合物的代表性實(shí)例包括氧絡(luò)釩復(fù)合物，諸如釩酸鹽和氧釩根復(fù)合物。合適的釩酸鹽復(fù)合物包括偏釩酸鹽和正釩酸鹽復(fù)合物，諸如例如偏釩酸銨、偏釩酸鈉、和正釩酸鈉。合適的氧釩根復(fù)合物包括例如乙酰丙酮氧釩和硫酸氧釩包括硫酸氧釩水合物諸如一和三水合硫酸氧釩。鎢和鉬復(fù)合物的代表性實(shí)例也包括氧絡(luò)復(fù)合物。合適的氧絡(luò)鎢復(fù)合物包括鎢酸鹽和氧化鎢復(fù)合物。合適的鎢酸鹽復(fù)合物包括鎢酸銨、鎢酸鈣、二水合鎢酸鈉、和鎢酸。合適的氧化鎢包括氧化鎢(IV)和氧化鎢(VI)。合適的氧絡(luò)鉬復(fù)合物包括鉬酸鹽、氧化鉬、和氧鉬根復(fù)合物。合適的鉬酸鹽復(fù)合物包括鉬酸銨及其水合物、鉬酸鈉及其水合物、和鉬酸鉀及其水合物。合適的氧化鉬包括氧化鉬(VI)、氧化鉬(VI)、和鉬酸。合適的氧鉬根復(fù)合物拷貝例如乙酰丙酮氧鉬。其它合適的鎢和鉬復(fù)合物包括由例如甘油、酒石酸、和糖類衍生的配位羥衍生物。極其多種其它抗血管發(fā)生因子也可用于本發(fā)明的內(nèi)容。代表性的實(shí)例包括血小板因子4；硫酸魚精蛋白；硫酸殼多糖衍生物(由雪花蟹殼制備)(Murata等人，CancerRes.，5122-26，1991)；硫酸多糖肽聚糖復(fù)合物(SP-PG)(該復(fù)合物的功能可通過類固醇的存在而增強(qiáng)，諸如雌激素和檸檬酸他莫昔芬)；十字孢堿；基質(zhì)代謝的調(diào)控物，包括例如脯氨酸類似物、順式羥基脯氨酸、d，L-3，4-脫氫脯氨酸、硫雜脯氨酸、α，α-二吡啶基氨基丙腈延胡索酸酯、4-丙基-5-(4-吡啶基)-2(3H)-噁唑酮；氨甲喋呤；米托蒽醌；肝素；干擾素；2巨球蛋白-清蛋白；ChIMP-3(Pavloff等人，J.Bio.Chem.，26717321-17326，1992)；抑糜酶素(Tomkinson等人，Biochem.J.，286475-480，1992)；環(huán)糊精十四硫酸酯；Eponemycin；喜樹堿；煙曲霉素(Ingber等人，Nature，348555-557，1990)；硫代蘋果酸鈉金(“GST”；Matsubara和Ziff，J.Clin.Invest.，791440-1446，1987)；抗膠原酶血清；α2-抗纖溶酶(Holmes等人，J.Biol.Chem.，262(4)1659-1664，1987)；必桑郡(NationalCancerInstitute)；氯苯扎利二鈉(N-(2)-羧苯基-4-氯蒽茴酸(anthronilicacid)二鈉或“CCA”；Takeuchi等人，AgentsActions，36312-316，1992)；沙利度胺；抑制血管發(fā)生的類固醇；AGM-1470；羧基氨基咪唑；和金屬蛋白酶抑制物，諸如BB94。細(xì)胞水平的疾病可用本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸治療、預(yù)防、診斷、和/或預(yù)測的與細(xì)胞存活增強(qiáng)或凋亡抑制有關(guān)的疾病包括癌(諸如濾泡性淋巴瘤、具有p53突變的癌、和激素依賴性腫瘤，包括但不限于結(jié)腸癌、心臟腫瘤、胰腺癌、黑素瘤、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤、成神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤、肺癌、腸癌、睪丸癌、胃癌、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、粘液瘤、肌瘤、淋巴瘤、內(nèi)皮瘤、成骨細(xì)胞瘤、破骨細(xì)胞瘤、骨肉瘤、軟骨肉瘤、腺瘤、乳癌、前列腺癌、卡波西氏肉瘤、和卵巢癌)；自身免疫性紊亂(諸如多發(fā)性硬化癥、斯耶格倫氏綜合癥、橋本氏甲狀腺炎、膽汁性肝硬化、貝切特氏病、克羅恩氏病、多肌炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和免疫相關(guān)腎小球腎炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)和病毒感染(諸如皰疹病毒、痘病毒、和腺病毒)、炎癥、移植物抗宿主病、急性移植排除、和慢性移植排斥。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用于抑制癌的生長、發(fā)展、和/或轉(zhuǎn)移，特別是上文所列舉的?？捎帽景l(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸治療或檢測的與細(xì)胞存活增強(qiáng)有關(guān)的其它疾病或狀況包括但不限于惡性腫瘤和相關(guān)紊亂的發(fā)展和/或轉(zhuǎn)移，諸如白血病(包括急性白血病(如急性淋巴細(xì)胞性白血病、急性髓細(xì)胞性白血病(包括成髓細(xì)胞、前髓細(xì)胞(早幼粒細(xì)胞)、骨髓單核細(xì)胞、單核細(xì)胞和紅白血病))和慢性白血病(如慢性髓細(xì)胞性(粒細(xì)胞性)白血病和慢性淋巴細(xì)胞性白血病))、真性紅細(xì)胞增多、淋巴瘤(如霍奇金氏病和非霍奇金氏病)、多發(fā)性骨髓瘤、瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血癥、重鏈病、和實(shí)體瘤，包括但不限于肉瘤和癌，諸如纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內(nèi)皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤文氏腫瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌、胰腺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細(xì)胞癌、肝癌、膽管癌、絨毛膜癌、精原細(xì)胞瘤、胚胎性癌、維爾姆斯氏瘤、宮頸癌、睪丸瘤、肺癌、小細(xì)胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、星形細(xì)胞瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、顱咽管瘤、室鼓膜瘤、松果體瘤、成血管細(xì)胞瘤、聽神經(jīng)瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腦膜瘤、黑素瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、和成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤。可用本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸治療、預(yù)防、診斷、和/或預(yù)測的與凋亡增強(qiáng)有關(guān)的疾病包括但不限于AIDS；神經(jīng)變性紊亂(諸如阿爾茨海默氏病、帕金森氏病、肌萎縮性側(cè)索硬化、色素性視網(wǎng)膜炎、小腦變性和腦瘤或前述相關(guān)疾病)；自身免疫性紊亂(諸如多發(fā)性硬化癥、斯耶格倫氏綜合癥、橋本氏甲狀腺炎、膽汁性肝硬化、貝切特氏病、克羅恩氏病、多肌炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和免疫相關(guān)腎小球腎炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)；骨髓發(fā)育異常綜合癥(諸如再生障礙性貧血)、移植物抗宿主病、缺血性損傷(諸如由心肌梗死、中風(fēng)、和再灌注損傷引起的)、肝損傷(如肝炎相關(guān)肝損傷、缺血性/再灌注損傷、膽汁淤積(膽管損傷)和肝癌)；毒素誘導(dǎo)的肝病(諸如由酒精引起的)、毒素誘導(dǎo)的肝病(諸如由酒精引起的)、感染性休克、惡病體質(zhì)和食欲缺乏。傷口愈合和上皮細(xì)胞增殖依照本發(fā)明的又一個方面，提供了將本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用于治療目的的方法，例如出于傷口愈合的目的用于刺激上皮細(xì)胞增殖和基底角質(zhì)形成細(xì)胞，及用于刺激毛囊生成和真皮傷口愈合。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可在臨床上用于刺激傷口愈合，包括外科傷口、切除術(shù)傷口、牽涉真皮和表皮損傷的深傷口、眼組織傷口、牙組織傷口、口腔傷口、糖尿病性潰瘍、真皮潰瘍、肘潰瘍、動脈潰瘍、靜脈淤滯潰瘍、由熱暴露或化學(xué)藥品引起的燒傷、以及其它異常傷口愈合狀況，諸如尿毒癥、營養(yǎng)不良、維生素缺乏、及與類固醇、放療、和抗贅生藥和抗代謝物的系統(tǒng)性治療有關(guān)的并發(fā)癥。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于促進(jìn)真皮損失后的真皮重建。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于提高皮膚移植物對傷口面的粘附和用于刺激傷口面的表皮細(xì)胞再生。下面是可用本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸提高對傷口面的粘附的移植物類型自體移植物(autograft)、人造皮膚、同種異體移植物(allograft)、自體真皮移植片、自體表皮移植片、無血管移植片、布-布二氏移植片、骨移植物、胚胎移植物、皮移植片(cutisgraft)、延遲移植片、真皮移植片(dermicgraft)、表皮移植片、筋膜移植片、全層皮移植片、異種移植物(heterologousgraft)、異種移植物(xenograft)、同種異體移植物(homologousgraft)、增生性移植物、角膜薄層移植片、網(wǎng)孔皮移植片、粘膜移植物、奧-提二氏移植物、網(wǎng)膜移植物、修補(bǔ)移植物、蒂狀移植物、全層角膜移植片、分層皮移植片、厚分層皮移植片。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于提升皮膚強(qiáng)度和改善衰老皮膚的外觀。我們認(rèn)為本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸還將在肝細(xì)胞增殖及肺、乳房、胰、胃、小腸、和大腸中的上皮細(xì)胞增殖中引起變化。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖，諸如皮脂細(xì)胞(sebocyte)、毛囊、肝細(xì)胞、II型肺細(xì)胞、生成粘液素的杯形細(xì)胞、和皮膚、肺、肝、和胃腸道中含有的其它上皮細(xì)胞及其祖先。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、和基底角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸還可用于降低由放療、化療、或病毒感染引起的內(nèi)臟(gut)毒性副作用。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可具有對小腸粘膜的細(xì)胞保護(hù)效果。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸還可刺激由化療和病毒感染引起的粘膜炎(口腔潰瘍)的康復(fù)。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸還可用于完全和部分厚度皮膚缺損包括燒傷(即毛囊、汗腺、和皮脂腺的重駐)的完全再生、其它皮膚缺損諸如銀屑病的治療。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治療大皰性表皮松解癥，即表皮對下面真皮的粘附有缺陷，通過加速這些損傷的表皮細(xì)胞再生導(dǎo)致頻繁的、開放的、且疼痛的水泡。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸還可用于治療胃和十二指腸潰瘍，并通過粘膜襯里的瘢痕形成及腺粘膜和十二指腸粘膜襯里的再生幫助更快愈合。炎性腸病，諸如克羅恩氏病和潰瘍性結(jié)腸炎，指分別導(dǎo)致小腸或大腸粘膜表面破壞的疾病。由此，本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于促進(jìn)粘膜表面的新表面形成(resurfacing)以幫助更塊愈合和預(yù)防炎性腸病的發(fā)展。用本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸進(jìn)行的治療預(yù)計(jì)對整個胃腸道的粘液生成具有顯著效果，且可用于保護(hù)腸粘膜免于所攝取有害物質(zhì)或手術(shù)后的傷害。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治療與表達(dá)不足有關(guān)的疾病。此外，本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于預(yù)防和治療各種病理狀態(tài)對肺的損害?？纱碳し闻莺椭夤苌掀ぴ鲋澈头只⒋龠M(jìn)修復(fù)的本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于預(yù)防或治療急性或慢性肺損傷。例如，導(dǎo)致肺泡漸進(jìn)損失的肺氣腫和引起支氣管上皮和肺泡壞死的吸入性損傷(即由吸入煙和燒傷引起的)可使用本發(fā)明的多核苷酸或多肽、激動劑或拮抗劑有效治療。同樣，本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于刺激II型肺細(xì)胞的增殖和分化，這有助于治療或預(yù)防諸如透明膜病等疾病，諸如早產(chǎn)兒中的嬰兒呼吸窘迫綜合癥和支氣管肺發(fā)育異常。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可刺激肝細(xì)胞的增殖和分化，由此可用于減輕或治療肝病和病理學(xué)，諸如由肝硬化引起的爆發(fā)性肝衰竭、由病毒性肝炎和有毒物質(zhì)(即醋氨酚、四氯化碳(carbontetraholoride)和本領(lǐng)域已知的其它肝毒素)引起的肝損傷。另外，本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治療或預(yù)防糖尿病的發(fā)作。在最近診斷為I型和II型糖尿病、其中保留有些胰島細(xì)胞功能的患者中，本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于維持胰島功能，從而減輕、延遲、或預(yù)防疾病的永久表現(xiàn)。同樣，本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用作胰島細(xì)胞移植的輔助療法以改進(jìn)或促進(jìn)胰島細(xì)胞功能。神經(jīng)活性和神經(jīng)學(xué)疾病本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于腦和/或神經(jīng)系統(tǒng)的疾病、紊亂、損傷、或損害的診斷和/或治療?？捎帽景l(fā)明的組合物(如本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸)治療的神經(jīng)系統(tǒng)紊亂包括但不限于神經(jīng)系統(tǒng)損傷，以及導(dǎo)致軸突斷開、神經(jīng)元消減或變性、或脫髓鞘疾病或紊亂。可依照本發(fā)明的方法在患者(包括人和非人哺乳動物患者)中治療的神經(jīng)系統(tǒng)損傷包括但不限于下列中樞(包括脊髓、腦)或周圍神經(jīng)系統(tǒng)損傷(1)缺血性損傷，其中部分神經(jīng)系統(tǒng)缺氧導(dǎo)致神經(jīng)元損傷或死亡，包括腦梗死或缺血或者脊髓梗死或缺血；(2)外傷性損傷，包括由物理傷害引起的或與手術(shù)有關(guān)的損傷，例如切斷部分神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，或者壓傷；(3)惡性損傷，其中部分神經(jīng)系統(tǒng)遭到惡性組織的破壞或損傷，該惡性組織或是神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)惡性腫瘤或是由非神經(jīng)系統(tǒng)組織衍生的惡性腫瘤；(4)感染性損傷，其中部分神經(jīng)系統(tǒng)因?yàn)楦腥径獾狡茐幕驌p傷，例如通過沙眼或者與人免疫缺陷病毒、帶狀皰疹、或單純皰疹病毒感染或與萊姆病、結(jié)核病、或梅毒有關(guān)；(5)變性損傷，其中部分神經(jīng)系統(tǒng)因?yàn)樽冃赃^程而遭到破壞或損傷，包括但不限于與帕金森氏病、阿爾茨海默氏病、亨廷頓氏舞蹈病、或肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)有關(guān)的變性；(6)與營養(yǎng)性疾病或紊亂有關(guān)的損傷，其中部分神經(jīng)系統(tǒng)因新陳代謝的營養(yǎng)性疾病或紊亂而遭到破壞或損傷，包括但不限于維生素B12缺乏、葉酸缺乏、韋尼克病、煙酒性弱視、馬-比二氏病(原發(fā)性胼胝體變性)、和酒精性小腦變性；(7)與系統(tǒng)性疾病有關(guān)的神經(jīng)學(xué)損傷，包括但不限于糖尿病(糖尿病性神經(jīng)病、貝耳氏面癱)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、癌、或結(jié)節(jié)病；(8)由有毒物質(zhì)引起的損傷，包括酒精、鉛、或特定神經(jīng)毒素；和(9)脫髓鞘損傷，其中部分神經(jīng)系統(tǒng)因脫髓鞘疾病而遭到破壞或損傷，包括但不限于多發(fā)性硬化癥、人免疫缺陷病毒相關(guān)脊髓病、橫貫性脊髓病或各種病因?qū)W、進(jìn)行性多灶性白質(zhì)腦病、和腦橋中央髓鞘溶解。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用于保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免于低氧的損害作用。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用于包含神經(jīng)細(xì)胞免于腦缺氧的損害作用。根據(jù)這個實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物用于治療或預(yù)防與腦缺氧有關(guān)的神經(jīng)細(xì)胞損傷。在這個實(shí)施方案的一個非排他性方面，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用于治療或預(yù)防與腦缺血有關(guān)的神經(jīng)細(xì)胞損傷。在這個實(shí)施方案的另一個非排他性方面，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用于治療或預(yù)防與腦梗死有關(guān)的神經(jīng)細(xì)胞損傷。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用于治療或預(yù)防與中風(fēng)有關(guān)的神經(jīng)細(xì)胞損傷。在一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用于治療或預(yù)防與中風(fēng)有關(guān)的腦神經(jīng)細(xì)胞損傷。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用于治療或預(yù)防與心臟病發(fā)作有關(guān)的神經(jīng)細(xì)胞損傷。在一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用于治療或預(yù)防與心臟病發(fā)作有關(guān)的腦神經(jīng)細(xì)胞損傷?？捎糜谥委熁蝾A(yù)防神經(jīng)系統(tǒng)紊亂的本發(fā)明組合物可通過測試在促進(jìn)神經(jīng)元存活或分化中的生物學(xué)活性來選擇。例如，而非作為限制，引發(fā)任何下列效果的組合物可依照本發(fā)明使用(1)在存在或缺乏缺氧或低氧條件中增加神經(jīng)元在培養(yǎng)中的存活時間；(2)在培養(yǎng)中或在體內(nèi)增加神經(jīng)元的發(fā)芽；(3)在培養(yǎng)中或在體內(nèi)增加神經(jīng)元相關(guān)分子的生成，如就運(yùn)動神經(jīng)元而言是膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶或乙酰膽堿酯酶；或(4)在體內(nèi)減少神經(jīng)元功能障礙。這些效果可通過本領(lǐng)域知道的任何方法來測量。在優(yōu)選的非限制性實(shí)施方案中，增加神經(jīng)元的存活可使用本文所列舉的或本領(lǐng)域其它途徑知道的方法來常規(guī)測量，諸如例如Zhang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，973637-42，2000或Arakawa等人，J.Neurosci.，103507-15，1990；增加神經(jīng)元的發(fā)芽可通過本領(lǐng)域知道的方法來測量，諸如例如Pestronk等人，Exp.Neurol.，7065-82，1980或Brown等人，Ann.Rev.Neurosci.，41742，1981中列舉的方法；增加神經(jīng)元相關(guān)分子的生成可使用本領(lǐng)域知道的且取決于待測量分子的技術(shù)通過生物測定法、酶促測定法、抗體結(jié)合、Northern印跡測定法等來測量；而運(yùn)動神經(jīng)元功能障礙可通過評估運(yùn)動神經(jīng)元紊亂的身體表現(xiàn)(physicalmanifestation)來測量，例如虛弱、運(yùn)動神經(jīng)元傳導(dǎo)速度、或功能殘疾。在具體的實(shí)施方案中，可依照本發(fā)明治療的運(yùn)動神經(jīng)元紊亂包括但不限于諸如下列紊亂，梗死形成、感染、暴露于毒素、外傷、手術(shù)損傷、可影響運(yùn)動神經(jīng)元及神經(jīng)系統(tǒng)其它成分的變性疾病或惡性腫瘤、以及選擇性影響神經(jīng)元的紊亂諸如肌萎縮側(cè)索硬化，包括但不限于進(jìn)行性脊髓性肌萎縮、進(jìn)行性延髓性麻痹、原發(fā)性側(cè)索硬化、嬰兒型和幼年型肌萎縮、兒童期進(jìn)行性延髓性麻痹(法奇奧-隆德二氏綜合癥)、脊髓灰質(zhì)炎和脊髓灰質(zhì)炎后綜合癥、和遺傳性運(yùn)動感覺神經(jīng)病(夏科-馬里-圖思三氏病)。另外，本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可在神經(jīng)元存活、突觸形成、傳導(dǎo)、神經(jīng)分化等中發(fā)揮作用。由此，本發(fā)明的組合物(包括本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸)可用于診斷和/或治療或預(yù)防與這些作用有關(guān)的疾病或紊亂，包括但不限于學(xué)習(xí)和/或認(rèn)知紊亂。本發(fā)明的組合物還可用于治療或預(yù)防神經(jīng)變性疾病狀態(tài)和/或行為紊亂。這些神經(jīng)變性疾病狀態(tài)和/或行為紊亂包括但不限于阿爾茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷頓氏病、圖雷特多綜合癥、精神分裂癥、躁狂癥、癡呆、偏執(zhí)狂、強(qiáng)制性紊亂、驚恐性紊亂、學(xué)習(xí)無能、ALS、精神病、孤獨(dú)癥、和行為改變，包括進(jìn)食、睡眠型式、平衡、和知覺紊亂。另外，本發(fā)明的組合物還可在與發(fā)育中胚胎有關(guān)的發(fā)育紊亂或性別連鎖紊亂的治療、預(yù)防、和/或檢測中發(fā)揮作用。另外，本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免于與腦血管紊亂有關(guān)的疾病、損傷、紊亂、或損害，包括但不限于頸動脈疾病(如頸動脈血栓形成、頸動脈狹窄、或煙霧病)、腦淀粉樣血管病、腦動脈瘤、腦缺氧、腦動脈硬化、腦動靜脈畸形、腦動脈疾病、腦栓塞和血栓形成(如頸動脈血栓形成、靜脈竇血栓形成、或瓦倫伯格氏綜合癥)、腦出血(如硬腦膜外或硬腦膜下血腫、或蛛網(wǎng)膜下出血)、腦梗死、腦缺血(如暫時性腦缺血、鎖骨下動脈盜血綜合癥、或脊椎基底動脈機(jī)能不全)、血管性癡呆(如多發(fā)性腦梗死性)、腦室周圍白質(zhì)軟化、和血管性頭痛(如叢集性頭痛或偏頭痛)。依照本發(fā)明的另一個方面，提供了出于治療目的利用本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸的方法，例如用于刺激神經(jīng)學(xué)細(xì)胞增殖和/或分化。因此，本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治療和/或檢測神經(jīng)疾病。此外，本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用作特定神經(jīng)系統(tǒng)疾病或紊亂的標(biāo)志物或檢測物。可用本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸治療或檢測的神經(jīng)紊亂的實(shí)例包括大腦疾病，諸如代謝性腦病，包括苯丙酮酸尿癥諸如母體苯丙酮酸尿癥、丙酮酸羧化酶缺乏癥、丙酮酸脫氫酶復(fù)合物缺乏癥、韋尼克氏腦病、腦水腫、腦贅生物諸如小腦贅生物包括幕中贅生物、腦室贅生物諸如脈絡(luò)叢贅生物、下丘腦贅生物、幕上贅生物、卡納萬病，小腦疾病，諸如小腦共濟(jì)失調(diào)，包括脊髓小腦變性諸如共濟(jì)失調(diào)性毛細(xì)管擴(kuò)張、小腦協(xié)同失調(diào)、弗里德賴希氏共濟(jì)失調(diào)、馬-約二氏病、橄欖體腦橋小腦萎縮、小腦贅生物諸如幕中贅生物、彌漫性腦硬化諸如軸周腦炎、球樣細(xì)胞腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、異染性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、和亞急性硬化性全腦炎?？捎帽景l(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸治療或檢測的其它神經(jīng)疾病包括腦血管紊亂(諸如頸動脈疾病，包括頸動脈血栓形成、頸動脈狹窄、和煙霧病)、腦淀粉樣血管病、腦動脈瘤、腦缺氧、腦動脈硬化、腦動靜脈畸形、腦動脈疾病、腦栓塞和血栓形成諸如頸動脈血栓形成、靜脈竇血栓形成、和瓦倫伯格氏綜合癥、腦出血諸如硬腦膜外血腫、硬腦膜下血腫、和蛛網(wǎng)膜下出血、腦梗死、腦缺血諸如暫時性腦缺血、鎖骨下動脈盜血綜合癥、和脊椎基底動脈機(jī)能不全、血管性癡呆諸如多發(fā)性腦梗死性癡呆、腦室周圍白質(zhì)軟化、血管性頭痛諸如叢集性頭痛和偏頭痛。可用本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸治療或檢測的其它神經(jīng)疾病包括癡呆諸如AIDS癡呆復(fù)合癥、早老性癡呆諸如阿爾茨海默氏病和克-雅二氏綜合癥、老年癡呆諸如阿爾茨海默氏病和進(jìn)行性核上性麻痹、血管性癡呆諸如多發(fā)性腦梗死性癡呆、腦炎包括軸周腦炎、病毒性腦炎諸如流行性腦炎、日本腦炎、圣路易腦炎、蜱傳腦炎、和西尼羅河熱、急性播散性腦脊髓炎、腦膜腦炎諸如葡萄膜腦膜腦炎綜合癥、腦炎后帕金森病、和亞急性硬化性全腦炎、腦軟化癥諸如腦室周圍白質(zhì)軟化、癲癇諸如全身型癲癇包括嬰兒痙攣、失神性癲癇、肌陣攣型癲癇包括MERRF綜合癥、強(qiáng)直陣攣性癲癇、局限性癲癇諸如復(fù)雜的局限性癲癇、額葉性癲癇和顳葉性癲癇、外傷后癲癇、癲癇持續(xù)狀態(tài)諸如持續(xù)性局限性癲癇、和哈-斯二氏綜合癥?？捎帽景l(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸治療或檢測的其它神經(jīng)疾病包括腦積水諸如丹迪-沃克綜合征和正常壓力腦積水、下丘腦疾病諸如下丘腦贅生物、腦型瘧、發(fā)作性睡病包括猝倒癥、延髓性脊髓灰質(zhì)炎、假性腦瘤、瑞特氏綜合癥、雷耶氏綜合癥、腦丘疾病、腦弓形蟲病、顱內(nèi)結(jié)核球和澤韋格綜合癥、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染諸如AIDS癡呆復(fù)合癥、腦膿腫、硬腦膜下積膿、腦脊髓炎諸如馬腦脊髓炎、委內(nèi)瑞拉馬腦脊髓炎、壞死性出血性腦脊髓炎、綿羊脫髓鞘性腦白質(zhì)炎、和腦型瘧?？捎帽景l(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸治療或檢測的其它神經(jīng)疾病包括腦膜炎諸如蛛網(wǎng)膜炎、無菌性腦膜炎諸如病毒性腦膜炎包括淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎、細(xì)菌性腦膜炎包括嗜血桿菌腦膜炎、利斯特桿菌腦膜炎、腦膜炎球菌腦膜炎諸如沃-弗綜合征、肺炎球菌腦膜炎和腦膜結(jié)核、真菌性腦膜炎諸如隱球菌腦膜炎、硬腦膜下積液、腦膜腦炎諸如葡萄膜腦膜腦炎綜合癥、脊髓炎諸如橫貫性脊髓炎、神經(jīng)梅毒諸如脊髓癆、脊髓灰質(zhì)炎包括延髓性脊髓灰質(zhì)炎和脊髓灰質(zhì)炎后綜合癥、朊病毒病(諸如克-雅二氏綜合癥、牛海綿樣腦病、格-斯二氏綜合癥、庫魯病、癢病)、和腦弓形蟲病。可用本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸治療或檢測的其它神經(jīng)疾病包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)贅生物，諸如腦贅生物，包括小腦贅生物諸如幕中贅生物、腦室贅生物諸如脈絡(luò)叢贅生物、下丘腦贅生物和幕上贅生物、腦膜贅生物、脊髓贅生物包括硬腦膜外贅生物、脫髓鞘疾病諸如卡納萬病、彌漫性腦硬化包括腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、軸周腦炎、球樣細(xì)胞腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、彌漫性腦硬化諸如異染性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、變應(yīng)性腦脊髓炎、壞死性出血性腦脊髓炎、進(jìn)行性多灶性白質(zhì)腦病、多發(fā)性硬化、腦橋中央髓鞘溶解、橫貫性脊髓炎、視神經(jīng)脊髓炎、癢病、凹背、慢性疲勞綜合癥、綿羊脫髓鞘性腦白質(zhì)炎、高壓神經(jīng)綜合癥、假性腦膜炎、脊髓病諸如先天性肌弛緩、肌萎縮側(cè)索硬化、脊髓性肌萎縮諸如韋德尼希-霍夫曼病、脊髓受壓、脊髓贅生物諸如硬腦膜外贅生物、脊髓空洞癥、脊髓癆、僵體綜合癥、智力落后諸如天使綜合癥、貓叫綜合癥、德朗熱氏綜合癥、唐氏綜合癥、神經(jīng)節(jié)苷脂貯積病諸如神經(jīng)節(jié)苷脂貯積病G(M1)、桑德霍夫病、泰-薩二氏病、哈特奈撲病、同型胱氨酸尿癥、勞-穆-比三氏綜合癥、萊-尼二氏綜合癥、槭糖尿病、粘脂貯積病諸如巖藻糖苷貯積病、神經(jīng)元蠟樣脂褐質(zhì)沉積癥、眼腦腎綜合癥、苯丙酮酸尿癥諸如母體苯丙酮酸尿癥、普拉德-威利綜合癥、瑞特氏綜合癥、魯賓斯坦-泰比綜合征、結(jié)節(jié)性硬化癥、WAGR綜合癥、神經(jīng)系統(tǒng)異常諸如前腦無裂畸形、神經(jīng)管缺陷諸如無腦畸形包括積水性無腦、阿-查二氏畸形、腦膨出、腦膜膨出、脊髓脊膜膨出、脊柱裂病諸如囊性脊柱裂和隱性脊柱裂?？捎帽景l(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸治療或檢測的其它神經(jīng)疾病包括遺傳性運(yùn)動和感覺神經(jīng)病，包括夏科-馬里二氏病、遺傳性視神經(jīng)萎縮、雷弗素姆氏病、遺傳性痙攣性截癱、韋德尼希-霍夫曼病、遺傳性感覺和自主神經(jīng)病諸如先天性無痛癥和家族性自主神經(jīng)異常、神經(jīng)表現(xiàn)(諸如失認(rèn)癥，包括格斯特曼氏綜合癥、健忘癥諸如逆行性遺忘、失用癥、神經(jīng)源性膀胱、猝倒癥、社交紊亂諸如聽覺紊亂包括耳聾、部分聽力喪失、響度重振和耳鳴、語言紊亂諸如失語癥包括失寫癥、命名不能癥、布羅卡失語癥和韋尼克失語癥、誦讀困難諸如后天性誦讀困難、語言發(fā)展紊亂、語言紊亂諸如失語癥包括命名不能癥、布羅卡失語癥和韋尼克失語癥、構(gòu)語紊亂、社交紊亂諸如語言紊亂包括構(gòu)音困難、模仿言語、緘默癥和口吃、發(fā)生紊亂諸如失聲和聲嘶、去大腦狀態(tài)、譫妄、肌束震顫、幻覺、假性腦膜炎、運(yùn)動障礙諸如天使綜合癥、共濟(jì)失調(diào)、手足徐動癥、舞蹈癥、張力失常、運(yùn)動減少、肌肉張力過低、肌陣攣、抽搐、斜頸和震顫、肌肉張力過高諸如肌肉僵化諸如僵體綜合癥、肌肉痙攣狀態(tài)、麻痹諸如面癱包括耳部帶狀皰疹、胃輕癱、偏癱、眼肌麻痹諸如復(fù)視、杜安氏綜合癥、霍納氏綜合癥、慢性進(jìn)行性外眼肌麻痹諸如基恩斯氏綜合癥、延髓性麻痹、熱帶痙攣性截癱、截癱諸如布朗-塞卡爾綜合癥、四肢癱瘓、呼吸麻痹和聲帶麻痹、輕癱、幻肢、味覺紊亂諸如味覺缺失和味覺障礙、視覺紊亂諸如弱視、盲、色覺缺陷、復(fù)視、偏盲、盲點(diǎn)和低常視力、睡眠障礙諸如睡眠過度包括克萊恩-萊文綜合癥、失眠和夢游癥、痙攣諸如牙關(guān)緊閉、無意識諸如昏迷、持續(xù)性植物狀態(tài)和昏厥和眩暈、神經(jīng)肌肉疾病諸如先天性肌弛緩、肌萎縮側(cè)索硬化、蘭伯特-伊頓肌無力綜合癥、運(yùn)動神經(jīng)元疾病、肌萎縮諸如脊髓性肌萎縮、夏-馬二氏病和韋德尼希-霍夫曼病、脊髓灰質(zhì)炎后綜合癥、肌肉萎縮癥、重癥肌無力、萎縮性肌強(qiáng)直、先天性肌強(qiáng)直、線狀體肌病、家族性周期性癱瘓、多發(fā)性(副)肌陣攣、熱帶痙攣性截癱和僵體綜合癥、周圍神經(jīng)系統(tǒng)疾病諸如肢端痛、淀粉狀蛋白神經(jīng)病、自主神經(jīng)系統(tǒng)疾病諸如艾迪氏綜合癥、巴-利二氏綜合癥、家族性性自主神經(jīng)異常、霍納氏綜合癥、反射交感性營養(yǎng)不良和夏伊-德雷格綜合癥、腦神經(jīng)疾病諸如聽神經(jīng)疾病諸如聽神經(jīng)瘤包括神經(jīng)纖維瘤病2、面神經(jīng)疾病諸如面神經(jīng)痛、梅爾克松-羅森塔爾綜合癥、動眼紊亂(ocularmotilitydisorder)包括弱視、眼震、動眼神經(jīng)麻痹、眼肌麻痹諸如杜安氏綜合癥、霍納氏綜合癥、慢性進(jìn)行性外眼肌麻痹包括基恩斯氏綜合癥、斜視諸如內(nèi)斜視和外斜視、動眼神經(jīng)麻痹、視神經(jīng)疾病諸如視神經(jīng)萎縮包括遺傳性視神經(jīng)萎縮、視盤玻璃疣、視神經(jīng)眼諸如視神經(jīng)脊髓炎、視盤水腫、三叉神經(jīng)痛、聲帶麻痹、脫髓鞘疾病諸如視神經(jīng)脊髓炎和凹背、和糖尿病性神經(jīng)病諸如糖尿病足。可用本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸治療或檢測的其它神經(jīng)疾病包括神經(jīng)壓迫綜合癥諸如腕管綜合癥、跗管綜合癥、胸廓出口綜合癥諸如頸肋綜合癥、尺神經(jīng)壓迫綜合癥、神經(jīng)痛諸如灼性神經(jīng)痛、頸臂神經(jīng)痛、面神經(jīng)痛和三叉神經(jīng)痛、神經(jīng)炎諸如實(shí)驗(yàn)性變應(yīng)性神經(jīng)炎、視神經(jīng)炎、多神經(jīng)炎、多神經(jīng)根神經(jīng)病和神經(jīng)根炎諸如多神經(jīng)根炎、遺傳性運(yùn)動和感覺神經(jīng)病諸如夏科-馬里二氏病、遺傳性視神經(jīng)萎縮、雷弗素姆氏病、遺傳性痙攣性截癱和韋德尼希-霍夫曼病、遺傳性感覺和自主神經(jīng)病包括先天性無痛癥和家族性自主神經(jīng)異常、POEMS綜合癥、坐骨神經(jīng)痛、味覺性出汗和手足搐搦。內(nèi)分泌紊亂本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治療、預(yù)防、診斷、和/或預(yù)測與激素失衡有關(guān)的紊亂和/或疾病、和/或內(nèi)分泌系統(tǒng)的紊亂或疾病。由內(nèi)分泌系統(tǒng)的腺分泌的激素控制著身體生長、性功能、新陳代謝、和其它功能。紊亂可以兩種方法進(jìn)行分類激素生成的擾動和應(yīng)答激素的組織無能。這些激素失衡或內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病、紊亂或狀況的病因可以是遺傳的、肉體的(諸如癌和有些自身免疫病)、獲得的(如通過化療、損傷或毒素)、或傳染性的。此外，本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用作與內(nèi)分泌系統(tǒng)和/或激素失衡有關(guān)的特定疾病或紊亂的標(biāo)志物或檢測物。內(nèi)分泌系統(tǒng)和/或激素失衡紊亂和/或疾病涵蓋子宮運(yùn)動性的紊亂，包括但不限于妊娠和分娩的并發(fā)癥(如早產(chǎn)分娩、過期妊娠、自然流產(chǎn)、和分娩緩慢或停止)；及月經(jīng)周期的紊亂和/或疾病(如痛經(jīng)和子宮內(nèi)膜異位癥)。內(nèi)分泌系統(tǒng)和/或激素失衡紊亂和/或疾病包括胰腺的紊亂和/或疾病，諸如例如糖尿病、尿崩癥、先天性胰腺發(fā)育不全、嗜鉻細(xì)胞瘤-胰島細(xì)胞瘤綜合癥；腎上腺的紊亂和/或疾病，諸如例如艾迪生氏病、皮質(zhì)類固醇缺乏癥、男性化疾病、多毛癥、庫欣氏綜合癥、高醛甾酮癥、嗜鉻細(xì)胞瘤；垂體腺的紊亂和/或疾病，諸如例如垂體功能亢進(jìn)、垂體功能減退、垂體性侏儒癥、垂體腺瘤、全垂體功能減退、肢端肥大癥、巨人癥；甲狀腺的紊亂和/或疾病，包括但不限于甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)、甲狀腺機(jī)能減退、普盧默氏病、格雷夫斯氏病(毒性彌漫性甲狀腺腫)、毒性節(jié)結(jié)性甲狀腺腫、甲狀腺炎(橋本氏甲狀腺炎、亞急性肉芽腫性甲狀腺炎、和靜息性淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎)、潘德雷德氏綜合癥、粘液水腫、克汀病、甲狀腺毒癥、甲狀腺激素偶聯(lián)缺陷、胸腺不發(fā)育、甲狀腺的許特爾氏細(xì)胞瘤、甲狀腺癌癥、甲狀腺癌、甲狀腺髓樣癌；甲狀旁腺的紊亂和/或疾病，諸如例如甲狀旁腺功能亢進(jìn)、甲狀旁腺功能減退；下丘腦的紊亂和/或疾病。另外，內(nèi)分泌系統(tǒng)和/或激素失衡紊亂和/或疾病還可包括睪丸或卵巢的紊亂和/或疾病，包括癌。睪丸或卵巢的其它紊亂和/或疾病還包括例如卵巢癌、多囊性卵巢綜合癥、克蘭費(fèi)爾特氏綜合癥、睪丸逸失綜合癥(雙側(cè)無睪癥)、萊迪希氏細(xì)胞先天性缺失、隱睪癥、努南氏綜合癥、強(qiáng)直性肌營養(yǎng)不良、睪丸的毛細(xì)血管瘤(良性)、睪丸的贅生物形成和新睪丸(neo-testis)。此外，內(nèi)分泌系統(tǒng)和/或激素失衡紊亂和/或疾病還可包括紊亂和/或疾病諸如例如多腺缺陷綜合癥、嗜鉻細(xì)胞瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、多發(fā)性內(nèi)分泌贅生物形成，及內(nèi)分泌組織的紊亂和/或癌。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于診斷、預(yù)測、預(yù)防、和/或治療與本發(fā)明清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分所對應(yīng)的治療性蛋白質(zhì)在其中表達(dá)的組織有關(guān)的內(nèi)分泌疾病和/或紊亂。生殖系統(tǒng)紊亂本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于診斷、治療、或預(yù)防生殖系統(tǒng)的疾病和/或紊亂?？捎帽景l(fā)明的組合物治療的生殖系統(tǒng)紊亂包括但不限于生殖系統(tǒng)損傷、感染、贅生性紊亂、先天性缺陷、和導(dǎo)致不育的疾病或紊亂、妊娠、分娩、或生產(chǎn)的并發(fā)癥、和產(chǎn)后困難(postpartumdifficulties)。生殖系統(tǒng)紊亂和/或疾病包括睪丸的疾病和/或紊亂，包括睪丸萎縮、睪丸女性化、隱睪癥(單側(cè)和雙側(cè))、無睪癥、異位睪丸、附睪炎和睪丸炎(通常由感染引起，諸如例如淋病、腮腺炎、結(jié)核病、和梅毒)、睪丸扭轉(zhuǎn)、節(jié)結(jié)狀輸精管炎、生殖細(xì)胞腫瘤(如精原細(xì)胞瘤、胚性細(xì)胞癌、畸胎癌、絨膜癌、卵黃囊腫瘤、和畸胎瘤)、基質(zhì)腫瘤(如萊迪希氏細(xì)胞腫瘤)、鞘膜積液、鞘膜積血、精索靜脈曲張、精液囊腫、腹股溝疝、和精子生成紊亂(如不動纖毛綜合癥、無精癥、弱精癥、無精子癥、精子減少癥、和畸形精子癥)。生殖系統(tǒng)紊亂還包括前列腺的紊亂，諸如急性非細(xì)菌性前列腺炎、慢性非細(xì)菌性前列腺炎、急性細(xì)菌性前列腺炎、慢性細(xì)菌性前列腺炎、前列腺張力失常、前列腺病、肉芽腫性前列腺炎、軟化斑、良性前列腺肥大或再生、及前列腺贅生性紊亂，包括腺癌、移行細(xì)胞癌、導(dǎo)管癌、和鱗狀細(xì)胞癌。另外，本發(fā)明的組合物可用于陰莖和尿道紊亂或疾病的診斷、治療、和/或預(yù)防，包括炎性紊亂，諸如陰莖頭包皮炎、閉塞性干燥性龜頭炎、包莖、嵌頓包莖、梅毒、單純皰疹病毒、淋病、非淋球菌性尿道炎、衣原體、枝原體、毛滴蟲、HIV、AIDS、萊特爾氏綜合癥、尖銳濕疣、扁頭濕疣、和珍珠樣陰莖丘疹；尿道異常，諸如尿道下裂、尿道上裂、和包莖；惡化前損傷，包括凱拉增生性紅斑、博溫氏病、博溫樣丘疹病、布-勒二氏巨型濕疣、和疣狀癌；陰莖癌，包括鱗狀細(xì)胞癌、原位癌、疣狀癌癌、和彌散性陰莖癌；尿道贅生性紊亂，包括陰莖尿道癌、尿道球膜癌(bulbomembranousurethralcarcinoma)、和前列腺尿道癌；及勃起紊亂，諸如陰莖異常勃起、佩倫涅氏病、勃起功能障礙、和陽萎。此外，輸精管的疾病和/或紊亂包括脈管炎和CBAVD(輸精管先天性雙側(cè)缺如)；另外，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于精囊疾病和/或紊亂的診斷、治療、和/或預(yù)防，包括包囊蟲病、先天性氯化物性腹瀉、和多囊性腎病。男性生殖系統(tǒng)的其它紊亂和/或疾病包括例如克蘭費(fèi)爾特氏綜合癥、楊氏綜合癥、早泄、糖尿病、囊性纖維化、卡塔格納氏綜合癥、高熱、多發(fā)性硬化、和男子乳腺發(fā)育。另外，本發(fā)明的多核苷酸、融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于陰道和陰門疾病和/或紊亂的診斷、治療、和/或預(yù)防，包括細(xì)菌性陰道病、假絲酵母陰道炎、單純皰疹病毒、軟下疳、腹股溝肉芽腫、性病淋巴肉芽腫、疥瘡、人乳頭瘤病毒、陰道外傷、陰門外傷、腺病、衣原體陰道炎、淋病、毛滴蟲陰道炎、尖銳濕疣、梅毒、傳染性軟疣、萎縮性陰道炎、佩吉特氏病、硬化性苔蘚、扁平苔蘚、外陰痛、中毒性休克綜合征、陰道痙攣、外陰陰道炎、外陰前庭炎、和贅生性紊亂，諸如鱗狀細(xì)胞增生、透明細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、黑素瘤、巴托林腺癌、和外陰上皮內(nèi)贅生物形成。子宮的紊亂和/或疾病包括痛經(jīng)、子宮后傾、子宮內(nèi)膜異位、纖維瘤、腺肌病(adenomyosis)、無排卵性出血、閉經(jīng)、庫欣氏綜合癥、水泡狀胎塊(葡萄胎)、阿謝曼氏綜合癥、過早絕經(jīng)、性早熟、子宮息肉、功能障礙性子宮出血(如由于異常激素信號)、和贅生性紊亂，諸如腺癌、平滑肌肉瘤、和肉瘤。另外，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用作先天性子宮異常的標(biāo)志物或檢測物，以及用于診斷、治療、和/或預(yù)防，諸如雙角子宮、有隔子宮、簡單單角子宮、具有無腔原始角的單角子宮、具有無連通腔原始角的單角子宮、具有連通腔角的單角子宮、弓形子宮、雙子宮、和T形子宮。卵巢的疾病和/或紊亂包括不排卵、多囊性卵巢綜合癥(斯坦-利文撒爾二氏綜合癥)、卵巢囊腫、卵巢機(jī)能減退、卵巢對促性腺激素不敏感、卵巢過度生成雄激素、右卵巢靜脈綜合癥、閉經(jīng)、hirutism、和卵巢癌(包括但不限于原發(fā)性和繼發(fā)性癌性生長、塞爾托利-萊迪希二氏腫瘤、卵巢子宮內(nèi)膜樣癌、卵巢乳頭狀漿液性腺癌、卵巢粘液腺癌、和卵巢克魯肯貝格瘤)。宮頸的疾病和/或紊亂包括宮頸炎、慢性宮頸炎、粘膿性宮頸炎、宮頸發(fā)育異常、宮頸息肉、納博特氏囊腫、宮頸糜爛、宮頸機(jī)能不全、和宮頸贅生物(包括例如宮頸癌、鱗狀化生、鱗狀細(xì)胞癌、腺鱗狀細(xì)胞贅生物形成、和柱狀細(xì)胞贅生物形成)。另外，生殖系統(tǒng)的疾病和/或紊亂包括妊娠紊亂和/或疾病，包括流產(chǎn)和死產(chǎn)，諸如早期流產(chǎn)、晚期流產(chǎn)、自然流產(chǎn)、人工流產(chǎn)、治療性流產(chǎn)、先兆流產(chǎn)、稽留流產(chǎn)、不全流產(chǎn)、完全流產(chǎn)、習(xí)慣性流產(chǎn)、稽留流產(chǎn)、和流產(chǎn)感染；異位妊娠、貧血癥、Rh不相容性、妊娠期間陰道出血、妊娠糖尿病、宮內(nèi)生長遲緩、羊水過多、HELLP綜合癥、胎盤早期脫離、前置胎盤、劇吐、先兆子癇、子癇、妊娠皰疹、和妊娠蕁麻疹。另外，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于妊娠可并發(fā)疾病的診斷、治療、和/或預(yù)防，包括心臟病、心力衰竭、風(fēng)濕性心臟病、先天性心臟病、二尖瓣脫垂、高血壓、貧血、腎病、傳染性疾病(如風(fēng)疹、細(xì)胞巨化病毒、弓形蟲病、傳染性肝炎、衣原體、HIV、AIDS、和生殖器皰疹)、糖尿病、格雷夫斯氏病、甲狀腺炎、甲狀腺機(jī)能減退、橋本氏甲狀腺炎、慢性活動性肝炎、肝硬化、原發(fā)性膽汁性肝硬化、哮喘、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、重癥肌無力、特發(fā)性血小板減少性紫癜、闌尾炎、卵巢囊腫、膽囊紊亂、和腸梗阻。與分娩和生產(chǎn)有關(guān)的并發(fā)癥包括羊膜早破、早產(chǎn)分娩、過期妊娠、過度成熟、分娩進(jìn)展過于緩慢、胎兒窘迫(如異常心率(胎兒的或母親的)、呼吸問題、和異常胎位)、肩難產(chǎn)、脫垂臍帶、羊水栓塞、和異常子宮出血。另外，分娩后時期的疾病和/或紊亂包括子宮內(nèi)膜炎、子宮肌炎、子宮旁(組織)炎、腹膜炎、骨盆血栓性靜脈炎、肺栓塞、內(nèi)毒素血癥、腎盂腎炎、隱靜脈血栓性靜脈炎、乳腺炎、膀胱炎、產(chǎn)后出血、和倒置子宮?？捎帽景l(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸診斷、治療、和/或預(yù)防的女性生殖系統(tǒng)的其它紊亂和/或疾病包括例如特納氏綜合癥、假兩性畸形、經(jīng)前綜合癥、盆腔炎疾病、盆腔充血(血管充血)、性感缺失、性快感缺失、性感不快、輸卵管破裂、和經(jīng)間痛。傳染病本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治療或檢測傳染媒介。例如，可通過提高免疫應(yīng)答，特別是提高B和/或T細(xì)胞的增殖和分化，來治療傳染病?；蚴峭ㄟ^增強(qiáng)現(xiàn)有的免疫應(yīng)答，或是通過啟動新的免疫應(yīng)答，可提高免疫應(yīng)答?；蛘?，本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸還可直接抑制傳染媒介，無需引發(fā)免疫應(yīng)答。病毒是可引起可用本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸治療或檢測的疾病或癥狀的傳染媒介的一種實(shí)例。病毒的實(shí)例包括但不限于下列DNA和RNA病毒和病毒科蟲媒病毒(Arbovirus)、腺病毒科(Adenoviridae)、沙粒病毒科(Arenaviridae)、動脈炎病毒科(Arterivirus)、雙RNA病毒科(Bimaviridae)、布尼病毒科(Bunyaviridae)、杯狀病毒科(Caliciviridae)、圓環(huán)病毒科(Circoviridae)、冠狀病毒科(Coronaviridae)、登革病毒、EBV、HIV、黃病毒科(Flaviviridae)、嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)(肝炎病毒)、皰疹病毒科(Herpesviridae)(諸如細(xì)胞巨化病毒、單純皰疹病毒、帶狀皰疹病毒)、Mononegavirus(如副粘病毒科(Paramyxoviridae)、麻疹病毒、桿狀病毒科(Rhabdoviridae))、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)(如流感病毒A、流感病毒B、和副流感病毒)、乳頭瘤病毒、乳多空病毒科(Papovaviridae)、細(xì)小病毒科(Parvoviridae)、小RNA病毒科(Picornaviridae)、痘病毒科(Poxviridae)(諸如天花或牛痘)、呼腸孤病毒科(Reoviridae)(如輪狀病毒)、逆轉(zhuǎn)錄病毒科(Retroviridae)(HTLV-I、HTLV-II、慢病毒)、和披膜病毒科(Togaviridae)(如風(fēng)疹病毒)。屬于這些科的病毒可引起多種疾病或癥狀，包括但不限于關(guān)節(jié)炎、細(xì)支氣管炎、呼吸道合胞病毒、腦炎、眼部感染(如結(jié)膜炎、角膜炎)、慢性疲勞綜合癥、肝炎(甲型、乙型、丙型、戊型、慢性活動性、丁型)、日本B型腦炎、胡寧熱、切昆貢亞熱、裂谷熱、黃熱病、腦膜炎、機(jī)會性感染(如AIDS)、肺炎、伯基特氏淋巴瘤、禽痘、出血熱、麻疹、腮腺炎、副流感、狂犬病、感冒、脊髓灰質(zhì)炎、白血病、風(fēng)疹、性傳播疾病、皮膚病(如卡波西氏、疣)、和病毒血癥。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治療或檢測任何這些癥狀或疾病。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用于治療腦膜炎、登革熱、EBV、和/或肝炎(如乙肝)。在另一個具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用于治療對一種或多種其它商品化肝炎疫苗不響應(yīng)的患者。在又一個具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用于治療AIDS。類似的，可引起可用本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸治療或檢測的疾病或癥狀的細(xì)菌和真菌媒介包括但不限于下列革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細(xì)菌、細(xì)菌科、和真菌放線菌屬(Actinomyces)(如諾卡氏菌屬(Nocardia))、不動桿菌屬(Acinetobacter)、新型隱球酵母(Cryptococcusneoformans)、曲霉屬(Aspergillus)、芽孢桿菌科(Bacillaceae)(如炭疽芽孢桿菌(Bacillusanthracis))、類桿菌屬(Bacteroides)(如脆弱類桿菌(Bacteroidesfragilis))、芽生菌屬(Blastomyces)、博德特氏桿菌屬(Bordetella)、疏螺旋體屬(Borrelia)(如布氏疏螺旋體(Borreliaburgdorferi))、布魯氏菌屬(Brucella)、假絲酵母屬(Candida)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、衣原體屬(Chlamydia)、梭狀芽孢桿菌屬(Clostridium)(如肉毒梭狀芽孢桿菌(Clostridiumbotulinum)、難辨梭狀芽孢桿菌(Clostridiumdiffcile)、產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌(Clostridiumperfringens)、破傷風(fēng)梭狀芽孢桿菌(Clostridiumtetani))、球孢菌屬(Coccidioides)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)(如白喉棒狀桿菌(Corynebacteriumdiphtheriae))、隱球酵母屬(Cryptococcus)、皮膚真菌病(Dermatocycoses)、大腸埃希氏桿菌(E.coli)(如產(chǎn)腸毒素的大腸桿菌和腸出血性大腸桿菌)、腸桿菌屬(Enterobacter)(如產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacteraerogenes))、腸桿菌科(Enterobacteriaceae)(克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、沙門氏菌屬(Salmonella)(如傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphi)、腸炎沙門氏菌(Salmonellaenteritidis)、傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphi))、沙雷氏菌屬(Serratia)、耶爾森氏菌屬(Yersinia)、志賀氏菌屬(Shigella))、丹毒絲菌屬(Erysipelothrix)、嗜血桿菌屬(Haemophilus)(如B型流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae))、螺桿菌屬(Helicobacter)、軍團(tuán)菌屬(Legionella)(如嗜肺軍團(tuán)菌(Legionellapneumophila))、螺旋體屬(Leptospira)、利斯特氏菌屬(Listeria)(如單核細(xì)胞增生利斯特氏菌(Listeriamonocytogenes))、枝原體屬(Mycoplasma)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)(如麻風(fēng)分枝桿菌(Mycobacteriumleprae)和結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis))、弧菌屬(Vibrio)(如霍亂壺菌(Vibriocholerae))、奈瑟氏球菌科(Neisseriaceae)(如淋病奈瑟氏球菌(Neisseriagonorrheae)、腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningilidis))、巴斯德氏菌科(Pasteurellaceae)、變形菌屬(Proteus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)(如銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa))、立克次氏體科(Rickettsiaceae)、螺旋體(Spirochetes)(如密螺旋體屬(Treponemaspp.)、鉤端螺旋體屬(Leptospiraspp.)、疏螺旋體屬(Borreliaspp.))、志賀氏菌屬(Shigellaspp.)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)(如金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus))、腦膜炎球菌(Meningiococcus)、肺炎球菌(Pneumococcus)和鏈球菌屬(Streptococcus)(如肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)及A、B、和C群鏈球菌)、和尿枝原體屬(Ureaplasmas)。這些細(xì)菌、寄生蟲、和真菌科可引起疾病或癥狀，包括但不限于抗生素抗性感染、菌血癥、心內(nèi)膜炎、敗血癥、眼部感染(如結(jié)膜炎)、葡萄膜炎、結(jié)核病、齦炎、細(xì)菌性腹瀉、機(jī)會性感染(如AIDS相關(guān)感染)、甲溝炎、假體相關(guān)感染、齲、賴特爾氏病、呼吸道感染諸如百日咳或膿胸、膿毒癥、萊姆病、貓抓病、痢疾、副傷寒、食物中毒、軍團(tuán)病、慢性和急性炎癥、紅斑、酵母感染、傷寒、肺炎、淋巴、腦膜炎(如A型和B型腦膜炎)、衣原體、梅毒、白喉、麻風(fēng)、布氏菌病、消化性潰瘍、炭疽、自然流產(chǎn)、出生缺陷、肺炎、肺部感染、耳部感染、耳聾、盲、嗜睡、不適、嘔吐、慢性腹瀉、克羅恩氏病、結(jié)腸炎、陰道炎、不育、盆腔炎疾病、假絲酵母病、副結(jié)核、結(jié)核病、狼瘡、肉毒中毒、壞疽、破傷風(fēng)、膿皰病、風(fēng)濕熱、猩紅熱、性傳播疾病、皮膚病(如蜂窩織炎、皮膚真菌病)、毒血癥、尿道感染、傷口感染、醫(yī)院感染。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治療或檢測任何這些癥狀或疾病。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用于治療破傷風(fēng)、白喉、肉毒中毒、和/或B型腦膜炎。此外，引起可用本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸治療、預(yù)防、和/或診斷的疾病或癥狀的寄生蟲媒介包括但不限于下列科或類阿米巴蟲(病)、巴倍斯蟲(病)、球蟲(病)、隱孢子蟲(病)、雙核阿米巴蟲(病)、馬等媾疫、外寄生蟲(病)、賈第蟲(病)、蠕蟲(病)、利什曼蟲(病)、裂體吸蟲(血吸蟲)病、泰勒爾梨漿蟲(病)、弓形蟲(病)、錐形蟲(病)、和滴蟲(病)和孢子蟲(如間日瘧原蟲Plasmodiumvirax、惡性瘧原蟲Plasmodiumfalciparium、三日瘧原蟲Plasmodiummalariae和卵形瘧原蟲Plasmodiumovale)。這些寄生蟲可引起多種疾病或癥狀，包括但不限于疥瘡、恙螨病、眼部感染、腸病(如痢疾、賈第蟲病)、肝病、肺病、機(jī)會性感染(如AIDS相關(guān)的)、瘧疾、妊娠并發(fā)癥、和弓形蟲病。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治療、預(yù)防、和/或診斷任何這些癥狀或疾病。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用于治療、預(yù)防、和/或診斷瘧疾。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可這樣施用，或是對患者施用有效量的本發(fā)明的清蛋白融合蛋白，或是由患者采集細(xì)胞，給細(xì)胞供應(yīng)本發(fā)明的多核苷酸，并將經(jīng)過改造的細(xì)胞返還患者(離體療法)。此外，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可在疫苗中用作抗原，用于引發(fā)針對傳染病的免疫應(yīng)答。再生本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于細(xì)胞的分化、增殖、和吸引，導(dǎo)致組織再生(參閱Science，27659-87，1997)。組織再生可用于修復(fù)、替換、或保換因先天性缺陷、外傷(傷口、燒傷、切口、或潰瘍)、衰老、疾病(如骨質(zhì)疏松、骨關(guān)節(jié)炎、牙周病、肝功能衰竭)、手術(shù)包括整容整形手術(shù)、纖維化、再灌注損傷、或系統(tǒng)性細(xì)胞因子損傷而受損的組織?？墒褂帽景l(fā)明再生的組織包括器官(如胰腺、肝、腸、腎、皮膚、內(nèi)皮)、肌肉(平滑肌、骨骼肌、或心肌)、脈管系統(tǒng)(包括血管和淋巴管)、神經(jīng)、造血、和骨骼(骨、軟骨、腱、和韌帶)組織。優(yōu)選的是，增生的發(fā)生沒有瘢痕或瘢痕減少。再生還可包括血管發(fā)生。此外，本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可提高難以治愈的組織的再生。例如，提高腱/韌帶再生將加快損傷后的恢復(fù)時間。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸還可在預(yù)防上用于避免損傷的努力。可治療的具體疾病包括腱炎、腕管綜合征、和其它腱或韌帶缺損。不愈合傷口的組織再生的另一個實(shí)例包括壓迫性潰瘍、與血管機(jī)能不全有關(guān)的潰瘍、手術(shù)和外傷傷口。類似的，神經(jīng)和腦組織也可使用本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸來再生，使神經(jīng)細(xì)胞增殖和分化?？墒褂迷摲椒ㄖ委煹募膊“ㄖ袠泻椭車窠?jīng)系統(tǒng)疾病、神經(jīng)病、或機(jī)械性和外傷性紊亂(如脊髓紊亂、頭部外傷、腦血管疾病、和中風(fēng))。具體而言，與周圍神經(jīng)損傷、周圍神經(jīng)病(如由化療或其它醫(yī)學(xué)療法引起的)、局限性神經(jīng)病、和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病(如阿爾茨海默氏病、帕金森氏病、亨庭頓氏病、肌萎縮側(cè)索硬化、和夏伊-德雷格綜合癥)有關(guān)的疾病都可使用本發(fā)明的清蛋白融合蛋自和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸來治療。胃腸紊亂本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治療、預(yù)防、診斷、和/或預(yù)測胃腸紊亂，包括炎性疾病和/或狀況、感染、癌(如腸贅生物(小腸類癌腫瘤、小腸非霍奇金氏淋巴瘤、小腸淋巴瘤))、和潰瘍，諸如消化性潰瘍。胃腸紊亂包括吞咽困難、吞咽痛、食道炎癥、消化性食道炎、胃反流、粘膜下纖維化和狹窄、馬洛萊-韋斯損傷、平滑肌瘤、脂肪瘤、表皮癌、腺癌、胃滯留紊亂、胃腸炎、胃萎縮、胃癌、胃息肉、自身免疫性紊亂諸如惡性貧血、幽門狹窄、胃炎(細(xì)菌性、病毒性、嗜曙紅細(xì)胞性、壓力誘導(dǎo)的、慢性侵蝕性、萎縮性、漿細(xì)胞性、和梅尼特里埃氏)、和腹膜疾病(如乳糜性水腹(chyloperioneum)、腹腔積血、腸系膜囊腫、腸系膜淋巴結(jié)炎、腸系膜血管阻塞、脂膜炎、贅生物、腹膜炎、氣腹、bubphrenicabscess)。胃腸紊亂還包括與小腸有關(guān)的紊亂，諸如吸收不良綜合癥、膨脹、腸易激綜合征、糖不耐、乳糜瀉、十二指腸潰瘍、十二指腸炎、熱帶口炎性腹瀉、惠普耳氏病、腸淋巴管擴(kuò)張、克羅恩氏病、闌尾炎、回腸梗阻、麥克爾氏憩室、多發(fā)性憩室、小腸和大腸完全運(yùn)行失效、淋巴瘤、和細(xì)菌和寄生蟲疾病(諸如旅行者腹瀉、傷寒和副傷寒、霍亂、蛔蟲(似蚓蛔線蟲Ascariasislumbricoides)、鉤蟲(十二指腸鉤口線蟲Ancylostomaduodenale)、線蟲(蠕形駐腸線蟲Enterobiusvermicularis)、絳蟲(牛肉絳蟲Taeniasaginata、細(xì)粒棘球絳蟲Echinococcusgranulosus、裂頭絳蟲屬Diphyllobothriumspp.、和豬肉絳蟲T.solium)感染.肝的疾病和/或紊亂包括肝內(nèi)膽汁淤積(阿拉吉爾氏綜合癥、膽汁性肝硬化)、脂肪肝(酒精性脂肪肝、萊耶氏綜合癥)、肝靜脈血栓形成、肝豆?fàn)盍Ｗ冃?、肝大、肝肺綜合癥、肝腎綜合癥、門靜脈高壓(食道和胃血管曲張)、肝膿腫(阿米巴性肝膿腫)、肝硬化(酒精性、膽汁性、和實(shí)驗(yàn)性)、酒精性肝病(脂肪肝、肝炎、硬化)、寄生蟲(肝包蟲病、片形吸蟲病、阿米巴性肝膿腫)、黃疸(溶血性、肝細(xì)胞性、和膽汁淤積性)、膽汁淤積、門靜脈高壓、肝擴(kuò)大、腹水、肝炎(酒精性肝炎、動物肝炎、慢性肝炎(自身免疫、乙肝、丙肝、丁肝、藥物誘導(dǎo)的)、中毒性肝炎、病毒性人肝炎(甲肝、乙肝、丙肝、丁肝、戊肝)、威爾遜氏病、肉芽腫性肝炎、繼發(fā)性膽汁性肝硬化、肝性腦病、門靜脈高壓、血管曲張、肝性腦病、原發(fā)性膽汁性肝硬化、原發(fā)性硬化性膽管炎、肝細(xì)胞腺瘤、血管瘤、膽石、肝功能衰竭(肝性腦病、急性肝功能衰竭)、和肝贅生物(血管肌脂瘤、鈣化性肝轉(zhuǎn)移癌、囊性肝轉(zhuǎn)移癌、上皮腫瘤、纖維板狀肝癌、灶性節(jié)結(jié)性增生、肝腺癌、肝膽囊腺瘤、肝母細(xì)胞瘤、肝細(xì)胞癌、肝細(xì)胞瘤、肝癌、肝血管內(nèi)皮瘤、間葉性錯構(gòu)瘤、肝的間葉細(xì)胞瘤、節(jié)結(jié)再生性增生、良性肝腫瘤(肝囊腫[簡單囊腫、多囊性肝病、肝膽囊腺瘤、膽總管囊腫]、間葉細(xì)胞瘤[間葉性錯構(gòu)瘤、幼兒血管內(nèi)皮瘤、血管瘤、紫癜樣肝病、脂肪瘤、炎性假瘤、混雜型]、上皮瘤[膽管上皮(膽管錯構(gòu)瘤、膽管腺瘤)、肝細(xì)胞(腺瘤、灶性節(jié)結(jié)性增生、節(jié)結(jié)再生性增生)]、惡性肝腫瘤[肝細(xì)胞、肝母細(xì)胞瘤、肝細(xì)胞癌、膽管細(xì)胞、膽管癌、囊腺癌、血管腫瘤、血管肉瘤、卡波西氏肉瘤、血管內(nèi)皮瘤、其它腫瘤、胚性肉瘤、纖維肉瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、癌肉瘤、畸胎瘤、類癌、鱗狀細(xì)胞癌、原發(fā)性淋巴瘤])、紫癜樣肝病、紅細(xì)胞生成性肝性卟啉癥、肝性卟啉癥(急性間歇性卟啉病、遲發(fā)性皮膚卟啉病)、澤韋格綜合癥)。胰腺的疾病和/或紊亂包括急性胰腺炎、慢性胰腺炎(急性壞死性胰腺炎、酒精性胰腺炎)、贅生物(胰腺的腺癌、囊腺癌、胰島瘤、胃泌素瘤、和高血糖素瘤、囊性贅生物、胰島細(xì)胞腫瘤、胰母細(xì)胞瘤)、和其它胰腺疾病(如囊性纖維化、囊腫(胰腺假囊腫、胰瘺、機(jī)能不全))。膽囊疾病包括膽石(膽石癥和膽總管結(jié)石病)、膽囊切除術(shù)后綜合癥、膽囊憩室病、急性膽囊炎、慢性膽囊炎、膽管腫瘤、和粘液囊腫。大腸的疾病和/或紊亂包括抗生素抗性結(jié)腸炎、憩室炎、潰瘍性結(jié)腸炎、獲得性巨結(jié)腸、膿腫、真菌和細(xì)菌感染、肛門直腸紊亂(如肛裂、痔瘡)、結(jié)腸疾病(結(jié)腸炎、結(jié)腸贅生物[結(jié)腸癌、腺瘤狀結(jié)腸息肉(如絨毛狀腺瘤)、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌]、結(jié)腸憩室炎、結(jié)腸憩室病、巨結(jié)腸[希爾施普龍病、中毒性巨結(jié)腸]；乙狀結(jié)腸疾病[直腸結(jié)腸炎、乙狀結(jié)腸贅生物])、便秘、克羅恩氏病、腹瀉(嬰兒腹瀉、痢疾)、十二指腸疾病(十二指腸贅生物、十二指腸梗阻、十二指腸潰瘍、十二指腸炎)、小腸炎(小腸結(jié)腸炎)、FIN腸病、回腸疾病(回腸贅生物、回腸炎)、免疫增殖性小腸疾病、炎性腸病(潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩氏病)、腸閉鎖、寄生蟲病(異尖線蟲病、小袋纖毛蟲病、酵母菌感染(blastocystisinfection)、隱孢子蟲病、雙核阿米巴蟲病、阿米巴痢疾、賈第蟲病)、腸瘺(直腸瘺)、腸贅生物(盲腸贅生物、結(jié)腸贅生物、十二指腸贅生物、回腸贅生物、腸息肉、空腸贅生物直腸贅生物)、腸梗阻(輸入袢綜合癥、十二指腸梗阻、糞便阻塞、假腸梗阻性直腸膨出)、消化性潰瘍(十二指腸潰瘍、消化性食道炎、出血、穿孔、胃潰瘍、佐林格-埃利森綜合征)、胃切除術(shù)后綜合癥(傾倒綜合癥)、胃病(如胃酸缺乏、十二指腸胃反流(膽汁反流)、胃竇血管擴(kuò)張、胃瘺、胃出口梗阻、胃炎(萎縮性或肥厚性)、胃輕癱、胃擴(kuò)張、胃憩室、胃贅生物(胃癌、胃息肉、胃腺癌、增生性胃息肉)、胃破裂、胃潰瘍、胃扭轉(zhuǎn))、結(jié)核病、內(nèi)臟下垂、嘔吐(如嘔血、妊娠劇吐、術(shù)后惡心和嘔吐)、和出血性結(jié)腸炎。胃腸系統(tǒng)的其它疾病和/或紊亂包括膽管疾病，諸如腹裂、瘺(如膽瘺、食道瘺、胃瘺、腸瘺、胰瘺)、贅生物(如膽管贅生物、食道贅生物諸如食道腺癌、食道鱗狀細(xì)胞癌、胃腸贅生物、胰贅生物諸如胰的腺癌、胰的粘蛋白囊性贅生物、胰囊性贅生物、胰母細(xì)胞瘤、和腹膜贅生物)、食道疾病(如大庖性疾病、假絲酵母病、糖原生成性棘皮癥、潰瘍、巴雷特食管血管曲張、閉鎖、囊腫、憩室(如岑克爾氏憩室)、瘺(如氣管食管瘺)、能動性紊亂(如CREST綜合癥、吞咽障礙、失弛緩癥、痙攣、胃食管反流)、贅生物、穿孔(如布爾哈弗綜合癥、馬洛萊-韋斯綜合征)、狹窄、食道炎、膈疝(如食管裂孔疝)；胃腸疾病，諸如胃腸炎(如假霍亂、諾沃克病毒感染)、出血(如嘔血、黑糞、消化性潰瘍出血)、胃贅生物(胃癌、胃息肉、胃腺癌、胃癌))、疝(如先天性膈疝、股疝、腹股溝疝、閉孔疝、臍疝、腹疝)、和腸疾病(如盲腸疾病(闌尾炎、盲腸贅生物))。趨化性本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可具有趨化活性。趨化分子將細(xì)胞(如單核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、T細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜曙紅細(xì)胞、上皮細(xì)胞、和/或內(nèi)皮細(xì)胞)吸引或動員至身體中特定部位，諸如發(fā)炎、感染、或過度增殖部位。然后動員的細(xì)胞可抗擊和/或治療特定創(chuàng)傷或異常。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可提高特定細(xì)胞的趨化活性。因而這些趨化分子可用于通過提高靶向身體中特定部位的細(xì)胞數(shù)目來治療炎癥、感染、過度增殖性紊亂、或任何免疫系統(tǒng)紊亂。例如，趨化分子可用于通過將免疫細(xì)胞吸引至受傷部位來治療傷口或?qū)M織的其它創(chuàng)始。本發(fā)明的趨化分子還可吸引成纖維細(xì)胞，它可用于治療傷口。還設(shè)想了本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可抑制趨化活性。這些分子也可用于治療紊亂。由此，本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用作趨化性的抑制劑。結(jié)合活性本發(fā)明的清蛋白融合蛋白可用于篩選結(jié)合融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分的分子或融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分結(jié)合的分子。融合蛋白與該分子的結(jié)合可刺激(激動劑)、提高、抑制(拮抗劑)、或降低融合蛋白或所結(jié)合分子的活性。這種分子的實(shí)例包括抗體、寡核苷酸、蛋白質(zhì)(如受體)、或小分子。優(yōu)選的是，該分子與本發(fā)明融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分的天然配體密切相關(guān)，如配體的片段，或是天然底物、配體、結(jié)構(gòu)或功能模擬物(參閱Coligan等人，CurrentProtocolsinImmunology，1(2)第5章，1991)。類似的，該分子可與本發(fā)明清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分結(jié)合的天然受體密切相關(guān)，或者至少是能由本發(fā)明清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分結(jié)合的受體片段(如活性位點(diǎn))。在任一種情況中，可使用已知技術(shù)理性設(shè)計(jì)該分子。優(yōu)選的是，這些分子的篩選牽涉生成表達(dá)本發(fā)明清蛋白融合蛋白的適當(dāng)細(xì)胞。優(yōu)選的細(xì)胞包括來自哺乳動物、酵母、果蠅、或大腸桿菌的細(xì)胞。測定法可僅僅測試候選化合物與本發(fā)明清蛋白融合蛋白的結(jié)合，其中結(jié)合是通過標(biāo)記物或在牽涉經(jīng)標(biāo)記競爭物的競爭的測定法中檢測。此外，測定法可測試候選化合物通過與融合蛋白的結(jié)合而產(chǎn)生信號?；蛘撸瑴y定法可使用無細(xì)胞制備物、附著于固相支持物上的融合蛋白/分子、化學(xué)庫、或天然產(chǎn)物混合物來進(jìn)行。測定法還可僅僅包括下列步驟將候選化合物與含清蛋白融合蛋白溶液混和；測量融合蛋白/分子活性或結(jié)合；并與標(biāo)準(zhǔn)品比較融合蛋白/分子活性或結(jié)合。優(yōu)選的是，ELISA測定法可使用單克隆或多克隆抗體測量樣品(如生物學(xué)樣品)中的融合蛋白水平或活性?；蚴峭ㄟ^與清蛋白融合蛋白的直接或間接結(jié)合，或是通過與清蛋白融合蛋白競爭底物，抗體可測量融合蛋白水平或活性。另外，可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的許多方法來鑒定本發(fā)明清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分結(jié)合的受體，例如配體淘選和FACS分選(Coligan等人，CurrentProtocolsinImmun.，1(2)，第5章，1991)。例如，在融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分對應(yīng)于FGF的情況中，可采用表達(dá)克隆，其中由響應(yīng)清蛋白融合蛋白的細(xì)胞制備聚腺苷酸化RNA，例如已知含有FGF家族蛋白質(zhì)的多種受體的NIH3T3細(xì)胞和SC-3細(xì)胞，并將由此RNA構(gòu)建的cDNA文庫分成幾個集合并用于轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞或不響應(yīng)清蛋白融合蛋白的其它細(xì)胞。將在載波片上培養(yǎng)的經(jīng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞暴露于本發(fā)明的清蛋白融合蛋白，事先對它們進(jìn)行標(biāo)記?？赏ㄟ^多種方法來標(biāo)記清蛋白融合蛋白，包括碘化或引入位點(diǎn)特異蛋白激酶的識別位點(diǎn)。固定和溫育后，對載波片進(jìn)行放射自顯影分析。鑒定陽性集合，并使用反復(fù)分子集和再次篩選過程來制備子集和再次轉(zhuǎn)染，最終產(chǎn)生編碼假定受體的單一克隆。作為受體鑒定的替代方法，可將經(jīng)標(biāo)記清蛋白融合蛋白與表達(dá)本發(fā)明清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分的受體分子的細(xì)胞膜或提取制備物通過光親和連接，連接的物質(zhì)可通過PAGE分析解析并使X射線膠片曝光?？汕邢潞诤系鞍资荏w的經(jīng)標(biāo)記復(fù)合物，解析成肽片段，并進(jìn)行蛋白質(zhì)微量測序。由微量測定得到的氨基酸序列將用于設(shè)計(jì)一組簡并寡核苷酸探針，用于篩選cDNA文庫以鑒定編碼假定受體的基因。此外，可采用基因改組、基序改組、外顯子改組、和/或密碼子改組(統(tǒng)稱為“DNA改組”)技術(shù)來調(diào)控融合蛋白和/或本發(fā)明清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分或清蛋白成分的活性，由此高效生成本發(fā)明清蛋白融合蛋白的激動劑和拮抗劑。通常參閱美國專利號5,605,793、5,811,238、5,830,721、5,834,252、和5,837,458以及Patten，P.A.等人，Curr.OpinionBiotechnol.，8724-33，1997；Harayama，S.，TrendsBiotechnol.，16(2)76-82，1998；Hansson，L.O.等人，J.Mol.Biol.，287265-76，1999；及Lorenzo，M.M.和Blasco，R.，Biotechniques，24(2)308-13，1998；將這些專利和出版物的每一篇引入本文作為參考。在一個實(shí)施方案中，可通過DNA改組來實(shí)現(xiàn)編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸及因而由其編碼的清蛋白融合蛋白的改變。DNA改組牽涉通過同源或位點(diǎn)特異重組將兩個或多個DNA區(qū)段組裝成所需分子。在另一個實(shí)施方案中，可通過進(jìn)行隨機(jī)誘變來改變編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸及因而由其編碼的清蛋白融合蛋白，而隨機(jī)誘變可通過在重組前進(jìn)行錯誤傾向PCR、隨機(jī)核苷酸插入、或其它方法來實(shí)現(xiàn)。在另一個實(shí)施方案中，可將本發(fā)明清蛋白融合蛋白的一種或多種成分、基序、部件、部分、結(jié)構(gòu)域、片段等與一種或多種異源分子的一種或多種成分、基序、部件、部分、結(jié)構(gòu)域、片段等重組。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，異源分子是家族成員。在更為優(yōu)選的實(shí)施方案中，異源分子是生長因子，諸如例如血小板衍生生長因子(PDGF)、胰島素樣生長因子(IGF-1)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-α、表皮生長因子(EGF)、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、TGF-β、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、激活蛋白A和B、decapentaplegic(dpp)、60A、OP-2、背蛋白、生長分化因子(GDF)、nodal、MIS、抑制素-α、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β5、和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)。其它優(yōu)選片段有本發(fā)明清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分和/或清蛋白成分的生物學(xué)活性片段。生物學(xué)活性片段指展示的活性與本發(fā)明清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分和/或清蛋白成分的活性相似但不必相同的片段。片段的生物學(xué)活性可包括提高的想要的活性或降低的不想要的活性。另外，本發(fā)明提供了篩選化合物以鑒定調(diào)控本發(fā)明清蛋白融合蛋白作用的化合物的方法。這種測定法的實(shí)例包括將哺乳動物成纖維細(xì)胞、本發(fā)明的清蛋白融合蛋白、及待篩選的化合物和3[H]胸苷在成纖維細(xì)胞將正常增殖的細(xì)胞培養(yǎng)條件下混和。對照測定法可在缺乏待篩選化合物的條件下進(jìn)行，并通過測定每種情況中的3[H]胸苷攝取與存在化合物時成纖維細(xì)胞增殖的數(shù)量進(jìn)行比較以確定該化合物是否刺激增殖。成纖維細(xì)胞增殖的數(shù)量是通過液體閃爍層析測量的，它測量3[H]胸苷的摻入。激動劑和拮抗劑兩種化合物都可通過這種程序來鑒定。在另一種方法中，將表達(dá)本發(fā)明融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)成分的受體的哺乳動物細(xì)胞或膜制備物與經(jīng)過標(biāo)記的本發(fā)明融合蛋白在存在化合物的條件下一起溫育。然后可測量化合物增強(qiáng)或阻斷此相互作用的能力?；蛘?，測量待篩選化合物與受體相互作用后的已知第二信使系統(tǒng)的應(yīng)答，并測量化合物結(jié)合受體并引發(fā)第二信使應(yīng)答的能力以確定該化合物是否是潛在的融合蛋白。這種第二信使系統(tǒng)包括但不限于cAMP鳥苷酸環(huán)化酶、離子通道、或磷酸肌醇水解。所有這些上述測定法都可用作診斷或預(yù)測標(biāo)志。通過活化或抑制融合蛋白/分子，使用這些測定法發(fā)現(xiàn)的分子可用于治療疾病或在患者中產(chǎn)生特定結(jié)果(如血管生長)。此外，這些測定法能發(fā)現(xiàn)可抑制或增強(qiáng)合適操作的細(xì)胞或組織生成本發(fā)明清蛋白融合蛋白的試劑。因此，本發(fā)明包括鑒定結(jié)合本發(fā)明清蛋白融合蛋白的化合物的方法，包括下列步驟(a)將候選結(jié)合化合物與本發(fā)明的清蛋白融合蛋白一起溫育；并(b)測定是否發(fā)生了結(jié)合。此外，本發(fā)明包括鑒定激動劑/拮抗劑的方法，包括下列步驟(a)將候選化合物與本發(fā)明的清蛋白融合蛋白一起溫育，(b)測定生物學(xué)活性，并(c)測定融合蛋白的生物學(xué)活性是否發(fā)生了改變。靶向投遞在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了將組合物投遞至表達(dá)本發(fā)明清蛋白融合蛋白一種成分的受體的靶細(xì)胞的方法。正如本文所討論的，本發(fā)明的融合蛋白可經(jīng)由疏水性、親水性、離子、和/或共價相互作用與異源多肽、異源核酸、毒素、或前體藥物締合。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通過施用與異源多肽或核酸締合的本發(fā)明融合蛋白(包括抗體)而將本發(fā)明的組合物特異投遞至細(xì)胞的方法。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明提供了用于將治療性蛋白質(zhì)投遞到靶細(xì)胞中的方法。在另一個實(shí)施例中，本發(fā)明提供了用于將單鏈核酸(如反義或核酶)或雙鏈核酸(如能整合到細(xì)胞基因組中或作為附加體復(fù)制且能夠轉(zhuǎn)錄的DNA)投遞到靶細(xì)胞中的方法。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通過施用與毒素或胞毒劑締合的本發(fā)明清蛋白融合蛋白(如本發(fā)明的多肽或本發(fā)明的抗體)來特異破壞細(xì)胞(如破壞腫瘤細(xì)胞)的方法?！岸舅亍币庵附Y(jié)合并激活內(nèi)源細(xì)胞毒性效應(yīng)物系統(tǒng)的化合物、放射性同位素、全毒素、改良毒素、毒素的催化亞基、或通常在細(xì)胞中或在細(xì)胞表面上不存在的、在限定條件下引起細(xì)胞死亡的任何分子或酶?？梢勒毡景l(fā)明使用的毒素包括但不限于本領(lǐng)域已知的放射性同位素、諸如例如結(jié)合內(nèi)在的或誘導(dǎo)的內(nèi)源細(xì)胞毒性效應(yīng)物系統(tǒng)的抗體(或其含補(bǔ)體固定部分)等化合物、胸苷激酶、內(nèi)切核酸酶、RNA酶、α-毒素、蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、假單胞菌外毒素A、白喉毒素、肥皂草毒蛋白、苦瓜毒蛋白、多花白樹毒蛋白、美洲商陸抗病毒蛋白、α-帚曲霉素、和霍亂毒素?！凹?xì)胞毒性前體藥物”意指由通常在細(xì)胞中存在的酶轉(zhuǎn)變成細(xì)胞毒性化合物的無毒化合物?？梢勒毡景l(fā)明的方法使用的細(xì)胞毒性前體藥物包括但不限于苯甲酸芥子烷化劑的谷氨酰衍生物、鬼臼亞乙苷或絲裂霉素C的磷酸鹽衍生物、阿糖胞甘、道諾紅霉素、和阿霉素的苯氧基乙酰胺衍生物。藥物篩選還設(shè)想了本發(fā)明的清蛋白融合蛋白或編碼這些融合蛋白的多核苷酸用于篩選修飾(modify)本發(fā)明的清蛋白融合蛋白或與清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分對應(yīng)的蛋白質(zhì)的活性的分子的用途。這種方法將包括使融合蛋白接觸懷疑具有拮抗劑或激動劑活性的選定化合物，并測定融合蛋白在結(jié)合后的活性。通過在多種藥物篩選技術(shù)中使用本發(fā)明的清蛋白融合蛋白或其結(jié)合片段，本發(fā)明特別可用于篩選治療性化合物。在這種測試中所采用的清蛋白融合蛋白可以附著于固相支持物、表達(dá)于細(xì)胞表面、游離于溶液中、或定位于細(xì)胞內(nèi)。一種藥物篩選方法利用經(jīng)表達(dá)清蛋白融合蛋白的重組核酸穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的真核或原核宿主細(xì)胞。在競爭性結(jié)合測定法中針對這種經(jīng)過轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或通過培養(yǎng)這種細(xì)胞得到的上清液對藥物進(jìn)行篩選?？蓽y量例如所測試試劑與本發(fā)明清蛋白融合蛋白之間復(fù)合物的形成。由此，本發(fā)明提供了篩選藥物或影響由本發(fā)明清蛋白融合蛋白介導(dǎo)的活性的任何其它試劑的方法。這些方法包括通過本領(lǐng)域眾所周知的方法使該試劑接觸本發(fā)明的清蛋白融合蛋白或其片段，并測定試劑與清蛋白融合蛋白或其片段之間復(fù)合物的存在。在這種競爭性結(jié)合測定法中，待篩選的試劑通常進(jìn)行了標(biāo)記。溫育后，將游離試劑與以結(jié)合形式存在的試劑分開，而游離的或未絡(luò)合的標(biāo)記物的數(shù)量是特定試劑結(jié)合本發(fā)明清蛋白融合蛋白的能力的度量。另一種藥物篩選技術(shù)提供了對本發(fā)明的清蛋白融合蛋白具有合適結(jié)合親和力的化合物的高通量篩選，而且在1984年9月13日公布的歐洲專利申請84/03564中進(jìn)行了極為詳細(xì)的描述，將其引入本文作為參考。簡而言之，在固相基底諸如塑料插腳或一些其它表面上合成大量的不同小肽測試化合物。使肽測試化合物與本發(fā)明的清蛋白融合蛋白進(jìn)行反應(yīng)，并進(jìn)行清洗。然后通過本領(lǐng)域眾所周知的方法來檢測結(jié)合的肽?？蓪⒓兓那宓鞍兹诤系鞍字苯影辉谄桨迳弦杂糜谏鲜鏊幬锖Y選技術(shù)。另外，非中和抗體可用于捕捉肽并將其固定在固相支持物上。本發(fā)明還設(shè)想了競爭性藥物篩選測定法的用途，其中能夠結(jié)合本發(fā)明清蛋白融合蛋白的中和抗體與測試化合物特異競爭與清蛋白融合蛋白或其片段的結(jié)合。如此，將抗體用于檢測與本發(fā)明清蛋白融合蛋白共享一個或多個抗原性表位的任何肽的存在。結(jié)合肽和其它分子本發(fā)明還涵蓋用于鑒定結(jié)合本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多肽和非多肽的篩選方法，以及由此鑒定得到的結(jié)合分子。這些結(jié)合分子可用作例如本發(fā)明清蛋白融合蛋白的激動劑和拮抗劑。這種激動劑和拮抗劑可依照本發(fā)明用于下文詳細(xì)描述的治療實(shí)施方案。該方法包括下列步驟使本發(fā)明的清蛋白融合蛋白接觸多種分子；并鑒定結(jié)合清蛋白融合蛋白的分子。使本發(fā)明的清蛋白融合蛋白接觸多種分子的步驟可以多種方式進(jìn)行。例如，可設(shè)想將清蛋白融合蛋白固定在固相支持物上，并使多種分子的溶液接觸固定化的多肽。這樣一種流程將類似于親和層析過程，其中親和基質(zhì)由固定化的本發(fā)明清蛋白融合蛋白構(gòu)成。然后可通過親和選擇來純化對清蛋白融合蛋白具有選擇性親和力的分子。固相支持物的本質(zhì)、用于將清蛋白融合蛋白附著于固相支持物的過程、溶劑、以及親和分離或選擇的條件是極為方便的，且是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的?；蛘撸€可將多種多肽分開成基本上分開的級分，給自包含個別多肽或其子集。例如，可通過凝膠電泳、柱層析、或本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道的用于將多肽分開的類似方法將多種多肽分開。還可以這樣一種方式由經(jīng)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞生成個別多肽，即表達(dá)在其外表面之上或周圍(如重組噬菌體)。然后可用本發(fā)明的清蛋白融合蛋白“探查”個別分離物，任選在存在表達(dá)所需要的誘導(dǎo)物的條件下，以確定清蛋白融合蛋白與個別克隆之間是否存在任何選擇性親和相互作用。在使清蛋白融合蛋白接觸包含個別多肽的每一級分前，首先可將多肽轉(zhuǎn)移至固相支持物以提供額外便利。這種固相支持物可僅僅是一片濾膜，諸如由硝酸纖維素或尼龍制成的。如此，可由表達(dá)文庫的經(jīng)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞集合鑒定出陽性克隆，它包含編碼對本發(fā)明的清蛋白融合蛋白具有選擇性親和力的多肽的DNA構(gòu)建物。此外，可通過常規(guī)方法直接測定對本發(fā)明的清蛋白融合蛋白具有選擇性親和力的多肽的氨基酸序列，或者常?？筛奖愕臏y定編碼多肽的DNA的編碼序列。然后可由相應(yīng)的DNA序列推導(dǎo)一級序列。如果要用多肽自身測定氨基酸序列，則可采用微量測序技術(shù)。測序技術(shù)可包括質(zhì)譜法。在某些情況中，可能希望在試圖測定或檢測選擇性親和相互作用的存在之前由本發(fā)明清蛋白融合蛋白與多種多肽的混合物洗去任何未結(jié)合的多肽。在將本發(fā)明的清蛋白融合蛋白或多種多肽結(jié)合于固相支持物時，可能特別需要這種清洗步驟。依照該方法提供的多種分子可通過多樣性文庫的方式來提供，諸如可用于篩選特異結(jié)合本發(fā)明清蛋白融合蛋白的分子的隨機(jī)或組合肽或非肽文庫。本領(lǐng)域知道許多可用的文庫，例如化學(xué)合成庫、重組庫(如噬菌體展示庫)、和基于體外翻譯的文庫。Fodor等人，Science，251767-773，1991；Houghten等人，Nature，35484-86，1991；Lam等人，Nature，35482-84，1991；Medynski，Bio/Technology，12709-710，1994；Gallop等人，J.MedicinalChemistry，37(9)1233-1251，1994；Ohlmeyer等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9010922-10926，1993；Erb等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9111422-11426，1994；Houghten等人，Biotechniques，13412，1992；Jayawickreme等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，911614-1618，1994；Salmon等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9011708-11712，1993；PCT公布號WO93/20242；及Brenner和Lemer，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，895381-5383，1992中描述了化學(xué)合成庫的實(shí)例。Scott等人，Science，249386-390，1990；Devlin等人，Science，249404-406，1990；Christian等人，J.Mol.Biol.，227711-718，1992；Lenstra，J.Immunol.Meth.，152149-157，1992；Kay等人，Gene，12859-65，1993；及PCT公布號WO94/18318，1994年8月18日中描述了噬菌體展示庫的實(shí)例。基于體外翻譯的文庫包括但不限于PCT公布號WO91/05058，1991年4月18日；及Mattheakis等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，919022-9026，1994中所描述的。作為非肽文庫的實(shí)例，苯并二氮雜草文庫(參閱例如Bunin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，914708-4712，1994)可適應(yīng)此用途。還可使用類肽文庫(Simon等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，899367-9371，1992)。Ostresh等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9111138-11142，1994描述了可用文庫的另一種實(shí)例，其中肽的酰胺官能度已經(jīng)permethylated以產(chǎn)生化學(xué)轉(zhuǎn)化的組合庫?？捎糜诒景l(fā)明的非肽文庫的種類極多。例如，Ecker和Crooke，Bio/Technology，13351-360，1995在構(gòu)成各種文庫基礎(chǔ)的化學(xué)種類中列出了苯并二氮雜草、乙內(nèi)酰脲、哌嗪二酮、聯(lián)苯、糖類似物、β-巰基酮、芳基乙酸、?；哙ぁ⒈讲⑦拎?、立方烷、黃嘌呤、胺化酰亞胺、和噁唑酮。非肽文庫可粗略的分成兩類裝飾單體和低聚物。裝飾單體庫采用相對簡單的支架結(jié)構(gòu)，在其上添加多種官能基。支架常常是具有已知有用藥理學(xué)活性的分子。例如，支架可以是苯并二氮雜草結(jié)構(gòu)。非肽低聚物文庫利用大量的單體并將其組裝到一起，根據(jù)單體的順序產(chǎn)生新的形狀。在已經(jīng)采用的單體單位中有氨基甲酸酯、pyrrolinone、和嗎啉代。類肽，即其中側(cè)鏈附著于α-氨基而非α-碳的肽樣低聚物，構(gòu)成了另一種形式的非肽低聚物文庫的基礎(chǔ)。最初的非肽低聚物文庫利用單一類型的單體，因而含有重復(fù)的主鏈。最近的文庫已經(jīng)利用超過一種單體，使得文庫的靈活性(flexibility)增加。篩選文庫可通過普遍知道的多種方法來進(jìn)行。參閱例如下列參考文獻(xiàn)，它們公開了肽庫的篩選Parsley等人，Adv.Exp.Med.Biol.，251215-218，1989；Scott等人，Science，249386-390，1990；Fowlkes等人，BioTechniques，13422-427，1992；Oldenburg等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，895393-5397，1992；Yu等人，Cell，76933-945，1994；Staudt等人，Science，241577-580，1988；Bock等人，Nature，355564-566，1992；Tuerk等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，896988-6992，1992；Ellington等人，Nature，355850-852，1992；美國專利號5,096,815、美國專利號5,223,409、和美國專利號5,198,346，都授予了Ladner等人；Rebar等人，Science，263671-673，1993；及PCT公布號WO94/18318。在一個具體實(shí)施方案中，為了鑒定結(jié)合本發(fā)明清蛋白融合蛋白的分子而進(jìn)行的篩選可通過使文庫成員接觸固定在固相支持物上的本發(fā)明清蛋白融合蛋白并收獲與清蛋白融合蛋白結(jié)合的那些文庫成員來執(zhí)行。例如Parmley等人，Gene，73305-318，1988；Fowlkes等人，BioTechniques，13422-427，1992；PCT公布號WO94/18318；及其引用的參考文獻(xiàn)中描述了稱為“淘選”技術(shù)的這些篩選方法的實(shí)例在另一個實(shí)施方案中，用于在酵母中篩選相互作用蛋白質(zhì)的雙雜交系統(tǒng)(Fields等人，Nature，340245-246，1989；Chien等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，889578-9582，1991)可用于鑒定特異結(jié)合本發(fā)明多肽的分子。當(dāng)結(jié)合分子是多肽時，可由任何肽庫方便的選擇多肽，包括隨機(jī)肽庫、組合肽庫、或偏愛肽庫。術(shù)語“偏愛”在用于本文時指用于構(gòu)建文庫的方法在操作時對一項(xiàng)或多項(xiàng)參數(shù)施加了限制，而該參數(shù)決定了由此得到的分子(在這種情況中是肽)集合的多樣性。由此，真正的隨機(jī)肽庫將產(chǎn)生這樣的肽集合，即其中在肽的指定位置發(fā)現(xiàn)特定氨基酸的概率對于所有20種氨基酸是相同的。然而，通過指定例如每5個氨基酸出現(xiàn)一個賴氨酸或十肽庫的位置4、8、和9固定為只包含精氨酸，可向文庫中引入偏愛。顯然，可設(shè)想許多類型的偏愛，而且本發(fā)明不限于任何具體偏愛。此外，本發(fā)明設(shè)想了特定類型的肽庫，諸如噬菌體展示肽庫和采用包含λ噬菌體載體及DNA插入片段的DNA構(gòu)建物的肽庫。如上所述，在結(jié)合分子是多肽的情況中，多肽可具有約6個至少于約60個氨基酸殘基，優(yōu)選約6個至約10個氨基酸殘基，且最優(yōu)選約6個至約22個氨基酸。在另一個實(shí)施方案中，結(jié)合多肽具有15-100個氨基酸或20-50個氨基酸。選定的結(jié)合多肽可通過化學(xué)合成或重組表達(dá)來獲得。其它活性本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于在因多種疾病狀況諸如血栓癥、動脈硬化、和其它心血管狀況引起的缺血組織中刺激新血管形成(re-vascularization)的治療。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸還可用于刺激血管發(fā)生和肢體再生，正如上文所討論的。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸還可用于治療因傷害、燒傷、術(shù)后組織修復(fù)、和潰瘍引起的創(chuàng)傷，因?yàn)樗鼈兇龠M(jìn)不同起源的多種細(xì)胞的有絲分裂，諸如成纖維細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞，并由此促進(jìn)受損或患病組織的修復(fù)或置換。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸還可用于刺激神經(jīng)元生長，以及用于治療和預(yù)防在某些神經(jīng)元紊亂或神經(jīng)變性狀況中發(fā)生的神經(jīng)元損傷，諸如阿爾茨海默氏病、帕金森氏病、和AIDS相關(guān)復(fù)合癥。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可具有刺激軟骨細(xì)胞生長的能力，因此它們可用于增強(qiáng)骨和牙周再生，并在組織移植或骨移植中提供幫助。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸還可用于通過刺激角質(zhì)形成細(xì)胞生長來預(yù)防因曬斑引起的皮膚衰老。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸還可用于預(yù)防掉毛(hairloss)。同樣，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸在聯(lián)合其它細(xì)胞因子使用時可用于刺激造血細(xì)胞和骨髓細(xì)胞的生長和分化。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸還可用于在移植前維持器官或支持初生組織的細(xì)胞培養(yǎng)物。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸還可用于在早期胚胎中誘導(dǎo)中胚層起源的組織進(jìn)行分化。除上文討論的造血譜系之外，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸還可提高或降低胚胎干細(xì)胞的分化或增殖。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸還可用于調(diào)控哺乳動物的特征，諸如身高、體重、毛色、眼睛顏色、皮膚、脂肪組織的比例、色素沉著、體型、和體形(如整容手術(shù))。類似的，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于調(diào)控哺乳動物的新陳代謝，影響分解代謝、合成代謝、能量的加工、利用和貯藏。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于通過影響生物節(jié)律、心律、抑郁(包括抑郁癥)、暴力傾向、疼痛耐受水平、生殖能力(優(yōu)選通過激活素或抑制素樣活性)、激素或內(nèi)分泌水平、食欲、性欲、記憶力、壓力、或其它認(rèn)知質(zhì)量來改變哺乳動物的精神狀態(tài)或身體狀態(tài)。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸還可作用食品添加劑或防腐劑，諸如用于提高或降低貯藏能力、脂肪含量、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、碳水化合物、微生物、礦物質(zhì)、輻因子、或其它營養(yǎng)成分。上述應(yīng)用可用于極其廣泛的宿主。這些宿主包括但不限于人、鼠、兔、山羊、豚鼠、駱駝、馬、小鼠、大鼠、倉鼠、豬、微型豬、雞、山羊、牛、綿羊、犬、貓、非人靈長類、和人。在具體的實(shí)施方案中，宿主是小鼠、兔、山羊、豚鼠、雞、大鼠、倉鼠、豬、綿羊、犬、或貓。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，宿主是哺乳動物。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，宿主是人。在概括描述了本發(fā)明后，參考下面的實(shí)施例將更容易的理解本發(fā)明。這些實(shí)施例是作為例證提供的，而非意圖作為限制。我們認(rèn)為，在沒有更多描述的條件下，憑借前述描述和下面的例示性實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可生成和利用本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)的改變，并實(shí)踐所主張的方法。因此，下面的工作實(shí)施例具體指出了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，而非解釋為以任何方式限制公開書的其余部分。實(shí)施例實(shí)施例1pScNHSA和pScCHSA的產(chǎn)生載體pScNHSA(ATCC保藏號PTA-3279)和pScCHSA(ATCC保藏號PTA-3276)是pPPC0005(ATCC保藏號PTA-3278)的衍生物，并作為克隆載體用于插入編碼治療性蛋白質(zhì)或其片段或變體的多核苷酸，與編碼人血清清蛋白“HSA”的多核苷酸鄰接且在同一翻譯框中。pScCHSA可用于產(chǎn)生治療性蛋白質(zhì)-HSA融合物，而pScNHSA可用于產(chǎn)生HSA-治療性蛋白質(zhì)融合物。pScCHSA的產(chǎn)生清蛋白部分位于治療性部分C-末端的清蛋白融合物通過改變pPPC0005中編碼嵌合HSA信號肽的核酸序列以包括XhoI和ClaI限制性位點(diǎn)來制備便于將編碼治療性蛋白質(zhì)的DNA克隆到編碼成熟清蛋白蛋白質(zhì)的DNA的N-末端的載體。第一步，通過用XhoI和ClaI消化pPPC0005除去pPPC0005固有的XhoI和ClaI位點(diǎn)(位于ADH1終止子序列的3’端)，用T4DNA聚合酶補(bǔ)平粘端，并重新連接平端以產(chǎn)生pPPC0006。第二步，使用兩輪PCR將XhoI和ClaI限制性位點(diǎn)加入pPPC006中編碼HSA信號肽的核酸序列(HSA前導(dǎo)序列與來自交配因子α“MAF”的kex2位點(diǎn)的嵌合體)中。在第一輪PCR中，用SEQIDNO36和SEQIDNO37所示引物進(jìn)行擴(kuò)增。序列如SEQIDNO36所示的引物包含編碼部分HSA信號肽序列、來自交配因子α前導(dǎo)序列的kex2位點(diǎn)和部分HSA成熟形式的氨基末端的核酸序列。序列中中引入了四個點(diǎn)突變，產(chǎn)生在嵌合信號肽和HSA成熟形式的連接處發(fā)現(xiàn)的XhoI和ClaI位點(diǎn)。這四個突變在如下所示序列中標(biāo)有下劃線。在pPPC0005中，這四個位置的核苷酸從5’到3’為T、G、T和G。5′-GCCTCGAGAAAAGAGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTCATCGATTTAAAGATTTGGG-3′(SEQIDNO36)和5′-AATCGATGAGCAACCTCACTCTTGTGTGCATCTCTTTTCTCGAGGCTCCTGGAATAAGC-3′(SEQIDNO37)。然后用上游側(cè)翼引物，5′-TACAAACTTAAGAGTCCAATTAGC-3′(SEQIDNO38)和下游側(cè)翼引物5′-CACTTCTCTAGAGTGGTTTCATATGTCTT-3′(SEQIDNO39)進(jìn)行第二輪PCR。然后純化如此產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物，用AflII和XbaI消化，并連接到pPPC0006的相同位點(diǎn)中以產(chǎn)生pScCHSA。如此產(chǎn)生的質(zhì)粒具有引入到信號序列中的XhoI和ClaI位點(diǎn)。XhoI位點(diǎn)的存在在信號序列的末端中產(chǎn)生了單個氨基酸改變即從LDKR到LEKR。在將具有5’SalI位點(diǎn)(它與XhoI位點(diǎn)相容)和3’ClaI位點(diǎn)、包含編碼清蛋白融合蛋白治療性部分的多核苷酸的核酸序列連接到pScCHSA的XhoI和ClaI位點(diǎn)中后，D到E的改變將不會存在于最終的清蛋白融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒中。SalI到XhoI的連接恢復(fù)了信號肽序列的原始氨基酸序列。編碼清蛋白融合蛋白治療性部分的DNA可插入到Kex2位點(diǎn)之后(Kex2在信號肽末端的二堿性氨基酸序列KR之后進(jìn)行切割)和ClaI位點(diǎn)之前。pScNHSA的產(chǎn)生清蛋白部分位于治療性部分N-末端的清蛋白融合物通過向pScCHSA中添加三個八堿基對限制性位點(diǎn)來制備便于將編碼治療性蛋白質(zhì)部分的DNA克隆到編碼成熟清蛋白蛋白質(zhì)的DNA的C-末端的載體。將AscI、FseI和PmeI限制性位點(diǎn)添加到編碼成熟HSA蛋白質(zhì)的核酸序列末端的Bsu36I和HindIII位點(diǎn)之間。這是通過使用含有下劃線標(biāo)示的AscI、FseI和PmeI限制性位點(diǎn)的兩個互補(bǔ)合成引物(SEQIDNO40和SEQIDNO41)實(shí)現(xiàn)的。5′-AAGCTGCCTTAGGCTTATAATAAGGCGCGCCGGCCGGCCGTTTAAACTAAGCTTAATTCT-3′(SEQIDNO40)和5′-AGAATTAAGCTTAGTTTAAACGGCCGGCCGGCGCGCCTTATTATAAGCCTAAGGCAGCTT-3′(SEQIDNO41)。將這些引物退火，用Bsu36I和HindIII消化，并連接到pScCHSA的相同位點(diǎn)中以產(chǎn)生pScNHSA。實(shí)施例2用于酵母轉(zhuǎn)化的一般構(gòu)建物的產(chǎn)生載體pScNHSA和pScCHSA可作為克隆載體用于插入編碼治療性蛋白質(zhì)或其片段或變體的多核苷酸，與編碼成熟人血清清蛋白“HSA”的多核苷酸鄰接。pScCHSA用于產(chǎn)生治療性蛋白質(zhì)-HSA融合物，而pScNHSA可以用于產(chǎn)生HSA-治療性蛋白質(zhì)融合物。包含HSA-治療性蛋白質(zhì)融合產(chǎn)物的清蛋白融合構(gòu)建物的產(chǎn)生編碼治療性蛋白質(zhì)的DNA(如SEQIDNOX所示的或本領(lǐng)域已知的序列)可以使用便于產(chǎn)生融合構(gòu)建物的引物(例如通過添加限制性位點(diǎn)、編碼無縫融合物、編碼接頭序列等)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠設(shè)計(jì)將編碼HSA成熟形式的最后四個氨基酸(和含有Bsu36I位點(diǎn))的多核苷酸到添加到編碼治療性蛋白質(zhì)的DNA的5’端的5’引物；以及將終止密碼子和合適克隆位點(diǎn)添加到治療性蛋白質(zhì)編碼序列的3’端的3’引物。例如，用于擴(kuò)增編碼治療性蛋白質(zhì)的DNA的正向引物可具有序列，5′aagctGCCTTAGGCTTA(N)15-3’(SEQIDNO42)，其中下劃線序列是Bsu36I位點(diǎn)，大寫的核苷酸編碼成熟HSA蛋白質(zhì)的最后四個氨基酸(ALGL)，而(N)15與編碼目的治療性蛋白質(zhì)的最先15個核苷酸相同。類似的，用于擴(kuò)增編碼治療性蛋白質(zhì)的DNA的反向引物可具有序列，5′-GCGCGCGTTTAAACGGCGCGCC(N)15-3′(SEQIDNO43)，其中斜體序列是PmeI位點(diǎn)，雙下劃線序列是FseI位點(diǎn)，單下劃線序列是AscI位點(diǎn)，方框核苷酸是兩個串聯(lián)終止密碼子的反向互補(bǔ)序列，而(N)15與編碼目的治療性蛋白質(zhì)的最后15個核苷酸的反向互補(bǔ)序列相同。一旦擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物，它可以用Bsu36I和(AscI、FseI或PmeI)之一進(jìn)行切割，并連接到pScNHSA中。HSA嵌合前導(dǎo)序列中XhoI位點(diǎn)的存在在嵌合信號序列，即HSA-kex2信號序列的末端中產(chǎn)生了單個氨基酸改變，從LDKR(SEQIDNO44)到LEKR(SEQIDNO45)。包含基因-HSA融合產(chǎn)物的清蛋白融合構(gòu)建物的產(chǎn)生與上文所述方法類似，編碼治療性蛋白質(zhì)的DNA可以使用下列引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增將含有SalI位點(diǎn)且編碼HSA前導(dǎo)序列最后三個氨基酸DKR的多核苷酸添加到編碼治療性蛋白質(zhì)的DNA的5′端的5′引物；和將含有ClaI位點(diǎn)、編碼成熟HSA最初幾個氨基酸的多核苷酸添加到編碼治療性蛋白質(zhì)的DNA的3′端的3′引物。例如，用于擴(kuò)增編碼治療性蛋白質(zhì)的DNA的正向引物可具有序列，5′-aggagcgtcGACAAAAGA(N)15-3′(SEQIDNO46)，其中下劃線序列是SalI位點(diǎn)，大寫核苷酸編碼HSA前導(dǎo)序列的最后三個氨基酸(DKR)，而(N)15與編碼目的治療性蛋白質(zhì)的最先15個核苷酸相同。類似的，用于擴(kuò)增編碼治療性蛋白質(zhì)的DNA的反向引物可具有序列，5′-CTTTAAATCGATGAGCAACCTCACTCTTGTGTGCATC(N)15-3′(SEQIDNO47)，其中斜體序列是ClaI位點(diǎn)，下劃線核苷酸是編碼HSA成熟形式的最初9個氨基酸(DAHKSEVAH，SEQIDNO48)的DNA的反向互補(bǔ)序列，而(N)15與編碼目的治療性蛋白質(zhì)的最后15個核苷酸的反向互補(bǔ)序列相同。一旦擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物，它可以用SalI和ClaI進(jìn)行切割，并連接到經(jīng)XhoI和ClaI消化的pScCHSA中?？赡苄枰煌男盘柣蚯皩?dǎo)序列，例如可通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法將轉(zhuǎn)化酶“INV”(Swiss-ProtAccessionP00724)、交配因子α“MAF”(GenbankAccessionAAA18405)、MPIF(GeneseqAAF82936)、纖蛋白B(Swiss-ProtAccessionP23142)、簇蛋白(Swiss-ProtAccessionP10909)、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白4(Swiss-ProtAccessionP22692)和HSA前導(dǎo)序列的變換(permutation)亞克隆到合適載體中。適合在釀酒酵母中表達(dá)的清蛋白融合構(gòu)建物的產(chǎn)生從pScNHSA或pScCHSA產(chǎn)生含有編碼N端或C端清蛋白融合蛋白的DNA的NotI片段，然后可克隆到具有LEU2選擇標(biāo)記的pSAC35的NotI位點(diǎn)中。接著將如此產(chǎn)生的載體用于釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)化。實(shí)施例3釀酒酵母中的一般表達(dá)與酵母表達(dá)相容的表達(dá)載體可通過醋酸鋰轉(zhuǎn)化、電穿孔或本領(lǐng)域已知的和/或Sambrook、Fritsch和Maniatis，1989，《MolecularCloningALaboratoryManual》，第2版，卷1-3及Ausubel等人，2000，MassachusettsGeneralHospitalandHarvardMedicalSchool，《CurrentProtocolsinMolecularBiology》，卷1-4中描述的其它方法轉(zhuǎn)化到釀酒酵母中。表達(dá)載體通過轉(zhuǎn)化導(dǎo)入釀酒酵母菌株DXY1、D88或BXP10中，個別轉(zhuǎn)化體可例如于30℃在10mlYEPD(1％w/v酵母提取物、2％w/v蛋白胨、2％w/v葡萄糖)中培養(yǎng)3天，并在培養(yǎng)60個小時后于穩(wěn)定期收集細(xì)胞。通過將細(xì)胞以3000g離心10分鐘來收集上清液。除LEU2選擇標(biāo)記以外，pSAC35(Sleep等人，1990，Biotechnology842及參見圖3)包含提供復(fù)制功能的整個酵母2μm質(zhì)粒、PRB1啟動子和ADH1終止信號。實(shí)施例4釀酒酵母中由清蛋白融合物表達(dá)的清蛋白融合蛋白的一般純化在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白包含融合于治療性蛋白質(zhì)的成熟形式或其部分(例如表1中列出的治療性蛋白質(zhì)的成熟形式，或表2中以SEQIDNOZ顯示的治療性蛋白質(zhì)的成熟形式)的N-或C-端的HSA的成熟形式。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白還包含在用于表達(dá)的宿主的分泌途徑中指導(dǎo)初生融合多肽的信號序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，由信號序列編碼的信號肽遭到切除，而成熟的清蛋白融合蛋白直接分泌到培養(yǎng)基中。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白優(yōu)選包含異源信號序列(例如特定治療性蛋白質(zhì)的非天然信號序列)，包括但不限于MAF、INV、Ig、纖蛋白B、簇蛋白、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白4、包括但不限于嵌合HSA/MAF前導(dǎo)序列的變體HSA前導(dǎo)序列、或本領(lǐng)域已知的其它異源信號序列。尤其優(yōu)選表2中列出的那些信號序列和/或上文說明書“融合蛋白的表達(dá)”和/或“重組和合成生產(chǎn)清蛋白融合蛋白的其它方法”部分中列出的信號序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的融合蛋白還包含N端甲硫氨酸殘基。本發(fā)明還涵蓋編碼這些多肽的多核苷酸，包括片段和/或變體。如上所述在酵母中表達(dá)的清蛋白融合蛋白能夠如下在Dyax肽親和柱上進(jìn)行小規(guī)模純化。來自表達(dá)清蛋白融合蛋白的酵母的上清液用3mM磷酸鹽緩沖液pH6.2、20mMNaCl和0.01％Tween20滲率以減小體積和清除色素。然后使溶液通過0.22μm裝置過濾。將濾出液加載到Dyax肽親和柱上。用100mMTris/HClpH8.2緩沖液對柱進(jìn)行洗脫。收集含有蛋白質(zhì)的峰級分，并在濃縮5倍后在SDS-PAGE上進(jìn)行分析。對于大規(guī)模純化，可以使用下述方法。將超過2升的上清液在20mMTris/HClpH8.0中滲率并濃縮至500ml。將濃縮的蛋白質(zhì)溶液加載到經(jīng)過預(yù)平衡的50mlDEAE-SepharoseFastFlow柱上，洗柱，并用20mMTris/HClpH8.0中從0到0.4MNaCl的線性梯度NaCl洗脫蛋白質(zhì)。合并含有蛋白質(zhì)的級分，用0.5M磷酸鈉(NaH2PO4)調(diào)至pH6.8。向蛋白質(zhì)溶液中加入終濃度0.9M的(NH4)2SO4，并將整個溶液加載到經(jīng)過預(yù)平衡的50mlButyl650S柱上。用線性梯度的硫酸銨(0.9到0M的(NH4)2SO4)洗脫蛋白質(zhì)。再次合并含有清蛋白融合物的級分，用10mMNa2HPO4/檸檬酸緩沖液pH5.75進(jìn)行滲率，并加載到50ml經(jīng)過預(yù)平衡的SP-SepharoseFastFlow柱上。用0到0.5M的NaCl線性梯度洗脫蛋白質(zhì)。合并含有目的蛋白質(zhì)的級分，用Amicon濃縮器將緩沖液換成10mMNa2HPO4/檸檬酸pH6.25，電導(dǎo)率＜2.5mS/cm。將此蛋白質(zhì)溶液加載到15ml經(jīng)過預(yù)平衡的Q-Sepharose高效柱上，洗柱，并用從0到0.15MNaCl的NaCl線性梯度洗脫蛋白質(zhì)。然后可通過緩沖液轉(zhuǎn)換將純化的蛋白質(zhì)配制成特定緩沖液組合物。實(shí)施例5用于哺乳動物細(xì)胞轉(zhuǎn)染的一般構(gòu)建物的產(chǎn)生適合在哺乳動物細(xì)胞系中表達(dá)的清蛋白融合構(gòu)建物的產(chǎn)生可在用于哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的表達(dá)載體中產(chǎn)生清蛋白融合構(gòu)建物?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法(例如PCR擴(kuò)增、限制性消化和連接)將編碼治療性蛋白質(zhì)的DNA克隆到哺乳動物表達(dá)載體中HSA的N端或C端。一旦構(gòu)建了表達(dá)載體，可進(jìn)行對哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)染。合適的載體是本領(lǐng)域已知的，包括但不限于例如pC4載體和/或可從LonzaBiologics，Inc.(Portsmouth，NH)購得的載體。編碼人血清清蛋白的DNA已經(jīng)克隆到適于哺乳動物培養(yǎng)系統(tǒng)的pC4載體中，產(chǎn)生質(zhì)粒pC4:HSA(ATCC保藏號PTA-3277)。此載體具有二氫葉酸還原酶，“DHFR”基因，容許在存在甲氨蝶呤時進(jìn)行選擇。pC4:HSA載體適于在CHO細(xì)胞中表達(dá)清蛋白融合蛋白。為了在其它哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)，可能希望將包含編碼清蛋白融合蛋白的DNA或由其組成的片段亞克隆到候選表達(dá)載體中。例如，可將包含編碼成熟清蛋白融合蛋白的DNA或由其組成的片段亞克隆到另一種表達(dá)載體中，包括但不限于本文描述的任何哺乳動物表達(dá)載體。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過本領(lǐng)域已知的程序?qū)⒕幋a清蛋白融合構(gòu)建物的DNA亞克隆到由LonzaBiologics，Inc.(Portsmouth，NH)提供的載體中，用于NSO細(xì)胞中的表達(dá)。包含HSA-治療性蛋白質(zhì)融合產(chǎn)物的清蛋白融合構(gòu)建物的產(chǎn)生使用pC4:HSA(ATCC保藏號PTA-3277)，可產(chǎn)生其中治療性蛋白質(zhì)部分位于成熟清蛋白序列C端的清蛋白融合構(gòu)建物。例如，可將編碼治療性蛋白質(zhì)或其片段或變體的DNA克隆到載體的Bsu36I和AscI限制性位點(diǎn)之間。在克隆到Bsu36I和AscI中時，可以采用為了克隆到酵母載體系統(tǒng)中而設(shè)計(jì)的相同引物(SEQIDNO42和43)(見實(shí)施例2)。包含基因-HSA融合產(chǎn)物的清蛋白融合構(gòu)建物的產(chǎn)生使用pC4:HSA(ATCC保藏號PTA-3277)，可產(chǎn)生其中治療性蛋白質(zhì)部分克隆到成熟清蛋白序列N端的清蛋白融合構(gòu)建物。例如，可將編碼具有自己的信號序列的治療性蛋白質(zhì)的DNA克隆到pC4:HSA的BamHI(或HindIII)和ClaI位點(diǎn)之間。在克隆到BamHI或HindIII位點(diǎn)中時，優(yōu)選在編碼治療性蛋白質(zhì)的DNA的翻譯起始密碼子之前包含Kozak序列(CCGCCACCATG，SEQIDNO49)。如果治療性蛋白質(zhì)沒有信號序列，那么可將編碼該治療性蛋白質(zhì)的DNA克隆到pC4:HSA的XhoI和ClaI位點(diǎn)之間。在使用XhoI位點(diǎn)時，可以使用下列5′(SEQIDNO50)和3′(SEQIDNO51)示例性PCR引物5′-CCGCCGCTCGAGGGGTGTGTTTCGTCGA(N)18-3′(SEQIDNO50)5′-AGTCCCATCGATGAGCAACCTCACTCTTGTGTGCATC(N)18-3′(SEQIDNO51)在5′引物(SEQIDNO50)中，下劃線序列是XhoI位點(diǎn)；且XhoI位點(diǎn)和XhoI位點(diǎn)后的DNA編碼天然人血清清蛋白前導(dǎo)序列的最后七個氨基酸。在SEQIDNO50中，“(N)18”與編碼目的治療性蛋白質(zhì)的最先18個核苷酸相同。在3′引物(SEQIDNO51)中，下劃線序列是ClaI位點(diǎn)；且ClaI位點(diǎn)和其后的DNA是編碼成熟HSA蛋白質(zhì)(SEQIDNO1)最先10個氨基酸的DNA的反向互補(bǔ)序列。在SEQIDNO51中，“(N)18”是編碼目的治療性蛋白質(zhì)的DNA的最后18個核苷酸的反向互補(bǔ)序列。使用這兩個引物，可PCR擴(kuò)增目的治療性蛋白質(zhì)，純化PCR產(chǎn)物，用XhoI和ClaI限制酶消化它，并將它克隆到pC4:HSA載體的XhoI和ClaI位點(diǎn)中。如果需要候選前導(dǎo)序列，那么可通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法將天然清蛋白前導(dǎo)序列替換成嵌合清蛋白前導(dǎo)序列，即HSA-kex2信號肽，或其它可選的前導(dǎo)序列。(例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠常規(guī)PCR擴(kuò)增替換用前導(dǎo)序列并將PCR產(chǎn)物亞克隆到清蛋白融合構(gòu)建物中以代替清蛋白前導(dǎo)序列，同時保持讀碼框)。實(shí)施例6哺乳動物細(xì)胞系中的一般表達(dá)可通過磷酸鈣沉淀、脂轉(zhuǎn)染胺試劑、電穿孔、或本領(lǐng)域已知的和/或Sambrook、Fritsch和Maniatis，1989，《MolecularCloningALaboratoryManual》，第2版及在Ausubel等人，2000，MassachusettsGeneralHospitalandHarvardMedicalSchool，《CurrentProtocolsinMolecularBiology》，卷1-4中描述的其它轉(zhuǎn)染方法將在適于在哺乳動物細(xì)胞系中表達(dá)的表達(dá)載體中產(chǎn)生的清蛋白融合構(gòu)建物轉(zhuǎn)染到合適細(xì)胞系中。然后通過由表達(dá)載體中的選擇標(biāo)記決定的選擇劑的存在來選擇轉(zhuǎn)染細(xì)胞。pC4表達(dá)載體(ATCCAccessionNo.209646)是質(zhì)粒pSV2-DHFR(ATCCAccessionNo.37146)的衍生物。pC4含有勞氏肉瘤病毒的強(qiáng)啟動子長末端重復(fù)序列“LTR”(Cullen等人，March1985，MolecularandCellularBiology，438-447)和細(xì)胞巨化病毒“CMV”增強(qiáng)子的片段(Boshart等人，1985，Cell41521-530)。該載體還含有大鼠前胰島素原基因的3’內(nèi)含子、多聚腺苷酸化和終止信號，以及在SV40早期啟動子控制下的小鼠DHFR基因。將中國倉鼠卵巢“CHO”細(xì)胞或缺乏活性DHFR基因的其它細(xì)胞系用于轉(zhuǎn)染。通過本領(lǐng)域已知的方法將pC4中的清蛋白融合構(gòu)建物轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞中將容許在CHO細(xì)胞中表達(dá)清蛋白融合蛋白，隨后切除前導(dǎo)序列，并分泌到上清液中。然后由上清液進(jìn)一步純化清蛋白融合蛋白。pEE12.1表達(dá)載體由LonzaBiologics，Inc.(Portsmouth，NH)提供，它是pEE6(Stephens和Cockett，1989，Nucl.AcidsRes.177110)的衍生物。此載體包含人細(xì)胞巨化病毒主要即刻早期基因“hCMV-MIE”的啟動子、增強(qiáng)子和完整的5’非翻譯區(qū)(國際公開號WO89/01036)，目的序列的上游區(qū)，以及谷氨酰胺合成酶基因(Murphy等人，1991，BiochemJ.227277-279；Bebbington等人，1992，Bio/Technology10169-175；美國專利US5,122,464)，其目的是在選擇性的含硫代甲硫氨酸(methioninesulphoximine)的培養(yǎng)基中選擇轉(zhuǎn)染細(xì)胞。通過本領(lǐng)域已知的方法將在pEE12.1中產(chǎn)生的清蛋白融合構(gòu)建物轉(zhuǎn)染到NSO細(xì)胞(國際公開號WO86/05807)中容許在NSO細(xì)胞中表達(dá)清蛋白融合蛋白，隨后切除前導(dǎo)序列，并分泌到上清液中。然后可使用本文描述的或本領(lǐng)域其它途徑知道的技術(shù)由上清液進(jìn)一步純化清蛋白融合蛋白。清蛋白融合蛋白的表達(dá)可通過例如SDS-PAGE和Western印跡、反相HPLC分析、或本領(lǐng)域已知的其它方法進(jìn)行分析。通過本領(lǐng)域已知的方法(例如脂轉(zhuǎn)染胺試劑轉(zhuǎn)染)產(chǎn)生并選擇經(jīng)清蛋白融合構(gòu)建物轉(zhuǎn)染的穩(wěn)定CHO和NSO細(xì)胞系，例如用100nM甲氨蝶呤選擇具有二氫葉酸還原酶“DHFR”基因作為選擇標(biāo)記的載體或者通過缺乏谷氨酰胺時的培養(yǎng)。表達(dá)水平可以通過例如免疫印跡來檢驗(yàn)，首選以抗HSA血清作為一抗，或者次選以含有針對給定清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分的抗體的血清作為一抗。以抗HSA血清為一抗，通過免疫印跡來檢驗(yàn)表達(dá)水平。具體生產(chǎn)率通過ELISA來測定，其中捕獲抗體可以是針對清蛋白融合物的治療性蛋白質(zhì)部分的單克隆抗體，而檢測抗體可以是單克隆抗HSA生物素化抗體(或反之亦然)，隨后根據(jù)制造商的方案結(jié)合辣根過氧化物酶/鏈霉親和素并進(jìn)行分析。實(shí)施例7清蛋白融合蛋白在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)可在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的清蛋白融合蛋白。典型的哺乳動物表達(dá)載體含有介導(dǎo)mRNA轉(zhuǎn)錄起始的啟動子元件、蛋白質(zhì)編碼序列、和轉(zhuǎn)錄終止及轉(zhuǎn)錄物多聚腺苷酸化所需要的信號。其它元件包括增強(qiáng)子、Kozak序列和側(cè)翼為RNA剪接供體和受體位點(diǎn)的間插序列。用來自SV40的早期和晚期啟動子，來自逆轉(zhuǎn)錄病毒如RSV、HTLVI、HIVI的長末端重復(fù)序列(LTR)，以及來自細(xì)胞巨化病毒(CMV)的早期啟動子實(shí)現(xiàn)了高效轉(zhuǎn)錄。然而，也可以使用細(xì)胞元件(例如人肌動蛋白啟動子)。適用于實(shí)行本發(fā)明的表達(dá)載體包括例如諸如下列載體，pSVL和pMSG(Pharmacia，Uppsala，Sweden)、pRSVcat(ATCC37152)、pSV2dhfr(ATCC37146)、pBC12MI(ATCC67109)、pCMVSport2.0和pCMVSport3.0?？梢允褂玫牟溉閯游锼拗骷?xì)胞包括但不限于人Hela、293、H9和Jurkat細(xì)胞，小鼠NIH3T3和C127細(xì)胞，Cos1、Cos7和CV1、鵪鶉QC1-3細(xì)胞、小鼠L細(xì)胞和中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞?；蛘?，可以在含有整合到染色體中的編碼清蛋白融合蛋白的多核苷酸的穩(wěn)定細(xì)胞系中表達(dá)清蛋白融合蛋白。與選擇標(biāo)記諸如DHFR、gpt、新霉素或潮霉素的共轉(zhuǎn)染容許鑒定和分離轉(zhuǎn)染細(xì)胞。還可以擴(kuò)增編碼融合蛋白的轉(zhuǎn)染多核苷酸以表達(dá)大量的所編碼融合蛋白。DHFR(二氫葉酸還原酶)標(biāo)記可用于建立攜帶幾百或甚至幾千個拷貝的目的基因的細(xì)胞系(參見例如Alt等人，J.Biol.Chem.2531357-1370，1978；Hamlin等人，Biochem.etBiophys.Acta1097107-143，1990；Page等人，Biotechnology964-68，1991)。另一種有用的選擇標(biāo)記是酶谷氨酰胺合成酶(GS)(Murphy等人，BiochemJ.227277-279，1991；Bebbington等人，Bio/Technology10169-175，1992)。使用這些標(biāo)記，在選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞并選擇具有最高抗性的細(xì)胞。這些細(xì)胞系含有整合到染色體中的擴(kuò)增基因。中國倉鼠卵巢(CHO)和NSO細(xì)胞常用于蛋白質(zhì)的生產(chǎn)。質(zhì)粒pSV2-dhfr(ATCCAccessionNo.37146)的衍生物，表達(dá)載體pC4(ATCCAccessionNo.209646)和pC6(ATCCAccessionNo.209647)含有勞氏肉瘤病毒的強(qiáng)啟動子(LTR)(Cullen等人，MolecularandCellularBiology，438-447，March，1985)加上CMV增強(qiáng)子的片段(Boshart等人，Cell41521-530，1985)。多克隆位點(diǎn)，例如具有限制性酶切位點(diǎn)BamHI、XbaI和Asp718，便于目的基因的克隆。載體還含有大鼠前胰島素原基因的3’內(nèi)含子、多聚腺苷酸化和終止信號，以及在SV40早期啟動子控制下的小鼠DHFR基因。具體的說，例如用合適的限制酶消化質(zhì)粒pC6，然后通過本領(lǐng)域已知程序使用小牛腸磷酸酶去磷酸化。然后從1％瓊脂糖凝膠分離載體。使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)產(chǎn)生編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸，并使用本領(lǐng)域已知的PCR技術(shù)擴(kuò)增此多核苷酸。如果使用天然存在的信號序列來生產(chǎn)本發(fā)明的融合蛋白，那么載體不需要第二種信號肽?；蛘撸绻皇褂锰烊淮嬖诘男盘栃蛄?，那么載體可進(jìn)行修飾以包括異源信號序列(參見例如國際公開號WO96/34891)。使用商品化試劑盒(″Geneclean″，BIO101Inc.，LaJolla，Ca.)從1％瓊脂糖凝膠分離編碼本發(fā)明融合蛋白的擴(kuò)增片段。然后用合適的限制酶消化該片段，并再次在1％瓊脂糖凝膠上純化。然后用相同的限制酶消化編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的擴(kuò)增片段，并在1％瓊脂糖凝膠上純化。接著用T4DNA連接酶連接分離的片段和去磷酸化的載體。隨后轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101或XL-1Blue細(xì)胞，并通過例如限制酶分析來鑒定含有插入質(zhì)粒pC6中的片段的細(xì)菌。將缺乏活性DHFR基因的中國倉鼠卵巢細(xì)胞用于轉(zhuǎn)染。使用脂轉(zhuǎn)染試劑(Felgner等人，同上)將5μg表達(dá)質(zhì)粒pC6或pC4與0.5μg質(zhì)粒pSVneo共轉(zhuǎn)染。質(zhì)粒pSV2-neo含有顯性選擇標(biāo)記，來自Tn5、編碼賦予針對包括G418在內(nèi)的一組抗生素的抗性的酶的neo基因。將細(xì)胞接種到補(bǔ)充1mg/mlG418的α-MEM中。兩天后，將細(xì)胞用胰蛋白酶消化并接種到雜交瘤克隆平皿(Greiner，Germany)中補(bǔ)充10、25或50ng/ml氨甲喋呤加1mg/mlG418的α-MEM中。約10-14天后，將單個克隆用胰蛋白酶消化，然后接種到使用不同濃度甲氨蝶呤(50nM、100nM、200nM、400nM、800nM)的6孔皮氏培養(yǎng)皿或10ml燒瓶中。隨后將在最高濃度甲氨蝶呤中生長的克隆轉(zhuǎn)移到新的、含有甚至更高濃度甲氨蝶呤(1μM、2μM、5μM、10mM、20mM)的6孔平皿中。重復(fù)相同程序，直到獲得在100-200μM濃度中生長的克隆。通過例如SDS-PAGE和Western印跡或通過反相HPLC分析對期望融合蛋白的表達(dá)進(jìn)行分析。實(shí)施例8哺乳動物細(xì)胞系中從清蛋白融合構(gòu)建物表達(dá)的清蛋白融合蛋白的一般純化在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白包含融合于治療性蛋白質(zhì)的成熟形式或其部分(例如表1中列出的治療性蛋白質(zhì)的成熟形式，或表2中以SEQIDNOZ顯示的治療性蛋白質(zhì)的成熟形式)的N-端或C-端的HSA的成熟形式。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白還包含在用于表達(dá)的宿主的分泌途徑中指導(dǎo)初生融合多肽的信號序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，由信號序列編碼的信號肽遭到切除，而成熟的清蛋白融合蛋白直接分泌到培養(yǎng)基中。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白優(yōu)選包含異源信號序列(例如特定治療性蛋白質(zhì)的非天然信號序列)，包括但不限于MAF、INV、Ig、纖蛋白B、簇蛋白、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白4、包括但不限于嵌合HSA/MAF前導(dǎo)序列的變體HSA前導(dǎo)序列、或本領(lǐng)域已知的其它異源信號序列。尤其優(yōu)選表2中列出的那些信號序列和/或上文說明書“融合蛋白的表達(dá)”和/或“重組和合成生產(chǎn)清蛋白融合蛋白的其它方法”部分中列出的信號序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的融合蛋白還包含N端甲硫氨酸殘基。本發(fā)明還涵蓋編碼這些多肽的多核苷酸，包括片段和/或變體。根據(jù)所使用的表達(dá)系統(tǒng)采用不同的方案由哺乳動物細(xì)胞系上清液純化清蛋白融合蛋白。從CHO和293T細(xì)胞系純化由CHO細(xì)胞上清液或瞬時轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞上清液純化清蛋白融合蛋白可以包括首先使用磷酸鈉緩沖液用陰離子HQ樹脂進(jìn)行捕獲，并用磷酸鹽梯度洗脫，隨后在BlueSepharoseFF柱上進(jìn)行親和層析，使用鹽梯度洗脫。BlueSepharoseFF除去主要的BSA/胎球蛋白污染物。采用磷酸鹽梯度在PorosPI50樹脂上進(jìn)行的進(jìn)一步純化可除去和降低內(nèi)毒素污染物并濃縮清蛋白融合蛋白。從NSO細(xì)胞系純化由NSO細(xì)胞上清液純化清蛋白融合蛋白可以包括Q-Sepharose陰離子交換層析，隨后是分步洗脫的SP-sepharose純化，然后是分步洗脫的Phenyl-650M純化，和最后的滲率。然后可通過緩沖液轉(zhuǎn)換配制純化的蛋白質(zhì)。實(shí)施例9清蛋白融合蛋白的細(xì)菌表達(dá)使用與DNA序列的5’和3’末端對應(yīng)的PCR寡核苷酸引物擴(kuò)增包含細(xì)菌信號序列、編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸，以合成插入片段。為了將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到表達(dá)載體中，用于擴(kuò)增編碼插入片段的多核苷酸的引物優(yōu)選在引物的5’端含有限制性位點(diǎn)，諸如BamHI和XbaI。例如，BamHI和XbaI對應(yīng)于細(xì)菌表達(dá)載體pQE-9(Qiagen，Inc.，Chatsworth，CA)上的限制酶位點(diǎn)。此質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr)、細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)(ori)、IPTG可調(diào)控啟動子/操縱子(P/O)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)、六組氨酸標(biāo)簽(6-His)和限制酶克隆位點(diǎn)。用BamHI和XbaI消化pQE-9載體，并將擴(kuò)增片段連接到pQE-9載體中，保持起始于細(xì)菌RBS的讀碼框。然后將連接混合液用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株M15/rep4(Qiagen，Inc.)，它含有多拷貝的質(zhì)粒pREP4，后者表達(dá)lacI抑制子并賦予卡那霉素抗性(Kanr)。通過其在LB平皿上生長的能力來鑒定轉(zhuǎn)化體，并選擇氨芐青霉素/卡那霉素抗性菌落。分離質(zhì)粒DNA并通過限制性分析確認(rèn)。將含有期望構(gòu)建物的克隆在補(bǔ)充Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB培養(yǎng)基中以液體培養(yǎng)方式培養(yǎng)過夜(O/N)。將O/N培養(yǎng)物用于以1∶100到1∶250的比例接種大培養(yǎng)物。將細(xì)胞培養(yǎng)到光密度600(O.D.600)在0.4和0.6之間。隨后加入IPTG(異丙基-B-D-硫代半乳糖苷)到1mM的終濃度。IPTG通過滅活lacI抑制子來誘導(dǎo)P/O的清除，導(dǎo)致基因表達(dá)升高。將細(xì)胞再培養(yǎng)3-4個小時。然后通過離心(6000Xg，20分鐘)收集細(xì)胞。通過于4℃攪動3-4個小時將細(xì)胞沉淀物溶于離液劑6M胍-HCl或優(yōu)選的8M尿素和濃度超過0.14M的2-巰基乙醇中(參見例如Burton等人，Eur.J.Biochem.179379-387，1989)。通過離心除去細(xì)胞碎片，并將含有多肽的上清液加載到鎳-次氮基三乙酸(“Ni-NTA”)親和樹脂柱(可從QIAGEN，Inc.獲得，同上)上。具有6xHis標(biāo)簽的蛋白質(zhì)以高親和力結(jié)合Ni-NTA樹脂，并能夠在簡單的一步程序中純化(詳情參見TheQIAexpressionist，1995，QIAGEN，Inc.，同上)。簡要的說，將上清液加載到6M胍-HClpH8中的柱上。柱首先用10倍體積的6M胍-HClpH8清洗，然后用10倍體積的6M胍-HClpH6清洗，最后用6M胍-HClpH5洗脫多肽。隨后通過將其對磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)或50mM醋酸鈉pH6緩沖液加200mMNaCl透析來使純化的蛋白質(zhì)復(fù)性?；蛘?，可在固定在Ni-NTA柱上時使蛋白質(zhì)成功的重折疊。例示性條件如下復(fù)性使用500mMNaCl、20％甘油、20mMTris/HClpH7.4中的線性6M-1M尿素梯度，其中含有蛋白酶抑制物。復(fù)性應(yīng)當(dāng)進(jìn)行1.5個小時或更長的時間。復(fù)性后，通過加入250mM咪唑來洗脫蛋白質(zhì)。通過最后對PBS或50mM醋酸鈉pH6緩沖液加200mMNaCl的透析步驟除去咪唑。將純化的蛋白質(zhì)貯存于4℃或凍存于-80℃。除上述表達(dá)載體外，本發(fā)明還包括稱為pHE4a的表達(dá)載體(ATCCAccessionNumber209645，于1998年2月25日保藏)，它含有與編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可操作連接的噬菌體操縱基因和啟動子元件，稱為pHE4a(ATCCAccessionNumber209645，于1998年2月25日保藏)。此載體含有1)作為選擇標(biāo)記的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，2)大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)，3)T5噬菌體啟動子序列，4)兩個lac操縱基因序列，5)Shine-Delgamo序列，和6)乳糖操縱子阻抑物基因(lacIq)。復(fù)制起點(diǎn)(oriC)衍生自pUC19(LTI，Gaithersburg，MD)。啟動子和操縱子序列是人工合成的?？扇缦聦NA插入到pHE4a中，即用NdeI和XbaI、BamHI、XhoI或Asp718限制性消化載體，將限制性酶切產(chǎn)物在凝膠上電泳，并分離較大片段(填充片段應(yīng)當(dāng)是約310個堿基對)。依照本文描述的或本領(lǐng)域其它途徑知道的PCR方案使用具有NdeI(5′引物)和XbaI、BamHI、XhoI或Asp718(3′引物)的限制性位點(diǎn)的PCR引物產(chǎn)生DNA插入物。將PCR插入物凝膠純化，并用相容酶進(jìn)行限制性消化。依照標(biāo)準(zhǔn)方案連接插入物和載體。可替換上述方案中的改造載體以在細(xì)菌系統(tǒng)中表達(dá)蛋白質(zhì)。實(shí)施例10從保藏的樣品分離選定的cDNA克隆如表3所示，本發(fā)明的許多清蛋白融合構(gòu)建物由ATCC保藏。清蛋白融合構(gòu)建物可包含任意一種下列表達(dá)載體釀酒酵母表達(dá)載體pSAC35、哺乳動物表達(dá)載體pC4、或哺乳動物表達(dá)載體pEE12.1。pSAC35(Sleep等人，1990，Biotechnology842)、pC4(ATCCAccessionNo.209646；Cullen等人，MolecularandCellularBiology，438-447，1985；Boshart等人，Cell41521-530，1985)和pEE12.1(LonzaBiologies，Inc.；Stephens和Cockett，Nucl.AcidsRes.177110，1989；國際公開號WO89/01036；Murphy等人，BiochemJ.227277-279，1991；Bebbington等人，Bio/Technology10169-175，1992；美國專利US5,122,464；國際公開號WO86/05807)載體包含氨芐青霉素抗性基因以在細(xì)菌細(xì)胞中培養(yǎng)?？墒褂帽绢I(lǐng)域描述的技術(shù)，諸如Hanahan，涂布在含有100μg/ml氨芐青霉素的Luria-Broth瓊脂平板上，并于37℃培養(yǎng)過夜，將這些載體和/或包含它們的清蛋白融合構(gòu)建物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株中，諸如StratageneXL-1Blue(StratageneCloningSystems，Inc.，11011N.TorreyPinesRoad，LaJolla，CA，92037)。表3中引用的ATCC保藏號所指定的樣品中的保藏材料還可含有一種或多種額外的清蛋白融合構(gòu)建物，每種編碼不同的清蛋白融合蛋白。因此，共用同一個ATCC保藏號的保藏物含有至少一種表3相應(yīng)行中確定的清蛋白融合構(gòu)建物。有兩種方法可用于從表3中為特定清蛋白融合構(gòu)建物引用的質(zhì)粒DNA的保藏樣品分離該清蛋白融合構(gòu)建物。方法1篩選首先，可直接分離清蛋白融合構(gòu)建物，即使用本領(lǐng)域已知的方法使用與表1中個別構(gòu)建物ID編號的SEQIDNOX對應(yīng)的多核苷酸探針篩選保藏的質(zhì)粒DNA樣品。例如，可以使用AppliedBiosystemsDNA合成儀根據(jù)報道的序列合成具有30-40個核苷酸的特異多核苷酸。寡核苷酸可依照常規(guī)方法例如使用T4多核苷酸激酶用32p-γ-ATP進(jìn)行標(biāo)記并進(jìn)行純化(例如Maniatis等人，《MolecularCloningALaboratoryManual》，ColdSpringHarborPress，ColdSpring，NY，1982)。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)，諸如由載體供應(yīng)商或在上文引用的相關(guān)出版物或?qū)＠刑峁┑募夹g(shù)，將來自指定ATCC保藏物的清蛋白融合構(gòu)建物轉(zhuǎn)化到上文所述的合適宿主(諸如XL-1Blue，Stratagene)中。將轉(zhuǎn)化體以每個平皿約150個轉(zhuǎn)化體(菌落)的密度涂布到1.5％瓊脂平板(含有合適的選擇劑，例如氨芐青霉素)上。依照細(xì)菌菌落篩選的常規(guī)方法(例如Sambrook等人，《MolecularCloningALaboratoryManual》，第2版，1989，ColdSpringHarborLaboratoryPress，pp1.93-1.104)或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它技術(shù)使用尼龍膜篩選這些平板。方法2PCR或者，編碼指定清蛋白融合蛋白的DNA可以從具有SEQIDNOX的保藏的清蛋白融合構(gòu)建物的樣品中擴(kuò)增，例如使用在保藏的清蛋白融合構(gòu)建物的5′和3′與編碼指定清蛋白融合蛋白的DNA發(fā)生雜交的17-20個核苷酸的兩種引物。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)在常規(guī)條件下進(jìn)行，例如在含有0.5μg上述cDNA模板的25μl反應(yīng)混合液中。方便的反應(yīng)混合液是1.5-5mMMgCl2，0.01％(w/v)明膠，dATP、dCTP、dGTP、dTTP每種20μM，引物每種25pmol，及0.25個單位的Taq聚合酶。用Perkin-ElmerCetus自動熱循環(huán)儀進(jìn)行35個PCR循環(huán)(94℃變性1分鐘；55℃退火1分鐘；72℃延長1分鐘)。擴(kuò)增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析，切下具有預(yù)期分子量的DNA條帶并純化。通過對DNA產(chǎn)物的亞克隆和測序證實(shí)該P(yáng)CR產(chǎn)物是選定的序列。有幾種方法可用于鑒定保藏克隆中可能不存在的基因的5′或3′非編碼部分。這些方法包括但不限于濾膜探查(filterprobing)、使用特異探針的克隆富集、以及與本領(lǐng)域已知的5′和3′“RACE”方案類似或等同的方案。例如，有一種與5′RACE類似的方法可用于產(chǎn)生期望全長轉(zhuǎn)錄物的缺失5’末端(Fromont-Racine等人，NucleicAcidsRes.21(7)1683-1684，1993)。簡要的說，將特定的RNA寡核苷酸連接到可能含有全長基因RNA轉(zhuǎn)錄物的RNA群體的5’末端。將含有對所連接RNA寡核苷酸特異的引物和對目的基因的已知序列特異的引物的引物組用于PCR擴(kuò)增期望全長基因的5’部分。然后可對此擴(kuò)增產(chǎn)物測序，并用于產(chǎn)生全長基因。此上述方法從預(yù)期來源分離的總RNA開始，但是也可使用polyA+RNA。如果需要，隨后可以用磷酸酶處理RNA制備物以除去降解的或受損的RNA上的5’磷酸基團(tuán)，它們可能會影響后面的RNA連接酶步驟。然后應(yīng)當(dāng)滅活磷酸酶，并用煙草酸性焦磷酸酶處理RNA以去除位于信使RNA5’端的帽結(jié)構(gòu)。此反應(yīng)在切除帽的RNA的5’末端留下5’磷酸基團(tuán)，它隨后可使用T4RNA連接酶與RNA寡核苷酸連接。將此經(jīng)修飾RNA制備物作為模板，使用基因特異的寡核苷酸合成第一條cDNA鏈。將第一條鏈合成反應(yīng)作為模板，使用對所連接RNA寡核苷酸特異的引物和對目的基因的已知序列特異的引物PCR擴(kuò)增期望的5’末端。然后對如此產(chǎn)生的產(chǎn)物測序和分析以證實(shí)該5’端序列屬于預(yù)期基因。實(shí)施例11多融合(Multifusion)融合物清蛋白融合蛋白(例如含有與清蛋白(或其片段或變體)融合的治療性蛋白質(zhì)(或其片段或變體))可與其它蛋白質(zhì)額外融合以產(chǎn)生“多融合蛋白”。這些多融合蛋白可用于廣泛的應(yīng)用。例如，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白與His標(biāo)簽、HA標(biāo)簽、蛋白A、IgG結(jié)構(gòu)域和麥芽糖結(jié)合蛋白的融合將有助于純化(見例如EPA394,827；Traunecker等人，Nature33184-86，1988)。與本發(fā)明多肽融合的核定位信號能夠?qū)⒌鞍踪|(zhì)靶向特定亞細(xì)胞定位，而共價雜二聚體或同二聚體能夠提高或降低清蛋白融合蛋白的活性。此外，附加蛋白質(zhì)序列與本發(fā)明清蛋白融合蛋白的融合可進(jìn)一步提高融合蛋白的溶解性和/或穩(wěn)定性。上述融合蛋白可使用或常規(guī)修改本領(lǐng)域已知的技術(shù)和/或通過修改概述多肽與IgG分子融合的下列方案來生成。簡要的說，可使用跨越下文所述序列5’和3’末端的引物PCR擴(kuò)增人IgG分子的Fc部分。這些引物還應(yīng)當(dāng)具有便利的限制酶位點(diǎn)，以便于克隆到表達(dá)載體中，優(yōu)選哺乳動物或酵母表達(dá)載體。例如，如果使用pC4(ATCCAccessionNo.209646)，那么可將人Fc部分連接到BamHI克隆位點(diǎn)中。注意，應(yīng)當(dāng)破壞3’BamHI位點(diǎn)。接著，用BamHI再次限制性消化含有人Fc部分的載體，將線性化載體和編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸(使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)產(chǎn)生和分離)連接到此BamHI位點(diǎn)中。注意，編碼本發(fā)明融合蛋白的多核苷酸在沒有終止密碼子的情況下克隆，否則將不會產(chǎn)生含有Fc的融合蛋白。如果使用天然存在的信號序列來生產(chǎn)本發(fā)明的清蛋白融合蛋白，那么pC4不需要第二種信號肽?；蛘?，如果不用天然存在的信號序列，那么載體可以進(jìn)行修飾以包括異源信號序列(參見例如國際公開號WO96/34891)。人IgGFc區(qū)GGGATCCGGAGCCCAAATCTTCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAATTCGAGGGTGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACTCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTAAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAACCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCAAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGTGCGACGGCCGCGACTCTAGAGGAT(SEQIDNO52)實(shí)施例12由清蛋白融合蛋白生產(chǎn)抗體雜交瘤技術(shù)與本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和本發(fā)明清蛋白融合蛋白的部分(如融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分或清蛋白部分)結(jié)合的抗體可以通過多種方法來制備(參見《CurrentProtocols》，第2章)。作為這些方法的一個實(shí)例，制備了本發(fā)明的清蛋白融合蛋白或本發(fā)明清蛋白融合蛋白的部分的制備物，并進(jìn)行純化以使其基本上不含天然污染物。然后將這樣的制備物導(dǎo)入動物以產(chǎn)生具有更高特異性活性的多克隆抗血清。對本發(fā)明的清蛋白融合蛋白或本發(fā)明清蛋白融合蛋白的部分特異的單克隆抗體使用雜交瘤技術(shù)來制備(Kohler等人，Nature256495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammering等人，在《MonoclonalAntibodiesandT-CellHybridomas》中，Elsevier，N.Y.，pp.563-681，1981)。通常，用本發(fā)明的清蛋白融合蛋白或本發(fā)明清蛋白融合蛋白的部分免疫動物(優(yōu)選小鼠)。提取這些小鼠的脾細(xì)胞并與合適的骨髓瘤細(xì)胞系融合。可依照本發(fā)明采用任何合適的骨髓瘤細(xì)胞系；然而，優(yōu)選使用可從ATCC獲得的親本骨髓瘤細(xì)胞系(SP20)。融合后，在HAT培養(yǎng)基中選擇性維持如此產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞，并隨后通過Wands等人(Gastroenterology80225-232，1981)描述的有限稀釋進(jìn)行克隆。隨后測定通過這種選擇獲得的雜交瘤細(xì)胞以鑒定分泌能夠結(jié)合本發(fā)明的清蛋白融合蛋白或本發(fā)明清蛋白融合蛋白的部分的抗體的克隆?；蛘?，可以使用抗獨(dú)特型抗體以兩步程序制備能夠結(jié)合本發(fā)明的清蛋白融合蛋白或本發(fā)明清蛋白融合蛋白的部分的另外的抗體。這種方法利用抗體本身也是抗原，因此有可能獲得與某種抗體結(jié)合的第二種抗體的事實(shí)。依照此方法，將蛋白質(zhì)特異性抗體用于免疫動物，優(yōu)選小鼠。然后將這種動物的脾細(xì)胞用于產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞，并篩選雜交瘤細(xì)胞以鑒定產(chǎn)生如下抗體的克隆，該抗體結(jié)合本發(fā)明的清蛋白融合蛋白(或本發(fā)明清蛋白融合蛋白的部分)特異性抗體的能力能夠被本發(fā)明的融合蛋白或本發(fā)明清蛋白融合蛋白的部分所阻斷。這些抗體包含針對本發(fā)明融合蛋白(或本發(fā)明清蛋白融合蛋白的部分)特異性抗體的抗獨(dú)特型抗體，并用于免疫動物以誘導(dǎo)另外的本發(fā)明融合蛋白(或本發(fā)明清蛋白融合蛋白的部分)特異性抗體的形成。為了抗體在人體中的體內(nèi)應(yīng)用，將抗體“人源化”?？梢允褂糜僧a(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞衍生的基因構(gòu)建物來生產(chǎn)這些抗體。用于生產(chǎn)嵌合和人源化抗體的方法是本領(lǐng)域已知的，并且在本文中有論述(回顧參見Morrison，Science2291202，1985；Oi等人，BioTechniques4214，1986；Cabilly等人，美國專利號4,816,567；Taniguchi等人，EP171496；Morrison等人，EP173494；Neuberger等人，WO8601533；Robinson等人，國際公開號WO8702671；Boulianne等人，Nature312643，1984；Neuberger等人，Nature314268，1985)。從scFv庫分離針對本發(fā)明的清蛋白融合蛋白或本發(fā)明清蛋白融合蛋白的部分的抗體片段。將從人PBL分離的天然存在V基因構(gòu)建成含有針對本發(fā)明的清蛋白融合蛋白或本發(fā)明清蛋白融合蛋白的部分的反應(yīng)性的抗體片段庫，其中供體可以是曾經(jīng)或未曾暴露于它(參見如美國專利5,885,793，將其完整引入本文作為參考)。庫的回收(rescue)。如國際公開號WO92/01047中所述，從人PBL的RNA構(gòu)建scFv庫。為了回收展示抗體片段的噬菌體，將大約109個含有噬菌粒的大腸桿菌用于接種50ml含有1％葡萄糖和100μg/ml氨芐青霉素的2xTY(2xTY-AMP-GLU)，并振蕩培養(yǎng)至O.D.達(dá)到0.8。將5ml此培養(yǎng)物用于接種50ml2xTY-AMP-GLU，加入2×108TU刪除了基因3的輔助噬菌體(刪除了基因3的M13，參見國際公開號WO92/01047)，將培養(yǎng)物在不振蕩的條件下于37℃培養(yǎng)45分鐘，然后于37℃振蕩培養(yǎng)45分鐘。將培養(yǎng)物以4000r.p.m.離心10分鐘，將沉淀物重懸于2升含有100μg/ml氨芐青霉素和50μg/ml卡那霉素的2xTY中，并培養(yǎng)過夜。如國際公開號WO92/01047中所述制備噬菌體。刪除了基因3的M13如下制備刪除了基因3的M13輔助噬菌體不編碼基因3蛋白質(zhì)，因此展示抗體片段的噬菌體(噬菌粒)具有更高的與抗原結(jié)合的親合力。傳染性的刪除了基因3的M13顆粒通過在含有pUC19衍生物的細(xì)胞中培養(yǎng)輔助噬菌體來制備，所述pUC19衍生物在噬菌體形態(tài)發(fā)生過程中提供野生型基因組3蛋白質(zhì)。將培養(yǎng)物在不振蕩的條件下于37℃溫育1小時，然后再于37℃振蕩培養(yǎng)1小時。將細(xì)胞離心沉淀(IEC-Centra8,400r.p.m.10分鐘)，重懸于300ml含有100μg/ml氨芐青霉素和25μg/ml卡那霉素的2xTY培養(yǎng)基(2xTY-AMP-KAN)，并于37℃振蕩培養(yǎng)過夜。通過兩次PEG沉淀(Sambrook等人，1990)從培養(yǎng)基中純化和濃縮噬菌體顆粒，將其重懸于2mlPBS，并通過0.45μm的濾器(MinisartNML；Sartorius)以產(chǎn)生約1013轉(zhuǎn)導(dǎo)單位/ml(氨芐青霉素抗性克隆)的終濃度。庫的淘選。將Immunotubes(Nunc)在PBS中用4ml100μg/ml或10μg/ml本發(fā)明清蛋白融合蛋白或本發(fā)明清蛋白融合蛋白的部分包被過夜。將管用2％Marvel-PBS于37℃封閉2小時，然后用PBS洗3次。將約1013TU的噬菌體施加到管中，并于室溫在翻轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)盤(overandunderturntable)上翻轉(zhuǎn)溫育30分鐘，然后再靜置1.5小時。將管用PBS、0.1％Tween-20洗10次并用PBS洗10次。為了洗脫噬菌體，加入1ml100mM三乙胺，并在翻轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)盤上旋轉(zhuǎn)15分鐘，其后立刻用0.5ml1.0MTris-HClpH7.4中和溶液。然后，通過將洗脫的噬菌體與細(xì)菌于37℃溫育30分鐘，將噬菌體用于感染10ml對數(shù)中期(mid-log)的大腸桿菌TG1。然后將大腸桿菌涂布在含有1％葡萄糖和100μg/ml氨芐青霉素的TYE平板上。然后如上所述用刪除了基因3的輔助噬菌體回收如此產(chǎn)生的細(xì)菌庫以制備用于下一輪選擇的噬菌體。然后將此過程重復(fù)總共4輪的親和純化，其中在第3輪和第4輪，洗管增加到用PBS、0.1％Tween-20洗20次并用PBS洗20次。結(jié)合者的鑒定。將第3輪和第4輪選擇中洗脫的噬菌體用于感染大腸桿菌HB2151，并從單菌落生產(chǎn)可溶性scFv(Marks等人，1991)用于測定。采用用溶于50mM碳酸氫鹽pH9.6的10pg/ml本發(fā)明的清蛋白融合蛋白或本發(fā)明清蛋白融合蛋白的部分包被的微量滴定板實(shí)施ELISA。在ELISA呈陽性的克隆進(jìn)而通過PCR指紋法(參見例如國際公開號WO92/01047)和隨后通過測序進(jìn)行鑒定。這些ELISA陽性克隆還可通過本領(lǐng)域已知的技術(shù)，諸如例如表位作圖、結(jié)合親和力、受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、阻斷或競爭性抑制抗體/抗原結(jié)合的能力、和競爭性對抗或拮抗活性進(jìn)一步鑒定。實(shí)施例13[3H]-2-脫氧葡萄糖攝取試驗(yàn)脂肪、骨骼肌和肝臟是胰島素敏感組織。胰島素可促進(jìn)葡萄糖攝取/轉(zhuǎn)運(yùn)到這些組織中。在脂肪和骨骼肌的情況中，胰島素啟動最終導(dǎo)致葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4分子，GLUT4，從專門的胞內(nèi)隔室轉(zhuǎn)移到細(xì)胞表面的信號傳導(dǎo)。一旦在細(xì)胞表面上，GLUT4容許葡萄糖的攝取/轉(zhuǎn)運(yùn)。-2-脫氧葡萄糖的攝取許多脂肪和肌肉相關(guān)細(xì)胞系可用于測試在缺乏或存在任何一種或多種為治療糖尿病而列出的治療性藥物的組合時葡萄糖的攝取/轉(zhuǎn)運(yùn)活性。具體而言，3T3-L1鼠成纖維細(xì)胞和L6鼠骨骼肌細(xì)胞可分別分化成3T3-L1脂肪細(xì)胞和肌管以作為[3H]-2-脫氧葡萄糖攝取測定法的合適體外模型(Urso等人，JBiolChem274(43)30864-73，1999；Wang等人，JMolEndocrinol19(3)241-8，1997；Haspel等人，JMembrBiol169(1)45-53，1999；Tsakiridis等人，Endocrinology136(10)4315-22，1995)。簡要的說，將2×105個細(xì)胞/100μl的脂肪細(xì)胞或已分化L6細(xì)胞轉(zhuǎn)移到經(jīng)50μg/ml多聚L-賴氨酸處理即包被的96孔組織培養(yǎng)皿即“TC”中的分化后培養(yǎng)基(post-differentiationmedium)中的，并于37℃在5％CO2中培養(yǎng)過夜。細(xì)胞首先用無血清低葡萄糖DMEM培養(yǎng)基洗一次，然后用100μl/孔的相同培養(yǎng)基和用100μl/孔的緩沖液或任何一種或多種為治療糖尿病而列出的治療性藥物的組合，例如本發(fā)明治療劑(例如SEQIDNOY公開的特定融合物及其片段和變體)的漸增濃度即1nM、10nM和100nM，于37℃在缺乏或存在1nM胰島素時饑餓培養(yǎng)(starve)16小時。平皿用100μl/孔HEPES緩沖鹽水洗三次。在存在10μM經(jīng)標(biāo)記[3H]-2-脫氧葡萄糖(Amersham，#TRK672)和10μM未標(biāo)記2-脫氧葡萄糖(SIGMA，D-3179)時胰島素于37℃在HEPES緩沖鹽水中以1nM加入30分鐘。作為對照，實(shí)行相同的條件，但是缺乏胰島素。在不同孔中以100μl/孔加入終濃度10μM的松胞菌素(cytochalasin)B(SIGMA，C6762)以測量非特異攝取。細(xì)胞用HEPES緩沖鹽水洗三次。經(jīng)標(biāo)記的即10μM[3H]-2-脫氧葡萄糖和未標(biāo)記的即10μM2-脫氧葡萄糖于室溫加入10分鐘。細(xì)胞用冷的磷酸鹽緩沖鹽水即“PBS”洗三次。通過加入150μl/孔0.2NNaOH以及隨后于室溫振蕩保溫20分鐘來裂解細(xì)胞。然后將樣品轉(zhuǎn)移到加有5ml閃爍液的閃爍管中。將管在β-閃爍計(jì)數(shù)器中進(jìn)行計(jì)數(shù)。重復(fù)條件中的攝取，區(qū)別在于缺乏或存在胰島素，通過如下方程式測定[(胰島素的每分鐘計(jì)數(shù)“cpm”-非特異cpm)/(無胰島素的cpm-非特異性cpm)]。平均應(yīng)答分別在脂肪細(xì)胞和肌管對照的約5倍和3倍的限制范圍內(nèi)。細(xì)胞的分化在T-75cm2燒瓶中使細(xì)胞完全匯合。除去培養(yǎng)基，并用25ml分化前培養(yǎng)基(pre-differentiationmedium)替換48小時。細(xì)胞于37℃在5％CO2、85％濕度中進(jìn)行培養(yǎng)。48小時后，除去分化前培養(yǎng)基，并用25ml分化培養(yǎng)基替換48小時。細(xì)胞再次于37℃在5％CO2、85％濕度中進(jìn)行培養(yǎng)。48小時后，除去培養(yǎng)基，用30ml分化后培養(yǎng)基替換。分化后培養(yǎng)基保持14-20天，或者直到實(shí)現(xiàn)完全的分化。每2-3天更換培養(yǎng)基。人脂肪細(xì)胞可購自Zen-Bio，INC(#SA-1096)。實(shí)施例14[3H]-胸苷摻入胰腺細(xì)胞系的體外測定法最近證明了GLP-1以時間和劑量依賴的方式誘導(dǎo)大鼠胰腺管上皮細(xì)胞系A(chǔ)RIP的分化，這與胰島十二指腸同源框-1(IDX-1)和胰島素mRNA水平的升高有關(guān)(Hui等人，2001，Diabetes50(4)785-96)。IDX-1繼而提高GLP-1受體的mRNA水平。測試的細(xì)胞類型RIN-M細(xì)胞這些細(xì)胞可由美國典型組織培養(yǎng)物收藏中心(ATCC細(xì)胞系編號CRL-2057)獲得。RIN-M細(xì)胞系衍生自放射誘導(dǎo)的可移植大鼠胰島細(xì)胞瘤。該系是從腫瘤的裸鼠異種移植物建立的。該細(xì)胞產(chǎn)生并分泌胰島多肽激素，并產(chǎn)生L-多巴脫羧酶(具有胺前體攝取和脫羧或APUD活性的細(xì)胞的標(biāo)記)。ARLP細(xì)胞這些是可由美國典型組織培養(yǎng)物收藏中心(ATCC細(xì)胞系編號CRL-1674)獲得的上皮形態(tài)的胰腺外分泌細(xì)胞。也可參見參考文獻(xiàn)Jessop，N.W.和Hay，R.J.，“Characteristicsoftworatpancreaticexocrinecelllinesderivedfromtransplantabletumors”，InVitro16212，1980；Cockell，M.等人，“Identificationofacell-specificDNA-bindingactivitythatinteractswithatranscriptionalactivatorofgenesexpressedintheacinarpancreas”，Mol.Cell.Biol.92464-2476，1989；Roux，E.等人，“Thecell-specifictranscriptionfacotrPTF1containstwodifderentsubunitsthatinteractwiththeDNA”，GenesDev.31613-1624，1989；及Hui，H.等人，“Glucagon-likepeptide1inducesdifferentiationofisletduodenalhomcobox-1-positivepancreaticductalcellsintoinsulin-secretingcells”，Diabetes50785-796，2001。細(xì)胞的制備RIN-M細(xì)胞系在含有10％胎牛血清(HyClone，#SH30088.03)的RPMI1640培養(yǎng)基(HyClone，#SH300027.01)中培養(yǎng)，并每6-8天以1∶3到1∶6的比例傳代培養(yǎng)。每3-4天更換培養(yǎng)基。ARIP(ATCC#CRL-1674)細(xì)胞系在含有2mML-谷氨酰胺并調(diào)至含有1.5g/L碳酸氫鈉和10％胎牛血清的Ham氏F12K培養(yǎng)基(ATCC，#30-2004)中培養(yǎng)。ARIP細(xì)胞系以1∶3到1∶6的比例每星期傳代培養(yǎng)兩次。每3-4天更換培養(yǎng)基。測定方案細(xì)胞以4000細(xì)胞/孔接種96孔平皿，并培養(yǎng)48-72小時至50％匯合。將細(xì)胞以100μl/孔轉(zhuǎn)換成無血清培養(yǎng)基。培養(yǎng)48-72小時后，向孔中加入血清和/或本發(fā)明的治療劑(如本發(fā)明的清蛋白融合蛋白及其片段和變體)。培養(yǎng)再持續(xù)36小時。[3H]-胸苷(5-20Ci/mmol)(AmershamPharmacia，#TRK120)稀釋至1微居/5微升。培養(yǎng)36小時后，向每個孔中加入5微升，再培養(yǎng)24小時。通過用冷的磷酸鹽緩沖鹽水即“PBS”輕輕的洗細(xì)胞一次來終止反應(yīng)。細(xì)胞隨后用100微升10％冰冷的TCA于4℃固定15分鐘。除去PBS，并加入200微升0.2NNaOH。平皿于室溫振蕩保溫1小時。將溶液轉(zhuǎn)移到閃爍管中，并加入5ml與水溶液相容的閃爍液，劇烈混勻。該管在β-閃爍計(jì)數(shù)器中進(jìn)行計(jì)數(shù)。作為陰性對照，僅使用緩沖液。作為陽性對照，使用胎牛血清。實(shí)施例15糖尿的測定糖尿(即尿中糖過量)能夠容易的測定以提供糖尿病的疾病狀態(tài)指數(shù)。與正?；颊邩悠废啾龋颊邩悠分羞^量的尿是IDDM和NIDDM的癥狀。這種患有IDDM和NIDDM的患者的治療效果表現(xiàn)為由此引起的尿中過量葡萄糖的量降低。在IDDM和NIDDM監(jiān)測的優(yōu)選實(shí)施方案中，使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)對患者的尿樣測定葡萄糖的存在。人的糖尿定義為尿葡萄糖濃度超過100mg/100ml。通過獲得血樣并測定血清葡萄糖，甚至可更加精確的測量顯示糖尿的那些患者中過度的糖水平。實(shí)施例16檢測B細(xì)胞增殖和分化的刺激或抑制的測定法功能性體液免疫應(yīng)答的產(chǎn)生需要B-譜系細(xì)胞與其微環(huán)境之間的可溶的和相關(guān)的信號。信號可傳遞導(dǎo)致B-譜系細(xì)胞繼續(xù)其程序化發(fā)育的正刺激，或指示細(xì)胞停止當(dāng)前發(fā)育途徑的負(fù)刺激。至今，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)大量的刺激和抑制信號影響B(tài)細(xì)胞響應(yīng)度，包括IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL10、IL-13、IL-14和IL-15。有趣的是，這些信號本身是弱效應(yīng)物，但是能夠結(jié)合多種共刺激蛋白在B細(xì)胞群中誘導(dǎo)激活、增殖、分化、歸巢、耐受和死亡。研究得最好的一類B-細(xì)胞共刺激蛋白是TNF超家族。在該家族中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CD40、CD27和CD30與它們相應(yīng)的配體CD154、CD70和CD153一起調(diào)節(jié)多種免疫應(yīng)答?？捎糜跈z測和/和觀察這些B細(xì)胞群及其前體的增殖和分化的測定法是測定各種蛋白質(zhì)對于這些B細(xì)胞群在增殖和分化方面可能具有的影響的有用工具。下面所列的是設(shè)計(jì)用于檢測B細(xì)胞群及其前體的分化、增殖或抑制的兩種測定法。體外測定法-可對本發(fā)明的清蛋白融合蛋白(包括含有治療性蛋白質(zhì)的片段或變體和/或清蛋白或清蛋白的片段或變體的融合蛋白)評估其在B細(xì)胞群及其前體中誘導(dǎo)激活、增殖、分化或抑制和/或死亡的能力。本發(fā)明清蛋白融合蛋白在從0.1到10000ng/ml的劑量范圍上定性測量的對純化的人扁桃體B細(xì)胞的活性是在標(biāo)準(zhǔn)B-淋巴細(xì)胞共刺激測定法中評估的，其中在存在福爾馬林固定的金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)Cowan1(SAC)或固定化抗人IgM抗體作為引發(fā)劑(primingagent)時培養(yǎng)純化的扁桃體B細(xì)胞。根據(jù)含氚胸苷摻入的測量，二級信號諸如IL-2和IL-15與SAC和IgM交聯(lián)協(xié)同作用，以引起B(yǎng)細(xì)胞增殖。新型協(xié)同劑可使用此測定法容易的鑒定。該測定法包括通過磁珠(MACS)耗盡CD3-陽性細(xì)胞來分離人扁桃體B細(xì)胞。根據(jù)CD45R(B220)的表達(dá)，評估得出如此產(chǎn)生的細(xì)胞群中超過95％是B細(xì)胞。將每個樣品的多種稀釋物置于96孔平皿的各個孔中，其中加入懸浮于培養(yǎng)基(RPMI1640，含有10％FBS、5X10-5M2ME、100U/ml青霉素、10μg/ml鏈霉素和10-5稀釋度的SAC)的105個B細(xì)胞，總體積150μl。通過加入因子后72小時開始的3H-胸苷(6.7Ci/mM)的20小時脈沖(1uCi/孔)對增殖或抑制定量。正負(fù)對照分別是IL2和培養(yǎng)基。體內(nèi)測定法-BALB/c小鼠每天注射(i.p.)兩次單獨(dú)的緩沖液、或2mg/Kg本發(fā)明的清蛋白融合蛋白(包括含有治療性蛋白質(zhì)的片段或變體和/或清蛋白或清蛋白的片段或變體的融合蛋白)。小鼠連續(xù)4天接受這種處理，這時處死小鼠，并收集各種組織和血清用于分析。來自正常脾和用本發(fā)明清蛋白融合蛋白處理的脾的H&E切片的比較確定了融合蛋白對脾細(xì)胞的活性的結(jié)果，諸如動脈周淋巴鞘的擴(kuò)散和/或紅髓區(qū)有核細(xì)胞結(jié)構(gòu)的顯著增加，這可指示B細(xì)胞群的分化和增殖的激活。將使用B細(xì)胞標(biāo)記即抗CD45R(B220)的免疫組織化學(xué)研究用于測定脾細(xì)胞的任何生理改變諸如脾組織破壞(disorganization)是否歸因于滲入已建立T細(xì)胞區(qū)的寬松定義的B細(xì)胞區(qū)中的B細(xì)胞表現(xiàn)度(representation)增加。將來自用清蛋白融合蛋白處理的小鼠的脾的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析用于指示清蛋白融合蛋白是否特異增加ThB+、CD45R(B220)雙重(dull)B細(xì)胞的比例超過在對照小鼠中所觀察到的。同樣的，在體內(nèi)增加成熟B細(xì)胞表現(xiàn)的預(yù)期結(jié)果是血清Ig滴度相應(yīng)升高。因此，比較緩沖液和融合蛋白處理小鼠之間的血清IgM和IgA水平。實(shí)施例17T細(xì)胞增殖測定法對PBMC進(jìn)行CD-3誘導(dǎo)增殖測定法，并通過3H-胸苷的攝取進(jìn)行測量。該測定法如下進(jìn)行。96孔平皿用100μl/孔針對CD3的mAb(HIT3a，Pharmingen)或同種型匹配的對照mAb(B33.1)于4℃包被過夜(1μg/ml，溶于0.5M碳酸氫鹽緩沖液pH9.5)，然后用PBS洗三次。通過F/H梯度離心從人外周血分離PBMC，并加到mAb包被平皿的四孔(5×104/孔)中含有10％FCS和P/S且存在不同濃度的本發(fā)明清蛋白融合蛋白(包括含有治療性蛋白質(zhì)的片段或變體和/或清蛋白或清蛋白的片段或變體的融合蛋白)的RPMI中(總體積200μl)。以單獨(dú)的相關(guān)蛋白質(zhì)緩沖液和培養(yǎng)基作為對照。于37℃培養(yǎng)48小時后，平皿以1000rpm旋轉(zhuǎn)2分鐘，取出100μl上清液并保存于-20℃以測量IL-2(或其它細(xì)胞因子)，如果觀察到增殖效果的話。向孔中添加100μl含有0.5μCi3H-胸苷的培養(yǎng)基，并于37℃培養(yǎng)18-24小時。收獲孔，并以3H-胸苷摻入作為增殖的度量。以單獨(dú)的抗CD3作為增殖的陽性對照。還使用IL-2(100U/ml)作為增強(qiáng)增殖的對照。使用不誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖的對照抗體作為本發(fā)明融合蛋白效果的陰性對照。實(shí)施例18本發(fā)明的融合蛋白對單核細(xì)胞和單核細(xì)胞衍生的人樹突細(xì)胞的II類MHC、共刺激分子和粘附分子表達(dá)及細(xì)胞分化的影響樹突細(xì)胞通過擴(kuò)充在外周血中發(fā)現(xiàn)的增殖前體來產(chǎn)生粘附性PBMC或淘析的單核細(xì)胞級分用GM-CSF(50ng/ml)和IL-4(20ng/ml)培養(yǎng)7-10天。這些樹突細(xì)胞具有未成熟細(xì)胞的特征性表型(CD1、CD80、CD86、CD40和II類MHC抗原的表達(dá))。用激活因子諸如TNF-α進(jìn)行的處理導(dǎo)致表面表型的迅速改變(I類和II類MHC、共刺激和粘附分子的表達(dá)增加，F(xiàn)CγRII下調(diào)，CD83上調(diào))。這些改變與抗原呈遞能力增加和樹突細(xì)胞的功能成熟有關(guān)。表面抗原的FACS分析如下進(jìn)行。細(xì)胞用遞增濃度的本發(fā)明清蛋白融合蛋白或LPS(陽性對照)處理1-3天，用含有1％BSA和0.02mM疊氮鈉的PBS清洗，然后與1∶20稀釋的合適FITC-或PE-標(biāo)記單克隆抗體于4℃保溫30分鐘。再次清洗后，標(biāo)記細(xì)胞在FACScan(BectonDickinson)上通過流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)進(jìn)行分析。對細(xì)胞因子產(chǎn)生的影響。由樹突細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，特別是IL-12，在T細(xì)胞依賴性免疫應(yīng)答的起始中是重要的。IL-12強(qiáng)烈影響Thl輔助T細(xì)胞免疫應(yīng)答的發(fā)生，并誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T和NK細(xì)胞功能。ELISA用于如下測量IL-12的釋放。樹突細(xì)胞(106/ml)用遞增濃度的本發(fā)明清蛋白融合蛋白處理24小時。將LPS(100ng/ml)加入到細(xì)胞培養(yǎng)物中作為陽性對照。隨后收集細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液，并用商品化ELISA試劑盒(例如R&DSystems，Minneapolis，MN)分析IL-12含量。使用隨試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)方案。對II類MHC、共刺激分子和粘附分子表達(dá)的影響。可在單核細(xì)胞上鑒定細(xì)胞表面抗原的三個主要家族粘附分子、參與抗原呈遞的分子和Fc受體。II類MHC抗原和其它共刺激分子諸如B7和ICAM-1的表達(dá)的調(diào)控可導(dǎo)致單核細(xì)胞抗原呈遞能力和誘導(dǎo)T細(xì)胞激活能力的改變。Fc受體的表達(dá)增加可能與改良的單核細(xì)胞細(xì)胞毒性活性、細(xì)胞因子釋放和吞噬作用有關(guān)。使用FACS分析如下檢驗(yàn)表面抗原。單核細(xì)胞用遞增濃度的本發(fā)明清蛋白融合蛋白或LPS(陽性對照)處理1-5天，用含有1％BSA和0.02mM疊氮化鈉的PBS清洗，然后與1∶20稀釋的合適FITC-或PE-標(biāo)記單克隆抗體于4℃保溫30分鐘。再次清洗后，標(biāo)記細(xì)胞在FACScan(BectonDickinson)上通過流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)進(jìn)行分析。單核細(xì)胞激活和/或存活提高。針對激活(或滅活)單核細(xì)胞和/或提高單核細(xì)胞存活(或降低單核細(xì)胞存活)的分子的測定法是本領(lǐng)域已知的，并可常規(guī)用于測定本發(fā)明的分子是否具有單核細(xì)胞抑制物或激活物的功能。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白可使用下述三種測定法進(jìn)行篩選。對于這些測定法中的每一種，外周血單核細(xì)胞(PBMC)通過經(jīng)過Histopaque梯度(Sigma)的離心從單一供體袋裝白細(xì)胞(leukopacks)(美國紅十字會，Baltimore，MD)純化。單核細(xì)胞通過逆流離心淘析從PBMC分離。單核細(xì)胞存活測定法。在缺乏血清或其它刺激的條件下培養(yǎng)時，人外周血單核細(xì)胞逐漸喪失活力。它們的死亡起因于內(nèi)部調(diào)控的過程(凋亡)。向培養(yǎng)物中加入激活因子諸如TNF-α明顯改善細(xì)胞存活并防止DNA斷裂。使用碘化丙啶(PI)染色如下測量凋亡。將單核細(xì)胞在聚丙烯管中在無血清培養(yǎng)基中(陽性對照)在存在100ng/mlTNF-α的條件下(陰性對照)和在存在不同濃度的待測融合蛋白的條件下培養(yǎng)48小時。細(xì)胞以2×106/ml的濃度懸浮于含有終濃度為5μg/mlPI的PBS中，然后在FACScan分析前于室溫保溫5分鐘。在此實(shí)驗(yàn)范例中，已經(jīng)證明PI攝取與DNA斷裂相關(guān)。對細(xì)胞因子釋放的影響。單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的一項(xiàng)重要功能是它們通過刺激后的細(xì)胞因子釋放對免疫系統(tǒng)其它細(xì)胞群的調(diào)控活性。測量細(xì)胞因子釋放的ELISA如下進(jìn)行。人單核細(xì)胞以5×105細(xì)胞/ml的密度與遞增濃度的本發(fā)明清蛋白融合蛋白以及在同樣條件但缺少融合蛋白的情況下進(jìn)行培養(yǎng)。對于IL-12的產(chǎn)生，細(xì)胞在存在融合蛋白的條件下用IFN(100U/ml)引發(fā)過夜。然后加入LPS(10ng/ml)。24小時后收集條件培養(yǎng)基，并保持冷凍直到使用。然后使用商品化ELISA試劑盒(例如R&DSystems，Minneapolis，MN)進(jìn)行TNF-α、IL-10、MCP-1和IL-8的測量，并應(yīng)用隨試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)方案。氧化猝發(fā)。將純化的單核細(xì)胞以2-1×105細(xì)胞/孔置于96孔平皿中。在總體積0.2ml的培養(yǎng)基(RPMI1640+10％FCS、谷氨酰胺和抗生素)中，向孔中加入遞增濃度的本發(fā)明清蛋白融合蛋白。培養(yǎng)3天后，將平皿離心，從孔中除去培養(yǎng)基。向巨噬細(xì)胞單層加入每孔0.2ml酚紅溶液(140mMNaCl、10mM磷酸鉀緩沖液pH7.0、5.5mM右旋糖、0.56mM酚紅和19U/mlHRPO)，以及刺激物(200nMPMA)。將平皿于37℃保溫2小時，通過向每個孔中加入20μl1NNaOH終止反應(yīng)。于610nm讀取吸光度。為了計(jì)算由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的H2O2的量，對每個實(shí)驗(yàn)實(shí)行已知摩爾濃度的H2O2溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)施例19本發(fā)明的清蛋白融合蛋白對血管內(nèi)皮細(xì)胞生長的影響第一天，將人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)以2-5×104細(xì)胞/35mm平皿的密度接種含有4％胎牛血清(FBS)、16單位/ml肝素和50單位/ml內(nèi)皮細(xì)胞生長補(bǔ)充物(ECGS，Biotechnique，Inc.)的M199培養(yǎng)基中。第2天，將培養(yǎng)基換成含有10％FBS、8單位/ml肝素的M199。以不同濃度加入本發(fā)明的清蛋白融合蛋白和陽性對照，諸如VEGF和堿性FGF(bFGF)。第4天和第6天，更換培養(yǎng)基。第8天，用Coulter計(jì)數(shù)器測定細(xì)胞數(shù)目。HUVEC細(xì)胞數(shù)目增加表明融合蛋白可使血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，而HUVEC細(xì)胞數(shù)目減少表明融合蛋白抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞。實(shí)施例20大鼠角膜創(chuàng)傷愈合模型此動物模型顯示了本發(fā)明清蛋白融合蛋白對新血管形成的影響。實(shí)驗(yàn)方案包括制造1-1.5mm長的從角膜中央到基質(zhì)層中的切口。在切口邊緣下插入刮刀，面向眼的外角。制造袋(其底部距眼的邊緣1-1.5mm)。在袋中放置含有50ng-5μg本發(fā)明清蛋白融合蛋白的顆粒。用本發(fā)明清蛋白融合蛋白進(jìn)行的治療也可以以20mg-500mg的劑量范圍局部應(yīng)用于角膜創(chuàng)傷(每天治療，持續(xù)五天)。實(shí)施例21糖尿病小鼠和糖皮質(zhì)激素?fù)p害創(chuàng)傷愈合模型糖尿病db+/db+小鼠模型為了證明本發(fā)明的清蛋白融合蛋白加速愈合過程，使用創(chuàng)傷愈合的遺傳糖尿病小鼠模型。db+/db+小鼠中的全層皮膚創(chuàng)傷愈合模型是充分鑒定的、臨床相關(guān)的、和可再生的損害創(chuàng)傷愈合模型。糖尿病創(chuàng)傷的愈合依賴于肉芽組織的形成和上皮再形成而不是收縮(Gartner，M.H.等人，J.Surg.Res.52389，1992；Greenhalgh，D.G.等人，Am.J.Pathol.1361235，1990)。糖尿病動物具有許多在II型糖尿病中觀察到的特有特征。純合(db+/db+)小鼠比它們的正常雜合(db+/+m)同胞仔肥胖。突變的糖尿病(db+/db+)小鼠在4號染色體上具有單個常染色體隱性突變(db+)(Coleman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77283-293，1982)。動物表現(xiàn)出多食、多飲和多尿。突變的糖尿病小鼠(db+/db+)具有升高的血糖、升高的或正常的胰島素水平、和抑制的細(xì)胞介導(dǎo)免疫(Mandel等人，J.Immunol.1201375，1978；Debray-Sachs，M.等人，Clin.Exp.Immunol.51(1)1-7，1983；Leiter等人，Am.J.ofPathol.11446-55，1985)。已經(jīng)在這些動物中描述了周圍神經(jīng)病、心肌并發(fā)癥和微血管損傷，基膜肥厚和腎小球?yàn)V過異常(Norido，F(xiàn).等人，Exp.Neurol.83(2)221-232，1984；Robertson等人，Diabetes29(1)60-67，1980；Giacomelli等人，LabInvest.40(4)460-473，1979；Coleman，D.L.，Diabetes31(Suppl)1-6，1982)。這些純合糖尿病小鼠形成與人類II型糖尿病類似的對胰島素具有抗性的高血糖(Mandel等人，J.Immunol.1201375-1377，1978)。在這些動物中觀察到的特征表明此模型中的愈合可能與人類糖尿病中觀察到的愈合相似(Greenhalgh等人，Am.J.ofPathol.1361235-1246，1990)。此研究中使用了遺傳糖尿病雌性C57BL/KsJ(db+/db+)小鼠和它們的無糖尿病(db+/+m)雜合同胞仔(JacksonLaboratories)。動物在其6周齡時購得，而在研究開始時是8周齡。動物單獨(dú)飼養(yǎng)，并隨意獲得食物和水。所有操作都采用無菌技術(shù)進(jìn)行。試驗(yàn)依照HumanGenomeSciences，Inc.科研動物管理和使用委員會(InstitutionalAnimalCareandUseCommittee)的規(guī)定和指導(dǎo)方針以及關(guān)于實(shí)驗(yàn)動物管理和使用的指導(dǎo)方針進(jìn)行。創(chuàng)傷方案依照以前報道的方法進(jìn)行(Tsuboi，R.和Rifkn，D.B.，J.Exp.Med.172245-251，1990)。簡要的說，在創(chuàng)傷當(dāng)天，通過腹膜內(nèi)注射溶于去離子水的阿佛丁(0.01mg/ml)、2，2，2-三溴乙醇和2-甲基-2-丁醇麻醉動物。將動物的背部區(qū)域除毛，皮膚用70％乙醇溶液和碘酒清洗。手術(shù)區(qū)域在創(chuàng)傷前用無菌紗布弄干。隨后用Keyes組織打孔器創(chuàng)造8mm的全層皮膚創(chuàng)傷。緊隨創(chuàng)傷之后，輕輕拉伸附近皮膚以消除創(chuàng)傷擴(kuò)張。創(chuàng)傷在實(shí)驗(yàn)期間保持開放。從創(chuàng)傷當(dāng)天開始，連續(xù)5天實(shí)施局部處理。在處理前，傷口用無菌鹽水和紗布輕輕清潔。肉眼檢查創(chuàng)傷，并在手術(shù)當(dāng)天和此后每隔兩天于固定距離進(jìn)行拍照。在第1-5天和第8天通過每天測量來測定傷口的閉合情況。使用標(biāo)有刻度的Jameson測徑器水平和垂直測量創(chuàng)傷。如果不再看到肉芽組織且創(chuàng)傷被連續(xù)的上皮所覆蓋，則認(rèn)為創(chuàng)傷愈合了。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白采用范圍不同劑量，從4mg到500mg每處創(chuàng)傷每天在載體中施用8天。載體對照組獲得50ml載體溶液。動物在第8天通過腹膜內(nèi)注射戊巴比妥鈉(300mg/kg)安樂死。然后收集創(chuàng)傷和附近皮膚以用于組織學(xué)和免疫組織化學(xué)。組織樣品置于組織盒中活組織檢查海綿之間10％中性緩沖福爾馬林中以用于進(jìn)一步加工。每組10只動物(5只糖尿病和5只無糖尿病對照)的三組評估1)載體安慰劑對照，2)未處理組，和3)處理組。通過以水平和垂直軸測量區(qū)域并獲得創(chuàng)傷的總平面面積來分析創(chuàng)傷閉合。隨后通過確定最初創(chuàng)傷面積(第0天)和處理后的創(chuàng)傷面積(第8天)之間的差異評估收縮。第1天的創(chuàng)傷面積是64mm2，即皮膚打孔器的相應(yīng)大小。使用如下公式進(jìn)行計(jì)算a.[第8天的開放面積]-[第1天的開放面積]/[第1天的開放面積]將樣品在10％緩沖福爾馬林中固定，并將石蠟包埋塊垂直于創(chuàng)傷表面切片(5mm)，切割采用Reichert-Jung切片機(jī)。對平分創(chuàng)傷的橫截面進(jìn)行常規(guī)蘇木精-曙紅(H&E)染色。使用創(chuàng)傷的組織學(xué)檢查來評估修復(fù)皮膚的愈合過程和形態(tài)學(xué)外觀是否因本發(fā)明清蛋白融合蛋白的處理而改變。此評估包括驗(yàn)證細(xì)胞聚集、炎性細(xì)胞、毛細(xì)管、成纖維細(xì)胞、上皮再形成和表皮成熟的存在(Greenhalgh，D.G等人，Am.J.Pathol.1361235，1990)。經(jīng)校準(zhǔn)的透鏡測微計(jì)由不知情的觀察者(blindedobserver)使用。組織切片還用多克隆兔抗人角蛋白抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，其中使用ABCElite檢測系統(tǒng)。使用人皮膚作為陽性組織對照，而使用未免疫IgG作為陰性對照。通過使用經(jīng)校準(zhǔn)透鏡測微計(jì)評估創(chuàng)傷上皮再形成的程度來測定角質(zhì)形成細(xì)胞的生長。通過使用抗PCNA抗體(1∶50)以及ABCElite檢測系統(tǒng)展示皮膚樣品中的增殖細(xì)胞核抗原/細(xì)胞周期蛋白(PCNA)。使用人結(jié)腸癌作為陽性組織對照，而使用人腦組織被作為陰性對照。每個樣品包括省略了一抗并以未免疫小鼠IgG替換的切片。這些切片的分級是基于增殖程度分為0-8的等級，反映輕微增殖的低端等級至反映強(qiáng)烈增殖的高端。使用非配對t檢驗(yàn)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。小于0.05的p值認(rèn)為是顯著的。類固醇損害大鼠模型類固醇對創(chuàng)傷愈合的抑制已經(jīng)在各種體外和體內(nèi)系統(tǒng)中很好的證明(Wahl，“GlucocorticoidsandWoundhealing”，在《Anti-InflammatorySteroidActionBasicandClinicalAspects》中，280-302，1989；Wahl等人，J.Immunol.115476-481，1975；Werb等人，J.Exp.Med.1471684-1694，1978)。糖皮質(zhì)激素通過抑制血管發(fā)生、降低血管通透性(Ebert等人，An.Intern.Med.37701-705，1952)、成纖維細(xì)胞增殖、和膠原合成(Beck等人，GrowthFactors5295-304，1991；Haynes等人，J.Clin.Invest.61703-797，1978)以及產(chǎn)生循環(huán)單核細(xì)胞的瞬間減少(Haynes等人，J.Clin.Invest.61703-797，1978；Wahl，“Glucocorticoidsandwoundhealing”，在《AntiinflammatorySteroidActionBasicandClinicalAspects》中，AcademicPress，NewYork，pp.280-302，1989)來延遲創(chuàng)傷愈合。在大鼠中系統(tǒng)施用類固醇損害創(chuàng)傷愈合是充分證明的現(xiàn)象(Beck等人，GrowthFactors5295-304，1991；Haynes等人，J.Clin.Invest.61703-797，1978；Wahl，“Glucocorticoidsandwoundhealing”，在《AntiinflammatorySteroidActionBasicandClinicalAspects》中，AcademicPress，NewYork，pp.280-302，1989；Pierce等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA862229-2233，1989)。為了證明本發(fā)明的清蛋白融合蛋白能夠加速愈合過程，評估了多次局部應(yīng)用融合蛋白對大鼠中全層切除皮膚創(chuàng)傷的效果，其中愈合因系統(tǒng)施用甲基強(qiáng)的松龍而損害。此實(shí)施例使用體重200-300g的年輕成年雄性SpragueDawley大鼠(CharlesRiverLaboratories)。動物在8周齡時購得，在研究開始時為9周齡。大鼠的愈合應(yīng)答因創(chuàng)傷時系統(tǒng)施用甲基強(qiáng)的松龍(17mg/kg/大鼠肌肉內(nèi))而受損。動物單獨(dú)飼養(yǎng)，并隨意獲得食物和水。所有操作都采用無菌技術(shù)進(jìn)行。此研究依照HumanGenomeSciences，Inc.科研動物管理和使用委員會(InstitutionalAnimalCareandUseCommittee)的規(guī)定和指導(dǎo)方針以及關(guān)于實(shí)驗(yàn)動物管理和使用的指導(dǎo)方針進(jìn)行。遵循上文描述的創(chuàng)傷方案。在創(chuàng)傷當(dāng)天，通過腹膜內(nèi)注射可達(dá)眠(50mg/kg)和塞拉嗪(5mg/kg)麻醉動物。將動物的背部區(qū)域除毛，皮膚用70％乙醇溶液和碘溶液清洗。外科手術(shù)區(qū)域在創(chuàng)傷前用無菌紗布弄干。隨后用Keyes組織打孔器創(chuàng)造8mm的全層皮膚創(chuàng)傷。創(chuàng)傷在實(shí)驗(yàn)期間保持開放。從創(chuàng)傷及隨后施用甲基強(qiáng)的松龍當(dāng)天開始，連續(xù)7天每天實(shí)施一次局部施用測試材料。在處理前，傷口用無菌鹽水和紗布輕輕清潔。肉眼檢查創(chuàng)傷，并在創(chuàng)傷當(dāng)天和處理結(jié)束時于固定距離進(jìn)行拍照。在第1-5天和第8天通過每天測量來測定傷口的閉合情況。使用標(biāo)有刻度的Jameson測徑器水平和垂直測量創(chuàng)傷。如果不再看到肉芽組織且創(chuàng)傷被連續(xù)的上皮所覆蓋，則認(rèn)為創(chuàng)傷愈合了。本發(fā)明的清蛋白融合蛋白采用范圍不同劑量，從4mg到500mg每處創(chuàng)傷每天在載體中施用8天。載體對照組獲得50ml載體溶液。動物在第8天通過腹膜內(nèi)注射戊巴比妥鈉(300mg/kg)安樂死。然后收集創(chuàng)傷和附近皮膚以用于組織學(xué)。組織樣品置于組織盒中活組織檢查海綿之間10％中性緩沖摩爾馬來中以用于進(jìn)一步加工。每組10只動物(5只糖尿病和5只無糖尿病對照)的三組評估1)未處理組，2)載體安慰劑對照，3)處理組。通過以水平和垂直軸測量區(qū)域并獲得創(chuàng)傷的總平面面積來分析創(chuàng)傷閉合。隨后通過確定最初創(chuàng)傷面積(第0天)和處理后的創(chuàng)傷面積(第8天)之間的差異來評估閉合。第1天的創(chuàng)傷面積是64mm2，即皮膚打孔器的相應(yīng)大小。使用如下公式進(jìn)行計(jì)算b.[第8天的開放面積]-[第1天的開放面積]/[第1天的開放面積]將樣品在10％緩沖摩爾馬來中固定，并將石蠟包埋塊垂直于創(chuàng)傷表面切片(5mm)，切割采用Olympus切片機(jī)。對平分創(chuàng)傷的橫截面進(jìn)行常規(guī)蘇木精-曙紅(H&E)染色。創(chuàng)傷的組織學(xué)檢查能夠評估修復(fù)皮膚的愈合過程和形態(tài)學(xué)外觀是否因本發(fā)明清蛋白融合蛋白的處理而改善。經(jīng)校準(zhǔn)的透鏡測微計(jì)由不知情的觀察者使用以測定創(chuàng)傷裂口的距離。使用非配對t檢驗(yàn)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。小于0.05的p值認(rèn)為是顯著的。實(shí)施例22淋巴水腫動物模型此實(shí)驗(yàn)方法的目的是創(chuàng)建合適和可靠的淋巴水腫模型以用于檢驗(yàn)本發(fā)明清蛋白融合蛋白在大鼠后肢的淋巴循環(huán)系統(tǒng)的淋巴管發(fā)生和重建中的治療效果。通過患病肢的腫脹體積、淋巴脈管系統(tǒng)數(shù)量的定量、總血漿蛋白和組織病理學(xué)來測量效果。急性淋巴水腫觀察7-10天。可能更加重要的是，水腫的慢性過程跟蹤長達(dá)3-4周。開始手術(shù)之前，采集血樣用于蛋白質(zhì)濃度分析。給體重約350g的雄性大鼠服用戊巴比妥。隨后，右腿從膝蓋到臀部除毛。除毛區(qū)域用浸在70％EtOH中的紗布擦洗。采集血樣用于血清總蛋白質(zhì)檢驗(yàn)。在標(biāo)記2個測量水平(后跟以上0.5cm，背爪的中部)之后，進(jìn)行周長和體積測量，然后向腳爪中注射染料。右爪和左爪的背部皮內(nèi)注射0.05ml1％Evan氏藍(lán)。然后在將染料注射到腳爪中后進(jìn)行周長和體積測量。使用膝蓋關(guān)節(jié)作為界標(biāo)，沿圓周產(chǎn)生腿中部腹股溝切口，從而可定位股血管(femoralvessel)。使用鑷子和止血鉗解剖和分離皮瓣。定位股血管后，定位位于血管下面、沿一側(cè)走向的淋巴管。然后將此區(qū)域的主要淋巴管電凝結(jié)(electricallycoagulated)或縫合結(jié)扎(sutureligated)。使用顯微鏡將腿背部(鄰近半肌腱和收肌)的肌肉直接切開。然后定位腿彎部的淋巴結(jié)。然后通過縫合結(jié)扎腿彎部淋巴結(jié)的2個鄰側(cè)和2個遠(yuǎn)側(cè)淋巴管和遠(yuǎn)側(cè)血液供應(yīng)。然后通過切斷結(jié)締組織除去腿彎部淋巴結(jié)和任何附隨的脂肪組織。注意控制由此操作引起的任何輕微出血。淋巴閉塞后，使用hquid皮膚(Vetbond)(AJBuck)封閉皮瓣。將分開的皮膚邊緣封閉到肌肉組織下，而在腿周圍留下約0.5cm的裂口。在需要時，也可以通過縫合到肌肉下方來錨定皮膚。為了避免感染，動物用網(wǎng)單獨(dú)飼養(yǎng)(無墊草)。正在復(fù)原的動物每天檢查，通過最佳水腫峰，一般發(fā)生在第5-7天。隨后觀察到穩(wěn)定水腫峰。為了評估淋巴水腫的強(qiáng)度，在手術(shù)前和7天的每天測量每個腳爪上2個指定位置的周長和體積。測定血漿蛋白質(zhì)對淋巴水腫的影響，而且還調(diào)查了蛋白質(zhì)分析是否是有效的檢驗(yàn)范圍(testingperimeter)。在2個位置評估對照和水腫肢體的重量。分析以盲目方式進(jìn)行。周長測量通過簡單的氣體麻醉以防止肢體活動，使用布卷尺測量肢體周長。由2個不同的人在踝骨和背爪處進(jìn)行測量，并將這兩個讀數(shù)取平均值。從對照和水腫肢體獲得讀數(shù)。體積測量在手術(shù)當(dāng)天，動物用戊巴比妥麻醉，并在手術(shù)前進(jìn)行檢測。為每天測定體積，動物簡單的用氟烷麻醉(快速制動和快速恢復(fù))，將兩腿都除毛并用防水標(biāo)記對腿進(jìn)行同樣標(biāo)記。將腿首先浸入水中，然后浸入儀器中到每個標(biāo)記的水平，隨后通過Buxco水腫軟件(Chen/Victor)測量。數(shù)據(jù)由一個人記錄，而另一個人將肢體浸到標(biāo)記區(qū)。血液-血漿蛋白質(zhì)測量在手術(shù)前采集血液、離心并分離血清，然后是結(jié)束時，用于比較總蛋白質(zhì)和Ca2+。肢體重量比較采集血液后，動物預(yù)備用于組織收集。用剪斷機(jī)(quillitine)切除肢體，然后在結(jié)扎處切割實(shí)驗(yàn)和對照腿并稱重。在脛-根關(guān)節(jié)脫離后進(jìn)行第二次稱重，并將足稱重。組織學(xué)制備物解剖位于膝蓋(腿彎部)區(qū)域后的橫肌并排列在金屬模具中，填滿冰凍凝膠(freezeGel)，浸入冷的甲基丁烷，置于-80℃的帶標(biāo)記樣品袋中直到切片。緊接切片，肌肉在熒光顯微鏡下觀察淋巴。實(shí)施例23本發(fā)明清蛋白融合蛋白對TNFα誘導(dǎo)的粘附分子表達(dá)的抑制淋巴細(xì)胞向炎癥和血管發(fā)生區(qū)域的募集涉及淋巴細(xì)胞和血管內(nèi)皮上的細(xì)胞表面粘附分子(CAM)之間的特異受體-配體相互作用。粘附過程在正常和病理?xiàng)l件中都遵循多步級聯(lián)，它涉及內(nèi)皮細(xì)胞(EC)上胞內(nèi)粘附分子-1(ICAM-1)、血管細(xì)胞粘附分子-1(VCAM-1)、和內(nèi)皮白細(xì)胞粘附分子-1(E-選擇蛋白)的表達(dá)。這些分子和其它分子在血管內(nèi)皮上的表達(dá)決定了白細(xì)胞可以在炎癥反應(yīng)期間粘附于局部血管系統(tǒng)并外滲到局部組織中的效率。細(xì)胞因子和生長因子的局部集中參與這些CAM的表達(dá)調(diào)控。腫瘤壞死因子α(TNF-a)，一種有效的促炎細(xì)胞因子，是內(nèi)皮細(xì)胞上所有三種CAM的刺激物，且可能涉及極其多種炎癥反應(yīng)，通常導(dǎo)致病理后果?？梢詸z驗(yàn)本發(fā)明清蛋白融合蛋白介導(dǎo)對TNF-a誘導(dǎo)的CAM表達(dá)的抑制的潛力。采用以EC作為固相吸收劑的修正ELISA測定法來測量在用FGF蛋白質(zhì)家族的一種成員共刺激后經(jīng)TNF-a處理的EC上的CAM表達(dá)量。為了實(shí)施該實(shí)驗(yàn)，從合并的臍帶收集物(cordharvests)獲得人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)培養(yǎng)物，并在含5％CO2的37℃潮濕培養(yǎng)箱中保持在補(bǔ)充有10％FCS和1％青霉素/鏈霉素的生長培養(yǎng)基(EGM-2；Clonetics，SanDiego，CA)中。將HUVEC以1×104細(xì)胞/孔的濃度接種到96孔平皿中，并于37℃溫育18-24小時或直到匯合。隨后將細(xì)胞單層用補(bǔ)充有100U/ml青霉素和100mg/ml鏈霉素的RPMI-1640的無血清溶液清洗3次，并用指定的細(xì)胞因子和/或生長因子于37℃處理24小時。培養(yǎng)后，對細(xì)胞評估CAM表達(dá)。將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)在標(biāo)準(zhǔn)96孔平皿中培養(yǎng)至匯合。從細(xì)胞除去生長培養(yǎng)基，并用90μl199培養(yǎng)基(10％FBS)替換。將用于測試的樣品和陽性或陰性對照加到平皿中一式三份(10μl體積)。將平皿于37℃保溫5小時(選擇蛋白和整聯(lián)蛋白表達(dá))或24小時(僅整聯(lián)蛋白表達(dá))。將平皿抽吸以除去培養(yǎng)基，并向每個孔中加入100μl0.1％低聚甲醛-PBS(含有Ca++和Mg++)。將平皿于4℃保持30分鐘。隨后從孔中除去固定液，將孔用PBS(+Ca、Mg)+0.5％BSA清洗1次，并排干。不讓孔干燥。向測試和對照孔中加入10μl經(jīng)過稀釋的一抗。以10μg/ml的濃度(1∶10稀釋的0.1mg/ml抗體儲液)使用抗ICAM-1-生物素、抗VCAM-1-生物素和抗E-選擇蛋白-生物素。將細(xì)胞在潮濕環(huán)境中于37℃保溫30分鐘。將孔用PBS(+Ca、Mg)+0.5％BSA清洗3次。然后向每個孔中加入20μl經(jīng)過稀釋的ExtrAvidin-堿性磷酸酶(1∶5,000稀釋)，并于37℃保溫30分鐘。將孔用PBS(+Ca、Mg)+0.5％BSA清洗3次。將1片對硝基苯酚磷酸酯(p-NitrophenolPhosphate，pNPP)溶于5ml甘氨酸緩沖液(pH10.4)。向每個測試孔中加入100μl溶于甘氨酸緩沖液的pNPP底物。由ExtrAvidin-堿性磷酸酶溶于甘氨酸緩沖液的使用稀釋液制備一式三份的標(biāo)準(zhǔn)孔1∶5,000(100)＞10-0.5＞10-1＞10-1.5。每個稀釋度取5μl加入到一式三份的孔中，如此得到的每個孔中的AP含量為5.50ng、1.74ng、0.55ng、0.18ng。然后必須向每個標(biāo)準(zhǔn)孔中加入100μlpNNP試劑。平皿必須于37℃保溫4小時。向所有孔中加入50μl體積的3MNaOH。在讀板儀上于405nm量化結(jié)果。對僅裝有甘氨酸緩沖液的空白孔使用背景扣除選項(xiàng)。將模板設(shè)定為顯示每個標(biāo)準(zhǔn)孔中AP-綴合物的濃度[5.50ng；1.74ng；0.55ng；0.18ng]。結(jié)果將顯示為每個樣品中結(jié)合的AP-綴合物的量。實(shí)施例24GAS報道分子構(gòu)建物的構(gòu)建將涉及細(xì)胞分化和增殖的一種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑稱為Jaks-STAT途徑。Jaks-STAT途徑中激活的蛋白質(zhì)結(jié)合γ激活位點(diǎn)“GAS”元件或干擾素敏感應(yīng)答元件(“ISRE”)，它們位于許多基因的啟動子中。蛋白質(zhì)與這些元件的結(jié)合改變相關(guān)基因的表達(dá)。GAS和ISRE元件受到稱為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)物和轉(zhuǎn)錄激活物或“STAT”的一類轉(zhuǎn)錄因子的識別。STAT家族有六個成員。Stat1和Stat3存在于許多細(xì)胞類型中，Stat2也一樣(作為對IFN-α的應(yīng)答是普遍的)。Stat4更加受限，而且在許多細(xì)胞類型中不存在，雖然它在I類T輔助細(xì)胞、用IL-12處理后的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)過。Stat5最初稱為乳腺生長因子，但是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)它以更高濃度存在于其它細(xì)胞中，包括骨髓細(xì)胞。它能夠在組織培養(yǎng)細(xì)胞中受到許多細(xì)胞因子的激活。STAT因稱為Janus激酶(“Jaks”)家族的一組激酶的酪氨酸磷酸化受到激活而從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到核。Jaks代表了可溶性酪氨酸激酶的一個獨(dú)特家族，包括Tyk2、Jak1、Jak2和Jak3。這些激酶展示顯著的序列相似性，而且通常在靜息細(xì)胞中無催化活性。Jaks受到下表所總結(jié)的多種受體的激活。(改編自Schidler和Darnell的綜述，Ann.Rev.Biochem.64621-51，1995)。能夠激活Jaks的細(xì)胞因子受體家族分為兩組(a)1類包括IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-9、IL-11、IL-12、IL-IS、Epo、PRL、GH、G-CSF、GM-CSF、LIF、CNTF、和血小板生成素的受體；和(b)2類包括IFN-a、IFN-g和IL-10。1類受體共有一個保守半胱氨酸基序(一組4個保守半胱氨酸和1個色氨酸)以及WSXWS基序(編碼Trp-Ser-Xaa-Trp-Ser(SEQIDNO53)的膜近中心區(qū))因此，在配體與受體結(jié)合后，Jaks受到激活，它繼而激活STAT，其隨后轉(zhuǎn)移并結(jié)合GAS元件。這整個過程包含在Jaks-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中。因此，由GAS或ISRE元件的結(jié)合所反映的Jaks-STAT途徑的激活可用于指示涉及細(xì)胞增殖和分化的蛋白質(zhì)。例如，已知生長因子和細(xì)胞因子激活Jaks-STAT途徑(見下文表5)。因此，通過使用與受體分子連接的GAS元件，可以鑒定Jaks-STAT途徑的激活因子。表5為了構(gòu)建含有啟動子元件的合成GAS，它用于實(shí)施例27-29中描述的生物學(xué)測定法，采用基于PCR的策略來產(chǎn)生GAS-SV40啟動子序列。5’引物含有GAS結(jié)合位點(diǎn)的4個串聯(lián)拷貝，它是在IRF1啟動子中發(fā)現(xiàn)的且先前證明在受到多種細(xì)胞因子的誘導(dǎo)后結(jié)合STAT(Rothman等人，Immunity1457-468，1994)，雖然可以使用其它GAS或ISRE元件作為替代。5’引物還含有與SV40早期啟動子序列互補(bǔ)的18bp序列，且側(cè)翼為XhoI位點(diǎn)。5’引物的序列為5′-GCGCCTCGAGATTTCCCCGAAATCTAGATTTCCCCGAAATGATTTCCCCGAAATGATTTCCCCGAAATATCTGCCATCTCAATTAG-3′(SEQIDNO54)下游引物與SV40啟動子互補(bǔ)，且側(cè)翼為HindIII位點(diǎn)5′-GCGGCAAGCTTTTTGCAAAGCCTAGGC-3′(SEQIDNO55)使用從Clontech獲得的B-gal啟動子質(zhì)粒中存在的SV40啟動子模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將如此得到的PCR片段用XhoI/HindIII消化，并亞克隆到BLSK2-(Stratagene)中。用正向和反向引物進(jìn)行的測序證實(shí)了插入物含有如下序列5’-CTCGAGATTTCCCCGAAATCTAGATTTCCCCGAAATGATTTCCCCGAAATGATTTCCCCGAAATATCTGCCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTT-3′(SEQIDNO56)通過與SV40啟動子連接的此GAS啟動子元件，接著改造了GASSEAP2報道分子構(gòu)建物。在這里，報道分子是分泌的堿性磷酸酶，或“SEAP”。然而，顯然任何報道分子都可以在這個或任何其它實(shí)施例中替代SEAP?？捎糜谔娲鶶EAP的眾所周知的報道分子包括氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、螢光素酶、堿性磷酸酶、B-半乳糖苷酶、綠色熒光蛋白(GFP)或可通過抗體檢測的任何蛋白質(zhì)。上述序列證實(shí)了合成GAS-SV40啟動子元件使用HindIII和XhoI亞克隆到了從Clontech獲得的pSEAP-啟動子載體中，用擴(kuò)增的GASSV40啟動子元件有效替換SV40啟動子，創(chuàng)建了GAS-SEAP載體。然而，此載體不含新霉素抗性基因，并因此不為哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)所優(yōu)選。因此，為了產(chǎn)生表達(dá)GAS-SEAP報道子的穩(wěn)定哺乳動物細(xì)胞系，使用SalI和NotI將GAS-SEAP盒從GAS-SEAP載體中移出，并使用多克隆位點(diǎn)中的這些限制性位點(diǎn)插入含有新霉素抗性基因的主鏈載體，諸如pGFP-1(Clontech)，創(chuàng)建了GAS-SEAP/Neo載體。一旦將此載體轉(zhuǎn)化到哺乳動物細(xì)胞中，此載體就可以如實(shí)施例27-29所述用作GAS結(jié)合的報道分子?？梢允褂蒙衔牡拿枋霾⒂貌煌瑔幼有蛄刑鎿QGAS來制備其它構(gòu)建物。例如，實(shí)施例27-31中描述了含有EGR和NF-KB啟動子序列的報道分子的構(gòu)建。然而，可使用這些實(shí)施例中描述的方案替換許多其它啟動子。例如，可以單獨(dú)或聯(lián)合(例如GAS/NF-KB/EGR、GAS/NF-KB、Il-2/NFAT或NF-KB/GAS)替換SRE、IL-2、NFAT或骨鈣蛋白啟動子。類似的，可使用其它細(xì)胞系來測試報道分子構(gòu)建物活性，諸如HELA(上皮)、HUVEC(內(nèi)皮)、Reh(B-細(xì)胞)、Saos-2(成骨細(xì)胞)、HUVAC(主動脈)或心肌細(xì)胞。實(shí)施例25SEAP活性的測定法作為用于本文公開的實(shí)施例中描述的測定法的報道分子，根據(jù)下述一般程序用TropixPhospho-light試劑盒(Cat.BP-400)測定SEAP活性。TropixPhospho-light試劑盒提供下面所用的稀釋、測定和反應(yīng)緩沖液。將分配器灌注2.5x稀釋緩沖液，并將15μl2.5x稀釋緩沖液分配到裝有35μl含本發(fā)明清蛋白融合蛋白溶液的Optiplate中。用塑料密封膜密封平皿，并于65℃保溫30分鐘。分開Optiplate以避免受熱不均。使樣品冷卻至室溫15分鐘。排空分配器并灌注測定緩沖液。加入50ml測定緩沖液并于室溫保溫5分鐘。排空分配器并灌注反應(yīng)緩沖液(見下表)。加入50μl反應(yīng)緩沖液并于室溫保溫20分鐘。由于化學(xué)發(fā)光信號的強(qiáng)度依賴于時間，而且在發(fā)光計(jì)上讀取5個平皿需要約10分鐘，因此每次處理5個平皿，并在10分鐘后開始第二組。在發(fā)光計(jì)中讀取相對光單位。設(shè)定H12為空白，并打印結(jié)果?；瘜W(xué)發(fā)光增強(qiáng)表明報道分子活性。表6實(shí)施例26鑒定神經(jīng)元活性的測定法在細(xì)胞進(jìn)行分化和增殖時，一組基因通過許多不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑受到激活。這些基因之一，EGR1(早期生長反應(yīng)基因1)，在多種組織和細(xì)胞類型中在激活后誘受到導(dǎo)。EGR1的啟動子負(fù)責(zé)這種誘導(dǎo)。使用與報道分子連接的EGR1啟動子，可評估本發(fā)明融合蛋白激活細(xì)胞的能力。具體的說，使用如下方案在PC12細(xì)胞系中評估神經(jīng)元活性。已知PC12細(xì)胞(大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞)通過多種促細(xì)胞分裂劑諸如TPA(十四酰佛波醇醋酸酯)、NGF(神經(jīng)生長因子)和EGF(表皮生長因子)的激活而增殖和/或分化。在此處理過程中EGR1基因表達(dá)受到激活。因此，通過用含有與SEAP報道基因連接的EGR啟動子的構(gòu)建物穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞，可評估本發(fā)明清蛋白融合蛋白對PC12細(xì)胞的激活。EGR/SEAP報道分子構(gòu)建物可通過如下方案來裝配。EGR-1啟動子序列(-633至+1)(SakamotoK等人，Oncogene6867-871，1991)可使用下列引物從人基因組DNA中PCR擴(kuò)增第一引物5′-GCGCTCGAGGGATGACAGCGATAGAACCCCGG-3′(SEQIDNO57)第二引物5′-GCGAAGCTTCGCGACTCCCCGGATCCGCCTC-3′(SEQIDNO58)使用實(shí)施例24中產(chǎn)生的GAS:SEAP/Neo載體，然后可將EGR1擴(kuò)增產(chǎn)物插入到此載體中。使用限制酶XhoI/HindIII將GAS:SEAP/Neo載體線性化，除去GAS/SV40填充物。用相同的酶將EGR1擴(kuò)增產(chǎn)物限制性消化。連接載體和EGR1啟動子。為了預(yù)備細(xì)胞培養(yǎng)用的96孔平皿，每個10cm平皿中加入2ml包被液(I類膠原(UpstateBiotechInc.，產(chǎn)品目錄編號08-115)在30％乙醇中1∶30稀釋(過濾滅菌))或96孔平皿每個孔50ml，并在空氣中干燥2小時。將PCI2細(xì)胞常規(guī)在經(jīng)過預(yù)包被的10cm組織培養(yǎng)皿上在補(bǔ)充有100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的含有10％馬血清(JRHBIOSCIENCES，產(chǎn)品目錄編號12449-78P)、5％加熱滅活的胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培養(yǎng)基(BioWhittaker)中常規(guī)培養(yǎng)。每3到4天將其一分為四。通過刮取從平皿中取出細(xì)胞，并通過吸入和吹出超過15次進(jìn)行重懸。使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)將EGR/SEAP/Neo構(gòu)建物轉(zhuǎn)染到PC12中。通過在300μg/mlG418中培養(yǎng)細(xì)胞來獲得EGR-SEAP/PC12穩(wěn)定細(xì)胞。使用不含G418的培養(yǎng)基進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，只是每1到2個月細(xì)胞應(yīng)在300μg/mlG418中重新培養(yǎng)幾代。為了測定神經(jīng)元活性，對細(xì)胞長至大約70-80％匯合的10cm平皿進(jìn)行篩選，即除去舊的培養(yǎng)基。用PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)清洗細(xì)胞一次。然后將細(xì)胞在低血清培養(yǎng)基(含有1％馬血清和0.5％FBS和抗生素的RPMI-1640)中饑餓培養(yǎng)過夜。第二天上午，除去培養(yǎng)基并用PBS清洗細(xì)胞。從平皿上刮下細(xì)胞，在2ml低血清培養(yǎng)基中充分懸浮細(xì)胞。對細(xì)胞計(jì)數(shù)，并加入更多低血清培養(yǎng)基，使最終的細(xì)胞密度達(dá)到5×105細(xì)胞/ml。向96孔平皿的每個孔中加入200μl細(xì)胞懸浮液(相當(dāng)于1×105細(xì)胞/孔)。加入一系列不同濃度的本發(fā)明清蛋白融合蛋白，于37℃保溫48到72小時?？墒褂靡阎ㄟ^EGR激活PC12細(xì)胞的生長因子作為陽性對照，諸如50ng/μl神經(jīng)元生長因子(NGF)。在陽性對照孔中通常觀察到超過50倍的SEAP誘導(dǎo)。SEAP測定法可使用本領(lǐng)域已知的和/或?qū)嵤├?5中描述的技術(shù)常規(guī)進(jìn)行。實(shí)施例27T細(xì)胞活性的測定法下面的方案用于通過鑒定因子并測定本發(fā)明的清蛋白融合蛋白是否增殖和/或分化T細(xì)胞來評估T細(xì)胞活性。使用實(shí)施例24中產(chǎn)生的GAS/SEAP/Neo構(gòu)建物來評估T細(xì)胞活性。因此，增加SEAP活性的倍數(shù)指示激活Jaks-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的能力。此測定法中所使用的T細(xì)胞是JurkatT-細(xì)胞(ATCC編號TIB-152)，雖然也可以使用Molt-3細(xì)胞(ATCC編號CRL-1552)和Molt-4細(xì)胞(ATCC編號CRL-1582)。JurkatT-細(xì)胞是成淋巴細(xì)胞CD4+Th1輔助細(xì)胞。為了產(chǎn)生穩(wěn)定的細(xì)胞系，使用DMRIE-C(LifeTechnologies)(下文描述的轉(zhuǎn)染方法)用GAS-SEAP/neo載體轉(zhuǎn)染大約2百萬Jurkat細(xì)胞。以每孔大約20,000細(xì)胞的密度接種轉(zhuǎn)染細(xì)胞并選擇對1mg/ml慶大霉素有抗性的轉(zhuǎn)染子。擴(kuò)增抗性菌落，然后測試它們對濃度增加的干擾素γ的反應(yīng)。演示了一個選定克隆的劑量應(yīng)答。具體而言，下面的方案將為75個含有200μl細(xì)胞的孔產(chǎn)生足夠的細(xì)胞。因此，為了為多個96孔板產(chǎn)生足夠的細(xì)胞，或者放大規(guī)模，或者多次實(shí)施。在含1％青霉素-鏈霉素的RPMI+10％血清中維持Jurkat細(xì)胞。在T25燒瓶中混和2.5mlOPTI-MEM(LifeTechnologies)和10μg質(zhì)粒DNA。加入含有50μlDMRIE-C的2.5mlOPTI-MEM，并于室溫保溫15-45分鐘。在保溫期間，對細(xì)胞濃度計(jì)數(shù)，旋轉(zhuǎn)沉淀所需數(shù)目的細(xì)胞(107個細(xì)胞每次轉(zhuǎn)染)，并重懸于OPTI-MEM至終濃度107個細(xì)胞/ml。然后向T25燒瓶中加入1mlOPTI-MEM中的1×107個細(xì)胞，并于37℃保溫6小時。保溫后，加入10mlRPMI+15％血清。在RPMI+10％血清、1mg/ml慶大霉素和1％青霉素-鏈霉素中維持Jurkat:GAS-SEAP穩(wěn)定報道系。用不同濃度的一種或多種本發(fā)明融合蛋白處理這些細(xì)胞。在用融合蛋白處理的當(dāng)天，細(xì)胞應(yīng)當(dāng)清洗，并重懸于新鮮的RPMI+10％血清至每毫升500,000細(xì)胞的密度。所需細(xì)胞準(zhǔn)確數(shù)目將取決于融合蛋白的數(shù)量和所篩選融合蛋白的不同濃度的數(shù)量。對于一個96孔板，需要大約1千萬細(xì)胞(對于10個平皿，需要1億細(xì)胞)。將含有經(jīng)融合蛋白處理的Jurkat細(xì)胞的有孔器皿在培養(yǎng)箱中放置48小時(注意，這個時間在48-72小時之間可變化)。然后使用12道移液器將每個孔的35μl樣品轉(zhuǎn)移到不透明的96孔板中。(使用sellophene覆蓋物)覆蓋不透明的平板，并保存于-20℃直至根據(jù)實(shí)施例25進(jìn)行SEAP測定法。將含有剩余經(jīng)處理細(xì)胞的平板置于4℃，并在需要時用作在特定孔上重復(fù)測定的材料來源?？墒褂?00U/ml干擾素γ作為陽性克隆，已知它激活JurkatT細(xì)胞。在陽性對照孔中通常觀察到超過30倍的誘導(dǎo)。上述方案可用于產(chǎn)生瞬時的和穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，這對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。實(shí)施例28T細(xì)胞活性的測定法NK-KB(核因子KB)是由多種因子，包括炎性細(xì)胞因子IL-1和TNF、CD30和CD40、淋巴毒素-α和淋巴毒素-β通過暴露于LPS或凝血酶，以及通過某些病毒基因產(chǎn)物的表達(dá)而激活的一種轉(zhuǎn)錄因子。作為轉(zhuǎn)錄因子，NF-KB調(diào)控涉及免疫細(xì)胞活化、凋亡控制(NF-KB表現(xiàn)出保護(hù)細(xì)胞免于凋亡)、B和T-細(xì)胞發(fā)育、抗病毒和抗微生物反應(yīng)以及多種應(yīng)激反應(yīng)的基因的表達(dá)。在未激發(fā)狀態(tài)中，NF-KB與I-KB(抑制物KB)保留在細(xì)胞質(zhì)中。然而，在刺激后，I-KB發(fā)生磷酸化和降解，導(dǎo)致NF-KB穿梭到細(xì)胞核中，從而激活靶基因的轉(zhuǎn)錄。由NF-KB激活的靶基因包括IL-2、IL-6、GM-CSF、ICAM-1和I類MHC。由于它的重要作用和應(yīng)答多種刺激的能力，將利用NF-KB啟動子元件的報道分子構(gòu)建物用于篩選融合蛋白。NF-KB的激活物或抑制物在治療、預(yù)防和/或診斷疾病中將是有用的。例如，NF-KB的抑制物可用于治療那些涉及NF-KB的急性或慢性激活的疾病，諸如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。為了構(gòu)建含有NF-KB啟動子元件的載體，采用基于PCR的策略。上游引物含有NF-KB結(jié)合位點(diǎn)(GGGGACTTTCCC)(SEQIDNO59)的4個串聯(lián)拷貝、與SV40早期啟動子序列的5’端互補(bǔ)的18bp序列，且側(cè)翼為XhoI位點(diǎn)5′-GCGGCCTCGAGGGGACTTTCCCGGGGACTTTCCGGGGACTTTCCGGGACTTTCCATCCTGCCATCTCAATTAG-3′(SEQIDNO60)下游序列與SV40啟動子的3’端互補(bǔ)，且側(cè)翼為HindIII位點(diǎn)5′-GCGGCAAGCTTTTTGCAAAGCCTAGGC-3′(SEQIDNO55)使用從Clontech獲得的pB-gal啟動子質(zhì)粒中存在的SV40啟動子模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將如此得到的PCR片段用XhoI和HindIII消化，并亞克隆到BLSK2-(Stratagene)中。用T7和T3引物進(jìn)行的測序證實(shí)了插入物含有如下序列5’-CTCGAGGGGACTTTCCCGGGGACTTTCCGGGGACTTTCCGGGACTTTCCATCTGCCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTT-3’(SEQIDNO61)接著，通過XhoI和HindIII用此NF-KB/SV40片段替換pSEAP2-啟動子質(zhì)粒(Clontech)中的存在的SV40最小啟動子元件。然而，此載體不含新霉素抗性基因，因此不為哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)所優(yōu)選。為了產(chǎn)生穩(wěn)定的哺乳動物細(xì)胞系，使用限制酶SalI和NotI將NF-KB/SV40/SEAP盒從上述NF-KB/SEAP載體中移出，并插入含有新霉素抗性的載體。具體而言，在用SalI和NotI將pGFP-1限制性消化后，將NF-KB/SV40/SEAP盒插入pGFP-1(Clontech)，替換GFP基因。一旦創(chuàng)建NF-KB/SV40/SEAP/Neo載體，就根據(jù)實(shí)施例25中描述的方案創(chuàng)建并維持穩(wěn)定的JurkatT-細(xì)胞。類似的，實(shí)施例25還描述了使用這些穩(wěn)定的JurkatT-細(xì)胞來測定融合蛋白的方法。作為陽性對照，向孔H9、H10和H11中加入外源TNFα(0.1、1、10ng)，其中通常觀察到5-10倍的激活。實(shí)施例29鑒定骨髓活性的測定法下面的方案用于通過測定融合蛋白是否增殖和/或分化骨髓細(xì)胞來評估本發(fā)明清蛋白融合蛋白的骨髓活性。使用實(shí)施例24中產(chǎn)生的GAS/SEAP/Neo構(gòu)建物來評估骨髓細(xì)胞活性。如此，增加SEAP活性的倍數(shù)指示激活Jaks-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的能力。此測定法中使用的骨髓細(xì)胞是U937，一種前單核細(xì)胞細(xì)胞系，雖然也可以使用TF-1、HL60或KG1。為了用實(shí)施例24中產(chǎn)生的GAS/SEAP/Neo構(gòu)建物瞬時轉(zhuǎn)染U937細(xì)胞，使用DEAE-Dextran方法(Kharbanda等人，1994，CellGrowth&Differentiation5259-265)。首先，收集2×107個U937細(xì)胞并用PBS清洗。U937細(xì)胞通常在補(bǔ)充有100U/ml青霉素和100mg/ml鏈霉素的含有10％加熱滅活的胎牛血清(FBS)的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。然后，將細(xì)胞懸浮于1ml含有0.5mg/mlDEAE-Dextran、8μgGAS-SEAP2質(zhì)粒DNA、140mMNaCl、5mMKCl、375μMNa2HPO4.7H2O、1mMMgCl2和675μMCaCl2的20mMTris-HCI(pH7.4)緩沖液中。于37℃保溫45分鐘。用含有10％FBS的RPMI1640培養(yǎng)基清洗細(xì)胞，然后重懸于10ml完全培養(yǎng)基，并于37℃保溫36小時。通過在400μg/mlG418中培養(yǎng)細(xì)胞來獲得GAS-SEAP/U937穩(wěn)定細(xì)胞。使用不含G418的培養(yǎng)基進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，只是每1到2個月細(xì)胞應(yīng)在400μg/mlG418中重新培養(yǎng)幾代。為了測試這些細(xì)胞，收集1×108個細(xì)胞(這足夠用于10個96孔板測定)并用PBS清洗。將細(xì)胞懸浮于200ml上文所述生長培養(yǎng)基，終密度為5×105細(xì)胞/ml。向96孔板的每個孔中加入200μl細(xì)胞(或1×105細(xì)胞/孔)。加入不同濃度的融合蛋白。于37℃保溫48到72小時?？梢允褂?00U/ml干擾素γ作為陽性對照，已知它激活U937細(xì)胞。在陽性對照孔中通常觀察到超過30倍的誘導(dǎo)。根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法和/或?qū)嵤├?5中描述的方案對上清液進(jìn)行SEAP測定。實(shí)施例30鑒定小分子濃度和膜通透性改變的測定法已知配體與受體的結(jié)合改變小分子，諸如鈣、鉀、鈉和pH的胞內(nèi)水平，并改變膜電位。這些改變可以在鑒定與特定細(xì)胞的受體結(jié)合的融合蛋白的測定法中進(jìn)行測量。雖然下面的方案描述的是鈣的測定法，但是此方案可以容易的修改以檢測鉀、鈉、pH、膜電位或可由熒光探針檢測的任何其它小分子的改變。下面的測定法使用熒光成像讀板儀(“FLIPR”)來測量結(jié)合小分子的熒光分子(MolecularProbes)的改變。顯然，可以使用檢測小分子的任何熒光分子，替代本文使用的鈣熒光分子，fluo-4(MolecularProbes，Inc.；產(chǎn)品目錄編號F-14202)。對于粘附細(xì)胞，將細(xì)胞以10,000-20,000細(xì)胞/孔接種具有清澈底部的Co-star黑色96孔板。將平皿在CO2培養(yǎng)箱中保溫20小時。將粘附細(xì)胞在Biotek洗滌器中用200μlHBSS(Hank氏平衡鹽溶液)清洗兩次，在最終的清洗后留下100μl緩沖液。在10％pluronicacidDMSO中制備1mg/mlfluo-4儲液。為了使細(xì)胞負(fù)載fluo-4，向每個孔中加入50μl12μg/mlfluo-4。將平皿在CO2培養(yǎng)箱中于37℃保溫60分鐘。將平皿在Biotek洗滌器中用HBSS清洗4次，并留下100μl緩沖液。對于非粘附細(xì)胞，將細(xì)胞從培養(yǎng)基中旋轉(zhuǎn)沉淀。將細(xì)胞在50ml圓錐管中的HBSS中重懸至2-5×106個細(xì)胞/ml。向每毫升細(xì)胞懸浮液中加入4μl1mg/mlfluo-4溶于10％pluronicacidDMSO的溶液。然后將管在37℃水浴中放置30-60分鐘。細(xì)胞用HBSS清洗兩次，重懸至1×106細(xì)胞/ml，并分配到微量培養(yǎng)板中，100μl/孔。將平皿以1000rpm離心5分鐘。然后將平皿在DenleyCellWash中用200μl清洗一次，隨后通過吸取步驟達(dá)到100μl的終體積。對于基于非細(xì)胞的測定法，每個孔含有熒光分子，諸如fluo-4。向孔中加入本發(fā)明的融合蛋白，并檢測熒光的改變。為了測量胞內(nèi)鈣的熒光，F(xiàn)LIPR設(shè)定如下參數(shù)(1)系統(tǒng)增益300-800mW；(2)曝光時間0.4秒；(3)相機(jī)F/停止F/2；(4)激發(fā)488nm；(5)發(fā)射530nm；和(6)加樣50μl。530nm的發(fā)射增加指示由本發(fā)明清蛋白融合蛋白或本發(fā)明清蛋白融合蛋白誘導(dǎo)的分子引起胞外信號事件，它導(dǎo)致胞內(nèi)Ca++濃度增加。實(shí)施例31鑒定酪氨酸激酶活性的測定法蛋白質(zhì)酪氨酸激酶(PTK)代表一組多樣的跨膜和細(xì)胞質(zhì)激酶。在受體蛋白質(zhì)酪氨酸激酶(RPTK)組中有多種促有絲分裂和代謝的生長因子的受體，包括PDGF、FGF、EGF、NGF、HGF和胰島素受體亞家族。另外，存在RPTK大家族，其相應(yīng)的配體是未知的。RPTK的配體主要包括分泌的小蛋白質(zhì)，但也包括膜結(jié)合的和胞外的基質(zhì)蛋白。配體對RPTK的激活牽涉配體介導(dǎo)的受體二聚化，導(dǎo)致受體亞基的轉(zhuǎn)磷酸作用和胞質(zhì)酪氨酸激酶的活化。胞質(zhì)酪氨酸激酶包括與src家族的酪氨酸激酶(如src、yes、Ick、lyn、fyn)有關(guān)的受體和無受體連接的細(xì)胞溶質(zhì)蛋白質(zhì)酪氨酸激酶，諸如Jak家族，其成員介導(dǎo)由細(xì)胞因子受體超家族(如白介素、干擾素、GM-CSF和瘦蛋白)觸發(fā)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。因?yàn)橐阎軌虼龠M(jìn)酪氨酸激酶活性的因子范圍較廣，所以對鑒定本發(fā)明的清蛋白融合蛋白或由本發(fā)明清蛋白融合蛋白誘導(dǎo)的分子是否能夠激活酪氨酸激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是感興趣的。因此，下面的方案設(shè)計(jì)用于鑒定這種能夠激活酪氨酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的分子。以每孔大約25,000個細(xì)胞的密度將靶細(xì)胞(如原代角質(zhì)形成細(xì)胞)接種到購自NalgeNunc(Naperville，IL)的96孔LoprodyneSilentScreen平皿中。平皿通過用100％乙醇漂洗兩個30分鐘進(jìn)行滅菌，用水漂洗，并干燥過夜。一些平皿用100ml細(xì)胞培養(yǎng)級I類膠原(50mg/ml)、明膠(2％)或多聚賴氨酸(50mg/ml)(都可從SigmaChemicals，St.Louis，MO購得)或10％Matrigel(購自BectonDickinson，Bedford，MA)，或牛血清包被2小時，用PBS漂洗，并保存于4℃。為了測定在這些平皿上生長的細(xì)胞，以5,000細(xì)胞/孔接種生長培養(yǎng)基上并在48小時后使用alamarBlue如制造商AlamarBiosciences，Inc.(Sacramento，CA)所述間接測定細(xì)胞的數(shù)量。使用BectonDickinson(Bedford，MA)的Falcon平皿蓋#3071封蓋LoprodyneSilentScreen平皿。FalconMicrotestIII細(xì)胞培養(yǎng)平皿還可用于一些增殖實(shí)驗(yàn)。為了制備提取物，將A431細(xì)胞接種到Loprodyne平皿的尼龍膜上(20,000/200ml/孔)，并在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。通過在無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基中保溫24小時使細(xì)胞靜默(quiesce)。用EGF(60ng/ml)或不同濃度的本發(fā)明清蛋白融合蛋白處理5-20分鐘后，除去培養(yǎng)基，并向每個孔中加入100ml提取緩沖液(20mMHEPESpH7.5、0.15MNaCl、1％TritonX-100、0.1％SDS、2mMNa3VO4、2mMNa4P2O7和從BoeheringerMannheim(Indianapolis，IN)獲得的蛋白酶抑制物混合物(#1836170))，并將平皿在旋轉(zhuǎn)搖床上于4℃晃動5分鐘。然后將平皿置于真空轉(zhuǎn)移裝置中，并使用室內(nèi)真空器使提取物通過每個孔的0.45mm濾膜底過濾。提取物收集到真空裝置底部的96孔捕獲/測定平皿中并立即置于冰上。為了通過離心獲得澄清的提取物，在洗滌劑溶解5分鐘后，取出每個孔的內(nèi)容物并于4℃以16,000xg離心15分鐘。對經(jīng)過過濾的提取物測試?yán)野彼峒っ富钚缘乃?。雖然知道檢測酪氨酸激酶活性的許多方法，本文只描述了其中一種方法。通常，本發(fā)明清蛋白融合蛋白的酪氨酸激酶活性是通過測定其磷酸化特定底物(生物素化的肽)上的酪氨酸殘基的能力來評估的?？捎糜诖四康牡纳锼鼗碾陌≒SK1(對應(yīng)于細(xì)胞分裂激酶cdc2-p34的氨基酸6-20)和PSK2(對應(yīng)于胃泌素的氨基酸1-17)。兩種肽都是多種酪氨酸激酶的底物，且可從BoehringerMannheim獲得。通過按順序添加下列組分建立酪氨酸激酶反應(yīng)。首先，加入10μl5μM生物素化的肽，然后是10μlATP/Mg2+(5mMATP/50mMMgCl2)，然后是10μl5x測定緩沖液(40mM咪唑氫氯化物pH7.3、40mMβ-甘油磷酸、1mMEGTA、100mMMgCl2、5mMMnCl2、0.5mg/mlBSA)，然后是5μl釩酸鈉(1mM)，然后是5μl水。輕輕混和各組分，并將反應(yīng)混合物于30℃預(yù)保溫2分鐘。通過加入10μl對照酶或經(jīng)過過濾的上清液而開始反應(yīng)。隨后加入10μl120mmEDTA來終止酪氨酸激酶測定反應(yīng)，并將反應(yīng)置于冰上。通過將50μl反應(yīng)混合物小樣轉(zhuǎn)移到微量滴定板(MTP)組件中并于37℃保溫20分鐘來測定酪氨酸激酶活性。這使得鏈霉親和素包被的96孔平皿可與生物素化的肽相結(jié)合。用300μl/孔PBS清洗MTP組件4次。然后向每個孔中加入75μl與辣根過氧化物酶綴合的抗磷酸酪氨酸抗體(抗P-Tyr-POD，0.5u/ml)，并于37℃保溫1小時。如上所述洗孔。然后加入100μl過氧化物酶底物溶液(BoehringerMannheim)，并于室溫保溫至少5分鐘(可長達(dá)30分鐘)。使用ELISA讀板儀測量樣品在405nm處的吸光率。使用ELISA讀板儀量化結(jié)合的過氧化物酶活性的水平，并反映酪氨酸激酶活性的水平。實(shí)施例32鑒定磷酸化活性的測定法作為實(shí)施例31中描述的蛋白質(zhì)酪氨酸激酶活性測定法的潛在選擇和/或補(bǔ)充，還可使用檢測主要胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中間物的激活(磷酸化)的測定法。例如，如下所述，一種具體的測定法可檢測Erk-1和Erk-2激酶的酪氨酸磷酸化。然而，其它分子，諸如Raf、JNK、p38MAP、Map激酶的激酶(MEK)、MEK激酶、Src、肌肉特異激酶(MuSK)、IRAK、Tec和Janus以及任何其它磷酸絲氨酸、磷酸酪氨酸或磷酸蘇氨酸分子的磷酸化可通過用這些分子替換下述測定法中的Erk-1或Erk-2來檢測。具體而言，通過將96孔ELISA平皿的孔用0.1ml蛋白G(1μg/ml)于室溫(RT)包被2小時來制備測定平皿。然后經(jīng)平皿用PBS漂洗，并用3％BSA/PBS于室溫封閉1小時。然后將蛋白G平皿用針對Erk-1和Erk-2的2種商品化單克隆抗體(100ng/孔)處理(室溫1小時)(SantaCruzBiotechnology)。(為了檢測其它分子，此步驟可以通過替換檢測任意上述分子的單克隆抗體而容易的修改)用PBS漂洗3-5次后，將平皿保存于4℃直至使用。將A431細(xì)胞以20,000/孔接種96孔Loprodyne濾板，并在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。然后將細(xì)胞在基礎(chǔ)培養(yǎng)基(DMEM)中饑餓培養(yǎng)48小時，然后用EGF(6ng/孔)或不同濃度的本發(fā)明融合蛋白處理5-20分鐘。然后溶解細(xì)胞，并將提取物直接過濾到測定平皿中。與提取物一起于室溫保溫1小時后，將孔再次漂洗。作為陽性對照，使用MAP激酶的商品化制備物(10ng/孔)替換A431提取物。然后將平皿用特異識別Erk-1和Erk-2激酶的磷酸化表位的商品化多克隆(兔)抗體(1μg/ml)處理(室溫1小時)。此抗體通過標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行了生物素化。然后通過在WallacDELFIA儀器(時間分辨熒光)中與銪-鏈霉親合素和銪熒光增強(qiáng)試劑連續(xù)保溫來測量結(jié)合的多克隆抗體。高于背景的熒光信號增加指示由本發(fā)明融合蛋白或本發(fā)明清蛋白融合蛋白誘導(dǎo)的分子產(chǎn)生的磷酸化。實(shí)施例33磷酸化測定法為了測定本發(fā)明清蛋白融合蛋白的磷酸化活性，應(yīng)用美國專利5,958,405中描述的磷酸化測定法(將其引入本文作為參考)。簡要的說，可以通過用γ標(biāo)記的32P-ATP磷酸化蛋白質(zhì)底物并用γ放射性同位素計(jì)數(shù)器測定摻入的放射性來測量磷酸化活性。將本發(fā)明的融合蛋白與蛋白質(zhì)底物、32P-ATP和激酶緩沖液一起保溫。然后通過電泳將摻入底物的32P與游離的32P-ATP分開，對摻入的32P計(jì)數(shù)并與陰性對照比較。高于陰性對照的放射性計(jì)數(shù)指示融合蛋白的磷酸化活性。實(shí)施例34在存在肽配體時檢測本發(fā)明清蛋白融合蛋白的磷酸化活性(活化作用)本領(lǐng)域已知的或本文描述的方法可用于測定本發(fā)明清蛋白融合蛋白的磷酸化活性。測定磷酸化活性的優(yōu)選方法是使用US5,817,471中描述的酪氨酸磷酸化測定法(引入本文作為參考)。實(shí)施例35刺激骨髓CD34+細(xì)胞增殖的測定法此測定法是基于人CD34+在存在造血生長因子時增殖的能力，并評估本發(fā)明融合蛋白刺激CD34+細(xì)胞增殖的能力。先前已經(jīng)證明大多數(shù)成熟的前體將僅應(yīng)答單一信號。更多未成熟的前體需要至少兩種信號以應(yīng)答。因此，為了測試本發(fā)明融合蛋白對多種祖細(xì)胞的造血活性的影響，測定法在存在或不存在造血生長因子的條件下含有指定的本發(fā)明融合蛋白。將分離的細(xì)胞在存在干細(xì)胞因子(SCF)連同測試樣品的條件下培養(yǎng)5天。SCF單獨(dú)對骨髓(BM)細(xì)胞的增殖具有非常有限的效果，它在這種條件中僅作為“生存”因子。然而，在與對這些細(xì)胞顯示刺激效果的任何因子(如IL-3)結(jié)合時，SCF將引起協(xié)同效應(yīng)。因此，如果測試的融合蛋白對造血祖細(xì)胞中具有刺激效果，那么該活性可以容易的檢測。由于正常BM細(xì)胞具有低水平的循環(huán)細(xì)胞(cyclingcells)，因而有可能無法檢測出指定融合蛋白的任何抑制效果。因此，對祖細(xì)胞的抑制效果的測定法優(yōu)選在如下細(xì)胞中進(jìn)行測試，該細(xì)胞首先用SCF+IL+3進(jìn)行體外刺激，然后與要評估抑制該誘導(dǎo)增殖的化合物接觸。簡要的說，使用本領(lǐng)域已知的方法分離CD34+細(xì)胞。將細(xì)胞解凍并重懸于培養(yǎng)基(含1％L-谷氨酰胺的QBSF60無血清培養(yǎng)基(500mI)，QualityBiological，Inc.，Gaithersburg，MD，產(chǎn)品目錄編號160-204-101)中。幾次200xg的溫和離心步驟后，使細(xì)胞休養(yǎng)1小時。將細(xì)胞數(shù)調(diào)至2.5×105細(xì)胞/ml。在此期間，向96孔平皿的外周孔中加入100μl無菌水。在此測定法中能夠用本發(fā)明清蛋白融合蛋白測試的細(xì)胞因子有單獨(dú)的50ng/mlrhSCF(R&DSystems，Minneapolis，MN，產(chǎn)品目錄編號255-SC)及與rhSCF和30ng/mlrhIL-3(R&DSystems，Minneapolis，MN，產(chǎn)品目錄編號203-ML)聯(lián)合。1小時后，將10μl準(zhǔn)備好的細(xì)胞因子、不同濃度的本發(fā)明清蛋白融合蛋白、和20μl稀釋細(xì)胞加入到已經(jīng)存在于孔中的培養(yǎng)基中，使得最終的總體積為100μl。然后將平皿在37℃/5％CO2的培養(yǎng)箱中放置5天。測定法收獲前18個小時，以10μl體積向每孔中加入0.5μCi/孔[3H]胸苷以測定增殖速率。試驗(yàn)通過使用TomtecHarvester96將細(xì)胞從每個96孔平皿收獲到濾墊(filtermat)來終止。收獲后，將濾墊干燥，整理并置于由一個OmniFilter平皿和一個OmniFilter盤組成的OmniFilter組件中。向每個孔中加入60μlMicroscint，并用TopSeal-A強(qiáng)加密封膜密封平皿。在第一個平皿上粘貼一張條形碼15貼紙以用于計(jì)數(shù)。然后將密封的平皿加載，通過PackardTopCount測定放射性水平，并收集打印的數(shù)據(jù)用于分析。放射性水平反映了細(xì)胞增殖的量。在本實(shí)施例中描述的研究測試指定融合蛋白促進(jìn)骨髓CD34+細(xì)胞增殖的活性。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易的修改示例的研究以測試本發(fā)明融合蛋白和多核苷酸(如基因治療)及其激動物和拮抗物的活性。本發(fā)明清蛋白融合蛋白促進(jìn)骨髓CD34+細(xì)胞增殖的能力指示清蛋白融合蛋白和/或與融合蛋白對應(yīng)的多核苷酸對于診斷和治療影響免疫系統(tǒng)和造血作用的疾病是有效的。代表性的用途描述于上文“免疫活性”和“傳染病”部分，以及本文的其它地方。實(shí)施例36胞外基質(zhì)增強(qiáng)的細(xì)胞應(yīng)答(EMECR)的測定法胞外基質(zhì)增強(qiáng)的細(xì)胞應(yīng)答(EMECR)的測定法的目的是評估本發(fā)明融合蛋白在胞外基質(zhì)(ECM)誘導(dǎo)信號的背景下作用于造血干細(xì)胞的能力。細(xì)胞在從周圍微環(huán)境中接收信號的背景下應(yīng)答調(diào)控因子。例如，成纖維細(xì)胞及內(nèi)皮和上皮干細(xì)胞在缺乏來自ECM的信號時無法復(fù)制。造血干細(xì)胞可以在骨髓中進(jìn)行自我更新，但是在體外懸浮培養(yǎng)中無法進(jìn)行。干細(xì)胞在體外進(jìn)行自我更新的能力依賴于它們與基質(zhì)細(xì)胞和ECM蛋白質(zhì)纖連蛋白(fn)的相互作用。細(xì)胞與fn的粘附是由α5.β1和α4.β1整聯(lián)蛋白受體介導(dǎo)的，它們由人和小鼠的造血干細(xì)胞表達(dá)。尚未鑒定出與ECM環(huán)境整合并負(fù)責(zé)刺激干細(xì)胞自我更新的因子。這些因子的發(fā)現(xiàn)在基因治療和骨髓移植應(yīng)用中將是極感興趣的。簡要的說，用fn片段以0.2μg/cm2的包被濃度包被聚苯乙烯未經(jīng)組織培養(yǎng)處理的96孔平皿。在0.2ml無血清培養(yǎng)基中分發(fā)小鼠骨髓細(xì)胞(1,000細(xì)胞/孔)。在存在IL-3(5ng/ml)+SCF(50ng/ml)的條件下培養(yǎng)的細(xì)胞將作為陽性對照，預(yù)計(jì)在此條件下干細(xì)胞很少自我更新但顯著分化。在存在和不存在SCF(5.0ng/ml)的條件下用合適的陰性對照測試本發(fā)明的清蛋白融合蛋白，其中含有本發(fā)明清蛋白融合蛋白的施用組合物的體積占總測定體積的10％。然后通過在低氧環(huán)境(5％CO2、7％O2和88％N2)的組織培養(yǎng)培養(yǎng)箱中保溫7天使分發(fā)的細(xì)胞生長。然后通過測量摻入細(xì)胞DNA的胸苷來測定孔中增殖細(xì)胞的數(shù)量。測定中陽性結(jié)果的證實(shí)需要細(xì)胞的表型鑒定，這可通過放大培養(yǎng)系統(tǒng)的規(guī)模和使用針對細(xì)胞表面抗原的合適抗體試劑和FACScan來進(jìn)行。如果發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的特定融合蛋白是造血祖細(xì)胞的刺激物，那么該融合蛋白以及與該融合蛋白對應(yīng)的多核苷酸可能在例如影響免疫系統(tǒng)和造血作用的疾病的診斷和治療中是有用的。代表性用途描述于上文“免疫活性”和“傳染病”部分，以及本文的其它地方。融合蛋白可能在干細(xì)胞和各種血細(xì)胞譜系的定向祖細(xì)胞的擴(kuò)增，以及各種細(xì)胞類型的分化和/或增殖中也是有用的。此外，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白以及編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸還可用于抑制造血細(xì)胞的增殖和分化，并因此可用于在化療期間保護(hù)骨髓干細(xì)胞免受化療劑的作用。這種抗增殖效果可容許施用更高劑量的化療劑，并因此進(jìn)行更有效的化療處理。此外，本發(fā)明的融合蛋白和編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸還可用于治療和診斷造血相關(guān)紊亂，諸如貧血、全血細(xì)胞減少、白細(xì)胞減少、血小板減少或白血病，因?yàn)榛|(zhì)細(xì)胞在造血譜系細(xì)胞的產(chǎn)生中是重要的。用途包括骨髓細(xì)胞的離體培養(yǎng)、骨髓移植、骨髓重構(gòu)、贅生物的放療或化療。實(shí)施例37人真皮成纖維細(xì)胞和主動脈平滑肌細(xì)胞增殖將本發(fā)明的清蛋白融合蛋白加到正常人真皮成纖維細(xì)胞(NHDF)和人主動脈平滑肌細(xì)胞(AoSMC)的培養(yǎng)物中，每份樣品進(jìn)行兩項(xiàng)共測定(co-assays)。第一項(xiàng)測定檢查融合蛋白對正常人真皮成纖維細(xì)胞(NHDF)或主動脈平滑肌細(xì)胞(AoSMC)增殖的效果。成纖維細(xì)胞或平滑肌細(xì)胞的異常生長是幾個病理過程的一部分，包括纖維化和再狹窄。第二項(xiàng)測定檢查NHDF和SMC的IL6生成。IL6生成表明功能激活。激活細(xì)胞將增加多種細(xì)胞因子和其它因子的生成，可導(dǎo)致促炎或免疫調(diào)節(jié)后果。在有和沒有共TNFa刺激的條件下進(jìn)行測定，以檢查共刺激或抑制活性。簡要的說，在第1天，96孔黑平皿設(shè)置為100μl培養(yǎng)基中的1000細(xì)胞/孔(NHDF)或2000細(xì)胞/孔(AoSMC)。NHDF培養(yǎng)基含有CloneticsFB基礎(chǔ)培養(yǎng)基、1mg/mlhFGF、5mg/ml胰島素、50mg/ml慶大霉素、2％FBS，而AoSMC培養(yǎng)基含有CloneticsSM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、0.5g/mlhEGF、5mg/ml胰島素、1μg/mlhFGF、50mg/ml慶大霉素、50μg/ml兩性霉素B、5％FBS。于37℃保溫至少4-5小時后，吸出培養(yǎng)基，替換為生長停滯培養(yǎng)基(Growtharrestmedia)。NHDF的生長停滯培養(yǎng)基含有成纖維細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基、50mg/ml慶大霉素、2％FBS，而AoSMC的生長停滯培養(yǎng)基含有SM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、50mg/ml慶大霉素、50μg/ml兩性霉素B、0.4％FBS。于37℃保溫直至第2天。在第2天，設(shè)計(jì)本發(fā)明清蛋白融合蛋白的連續(xù)稀釋物和模板，使得它們總是包括培養(yǎng)基對照和已知蛋白質(zhì)對照。對于刺激和抑制兩種實(shí)驗(yàn)，蛋白質(zhì)都在生長停滯培養(yǎng)基中稀釋。對于抑制實(shí)驗(yàn)，加入TNFa至終濃度2ng/ml(NHDF)或5ng/ml(AoSMC)的。加入1/3體積的含有對照或本發(fā)明清蛋白融合蛋白的培養(yǎng)基，并于37℃/5％CO2保溫直至第5天。從每個孔轉(zhuǎn)移60μl到另一個有標(biāo)記的96孔平皿中，用平皿密封物封蓋，并于4℃保存直到第6天(用于IL6ELISA)。向細(xì)胞培養(yǎng)平皿中剩余的100μl，無菌加入相當(dāng)于培養(yǎng)物體積10％(10μl)的AlamarBlue。將平皿放回培養(yǎng)箱3-4個小時。然后使用CytoFluor測量530nm處激發(fā)和590nm處發(fā)射的熒光。這產(chǎn)生了生長促進(jìn)/抑制數(shù)據(jù)。在第5天，如下進(jìn)行IL6ELISA，用50-100μl/孔在PBSpH7.4中稀釋的抗人IL6單克隆抗體包被96孔板，并于室溫保溫過夜。在第6天，向水槽中倒空平皿，并在紙巾上吸干。用4％BSA制備含有PBS的測定緩沖液。用200μl/孔PBS中的PierceSuperBlock封閉緩沖液將平皿封閉1-2小時，然后用清洗緩沖液(PBS、0.05％Tween-20)清洗平皿。將平皿在紙巾上吸干。然后加入50μl/孔于0.5mg/ml稀釋的抗人IL-6單克隆、生物素標(biāo)記的抗體。將IL-6儲液在培養(yǎng)基中稀釋(30、10、3、1、0.3、0ng/ml)。向平皿的頂部行加入雙份樣品。封蓋平皿，在搖床上于室溫保溫2小時。將平皿用清洗緩沖液清洗，并在紙巾上吸干。在測定緩沖液中1∶1000稀釋EU標(biāo)記的鏈霉親合素，并加入100μl/孔。封蓋平皿并于室溫保溫1小時。將平皿再次用清洗緩沖液清洗，并在紙巾上吸干。加入100μl/孔的增強(qiáng)液。搖動5分鐘。在WallacDELFIA熒光計(jì)上對平皿讀數(shù)。將每次測定中三份樣品的讀數(shù)制表并平均。此測定中的陽性結(jié)果說明AoSMC細(xì)胞增殖且清蛋白融合蛋白可能涉及真皮成纖維細(xì)胞增殖和/或平滑肌細(xì)胞增殖。陽性結(jié)果還暗示融合蛋白和編碼清蛋白融合蛋白的多核苷酸的許多潛在用途。例如，炎癥和免疫應(yīng)答、傷口愈合和血管發(fā)生，正如本說明書全文所詳述的。具體的說，融合蛋白可用于傷口愈合和皮膚再生，以及促進(jìn)血管和淋巴管二者的脈管發(fā)生。脈管的生長可用于治療例如心血管疾病。此外，在此測定法中顯示拮抗活性的融合蛋白可能可通過作為抗血管劑(例如抗血管發(fā)成)有效的用于治療涉及血管發(fā)生的疾病、紊亂和/或狀況。這些疾病、紊亂和/或狀況是本領(lǐng)域已知的和/或本文描述的，諸如例如惡性腫瘤、實(shí)體瘤、良性腫瘤，例如血管瘤、聽神經(jīng)瘤、神經(jīng)纖維瘤、沙眼、和膿性肉芽腫；動脈粥樣硬化斑塊；眼的血管發(fā)生性疾病，例如糖尿病性視網(wǎng)膜病、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病、黃斑變性、角膜移植排斥、新生血管性青光眼、晶狀體后纖維組織增生、發(fā)紅、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤、眼的葡萄膜炎和翼狀胬肉(異常血管生長)；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；銀屑??；傷口愈合遲緩；子宮內(nèi)膜異位；血管新生(vasculogenesis)；肉芽形成；肥厚性瘢痕(瘢痕疙瘩)；不連接骨折；硬皮??；沙眼；血管粘附；心肌血管發(fā)生；冠狀動脈側(cè)枝；腦側(cè)枝；動靜脈畸形；缺血性四肢血管發(fā)生(ischemiclimbangiogenesis)；奧-韋二氏綜合癥；斑塊新血管形成；毛細(xì)管擴(kuò)張；血友病性關(guān)節(jié)；血管纖維瘤；纖維肌肉發(fā)育異常；傷口肉芽形成；克羅恩氏??；和動脈粥樣硬化。此外，在此測定法中作為拮抗物的清蛋白融合蛋白可用于治療本領(lǐng)域已知的和/或本文描述的抗過度增殖性疾病和/或抗炎。實(shí)施例38內(nèi)皮細(xì)胞上的細(xì)胞粘附分子(CAM)表達(dá)淋巴細(xì)胞向炎癥和血管發(fā)生區(qū)域的募集涉及淋巴細(xì)胞和血管內(nèi)皮上的細(xì)胞表面粘附分子(CAM)之間的特異受體-配體相互作用。粘附過程在正常和病理?xiàng)l件中都遵循多步級聯(lián)，它涉及內(nèi)皮細(xì)胞(EC)上胞內(nèi)粘附分子-1(ICAM-1)、血管細(xì)胞粘附分子-1(VCAM-1)、和內(nèi)皮白細(xì)胞粘附分子-1(E-選擇蛋白)的表達(dá)。這些分子和其它分子在血管內(nèi)皮上的表達(dá)決定了白細(xì)胞可以在炎癥反應(yīng)期間粘附于局部血管系統(tǒng)并外滲到局部組織中的效率。細(xì)胞因子和生長因子的局部集中參與這些CAM的表達(dá)調(diào)控。簡要的說，將內(nèi)皮細(xì)胞(如人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC))在標(biāo)準(zhǔn)96孔平皿中培養(yǎng)至匯合，從細(xì)胞除去生長培養(yǎng)基，并替換為100μl199培養(yǎng)基(10％胎牛血清(FBS))。將測試樣品(含有本發(fā)明的清蛋白融合蛋白)和陽性或陰性對照一式三份加到平皿中(10μl體積)。然后將平皿于37℃保溫5小時(選擇蛋白和整聯(lián)蛋白表達(dá))或24小時(僅整聯(lián)蛋白表達(dá))。將平皿抽吸以除去培養(yǎng)基，并向每個孔中加入100μl0.1％低聚甲醛-PBS(具有Ca++和Mg++)。將平皿于4℃保持30分鐘。從孔中除去固定液，將孔用PBS(+Ca、Mg)+0.5％BSA清洗1次并排干。向測試和對照孔中加入10μl經(jīng)過稀釋的一抗。抗ICAM-1-生物素、抗VCAM-1-生物素和抗E-選擇蛋白-生物素以10μg/ml的濃度使用(0.1mg/ml抗體儲液的1∶10稀釋液)。將細(xì)胞在潮濕環(huán)境中于37℃保溫30分鐘。將孔PBS(+Ca、Mg)+0.5％BSA清洗3次。向每個孔中加入20μl經(jīng)過稀釋的Extr親合素-堿性磷酸酶(1∶5,000稀釋，在本文中稱為使用稀釋液)，并于37℃保溫30分鐘。將孔用PBS(+Ca、Mg)+0.5％BSA清洗三次。每5ml甘氨酸緩沖液(pH10.4)中溶解1片對硝基苯酚磷酸酯pNPP。100μl氨基乙酸緩沖液中的pNPP底物將加入到每個檢驗(yàn)孔。由Extr親合素-堿性磷酸酶溶于甘氨酸緩沖液的使用稀釋液制備一式三份的標(biāo)準(zhǔn)孔1∶5,000(100)＞10-05＞10-1＞10-1.5。每個稀釋度取5μl加入到一式三份的孔中，如此得到的每個孔中的AP含量為5.50ng、1.74ng、0.55ng、0.18ng。然后向每個標(biāo)準(zhǔn)孔中加入100μlpNNP試劑。將平皿于37℃保溫4小時。向所有孔中加入50μl體積的3MNaOH。在讀板儀上于405nm對平皿讀數(shù)，對僅裝有甘氨酸緩沖液的空白孔使用背景扣除選項(xiàng)。此外，將模板設(shè)定為顯示每個標(biāo)準(zhǔn)孔中AP-綴合物的濃度[5.50ng；1.74ng；0.55ng；0.18ng]。結(jié)果將顯示為每個樣品中結(jié)合的AP-綴合物的量。實(shí)施例39AlamarBlue內(nèi)皮細(xì)胞增殖測定法此測定法可用于定量測定由蛋白質(zhì)介導(dǎo)的對bFGF誘導(dǎo)的牛淋巴內(nèi)皮細(xì)胞(LEC)、牛主動脈內(nèi)皮細(xì)胞(BAEC)或人微血管子宮肌層細(xì)胞(UTMEC)增殖的抑制。此測定法摻入基于代謝活性檢測的熒光生長指示劑。在添加10ng/mlbFGF作為內(nèi)皮細(xì)胞刺激來源的EGM-2MV中預(yù)備標(biāo)準(zhǔn)AlamarBlue增殖測定。通過生長培養(yǎng)基和細(xì)胞濃度的微小改變，此測定法可將用于各種內(nèi)皮細(xì)胞。將待測試蛋白質(zhì)批次的稀釋液適當(dāng)稀釋。使用不含bEGF的無血清培養(yǎng)基作為無刺激對照，并包括制管張素或TSP-1作為已知的抑制對照。簡要的說，將LEC、BAEC或UTMEC在生長培養(yǎng)基中以5000至2000細(xì)胞/孔的密度接種到96孔平皿中，并于37℃放置過夜。細(xì)胞保溫過夜后，除去生長培養(yǎng)基，并替換為GIBCOEC-SFM。將細(xì)胞在一式三份孔中用本發(fā)明清蛋白融合蛋白或?qū)φ盏鞍踪|(zhì)樣品的適當(dāng)稀釋液(在SFM中制備)進(jìn)行處理，并添加bFGF至10ng/ml的濃度。一旦細(xì)胞用樣品進(jìn)行了處理，將平皿放回37℃培養(yǎng)箱中3天。3天后，向每個孔中加入10mlalamarblue儲液(Biosource，產(chǎn)品目錄編號DAL1100)，并將平皿放回37℃培養(yǎng)箱中4個小時。然后使用CytoFluor熒光讀數(shù)器在530nm激發(fā)和590nm發(fā)射對平皿讀數(shù)。以相對熒光單位記錄直接輸出。Alamarblue是氧化-還原指示劑，熒光和顏色改變都反映由細(xì)胞生長導(dǎo)致的生長培養(yǎng)基的化學(xué)還原。當(dāng)細(xì)胞在培養(yǎng)基中生長時，先天的代謝活性導(dǎo)致緊鄰環(huán)境的化學(xué)還原。涉及生長的還原反應(yīng)導(dǎo)致指示劑從氧化(無熒光的藍(lán)色)形式變成還原(有熒光的紅色)形式(即受到促進(jìn)的增殖將產(chǎn)生更強(qiáng)的信號，而受到抑制的增殖將產(chǎn)生更弱的信號，總信號與細(xì)胞的總數(shù)以及它們的代謝活性成比例)。用單獨(dú)的饑餓培養(yǎng)基觀察活性的背景水平。將這與從陽性對照樣品(生長培養(yǎng)基中的bFGF)和蛋白質(zhì)稀釋液中觀察到的輸出進(jìn)行比較。實(shí)施例40混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)的抑制的檢測此測定法可用于檢測和評估本發(fā)明融合蛋白對混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)的抑制。MLR的抑制可能是由于對細(xì)胞增殖和活力的直接影響、相互作用細(xì)胞上共刺激分子的調(diào)節(jié)、淋巴細(xì)胞和附屬細(xì)胞之間粘聯(lián)的調(diào)節(jié)、佐細(xì)胞對細(xì)胞因子生成的調(diào)節(jié)。由于此測定法中所用的外周血單核級分包括T、B和自然殺傷淋巴細(xì)胞以及單核細(xì)胞和樹突細(xì)胞，因而抑制MLR的清蛋白融合蛋白可針對多種細(xì)胞。將發(fā)現(xiàn)抑制MLR的本發(fā)明清蛋白融合蛋白可在與淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞激活或增殖有關(guān)的疾病中找到應(yīng)用。這些包括但不限于諸如下列疾病，哮喘、關(guān)節(jié)炎、糖尿病、炎性皮膚狀況、銀屑病、濕疹、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化癥、腎小球性腎炎、炎性腸病、克羅恩氏病、潰瘍性結(jié)腸炎、動脈硬化、硬化、移植物抗宿主疾病、宿主抗移植物疾病、肝炎、白血病和淋巴瘤。簡要的說，使用淋巴細(xì)胞分離培養(yǎng)基(LSM_，密度1.0770g/ml，OrganonTeknikaCorporation，WestChester，PA)通過密度梯度離心純化來自人供體的PBMC。將來自兩個供體的PBMS在補(bǔ)充有10％FCS和2mM谷氨酰胺的RPMI-1640(LifeTechnologies，GrandIsland，NY)中調(diào)至2×106細(xì)胞/ml。將來自第三供體的PBMC調(diào)至2×105細(xì)胞/ml。將50μl來自每個供體的PBMC加到96孔圓底微量滴定平皿的孔中。將融合蛋白測試材料的稀釋液(50μl)一式三份加到微量滴定孔中。加入測試樣品(目的蛋白質(zhì))至最終1∶4稀釋度；加入rhulL-2(R&DSystems，Minneapolis，MN，產(chǎn)品目錄編號202-IL)至終濃度1μg/ml；加入抗CD4mAb(R&DSystems，克隆34930.11，產(chǎn)品目錄編號MAB379)至終濃度10μg/ml。將細(xì)胞于37℃在5％CO2中培養(yǎng)7-8天，在培養(yǎng)的最后16個小時向孔中加入1μC[3H]胸苷。收集細(xì)胞，并用PackardTopCount測定胸苷摻入。數(shù)據(jù)表述為三份測定的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。在分開的實(shí)驗(yàn)中篩選目的融合蛋白的樣本，并與抑制淋巴細(xì)胞增殖的陰性對照處理，抗CD4mAb以及增強(qiáng)淋巴細(xì)胞增殖的陽性對照處理，IL-2(重組材料或上清液)進(jìn)行比較。實(shí)施例41蛋白酶活性的測定法下面的測定法可用于評估本發(fā)明清蛋白融合蛋白的蛋白酶活性。明膠和酪蛋白酶譜法(zymography)本質(zhì)上按照記載進(jìn)行(Heusen等人，Anal.Biochem.102196-202，1980；Wilson等人，JournalofUrology149653-658，1993)。將樣品在含有1％明膠或酪蛋白的10％聚丙烯酰胺/0.1％SDS凝膠上進(jìn)行電泳，在2.5％triton中于室溫浸泡1小時，并在0.1M甘氨酸pH8.3中于37℃浸泡5-16小時。在酰胺黑中染色后，蛋白質(zhì)水解區(qū)域顯示為藍(lán)黑背景中的清澈區(qū)。使用胰蛋白酶(SigmaT8642)作為陽性對照。還可以通過監(jiān)測n-a-苯甲酰-L-精氨酸乙酯(BAEE)(SigmaB-4500)的切割來測定蛋白酶活性。在(25mMNaPO4、1mMEDTA和1mMBAEE)，pH7.5中設(shè)立反應(yīng)。加入樣品，并在BeckmanDU-6分光光度計(jì)上以時間驅(qū)動模式監(jiān)測260nm處吸光度的改變。使用胰蛋白酶作為陽性對照。通過測量280nm處的吸光度或使用Folin法的比色滴定，基于由酪蛋白或血紅蛋白釋放可溶肽的其它測定法如Bergmeyer等人，MethodsofEnzymaticAnalysis5，1984)中所述進(jìn)行。其它測定法牽涉顯色底物的溶解(Ward，AppliedScience251-317，1983)。實(shí)施例42鑒定絲氨酸蛋白酶底物特異性本領(lǐng)域已知的或本文描述的方法可用于測定具有絲氨酸蛋白酶活性的本發(fā)明清蛋白融合蛋白的底物特異性。測定底物特異性的優(yōu)選方法是如GB2324529(完整引入本文)中所述使用定位掃描合成組合庫(positionalscanningsyntheticcombinatoriallibraries)。實(shí)施例43配體結(jié)合測定法下面的測定法可用于評估本發(fā)明清蛋白融合蛋白的配體結(jié)合活性。配體結(jié)合測定法提供確認(rèn)受體藥理學(xué)的直接方法，并且適于高通量形式。將純化的本發(fā)明清蛋白融合蛋白的配體放射性標(biāo)記成高比活(50-2000Ci/mmol)以用于結(jié)合研究。隨后確定放射性標(biāo)記的過程沒有消減配體對融合蛋白的活性。優(yōu)化緩沖液、離子、pH和其它調(diào)節(jié)物諸如核苷酸的測定條件，從而對膜和全細(xì)胞多肽來源二者都建立可行的信噪比。對于這些測定法，特異的多肽結(jié)合定義為總的相關(guān)放射性減去存在過量未標(biāo)記競爭性配體時測得的放射性。如果可能，使用超過一種競爭性配體來定義殘余非特異性結(jié)合。實(shí)施例44爪蟾卵母細(xì)胞中的功能測定法根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序使用RNA聚合酶在體外合成編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的線性化質(zhì)粒模板的加帽RNA轉(zhuǎn)錄物。將體外轉(zhuǎn)錄物以0.2mg/ml的終濃度懸浮于水中。從成年雌蟾蜍中取出卵巢葉，獲得V階段的去濾泡(defolliculated)卵母細(xì)胞，并使用顯微注射裝置以50nl推注(bolus)注射RNA轉(zhuǎn)錄物(10ng/卵母細(xì)胞)。使用兩個電極電壓鉗來測量個別爪蟾卵母細(xì)胞應(yīng)答融合蛋白和多肽激動劑暴露的電流。在無Ca2+Barth氏培養(yǎng)基中于室溫進(jìn)行記錄。爪蟾系統(tǒng)可用于篩選已知配體和用于激活配體的組織/細(xì)胞提取物。實(shí)施例45微生理功能測定測定法(MicrophysiometricAssay)極其多種第二信使系統(tǒng)的激活導(dǎo)致少量酸從細(xì)胞中擠出。形成的酸主要是推動胞內(nèi)信號過程所需的代謝活性增加的結(jié)果。細(xì)胞周圍培養(yǎng)基中pH的改變是很小的，但是CYTOSENSOR微生理功能測定器(MolecularDevicesLtd.，MenloPark，Calif.)能檢測到。CYTOSENSOR因此能夠檢測本發(fā)明清蛋白融合蛋白激活與能量利用胞內(nèi)信號途徑相關(guān)聯(lián)的第二信使的能力。實(shí)施例46提取物/細(xì)胞上清液篩選存在多種仍然還沒有相關(guān)激活配體(激動劑)的哺乳動物受體。因而，這些受體的活性配體可能不包括在迄今鑒定的配體庫中。因此，本發(fā)明的清蛋白融合蛋白還可針對組織提取物進(jìn)行功能篩選(使用鈣、cAMP、微生理功能測定器、卵母細(xì)胞電生理學(xué)等功能篩選)以鑒定本發(fā)明清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分和/或清蛋白蛋白質(zhì)部分的天然配體。產(chǎn)生陽性功能應(yīng)答的提取物可以繼續(xù)亞分級(subfractionate)直至分離和鑒定得到活性配體。實(shí)施例47ATP結(jié)合試驗(yàn)下面的測定法可用于評估本發(fā)明融合蛋白的ATP結(jié)合活性。本發(fā)明清蛋白融合蛋白的ATP結(jié)合活性可使用美國專利5,858,7l9中描述的ATP結(jié)合測定法進(jìn)行檢測，將其完整引入本文作為參考。簡要的說，在競爭性測定法中通過8-疊氮-ATP標(biāo)記的光親和力測量與本發(fā)明清蛋白融合蛋白結(jié)合的ATP。將含有1mg/mlABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的反應(yīng)混合液與不同濃度的ATP，或不能水解的ATP類似物腺嘌呤-5′-亞氨二磷酸一起于4℃保溫10分鐘。加入8-疊氮-ATP(SigmaChem.Corp.，St.Louis，MO.)加8-疊氮-ATP(32P-ATP)(5mCi/μmol，ICN，Irvine，CA.)的混合物至100μM的終濃度，并將0.5ml小樣置于冰上的瓷制點(diǎn)滴板的孔中。平皿用短波254nmUV燈在離平皿2.5cm的距離進(jìn)行照射兩個一分鐘的時間間隔，其間有一個一分鐘冷卻間隔。加入終濃度2mM的二硫蘇糖醇終止反應(yīng)。將保溫液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，干燥，并放射自顯影。切下與本發(fā)明清蛋白融合蛋白對應(yīng)的蛋白質(zhì)條帶，并測量放射性。隨著ATP或腺嘌呤-5′-亞氨二磷酸漸增而降低的放射性提供了對融合蛋白的ATP親和力的測量。實(shí)施例48與本發(fā)明清蛋白融合蛋白相互作用的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白質(zhì)的鑒定本發(fā)明的清蛋白融合蛋白可以作為研究工具，用于鑒定、表征和純化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑蛋白質(zhì)或受體蛋白質(zhì)。簡要的說，經(jīng)過標(biāo)記的本發(fā)明融合蛋白可作為試劑，用于純化與其相互作用的分子。在親和純化的一個實(shí)施方案中，將本發(fā)明的清蛋白融合蛋白與層析柱共價偶聯(lián)。使源自假定靶細(xì)胞諸如癌組織的無細(xì)胞提取物流過柱子，而具有合適親和力的分子與清蛋白融合蛋白結(jié)合。由柱子回收蛋白質(zhì)復(fù)合物，解離，并對回收的分子進(jìn)行N端蛋白質(zhì)測序。此氨基酸序列隨后用于鑒定捕獲到的分子或設(shè)計(jì)用于從合適cDNA庫中克隆相應(yīng)基因的簡并寡核苷酸探針。實(shí)施例49IL-6生物測定法本領(lǐng)域知道多種用于測試本發(fā)明清蛋白融合蛋白的增殖效果的測定法。例如，這樣一種測定法是Marz等所述的IL-6生物測定法(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.953251-56，1998，將其引入本文作為參考)。于37℃保溫68小時后，為了測量存活細(xì)胞的數(shù)量，加入四唑鹽噻唑藍(lán)(MTT)并于37℃再保溫4小時。用SDS溶解B9細(xì)胞，并于570nm測量光密度。加入了含有IL-6(陽性)和無細(xì)胞因子(陰性)的對照。(簡要的說，將IL-6依賴性B9鼠細(xì)胞用無IL-6培養(yǎng)基清洗3次，并以每孔5,000細(xì)胞的濃度以50μl分配到平皿中，并加入50μl本發(fā)明的融合蛋白。)測試樣品(含有本發(fā)明的清蛋白融合蛋白)中相對于陰性對照增強(qiáng)的增殖表明由融合蛋白介導(dǎo)的增殖效果。實(shí)施例50雞胚神經(jīng)元存活的支持為了測試本發(fā)明的清蛋白融合蛋白是否支持交感神經(jīng)元細(xì)胞的存活，可利用Senaldi等人的雞胚神經(jīng)元存活測定法(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9611458-63，1998，將其引入本文作為參考)。簡要的說，從雞胚分離運(yùn)動和交感神經(jīng)元，分別重懸于L15培養(yǎng)基(含10％FCS、葡萄糖、亞硒酸鈉、孕酮、伴清蛋白、腐胺和胰島素；LifeTechnologies，Rockville，MD.)和Dulbecco氏改進(jìn)的Eagles氏培養(yǎng)基(含10％FCS、葡萄糖、青霉素和25mMHepes緩沖液(pH7.2)；LifeTechnologies，Rockville，MD.)，并在存在不同濃度的純化的本發(fā)明融合蛋白時于37℃在5％CO2中保溫，以及缺乏任何細(xì)胞因子的陰性對照。3天后，通過評估細(xì)胞形態(tài)學(xué)和使用Mosmann的比色測定法(Mosmann，T.，J.Immunol.Methods6555-63，1983)測定神經(jīng)元存活。與缺乏細(xì)胞因子的對照相比增強(qiáng)的神經(jīng)元細(xì)胞存活表明清蛋白融合蛋白增強(qiáng)神經(jīng)元細(xì)胞存活的能力。實(shí)施例51磷酸酶活性的測定法下面的測定法可用于評估本發(fā)明清蛋白融合蛋白的絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶(PTPase)活性。為了測定絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶(PTPase)活性，可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員廣泛知道的測定法。例如，本發(fā)明清蛋白融合蛋白的絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶(PSPase)活性可以使用NewEnglandBiolabs，Inc的PSPase測定試劑盒進(jìn)行測量。在存在[32P]ATP時用cAMP依賴性蛋白激酶在絲氨酸和蘇氨酸殘基上磷酸化髓磷脂堿性蛋白(MyBP)，PSPase的底物。隨后通過測量32P-標(biāo)記MyBP釋放的無機(jī)磷酸鹽來測定蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶活性。實(shí)施例52絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶與其它蛋白質(zhì)的相互作用具有絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶活性的本發(fā)明融合蛋白(例如根據(jù)實(shí)施例51的測定)例如可作為研究工具，用于鑒定、表征和純化其它相互作用的蛋白質(zhì)或受體蛋白質(zhì)，或其它信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑蛋白質(zhì)。簡要的說，將經(jīng)過標(biāo)記的本發(fā)明融合蛋白可作為試劑，用于純化與其相互作用的分子。在親和純化的一個實(shí)施方案中，將本發(fā)明的清蛋白融合蛋白與層析柱共價偶聯(lián)。使來自推定靶細(xì)胞諸如神經(jīng)或肝細(xì)胞的無細(xì)胞提取物流過柱子，而具有合適親和力的分子與融合蛋白結(jié)合。從柱上回收融合蛋白-復(fù)合物，解離，并將回收的分子進(jìn)行N端蛋白質(zhì)測序。此氨基酸序列隨后用于鑒定捕獲到的分子或設(shè)計(jì)用于從合適cDNA庫中克隆相應(yīng)基因的簡并寡核苷酸探針。實(shí)施例53類肝素酶(heparanase)活性的測定法本領(lǐng)域知道可用于測定本發(fā)明清蛋白融合蛋白的類肝素酶活性的多種測定法。在一個實(shí)例中，本發(fā)明清蛋白融合蛋白的類肝素酶活性如Vlodavsky等人所述進(jìn)行測定(Vlodavsky等人，Nat.Med.5793-802，1999)。簡要的說，將細(xì)胞溶解產(chǎn)物、條件培養(yǎng)基、完整細(xì)胞(每個35mm碟1×106細(xì)胞)、細(xì)胞培養(yǎng)上清液或純化的融合蛋白于37℃pH6.2-6.6與35S標(biāo)記的ESC或源自峰I蛋白聚糖的可溶ECM一起保溫18小時。將保溫培養(yǎng)基離心，并在SepharoseCL-6B柱(0.9×30cm)上通過凝膠過濾分析上清液。用PBS洗脫級分，并測量它們的放射性。硫酸類肝素側(cè)鏈的降解片段在0.5＜Kav＜0.8(峰II)時從Sepharose6B上洗脫。每個實(shí)驗(yàn)進(jìn)行至少三次。如Vlodavsky等人所述，與“峰II”對應(yīng)的降解片段表明本發(fā)明清蛋白融合蛋白在切割硫酸類肝素中的活性。實(shí)施例54生物分子的固定此實(shí)施例提供了用于在非宿主細(xì)胞脂雙層構(gòu)建物中穩(wěn)定本發(fā)明清蛋白融合蛋白的方法(參見例如Bieri等人，NatureBiotech171105-1108，1999，完整引入本文作為參考)，它可適應(yīng)上述各種功能測定法中本發(fā)明融合蛋白的研究。簡要的說，將用于生物素化的碳水化合物特異性化學(xué)法用于將生物素標(biāo)簽限制于本發(fā)明的清蛋白融合蛋白，從而導(dǎo)致固定后統(tǒng)一的取向。將洗過的膜中50μM本發(fā)明清蛋白融合蛋白的溶液與20mMNaIO4和1.5mg/ml(4mM)BACH或2mg/ml(7.5mM)生物素-酰肼于室溫保溫1小時(反應(yīng)體積，150μl)。然后將樣品于4℃首先透析(PierceSlidealizerCassett，10kDa截留；PierceChemicalCo.，Rockford，IL)5小時，每個小時更換緩沖液，最后用500ml緩沖液R(0.15MNaCl、1mMMgCl2、10mM磷酸鈉pH7)透析12小時。僅在加入比色杯前，將樣品用緩沖液ROG50(補(bǔ)充有50mM辛基葡糖苷的緩沖液R)1∶5稀釋。實(shí)施例55金屬蛋白酶活性的測定法金屬蛋白酶是肽水解酶，它利用金屬離子諸如Zn2+作為催化機(jī)制。本發(fā)明清蛋白融合蛋白的金屬蛋白酶活性可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法來測定。提供了下面的示例性方法α-2-巨球蛋白的蛋白水解為了證實(shí)蛋白酶活性，將純化的本發(fā)明融合蛋白與底物α-2-巨球蛋白(0.2單位/ml；BoehringerMannheim，Germany)在1x測定緩沖液(50mMHEPESpH7.5、0.2MNaCl、10mMCaCl2、25μMZnCl2和0.05％Brij-35)中混合，并于37℃保溫1-5天。使用胰蛋白酶作為陽性對照。陰性對照在測定緩沖液中僅含有α-2-巨球蛋白。收集樣品，在含有5％2-巰基乙醇的SDS-PAGE樣品緩沖液中煮沸5分鐘，然后加載到8％SDS-聚丙烯酰胺凝膠上。電泳后，通過銀染使蛋白質(zhì)顯影。通過與陰性對照相比更低分子量條帶的出現(xiàn)證明了蛋白水解。金屬蛋白酶的抑制物對α-2-巨球蛋白的蛋白水解的抑制已知的金屬蛋白酶抑制物(金屬螯合劑(EDTA、EGTA和HgCl2)、肽金屬蛋白酶抑制物(TIMP-1和TIMP-2)以及商品化小分子MMP抑制物)也可用于表征本發(fā)明清蛋白融合蛋白的蛋白水解活性。可以使用的三種合成MMP抑制物是MMP抑制物I，[IC50＝1.0μM對MMP-1和MMP-8；IC50＝30μM對MMP-9；IC50＝150μM對MMP-3]；MMP-3(溶基質(zhì)蛋白酶-1)抑制物I，[IC50＝5μM對MMP-3]，和MMP-3抑制物II，[Ki＝130nM對MMP-3]；抑制物可從Calbiochem獲得，產(chǎn)品目錄編號分別是444250、444218和444225。簡要的說，將不同濃度的小分子MMP抑制物與純化的本發(fā)明融合蛋白(50μg/ml)在22.9μl1xHEPES緩沖液(50mMHEPESpH7.5、0.2MNaCl、10mMCaCl2、25μMZnCl2和0.05％Brij-35)中混合，并于室溫(24℃)保溫2小時，然后加入7.1μl底物α-2-巨球蛋白(0.2單位/ml)，并于37℃保溫20小時。加入4x樣品緩沖液來終止反應(yīng)，并立刻煮沸5分鐘。SDS-PAGE后，通過銀染顯現(xiàn)蛋白質(zhì)條帶。合成熒光肽底物切割測定法具有已證實(shí)金屬蛋白酶活性的本發(fā)明融合蛋白的底物特異性可以使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)來測定，諸如使用合成熒光肽底物(購自BACHEMBioscienceInc)。測試底物包括M-1985、M-2225、M-2105、M-2110和M-2255。前4種是MMP底物，最后一種是腫瘤壞死因子-α(TNF-α)轉(zhuǎn)化酶(TACE)的底物。這些底物優(yōu)選在1∶1的二甲基亞砜(DMSO)和水中制備。儲液是50-500μM。使用配有恒溫水浴的PerkinElmerLS50B發(fā)光分光計(jì)進(jìn)行熒光測定。激發(fā)λ是328nm，發(fā)射λ是393nm。簡要的說，如下進(jìn)行測定，將176μl1xHEPES緩沖液(0.2MNaCl、10mMCaCl2、0.05％Brij-35和50mMHEPESpH7.5)和20μl底物溶液(50μM)于25℃保溫15分鐘，然后向測定比色杯中加入20μl純化的本發(fā)明融合蛋白。底物的終濃度為1μM。對初始水解速率監(jiān)測30分鐘。實(shí)施例56NOD小鼠中糖尿病的發(fā)生雌性NOD(無肥胖糖尿病)小鼠的特征是以與在人類中所發(fā)現(xiàn)的類似的病程顯示IDDM，雖然疾病在雌性中比在雄性NOD小鼠更明顯。在下文中，除非另有說明，術(shù)語“NOD小鼠”表示雌性NOD小鼠。NOD小鼠具有慢性自身免疫病引起的β細(xì)胞逐漸破壞。因此，NOD小鼠生命開始時具有正常血糖或正常的血糖水平。然而到約15-16周齡時，NOD小鼠開始變成高血糖，這表明它們的大多數(shù)胰腺β細(xì)胞的破壞和相應(yīng)的胰腺無能力產(chǎn)生足夠的胰島素。因此，疾病的起因和進(jìn)展都與人IDDM患者類似?？梢栽诖菩訬OD/LtJ小鼠(可從TheJacksonLaboratory，BarHarbor，Me.購得)中評估免疫方案功效的體內(nèi)測定法。文獻(xiàn)中報道80％的雌性小鼠在24周齡時形成糖尿病，胰島炎的發(fā)作開始于6-8周齡之間。NOD小鼠是近交系，且高度響應(yīng)多種免疫調(diào)控策略。成年NOD小鼠(6-8周齡)具有20-25g的平均重量。這些小鼠可以是未經(jīng)處理的(對照)，用本發(fā)明的治療劑(如本發(fā)明的清蛋白融合蛋白及其片段和變體)單獨(dú)或結(jié)合上文所述其它治療性化合物處理的。這些不同療法對糖尿病進(jìn)展的效果可以如下測量在14周齡時，可根據(jù)葡萄糖耐受確定雌性NOD小鼠的表型。葡萄糖耐受可以通過腹膜內(nèi)葡萄糖耐受測試法(IPGTT)來測量。簡要的說，在腹膜內(nèi)注射葡萄糖(1g/kg體重)后的第0分鐘和第60分鐘從眶旁血管叢取血。正常耐受定義為第0分鐘的血漿葡萄糖低于144mg％，或第60分鐘低于160mg％。血糖水平是用GlucometerElite裝置測定的?；诖吮硇头治觯蓪游锓峙涞讲煌脑囼?yàn)組。具體的說，可以將具有升高的血糖水平的動物指定到葡萄糖耐受受損組。小鼠可以隨意進(jìn)食，并供應(yīng)酸化水(pH2.3)。耐受和不耐受葡萄糖的小鼠可以進(jìn)一步細(xì)分為對照組、本發(fā)明清蛋白融合蛋白組、和清蛋白融合蛋白/治療性化合物組合組。對照組中的小鼠可每天接受載體的腹膜內(nèi)注射，每周6次。清蛋白融合組中的小鼠可每天接受載體中的本發(fā)明治療劑(如本發(fā)明的清蛋白融合蛋白及其片段和變體)的腹膜內(nèi)注射，每周6次。清蛋白融合蛋白/治療性化合物組合組中小鼠可如上所述接受清蛋白融合蛋白和治療性化合物組合二者。NOD小鼠的尿糖水平可以用Labstix(BayerDiagnostics，Hampshire，England)兩周測定一次。體重和液體攝入也兩周測定一次。在連續(xù)兩次測定中出現(xiàn)糖尿之后確定糖尿病的發(fā)作。處理10周后，可以進(jìn)行附加的IPGTT，并在第二天處死動物。經(jīng)過10周療程后，耐受和不耐受葡萄糖組中的對照動物分別以60％和86％的比例形成糖尿病(見美國專利號5,866,546，Gross等人)。因此，如果沒有進(jìn)行干預(yù)，即使在最初耐受葡萄糖的NOD小鼠中也出現(xiàn)高比例的糖尿病?？梢酝ㄟ^測量治療前后NOD小鼠中的血糖水平來證實(shí)結(jié)果。在描述的所有組中耐受和不耐受葡萄糖的兩種小鼠的血糖水平都如上所述測量。在可選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的治療劑(例如作為SEQIDNOY公開的特定融合蛋白及其片段和變體)可以使用光譜法分析來測量，并在注射前將適當(dāng)數(shù)量的蛋白質(zhì)重懸于每劑量50μl磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。相隔一周的兩次注射可皮下施用于每只小鼠的背部皮膚下。監(jiān)測可以在免疫前兩個分開的時期進(jìn)行，且可以在治療期間每周進(jìn)行并在其后繼續(xù)。可每周測試尿糖(Keto-Diastix.RTM.；MilesInc.，Kankakee，Ill.)，并可對糖尿小鼠檢查血清葡萄糖(ExacTech.RTM.，MediSense，Inc.，Waltham，Mass.)。當(dāng)禁食糖血癥高于2.5g/L時診斷為糖尿病。實(shí)施例57NOD小鼠的組織學(xué)檢查NOD小鼠組織樣品的組織學(xué)檢查可以證明本發(fā)明組合物和/或本發(fā)明組合物與其它糖尿病治療劑的組合增加胰腺中β細(xì)胞相對濃度的能力。實(shí)驗(yàn)方法如下來自實(shí)施例56的小鼠可以在治療階段結(jié)束時處死，并從胰腺中取出組織樣品。可將樣品在溶于0.9％鹽水的10％甲醛中固定，并包蠟。兩組5個連續(xù)5μm切片可以以150μm的切割間隔切割以用于免疫標(biāo)記。切片可以為胰島素(豚鼠抗胰島素抗血清1∶1000稀釋液，ICNThamesU.K.)和高血糖素(兔抗胰高血糖素抗血清1∶2000稀釋液)進(jìn)行免疫標(biāo)記，并用綴合了過氧化物酶的抗豚鼠(Dako，HighWycombe，U.K.)或綴合了過氧化物酶的抗兔血清(1∶50稀釋液，Dako)進(jìn)行檢測。本發(fā)明的組合物對于β細(xì)胞的可見質(zhì)量(visiblemass)可具有或不具有與其對耐受和不耐受葡萄糖的動物中糖尿病臨床證明同樣強(qiáng)的效果。實(shí)施例58NIDDM的體內(nèi)小鼠模型來自JacksonLaboratory(BarHarbor，ME)的雄性C57BL/6J小鼠可在3周齡時獲得，并飼喂常規(guī)食物或富含脂肪(35.5％wt/wt；Bioserv.Frenchtown，NJ)或果糖(60％wt/wt；HarlanTeklad，Madison，W1)的食物。常規(guī)食物由4.5％wt/wt脂肪、23％wt/wt蛋白質(zhì)、31.9％wt/wt淀粉、3.7％wt/wt果糖和5.3％wt/wt纖維組成。高脂肪(豬油)食物由35.5％wt/wt脂肪、20％wt/wt蛋白質(zhì)、36.4％wt/wt淀粉、0.0％wt/wt果糖和0.1％wt/wt纖維組成。高果糖食物由5％wt/wt脂肪、20％wt/wt蛋白質(zhì)、0.0％wt/wt淀粉、60％wt/wt果糖和9.4％wt/wt纖維組成。小鼠在22±3℃溫度、50+20％濕度的12小時光照(上午6點(diǎn)到下午6點(diǎn))/黑暗循環(huán)的控制室中飼養(yǎng)，每籠不超過5只(Luo等人，1998，Metabolism47(6)663-8，“Nongeneticmousemodelsofnon-insulin-dependentdiabetesmellitus”；Larsen等人，Diabetes50(11)2530-9，2001，“Systemicadministrationofthelong-actingGLP-1derivativeNN2211induceslastingandreversibleweightlossinbothnormalandobeserats”)。給予相應(yīng)的食物3周后，小鼠可腹膜內(nèi)注射100mg/kg體重的鏈唑霉素，“STZ”(Sigma，St.Louis，MO)或載體(0.05mol/L檸檬酸pH4.5)，并在接下來的4周保持同樣的食物。在不禁食的條件下，通過剪去尾部末端在STZ后1、2和4周取血。將樣品用于測量不禁食血漿的葡萄糖和胰島素濃度。每周記錄體重和食物攝取。為了直接測定高脂肪食物對胰島素促進(jìn)葡萄糖控制能力的影響，可在上文所述7周時期結(jié)束時對三組小鼠開始實(shí)驗(yàn)，即脂肪喂養(yǎng)小鼠、用載體注射的食物喂養(yǎng)小鼠、和用STZ注射的脂肪喂養(yǎng)小鼠。小鼠可在實(shí)驗(yàn)前禁食4小時。在第一組實(shí)驗(yàn)中，可通過吸入甲氧氟烷(Pitman-Moor，Mundelein，IL)麻醉小鼠。常規(guī)胰島素(Sigma)可通過尾部靜脈進(jìn)行靜脈內(nèi)注射([IV]0.1U/kg體重)，并在注射后3、6、9、12和15分鐘從不同尾部靜脈取血?？蓪@些樣品測定血漿葡萄糖濃度，并使用WinNonlin(ScientificConsulting，Apex，NC)，一種藥動學(xué)/藥效學(xué)軟件程序計(jì)算血漿中葡萄糖消失的半衰期(t1/2)。在第二組實(shí)驗(yàn)中，小鼠可通過腹膜內(nèi)戊巴比妥鈉(Sigma)麻醉。打開腹腔，暴露主要的腹部靜脈，并插入24號IV導(dǎo)管(Johnson-JohnsonMedical，Arlington，TX)。將導(dǎo)管固定在腹部靜脈附近的肌肉組織上，在注射器連接的底部上切開，掛上預(yù)先注滿的PE50塑料管，它繼而連接裝有灌注液的注射器。然后縫合腹腔。通過這種方法，將不存在血液從身體的較低部位回流的障礙。給小鼠以10μl/min灌注體積連續(xù)灌注葡萄糖(24.1mg/kg/min)和胰島素(10mU/kg/min)。為了測量血漿葡萄糖和胰島素濃度，可在灌注開始后90、105、120和135分鐘采集眶后血液樣品(每個70μl)。將這4個樣品的平均值用于估算每個動物的穩(wěn)定狀態(tài)血漿葡萄糖(SSPG)和胰島素(SSPI)濃度。最后，用于評估本申請的清蛋白融合蛋白，治療性組合物，在單獨(dú)施用或聯(lián)合任何一種或多種為治療糖尿病而列出的治療性藥物時降低血漿葡萄糖能力的實(shí)驗(yàn)可在下列兩組用STZ注射的“NIDDM”小鼠模型中進(jìn)行(1)脂肪喂養(yǎng)的C57BL/6J，和(2)果糖喂養(yǎng)的C57BL/6J。用于這些研究的小鼠的血漿葡萄糖濃度在255到555mg/dL的范圍內(nèi)。小鼠隨機(jī)指定用載體、或是用本發(fā)明的清蛋白融合治療劑單獨(dú)或聯(lián)合任何一種或多種為治療糖尿病而列出的治療性藥物進(jìn)行治療?？墒┯每偣踩齻€劑量?？稍谑状畏幹昂妥詈笠淮畏幹?小時采集尾部靜脈血液樣品用于測量血漿葡萄糖濃度。血漿葡萄糖濃度可使用來自Sigma的葡萄糖診斷試劑盒(SigmaNo.315)，一種酶比色測定法來測定。血漿胰島素水平可使用來自LincoResearch的小鼠胰島素RIA試劑盒(#RI-13K；St.Charles，MO)來測定。實(shí)施例59確定涉及胰島素作用的體外H4IIe-SEAP報道分子測定法各種H4IIe報道基因H4IIe/rMEP-SEAP分離自大鼠的蘋果酸酶(rMEP)含有胰島素途徑中的PPAR-γ元件。將此報道分子構(gòu)建物穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到肝H4IIe細(xì)胞系中。H4IIe/SREBP-SEAP固醇調(diào)控元件結(jié)合蛋白(SREBP-1c)是一種轉(zhuǎn)錄因子，它作用于多種胰島素應(yīng)答基因，例如脂肪酸合成酶(FAS)的啟動子，并在成纖維細(xì)胞、脂細(xì)胞和肝細(xì)胞中調(diào)節(jié)脂肪酸代謝中關(guān)鍵基因的表達(dá)。SREBP-1c也稱為脂肪細(xì)胞決定和分化因子1(ADD-1)，認(rèn)為是脂肪細(xì)胞中胰島素影響基因表達(dá)的主要中介物。它的活性受到胰島素、固醇和葡萄糖水平的調(diào)節(jié)。將此報道分子構(gòu)建物穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到肝H4IIe細(xì)胞系中。H4IIe/FAS-SEAP脂肪酸合成酶報道分子構(gòu)建物含有最小的SREBP響應(yīng)性FAS啟動子。將此報道分子構(gòu)建物穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到肝H4IIe細(xì)胞系中。H4IIe/PEPCK-SEAP磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)啟動子是調(diào)節(jié)PECK活性的PEPCK基因轉(zhuǎn)錄的主要激素調(diào)控位點(diǎn)。PEPCK催化肝臟糖異生中的關(guān)鍵和限速步驟，因此必須小心控制從而將血糖水平維持在正常限度內(nèi)。將此報道分子構(gòu)建物穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到肝H4IIe細(xì)胞系中。也可以將這些報道分子構(gòu)建物穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到3T3-L1成纖維細(xì)胞和L6成肌細(xì)胞中。然后如先前實(shí)施例13中所述使這些穩(wěn)定細(xì)胞系分化成3T3-L1脂肪細(xì)胞和L6肌管。然后可以將分化的細(xì)胞系用于下文所述SEAP測定法。生長和測定培養(yǎng)基生長培養(yǎng)基含有10％胎牛血清(FBS)、10％小牛血清、1％NEAA、1x青霉素/鏈霉素、和0.75mg/mlG418(用于H4IIe/rFAS-SEAP和H4IIe/SREBP-SEAP)或0.50mg/mlG418(用于H4IIe/rMEP-SEAP)。對于H4IIe/PEPCK-SEAP，生長培養(yǎng)基由10％FBS、1％青霉素/鏈霉素、15mMHEPES緩沖鹽水和0.50mg/mlG418組成。對于H4IIe/rFAS-SEAP、H4IIe/SREBP-SEAP、H4IIe/rMEP-SEAP報道基因，測定培養(yǎng)基由低葡萄糖DMEM培養(yǎng)基(LifeTechnologies)、1％NEAA、1x青霉素/鏈霉素組成。H4IIe/PEPCK-SEAP報道基因的測定法培養(yǎng)基由0.1％FBS、1％青霉素/鏈霉素、和15mMHEPES緩沖鹽水組成。方法將96孔平皿以75,000細(xì)胞/孔在100μl/孔生長培養(yǎng)基中接種，直到對數(shù)生長期的細(xì)胞變成貼壁的。通過將生長培養(yǎng)基替換為200μl/孔測定培養(yǎng)基，將細(xì)胞饑餓培養(yǎng)48小時。(對于H4IIe/PEPCK-SEAP細(xì)胞，以100μl/孔加入含有0.5μM地塞米松的測定培養(yǎng)基，并保溫大約20小時)。隨后將測定培養(yǎng)基替換為100μl/孔新鮮的測定培養(yǎng)基，并向孔中加入從表達(dá)本發(fā)明治療劑(如本發(fā)明的清蛋白融合蛋白及其片段和變體)的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系獲得的細(xì)胞上清液的50μl小樣。使用來自空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的上清液作為陰性對照。向孔中添加10nM和/或100nM胰島素作為陽性對照。保溫48小時后，收獲條件培養(yǎng)基，并測量SEAP活性(Phospha-LightSystemprotocol，Tropix#BP2500)。簡要的說，將樣品在稀釋緩沖液中1∶4稀釋，并于65℃保溫30分鐘以滅活內(nèi)源非胎盤形式的SEAP。將稀釋樣品的50μl小樣與50μlSEAP測定緩沖液混合，后者含有對非胎盤SEAP同工酶有活性的抑制物混合物，并再保溫5分鐘。向混合液中加入在Emerald發(fā)光增強(qiáng)劑中1∶20稀釋的CSPD化學(xué)發(fā)光底物的50μl小樣，并保溫15-20分鐘。將平皿在Dynex平皿光度計(jì)中進(jìn)行讀數(shù)。實(shí)施例60轉(zhuǎn)基因動物本發(fā)明的清蛋白融合蛋白也可在轉(zhuǎn)基因動物中表達(dá)。任何物種的動物，包括但不限于小鼠、大鼠、兔子、倉鼠、豚鼠、豬、微型豬、山羊、綿羊、牛和非人靈長類，如狒狒、猴子和猩猩都可用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物。在特定的實(shí)施方案中，使用本文所描述的或本領(lǐng)域其它途徑知道的技術(shù)在人中表達(dá)本發(fā)明的融合蛋白，作為基因治療方案的一部分。本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)都可用于將編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸導(dǎo)入動物以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物的建立者系(founderlines)。這樣的技術(shù)包括但不限于前核顯微注射(Paterson等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.40691-698，1994；Carver等人，Biotechnology(NY)111263-1270，1993；Wright等人，Biotechnology(NY)9830-834，1991；及Hoppe等人，美國專利號4,873,191，1989)；逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移至生殖系(VanderPutten等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA826148-6152，1985)、胚泡或胚胎；胚胎干細(xì)胞中的基因靶向(Thompson等人，Cell56313-321，1989)；細(xì)胞或胚胎的電穿孔(Lo，1983，Mol.Cell.Biol.31803-1814，1983)；使用基因槍的本發(fā)明多核苷酸的導(dǎo)入(參見例如Ulmer等人，Science2591745，1993)；將核酸構(gòu)建物導(dǎo)入胚胎多能干細(xì)胞并將干細(xì)胞轉(zhuǎn)移回胚泡；及精子介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移(Lavitrano等人，Cell57717-723，1989)；等。這些技術(shù)的綜述參見Gordon，“TransgenicAnimals”，Intl.Rev.Cytol.115171-229，1989)，將其完整引入本文作為參考?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的任何技術(shù)來產(chǎn)生含有編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸的轉(zhuǎn)基因克隆，例如將來自培養(yǎng)的胚胎、胎兒或誘導(dǎo)成靜止的成體細(xì)胞的核核轉(zhuǎn)移到去核的卵母細(xì)胞中(Campell等人，Nature38064-66，1996；Wilmut等人，Nature385810-813，1997)。本發(fā)明提供了在其所有細(xì)胞中攜帶編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸的轉(zhuǎn)基因動物，以及在其一些但非所有細(xì)胞中攜帶這些核苷酸的動物，即嵌合動物或嵌合體。轉(zhuǎn)基因可作為單一轉(zhuǎn)基因或作為多拷貝例如多聯(lián)體，如頭對頭串聯(lián)或頭對尾串聯(lián)而整合。根據(jù)例如Lasko等人的教導(dǎo)，也可以將轉(zhuǎn)基因選擇性導(dǎo)入特定細(xì)胞類型并在其中激活(Lasko等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA896232-6236，1992)。這種細(xì)胞類型特異性激活所需的調(diào)控序列將取決于具體的目的細(xì)胞類型，而且對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。當(dāng)期望編碼本發(fā)明融合蛋白的多核苷酸整合到與本發(fā)明融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分或清蛋白部分對應(yīng)的內(nèi)源基因的染色體位置時，基因打靶是優(yōu)選的。簡要的說，在使用這樣的技術(shù)時，將含有一些與內(nèi)源基因同源的核苷酸序列的載體設(shè)計(jì)用于通過與染色體序列的同源重組整合到內(nèi)源基因的核苷酸序列中并破壞它的功能。根據(jù)例如Gu等人的教導(dǎo)，也可以將轉(zhuǎn)基因選擇性導(dǎo)入特定細(xì)胞類型，從而僅在該細(xì)胞類型中滅活內(nèi)源基因(Gu等人，Science265103-106，1994)。這種細(xì)胞類型特異性滅活所需的調(diào)控序列將取決于具體的目的細(xì)胞類型，而且對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。一旦產(chǎn)生了轉(zhuǎn)基因動物，可利用標(biāo)準(zhǔn)減少來測定重組基因的表達(dá)。通過Southern印跡分析或PCR技術(shù)分析動物組織來證實(shí)已經(jīng)發(fā)生了編碼本發(fā)明融合蛋白的多核苷酸的整合，由此完成初步篩選。還可使用下列技術(shù)來評估轉(zhuǎn)基因動物的組織中編碼本發(fā)明融合蛋白的多核苷酸的mRNA表達(dá)水平，包括但不限于從動物中獲得的組織樣品的Northern印跡分析、原位雜交分析和逆轉(zhuǎn)錄PCR(rt-PCR)。表達(dá)融合蛋白的組織的樣品還可以使用對融合蛋白特異的抗體進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)或免疫組織化學(xué)評估。一旦產(chǎn)生了建立者動物，可以使它們交配、近交、遠(yuǎn)交或雜交以產(chǎn)生特殊動物的群體。這樣的交配策略的例子包括但不限于具有超過一個整合位點(diǎn)的建立者動物的遠(yuǎn)交，以建立隔離系(separatelines)；隔離系的近交，以產(chǎn)生由于每個轉(zhuǎn)基因的附加表達(dá)的效果而以更高水平表達(dá)轉(zhuǎn)基因的復(fù)合轉(zhuǎn)基因動物；雜合轉(zhuǎn)基因動物的雜交，以產(chǎn)生在指定整合位點(diǎn)純合的動物，從而增加表達(dá)和消除通過DNA分析篩選動物的需要；隔離純合系的雜交，以產(chǎn)生復(fù)合雜合或純合系；及交配，以將轉(zhuǎn)基因(即編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸)置于適于目的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷莫?dú)特背景。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物的用途包括但不限于可用于在詳細(xì)說明本發(fā)明融合蛋白和本發(fā)明融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)和/或清蛋白組分的生物學(xué)功能、研究與異常表達(dá)有關(guān)的狀況和/或疾病、以及篩選有效改善這些狀況和/或紊亂的化合物的動物模型系統(tǒng)。實(shí)施例61使用基因治療的治療方法-回體(exvivo)基因治療的一種方法將能夠表達(dá)本發(fā)明清蛋白融合蛋白的成纖維細(xì)胞移植到患者身上。通常，通過皮膚活組織檢查從受試者獲得成纖維細(xì)胞。將如此獲得的組織置于組織培養(yǎng)基中，并分為小塊。將小塊組織置于組織培養(yǎng)燒瓶的濕表面上，每個燒瓶中放置大約十塊。將燒瓶上下顛倒，密閉，并于室溫放置過夜。于室溫放置24小時后，將燒瓶倒轉(zhuǎn)，而組織塊仍然固定在燒瓶底部，加入新鮮培養(yǎng)基(如含10％FBS、青霉素和鏈霉素的Ham氏F12培養(yǎng)基)。然后將燒瓶于37℃保溫大約一周。此時，加入新鮮培養(yǎng)基，隨后每幾天進(jìn)行更換。額外培養(yǎng)2周后，出現(xiàn)成纖維細(xì)胞單層。將細(xì)胞單層用胰蛋白酶消化，并放大規(guī)模至更大的燒瓶。將側(cè)翼為Moloney鼠肉瘤病毒的長末端重復(fù)序列的pMV-7(Kirschmeier，P.T.等人，DNA7219-25，1988)用EcoRI和HindIII消化，然后用小牛腸磷酸酶處理。將線性載體在瓊脂糖凝膠上分級，并使用玻璃珠純化。編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)產(chǎn)生，采用與其5’和3’端序列對應(yīng)的PCR引物進(jìn)行擴(kuò)增，如果需要任選具有合適的限制性位點(diǎn)和起始/終止密碼子。優(yōu)選的是，5’引物含有EcoRI位點(diǎn)，而3’引物含有HindIII位點(diǎn)。將等量的Moloney鼠肉瘤病毒線性主鏈和擴(kuò)增得到的EcoRI和HindIII片段在存在T4DNA連接酶時加到一起。在適于兩種片段連接的條件下保持如此得到的混合物。然后將連接混合物用于轉(zhuǎn)化細(xì)菌HB101，隨后涂布在含有卡那霉素的瓊脂上以證實(shí)載體中正確插入了目的基因。將雙嗜性pA317或GP+am12包裝細(xì)胞在含10％小牛血清(CS)、青霉素和鏈霉素的Dulbecco氏改良的Eagles氏培養(yǎng)基(DMEM)中在組織培養(yǎng)中培養(yǎng)至匯合密度。然后向培養(yǎng)基中加入含有基因的MSV載體，用載體轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝細(xì)胞。包裝細(xì)胞現(xiàn)在產(chǎn)生含有基因的感染性病毒顆粒(包裝細(xì)胞現(xiàn)在稱為生產(chǎn)細(xì)胞)。向轉(zhuǎn)導(dǎo)生產(chǎn)細(xì)胞中加入新鮮培養(yǎng)基，隨后從匯合的生產(chǎn)細(xì)胞的10cm平皿收獲培養(yǎng)基。使含有感染性病毒顆粒的用過的培養(yǎng)基通過微孔過濾器過濾以除去脫落的生產(chǎn)細(xì)胞，然后將此培養(yǎng)基用于感染成纖維細(xì)胞。從成纖維細(xì)胞的亞匯合平皿取出培養(yǎng)基，并更換成來自生產(chǎn)細(xì)胞的培養(yǎng)基。取出此培養(yǎng)基，并更換成新鮮培養(yǎng)基。如果病毒的滴度高，那么事實(shí)上所有成纖維細(xì)胞都將受到感染，而不需要進(jìn)行選擇。如果滴度很低，那么必須使用具有選擇標(biāo)記諸如neo或his的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。一旦有效感染了成纖維細(xì)胞，分析成纖維細(xì)胞以測定是否產(chǎn)生清蛋白融合蛋白。然后將經(jīng)過改造的成纖維細(xì)胞單獨(dú)或在cytodex3微載體珠上生長至匯合后移植到宿主上。實(shí)施例62使用基因治療的治療方法-體內(nèi)本發(fā)明的另一個方面是使用體內(nèi)基因療法來治療紊亂、疾病和狀況?；蛑委煼椒ㄉ婕皩⒕幋a本發(fā)明清蛋白融合蛋白的裸露核酸(DNA、RNA以及反義DNA或RNA)序列導(dǎo)入動物。編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可以與啟動子或者由靶組織表達(dá)多肽所必需的任何其它基因元件可操作連接(即相連)。這樣的基因治療和投遞技術(shù)及方法是本領(lǐng)域已知的，見例如WO90/11092、WO98/11779；美國申請?zhí)?693622、5705151、5580859；Tabata等人，Cardiovasc.Res.35(3)470-479，1997；Chao等人，Pharmacol.Res.35(6)517-522，1997；Wolff，Neuromuscul.Disord.7(5)314-318，1997；Schwartz等人，GeneTher.3(5)405-411，1996；Tsurumi等人，Circulation94(12)3281-3290，1996(引入本文作為參考)。多核苷酸構(gòu)建物可通過將可注射物質(zhì)投遞至動物細(xì)胞中的任何方法來投遞，諸如注射至組織(心、肌肉、皮膚、肺、肝、腸等)胞間隙。多核苷酸構(gòu)建物可以在制藥學(xué)可接受液體或含水載體中投遞。術(shù)語“裸露的”多核苷酸、DNA或RNA指序列游離于輔助、促進(jìn)或加速進(jìn)入細(xì)胞的任何投遞載體，包括病毒序列、病毒顆粒、脂質(zhì)體制劑、脂轉(zhuǎn)染或沉淀試劑等。然而，編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸也可以在可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法制備的脂質(zhì)體制劑中投遞(諸如FelgnerP.L.等人，1995，Ann.NYAcad.Sci.772126-139和AbdallahB.等人，1995，Biol.Cell85(1)1-7中所教導(dǎo)的)。用于基因治療方法的多核苷酸載體構(gòu)建物優(yōu)選為既不會整合到宿主基因組中也不含允許復(fù)制的序列的構(gòu)建物?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員知道的任何強(qiáng)啟動子來驅(qū)動DNA的表達(dá)。與其它基因治療技術(shù)不同，將裸落的核酸序列導(dǎo)入靶細(xì)胞的一個主要優(yōu)點(diǎn)是細(xì)胞中多核苷酸合成的短暫性質(zhì)。研究表明可以將非復(fù)制DNA序列導(dǎo)入細(xì)胞，從而在可長達(dá)6個月的期間提供期望多肽的生成。可以將多核苷酸構(gòu)建物投遞至動物的組織胞間隙，包括肌肉、皮膚、腦、肺、肝、脾、骨髓、胸腺、心、淋巴、血液、骨、軟骨、胰、腎、膽囊、胃、腸、睪丸、卵巢、子宮、直腸、神經(jīng)系統(tǒng)、眼、腺、和結(jié)締組織。組織胞間隙包括細(xì)胞間液、器官組織的網(wǎng)狀纖維間的粘多糖層、管壁或室壁中的彈性纖維、纖維組織的膠原纖維、或者納入肌細(xì)胞的結(jié)締組織或骨隙中的相同基質(zhì)。由循環(huán)血漿和淋巴管道的淋巴液占據(jù)的空間也類似。由于下面討論的原因優(yōu)選投遞至肌肉組織胞間隙。它們可以通過注射方便的投遞至包含這些細(xì)胞的組織。它們優(yōu)選投遞至持久的、不分裂的已分化細(xì)胞并在其中表達(dá)，盡管投遞和表達(dá)可以在未分化或者分化較不完全的細(xì)胞，諸如例如血液的干細(xì)胞或皮膚成纖維細(xì)胞中完成。在體內(nèi)肌肉細(xì)胞在它們攝取和表達(dá)多核苷酸的能力方面特別勝任。對于裸露多核苷酸注射，DNA或RNA的有效劑量將在約0.05g/kg體重至約50mg/kg體重的范圍內(nèi)。優(yōu)選的是，劑量將是約0.005mg/kg至約20mg/kg且更優(yōu)選約0.05mg/kg至約5mg/kg。當(dāng)然，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將領(lǐng)會，這個劑量將隨著注射的組織部位而變化。核酸序列的適當(dāng)且有效的劑量可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易的確定，而且可能取決于治療的狀況和施藥途徑。優(yōu)選的施藥途徑是通過腸胃外注射途徑至組織胞間隙中。然而，也可以使用其它腸胃外途徑，諸如氣霧劑吸入，特別適用于投遞至肺或支氣管組織、喉或鼻粘膜。此外，裸露多核苷酸構(gòu)建物可在血管成形術(shù)過程中通過程序中使用的導(dǎo)管投遞至動脈。體內(nèi)肌肉注射多核苷酸的服藥反應(yīng)效果如下測定。依照常規(guī)重組DNA方法制備用于生成編碼本發(fā)明多肽的mRNA的合適模板DNA。模板DNA，可能為環(huán)形的或線性的，或是作為裸露DNA使用或是與脂質(zhì)體復(fù)合。隨后給小鼠的四頭肌注射不同量的模板DNA。五至六周齡的雌性和雄性Balb/C小鼠通過腹膜內(nèi)注射0.3ml2.5％阿佛丁來麻醉。在前大腿上做一1.5cm的切口，直接暴露四頭肌。模板DNA在0.1ml載體中用1cc注射器通過27號針以一分鐘注射，從肌肉末梢插入部位向膝蓋約0.5cm并且約0.2cm深。為了將來的定位，在注射部位上縫合，并且皮膚用不銹鋼夾閉合。在適當(dāng)?shù)谋貢r間(例如7天)后，通過切下整個四頭肌來制備肌肉提取物。對個別四頭肌的每五個15μm橫向切片為蛋白質(zhì)表達(dá)進(jìn)行組織學(xué)染色。融合蛋白表達(dá)的時間過程可以相似形式完成，只是不同小鼠的四頭肌在不同時間采集。注射后肌肉中DNA的持久性可由從注射小鼠和對照小鼠制備總細(xì)胞DNA和HIRT上清液的Southern印跡分析來測定。小鼠中上述實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可用于外推合適的劑量以及在人和其它動物中使用裸露DNA的其它治療參數(shù)。實(shí)施例63本發(fā)明融合蛋白的生物學(xué)效果星形細(xì)胞和神經(jīng)元測定法可以對本發(fā)明的清蛋白融合蛋白測試在促進(jìn)皮層神經(jīng)元細(xì)胞的存活、神經(jīng)突向外長出、或表型分化中的活性以及誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白免疫陽性細(xì)胞，星形細(xì)胞增殖的能力。為生物測定法選擇皮層細(xì)胞是基于皮層結(jié)構(gòu)中FGF-1和FGF-2的普遍表達(dá)以及先前報道的因FGF-2處理引起的皮層神經(jīng)元存活增強(qiáng)。例如，胸苷摻入測定法可用于闡明本發(fā)明清蛋白融合蛋白對這些細(xì)胞的活性。此外，先前描述FGF-2(基礎(chǔ)FGF)在體外對皮層或海馬神經(jīng)元的生物學(xué)效果的報道已經(jīng)證實(shí)神經(jīng)元存活和神經(jīng)突向外長出二者的增加(Walicke等人，“Fibroblastgrowthfactorpromotessurvivalofdissociatedhippocampalneuronsandenhancesneuriteextension”，Proc.Nntl.Acad.Sci.USA833012-3016，1986，將測定法完整引入本文作為參考)。然而，來自對PC-12細(xì)胞所做實(shí)驗(yàn)的報告表明這兩種應(yīng)答不必是同義的，而是可能不僅取決于測試的是哪種FGF還取決于靶細(xì)胞上表達(dá)的是哪種受體。使用原代皮層神經(jīng)元培養(yǎng)模本，本發(fā)明清蛋白融合蛋白誘導(dǎo)神經(jīng)突向外長出的能力可與例如使用胸苷摻入測定法用FGF-2實(shí)現(xiàn)的應(yīng)答進(jìn)行比較。成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞測定法從Clonetics(SanDiego，CA)獲得人肺成纖維細(xì)胞，并在從Clonetics獲得的生長培養(yǎng)基中維持。皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞從CellApplications(SanDiego，CA)獲得。對于增殖測定法，可將人肺成纖維細(xì)胞和皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞在96孔平皿中在生長培養(yǎng)基中以5,000細(xì)胞/孔培養(yǎng)1天。然后將細(xì)胞在0.1％BSA基礎(chǔ)培養(yǎng)基中保溫1天。在用新鮮的0.1％BSA培養(yǎng)基更換培養(yǎng)基后，將細(xì)胞與本發(fā)明蛋白質(zhì)的測試融合蛋白一起保溫3天。向每個孔中加入AlamarBlue(AlamarBiosciences，Sacramento，CA)至終濃度10％。將細(xì)胞保溫4個小時。通過CytoFluor熒光讀數(shù)器中的讀數(shù)測量細(xì)胞活力。對于PGE2測定法，將人肺成纖維細(xì)胞在96孔平皿中以5,000細(xì)胞/孔培養(yǎng)1天。在將培養(yǎng)基更換為0.1％BSA基礎(chǔ)培養(yǎng)基后，將細(xì)胞與FGF-2或本發(fā)明的融合蛋白一起在含有或不含IL-1α的條件下保溫24個小時。收集上清液并用EIA試劑盒(Cayman，AnnArbor，MI)測定PGE2。對于IL-6測定法，將人肺成纖維細(xì)胞在96孔平皿中以5,000細(xì)胞/孔培養(yǎng)1天。在將培養(yǎng)基更換為0.1％BSA基礎(chǔ)培養(yǎng)基后，將細(xì)胞與FGF-2或者在含有或不含本發(fā)明清蛋白融合蛋白和/或IL-1α的條件下保溫24小時。收集上清液并用ELISA試劑盒(Endogen，Cambridge，MA)測定IL-6。在加入AlamarBlue以評估對成纖維細(xì)胞生長的效果之前，將人肺成纖維細(xì)胞與FGF-2或本發(fā)明的清蛋白融合蛋白一起在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天。FGF-2應(yīng)當(dāng)在10-2500ng/ml顯示刺激效果，這可用于與本發(fā)明的融合蛋白比較刺激效果?；赱3H]胸苷摻入的細(xì)胞增殖下面的[3H]胸苷摻入測定法可用于測量治療性蛋白質(zhì)，例如生長因子蛋白對諸如成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞或未成熟肌肉細(xì)胞等細(xì)胞的增殖效果。通過在不含血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)18小時，將亞匯合培養(yǎng)物阻滯在Gl階段。然后加入治療性蛋白質(zhì)達(dá)24小時，并在最后的4小時用[3H]胸苷標(biāo)記培養(yǎng)物，終濃度為0.33μM(25Ci/mmol，Amersham，ArlingtonHeights，IL)。摻入的[3H]胸苷用冰冷的10％三氯乙酸沉淀24小時。隨后，將細(xì)胞連續(xù)用冰冷的10％三氯乙酸隨后用冰冷的水漂洗。在0.5MNaOH中溶解后，合并溶解產(chǎn)物和PBS漂洗液(500ml)，并測量放射性的數(shù)量。帕金森模型帕金森病中的運(yùn)動功能喪失要?dú)w咎于因黑質(zhì)紋狀體多巴胺能投射神經(jīng)元退化引起的紋狀體多巴胺缺乏。已經(jīng)廣泛鑒定的帕金森病動物模型牽涉系統(tǒng)施用1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)。在CNS中，MPTP由星形細(xì)胞攝取，而由一元胺氧化酶B分解代謝為1-甲基-4-苯基吡啶(MPP+)并釋放。隨后，MPP+在多巴胺能神經(jīng)元中通過多巴胺的高親和力再攝取轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白積極積累。然后MPP+在線粒體中通過電化學(xué)梯度集中并選擇性抑制煙酰胺腺嘌呤二磷酸泛醌氧化還原酶(復(fù)合物1)，由此干擾電子轉(zhuǎn)運(yùn)并最終產(chǎn)生氧自由基。已經(jīng)在組織培養(yǎng)范例中證實(shí)了FGF-2(基礎(chǔ)FGF)具有針對黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的營養(yǎng)活性(Ferrari等人，Dev.Biol.1989)。近來，Unsicker博士的團(tuán)隊(duì)已經(jīng)證實(shí)了以凝膠泡沫植入物在紋狀體中施用FGF-2導(dǎo)致近乎完全保護(hù)黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元免于與MPTP暴露有關(guān)的毒性(Otto和Unsicker，J.Neuroscience，1990)。根據(jù)FGF-2的數(shù)據(jù)，可以評估本發(fā)明的清蛋白融合蛋白以確定它是否具有與FGF-2在體外增強(qiáng)多巴胺能神經(jīng)元存活中相似的作用，而且還可以在體內(nèi)測試保護(hù)紋狀體中的多巴胺能神經(jīng)元免于與MPTP處理有關(guān)的損傷的作用。首先在體外在多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)范例中檢驗(yàn)本發(fā)明清蛋白融合蛋白的潛在作用。為了制備培養(yǎng)物，從妊娠14天Wistar大鼠胚胎解剖中腦底板。用胰蛋白酶解離組織，并以200,000細(xì)胞/cm2接種到polyorthinine-層粘連蛋白包被的玻璃蓋玻片上。在Dulbecco氏改良的Eagle氏培養(yǎng)基和含有激素補(bǔ)充物(N1)的F12培養(yǎng)基中維持細(xì)胞。8天后在體外用低聚甲醛固定培養(yǎng)物，并為酪氨酸羥化酶(多巴胺能神經(jīng)元的特殊標(biāo)記)的免疫組織化學(xué)染色進(jìn)行加工。從胚胎大鼠制備解離的細(xì)胞培養(yǎng)物。培養(yǎng)基每三天一換，并在那時加入因子。由于多巴胺能神經(jīng)元是從妊娠14天的動物分離的，那時的發(fā)育時間已經(jīng)過了多巴胺能前體細(xì)胞增殖的階段，因此酪氨酸羥化酶免疫陽性神經(jīng)元在數(shù)量上的增加將代表體外存活的多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量的增加。因此，如果本發(fā)明的治療性蛋白質(zhì)起到延長多巴胺能神經(jīng)元存活的作用，那么表明該融合蛋白可能涉及帕金森病。實(shí)施例64胰腺β-細(xì)胞移植聯(lián)合治療移植是自身免疫病的常見治療形式，尤其是當(dāng)靶自身組織已經(jīng)嚴(yán)重受損時。例如，而非限于，胰腺移植和胰島細(xì)胞移植是IDDM的常見治療選擇(見例如Stewart等人，JournalofClinicalEndocrinology&Metabolism86(3)984-988，2001；Brunicardi，Transplant.Proc.282138-40，1996；Kendall和Robertson，DiabetesMetab.22157-163，1996；Hamano等人，KobeJ.Med.Sci.4293-104，1996；Larsen和Stratta，DiabetesMetab.22139-146，1996；及Kinkhabwala等人，Am.J.Surg.171516-520，1996)。正如任何移植方法一樣，自身免疫病患者的移植治療包括將宿主排斥移植組織的風(fēng)險降到最低的處理。然而，自身免疫病包括牽涉破壞最初自身組織的預(yù)先存在的宿主自身免疫應(yīng)答將對移植組織產(chǎn)生相同損壞效果的附加的、獨(dú)立的風(fēng)險。因此，本發(fā)明涵蓋在接受自身免疫病的移植治療的個體中使用本發(fā)明的清蛋白融合蛋白聯(lián)合免疫調(diào)節(jié)劑/免疫抑制劑來治療自身免疫性胰腺疾病的方法和組合物。根據(jù)本發(fā)明，施用上文描述的基于清蛋白融合物的組合物和制劑來預(yù)防和治療由宿主個體最初針對最初自身組織的自身免疫應(yīng)答對移植器官、組織或細(xì)胞產(chǎn)生的損害?？梢栽谝浦睬昂鸵浦埠笠悦看蜗嗑嘁恢艿?至4個劑量進(jìn)行施藥。下面的免疫調(diào)節(jié)劑/免疫抑制劑，包括但不限于AI-401、CDP-571(抗TNF單克隆抗體)、CG-1088、Diamyd(糖尿病疫苗)、ICM3(抗ICAM-3單克隆抗體)、利諾胺(Roquinimex)、NBI-6024(改變的肽配體)、TM-27、VX-740(HMR-3480)、胱天蛋白酶8蛋白酶抑制劑、沙利度胺、hOKT3gammal(Ala-ala)(抗CD3單克隆抗體)、口服干擾素-α、口服乳酸桿菌以及LymphoStat-BTM，可以與本發(fā)明的清蛋白融合物治療劑一起在胰島細(xì)胞和胰腺移植中使用。實(shí)施例65VH和VL結(jié)構(gòu)域的鑒定和克隆從表達(dá)特定抗體的細(xì)胞系鑒定和克隆VH和VL結(jié)構(gòu)域的一種方法是用VH和VL特異引物對從抗體表達(dá)細(xì)胞系制備的cDNA進(jìn)行PCR。簡要的說，從細(xì)胞系分離RNA，并在設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增EBV細(xì)胞系表達(dá)的抗體VH和VL結(jié)構(gòu)域的RT-PCR中用作模板?？梢杂肨Rlzol_試劑(LifeTechnologies，Rockville.MD)溶解細(xì)胞，并用五分之一體積的氯仿抽提。加入氯仿后，使溶液于室溫保溫10分鐘，并于4℃在臺式離心機(jī)中在14,000rpm離心15分鐘。收集上清液，并用等體積的異丙醇沉淀RNA。通過在臺式離心機(jī)中于4℃以14,000rpm離心15分鐘來沉降沉淀的RNA。離心后，丟棄上清液并用75％乙醇清洗。清洗后，將RNA再次于4℃以800rpm離心5分鐘。丟棄上清液并使沉淀物空氣干燥。將RNA溶于DEPC水中并加熱至60℃達(dá)10分鐘?？赏ㄟ^光密度測量法來測定RNA的數(shù)量?？梢园凑毡绢I(lǐng)域眾所周知的方法從1.5-2.5微克RNA用逆轉(zhuǎn)錄酶和隨機(jī)六聚物引物合成cDNA。隨后將cDNA作為PCR擴(kuò)增VH和VL結(jié)構(gòu)域的模板。用于擴(kuò)增VH和VL基因的引物顯示于表7。典型的是，PCR反應(yīng)使用單一的5′引物和單一的3′引物。有時，當(dāng)可獲得的RNA模板的數(shù)量有限時，或者為了更高的效率，可以使用成組的5′和/或3′引物。例如，在單一PCR反應(yīng)中有時使用所有五種VH-5′引物和所有JH3′引物。PCR反應(yīng)在含有1XPCR緩沖液、2mM每種dNTP、0.7個單位的高保真Taq聚合酶、5′引物混合物、3′引物混合物和7.5微升cDNA的50微升體積中進(jìn)行。VH和VL二者的5′和3′引物混合物可通過分別合并22pmole和28pmole的每種個別引物來制備。PCR條件為96℃5分鐘；隨后25個循環(huán)的94℃1分鐘、50℃1分鐘、和72℃1分鐘；隨后一個延伸循環(huán)的72℃10分鐘。反應(yīng)完成后，將樣品管貯存于4℃表7用于擴(kuò)增VH和VL結(jié)構(gòu)域的引物序列然后將PCR樣品在1.3％瓊脂糖凝膠上電泳。可以從凝膠上切下預(yù)期大小的DNA條帶(VH結(jié)構(gòu)域是約506堿基對，而VL結(jié)構(gòu)域是344堿基對)，并用本領(lǐng)域眾所周知的方法純化?？梢詫⒓兓腜CR產(chǎn)物連接到PCR克隆載體中(來自InvitrogenInc.，Carlsbad，CA的TA載體)?？梢栽谵D(zhuǎn)染大腸桿菌和藍(lán)/白顏色選擇后分離個別克隆的PCR產(chǎn)物。然后可以將克隆的PCR產(chǎn)物用本領(lǐng)域普遍知道的方法測序。含有VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域的PCR條帶還可用于創(chuàng)建全長Ig表達(dá)載體?？梢詫H和VL結(jié)構(gòu)域克隆到含有重鏈(例如人IgGl或人IgG4)或輕鏈(人κ或人λ)恒定區(qū)的核苷酸序列的載體中，使得在轉(zhuǎn)染到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中后，可以從這些載體表達(dá)完整的重鏈或輕鏈分子。此外，當(dāng)克隆的重鏈和輕鏈均在一個細(xì)胞系中表達(dá)時(從一種個或兩種載體)，它們可以裝配成完整的功能性抗體分子，分泌到細(xì)胞培養(yǎng)基中。用編碼VH和VL抗體結(jié)構(gòu)域的多核苷酸產(chǎn)生編碼完整抗體分子的表達(dá)載體的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。實(shí)施例66HA-細(xì)胞因子或HA-生長因子融合蛋白(諸如NGF、BDNFa、BDNFb和BDNFc)的制備目的細(xì)胞因子或生長因子諸如NGF的cDNA可以通過多種方法來分離，包括從cDNA庫，通過RT-PCR和通過采用一系列交疊合成寡核苷酸引物的PCR，所有均使用標(biāo)準(zhǔn)方法。所有這些蛋白質(zhì)的核苷酸序列是已知的且可獲得的。cDNA可以在5′和3′端修剪以產(chǎn)生限制性位點(diǎn)，使得可以使用寡核苷酸接頭將cDNA克隆到含有HA的cDNA的載體中。這可以是在N或C-末端，使用或不用間隔物序列。將NGF(或其它細(xì)胞因子)cDNA克隆到諸如pPPC0005(圖2)、pScCHSA、pScNHSA或pC4:HSA等載體中，然后從其中切下完整表達(dá)盒并插入到質(zhì)粒pSAC35中，從而可以在酵母中表達(dá)清蛋白融合蛋白。然后可以從培養(yǎng)基收集并純化酵母分泌的清蛋白融合蛋白，并測試其生物學(xué)活性。對于在哺乳動物細(xì)胞系中的表達(dá)，采用相似的程序，只是所用的表達(dá)盒采用哺乳動物啟動子、前導(dǎo)序列和終止子(見實(shí)施例1)。然后切下此表達(dá)盒并插入到適于轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞系的質(zhì)粒中。實(shí)施例67HA-IFN融合蛋白(諸如IFNa)的制備目的干擾素諸如IFNa的cDNA可以通過多種方法來分離，包括但不限于從cDNA庫，通過RT-PCR和通過采用一系列交疊合成寡核苷酸引物的PCR，所有均使用標(biāo)準(zhǔn)方法。干擾素諸如IFNa的核苷酸序列是已知的且是可獲得的，例如在美國專利5,326,859和4,588,585、EP32134以及諸如GenBank等公共數(shù)據(jù)庫中。cDNA可以在5′和3′端修剪以產(chǎn)生限制性位點(diǎn)，使得可以使用寡核苷酸接頭將cDNA克隆到含有HA的cDNA的載體中。這可以是在N或C-末端，使用或不用間隔物序列。將IFNa(或其它干擾素)cDNA克隆到諸如pPPC0005(圖2)、pScCHSA、pScNHSA或pC4:HSA等載體中，然后從其中切下完整表達(dá)盒并插入到質(zhì)粒pSAC35中，從而可以在酵母中表達(dá)清蛋白融合蛋白。然后可以從培養(yǎng)基收集并純化酵母分泌的清蛋白融合蛋白，并測試其生物學(xué)活性。對于在哺乳動物細(xì)胞系中的表達(dá)，采用相似的程序，只是所用的表達(dá)盒采用哺乳動物啟動子、前導(dǎo)序列和終止子(見實(shí)施例1)。然后切下此表達(dá)盒并插入到適于轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞系的質(zhì)粒中。從管中的最大蛋白質(zhì)回收本發(fā)明的清蛋白融合蛋白具有高度穩(wěn)定性，即使在它們以低濃度包裝時。此外，盡管蛋白質(zhì)濃度低，仍然觀察到好的融合蛋白回收率，即使在水溶液不含為了使與管壁的結(jié)合降至最低而加入的其它蛋白質(zhì)時。將以管貯存的HA-IFN溶液的回收與儲液進(jìn)行比較。將6或30μg/mlHA-IFN溶液置于管中并貯存于4℃。48或72小時后，取出最初與10ng樣品相當(dāng)?shù)捏w積并用IFN夾心ELISA測量。將估計(jì)值與高濃度儲液進(jìn)行比較。正如所證明的，這些管中的樣品本質(zhì)上沒有損失，說明為了防止樣品因管壁的損失而加入外源物質(zhì)諸如清蛋白不是必需的。HA-α-IFN融合物的體內(nèi)穩(wěn)定性和生物利用度為了測定HA-α-IFN融合分子的體內(nèi)穩(wěn)定性和生物利用度，對猴子施用純化的融合分子(來自酵母)。由HA-α-IFN融合物配制的藥物組合物可導(dǎo)致血清半衰期和生物利用度提高。因此，可以配制與天然α-干擾素分子相比含有較低劑量α-干擾素活性的藥物組合物。含有HA-α-IFN融合物的藥物組合物可用于在患有可通過施用α-IFN來調(diào)節(jié)的任何疾病或疾病狀態(tài)的患者中治療或預(yù)防疾病。這樣的疾病包括但不限于毛細(xì)胞性白血病、卡波西氏肉瘤、生殖和肛門疣、慢性乙型肝炎、慢性非甲非乙型肝炎，特別是丙肝、丁肝、慢性髓細(xì)胞性白血病、腎細(xì)胞癌、膀胱癌、卵巢和宮頸癌、皮膚癌、復(fù)發(fā)性呼吸機(jī)乳頭瘤病(recurrentrespiratorpapillomatosis)、非霍奇金氏和皮膚T-細(xì)胞淋巴瘤、黑素瘤、多發(fā)性骨髓瘤、AIDS、多發(fā)性硬化癥、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤等(見InterferonAlpha，在《AHFSDrugInformation》中，1997)。因此，本發(fā)明包括含有HA-α-IFN融合蛋白、多肽或肽且以正確劑量配制用于人類施用的藥物組合物。本發(fā)明還包括治療需要這種治療的患者的方法，它包括施用含有至少一種HA-α-IFN融合蛋白、多肽或肽的藥物組合物的至少一個步驟。雙功能HA-α-IFN融合物HA-α-IFN表達(dá)載體可以修飾成包含用于表達(dá)雙功能HA-α-IFN融合蛋白的插入物。例如，可以在移除雙重終止密碼子或移動到編碼序列下游后，將第二目的蛋白的cDNA以相同讀碼框插入“rHA-IFN”序列的下游。在雙功能HA-α-IFN融合蛋白的一個版本中，可將針對B-淋巴細(xì)胞刺激物蛋白質(zhì)(GenBank編號4455139)或多肽的抗體或片段融合在融合分子的HA成分的一個末端。這種雙功能蛋白質(zhì)對調(diào)節(jié)由融合物的α-IFN成分產(chǎn)生的任何免疫應(yīng)答是有用的。實(shí)施例68HA-激素融合蛋白的制備目的激素的cDNA可以通過多種方法來分離，包括但不限于從cDNA庫，通過RT-PCR和通過采用一系列交疊合成寡核苷酸引物的PCR，所有均使用標(biāo)準(zhǔn)方法。所有這些蛋白質(zhì)的核苷酸序列是已知的且是可獲得的，例如在諸如GenBank等公共數(shù)據(jù)庫中。cDNA可以在5′和3′端修剪以產(chǎn)生限制性位點(diǎn)，使得可以使用寡核苷酸接頭將cDNA克隆到含有HA的cDNA的載體中。這可以是在N或C-末端，使用或不用間隔物序列。將激素cDNA克隆到諸如pPPC0005(圖2)、pScCHSA、pScNHSA或pC4:HSA等載體中，然后從其中切下完整表達(dá)盒并插入到質(zhì)粒pSAC35中，從而可以在酵母中表達(dá)清蛋白融合蛋白。然后可以從培養(yǎng)基收集并純化酵母分泌的清蛋白融合蛋白，并測試其生物學(xué)活性。對于在哺乳動物細(xì)胞系中的表達(dá)，采用相似的程序，只是所用的表達(dá)盒采用哺乳動物啟動子、前導(dǎo)序列和終止子(見實(shí)施例1)。然后隨后切下此表達(dá)盒并插入到適于轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞系的質(zhì)粒中。實(shí)施例69HA-可溶性受體或HA-結(jié)合蛋白融合蛋白的制備目的可溶性受體或結(jié)合蛋白的cDNA可以通過多種方法來分離，包括但不限于從cDNA庫，通過RT-PCR和通過采用一系列交疊合成寡核苷酸引物的PCR，所有均使用標(biāo)準(zhǔn)方法。所有這些蛋白質(zhì)的核苷酸序列是已知的且是可獲得的，例如在GenBank中。cDNA可以在5′和3′端修剪以產(chǎn)生限制性位點(diǎn)，使得可以使用寡核苷酸接頭將cDNA克隆到含有HA的cDNA的載體中。這可以是在N或C-末端，使用或不用間隔物序列。將受體cDNA克隆到諸如pPPC0005(圖2)、pScCHSA、pScNHSA或pC4:HSA等載體中，然后從其中切下完整表達(dá)盒并插入到質(zhì)粒pSAC35中，從而可以在酵母中表達(dá)清蛋白融合蛋白。然后可以從培養(yǎng)基收集并純化酵母分泌的清蛋白融合蛋白，并測試其生物學(xué)活性。對于在哺乳動物細(xì)胞系中的表達(dá)，采用相似的程序，只是所用的表達(dá)盒采用哺乳動物啟動子、前導(dǎo)序列和終止子(見實(shí)施例1)。然后切下此表達(dá)盒并插入適于轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞系的質(zhì)粒中。實(shí)施例70HA-生長因子的制備目的生長因子的cDNA可以通過多種方法來分離，包括但不限于從cDNA庫，通過RT-PCR和通過采用一系列交疊合成寡核苷酸引物的PCR，所有均使用標(biāo)準(zhǔn)方法(見GenBank編號NP000609)。cDNA可以在5′和3′端修剪以產(chǎn)生限制性位點(diǎn)，使得可以使用寡核苷酸接頭將cDNA克隆到含有HA的cDNA的載體中。這可以是在N或C-末端，使用或不用間隔物序列。將生長因子cDNA克隆到諸如pPPC0005(圖2)、pScCHSA、pScNHSA或pC4:HSA等載體中，然后從其中切下完整表達(dá)盒并插入到質(zhì)粒pSAC35中，從而可以在酵母中表達(dá)清蛋白融合蛋白。然后從培養(yǎng)基收集并純化酵母分泌的清蛋白融合蛋白，并測試其生物學(xué)活性。對于在哺乳動物細(xì)胞系中的表達(dá)，采用相似的程序，只是所用的表達(dá)盒采用哺乳動物啟動子、前導(dǎo)序列和終止子(見實(shí)施例1)。然后切下此表達(dá)盒并插入到適于轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞系的質(zhì)粒中。實(shí)施例71HA-單鏈抗體融合蛋白的制備單鏈抗體通過幾種方法制備，包括但不限于從噬菌體庫中選擇，通過克隆抗體的cDNA并使用側(cè)翼恒定區(qū)作為引物克隆可變區(qū)來克隆特定抗體的可變區(qū)，或者通過合成與任何特定抗體的可變區(qū)對應(yīng)的寡核苷酸。cDNA可以在5′和3′端修剪以產(chǎn)生限制性位點(diǎn)，使得可以使用寡核苷酸接頭將cDNA克隆到含有HA的cDNA的載體中。這可以是在N或C-末端，使用或不用間隔物序列。將細(xì)胞cDNA克隆到諸如pPPC0005(圖2)、pScCHSA、pScNHSA或pC4:HSA等載體中，然后從其中切下完整表達(dá)盒并插入到質(zhì)粒pSAC35中，從而可以在酵母中表達(dá)清蛋白融合蛋白。在本發(fā)明的融合分子中，VH和VL可以通過下面的一種方法或其組合來連接VH的C-末端和VL的N-末端之間的肽接頭；VH和VL之間的Kex2p蛋白酶切割位點(diǎn)，使得二者可以在分泌后切開且隨后自我締合；以及胱氨酸殘基，其位置使得VH和VL能夠在它們之間形成二硫鍵以將它們連接在一起。可選選項(xiàng)是將VH置于HA或HA結(jié)構(gòu)域片段的N-末端并將VL置于HA或HA結(jié)構(gòu)域片段的C-末端。然后可以從培養(yǎng)基收集并純化酵母分泌的清蛋白融合蛋白，并測試其生物學(xué)活性。對于在哺乳動物細(xì)胞系中的表達(dá)，采用相似的程序，只是所用的表達(dá)盒采用哺乳動物啟動子、前導(dǎo)序列和終止子(見實(shí)施例1)。然后切下此表達(dá)盒并插入到適于轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞系的質(zhì)粒中。用這種方式制備的抗體可以從培養(yǎng)基純化，并用標(biāo)準(zhǔn)免疫化學(xué)方法測試其與抗原的結(jié)合。實(shí)施例72HA-細(xì)胞粘附分子融合蛋白的制備目的細(xì)胞粘附分子的cDNA可以通過多種方法來分離，包括但不限于從cDNA庫，通過RT-PCR和通過采用一系列交疊合成寡核苷酸引物的PCR，所有均使用標(biāo)準(zhǔn)方法。已知的細(xì)胞粘附分子的核苷酸序列是已知的且是可獲得的，例如在GenBank中。cDNA可以在5′和3′端修剪以產(chǎn)生限制性位點(diǎn)，使得可以使用寡核苷酸接頭將cDNA克隆到含有HA的cDNA的載體中。這可以是在N或C-末端，使用或不用間隔物序列。將細(xì)胞粘附分子cDNA克隆到諸如pPPC0005(圖2)、pScCHSA、pScNHSA或pC4:HSA等載體中，然后從其中切下完整表達(dá)盒并插入到質(zhì)粒pSAC35中，從而可以在酵母中表達(dá)清蛋白融合蛋白。然后從培養(yǎng)基收集并純化酵母分泌的清蛋白融合蛋白，并測試其生物學(xué)活性。對于在哺乳動物細(xì)胞系中的表達(dá)，采用相似的程序，只是所用的表達(dá)盒采用哺乳動物啟動子、前導(dǎo)序列和終止子(見實(shí)施例1)。然后切下此表達(dá)盒并插入到適于轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞系的質(zhì)粒中。實(shí)施例73抑制因子和肽作為HA融合蛋白(諸如HA-抗病毒藥、HA-抗生物質(zhì)(antibiotic)、HA-酶抑制劑和HA-抗變應(yīng)蛋白)的制備目的肽諸如抗生肽的cDNA可以通過多種方法來分離，包括但不限于從cDNA庫，通過RT-PCR和通過采用一系列交疊合成寡核苷酸引物的PCR，所有均使用標(biāo)準(zhǔn)方法。cDNA可以在5′和3′端修剪以產(chǎn)生限制性位點(diǎn)，使得可以使用寡核苷酸接頭將cDNA克隆到含有HA的cDNA的載體中。這可以是在N或C-末端，使用或不用間隔物序列。將肽cDNA克隆到諸如pPPC0005(圖2)、pScCHSA、pScNHSA或pC4:HSA等載體中，然后從其中切下完整表達(dá)盒并插入到質(zhì)粒pSAC35中，從而可以在酵母中表達(dá)清蛋白融合蛋白。然后從培養(yǎng)基收集并純化酵母分泌的清蛋白融合蛋白，并測試其生物學(xué)活性。對于在哺乳動物細(xì)胞系中的表達(dá)，采用相似的程序，只是所用的表達(dá)盒采用哺乳動物啟動子、前導(dǎo)序列和終止子(見實(shí)施例1)。然后切下此表達(dá)盒并插入到適于轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞系的質(zhì)粒中。實(shí)施例74靶向HA融合蛋白的制備目的蛋白質(zhì)的cDNA可以使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法從cDNA庫中分離或者可以用幾種交疊寡核苷酸合成制備?？梢愿脑靋DNA中的適當(dāng)核苷酸以形成方便的限制性位點(diǎn)并容許將蛋白質(zhì)cDNA附著于清蛋白cDNA。同樣，可以將能夠在細(xì)胞內(nèi)引導(dǎo)蛋白質(zhì)的靶向蛋白質(zhì)或肽cDNA諸如單鏈抗體或肽，諸如核定位信號融合在清蛋白的另一端。將目的蛋白質(zhì)和靶向肽克隆到諸如pPPC0005(圖2)、pScCHSA、pScNHSA或pC4:HSA等載體中，從而導(dǎo)致與清蛋白cDNA的融合。在這種方式中，清蛋白的N-和C-兩個末端都融合有其它蛋白質(zhì)。然后從pPPC0005中切出融合的cDNA并插入到諸如pSAC35等質(zhì)粒中，從而可以在酵母中表達(dá)清蛋白融合蛋白。所有上述程序可以使用分子生物學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)方法來執(zhí)行?？梢詮呐囵B(yǎng)基收集并純化酵母分泌的清蛋白融合蛋白，并使用適當(dāng)?shù)纳蜕飳W(xué)測試法測試其生物學(xué)活性和其靶向活性。實(shí)施例75HA-酶融合物的制備目的酶的cDNA可以通過多種方法來分離，包括但不限于從cDNA庫，通過RT-PCR和通過使用一系列交疊合成寡核苷酸引物的PCR，均使用標(biāo)準(zhǔn)方法。cDNA可以在5′和3′端修剪以產(chǎn)生限制性位點(diǎn)，使得可以使用寡核苷酸接頭將cDNA克隆到含有HA的cDNA的載體中。這可以是在N或C-末端，使用或不用間隔物序列。將酶cDNA克隆到諸如pPPC0005(圖2)、pScCHSA、pScNHSA或pC4:HSA等載體中，然后從其中切下完整表達(dá)盒并插入到質(zhì)粒pSAC35中，從而可以在酵母菌中表達(dá)清蛋白融合蛋白。然后可以從培養(yǎng)基收集并純化酵母分泌的清蛋白融合蛋白并測試其生物學(xué)活性。對于在哺乳動物細(xì)胞系中的表達(dá)，采用相似的程序，只是所用的表達(dá)盒采用哺乳動物啟動子、前導(dǎo)序列和終止子(見實(shí)施例1)。然后切下此表達(dá)盒并插入到適于轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞系的質(zhì)粒中。實(shí)施例76構(gòu)建物ID2053，IFNb-HSA的產(chǎn)生構(gòu)建物ID2053，pEE12.1:IFNb.HSA在NSO表達(dá)載體pEE12.1中包含編碼具有全長IFNb蛋白質(zhì)的IFNb-清蛋白融合蛋白的DNA，其中包括與HSA成熟形式的氨基末端融合的天然IFNb前導(dǎo)序列。IFNbcDNA的克隆使用下文所述引物IFNb-1和IFNb-2PCR擴(kuò)增編碼IFNb的多核苷酸，用BamHI/ClaI切割，并連接到經(jīng)BamHI/ClaI切割的pC4:HSA中，產(chǎn)生構(gòu)建物2011。將構(gòu)建物ID#2011的EcoRI/EcoRI片段亞克隆到pEE12.1的EcoRI位點(diǎn)中，產(chǎn)生構(gòu)建物ID#2053，它包含編碼清蛋白融合蛋白的DNA，該融合蛋白含有前導(dǎo)序列和IFNb成熟形式，后面是成熟HSA蛋白質(zhì)。合成適于PCR擴(kuò)增編碼全長IFNb的多核苷酸的兩條寡核苷酸，IFNb-1和IFNb-2IFNb-15′-GCGCGGATCCGAATTCCGCCGCCATGACCAACAAGTGTCTCCTCCAAATTGCTCTCCTGTTGTGCTTCTCCACTACAGCTCTTTCCATGAGCTACAACTTGCTTGG-3’(SEQIDNO107)IFNb-25′-GCGCGCATCGATGAGCAACCTCACTCTTGTGTGCATCGTTTCGGAGGTAACCTGT-3′(SEQIDNO108)IFNb-1引物摻入了BamHI克隆位點(diǎn)(下劃線顯示)、EcoRI克隆位點(diǎn)、和Kozak序列(斜體顯示)，后面是編碼全長形式IFNb的頭27個氨基酸的80個核苷酸。在IFNb-2中，ClaI位點(diǎn)(下劃線顯示)及其后的DNA為編碼成熟HSA蛋白質(zhì)(SEQIDNO1)的頭10個氨基酸的DNA的反向互補(bǔ)序列，而最后的18個核苷酸為編碼IFNb的最后6個氨基酸殘基的DNA的反向互補(bǔ)序列(見實(shí)施例2)。用這些引物產(chǎn)生PCR擴(kuò)增物，純化，用BamHI和ClaI限制酶消化，并克隆到pC4:HSA載體的BamHI和ClaI位點(diǎn)中。在確認(rèn)序列后，將含有IFNb-清蛋白融合蛋白表達(dá)盒的EcoRI片段亞克隆到經(jīng)EcoRI消化的pEE12.1中。此外，通過氨基酸測序?qū)λ磉_(dá)清蛋白融合蛋白N-末端的分析可以證實(shí)預(yù)期IFNb序列的存在(見下文)。本發(fā)明的IFNb-清蛋白融合蛋白優(yōu)選包含HSA的成熟形式即Asp-25至Leu-609，它融合在IFNb的成熟形式即Met-22至Asn-187的N-或C-末端。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的IFNb-清蛋白融合蛋白還包含用于在用于表達(dá)的宿主的分泌途徑中引導(dǎo)初生融合多肽的信號序列。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，由信號序列編碼的信號肽遭到切除，而成熟的IFNb-清蛋白融合蛋白直接分泌到培養(yǎng)基中。本發(fā)明的IFNb-清蛋白融合蛋白可包含異源信號序列，包括但不限于MAF、INV、Ig、纖蛋白B、簇蛋白、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白4、HSA前導(dǎo)序列變體包括但不限于嵌合HSA/MAF前導(dǎo)序列、或本領(lǐng)域已知的其它異源信號序列。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的IFNb-清蛋白融合蛋白包含天然的IFNb。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的IFNb-清蛋白融合蛋白還包含N-末端甲硫氨酸殘基。本發(fā)明還涵蓋編碼這些多肽的多核苷酸，包括片段和/或變體。構(gòu)建物ID2053的表達(dá)和純化在鼠骨髓瘤NSO細(xì)胞系中的表達(dá)通過本領(lǐng)域已知的方法將構(gòu)建物ID#2053，pEE12.1:IFNb-HSA電穿孔到NSO細(xì)胞中(見實(shí)施例6)。從NSO細(xì)胞上清液純化從NSO細(xì)胞上清液純化IFNb-HSA可包括在pH7.4用20mMTris-HCl中0到1M的NaCl梯度進(jìn)行的Q-Sepharose陰離子交換層析，隨后是在pH6.5用5至40mM的檸檬酸鈉梯度進(jìn)行的PorosPI50陰離子交換層析，并6DV滲濾至10mM檸檬酸鹽pH6.5和140mMNaCl即最后的緩沖組合物中。N-末端測序應(yīng)當(dāng)?shù)玫叫蛄蠱SYNLL，它是IFNb成熟形式的氨基末端。蛋白質(zhì)具有約88.5kDa的分子量。對于更大規(guī)模的純化，例如，可以將50升NSO細(xì)胞上清液濃縮至約8-10升。然后使?jié)饪s樣品流過pH7.5的Q-Sepharose陰離子交換柱(10×19cm，1.5L)，采用由50mMNaOAcpH6.0和150mMNaCl組成的分布洗脫。然后可以將洗脫的樣品用0.75％Triton-X100于室溫滅活病毒60分鐘。然后可以采用在pH6.0使用50mMNaOAc和150mMNaCl的SDR-反相層析(10cm×10cm，0.8L)，或者可以使樣品流過pH4.8的SP-Sepharose柱，采用50mMNaOAcpH6.0和150mMNaCl的分布洗脫。隨后通過DV50過濾以除去任何病毒內(nèi)容物。隨后可以是pH6.0的Phenyl-650M層析(20cm×12cm，3.8L)，采用由350mM(NH4)2SO4和50mMNaOAc組成的或者由50mMNaOAcpH6.0組成的分布洗脫。6-8DV的滲濾可以將緩沖液更換成10mMNa2HPO4+58mM蔗糖+120mMNaClpH7.2或10mM檸檬酸鹽pH6.5和140mMNaCl或25mMNa2HPO4、100mMNaClpH7.2的預(yù)期最終配制緩沖液。IFNb的活性可以用體外ISRE-SEAP測定法來測定所有I型干擾素蛋白質(zhì)通過公用受體復(fù)合物和類似的Jak/STAT信號路徑來發(fā)信號，后者在通過干擾素序列應(yīng)答元件“ISRE”激活干擾素“IFN”應(yīng)答基因中達(dá)到峰值。I型IFN活性的方便測定法是基于啟動子-報道基因的測定系統(tǒng)，它含有與下游報道基因融合的多個拷貝ISRE元件?？僧a(chǎn)生穩(wěn)定的HEK293細(xì)胞系，并含有對I型IFN極其敏感且在超過5個對數(shù)濃度上顯示出線性的穩(wěn)定整合拷貝的ISRE-SEAP報道基因。IFNb-HSANSO穩(wěn)定克隆的篩選方法如實(shí)施例6所述將構(gòu)建物2053電穿孔到NSO細(xì)胞中。通過在ISRE-SEAP測定法中測試條件生長培養(yǎng)基對經(jīng)構(gòu)建物ID#2053轉(zhuǎn)染的NSO細(xì)胞篩選活性。將ISRE-SEAP/293F報道細(xì)胞在處理前一天以3×104細(xì)胞/孔分配到經(jīng)聚-D-賴氨酸包被的96孔平皿中。用各種稀釋度(包括但不限于1∶500和1∶5000)的條件上清液或由構(gòu)建物ID2053編碼的IFNb-清蛋白融合蛋白的純化制備物或者作為對照的rhIFNb處理報道細(xì)胞。然后將報道細(xì)胞保溫24小時，隨后取出40μl，用于SEAP報道基因化學(xué)發(fā)光測定法(Roche產(chǎn)品目錄編號1779842)。使用重組人干擾素β，“rhIFNb”(Biogen)，作為陽性對照。結(jié)果NSO表達(dá)的IFNb-HSA的純化制備物具有比EC50值為1.8×10-10g/ml(見實(shí)施例4)的rhIFNb(Biogen)更大的EC50值，為9.3×10-9g/ml。干擾素對OAS的體內(nèi)誘導(dǎo)方法OAS酶，2′-5′-寡腺苷酸合成酶在應(yīng)答抗病毒感染中由干擾素在轉(zhuǎn)錄水平激活。干擾素構(gòu)建物的效果可以通過從接受處理的猴子獲得血樣并對這些樣品分析兩種OASmRNA，p41和p69的轉(zhuǎn)錄激活作用來測量?？蓮拿拷M4只動物在每個動物的7個不同時間點(diǎn)，第0天、第1天、第2天、第4天、第8天、第10天、和第14天獲得0.5ml體積的全血。不同的組可包括注射賦形劑對照、第一天靜脈內(nèi)和/或皮下注射30μg/kg和/或300μg/kgIFN-清蛋白融合蛋白、及第1、3和5天皮下注射40μg/kg干擾素α(Schering-Plough)作為陽性對照。p41和p69mRNA轉(zhuǎn)錄本的水平可使用對p41-OAS和p69-OAS特異的探針通過實(shí)時定量PCR(Taqman)來測定。OASmRNA水平可相對于18S核糖體RNA內(nèi)源對照進(jìn)行定量。由構(gòu)建物ID2053編碼的干擾素β-清蛋白融合物對OAS的體內(nèi)誘導(dǎo)方法由構(gòu)建物2053編碼的HSA-IFNb融合蛋白的活性可以通過體內(nèi)OAS測定法來測定，正如先前上文在副標(biāo)題“干擾素對OAS的體內(nèi)誘導(dǎo)”中所述。實(shí)施例77IFNb-清蛋白融合蛋白的適應(yīng)癥IFNβ-清蛋白融合蛋白(包括但不限于由構(gòu)建物2053編碼的那些)可用于治療、預(yù)防、改善和/或檢測多發(fā)性硬化癥。其它適應(yīng)癥包括但不限于病毒感染，包括嚴(yán)重急性呼吸道綜合癥(SARS)和其它冠狀病毒感染；纖絲病毒，包括但不限于埃博拉病毒和馬爾堡病毒；沙粒病毒，包括但不限于Pichende病毒、拉沙病毒、胡寧病毒、馬丘坡病毒、瓜納瑞托病毒；和淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(LCMV)；布尼亞病毒，包括但不限于龐塔托魯病毒、克里米亞半島-剛果出血熱病毒、白蛉熱病毒、立夫特山谷熱病毒、拉克羅斯病毒、和漢坦病毒；黃病毒，包括但不限于黃熱病、斑齊病毒、西尼羅病毒、登革熱病毒、日本腦炎病毒、蜱媒腦炎、鄂木斯克出血熱、和科薩努爾森林病病毒；披膜病毒，包括但不限于委內(nèi)瑞拉、東方、和西方馬腦炎病毒、羅斯河病毒、和風(fēng)疹病毒；正痘病毒，包括但不限于痘苗、牛痘、天花、和猴痘；皰疹病毒；流感A/B；呼吸道合胞病毒(RAV)；副流感；麻疹；鼻病毒；腺病毒；塞姆利基森林病毒；病毒性出血熱；桿狀病毒；副粘病毒，包括但不限于尼帕病毒和亨德拉病毒；及由美國疾病控制和預(yù)防中心確定為高度優(yōu)先的疾病因子的其它病毒因子(即A、B、和C類因子；見例如Moran，Emerg.Med.Clin.North.Am.20(2)311-30，2002及Darling等人，Emerg.Med.Clin.NorthAm.20(2)273-309，2002)。實(shí)施例78構(gòu)建物ID2249，IFNa2-HSA的產(chǎn)生構(gòu)建物ID2249，pSAC35:IFNa2.HSA在釀酒酵母表達(dá)載體pSAC35中包含編碼IFNa2-清蛋白融合蛋白的DNA，該融合蛋白具有HSA嵌合前導(dǎo)序列，后面是IFNa2蛋白質(zhì)的成熟形式即Cl-E165，融合在HSA成熟形式的氨基末端。IFNa2cDNA的克隆使用下文所述引物IFNa2-1和IFNa2-2PCR擴(kuò)增編碼IFNa2的多核苷酸。用SalI/ClaI切割PCR擴(kuò)增物，并連接到經(jīng)XhoI/ClaI切割的pScCHSA中。構(gòu)建物ID#2249編碼清蛋白融合蛋白，它含有嵌合HSA前導(dǎo)序列、IFNa2的成熟形式，后面是成熟HSA蛋白質(zhì)。合成適于PCR擴(kuò)增編碼IFNa2成熟形式的多核苷酸的兩條寡核苷酸，IFNa2-1和IFNa2-2IFNa2-15′-CGCGCGCGTCGACAAAAGATGTGATCTGCCTCAAACCCACA-3’(SEQIDNO109)IFNa2-25′-GCGCGCATCGATGAGCAACCTCACTCTTGTGTGCATCTTCCTTACTTCTTAAACTTTCT-3′(SEQIDNO110)IFNa2-1引物摻入SalI克隆位點(diǎn)(下劃線顯示)、編碼嵌合HSA前導(dǎo)序列的最后三個氨基酸殘基的核苷酸、及編碼IFNa2成熟形式的頭7個氨基酸殘基的22個核苷酸(粗體顯示)。在IFNa2-2中，ClaI位點(diǎn)(下劃線顯示)及其后的DNA為編碼成熟HSA蛋白質(zhì)的頭10個氨基酸的DNA的反向互補(bǔ)序列，而最后的22個核苷酸(粗體顯示)為編碼IFNa2的最后7個氨基酸殘基的DNA的反向互補(bǔ)序列(見實(shí)施例2)。用這些引物產(chǎn)生IFNa2-HSA的PCR擴(kuò)增物，純化，用SalI和ClaI限制酶消化，并克隆到pScCHSA載體的XhoI和ClaI位點(diǎn)中。確認(rèn)序列后，將編碼此IFNa2-清蛋白融合蛋白的表達(dá)盒亞克隆到經(jīng)NotI消化的pSAC35中。此外，通過氨基酸測序?qū)λ磉_(dá)清蛋白融合蛋白N-末端的分析可以證實(shí)預(yù)期的IFNa2序列的存在(見下文)。通過本領(lǐng)域已知的方法構(gòu)建了采用不同前導(dǎo)序列的其它IFNa2-清蛋白融合蛋白(見實(shí)施例2)。各種前導(dǎo)序列的例子包括但不限于轉(zhuǎn)化酶“INV”(構(gòu)建物2343和2410)和交配α因子“MAF”(構(gòu)建物2366)?？梢匀缦惹八?見實(shí)施例5)將這些IFNa2-清蛋白融合蛋白亞克隆到諸如pC4(構(gòu)建物2382)和pEE12.1等哺乳動物表達(dá)載體中。還可以構(gòu)建治療性部分融合于HSAC-末端的IFNa2-清蛋白融合蛋白(構(gòu)建物2381)。本發(fā)明的IFNa2-清蛋白融合蛋白優(yōu)選包含HSA的成熟形式即Asp-25至Leu-609，它融合在IFNa2的成熟形式即Cys-1至Glu-165的N-或C-末端。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的IFNa2-清蛋白融合蛋白還包含在用于表達(dá)的宿主的分泌途徑中引導(dǎo)初始融合多肽的信號序列。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，由信號序列編碼的信號肽遭到切除，而成熟的IFNa2-清蛋白融合蛋白直接分泌到培養(yǎng)基中。本發(fā)明的IFNa2-清蛋白融合蛋白可包含異源信號序列，包括但不限于MAF、INV、Ig、纖蛋白B、簇蛋白、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白4、HSA前導(dǎo)序列變體包括但不限于嵌合HSA/MAF前導(dǎo)序列、或本領(lǐng)域已知的其它異源信號序列。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的IFNa2-清蛋白融合蛋白包含天然的IFNa2。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的IFNa2-清蛋白融合蛋白還包含N-末端甲硫氨酸殘基。本發(fā)明還涵蓋編碼這些多肽的多核苷酸，包括片段和/或變體。構(gòu)建物ID2249的表達(dá)和純化在釀酒酵母中的表達(dá)通過本領(lǐng)域已知的方法將構(gòu)建物2249轉(zhuǎn)化到釀酒酵母菌株BXP10中(見實(shí)施例3)。可在生長72小時后收集穩(wěn)定階段的細(xì)胞。通過將細(xì)胞以3000g離心10分鐘來收集上清液。使用抗HSA血清(KentLaboratories)或者作為一抗通過免疫印跡檢測來檢驗(yàn)表達(dá)水平?？色@得分子量大約88.5kDa的IFNa2-清蛋白融合蛋白。從釀酒酵母細(xì)胞上清液純化含有在釀酒酵母細(xì)胞中由構(gòu)建物ID#2249表達(dá)的IFNa2-清蛋白融合蛋白的細(xì)胞上清液可使用Dyax肽親和柱進(jìn)行小規(guī)模(見實(shí)施例4)，或者通過如下5步進(jìn)行大規(guī)模純化滲濾、用DEAE-SepharoseFastFlow柱進(jìn)行的陰離子交換層析、用Butyl650S柱進(jìn)行的疏水相互作用層析(HIC)、用SP-SepharoseFastFlow進(jìn)行的陽離子交換層析或Blue-Sepharose層析、以及用Q-Sepharose高效柱進(jìn)行的高效層析(見實(shí)施例4)。IFNa2-清蛋白融合蛋白可從DEAE-SepharoseFastFlow柱上用100-250mMNaCl、從SP-SepharoseFastFlow柱上用150-250mMNaCl、和在5-7.5mS/cm從Q-Sepharose高效柱上洗脫。N-末端序列應(yīng)當(dāng)?shù)玫脚cIFNa2成熟形式一致的序列CDLPQ(SEQIDNO98)。IFNa2的活性可以用體外ISRE-SEAP測定法來測定方法可如先前實(shí)施例76所述對由構(gòu)建物ID#2249編碼的IFNa2-清蛋白融合蛋白在ISRE-SEAP測定法中測試活性。簡要的說，條件酵母上清液以1∶1000的稀釋度測試其在ISRE-SEAP/293F報道細(xì)胞系上指導(dǎo)ISRE信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力。將ISRE-SEAP/293F報道細(xì)胞在處理前一天以3×104細(xì)胞/孔分配到經(jīng)聚-D-賴氨酸包被的96孔平皿中。然后將報道細(xì)胞保溫18至24小時，隨后取出40μl，用于SEAP報道基因化學(xué)發(fā)光測定法(Roche產(chǎn)品目錄編號1779842)。使用重組人干擾素β，“rhIFNb”(Biogen)，作為陽性。結(jié)果IFNa2-HSA的純化制備物在ISRE-SEAP測定法中在濃度范圍10-1至101ng/ml(見圖5)或者10-10至10-8ng/ml(見圖6)上展示相對線性的增加。由構(gòu)建物ID2249編碼的干擾素α融合物對OAS的體內(nèi)誘導(dǎo)方法OAS酶，2′-5′-寡腺苷酸合成酶在應(yīng)答抗病毒感染中由干擾素在轉(zhuǎn)錄水平激活。干擾素構(gòu)建物的效果可以通過從接受處理的猴子獲得血樣并對這些樣品分析兩種OASmRNA，p41和p69的轉(zhuǎn)錄激活作用來測量。從每組4只動物在每個動物的7個不同時間點(diǎn)，第0天、第1天、第2天、第4天、第8天、第10天、和第14天獲得0.5ml體積的全血。不同的組包括賦形劑對照、第1天靜脈內(nèi)注射30μg/kgHSA-IFN、第1天皮下注射30μg/kgHSA-IFN、第1天皮下注射300μg/kgHSA-IFN、及第1、3和5天皮下注射40μg/kg干擾素α(Schering-Plough)作為陽性對照。p41和p69mRNA轉(zhuǎn)錄本的水平使用對p41-OAS和p69-OAS特異的探針通過實(shí)時定量PCR(Taqman)來測定。OASmRNA水平相對于18S核糖體RNA內(nèi)源對照進(jìn)行定量。由構(gòu)建物2249編碼的清蛋白融合可進(jìn)行類似的實(shí)驗(yàn)。結(jié)果在用HSA-干擾素處理的猴子中觀察到p41和p69兩種OAS的mRNA轉(zhuǎn)錄本水平的顯著增加，與用IFNa處理的猴子形成對比(p41數(shù)據(jù)見圖7)。作用持續(xù)近10天。實(shí)施例79IFNa2-清蛋白融合蛋白的適應(yīng)癥IFNα-清蛋白融合蛋白(包括但不限于由構(gòu)建物2249、2343、2410、2366、2382和2381編碼的那些)可用于治療、預(yù)防、改善和/或檢測多發(fā)性硬化癥。其它適應(yīng)癥包括但不限于病毒感染，包括嚴(yán)重急性呼吸道綜合癥(SARS)和其它冠狀病毒感染；纖絲病毒(filovirus)，包括但不限于埃博拉病毒(Ebolavirus)和馬爾堡病毒(Marburgvirus)；沙粒病毒(Arenavirus)，包括但不限于Pichende病毒、拉沙病毒(Lassavirus)、胡寧病毒(Juninvirus)、馬丘坡病毒(Machupovirus)、瓜納瑞托病毒(Guanaritovirus)；和淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(LCMV)；布尼亞病毒(Bunyavirus)，包括但不限于龐塔托魯病毒(Puntatorovirus)、克里米亞半島-剛果出血熱病毒(Crimean-Congohemorrhagicfevervirus)、白蛉熱病毒(sandflyfevervirus)、立夫特山谷熱病毒(RiftValleyfevervirus)、拉克羅斯病毒(LaCrossevirus)、和漢坦病毒(hantavirus)；黃病毒(Flavivirus)，包括但不限于黃熱病、斑齊病毒(Banzivirus)、西尼羅病毒(WestNilevirus)、登革熱病毒、日本腦炎病毒、蜱媒腦炎、鄂木斯克出血熱(OmskHemorrhagicfever)、和科薩努爾森林病病毒(KyasanurForestDiseasevirus)；披膜病毒(Togavirus)，包括但不限于委內(nèi)瑞拉、東方、和西方馬腦炎病毒、羅斯河病毒(RossRivervirus)、和風(fēng)疹病毒；正痘病毒，包括但不限于痘苗、牛痘、天花、和猴痘；皰疹病毒；流感A/B；呼吸道合胞病毒(RAV)；副流感；麻疹；鼻病毒；腺病毒；塞姆利基森林病毒(SemlikiForestvirus)；病毒性出血熱；桿狀病毒；副粘病毒，包括但不限于尼帕病毒(Nipahvirus)和亨德拉病毒(Hendravirus)；及由美國疾病控制和預(yù)防中心確定為高度優(yōu)先的疾病因子的其它病毒因子(即A、B、和C類因子；見例如Moran，Emerg.Med.Clin.North.Am.20(2)311-30，2002及Darling等人，Emerg.Med.Clin.NorthAm.20(2)273-309，2002)。優(yōu)選的是，IFNa-清蛋白融合蛋白或IFN雜化物融合蛋白與CCR5拮抗劑聯(lián)合施用，進(jìn)而與利巴韋林(ribavirin)、IL-2、IL-12、噴他夫西(pentafuside)中的至少一種單獨(dú)聯(lián)合或聯(lián)合抗HIV藥物治療，例如HAART，用于制備在未接受過治療及接受過治療的成人和小兒患者中治療HIV-1感染、HCV、或HIV-1和HCV共感染的藥物。實(shí)施例80構(gòu)建物#3691，BNP-HSA的產(chǎn)生構(gòu)建物ID#3691，pC4:SPCON.BNP1-32/HSA在哺乳動物表達(dá)載體pC4中包含編碼BNP-清蛋白融合蛋白的DNA，它具有共有前導(dǎo)序列，secrecon，后面是融合在HSA成熟形式氨基末端的經(jīng)過加工的、有活性的BNP肽(氨基酸1-32)。用于構(gòu)建物3691的BNPcDNA的克隆使用下文所述引物BNP-1和BNP-2PCR擴(kuò)增編碼BNP的多核苷酸，用BamHI/ClaI切割，并連接到經(jīng)BamHI/ClaI切割的pC4:HSA中，產(chǎn)生構(gòu)建物ID#3691。構(gòu)建物ID#3691編碼清蛋白融合蛋白，它含有共有前導(dǎo)序列(SEQIDNO111)和經(jīng)過加工的活性形式的BNP，后面是成熟的HSA蛋白質(zhì)(見表2中構(gòu)建物3691的SEQIDNO321)。合成適于PCR擴(kuò)增編碼有活性的、經(jīng)過加工形式的BNP的多核苷酸的兩條核苷酸，BNP-1和BNP-2BNP-15′-GAGCGCGGATCCAAGCTTCCGCCATCATGTGGTGGCGCCTGTGGTGGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGTGGCCCATGGTGTGGGCCAGCCCCAAGCTGGTGCAAGG-3′(SEQIDNO463)BNP-25′-AGTCCCATCGATGAGCAACCTCACTCTTGTGTGCATCATGCCGCCTCAGCACTTTGC-3′(SEQIDNO464)BNP-1摻入BamHI克隆位點(diǎn)(下劃線)、編碼共有前導(dǎo)序列(SEQIDNO111)的多核苷酸(斜體)、和編碼BNP的頭7個氨基酸序列的多核苷酸(粗體)。在BNP-2中，下劃線序列為ClaI位點(diǎn)，它后面的多核苷酸含有編碼BNP的最后6個氨基酸(粗體)和成熟HSA蛋白質(zhì)的頭10個氨基酸的DNA的反向互補(bǔ)序列。使用這兩種引物PCR擴(kuò)增BNP蛋白質(zhì)。必須根據(jù)經(jīng)驗(yàn)為每對特異引物和模板確定退火和延伸溫度和時間。純化PCR產(chǎn)物(例如使用WizardPCRPrepsDNA純化系統(tǒng)；Promega公司)，然后用BamHI和ClaI消化。在通過凝膠電泳進(jìn)一步純化BamHI-ClaI片段后，將產(chǎn)物克隆到經(jīng)BamHI/ClaI消化的pC4:HSA中，產(chǎn)生構(gòu)建物ID#3691。驗(yàn)證表達(dá)構(gòu)建物的序列。構(gòu)建物ID3691的表達(dá)和純化293F細(xì)胞中的表達(dá)通過本領(lǐng)域已知的方法將構(gòu)建物ID#3691，pC4:SPCON.BNP1-32/HSA轉(zhuǎn)染到293F細(xì)胞中(見實(shí)施例6)。從293F細(xì)胞上清液純化轉(zhuǎn)染后3天收集到2升上清液。重組蛋白用5mlBlueSepharoseCL-6B柱(AmershamBiosciences，Piscataway，NJ，USA)捕捉并用2MNaCl洗脫。將物質(zhì)結(jié)合到HiPrep16/10PhenylFF(highsub)柱上并用20mMMESpH6.7洗脫。通過羥磷灰石柱層析在pH6.8以磷酸鈉緩沖液梯度(200ml中0-20mS/cm)進(jìn)一步純化BNP-HSA。通過HiPrep26/10脫鹽柱(AmershamBiosciences)將最終產(chǎn)物轉(zhuǎn)換到PBSpH7.2中。BNP-HSA的活性可以用體外NPR-A/cGMP測定法來測定利尿鈉肽受體-A(NPR-A)是BNP的信號受體，因而負(fù)責(zé)BNP的大多數(shù)生物學(xué)作用。BNP的生物活性是由在激活后將GTP轉(zhuǎn)變成cGMP的NPR-A鳥苷酸環(huán)化酶結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的。BNP活性的方便測定法是測量穩(wěn)定過表達(dá)NPR-A的293F細(xì)胞系的BNP刺激作用?？赏ㄟ^cGMPELISA來測量暴露于BNP后細(xì)胞中的cGMP生成。NPR-A293F穩(wěn)定克隆的篩選方法將人NPR-A的開放讀碼框構(gòu)建到pcDNA3.1表達(dá)載體(Invitrogen)中。通過脂轉(zhuǎn)染胺試劑(Lipofectamine)法用質(zhì)粒DNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染293F細(xì)胞，并用0.8ug/mlG418選擇。對293F/NPR-A穩(wěn)定克隆篩選對重組BNP的最好響應(yīng)。cGMP激活作用的測量BNP對cGMP的激活作用是在293F/NPR-A細(xì)胞中進(jìn)行的，并使用CatchPointcGMP熒光測定試劑盒(MolecularDevices，Sunnyvale，CA，USA)來測量。簡要的說，將96孔平皿中以50,000細(xì)胞/孔培養(yǎng)的293F/NPR-A細(xì)胞用80μl預(yù)刺激緩沖液(含有10mM葡萄糖pH7.4、15nM碳酸氫鈉、及0.75mM3-異丁基-1-甲基黃嘌呤的Krebs-Ringe碳酸氫鹽緩沖液)清洗。將40μl預(yù)刺激緩沖液中的BNP-HSA或重組BNP于37℃加入到細(xì)胞中達(dá)10分鐘。將細(xì)胞用40μl溶解緩沖液搖晃溶解10分鐘。按照制造商的指示測定溶菌產(chǎn)物中cGMP的數(shù)量。結(jié)果測定了BNP-HSA和重組BNP的劑量-應(yīng)答關(guān)系(見圖8)。構(gòu)建物ID#3691和重組BNP的最大活性是相似的(分別為1.63±0.016和1.80±0.016pm)，EC50值分別為28.4+1.2和0.46±1.1nM。BNP-HSA在體內(nèi)降低血壓方法BNP通過直接的血管舒張和通過抑制腎素/血管緊張素/內(nèi)皮縮血管肽/醛固酮系統(tǒng)而降低血壓。在購自Taconic(Germantown，NY，USA)的3月齡雄性自發(fā)性高血壓大鼠中測試BNP-HSA降低動脈血壓的能力。自發(fā)性高血壓大鼠是遺傳性高血壓，高血壓在3月齡后發(fā)作。將BNP-HSA或重組BNP在0.3ccPBS中重構(gòu)給予每只大鼠。藥物通過尾部靜脈注射投遞。使用XBP-1000系統(tǒng)(KentScientific，Torrington，CT，USA)通過套尾法記錄心臟收縮和心臟舒張的血壓。對于每個血壓數(shù)據(jù)點(diǎn)，采集4-5個連續(xù)讀數(shù)并取平均值。用1/3心臟收縮壓+2/3心臟舒張壓來計(jì)算平均動脈壓(MAP)。對于劑量-應(yīng)答測定，在以0.5、2、6和18nmol/kg的劑量施用pC4:SPCON.BNP1-32/HSA后20小時測量血壓。結(jié)果自發(fā)性高血壓大鼠的典型心臟收縮壓在服藥前是180-200mmHg。經(jīng)尾部靜脈注射投遞的單一推注6nmol/kgBNP-HSA降低心臟收縮和心臟舒張兩種血壓，達(dá)到平均動脈壓(MAP)降低超過30mmHg。降低的血壓穩(wěn)定并持續(xù)1天，然后在幾天內(nèi)逐漸恢復(fù)到基線(見圖9)。相反的，由于其瞬間清除，重組BNP的單一6nmol/kg推注僅產(chǎn)生約15mmHg的非常短暫的MAP降低。此外，在4只自發(fā)性高血壓大鼠中測定了推注注射BNP-HSA后20個小時的劑量-應(yīng)答。0.5nmol/kgBNP-HSA有平均7mmHg的MAP降低，而6nmol/kgBNP-HSA有平均30mmHg的MAP降低，18nmol/kg高劑量的BNP-HSA降低血壓的幅度僅比6nmol/kg略多一點(diǎn)。BNP-HSA對血漿cGMP的體內(nèi)誘導(dǎo)方法BNP的細(xì)胞內(nèi)cGMP活化作用導(dǎo)致其從細(xì)胞釋放到循環(huán)中。血漿cGMP水平與BNP誘導(dǎo)的心血管和腎生理學(xué)有關(guān)。血漿cGMP已經(jīng)用作體內(nèi)BNP作用的生物標(biāo)記。為了在體內(nèi)測試BNP-HSA對血漿cGMP的誘導(dǎo)，對11-12周齡雄性C57/BL6小鼠經(jīng)尾部靜脈通過單一推注以6nmol/kg的劑量投遞重組BNP或BNP-HSA。在重組BNP服藥組的5、10、20、40和80分鐘時間點(diǎn)和BNP-HSA組的額外640、1440、2880和5760分鐘從尾血制備血漿。在零時間點(diǎn)收集用PBS處理的小鼠的血漿樣品作為賦形劑對照。按照制造商的指示使用CatchPointcGMP熒光測定試劑盒測定cGMP水平。結(jié)果在單一靜脈內(nèi)推注6nmol/kg重組BNP或BNP-HSA后，超過基線的峰值血漿cGMP水平分別增加了3.9倍或5.6倍(見圖10)。此外，在用重組BNP處理后cGMP的單相指數(shù)式衰減半衰期(one-phaseexponentialdecayhalf-life)為16分鐘(10至42分鐘，95％CI)，而在施用BNP-HSA后cGMP的單相指數(shù)式衰減半衰期為1538分鐘(1017至3153分鐘，95％CI)。由構(gòu)建物ID3691編碼的BNP-清蛋白融合物的體內(nèi)藥動學(xué)分析方法11-12周齡雄性C57/BL6小鼠(從AceAnimals，Boyertown，PA，USA獲得)在研究時間體重為25.1±0.12g。所有動物以10ml/kg體重的體積服藥。給預(yù)服藥動物注射PBS。重組BNP腹膜內(nèi)注射到尾部或者皮下注射到肩胛中間區(qū)域。對下面的組進(jìn)行藥動學(xué)分析表8從下腔靜脈采集血樣，置于經(jīng)EDTA包被的微型容器中，并貯存在冰中。將樣品在微量離心機(jī)中于室溫以14,000rpm(16,000xg)離心10分鐘。將血漿轉(zhuǎn)移到簇管(clustertube)中并貯存于-80℃。使用BNPEIA試劑盒(PhoenixPharmaceutical，Belmont，CA，USA)測定血漿樣品中的BNP-HSA濃度。在與測試樣品相同的平皿上在相同的時間產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線。重組BNP的檢測極限為0.11ng/ml。該測定法檢測重組BNP且不與小鼠BNP交叉反應(yīng)。通過非區(qū)室法(WinNonlin；4.1版；PharsightCorp.，MountainView，CA，USA)進(jìn)行分析。分析中使用每個時間的平均血漿濃度。使用線性上升/對數(shù)下降梯形法來計(jì)算AUC0-t。用最后觀察到的濃度除以終端消除速率常數(shù)來進(jìn)行無窮大AUC0-∞的外推。將這些分析中的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)一加權(quán)。結(jié)果在服藥前樣品中檢測到的血漿中BNP-HSA平均基線濃度為大約0.081-0.095μg/ml。單一靜脈內(nèi)或皮下注射后，BNP-HSA有11.2(靜脈內(nèi)投遞)或19.3小時(皮下投遞)的終端消除半衰期(terminaleliminationhalf-life)，而重組BNP在小鼠中的半衰期為3.1分鐘。BNP-HSA的非區(qū)室分析(noncompartmentalanalysis)揭示了BNP-HSA具有下列特征表9選擇在靜脈內(nèi)曲線最終階段的5個點(diǎn)和皮下曲線最終階段的4個點(diǎn)用于最終半衰期的計(jì)算。如此得到的此最終階段的AUC分別是靜脈內(nèi)和皮下曲線總AUC的約10％。與之相比，在選擇最后3個點(diǎn)用于最終半衰期的計(jì)算時，分別僅有靜脈內(nèi)和皮下曲線總AUC的2％和4％。實(shí)施例81構(gòu)建物ID#3618，BNP(2X)-HSA的產(chǎn)生構(gòu)建物ID#3618，pC4:SPCON.BNP1-32(2x)/HSA在哺乳動物表達(dá)載體pC4中包含編碼BNP-清蛋白融合蛋白的DNA，它具有共有前導(dǎo)序列，secrecon，后面是融合在HSA成熟形式氨基末端的兩個經(jīng)過加工的、有活性的BNP肽(氨基酸1-32)。用于構(gòu)建物3618的BNPcDNA的克隆首先使用下文所述四種引物BNP-1、BNP-2、BNP-3和BNP-4從經(jīng)過加工的活性形式BNP(氨基酸1-32)PCR擴(kuò)增編碼雙重BNP模塊的多核苷酸，以產(chǎn)生兩個片段A和B。擴(kuò)增后，將兩個純化片段(A和B)以等摩爾量混合，并作為PCR模板，用下文所述引物BNP-5和BNP-6擴(kuò)增。然后用BamHI和ClaI消化BNP(2x)插入物，并連接到經(jīng)BamHI和ClaI預(yù)消化的pC4:HSA載體中，產(chǎn)生構(gòu)建物ID#3618。構(gòu)建物ID#3618編碼清蛋白融合蛋白，它含有共有前導(dǎo)序列，secrecon，(SEQIDNO111)，和經(jīng)過加工的活性形式BNP的兩個串聯(lián)拷貝，后面是成熟HSA蛋白質(zhì)(見表2中構(gòu)建物3618的SEQIDNO483)。首先合成適于PCR擴(kuò)增編碼BNP蛋白質(zhì)兩個片段的多核苷酸的四條寡核苷酸BNP-15′AGCCCCAAGATGGTGCAAGGGTCTGGCTGCTTTGGGAGGAAGATGGACCGGATCAGCTCCTCCAGTGGCTGGGCTGCAAAGTGCTGAGGCGGCAT-3′(SEQIDNO486)BNP-25′-CCTTGCACCATCTTGGGGCTATGCCGCCTCAGCACTTTGC-3′(SEQIDNO487)BNP-35′-GCAAAGTGCTGAGGCGGCATAGCCCCAAGATGGTGCAAGG-3′(SEQIDNO488)BNP-45′-AGTCCCATCGATGAGCAACCTCACTCTTGTGTGCATCATGCCGCCTCAGCACTTTGC-3′(SEQIDNO489)使用引物組BNP-I/BNP-2和BNP-3/BNP-4，PCR擴(kuò)增兩個BNP蛋白質(zhì)片段(分別為A和B)。必須根據(jù)經(jīng)驗(yàn)為每對特異引物和模板確定退火和延伸溫度和時間。純化片段A和B(例如使用WizardPCRPrepsDNA純化系統(tǒng)；PromegaCorp)，以等摩爾量混合，并作為模板用于使用適于PCR擴(kuò)增的另兩條寡核苷酸BNP-5和BNP-6的PCR擴(kuò)增BNP-55′-GAGCGCGGATCCAAGCTTCCGCCATCATGTGGTGGCGCCTGTGGTGGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGTGGCCCATGGTGTGGGCCAGCCCCAAGCTGGTGCAAGG-3′(SEQIDNO463)BNP-65′-AGTCCCATCGATGAGCAACCTCACTCTTGTGTGCATCATGCCGCCTCAGCACTTTGC-3′(SEQIDNO464)BNP-5摻入BamHI克隆位點(diǎn)(下劃線)、編碼共有前導(dǎo)序列(SEQIDNO111)的多核苷酸(斜體字)、和編碼BNP的前7個氨基酸序列的多核苷酸(粗體)。在BNP-6中，下劃線序列為ClaI位點(diǎn)，它后面的多核苷酸含有編碼BNP的最后6個氨基酸(粗體)和成熟HSA蛋白質(zhì)的頭10個氨基酸的DNA的反向互補(bǔ)序列。使用這兩種引物，PCR擴(kuò)增共有前導(dǎo)序列和活性BNP肽的兩個串聯(lián)拷貝。必須根據(jù)經(jīng)驗(yàn)為每對特異引物和模板確定退火和延伸溫度和時間。純化PCR產(chǎn)物(例如使用WizardPCRPrepsDNA純化系統(tǒng)；Promega公司)，然后用BamHI和ClaI消化。在通過凝膠電泳進(jìn)一步純化BamHI-ClaI片段后，將產(chǎn)物克隆到經(jīng)BamHI/ClaI消化的pC4:HSA中，產(chǎn)生構(gòu)建物ID#3618。驗(yàn)證表達(dá)構(gòu)建物的序列。構(gòu)建物ID3618的表達(dá)和純化293F細(xì)胞中的表達(dá)通過本領(lǐng)域已知的方法將構(gòu)建物ID#3618，pC4:SPCON.BNP1-32(2x)/HSA轉(zhuǎn)染到293F細(xì)胞中(見實(shí)施例6)。從293F細(xì)胞上清液純化如先前上文實(shí)施例80中在副標(biāo)題“從203F細(xì)胞上清液純化”下所述純化由構(gòu)建物ID#3618編碼的pC4:SPCON.BNPl-32(2x)/HSA。BNP(2X)-HSA的活性可以用體外NPR-A/cGMP測定法來測定由構(gòu)建物ID#3618編碼的BNP(2X)-HSA的活性可以如先前實(shí)施例80中在副標(biāo)題“BNP-HSA的活性可以用體外NPR-A/cGMP測定法來測定”和“NPR-A293F穩(wěn)定克隆的篩選方法”下所述通過NPR-A/cGMP測定法在體外測定。結(jié)果測定了BNP(2X)-HSA和重組BNP的劑量-應(yīng)答關(guān)系(見圖8)。由構(gòu)建物ID#3618編碼的BNP(2X)-HSA和重組BNP的最大活性是相似的(分別為1.68+0.021和1.80±0.016pm)，EC50值分別為9.8±1.1和0.46+1.1nM。將本申請中引用的每篇文獻(xiàn)(包括專利、專利申請、專利公布、雜志文章、摘要、實(shí)驗(yàn)指南、書籍、或其它公開)的全部公開以及可通過本申請中提到的GenBank、GeneSeq或CASRegistry特異標(biāo)識符獲得的信息完整引入本文作為參考。此外，將下述每項(xiàng)美國申請的說明書和序列表完整引入本文作為參考2005年2月4日提交的美國申請?zhí)?0/542,274；2004年3月5日提交的美國申請?zhí)?0/549,901；2004年3月29日提交的美國申請?zhí)?0/556,906；以及2004年12月17日提交的美國申請?zhí)?0/636,603。關(guān)于保藏生物材料的說明A.下面的說明涉及說明書第44頁表3提到的保藏生物材料。B.保藏物的鑒定保藏單位名稱美國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏單位地址10801UniversityBoulevardManassas，Virginia20110-2209UnitedStatesofAmerica加拿大申請人要求，直至在申請基礎(chǔ)上授予加拿大專利或申請被駁回，或者放棄且不再進(jìn)行恢復(fù)，或者撤回，專利局長只能批準(zhǔn)向局長指定的獨(dú)立專家提供本申請中所提到的保藏生物學(xué)材料的樣品，因此申請人必須在公布國際申請的技術(shù)準(zhǔn)備完成之前以書面聲明通知國際局。挪威申請人在此要求，直至申請已經(jīng)(通過挪威專利局)向公眾公開，或者在沒有公開的情況下已經(jīng)最終由挪威專利局做出決定，樣品應(yīng)當(dāng)只發(fā)放給本領(lǐng)域的專家。根據(jù)挪威專利法22和33(3)節(jié)，對此效力的要求應(yīng)當(dāng)在不遲于向公眾公開之日由申請人向挪威專利局提出。如果申請人已經(jīng)提出了此類要求，那么第三方提出的提供樣品的任何要求應(yīng)當(dāng)指出將使用的專家。該專家可以是挪威專利局草擬的公認(rèn)專家表上的任何人或是個案中申請人批準(zhǔn)的任何人。澳大利亞申請人在此通知，微生物樣品應(yīng)當(dāng)在授予專利之前、或者在終止、駁回或撤回申請之前只發(fā)放給作為與本發(fā)明無利害關(guān)系(interest)的熟練從業(yè)人員的人員(澳大利亞專利條例的條例3.25(3))。芬蘭申請人在此要求，直至申請已經(jīng)(通過國家專利和管理委員會)向公眾公開，或者在沒有向公眾公開的情況下已經(jīng)最終由國家專利和管理委員會做出決定，樣品應(yīng)當(dāng)只發(fā)放給本領(lǐng)域的專家。英國申請人要求，微生物的樣品只能提供給專家。該申請必須由申請人在該申請作好國際公布的技術(shù)準(zhǔn)備前提交給國際局才能生效。丹麥申請人要求，直至該申請已經(jīng)國際公開(由丹麥專利局)，或已經(jīng)由丹麥專利局在沒有向公眾公開的情況下作出最后決定，生物樣品僅能發(fā)放給本領(lǐng)域的專家。依照丹麥專利法案第22和33(3)節(jié)，該要求在由申請人在不遲于向公眾公開之日提交給丹麥專利局才能生效。如果申請人已經(jīng)提交了這樣的要求，那么任何第三方所提出的提供樣品的要求都要滿足專家使用的規(guī)定。所述專家可以是丹麥專利局所認(rèn)可的專家名單中的任何專家，或者是申請人個案認(rèn)可的任何人。瑞典申請人要求，直至該申請已經(jīng)國際公開(由瑞典專利局)，或已經(jīng)由瑞典專利局在沒有向公眾公開的情況下作出最后決定，生物樣品僅能發(fā)放給本領(lǐng)域的專家。該要求必須在優(yōu)先權(quán)之日起16個月屆滿前提交給國際局(優(yōu)選以PCT申請人指南的第I卷附件Z中PCT/RO/134表的形式)才能生效。如果申請人已經(jīng)提交了這樣的要求，那么任何第三方所提出的要求提供樣品的要求都要滿足專家使用的規(guī)定。所述專家可以是丹麥專利局所認(rèn)可的專家名單中的任何專家，或者是申請人個案認(rèn)可的任何人。荷蘭申請人要求，直至荷蘭專利授權(quán)之日或直至該申請被駁回或撤回或放棄之日，按照專利法31F(1)的規(guī)定，微生物僅可發(fā)放給專家。該要求必須由申請人在該申請按照荷蘭專利法案的第22C節(jié)或第25節(jié)的規(guī)定向公眾公開之日(兩個日期無論那個在先)前提交給荷蘭工業(yè)產(chǎn)權(quán)局才能生效。權(quán)利要求1.包含選自下組的成員的清蛋白融合蛋白(a)治療性蛋白質(zhì)X和包含SEQIDNO1的氨基酸序列的清蛋白；(b)治療性蛋白質(zhì)X和SEQIDNO1的氨基酸序列的片段或變體，其中所述片段或變體具有清蛋白活性；(c)治療性蛋白質(zhì)X和SEQIDNO1的氨基酸序列的片段或變體，其中所述片段或變體具有清蛋白活性，且其中所述清蛋白活性是與未融合狀態(tài)的治療性蛋白質(zhì)X的保存期相比延長治療性蛋白質(zhì)X的保存期的能力；(d)治療性蛋白質(zhì)X和SEQIDNO1的氨基酸序列的片段或變體，其中所述片段或變體具有清蛋白活性，且其中所述片段或變體包含SEQIDNO1的氨基酸1-387的氨基酸序列；(e)治療性蛋白質(zhì)X的片段或變體和包含SEQIDNO1的氨基酸序列的清蛋白，其中所述片段或變體具有治療性蛋白質(zhì)X的生物學(xué)活性；(f)(a)-(e)的治療性蛋白質(zhì)X或其片段或變體和清蛋白或其片段或變體，其中所述治療性蛋白質(zhì)X或其片段或變體融合在清蛋白的N-未端，或清蛋白片段或變體的N-末端；(g)(a)-(e)的治療性蛋白質(zhì)X或其片段或變體和清蛋白或其片段或變體，其中所述治療性蛋白質(zhì)X或其片段或變體融合在清蛋白的C-末端，或清蛋白片段或變體的C-末端；(h)(a)-(e)的治療性蛋白質(zhì)X或其片段或變體和清蛋白或其片段或變體，其中所述治療性蛋白質(zhì)X或其片段或變體融合在清蛋白的N-末端和C-末端，或清蛋白片段或變體的N-末端和C-末端；(i)(a)-(e)的治療性蛋白質(zhì)X或其片段或變體和清蛋白或其片段或變體，它包含第一治療性蛋白質(zhì)X或其片段或變體和第二治療性蛋白質(zhì)X或其片段或變體，其中所述第一治療性蛋白質(zhì)X或其片段或變體不同于所述第二治療性蛋白質(zhì)X或其片段或變體；(j)(a)-(i)的治療性蛋白質(zhì)X或其片段或變體和清蛋白或其片段或變體，其中所述治療性蛋白質(zhì)X或其片段或變體通過接頭與所述清蛋白或清蛋白片段或變體分開；和(k)(a)-(j)的治療性蛋白質(zhì)X或其片段或變體和清蛋白或其片段或變體，其中所述清蛋白融合蛋白具有如下通式R1-L-R2；R2-L-R1；或R1-L-R2-L-R1，且其中R1是治療性蛋白質(zhì)X或其片段或變體，L是肽接頭，而R2是包含SEQIDNO1的氨基酸序列的清蛋白或清蛋白的片段或變體。2.權(quán)利要求1的清蛋白融合蛋白，其中所述清蛋白融合蛋白的保存期或血漿穩(wěn)定性大于未融合狀態(tài)的治療性蛋白質(zhì)X或其片段或變體的保存期或血漿穩(wěn)定性。3.權(quán)利要求1的清蛋白融合蛋白，其中與清蛋白或其片段或變體融合的治療性蛋白質(zhì)X或其片段或變體的體外生物學(xué)活性大于未融合狀態(tài)的治療性蛋白質(zhì)X或其片段或變體的體外生物學(xué)活性。4.權(quán)利要求1的清蛋白融合蛋白，其中與清蛋白或其片段或變體融合的治療性蛋白質(zhì)X或其片段或變體的體內(nèi)生物學(xué)活性大于未融合狀態(tài)的治療性蛋白質(zhì)X或其片段或變體的體內(nèi)生物學(xué)活性。5.包含插入到清蛋白或其片段或變體中的治療性蛋白質(zhì)X或其片段或變體的清蛋白融合蛋白，包含SEQIDNO1的氨基酸序列或其片段或變體。6.包含插入到清蛋白或其片段或變體中的治療性蛋白質(zhì)X或其片段或變體的清蛋白融合蛋白，包含選自下組的一個或多個氨基酸序列(a)SEQIDNO1的氨基酸54-61；(b)SEQIDNO1的氨基酸76-89；(c)SEQIDNO1的氨基酸92-100；(d)SEQIDNO1的氨基酸170-176；(e)SEQIDNO1的氨基酸247-252；(f)SEQIDNO1的氨基酸266-277；(g)SEQIDNO1的氨基酸280-288；(h)SEQIDNO1的氨基酸362-368；(i)SEQIDNO1的氨基酸439-447；(j)SEQIDNO1的氨基酸462-475；(k)SEQIDNO1的氨基酸478-486；和(l)SEQIDNO1的氨基酸560-566。7.權(quán)利要求5的清蛋白融合蛋白，其中所述清蛋白融合蛋白包含與未融合狀態(tài)的治療性蛋白質(zhì)X或其片段或變體的保存期或血漿穩(wěn)定性相比足以延長治療性蛋白質(zhì)X或其片段或變體的保存期或血漿穩(wěn)定性的部分清蛋白。8.權(quán)利要求6的清蛋白融合蛋白，其中所述清蛋白融合蛋白包含與未融合狀態(tài)的治療性蛋白質(zhì)X或其片段或變體的保存期或血漿穩(wěn)定性相比足以延長治療性蛋白質(zhì)X或其片段或變體的保存期或血漿穩(wěn)定性的部分清蛋白。9.權(quán)利要求5的清蛋白融合蛋白，其中所述清蛋白融合蛋白包含與未融合狀態(tài)的治療性蛋白質(zhì)X或其片段或變體的體外生物學(xué)活性相比足以延長與清蛋白融合的治療性蛋白質(zhì)X或其片段或變體的體外生物學(xué)活性的部分清蛋白。10.權(quán)利要求6的清蛋白融合蛋白，其中所述清蛋白融合蛋白包含與未融合狀態(tài)的治療性蛋白質(zhì)X或其片段或變體的體外生物學(xué)活性相比足以延長與清蛋白融合的治療性蛋白質(zhì)X或其片段或變體的體外生物學(xué)活性的部分清蛋白。11.權(quán)利要求5的清蛋白融合蛋白，其中所述清蛋白融合蛋白包含與未融合狀態(tài)的治療性蛋白質(zhì)X或其片段或變體的體內(nèi)生物學(xué)活性相比足以延長與清蛋白融合的治療性蛋白質(zhì)X或其片段或變體的體內(nèi)生物學(xué)活性的部分清蛋白。12.權(quán)利要求6的清蛋白融合蛋白，其中所述清蛋白融合蛋白包含與未融合狀態(tài)的治療性蛋白質(zhì)X或其片段或變體的體內(nèi)生物學(xué)活性相比足以延長與清蛋白融合的治療性蛋白質(zhì)X或其片段或變體的體內(nèi)生物學(xué)活性的部分清蛋白。13.權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)的清蛋白融合蛋白，它是非糖基化的。14.權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)的清蛋白融合蛋白，它是在酵母中表達(dá)的。15.權(quán)利要求14的清蛋白融合蛋白，其中所述酵母是糖基化缺陷的。16.權(quán)利要求14的清蛋白融合蛋白，其中所述酵母是糖基化和蛋白酶缺陷的。17.權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)的清蛋白融合蛋白，它是由哺乳動物細(xì)胞表達(dá)的。18.權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)的清蛋白融合蛋白，其中所述清蛋白融合蛋白是由培養(yǎng)中的哺乳動物細(xì)胞表達(dá)的。19.權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)的清蛋白融合蛋白，其中所述清蛋白融合蛋白還包含分泌前導(dǎo)序列。20.包含權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)的清蛋白融合蛋白和制藥學(xué)可接受載體的組合物。21.包含權(quán)利要求20的組合物的試劑盒。22.治療患者的疾病或紊亂的方法，包括施用權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)的清蛋白融合蛋白的步驟。23.權(quán)利要求22的方法，其中所述疾病或紊亂包含適應(yīng)癥Y。24.治療患有受治療性蛋白質(zhì)X或其片段或變體調(diào)節(jié)的疾病或紊亂的患者的方法，包括施用有效量的權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)的清蛋白融合蛋白的步驟。25.權(quán)利要求24的方法，其中所述疾病或紊亂是適應(yīng)癥Y。26.延長治療性蛋白質(zhì)X或其片段或變體的保存期或血漿穩(wěn)定性的方法，包括將治療性蛋白質(zhì)X或其片段或變體與清蛋白或其片段或變體融合的步驟，與未融合狀態(tài)的治療性蛋白質(zhì)X或其片段或變體的保存期相比，所述清蛋白或其片段或變體足以延長治療性蛋白質(zhì)X或其片段或變體的保存期或血漿穩(wěn)定性。27.核酸分子，包含編碼權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)的清蛋白融合蛋白的多核苷酸序列。28.包含權(quán)利要求27的核酸分子的載體。29.包含權(quán)利要求28的核酸分子的宿主細(xì)胞。全文摘要本發(fā)明涵蓋清蛋白融合蛋白。本發(fā)明還涵蓋編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的核酸分子，以及含有這些核酸的載體、經(jīng)過這些核酸載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞、及使用這些核酸、載體和/或宿主細(xì)胞和生成本發(fā)明清蛋白融合蛋白的方法。另外，本發(fā)明還涵蓋包含清蛋白融合蛋白的藥物組合物以及使用本發(fā)明的清蛋白融合蛋白來治療、預(yù)防或改善疾病、紊亂或狀況的方法。文檔編號C07K14/765GK1980687SQ200580012252公開日2007年6月13日申請日期2005年2月9日優(yōu)先權(quán)日2004年2月9日發(fā)明者克雷格·A·羅森,威廉·A·哈塞爾廷,保羅·A·穆爾,賈森·B·博克,亞當(dāng)·貝爾,石陽古,戴維·拉弗勒申請人:人類基因科學(xué)公司