專利名稱：腎綜合征出血熱快速金標(biāo)診斷試紙條的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及疾病診斷的抗原，具體說是一種用于腎綜合征出血熱診斷的重組抗原及其快速金標(biāo)診斷試紙條。
背景技術(shù)：
漢坦病毒(Hantaviruses，HV)流行范圍廣泛、危害嚴(yán)重，已成為一個全球性的公共衛(wèi)生問題。由HV感染引起的腎綜合征出血熱(hemorrhagic fever withrenal syndrome，HFRS)是一組以發(fā)熱、出血和腎臟損害為主要臨床表現(xiàn)的急性傳染病。疫區(qū)分布于亞洲、歐洲、非洲和美洲32個國家和地區(qū)，但主要流行于亞洲的我國和韓國，次為歐洲的俄羅斯、芬蘭和前南斯拉夫等國，非洲和美洲的病例較少；疫源地則遍及世界五大洲70余個國家。在中國，HFRS是除病毒性肝炎之外危害最大的病毒性傳染病，其發(fā)病人數(shù)占世界發(fā)病總數(shù)90％以上。
1978年韓國學(xué)者李鎬汪等率先成功地分離到HFRS的病原——HV，并建立了檢測抗原和抗體的特異性免疫熒光技術(shù)，使HFRS防治的研究進(jìn)入了一個新的階段。在血清學(xué)檢測和實驗研究中，目前已經(jīng)建立了一系列技術(shù)方法，如間接免疫熒光法(IFA)、免疫酶聯(lián)吸附實驗(ELISA)、血凝抑制試驗(HI)、空斑減少中和試驗(PRNT)等。但是，就實驗室診斷而言，目前在國內(nèi)應(yīng)用最普遍的仍屬IFA。IFA具有很好的敏感性和特異性，但需要熒光顯微鏡和訓(xùn)練有素的專業(yè)人員，難以在農(nóng)村、基層醫(yī)院及現(xiàn)場使用?？偟膩碚f，近年問世的各種HV基因、抗原和抗體的檢測新技術(shù)尚不夠穩(wěn)定，有些方法較為復(fù)雜，操作流程長，難以在基層單位或工作現(xiàn)場應(yīng)用；此外，國內(nèi)HFRS檢測試劑或藥盒的標(biāo)準(zhǔn)化和商品化率還較低。因此，急需建立一種快速、簡便、特異、敏感、穩(wěn)定和規(guī)范的，并能滿足不同需要的早期診斷方法。
研究發(fā)現(xiàn)漢坦病毒核衣殼蛋白上含有屬特異性、型特異性、組特異性和病毒株特異性抗原位點。N蛋白的N未端100aa(氨基酸)主要是親水性的，具有免疫優(yōu)勢，存在交叉反應(yīng)性的線性抗原表位。近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，新的病毒學(xué)檢測方法不斷被應(yīng)用于HFRS防治研究中，如應(yīng)用重組HV核衣殼蛋白(NP)替代從細(xì)胞培養(yǎng)或乳鼠鼠腦制備的病毒抗原，具有安全、省時、易于純化和標(biāo)化等優(yōu)點，而且漢坦病毒的核衣殼蛋白同源性最高，抗原性最保守，免疫原性強(qiáng)，且容易表達(dá)，患者對該蛋白的抗體應(yīng)答產(chǎn)生早而且滴度高。因而，可以運用重組的NP抗原進(jìn)行HFRS血清學(xué)診斷。
膠體金是一種處于半還原狀態(tài)的懸浮顆粒，能迅速吸附蛋白質(zhì)等大分子而不影響其活性，膠體金具有易分辨的紅至紫紅色，在與大分子結(jié)合后，易于用肉眼識別，不需二級放大即可直接觀察結(jié)果，膠體金診斷產(chǎn)品因而可直接進(jìn)入沒有復(fù)雜檢測設(shè)備的診所甚至家庭里。近年來，以早孕檢測試紙為代表的膠體金免疫診斷試劑已進(jìn)入千家萬戶，給人們的生活帶來很大的方便。
從包括中國專利等有關(guān)資料檢索表明，目前尚未有利用基因工程方法獲得高表達(dá)、高活性的截短N(yùn)P重組抗原用于腎綜合征出血熱的診斷及可同時檢測HFRS病人血清中IgM、IgG抗體的HFRS金標(biāo)快速診斷試紙條的相關(guān)報道。

發(fā)明內(nèi)容
為了彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是要提出一種用于HFRS診斷的截短N(yùn)P重組抗原e112及可同時檢測HFRS病人血清中IgM、IgG抗體的HFRS快速金標(biāo)診斷試紙條。
本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是一.溶液配方(1)重組抗原溶解液SDS 0.1％甘氨酸 250mmol/LTris.Cl 25mmol/L(2)膠體金溶液0.03～0.05％的四氯金酸，加1～2％檸檬酸三鈉制備成膠體金顆粒；(3)二抗羊抗人IgG單抗、羊抗人μ鏈單抗，羊抗鼠IgG單抗由廈門波生生物技術(shù)有限公司研制；(4)包被緩沖液含1～3％蔗糖的磷酸鹽緩沖液；(5)基礎(chǔ)緩沖液由廈門波生生物技術(shù)有限公司研制，主要含牛血清白蛋白的緩沖液；(6)反應(yīng)緩沖液含0.01～0.05％NaN3的磷酸鹽緩沖液；(7)磷酸鹽緩沖液(PBS)為在800ml蒸餾水中溶解8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4，用鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.2～7.6，加水定容至1L。
二.本發(fā)明重組抗原的工藝流程(1)本研究所用的漢坦病毒株A537是1985年在福建省周寧縣HFRS疫區(qū)捕獲的一黑線姬鼠肺組織中應(yīng)用Vero E6細(xì)胞直接分離出漢坦病毒株A537；(2)以漢坦病毒株A537基因組為模板，以P14為逆轉(zhuǎn)錄引物、4S1/S2為PCR擴(kuò)增引物，用逆轉(zhuǎn)錄PCR法常規(guī)擴(kuò)增得到S基因全長片段，其大小為1696bp，用TA克隆技術(shù)將此大片段克隆入TA載體pMD 18-T中，獲得重組質(zhì)粒TA-A537；(3)以該重組質(zhì)粒TA-A537為模板，以P1、P112為引物(p1為正向引物，添加了NcoI酶切位點；p112為反向引物，添加了Sal I酶切位點和終止密碼子tta)，從中擴(kuò)增出長度約330bp的截短片段p1-112，將此片段定向插入原核表達(dá)載體pET-30a，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)；Western blot證實該重組抗原e112能被HFRS患者陽性血清所識別，以上所用引物見表1；表1漢坦病毒克隆、表達(dá)所應(yīng)用的引物

(4)克隆基因p1-112的核酸序列及其所編碼的氨基酸序列1ATG GAG GAA CTG CAG AGG GAA ATC AAT GCC CAT GAG GGT CAA CTG 451Met Glu Glu Leu Gln Arg Glu Ile Asn Ala His Glu Gly Gln Leu 1546 GTG ATA GCC AGG CAG AAG GTG AGG GAT GCA GAA AAA CAA TAT GAA 9016 Val Ilc Ala Arg Gln Lys Val Arg Asp Ala Glu Lys Gln Tyr Glu 3091 AAG GAT CCA GAT GAG CTG AAT AAA AGA ACA TTA ACA GAC AGA GAA 13531 Lys Asp Pro Asp Glu Leu Asn Lys Arg Thr Leu Thr Asp Arg Glu 45
136 GGG GTT GCA GCA TCT ATC CAG GCC AAG ATT GAT GAA TTG AAA AGG 18046Gly Val Ala Ala Ser Ile Gln Ala Lys lle Asp Glu Leu Lys Arg60181 CAG TTA GCA GAT AGG ATT GCA ACC GGA AAG AAC CrT GGG AAA GAA 22561Gln Leu Ala Asp Arg Tle Ala Thr Gly Lys Asn Leu Gly Lys Glu 75226 CAG GAT CCC ACA GGG GTT GAG CCT GGA GAC CAT CTG AAA GAG AGA 27091Gln Asp Pro Thr Gly Val Glu Pro Gly Asp Hls Leu Lys Glu Arg 105271 TCA ATG CTT AGT TAT GGA AAT GTA TTG GAT TTG AAC CAC CTG GAT 31591Ser Met Leu Ser Tyr Gly Asn Val Leu Asp Leu Asn His Leu Asp 105316 ATT GAT GAG CCT TAA330106 Ile Asp Glu Pro End110(5)采用電洗脫方法純化重組蛋白對大量誘導(dǎo)時收集的菌體進(jìn)行超聲粉碎后，將超聲上清先經(jīng)過飽和硫銨沉淀粗純后，取飽和硫銨沉淀物進(jìn)行SDS-PAGE電泳，用0.3mol/L CuCl2進(jìn)行染色確定目標(biāo)蛋白帶e112在凝膠中的位置，切下目標(biāo)蛋白帶e112，置于透析袋中進(jìn)行電洗脫；純化蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，確定純度并進(jìn)行蛋白定量。
三.本發(fā)明的試紙條制作工藝(1)以膠體金標(biāo)記重組抗原e112和鼠IgG；(2)兩種金標(biāo)抗原溶液混合后充分浸潤玻璃纖維紙，置凍干機(jī)凍干；(3)羊抗人μ鏈單抗1.0～5.0mg/ml、羊抗人IgG單抗1.0～5.0mg/ml與羊抗鼠IgG單抗1.0～5.0mg/ml包被NC膜，自然晾干；(4)將吸水紙、NC膜和吸附了金標(biāo)抗原的玻璃纖維組裝成檢測IgM、IgG的金標(biāo)試紙條。
用本發(fā)明制作的重組抗原e112及利用重組抗原制作成的HFRS快速金標(biāo)診斷試紙條就可以用于HFRS臨床診斷。
本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明利用基因工程技術(shù)，克隆漢坦病毒的免疫優(yōu)勢抗原的結(jié)構(gòu)基因，并在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)，以方便地獲得大量廉價的重組抗原，純化后即可用于免疫學(xué)診斷。由此方法得到的重組抗原及快速診斷試紙條克服了現(xiàn)有HFRS診斷方法的局限性，具有很高的靈敏度、特異度，而且可以同時檢測HFRS病人血清中IgM、IgG抗體。這對判斷患者的感染狀態(tài)，及對患者作出早期診斷，以贏得最佳的治療時間，降低病死率及提高治愈率無疑具有重要的意義。此外，由于金標(biāo)試紙條無需特殊儀器，無需訓(xùn)練有素的專業(yè)人員，可以滿足基層醫(yī)院、農(nóng)村衛(wèi)生院等臨床檢測的需要，而且大大的降低了成本，方便了患者，適用于大規(guī)模的血清流行病學(xué)調(diào)查。


圖1是本發(fā)明的快速金標(biāo)診斷試紙條。
圖中1對照線，2 IgM，3 IgG，4 加樣處。
具體實施例方式
實施例1一、重組抗原的制備1、本研究所用的漢坦病毒株A537是從1985年在福建省周寧縣HFRS疫區(qū)捕獲的一黑線姬鼠肺組織中應(yīng)用Vero E6細(xì)胞直接分離的毒株；2、取病毒感染上清，用Viral RNA Mini Kit(QIAGEN公司)提取試劑盒提取病毒RNA。
3、用P14逆轉(zhuǎn)錄引物及S1/S2PCR擴(kuò)增引物從漢坦病毒A537株基因組中擴(kuò)增出全長的S基因共1696bp。RT-PCR反應(yīng)體系如下逆轉(zhuǎn)錄20μl反應(yīng)體系包含以下成份

逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件室溫10min，42℃逆轉(zhuǎn)錄1h，96℃ 5min，置冰上5min，cDNA凍存于-20℃PCR50μl反應(yīng)體系包含以下成份


PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件94℃ 5min；94℃ 45s，55℃ 45s，72℃ 2min，35cycles；72℃ 10min4、采用QIAquick Gel extraction試劑盒對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化。用TA克隆技術(shù)將純化后的PCR產(chǎn)物直接克隆入TA載體pMD 18-T中，獲得重組克隆質(zhì)粒，命名為TA-A537；5、以該重組克隆質(zhì)粒TA-A537為模板，用P1/P112引物擴(kuò)增出長度約330bp的片段p1-112，將擴(kuò)增得到的截短片段p1-112及原核表達(dá)載體pET-30a分別用NcoI和Sal I雙酶切，并用QIAquick Gel extraction試劑盒純化回收產(chǎn)物。
6、將目的基因片段與表達(dá)載體pET-30a進(jìn)行定向連接，從而構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，命名為pET-112按TaKaRa DNA連接試劑盒(Version2.1)操作說明書進(jìn)行。
①將質(zhì)粒載體DNA(0.03pmol)與插入DNA片段(0.1～0.3pmol)混合制備成體積為5μl～10μl的DNA溶液。
②向上述DNA溶液中加入等體積的Solution I，混合均勻。
③16℃反應(yīng)30min～2h。
④取10～20μl上述連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化100μl相應(yīng)的感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)。
7、重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定篩選陽性克隆，以Sal I單酶切，Nco I、Sal I雙酶切對重組表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，篩選陽性克隆。
8、重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)(1)挑單菌落于5ml含Kan+(30ug/ml)的LB培養(yǎng)液中，37℃250rpm/min過夜培養(yǎng)；(2)將過夜培養(yǎng)的含重組質(zhì)粒的表達(dá)菌以1∶100擴(kuò)種。
(3)表達(dá)菌生長到OD值約0.8時，加入IPTG使終濃度為1mM，37℃誘導(dǎo)4h。
(4)菌液用4℃ 8000rpm/min，離心5min收集菌體，沉淀倒置扣干備用。
9、對誘導(dǎo)前后的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE鑒定表達(dá)效果10、對重組抗原進(jìn)行Western blot鑒定表達(dá)產(chǎn)物的抗原活性11、用電洗脫方法純化重組抗原(1)細(xì)菌的裂解(超聲波粉碎法)①將1500ml表達(dá)菌液于4℃，6000r/min，離心10min。
②Buffer I 100ml懸浮沉淀，置冰浴上，350W超聲粉碎20min(2sec超聲，5sec間隔)。
Buffer I(pH 7.2)5mM EDTA20mM Tris.Cl150mMNaCl③4℃，12000r/min，離心10min，取少量沉淀和上清進(jìn)行SDS-PAGE，確定目標(biāo)蛋白位置及純度，可溶性蛋白存在于上清中。
(2)飽和硫銨沉淀①將上述細(xì)菌裂解上清轉(zhuǎn)移到燒杯中，置冰浴上，放在磁力攪拌器上邊攪拌邊加飽和硫銨(S終為10％)，流速控制在1ml/min?；旌弦褐?℃冰箱靜置過夜或＞4h。以防因局部硫銨濃度過高而使蛋白在局部濃縮沉淀。
飽和硫銨加樣量 (X為細(xì)菌裂解液體積，S為飽和硫銨濃度)②取出混合液，4℃，12000r/min，離心10min。留取上清，沉淀用少量去離子水重懸，于4℃冰箱保存。
③測量下上清體積，并將上清移到燒杯中，按上述公式計算所需加入的飽和硫銨的量(S終為20％)。置冰浴上，邊攪拌邊緩慢地加入飽和硫銨，混合液置4℃冰箱靜置過夜或＞4h。
④重復(fù)2～3步驟，但S終為30％，以此類推，每次飽和硫銨加樣量遞增10％。直到幾乎所有目標(biāo)蛋白出現(xiàn)沉淀為止。
(3)電洗脫①配制分離膠8塊，積層膠不加梳子，留出位置用于加樣。
②對大量誘導(dǎo)時收集的菌體進(jìn)行超聲粉碎。
③超聲上清先經(jīng)過飽和硫銨沉淀粗純后，取飽和硫銨沉淀物加6×加樣緩沖液上樣，每板加6ml，注意不要有氣泡。
④SDS-PAGE先80V電泳，當(dāng)樣品后沿進(jìn)入分離膠后，升至110-120V，電泳過夜。
⑤切膠取下膠，約在膠的縱向1/3處切一小條膠進(jìn)行CuCl2染色。約3min后，將凝膠小條取出，重新放置于原來的位置，觀察目標(biāo)條帶在凝膠中的位置，切下目標(biāo)條帶，置于1×SDS電泳緩沖液中。
CuCl2染色染色液 0.3M CuCl2脫色液(pH 9.0) 0.25M EDTA0.25M Tris.Cl⑥將膠條分成3段，置于透析袋中，并加入1×SDS電泳緩沖液，以浸沒膠為宜，置于水平電泳槽上電泳。電洗脫12h，每4h吸出透析袋中的溶液，更換新的電泳緩沖液(共3次)，吸出的液體即為洗脫出的純化蛋白溶液。
⑦純化樣品進(jìn)行SDS-PAGE，確定純度。
⑧蛋白定量參照DU530核酸蛋白分析儀說明書進(jìn)行。
①在主菜單上選擇蛋白分析程序。
②選擇UV280方法測定蛋白濃度。
③以牛血清白蛋白(BSA)為參考蛋白，以溶解待測定蛋白的溶液配制一系列濃度的BSA溶液，測定其OD值，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。
④以溶解BSA的溶液調(diào)零。
實施例2HFRS金標(biāo)快速診斷試紙條的制作(1)取0.03％四氯金酸1000ml，加熱至沸騰，加入1％檸檬酸三鈉溶液25ml，繼續(xù)煮沸5分鐘，待膠體金溶液顏色由有藍(lán)經(jīng)紫變紅后，自然冷卻后備用；(2)取膠體金溶液1ml，加入0.2M K2CO310μl、50μg純化抗原，攪勻后靜置1h；(3)加入20％牛血清白蛋白25μl、20％PEG 20,000 15μl，8,000r/min，離心8min，棄上清；(4)將沉淀懸浮于1ml基礎(chǔ)緩沖液中，即為金標(biāo)抗原溶液；(5)同法標(biāo)記鼠IgG；(6)兩種金標(biāo)抗原溶液混合后充分浸潤玻璃纖維紙，置凍干機(jī)凍干；(7)羊抗鼠IgG單抗3.0mg/ml、羊抗人μ鏈單抗2.0mg/ml、羊抗人IgG單抗2.0mg/ml，分別在NC膜的上、中、下位置包被NC膜，自然晾干；(8)在約10cm寬的底板上，將吸水紙、NC膜、吸附了金標(biāo)抗原的玻璃纖維和未吸附抗原的玻璃纖維組裝成檢測IgM與IgG的試紙條。
評價將血清或血漿10ul+90ul PBS進(jìn)行1∶10稀釋后，取至少60ul的樣本稀釋液加到樣品吸收處，5-10分鐘內(nèi)觀察金標(biāo)抗原釋放后NC膜上檢測線和對照線的反應(yīng)情況，檢測線和對照線同時出現(xiàn)紅色條帶判為陽性，僅對照線出現(xiàn)紅色條帶判為陰性，對照線未出現(xiàn)條帶為無效試驗，具體判斷方法見表2。
表2金標(biāo)診斷試紙條的判斷原則

用HFRS金標(biāo)試劑條對福建(家鼠型為主)、江蘇(混合型)、山西(家鼠型為主)、陜西(姬鼠型為主)四省疾控中心保存的腎綜合征出血熱陽性、陰性血清共828份進(jìn)行檢測。以IFAT/ELISA為參照標(biāo)準(zhǔn)，HFRS金標(biāo)試劑條的敏感性為97.9％，特異性為98.2％，總一致率為98.1％。這充分顯示出該金標(biāo)試劑條具有很高的靈敏度、特異度，而且具有操作簡便、快速，不需要特殊儀器設(shè)備，結(jié)果易于觀察，便于保存和運輸?shù)葍?yōu)點，非常適用于各種層次尤其是基層醫(yī)療單位、農(nóng)村衛(wèi)生院等缺乏實驗條件和專業(yè)人員的地方開展此項工作。
權(quán)利要求
1.一組腎綜合征出血熱快速金標(biāo)診斷試紙條的溶液配方，其特征是(1)重組抗原溶解液SDS 0.1％甘氨酸 250mmol/LTris.Cl 25mmol/L(2)膠體金溶液0.03～0.05％的四氯金酸，加1～2％檸檬酸三鈉制備成膠體金顆粒；(3)二抗羊抗人IgG單抗、羊抗人μ鏈單抗，羊抗鼠IgG單抗；(4)包被緩沖液含1～3％蔗糖的磷酸鹽緩沖液；(5)基礎(chǔ)緩沖液由廈門波生生物技術(shù)有限公司研制，主要含牛血清白蛋白的緩沖液；(6)反應(yīng)緩沖液0.01～0.05％NaN3的磷酸鹽緩沖液；(7)磷酸鹽緩沖液(PBS)為在800ml蒸餾水中溶解8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4，用鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.2～7.6，加水定容至1L。
2.腎綜合征出血熱快速金標(biāo)診斷試紙條的重組抗原工藝流程，其特征是(1)從一黑線姬鼠肺組織中應(yīng)用Vero E6細(xì)胞直接分離出漢坦病毒株A537；(2)以漢坦病毒株A537基因組為模板，以P14為逆轉(zhuǎn)錄引物、4S1/S2為PCR擴(kuò)增引物，用道轉(zhuǎn)錄PCR法常規(guī)擴(kuò)增得到S基因全長片段，其大小為1696bp，用TA克隆技術(shù)將此大片段克隆入TA載體pMD 18-T中，獲得重組質(zhì)粒TA-A537；(3)以該重組質(zhì)粒TA-A537為模板，以P1、P112為引物，從中擴(kuò)增出長度約330bp的截短片段p1-112，將片段定向插入原核表達(dá)載體pET-30a，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)；Western blot證實該重組抗原e112能被HFRS患者陽性血清所識別；(4)采用電洗脫方法純化重組蛋白對大量誘導(dǎo)時收集的菌體進(jìn)行超聲粉碎后，將超聲上清先經(jīng)過飽和硫銨沉淀粗純后，取飽和硫銨沉淀物進(jìn)行SDS-PAGE電泳，用0.3mol/L CuCl2進(jìn)行染色確定目標(biāo)蛋白帶e112在凝膠中的位置，切下目標(biāo)蛋白帶e112，置于透析袋中進(jìn)行電洗脫；純化蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，確定純度并進(jìn)行蛋白定量。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的RT-PCR反應(yīng)體系，其特征是逆轉(zhuǎn)錄20μl反應(yīng)體系包含以下成份
逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件室溫10min，42℃逆轉(zhuǎn)錄1h，96℃ 5min，置冰上5min，cDNA凍存于-20℃PCR50μl反應(yīng)體系包含以下成份
PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件94℃ 5min；94℃ 45s，55℃45s，72℃ 2min，35cycles；72℃ 10min。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的長度約330bp的截短片段p1-112，其特征是克隆基因p1-112的核酸序列及其所編碼的氨基酸序列1 ATG GAG GAA CTG CAG AGG GAA ATC AAT GCC CAT GAG GGT CAA CTG 451 Met Glu Glu Leu Gln Arg Glu Ile Asn Ala His Glu Gly Gln Leu 1546 GTG ATA GCC AGG CAG AAG GTG AGG GAT GCA GAA AAA CAA TAT GAA 9016 Val Ile Ala Arg Gln Lys Val Arg Asp Ala Glu Lys Gln Tyr Glu 3091 AAG GAT CCA GAT GAG CTG AAT AAA AGA ACA TTA ACA GAC AGA GAA 13531 Lys Asp Pro Asp Glu Leu Asn Lys Arg Thr Leu Thr Asp Arg Glu 45136 GGG GTT GCA GCA TCT ATC CAG GCC AAG ATT GAT GAA TTG AAA AGG 18046 Gly Val Ala Ala Sor Ile Gln Ala Lys Ile Asp Glu Leu Lys Arg 60181 CAG TTA GCA GAT AGG ATT GCA ACC GGA AAG AAC CTT GGG AAA GAA 22561 Gln Leu Ala Asp Arg Ile Ala Thr Gly Lys Asn Leu Gly Lys Glu 75226 CAG GAT CCC ACA GGG GTT GAG CCT GGA GAC CAT CTG AAA GAG AGA 27091 Gln Asp Pro Thr Gly Val Glu Pro Gly Asp His Leu Lys Glu Arg 105271 TCA ATG CTT AGT TAT GGA AAT GTA TTG GAT TTG AAC CAC CTG GAT 31591 Ser Met Leu Ser Tyr Gly Asn Val Leu Asp Leu Asn His Leu Asp 105316 ATT GAT GAG CCT TAA 330106 Ile Asp Glu Pro End 110
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的漢坦病毒克隆、表達(dá)所應(yīng)用的引物，其特征是(p1為正向引物，添加了NcoI酶切位點；p112為反向引物，添加了Sal I酶切位點和終止密碼子tta)
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組蛋白，其特征是其重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)(1)挑單菌落于5ml含Kanamycin(30ug/ml)的LB培養(yǎng)液中，37℃250rpm/min過夜培養(yǎng)；(2)將過夜培養(yǎng)的含重組質(zhì)粒的表達(dá)菌以1∶100擴(kuò)種。(3)表達(dá)菌生長到OD值約0.8時，加入IPTG使其終濃度為1mM，37℃誘導(dǎo)4h。(4)菌液用4℃8000rpm/min，離心5min收集菌體，沉淀倒置扣干備用。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用電洗脫方法純化重組抗原，其特征是(1)用超聲波粉碎法裂解細(xì)菌①將1500ml表達(dá)菌液于4℃，6000r/min，離心10min；②Buffer I 100ml懸浮沉淀，置冰浴上，350W超聲粉碎20min(2sec超聲，5sec間隔)；Buffer I(pH 7.2) 5mM EDTA20mMTris.Cl150mM NaCl③4℃，12000r/min，離心10min，取少量沉淀和上清進(jìn)行SDS-PAGE，確定目標(biāo)蛋白位置及純度，可溶性蛋白存在于上清中；(2)飽和硫銨沉淀①將上述細(xì)菌裂解上清轉(zhuǎn)移到燒杯中，置冰浴上，放在磁力攪拌器上邊攪拌邊加飽和硫銨(S終為10％)，流速控制在1ml/min；混合液置4℃冰箱靜置過夜或＞4h；以防因局部硫銨濃度過高而使蛋白在局部濃縮沉淀； (X為細(xì)菌裂解液體積，S為飽和硫銨濃度)②取出混合液，4℃，12000r/min，離心10min；留取上清，沉淀用少量去離子水重懸，于4℃冰箱保存；③測量上清體積，并將上清移到燒杯中，按上述公式計算所需加入的飽和硫銨的量(S終為20％)；置冰浴上，邊攪拌邊緩慢地加入飽和硫銨，混合液置4℃冰箱靜置過夜或＞4h；④重復(fù)2～3步驟，但S終為30％，以此類推，每次飽和硫銨加樣量遞增10％。直到幾乎所有目標(biāo)蛋白出現(xiàn)沉淀為止；(3)電洗脫①配制分離膠8塊，積層膠不加梳子，留出位置用于加樣；②對大量誘導(dǎo)時收集的菌體進(jìn)行超聲粉碎；③超聲上清先經(jīng)過飽和硫銨沉淀粗純后，取飽和硫銨沉淀物加6×加樣緩沖液上樣，每板加6ml，注意不要有氣泡；④SDS-PAGE先80V電泳，當(dāng)樣品后沿進(jìn)入分離膠后，升至110～120V，電泳過夜；⑤切膠取下膠，約在膠的縱向1/3處切一小條膠進(jìn)行CuCl2染色；約3min后，將凝膠小條取出，重新放置于原來的位置，觀察目標(biāo)條帶在凝膠中的位置，切下目標(biāo)條帶，置于1×SDS電泳緩沖液中；CuCl2染色染色液0.3M CuCl2脫色液(pH 9.0)0.25M EDTA0.25M Tris.Cl⑥將膠條分成3段，置于透析袋中，并加入1×SDS電泳緩沖液，以浸沒膠為宜，置于水平電泳槽上電泳；電洗脫12h，每4h吸出透析袋中的溶液，更換新的電泳緩沖液(共3次)，吸出的液體即為洗脫出的純化蛋白溶液；⑦純化樣品進(jìn)行SDS-PAGE，確定純度；⑧蛋白定量；①選擇蛋白分析程序；②選擇UV280方法測定蛋白濃度；③以牛血清白蛋白(BSA)為參考蛋白，以溶解待測定蛋白的溶液配制一系列濃度的BSA溶液，測定其OD值，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。以溶解BSA的溶液調(diào)零。
8.腎綜合征出血熱快速金標(biāo)診斷試紙條的制作工藝，其特征是(1)取0.03％四氯金酸1000ml，加熱至沸騰，加入1％檸檬酸三鈉溶液25ml，繼續(xù)煮沸5分鐘，待膠體金溶液顏色由有藍(lán)經(jīng)紫變紅后，自然冷卻后備用；(2)取膠體金溶液1ml，加入0.2M K2CO310μl、50μg純化抗原，攪勻后靜置1h；(3)加入20％牛血清白蛋白25μl、20％PEG 20,000 15μl，8,000r/min，離心8min，棄上清；(4)將沉淀懸浮于1ml基礎(chǔ)緩沖液中，即為金標(biāo)抗原溶液；(5)同法標(biāo)記鼠IgG；(6)兩種金標(biāo)抗原溶液混合后充分浸潤玻璃纖維紙，置凍干機(jī)凍干；(7)羊抗鼠IgG單抗3.0mg/ml、羊抗人μ鏈單抗2.0mg/ml、羊抗人IgG單抗2.0mg/ml，分別在NC膜的上、中、下位置包被NC膜，自然晾干；(8)在約10cm寬的底板上，將吸水紙、NC膜、吸附了金標(biāo)抗原的玻璃纖維和未吸附抗原的玻璃纖維組裝成檢測IgM與IgG的試紙條。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的金標(biāo)診斷試紙條的判斷原則，其特征是
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于腎綜合征出血熱診斷的重組抗原及其快速金標(biāo)診斷試紙條。其主要針對于HFRS診斷的截短N(yùn)P重組抗原e112及可同時檢測HFRS病人血清中IgM、IgG抗體的HFRS快速金標(biāo)診斷試紙條。利用基因克隆技術(shù)獲得漢坦病毒的截短N(yùn)P重組抗原，純化后即可用于免疫學(xué)診斷。快速金標(biāo)診斷試紙條克服了現(xiàn)有HFRS診斷方法的局限性，可同時檢測HFRS病人血清中IgM、IgG抗體，可判斷患者的感染狀態(tài)，并對患者作出早期診斷，能夠降低病死率，提高治愈率。此外，由于金標(biāo)試紙條無需特殊儀器，無需訓(xùn)練有素的專業(yè)人員，可以滿足基層醫(yī)院、農(nóng)村衛(wèi)生院等臨床檢測的需要，而且大大的降低了成本，方便了患者，適用于大規(guī)模的血清流行病學(xué)調(diào)查。
文檔編號C07K16/00GK1800854SQ20051009974
公開日2006年7月12日 申請日期2005年9月5日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月5日
發(fā)明者嚴(yán)延生, 吳守麗 申請人:福建省疾病預(yù)防控制中心